Вирусные вакцины и их онколизаты в терапии экспериментальных опухолей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат медицинских наук Видяева, Инна Геннадьевна

• Видяева, Инна Геннадьевна
• кандидат медицинских наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Видяева, Инна Геннадьевна

СПИСОК

СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биотерапия солидных опухолей.

1.1. ¡.Классификация основных методов биотерапии опухолей.

1.2. Механизмы противоопухолевого иммунного надзора и иммунологическое отторжение опухоли.

1.3.Механизмы противоопухолевого действия вирусов и проблема иммунотерапии опухолей.

1.3.1. История вопроса.

1.3.2. Цитопатический эффект вирусов в отношении опухолевых клеток.

1.3.3. Апоптоз - индуцирующее действие вирусов.

1.3.4 Иммунологические аспекты противоопухолевого действия вирусов.

1.4. Современные достижения в области развития онколитической виру сотерапии.

1.5. Характеристики вирусов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы исследований.

2.2. Методы исследований.

2.2.1. Приготовление мазков и подсчет цитологических показателей в системе in vivo.

2.2.2 Приготовление мазков и подсчет цитологических показателей в системе in vitro.

2.2.3 Количественное определение апоптоз — индуцирующего действия вирусных вакцин в клетках экспериментальных опухолей in vitro.

2.2.4 Определение коэффициента торможения роста опухолей.

2.2.5. Определение индекса ингибирования метастазирования.

2.2.6 Оценка функциональной активности клеток — эффекторов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Исследование влияния вакцинных штаммов вирусов на индукцию цитоморфологических нарушений в клетках карциномы лёгких Льюис и асцитной карциномы Эрлиха in vivo.

3.1.2. Исследование влияния онколизата вируса паротита на индукцию цитоморфологических нарушений в клетках карциномы легких Льюис in vivo.".

3.1.3. Исследование влияния вирусных вакцин и цитостатиков на индукцию цитоморфологических нарушений в клетках карциномы легких Льюис in vivo.

3.1.4. Исследование влияния вирусных вакцин на индукцию цитоморфологических нарушений в клетках карциномы легких Льюис in vitro.

3.2. Влияние вирусных вакцин на апоптотическую гибель опухолевых клеток in vitro.

3.3. Изучение воздействия вакцинных штаммов вирусов на рост экспериментальных опухолей.

3.3.1. Исследование влияния вакцинных штаммов вирусов и циклофосфана на динамику роста карциномы легких Льюис.

3.3.2. Изучение влияния вирусных вакцин и их онколизатов на динамику роста карциномы легких Льюис.

3.3.3. Изучение влияния вирусных вакцин и их онколизатов на рост меланомы В 16.

3.4. Изучение антиметастатических свойств вакцинных штаммов вирусов на моделях экспериментальных опухолей.

3.4.1. Исследование модуляции вирусными вакцинами антиметастатической активности циклофосфана на модели карциномы легких Лыоис.

3.4.2. Влияние вирусных вакцин и их онколизатов на метастазирование карциномы легких Льюис.

3.4.3. Влияние вирусных вакцин и их онколизатов на метастазирование меланомы В 16.

3.5. Изучение иммуномодулирующей активности вирусных вакцин на моделях экспериментальных опухолей.

3.5.1. Влияние вакцинных штаммов вирусов и их онколизатов на цитостатическую активность иммунокомпетентных клеток мышей с карциномой легких Лыоис.

3.5.2. Влияние вакцинных штаммов вирусов и их онколизатов на мембранотоксическую активность иммунокомпетентных клеток мышей с карциномой легких Льюис.

3.5.3. Влияние вакцинных штаммов вирусов .на функциональную активность иммунокомпетентных клеток мышей с карциномой легких Льюис на фоне цитостатической терапии.

3.5.4. Влияние вакцинных штаммов вирусов и их онколизатов на функциональную активность иммунных клеток мышей с меланомой В16.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Вирусные вакцины и их онколизаты в терапии экспериментальных опухолей»

Актуальность. Сегодня прогресс в лечении онкологических заболеваний связан с существенным прорывом в молекулярной биологии, иммунологии, понимании причин возникновения опухолевой клетки и закономерностей опухолевого процесса. Как известно, в организме существует целый ряд механизмов, позволяющих противостоять появлению и развитию опухоли. Это антиоксидантная и репаративная системы, блокирующие появление опухолевых клеток, а также иммунная система, работа которой направлена, в том числе, и на элиминацию клеток, несущих признаки отличия от нормальных тканей человека (Кузнецов В. П., 2000; Коростелев С. А.,2003).

Достигнут, также, колоссальный прогресс в клинической онкологии. Хирургическое лечение больных злокачественными опухолями изменилось, коренным образом, с появлением новых подходов (комбинированного и комплексного лечения), которые позволили выполнять менее травматичные органосохраняющие операции. Значительный прогресс достигнут в лекарственной терапии злокачественных опухолей. Химио-, гормоно- и лазерная терапия стали за это время неотъемлемыми компонентами комплексного лечения многих злокачественных новообразований (Хансон К. П., Афанасьев Б. В и др., 1996). Тем не менее, высокая резистентность опухолей к стандартным методам терапии вдохновляет исследователей на поиск новых, оригинальных стратегий лечения рака, одной из которых является биотерапия. Под этим термином понимается группа высокотехнологичных методов лечения опухолей, основой которых служит воздействие на естественные защитные реакции больного, или введение в организм естественных полимерных молекул (факторов роста, антител, генов, цнтокинов и так далее). Вакцинотерапия, как один из методов биотерапии, основана на использовании антигена или их комплекса в сочетании с адъювантами, или без них, для модуляции иммунного ответа. Это активная специфическая иммунотерапия, в основе которой лежит стимуляция иммунного ответа пациента на собственную опухоль. Большинство подходов к созданию противоопухолевых вакцин направлено на достижение таких лечебных эффектов, как: предотвращение рецидивирования и метастазирования новообразований после их хирургического удаления или химиолучевого "воздействия, восстановление функций иммунокомпетентных клеток, снятие явления депрессии кроветворения, улучшение качества и продолжительности жизни больного ( Кузнецов В. П., 2000). Частным случаем вакцинотерапии является вирусный онколиз. Вирусы являются естественными природными иммуномодуляторами, имеющими рецепторные структуры для взаимодействия как с иммунными, так и с другими, в частности, опухолевыми, клетками, и обладающие, при этом, повышенной чувствительностью к последним (Фердат А.К., Муцениеце А. Я., 1988). Существует несколько потенциальных механизмов разрушения опухолевых клеток онколитическими вирусами (Kirn D., 1996). В первую очередь -непосредственное прямое литическое действие, возникающее в результате репликации вирусов в малигнизированных клетках. Следующий механизм -онколитический, то есть, в течение репликационного цикла вирусы индуцируют синтез белков, которые обладают цитотоксическими свойствами в отношении опухолевых клеток (Tollefson A., Ryerse J., Scaria A.et al., 1996; Shtrichman R, Kleinberger Т., 1998). Третий механизм разрушения опухолевых клеток онколитическими вирусами - посреднический, через индукцию неспецифического и специфического противоопухолевого иммунитета.

В настоящее время проводятся исследования онколитических свойств адено- и реовирусов, вирусов вакцинных штаммов, болезни Ныокасла и других. Проводится исследование антибластомных свойств лизатов опухолевых клеток, инфицированных вирусами, которые, в качестве активной специфической иммунотерапии, используются сейчас для лечения пациентов с меланомой и раком яичников. Лизаты вирусинфицированных опухолевых клеток человека вызывают гуморальный иммунный ответ против опухоле- и вирус - ассоциированных антигенов (Savage Н., Rossen R., Hersh Е. et al., 1986), что, за счет усиления иммунных реакций, улучшает результаты хирургического лечения пациентов с меланомой (Wallack М., Sivanandham М, Balch С. et al., 1998). Онколитические вирусы могут увеличивать чувствительность опухолевых клеток к химио- и лучевой терапии (John Т. Mullen, Kenneth К. Tanabe., 2002). С другой стороны, вирусы могут размножаться в опухолевых клетках, сохранивших функцию р53, индуцируя их апоптотическую гибель. В настоящее время проводятся исследования, направленные на понимание механизмов этого явления и создание вирусных штаммов с максимально выраженной способностью индуцировать апоптоз в опухолевых клетках (John Т. Mullen, Kenneth К. Tanabe., 2002). Созданы препараты на основе мутантных вариантов аденовируса человека, способных избирательно размножаться на р53-дефицитных раковых клетках, вызывая их разрушение (Сергеев А.Н. с соавт., 2003; Шишкина JI. Н. с соавт., 2002). Тем не менее, в литературе не освещен вопрос использования вакцинных штаммов вирусов в качестве терапевтических агентов в лечении рака. Между тем, вирусные вакцины имеют огромное преимущество перед «дикими» вариантами эпидемиологическую безопасность, поскольку в процессе их получения происходит инактивация гена, ответственного за образование фактора вирулентности. Наряду с генетически закрепленной утратой патогенных свойств, вакцинные штаммы в полной мере сохраняют присущие исходным способность к репликации и формированию активного иммунного ответа (Медушщин Н. В., 1999). При этом, вирусы обладают высокой тропностыо по отношению к клеткам опухолей разных локализаций. Этот феномен -достаточно давно установленный факт. В экспериментальных исследованиях доказано, что концентрация вирусных частиц в опухолевой ткани превышает тот же показатель в нормальных, и различия могут достигать до 104 ЕД/мл (Stojdl D., 2000; Chung R., 1999; Nakamura H. et. al., 2002; Li Y., 2001; Andreansky S., 1997). Кроме того, вирусы, являясь высокоиммуногенными агентами, способны индуцировать клеточное и гуморальное звенья иммунитета. Универсальность механизмов действия вирусных вакцин заключается в том, что с одной стороны они оказывают прямое цитопатическое действие на опухолевые клетки в процессе вирусной репликации, с другой - индуцируют противоопухолевое звено иммунитета. Руководствуясь выше изложенными фактами, мы сочли целесообразным исследовать вакцинные штаммы вирусов оспы, паротита, гриппа и ВЭЛ в качестве онколитических агентов и изучить особенности механизмов их противоопухолевого действия на моделях экспериментальных опухолей, а также особенности действия лизатов опухолевых клеток, инфицированных данными вакцинными вирусами.

Цель исследования. Оценка цитопатического и апоптоз-индуцирующего действия вакцинных штаммов вирусов и онколизатов оспы, паротита, гриппа и венесуэльского энцефаломиелита, исследование их способности индуцировать противоопухолевую активность эффекторов системы иммунитета.

Задачи:

1. Исследовать индуцируемую вакцинными штаммами вирусов и их онколизатами патологию ядра и цитоплазмы опухолевых клеток в системах in vivo и in vitro.

2. Изучить особенности индуцируемой вирусами апоптотической гибели опухолевых клеток.

3. Оценить противоопухолевую активность вакцинных штаммов вирусов на фоне терапии цитостатиками.

4. Изучить влияние вирусных вакцин и онколизатов на функциональную активность иммунокомпетентных клеток (спленоцитов, тимоцитов) животных-опухоленосителей при экспериментальном онкогенезе.

Положения, выносимые на защиту:

- Вакцинные штаммы вирусов и их онколизаты активно подавляют метастазирование и рост экспериментальных опухолей.

- Противоопухолевая и антиметастатическая активность вирусных вакцин и их онколизатов базируется как на прямом литическом воздействии на опухолевые клетки, так и на модуляции противоопухолевой активности клеток иммунной системы.

- Вакцинные штаммы вирусов проявляют апоптоз-индуцирующие свойства по отношению к опухолевым клеткам in vitro.

Цитостатическая терапия существенно повышает противоопухолевую и антиметастатическую активность вакцинных штаммов вирусов.

Научная новизна.

Впервые проведено развернутое исследование по изучению влияния вакцинных штаммов вирусов оспы, паротита, гриппа, венесуэльского энцефаломиелита на уровень цитологических нарушений в опухолевых клетках животных в системах in vivo и in vitro.

Впервые оценена апоптозиндуцирующая активность вакцинных штаммов вирусов при экспериментальном онкогенезе.

На экспериментальных моделях опухолевого роста выявлена степень изменения функциональной активности иммунокомпетентных клеток (спленоцитов, тимоцитов) при терапии вирусными вакцинами и их онколизатами.

Впервые показано, что комплексное применение вакцинных штаммов вирусов с цитостатиками приводит к более выраженному угнетению роста и метастазирования злокачественных опухолей.

Впервые оценена цнтодеструктивная, противоопухолевая и антиметастатическая активность онколизатов вирусных вакцин оспы, паротита, венесуэльского энцефаломиелита.

Теоретическая и практическая значимость.

На основании полученных результатов определена значимость различных звеньев системы иммунитета в реализации противоопухолевого действия вирусных вакцин. Скрининг цитодеструктивной, иммуномодулирующей и противоопухолевой активности вакцинных штаммов вирусов позволяет скорректировать подходы к их практическому применению. Результаты проведенных экспериментальных исследований свидетельствуют о возможности применения вирусных вакцин в качестве биотерапевтических агентов в комплексной терапии онкологических заболеваний.

Апробация работы.

Основные положения работы доложены и обсуждены на 1-й международной юбилейной конференции, посвященной 110-летию проф. К. Н. Виноградова (Томск, Россия 2-5 апреля, 2001); на 9-й, 10-й международных конференциях «СПИД, рак и родственные проблемы» (Санкт - Петербург, 2001, 2002); 4-й конференции молодых ученых (Новосибирск, 2002); конкурсах молодых ученых (НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН, 2000-2003 гг); 5-й конференции молодых ученых СО РАМН "Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины" (Новосибирск 2004); Российской научно-практической конференции "Отечественные противоопухолевые препараты" (Москва, 2004). Результаты исследования опубликованы в 20 печатных работах, отражающих основные положения диссертации.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Видяева, Инна Геннадьевна

ВЫВОДЫ

1. Антибластомный эффект вакцинных штаммов вирусов на ранних стадиях опухолевого процесса реализуется посредством прямого литического действия на клетки перевиваемых опухолей, индуцируя в них увеличение количества многоядерных, двуядерных, клеток с микроядрами и вакуолизированной цитоплазмой (2,4%; 15,1-21,3%; 3,7%; 21,3-29,1%, соответственно). При этом, вакцинные штаммы вирусов оспы, паротита, ВЭЛ вызывали снижение митотической активности опухолевых клеток (до 1,5%, 1,3% и 1,0%, соответственно, против 23% контроля).

2. Вакцинный штамм вируса паротита в ранние сроки инкубации на 1415% увеличивает количество апоптотических клеток эритромиелолейкоза человека К-562, вирус венесуэльского энцефаломиелита - на 20% в более поздние. Апоптоз-индуцирующие потенции вируса осповакцины показаны на модели клеток асцитного варианта аденокарциномы Эрлиха (увеличение количества апоптотических клеток на 17-19%).

3. Вакцинные штаммы вирусов подавляют развитие метастазов более активно (НИМ составляет до 75%), чем их онколизаты (НИМ - до 21-26%) замедляющие, преимущественно, рост первичных опухолей (ТРО на 10 сутки - 60- 63%, 20 сутки - 42 - 49%; ТРО вирусами - 36 -47%, 21 -26% в соответствующие сроки).

4. Применение вирусов оспы и паротита на фоне терапии циклофосфаном вызывает более эффективное торможение роста (73%) и метастазирования (83,5%>) экспериментальных опухолей, чем монотерапия вирусными вакцинами (до 47%, 58%-76%, соответственно).

5. Вакцинные штаммы вирусов оспы и паротита в большей степени, чем их онколизаты, модулируют функциональную активность (цитостатическую и мембранотоксическую) лимфоцитов селезенки и тимуса.

6. Супернатанты тимоцитов и спленоцитов, содержащие цитокины и биологически активные вещества, проявляют более выраженную, чем исходные лимфоциты, функциональную активность в отношении клеток экспериментальных опухолей.

129

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Истоками возникновения проблемы противоопухолевого действия вирусов послужили эмпирические наблюдения случаев стабилизации и обратного развития опухолевого процесса, как при естественных вирусных инфекциях, так и вакцинации живыми вирусными вакцинами (Муцениеце А. Я., 1972; Sinkovics G., 1986), а также обнаружение в экспериментальных опухолях различного генеза онкотропных и онколитических свойств у многих вирусов животных и человека (Муцениеце А. Я., 1972; Lindenmann J., 1970). Поскольку формирование и рост опухоли представляют собой сложнейший процесс, который затрагивает все существующие в организме системы, подход к лечению рака должен быть комплексным и включать в себя не только традиционные методы — хирургическое вмешательство, химио- и лучевую терапию, но и дополнительные воздействия. На сегодняшний день, в онкологическую практику прочно входит биотерапия — метод, использующий в своем вооружении целый арсенал различных иммуномодуляторов, используемых в качестве адыовантов в комплексной терапии, рака. Этот подход действительно необходим, поскольку традиционные методы лечения рака чрезвычайно токсичны и наносят большой ущерб организму, и без того ослабленному опухолью. В настоящее время уделяется большое внимание применению онколитических вирусов в качестве адьювантов.

В чем же преимущество онколитических вирусов, как иммуномодуляторов, перед другими адыовантами ? Во - первых, высокая тропность вирусов, в большей степени, к опухолевым клеткам, чем к нормальным. Этот феномен - уже достаточно давно установленный факт. Доказано в экспериментальных исследованиях, что концентрация вирусных частиц в опухолевой ткани превышает тот же показатель в нормальных, и различия в титрах могут достигать до 104 (Andreansky S., 1998; Chung R.Y.,

1999; Li Y., 2001; Nakamura H. et. al., 2002). Механизмы вирусного онкотропизма расшифрованы недостаточно. Некоторые авторы (Муцениеце А. Я., 1979) считают, что онкотропизм вирусов не определяется малигнизацией клеток и опухоль, в определенной мере, сохраняет ту чувствительность к вирусу, которая имелась у исходной нормальной ткани. Поэтому каждый вирус имеет свой опухолевый спектр и каждый вид опухоли - свой вирусный спектр, аналогично тропизму вирусов к нормальной ткани. Но есть и другая сторона проблемы: возможно, вирусный онкотропизм связан с тем, что опухолевая ткань является быстрорастущей, с усиленными процессами метаболизма, что создает благоприятные условия для репликации вируса, поскольку обеспечивает быстрое формирование и массовый выход вирусных частиц.

Во — вторых, универсальность механизмов действия вакцин: с одной стороны, это прямое цитопатическое действие на опухолевые клетки в процессе вирусной репликации, с другой - индукция противоопухолевого звена иммунитета. По характеру протекания вирусная инфекция в малигнизированных клетках практически не отличается от таковой в нормальных (Муцениеце А. Я. 1979; 1982). Репликация вируса в опухолевой клетке сопровождается цитоморфологическими изменениями (патологией ядра и цитоплазмы), которые, чаще всего, не совместимы с дальнейшим существованием этой клетки и, в конечном итоге, сопровождаются ее гибелью. Помимо этого, инфицирование опухоли вирусом может сопровождаться апоптотической гибелью популяции опухолевых клеток, которые сохранили дикий тип гена р53, по механизму, запускающему апоптоз в нормальных клетках, инфицированных вирусом. Известно, что в нормальных клетках белки некоторых вирусов блокируют активность р53, что препятствует апоптозу инфицированной клетки и позволяет вирусу реплицироваться (Yew Р. & Berk А., 1992). С другой стороны, инфицирование вирусом нормальных клеток автоматически запускает в них процесс апоптоза (по крайней мере, в клетках, которые получили необратимые повреждения), а это препятствует процессу репликации и распространения вируса в ткани. Естественно, напрашивается вывод о том, что вирусы отдадут предпочтение размножению в клетках, дефектных по данному механизму. Действительно, в некоторых лабораториях было показано, что онколитические вирусы эффективно реплицируются в опухолевых клетках, которые несут мутации (Bischoff J. et al. 1996) или другие дефекты р53 (Ries S. et al., 2000), активно лизируя их. Следовательно, можно предположить, что этот механизм также может лежать в основе тропизма вирусов к опухолевой ткани.

Иммуномодулирующее действие вирусов заключается в их способности стимулировать Т-клеточное звено иммунитета, неспецифически индуцировать естественные защитные силы организма, изменять антигенные и иммуногенные характеристики опухолевых клеток, вызывать образование интерферона (Мерфи Б., 1989; Пемен Ш., 1989). Опухоли, в основном, слабоиммуногенны. Проще ситуация с вирус - инфицированными опухолями, в которых обнаруживаются вирусные антигены. Они относятся к группе сильно иммуногенных опухолей (Кузнецов В. П., 2000). Вирусные антигены представлены на поверхности клетки в соединении с белками МНС 1 класса, а этот комплекс может распознаваться цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTLS), которые привлечены инфицированной вирусом опухолью. После инфицирования опухолевой клетки происходит индукция выброса цитокинов лимфоцитами и антигенпрезентирующими клетками (Toda M., Rabkin S., Kojima H. et al., 1999).

В-третьих, живые вирусные вакцины практически не имеют противопоказаний и побочных эффектов. Аттенуированные штаммы вирусов получают путем инактивации гена, ответственного за образование фактора вирулентности, или за счет мутаций в генах, неспецифически снижающих этот показатель (Медуницин Н. В., 1999). Наряду с генетически закрепленной утратой патогенных свойств и потерей способности вызывать у человека острое инфекционное заболевание, вакцинные штаммы индуцируют формирование иммунитета при отсутствии клинической картины заболевания. Лишь в единичных случаях могут возникать вакцино-ассоциированные заболевания, связанные с остаточной вирулентностью вакцинного штамма, реверсией его вирулентных свойств или наличием у привитого иммунодефицитного состояния. Чаще всего, на введение вакцин возникают аллергические реакции 1 типа, которые можно купировать симптоматическим лечением (Медуницин Н. В., 1999).

Проведенное исследование убедительно показало, что использованные нами терапевтические агенты (вирусные вакцины и онколизаты) проявляют выраженную противоопухолевую и антиметастатическую активность при моно- и комплексной терапии перевиваемых экспериментальных опухолей, таких, как карцинома легких Льюис, меланома В 16, аденокарцинома Эрлиха.

В наших исследованиях мы попытались осветить самые важные аспекты противоопухолевого действия вирусов. Нами было показано, что цитодеструктивные нарушения в опухолевых клетках развиваются in vitro уже через 24 часа после заражения вирусами свежевыделенных опухолевых клеток, т.е. практически на стадии инфицирования, и к 48 часам инкубации эти изменения продолжали нарастать. По мере развития цитодеструктивных нарушений, увеличивается в 3 - 4 раза и процент гибнущих клеток в зараженных культурах, , что говорит о хорошем литическом потенциале исследованных вакцинных штаммов. При этом, следует отметить, что в культуре опухолевых клеток, инфицированных вирусом венесуэльского энцефаломиелита, наблюдается наиболее высокий процент клеточных повреждений.

При лечении животных вирусными вакцинами, также наблюдается, преимущественно на ранних стадиях онкогенеза, увеличение количества опухолевых клеток с патологиями. Позднее, при генерализации опухолевого процесса, деструктивные нарушения становятся менее выраженными. Конечно, трудно ожидать на поздних стадиях онкогенеза высокие показатели клеточной деструкции, поскольку следует учитывать то, что в эти сроки период вирусемии заканчивается. И хотя показатели патологии клетки на 20 сутки менее выражены, чем на 10, они остаются достаточно высокими, что свидетельствует об опосредованном, через иммунную систему, воздействии вирусов на опухолевые клетки.

Стимуляция противоопухолевого Т- клеточного иммунитета является одним из основных механизмов, с помощью которого вирусы уничтожают опухолевые клетки или подавляют их рост. В ранний период опухолевого процесса (7-14 сутки), когда наблюдается увеличение количества опухолевых клеток в состоянии деструкции, нами зарегистрировано значительное торможение опухолевого роста, являющееся результатом размножения вируса в опухолевых клетках, а также высокий антиметастатический эффект: Кроме того, в эти сроки отмечается максимальное увеличение функциональной активности иммунокомпетентных клеток, стимулированных вирусными вакцинами. Суммируя вышеизложенное, мы можем утверждать, что на данном этапе опухолевого процесса проявляется комплексное действие вирусов - цитодеструктивное и иммуномодулирующее, что и обеспечивает положительный эффект от проведенного лечения. На более поздних стадиях онкогенеза, когда опухолевый процесс начинает прогрессировать, наблюдаем снижение показателей иммунологической активности лимфоцитов. Известно, что при клинически развитой форме онкологической патологии возможности иммунной системы, как правило, исчерпаны и попытки ее активации методами иммунотерапии не могут вызвать кардинальных изменений, хотя, безусловно, влияют на динамику заболевания (Кузнецов В.П., 2000). Таким образом, применять иммуномодуляторы более целесообразно, безусловно, на ранних стадиях онкогенеза, когда масса опухоли еще невелика, а иммунная система находится в достаточно активном состоянии для стимуляции ее противоопухолевого звена с целью получения клинически выраженного эффекта. Однако, применение иммуномодуляторов на более поздних стадиях онкогенеза также необходимо для: а) снятия депрессии кроветворения и восстановления нарушенных опухолью и/или цитотоксическим лечением функций иммунных эффекторов; б) восстановления противоопухолевого иммунного надзора, снижения риска развития рецидивов и метастазов; в) улучшения качества жизни пациентов (Кузнецов В.П., 2000).

Мы попытались, также, оценить цитодеструктивный и противоопухолевый потенциал лизатов опухолевых клеток, инфицированных вирусами (онколизатов). Преимуществом этих препаратов является то, что они содержат двойной набор антигенов (опухолевых и вирусных), следовательно, теоретически, должны индуцировать более высокий уровень специфического противоопухолевого иммунитета (Фердат А. К., Муцениеце А. Я., 1988). Однако, несмотря на более высокую иммуногепность онколизатов, иногда исходные вирусы (в наших исследованиях - вирус паротита) оказывают более выраженное цитодеструктивное действие, что сопровождается появлением большего количества опухолевых клеток с патологией ядра и цитоплазмы. Таким образом, онколизаты не вызывают выраженного прямого цитодеструктивного эффекта, так как их действие на опухолевые клетки связано, в основном, с индукцией противоопухолевого иммунного ответа. Нами не было показано существенных различий в показателях функциональной активности иммунокомпетентных клеток (лимфоцитов тимуса и селезенки) при терапии подопытных животных вирусами, либо их онколизатами. Интересно и то, что онколизаты более активно, чем вакцинные штаммы вирусов, подавляют рост первичных опухолей (карциномы Лыоис и меланомы В16), причем, процент торможения этого показателя не только существенно превышает аналогичный при монотерапии вирусами, но и эффект этот сохраняется в течение более длительного периода. Антиметастатический потенциал вирусных онколизатов высок, преимущественно, на ранних стадиях онкогенеза (10 сутки), в более поздние сроки (20 сутки) наблюдается его снижение, в то время, как вирусы подавляют развитие метастазов на протяжении всего периода развития опухоли. Чем можно объяснить подобный эффект?

Видимо, мы имеем дело с некоторыми особенностями механизмов противоопухолевого действия данных терапевтических агентов. Вирусы являются, прежде всего, индукторами Т- клеточного звена иммунитета, кроме того, они стимулируют выработку эндогенного интерферона, увеличивают чувствительность опухолевых клеток к фактору некроза опухолей, а также могут изменять их антигенные и иммуногенные характеристики (Кузнецов В. П., 2000.; Gooding L., 1994). Опухолевые клетки, инфицированные вирусом, становятся более доступными для распознавания и уничтожения Т-лимфоцитами, так как содержат в составе своей мембраны вирусные антигены и, таким образом, привлекают к себе внимание представителей специфического и неспецифического иммунного ответа - макрофагов, цитотоксических Т-лимфоцитов, естественных киллеров и др. (Toda М., Rabkin S., Kojima Н., 1999). Помимо стимуляции вирусами системного иммунитета (увеличение цитостатического и мембранотоксического потенциала ИКК), Т-клетки, привлеченные опухолью, инфицированной вирусом, накапливаются в опухолевой массе и могут специфически лизировать неопластические клетки. Кроме того, эти лимфоциты обладают способностью секретировать ИЛ-2, ИНФу, ГМ-КСФ, а также пролиферировать в ответ на стимуляцию аутологичными опухолевыми клетками (Барышников А. Ю., 2003). Согласно полученным нами результатам, аттенуированные штаммы вирусов оспы, паротита, ВЭЛ эффективны в отношении первичных узлов метастазирующих опухолей мышей, но более активно исследуемые вирусы ингибируют развитие небольших опухолевых очагов - метастазов. При помощи рассмотренного механизма действия вирусы способны не только подавлять рост первичной опухоли, но и препятствовать на начальных этапах развития опухолевого процесса распространению опухолевых клеток от основного очага, когда метастазы только закладываются в организме, что, видимо, лежит в основе высокого антиметастатического потенциала вирусных вакцин.

Обращает на себя внимание, что супернатанты изученных нами иммунокомпетентных клеток (тимоцитов и спленоцитов) животных, получивших терапию вирусными вакцинами и их онколизатами, проявляют более высокую функциональную активность в отношении опухолевых клеток, чем исходные лимфоциты. Супернатанты представляют собой комплекс растворимых медиаторов иммунной системы (ИФН, ИЛ-1, -2, -4, -6, -8, ФНО-а и др.) и биологически активных веществ (лизосомальных ферментов, активных форм кислорода, продуктов окисления арахидоновой кислоты и др.), продуцируемых иммунными клетками в процессе инкубации in vitro. Поскольку мы не выявили ярко выраженного повышения специфической активности клеток-эффекторов, мы предполагаем, что противоопухолевый эффект их связан, в большей степени, с продукцией вышеупомянутых растворимых факторов - цитокинов и биологически активных веществ, и в меньшей - с прямым цитотоксическим контактом с клетками-мишенями. Согласно литературным данным, селезенка, например, содержит все субпопуляции"ИКК, цитостатическое действие которых связано с секрецией комплекса цитокинов и биологически активных веществ (Кетлинский С. А. и соавт., 1995; Маянский Д. Н. и соавт., 1990). Не исключено, что противоопухолевый эффект обеспечивается, также, инфильтрирующими опухоль лимфоцитами, макрофагами и, возможно, другими клетками специфического и неспецифического иммунитета.

Онколизаты, в отличие от вирусов, вызывают, в большей степени, гуморальный иммунный ответ против опухоле- и вирус - ассоциированных антигенов, что приводит к образованию вирус- и опухоль- нейтрализующих антител (Savage Н., Rossen R., Hersh Е. et al., 1986). Индукция гуморального звена иммунитета может сопровождаться активацией цитотоксических лимфоцитов и натуральных киллеров, поскольку в функционировании иммунной системы существует кооперация лимфоцитов - взаимодействие Тс B-лимфоцитами и предшественниками Т-киллеров и т.д. (Ярилин А. А., 1999). Мы полагаем, что эффективное торможение роста первичного опухолевого узла онколизатами связано с их более выраженными иммуногенными свойствами, поскольку, содержание большого количества различных антигенов должно способствовать индукции более высокого уровня специфического противоопухолевого иммунитета, с привлечением разных звеньев иммунитета, в том числе, антител, антиген- презентирующих клеток, Т- лимфоцитов. Рассмотренные нами конкретные звенья иммунитета (цитостатическая и мембранотоксическая активность клеток тимуса и селезенки) не единственные показатели, обеспечивающие противоопухолевую эффективность онколизатов, поэтому необходимо более углубленное исследование иммунологических механизмов действия изученных терапевтических агентов.

Некоторыми исследователями проведено изучение лизатов инфицированных вирусом опухолевых клеток, которые используются в клинике в качестве агентов активной специфической иммунотерапии меланомы и рака яичников (Коростелев С.А., 2003). Клинические испытания показали, например, повышение выживаемости больных меланомой при использовании онколизата клеток меланомы, инфицированных вирусом болезни Ныокастла (Batliwalla F., Bateman В., Serrano D., 1998); корреляционную зависимость между повышением уровня иммунного ответа и выживаемостью больных при использовании, в качестве терапевтического средства, онколизата клеток меланомы, инфицированных вирусом коровьей оспы (Wallack М., Sivanandham М.,1998).

Одним из традиционных методов лечения опухолей на сегодняшний день является химиотерапия. Различные препараты, которые используются для этой цели, несмотря на хороший цитостатический потенциал, не могут полностью справиться с растущей опухолью, поэтому предпринимаются попытки усилить терапевтическое действие этих агентов и снизить побочные эффекты от их применения с помощью различных адыовантов.

Проведенные нами исследования позволили оценить противоопухолевый потенциал вакцинных штаммов вирусов на фоне цитостатической терапии карциномы легких Льюис. Комбинация этих терапевтических агентов вызвала значительное торможение опухолевого роста у животных-опухоленосителей, причем, объемы опухолей у подопытных мышей в этих группах были на 20 -30 % ниже, чем у животных, получивших монотерапию вирусами, либо циклофосфаном. Индекс торможения роста опухоли в группах, получивших комбинированную терапию, был достаточно высок и на поздних стадиях опухолевого процесса (20 сутки), когда у подопытных мышей других групп был отмечен рецидив первичного опухолевого узла. Антиметастатический эффект схемы лечения "вирус + ЦФ" превышает аналогичный, полученный при использовании вирусных вакцин и циклофосфана в монотерпии. (Подавление развития метастазов, как и торможение роста опухоли, отмечалось до 20-х суток наблюдения, а индекс ингибирования метастазирования при использовании вышеупомянутых схем был, приблизительно, на 20 % выше, чем в группах, получивших только вирус, или цитостатик. Однако, исследованные противоопухолевые эффекты не были связаны с активностью соответствующих звеньев системы иммунитета (мы не выявили увеличения функциональной активности тимоцитов и спленоцитов под действием данных агентов), что может быть связано с супрессивным действием циклофосфана на иммунокомпетентные клетки (Агеенко А. И., 1982; Гершанович М. Л., 1982). Более значимое торможение роста и метастазирования карциномы легких Льюис, при сочетанной терапии вирусом и цитостатиком, может происходить вследствие суммирования соответствующих эффектов каждого из применяемых агентов. Циклофосфан, благодаря своему иммунодепрессивному действию, может блокировать противовирусный иммунный ответ (Ikeda К., 1999) и, тем самым, облегчать распространение вируса в опухолевой ткани и его успешную репликацию (Chase М., Chung R. Y., 1998). Кроме того, при регрессии опухоли опухолевые и вирусные антигены высвобождаются в циркуляторное русло и могут быть презентированы антиген - представляющими клетками, которые, в свою очередь, активируют CD4+n CD8+ Т- клетки (Т-хелперы, Т-киллеры), что приводит к иммунной деструкции остатков опухоли (Todo Т. et. al., 1999).

В представленной работе мы предприняли попытку оценить апоптоз-индуцирующее действие вирусных вакцин на клетки экспериментальных опухолей. Недавно в литературе появились сообщения по исследованию апоптоз-индуцирующего действия онколитического аденовируса ONIX-15, которое продемонстрировало эффективное размножение данного вируса во многих типах опухолевых клеток с утраченной функцией апоптоза (Goodrum F., Ornelles DA., 1998; Rothmann Т., Hengstermann А., 1998). Поскольку, популяция опухолевых клеток гетерогенна по своему составу (часть из них сохраняет полную или частичную способность к апоптозу, а другая -утрачивает это свойство), то цитоморфологическое действие онколитнческих вирусов может складываться из двух компонентов: цитодеструктивного и апоптоз - индуцирующего, что мы и наблюдали в наших исследованиях. Но если цитодеструктивное действие в отношении опухолевых клеток у всех исследованных вирусных вакцнн было четко выражено, то апоптоз-индуцирующее проявлялось у каждого вируса индивидуально. Так, например, вирус паротита активно индуцировал этот показатель в клетках эритромиелолейкоза человека К-562 на ранних сроках инкубации (3-6 часов), а вирус ВЭЛ - на более поздних (24 часа). Вирус осповакцины проявил слабую апоптоз-индуцирующую активность по отношению к клеткам К—562, но довольно активно стимулировал апоптоз в клетках карциномы Эрлиха. Таким образом, проведенные нами исследования не противоречат литературным данным, свидетельствующим о том, что интенсивность индуцированного апоптоза в опухолевых клетках может зависеть от многих причин, например, от типа опухоли, ее происхождения, гистологического варианта, прогрессии, стадии, а также природы индуктора апоптоза, его индивидуальных свойств (Погорелов В.М., 1995; Циплакова В. Г., 1999; Bowen J., 1998; Candiz - Boduroglu Е., 1999; Demoura S., 1999; Galazka К., 1999; 1999; Torre F., 1999). Использование индукторов апоптоза вирусной природы весьма заманчиво, в перспективе, для лечения злокачественных опухолей и требует, безусловно, дальнейшего изучения. С одной стороны, потеря опухолевыми клетками функций р53 может являться причиной опухоле -селективной репликации вирусов (Goodrum F., Ornelles D., 1998; Rothmann T, Hengstermann A, Whitaker N. et al., 1998). С другой стороны, вирусы могут размножаться в опухолевых клетках с сохраненной функция р53 и индуцировать их апоптотическую гибель с участием иммунных клеток, ответственных за этот процесс, который протекает по тем же законам, что и апоптоз в нормальных клетках, инфицированных вирусом. В настоящее время проводятся исследования, направленные на понимание механизмов этого явления и создание вирусных штаммов с максимально выраженной способностью индуцировать апоптоз в опухолевых клетках ( Mullen J., Tanabe К., 2002).

Широкий спектр иммунобиологической активности вирусных вакцин, их цитодеструктивное и апоптоз-индуцирующее действие, способность стимулировать противоопухолевый иммунный ответ организма-опухоленосителя, высокий антиметастатический потенциал, отсутствие выраженных побочных эффектов и осложнений, высокая избирательность по отношению к опухолевым клеткам позволяют рассматривать вирусные вакцины как перспективное адъювантное средство в комплексной терапии злокачественных опухолей.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Видяева, Инна Геннадьевна, 2005 год

1. Агол В.И. Молекулярная биология вирусов / В.И. Агол., И.Г. Атабеков. Москва: Наука, 1971. - 256 с.

2. Агеенко А.И. Молекулярная биология и иммунология вирусного канцерогенеза / А.И. Агеенко. Москва: Медицина, 1974.- 328 с.

3. Агеенко А.И. Иммунитет и терапия экспериментальных опухолей / А.И. Агеенко., С.П. Гордиенко., О.Г. Саканделидзе. Кишинев: «Штиинца», 1982. - 310 с.

4. Амченкова A.M. Этиологические механизмы специфического противовирусного иммунитета / A.M. Амченкова., Г.П. Советова. // Вопросы вирусологии. 1968. - № 5. - С. 53-56.

5. Анджапаридзе О.Г. Культура ткани в вирусологических исследованиях / О.Г. Анджапаридзе. Москва: Медгиз, 1962. - 234 с.

6. Анджапаридзе О.Г. Моделирование хронической вирусной инфекции в тканевых культурах / О.Г. Анджапаридзе., H.H. Богомолова. Москва: Медицина, 1974. - 257 с.

7. Барышников А.Ю. Программированная клеточная смерть / A.IO. Барышников., Ю.В. Шишкин // Российский онкологический журнал.-1996.-№ 1.-е. 58-61.

8. Бумбиерис Я.В. Нивелирование индивидуально-специфической антигенности опухолей и целенаправленное наведение противоопухолевого иммунитета вируса осповакцины / Я.В. Бумбиерис // Иммунология опухолей. Рига. - 1982. - С. 235-241.

9. Возможность культивирования мутантного варианта Ade 12 аденовируса на культуре клеток 293 / А.Н. Сергеев., В.А. Петрищенко., О.В. Пьянков., О.Г. Пьянкова и др. // Вопросы вирусологии. — 2003. № 6.-С. 30-33.

10. Гершанович М.П. Основные осложнения при химио- и гормонотерапии злокачественных опухолей / М.П. Гершанович // М.: Медицина. 1982. - 65 с.

11. Глан П.В. Авторадиографическое изучение влияния вируса болезни Ньюкастла на митотический цикл клеток / П.В. Глан // Бюлл. экспер. биол. 1968. - № 8. - С. 105-108.

12. Гольдберг Е.Д. Методы культуры ткани в гематологии / Е.Д. Гольдберг ., A.M. Дыгай ., В.П. Шахов. Изд - во ТГУ: Томск - 1992. -272 с.

13. Дейчман Г.И. Опухолевые антигены и противоопухолевый иммунитет. / Г.И. Дейчман. В кн.: Канцерогенез / под ред. Д.Г. Заридзе, М. - 2000. - С. 310-332.

14. Жданов В.М. Атлас вирусной цитопатологии / В.М. Жданов. -Москва: Медицина, 1975. 473 с.

15. Жданов В.М. Общая и частная вирусология / В.М. Жданов. -Москва: Медицина, 1982. Т. 1.-495 с.

16. Егорова Н.В. Иммунологические аспекты эпидемиологии / Н.В. Егорова., И.В. Мирошниченко., Л.С. Кренин. Кишинев, 1977. - С. 15-16.

17. Кетлинский С. А. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции реакции воспаления и иммунитета / С.А. Кетлинский., Н.М.Калинина // Иммунология. 1995. - № 3. - С. 30- 44.

18. Коростелев С.А. Противоопухолевые вакцины / С.А. Коростелев // Актуальные вопросы клинической онкологии. — 2003. т. 5. - № 4. -С. 160-169.

19. Кузнецов В.П. Иммунокорригирующая терапия сопровождения при солидных опухолях: вопросы тактики / В.П. Кузнецов // International Journal on Immunorehabilitation. 2000. - Vol. 2. - № 1. - P. 37-47.

20. Кусмарцев С.А. Функциональное состояние B-лимфоцитов и активность супрессоров костного мозга на этапах злокачественного роста: Автореф.дис.канд.мед.наук / С.А. Кусмарцев. Томск, 1990. -26 с.

21. Макарова Г.Ф. Индукция клеточной пролиферации при действии , опухолеродных вирусов / Г.Ф. Макарова. В кн.: Клеточный цикл. М., 1973 -С. 134-159.

22. Маянский Д.Н. Активация макрофагов / Д.Н, Маянский., Д.Д. Цырендоржиев // Успехи совр. биологии. 1990. - Т. 109. - вып. 3. - С. 352-368.

23. Медуницын Н.В. Вакцинология / Н.В. Медуницын. Москва: Триада-X, 1999.- 272 с.

24. Медуницын Н.В. Иммунный ответ на сложные антигены и комбинированные вакцины / Н.В. Медуницын //Иммунология. 2001. -№ 1.-С.4-6.

25. Мерфи Б. Противовирусная иммунизация / Б. Мерфи., Р. Ченок //Вирусология в 3-х томах под ред.Филдса Б., Найпа Д. — М.: Медицина, 1989.-Т. 2.-С. 145-190.

26. Моисеенко В.М. Биотерапия солидных опухолей / В.М. Моисеенко//Вопросы онкологии. 1998. - Т 44. -№ 1. - С. 120-125.

27. Моисеенко В.М. Вакцинотерапия злокачественных опухолей / В.М. Моисеенко., И.А. Балдуева., К.П. Хансон // Вопросы онкологии.-1999. Т 45. - № 3. - С. 327-332.

28. Муцениеце А.Я. Онкотропизм вирусов и проблема виротерапии злокачественных опухолей / А.Я. Муцениеце. — Рига, 1972 С. 175190.

29. Муцениеце А.Я. Изучение чувствительности меланом человека к энтеровирусам адаптированным и неадаптированным к этим опухолям /А.Я. Муцениеце // Вирусы в терапии опухолей. Рига. - 1978. - С. 175-190.

30. Муцениеце А.Я. Решенные и нерешенные вопросы виротерапии злокачественных опухолей / А. Я. Муцениеце // Иммунологические аспекты вирусного онкотропизма. Рига. - 1979. - С. 7-22.

31. Муцениеце А.Я. Трансплантационные антигены и их изменения при канцерогенезе и вирусной инфекции / А.Я. Муцениеце., Я.В. Бумбиерис // Гетерогенизация опухолей. Рига. - 1980. -С. 7-35.

32. Общая вирусология / С. Лурия., Д. Дарнелл., Д. Балтимор., Э. Кэмбелл. Москва: Мир, 1981. - С. 156-169.

33. Пенмен Ш. Метаболизм вирусов и клеточная архитектура / Ш. Пенмен // Вирусология в 3-х томах под ред. Филдса Б., Найпа Д. М.: Медицина, 1989.-Т. 1.-С. 307-329

34. Петухов В.И. Роль Fas-опосредованного апоптоза в реализации противоопухолевого эффекта А-интерферона при хроническом миелолейкозе / В.И. Петухов // Гематол. трансфузиол. 2000. - № 4. - С. 29-33.

35. Погорелов В.М. Морфология апоптоза при нормальном и патологическом апоптозе / В.М. Погорелов., Г.И. Козинец // Гематол. трансфузиол. 1995. - № 5. - С. 17-24.

36. Полосухина Е.Р. Исследование экспрессии CD95 (FAS/APO — 1), опосредующего апоптоза, с помощью моноклональных антител ICO-160 при гемобластозах / Е.Р. Полосухина., АЛО. Барышников., Ю.В. Шишкин // Гематол. Трансфузиолог. 2000. - № 4. - С. 29-33.

37. Программированная клеточная гибель / Ред. B.C. Новиков. — СПб.: Наука, 1996.-256 с.

38. Райхлин Н.Т. Регуляция и проявления апоптоза в физиологических условиях и в опухолях / Н.Т. Райхлин., А.Н. Райхлин //Вопросы онкологии. 2002. - том 48.-№ 2. - С. 159-171.

39. Разработка лечебного противоракового препарата на основе мутантного штамма аденовируса человека / Л.Н. Шишкина., А.Н. Сергеев., В.А. Петрищенко., A.A. Сергеев., О.В. Пьянков., В.А. Жуков

40. Совр. состояние и перспективы развития экспер. и клин, онкологии. Мат лы Росс, научно - практической конференции, посвященной 25-летию НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН ( 24 - 25 июня 2004 г). - Томск. -2004,- Часть II. - С. 313-314.

41. Рыкова М.П. Новая чувствительная техника тестирования нормальных киллеров / М.П. Рыкова., И.В. Спиранде., М.С. Зедгенидзе //Иммунология. 1981.-№3.-С. 88-90.

42. Семенов Б.Ф. Клеточные и молекулярные основы противовирусного иммунитета / Б.Ф. Семенов., Д.Р. Каулен., И.Г. Баландин. Москва: Медицина.- 1982. - 240 с.

43. Современные тенденции в развитии биологичекой терапии злокачественных опухолей / К.П. Хансон., Б.В. Афанасьев., Л.М. Берштейн и др. // Вопросы онкологии.- 1996. Т. 45. - № 5. - С. 7-12.

44. Соловьев В.Д. Очерки по вирусной цитопатологии / В.Д. Соловьев., Я.Е. Хесин., А.Ф. Быковский. Москва: Медицина, 1979. -320 с.

45. Станкевич С.А. Функциональное состояние клеток тимуса и их участие в регуляции иммунитета при опухолевом росте: Автореф.дис. .канд.мед.наук / С.А. Станкевич. Томск.- 1990. - 25 с.

46. Трещалина Е.И. Выбор моделей для скрининга природных веществ на противоопухолевую активность / Е. И. Трещалина., Л.А. Седакова., Г.А. Фирсова // Антибиотики и химиотерапия. 1990. - Т. 35. -№2.-С. 7-10.

47. Фердат А.К. Ретровирусы как фактор модуляции противоопухолевой резистентности / А.К. Фердат // Гетерогенизация опухолей. Рига, 1980. - С. 36-56.

48. Фердат А.К. Вирусная инфекция фактор модуляции антигенных и иммуногенных свойств опухолей / А.К. Фердат., Я.В. Бумбиерис., А.Я. Муцениеце // Изв. АН Латв. ССР. - 1983. - № 3. - С. 83-95.

49. Фердат А.К. Механизмы противоопухолевого действия вирусов и проблема иммунотерапии опухолей / А.К. Фердат., А.Я. Муцениеце // Вопросы онкологии.- том XXIV. -№ 11.- 1988. С. 1291-1298.

50. Фильченков А.А. Апоптоз и рак / А.А. Фильченков., Р.С. Стойка.- Киев, 1999. 137 с.

51. Фролов А.Ф. Практическая вирусология / А.Ф. Фролов., П.Ф. Шевченко., В.П. Широбоков. Киев: Здоровье, 1989. - С. 78-112.

52. Хесин Я.Е. Размеры ядер и функциональное состояние клеток / Я.Е. Хесин. Москва: Медицина, 1967. - 87 с.

53. Хетсс С.В. Умирать или не умирать. Описание апоптоза и его роли в протекании болезни / С. В. Хетсс // Амер. Мед. Ассоц. 1998. - № 1. -С. 12-26.

54. Циплакова В.Г. Апоптоз / В.Г. Циплакова., Н.Н. Бескровнова // Арх. Пат. 1999. - № 5. - С. 71-74.

55. Швембергер И.Н. Апоптоз: роль в нормальном онтогенезе и патологии / И.Н. Швембергер., Л.Б. Гинкул // Вопросы онкологии. -2002.-Т 48. № 2. - С. 153-158.

56. Якубовская Р.И. Современные подходы к биотерапии рака / Р.И. Якубовская // Российский биотерапевтический журнал т. 1. - № 3. -2002.-С. 5-14.

57. Ярилин А.А. Система цитокинов и ее функционирование в норме и при патологии / А.А. Ярилин // Иммунология. 1997. - N 5. - С. 3-7.

58. A prospective phase II trial of ONYX-O15 adenovirus and chemotherapy in recurrent squamous cell carcinoma of the head and neck (the Baylor experience) / J. Lamont., J. Nemunaitis., J. Kuhn et al. // Ann Surg Oncol. 2000. - Vol. 7. - P. 588-592.

59. A hepatocellular carcinoma-specific adenovirus variant, CV890, eliminates distant human liver tumors in combination with doxorubicin / Y. Li et al. //Cancer.Res. 2001. - V. 61. - P. 6428-6436.

60. Acute Myeloblasts leukemia: replication ofavian influenca virus in human myeloblasts and First attempt at clinical application / C. Sauter., J. Lindenmann., A. Gerber et. al. // Recent Results Cancer Res. 1974. -Vol. 47.-P. 455-460.

61. Ada G // Biologicals. 1994. - Vol. 22. - P. 329-331.

62. Agol V. Two types of death of poliovirus-infected cells / V. Agol., G. Belov., K. Bienz // Virology, 1998.- Vol. 252.- P. 343-353.

63. An adenovirus mutant that replicates selectively in p53-deficient human tumor cells / J. Bischoff., D. Kirn., A. Williams et al. // Science 1996. Vol. 274. - P. 373-376.

64. An oncolytic herpes simplex virus type 1 selectively destroys diffuse liver metastases from colon carcinoma / S. Yoon., H. Nakamura., N. Carroll et al. // FASEB J. 2000. - Vol. 14. - P. 301-311.

65. Antitumor effect of locally prodused CD95 ligand / J. Seino., N. Kayayaki., K. Okumura., H. Yagita // Nat. Med. - 1997. - Vol. 3. - P. 165170.

66. Apoptosis in neuroendocrine tumor of the lung / S. Demoura., E. Kogan., B. Szende., M. Paltsev // Virch. Arch. 1999. - Vol. 435. - P. 268277.

67. Apoptosis. Its significance in cancer and cancer therapy / J. Kerr et al. // Cancer. 1994. - Vol. 73. - P. 2013-2026.

68. Association between an oncogene and an anti-oncogene: the adenovirus El A proteins bind to the retinoblastoma gene product / P. Whyte., K. Buchkovich., J. Horowitz et al. // Nature.- 1988. Vol. 334.- P. 124-129.

69. Attenuated, replication-competent herpes simplex virus type 1 mutant G207: safety evaluation of intracerebral injection in nonhuman primates / W. Hunter., R. Martuza., F. Feigenbaum et al. // J Virol. 1999. - Vol. 73. - P. 6319-6326.

70. Austin F. Virus augmentation of the antigenecitu of tumor cell extracts / F. Austin., C. Boone // Adv. Cancer Res. 1979. - Vol. 30. - P. 301-340.

71. Boone C. Augmented immunogenicity of tumor cell homogenates infected with influenza virus / C. Boone // Ree. Results. Cancer Res. -1975.-Vol. 47.-P. 394- 400.

72. Biological Therapy of Cancer / V. De Vita, S. Hellman, M. Rosenberg // nd Ed. 1995. - Vol. 2. - P. 235- 446.

73. Bendinelli M. Immunomodulation in viral infections: Virus of infection induced / M. Bendinelli // Immunomodulation. New Frontiers and Advances. Plenum Press. N. Y., London. 1984. - P. 161-195.

74. Bowen J. Mitosis and Apoptosis / J. Bowen., S. Bowen., A. Jones // Matters of Life and Death. London: Chapman & Hall, 1998. - 182 p.

75. Cassel W. Newcastle disease virus as an antineoplastic agent / W. Cassel., R. Garrett //Cancer, 1965. Vol. 18. - P. 863-868.

76. Cassel W. A phase II study on the postsurgical management of phase II malignant melanoma with a Newcastle disease virus oncolysate / W. Cassel., D. Murray., H. Phillips // Cancer (Philad.). 1983. -Vol. 52. - P. 856-860.

77. Combination of immunotherapy and chemotherapy to transplantation of methylcholanthrene-induced tumor in WKA rats / E. Gotohda., F. Sendo., M. Hosokawa et al. // Cancer Res. 1974. - Vol. 34. - P. 1947-1951.

78. Combination of immunotherapy and chemotherapy of experimental tumors in rats / M. Hosokawa., F. Sendo., E. Gotohda et al. // GANN. -1971.-Vol. 62.-P. 67-70.

79. Complete regression of human neuroblastoma xenografts in athymic mice after local Newcastle disease virus therapy / R. Lorence., K. Reichard., B. Katubig et al. // J Natl Cancer Inst. 1994. - Vol. 86. - P. 1228-1233.

80. Conditionally replicating herpes simplex virus mutant, G207 for the treatment of malignant glioma: results of a phase I trial / J. Markert., M. Medlock., S. Rabkin et al. // Gene Ther. 2000. - Vol. 7. - P. 867-874.

81. Chase M. An oncolytic viral mutant that delivers the CYP2B1 transgene and augments cyclophosphamide chemotherapy / M. Chase ., R. Chung., E. Chiocca //Nat. Biotechnol. 1998. - Vol. 16. - P. 444- 448.

82. Chiocca E. Oncolytic viruses / E. Chiocca // Nature Publishing Group. 2002. - Vol. 2. - P. 938-949.

83. Christopher J. Cytolytic viruses as potential anti cancer agent / J. Christopher //Journal of General Virology. - 2002.-Vol. 83.-P. 491-502.

84. Chung R. B-Myb promoter retargeting on herpes simplex virus y34.5 gene-mediated virulence toward tumor and cycling cells / R. Chung., Y. Saeki., E. Chiocca //J.Virol. 1999. - V. 73. - P. 7556-7564.

85. Culver K. Gene therapy for cancer / K. Culver., M. Blease // TJG, 1994.-Vol. 10.-P. 88-101.

86. Davis I. An overview of cancer immunotherapy / I. Davis // Immunol. Cell. Biol. 2000. - Vol. 78. - P. 179-195.

87. De Pace N. Sulla scomparsa di un enorme cancro vegetante del collo dell'utero senza cura chirurgica / N. De Pace // Ginecologia. 1912. - Vol. 9. - P. 82-89.

88. Dock G. Rabies virus vaccination in a patient with cervical carcinoma / G. Dock // Am J Med Sci. 1904. - P. 127-563.

89. Dose-related immunologic effect of levamisole in patients with cancer / J.Janic, W.Kopp, J.Smith et al. // J.Clin.Oncol. 1993.-V. 11.- P. 125-135.

90. Duncan M. Differential sensitivity of normal and transformed human cells to reovirus infection / M. Duncan., S. Stanish., D. Cox // J Virol. -1978.-Vol. 28.-P. 444-449.

91. Eaton M. Enhancement of lymphoma cell immunogenicity by infection with non oncogenic virus / M. Eaton., J. Heller., A. Scala // Cancer Res. - 1973.-Vol. 33. -P. 3292-3298.

92. Efficacy of a replicationselective adenovirus against ovarian carcinomatosis is dependent on tumor burden, viral replication and p53 status / C. Heise., I. Ganly., Y.T. Kim et al. // Gene The. 2000. - Vol. 7. -P. 1925-1929.

93. Effective treatment of pancreatic tumors with two multimutated herpes simplex oncolytic viruses / P. McAuliffe., W. Jarnagin., P. Johnson et al. // J. Gastrointest Surg. 2000. - Vol. 4. - P. 580-588.

94. Enhancement of replication of genetically engineered herpes simplex viruses by ionizing radiation: a new paradigm for destruction of therapeutically intractable tumors / S. Advani., G. Sibley., P. Song et al. // Gene Ther. 1998.- Vol. 5. - P. 160-165.

95. Engineered herpes simplex virus expressing IL-12 in the treatment of experimental murine brain tumors / J. Parker., G. Gillespie., C. Love et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97. - P. 2208-2213.

96. Experimental therapy of human glioma by means of a genetically engineered virus mutant / R. Martuza., A. Malick., J. Markert et al. // Science. 1991. - Vol. 252. - P. 854-856.

97. Finlay C. The p53 protooncogene can act as a suppressor of transformation / C. Finlay., P. Hids // Ibid. 1998. - Vol. 57. - P. 244-262.

98. Flanagan A. Propagation of Newcastle disease virus in Ehrlich ascites cells in vitro and in vivo / A. Flanagan., R. Love., W. Tesar // Proc Soc Exp Biol Med. 1955. - Vol. 90. - P. 82-86.

99. Fong L. Dendritic cells in cancer immunotherapy / L. Fong., E. Engleman. //Ann. Rev. Immunol. 2000. - Vol. 18, Palo Alto. - P. 245-273.

100. Galazka K. Apoptosis and proliferative activity in primary gastric lymphoma / K. Galazka., J. Stachura // Virch. Arch. 1999. - Vol. 435.-P. 244-252.

101. Gavilondo I. Human antibodies therapy / I. Gavilondo., J. Larrick., C. Borrebaeck // Immunologist. 2000. - Vol. 8. - P. 58-65.

102. Ghosh J. Inhibition of arachidonate 5-lipoxygenase triggers massive apoptosis in human prostate cancer cells / J. Ghosh., C. Myers // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95. - P. 13182-13187.

103. Goodrum F. p53 status does not determine outcome of E1B 55-kilodalton mutant adenovirus lytic infection / F. Goodrum., D. Ornelles // J Virol. 1998. - Vol. 72. - P. 9479-9490.

104. Gooding L. Regulation of TNF-mediated cell death and inflammation by human adenoviruses / L. Gooding // Infect Agents Dis. -1994.-Vol. 3.-P. 106-115.

105. Hashiro G. The preferential cytotoxicity of reovirus for certain transformed cell lines / G. Hashiro., P. Loh., J. Yau // Arch Virol. 1977. -Vol. 54.-P. 307-315.

106. Herpes simplex virus as an in situ cancer vaccine for the induction of specific antitumor immunity / M. Toda., S.D. Rabkin., H. Kojima et al. // Hum. Gene Ther. 1999.- Vol. 10. - P. 385-393.

107. Hug H. Fas mediated apoptosis in tumor formation and defense / H. Hug //Boil. Chem. - 1997. - Vol. 378. - P. 1405-1412.

108. Inada T. Selective elimination of suppressor T-cells by mouse adenovirus / T. Inada., H. Uatake // Ann. Rep. Inst. Virus Res. Kyoto Univ. 1979.-Vol. 22.-P. 22-24.

109. Inhibition of metastasis in rats immunized with xenogenized autologous tumor cells after excision of the primary tumor / H. Kobayashi., E. Gotohda., M. Hosokawa et al. // J. Nat. Canser Inst. 1975. - Vol. 54. - P. 997-999.

110. Intratumoral recombinant GM-CSF-encoding virus as gene therapy in patients with cutaneous melanoma / M. Mastrangelo., H. Maguire., L. Eisenlohr et al. // Cancer Gene Ther. 1999. - Vol. 6. - P. 409-422.

111. In vivo antitumor activity of ONYX-O15 is influenced by p53 status and is augmented by radiotherapy / K. Rogulski., S. Freytag., K. Zhang et al. // Cancer Res. 2000. - Vol. 60. - P. 1193-1196.

112. Is Nothingham prognostic index correlated with apoptosis and p53 expression in invasive ductal carcinoma of the breast? / E. Candiz — Boduroglu., C. Irkkan., G. Bilir., J. Pak // Virch. Arch. 1999. - Vol. 435. -P. 194-203.

113. Kerr J. Apoptosis. /J. Kerr., A. Wyllii //Brit. J. Cancer. 1972.-Vol.26. - P.239-257.

114. Kirn D. Replicating oncolytic viruses: an overview / D. Kirn // Expert Opin Investig Drugs 1996. Vol. 5. - P. 753-762.

115. Kobayashi H. Xenogenization of tumor eels / H. Kobayashi., E. Gotohda., T. Kodoma // Hokkaido Univ. Med. Libr. Series, Sapporo, 1977. -Vol. 9.-P. 121-124.

116. Kobayashi H. Immunogenicity of viable xenogenized tumor cells // Immunological Xenogenization of Tumor Cells / H. Kobayashi., F. Sendo // GANN Monogr. Cancer Res. 1979. - Vol. 23. - P. 27-39.

117. Kobayashi H. Viral xenogenization in intact tumor cells / H. Kobayashi // Adv. Cancer Res. 1979. - Vol. 30. - P. 279-299.

118. Lindenmann J. Viruses as immunological adjuvants in cancer / J. Lindenmann // Biochem. Biophys. Acta. 1974. - Vol. 355. - P. 49-75.

119. Lindemann J. Iunological aspect of viral oncolysis / J. Lindemann., P. Klein // Recent Results Cancer Res. Berlin. - 1967. - Vol. 9. - P. 81-84.

120. Lindenmann J. Immunogenicity of oncolysates obtained from Ehrlich ascites tumours wih vesicular stomatitis virus / J. Lindenmann // Arch. Virusforsch. 1970. - Vol. 31. - P. 61 -70.

121. Local and systemic therapy of human prostate adenocarcinoma with the conditionally replicating herpes simplex virus vector G207 / J. Walker., K. McGeagh., P. Sundaresan et al. // Hum. Gene Ther. 1999. - Vol. 10. -P. 2237-2243.

122. Loss of pl4ARF in tumor cells facilitates replication of the adenovirus mutant dl 520 (ONIX-O15) / S. Reis., C. Brandts., A. Chung et. al. // Nat. Med., 2000. Vol. 6. - P. 1128-1133.

123. Lotzova E. The role of natural killer cells in immune surveillance against malignancies / E. Lotzova // Cancer Bull. 1984. - Vol. 36. - P. 215226.

124. Marael H. Molecular mechanisms of tumor invasion / H. Marael // Int. J. Cancer. 2002. - Vol. 13. - P. 15-16.

125. Martuza R. Conditionally replicating herpes vectors for cancer therapy /R. Martuza//J Clin Invest. 2000. - Vol. 105. - P. 841-846.

126. Meignier B. In vivo behavior of genetically engineered herpes simplex viruses R7017 and R7020: construction and evaluation in rodents / B. Meignier., R. Longnecker., B. Roizman // J Infect Dis. -1998. Vol. 158.-P. 602-614.

127. Mullen J. Viral oncolysis / J. T. Mullen., K. K. Tanabe // The Oncologist.-2002.-Vol. 7.-P. 106-119.

128. Nakamura H. Regulation of herpes simplex virus y (1)34.5 expression and oncolysis of diffuse liver metastases by Myb34.5 / H. Nakamura // J. Clin. Invest. 2002. - V. 109. - P. 871-882.

129. Newman W. Virus treatment in advanced cancer / W. Newman., C. Southam // Cancer. 1954. - Vol. 7. - P. 106-118.

130. Newcastle disease virus selectively kills human tumor cells / K. Reichard., R. Lorence., C. Cascino et al. // J Surg. Res. 1992. - Vol. 52. -P. 448-453.

131. Oncolytic virus therapy of multiple tumors in the brain requires suppression of innate and elicited antiviral responses / K. Ikeda., T. Ichikawa., H. Wakimoto H. et. al. //Nat. Med. 1999. - Vol. 5. - P. 881-887.

132. Oncolytic potentials of nonhuman viruses for human cancer. II. Effect of five viruses on heterotransplanted human tumors / D. Yohn., W. Hammon., R. Atchinson et. al. // J. Nat. Cancer Inst. 1968. - Vol. 41. - P. 523-529.

133. Orlov S. et. al. // Biochem. Biophis. Res. Commun. 1996. - Vol. 221.-P. 708-715.

134. Pecora A. An intravenous phase I trial of a replication-competent virus, PV701, in the treatment of patients with advanced solid cancers / A. Pecora, N. Rizvi, G. Cohen // Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 2001. - Vol. 20. - P. 1009-1015.

135. Phase II trial of intratumoral administration of ONYX-O15, a replication-selective adenovirus, in patients with refractory head and neck cancer / J. Nemunaitis., F. Khuri ., I. Ganly et al. // J Clin. Oncol. 2001. -Vol. 19.-P. 289-298.

136. Phylchenkov A. Apoptosis: short history, molecular mechanisms, methods of detection and possible significance in oncology / A.

137. Phylchenkov., R. Stoika // Experimental Oncology. -1996. Vol. 18. - P. 435-448.

138. Pinkoski M. Cloak and dagger in the avoidance of immune surveillance / M. Pinkoski., D. Greene // Curr. Opin. Genetics & Development. 2000. - Vol. 10. - P. 114-119.

139. Prager M. Methods for modification of cancer cells to enhance their antigenicity / M. Prager., F. Baechtel //Meth. Cancer Res. 1973. - Vol. 9.-P. 339-400.

140. Prevention of syngeneic tumor growth in vaccinia virus primed mice by immunization with vaccinia virus-modulated tumor cells / K. Wu., S. Ueda., Ii. Sakaue et al. //Bikens J. 1981. - Vol. 24. - P. 153-158.

141. Prognostic significance of spontaneous apoptosis, p53 atatus and bcl -2 expression in ovarian carcinomas / F. Torre., C. Esteban., J. Castellvi et al. // Virch. Arch. 1999. - Vol. 435. - P. 231-245.

142. Prostate attenuated replication competent adenovirus (ARCA) CN706: a selective cytotoxic for prostate-specific antigen-positive prostate cancer cells / R. Rodriguez., E. Schuur., H. Lim et al. // Cancer Res. 1997. - Vol. 57. - P. 2559-2563.

143. PV701, a naturally attenuated strain of Newcastle disease virus, has a broad spectrum of oncolytic activity against human tumor xenografts / M. Roberts., P. Buasen., B. Incao et al. // Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 2001. -Vol. 42.-P. 2441-2465.

144. Reovirus therapy of tumors with activated Ras pathway / M. Coffey., J. Strong., P. Forsyth et al. // Science. 1998.- Vol. 282. - P. 1332-1334.

145. Reovirus therapy of metastatic cancer models in immune-competent mice / K. Hirasawa., C. Yoon., S. Nishikawa et al. // Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 2001. - Vol. 42. - P. 2437-2459.

146. Replication-competent, nonneuroinvasive genetically engineered herpes virus is highly effective in the treatment of therapy-resistant experimental human tumors / S. Advani., S. Chung., S. Yan et al. // Cancer Res. 1999. - Vol. 59. - P. 2055-2058.

147. Restifo N. Cancer vaccines / N. Restifo., M. Sznol // Cancer: Principles & Practice of Oncology, 5th ed. / Eds. V.DeVita, S. Hellman, S. Rosenberg.-Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers. 1997. - P. 30233043.

148. Rosenberg S. Principles of cancer manegement: biologic therapy / S. Rosenberg // Ibid. P. 349-373.

149. Replication of ONYX-O15, a potential anticancer adenovirus, is independent of p53 status in tumor cells / T. Rothmann., A. Hengstermann., N. Whitaker et al. // J Virol. 1998. - Vol. 72. - P. 9470-9478.

150. Schuepback J. Early antiviral antibody response after immunization with viral oncolysates. A powerful prognostic marker for myelogenous leukemia remission patients / J.Schuepback // Blood. 1983. - Vol. 62. - P. 616-623.

151. Selectivity of a replication-competent adenovirus for human breast carcinoma cells expressing the MUC1 antigen / T. Kurihara., D. Brough., I. Kovesdi et al. //J Clin Invest. 2000. - Vol. 106 - P. 763-771.

152. Serological response of melanoma patients to vaccines prepared frem VSV lysates of autologous and allogeneic cultured melanoma cells / P. Livingston., A. Albino., T. Chung et al. // Cancer (Philad.). 1985. - Vol. 55. -P. 713-720.

153. Shtrichman R. Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells / R. Shtrichman., T. Kleinberger // J Virol. 1998. - Vol. 72 . - P. 2975-2982.

154. Sinkovics G. Onkolytik viruses and viral oncolytes / G. Sinkovics // Ann. Immunol. Hungarcae. 1986. - Vol. 26. - P. 210-240.

155. Sinkovics J. New developments in the virus therapy of cancer: a historical review / J. Sinkovics., J. Horvath // Intervirology.- 1993. Vol. 36.-P. 193-214.

156. Southam C. Pathogenicity and oncolytic capacity of RI virus strain RI-67 in man. /C. Southam., M. Hilleman., J. Werner // Trans NY Acad. Sci. 1960. - Vol. 22. - P. 657-673.

157. Studies on the use of viruses in the treatment of carcinoma of the cervix / R. Smith., R. Huebner., W. Rowe et al. // Cancer . 1956. - Vol. 9. -P. 1211-1218.

158. Svet-Moldavsky G. Quantitative relationships in viral oncolys and the possibility of artificial heterogenization of tumors / G. Svet-Moldavsky., V. Hamburg //Nature.- 1974.- Vol. 202.- P. 303-304.

159. Svet-Moldavsky G. Artificial heterogenization of tumours: general outline new approaches / G. Svet-Moldavsky // Immunological Xenogenization of Tumor Cells: GAAN Monog. Cancer Res. 1979. - Vol. 23.-P. 12-25.

160. The E3-11.6-kDadenovirus death protein (ADP) is required for efficient cell death: characterization of cells infected with adp mutants / A. Tollefson., J. Ryerse., A. Scaria et al. // Virology. 1996. - Vol. 220. - P. 152-162.

161. The addition of adenovirus type 5 region E3 enables Calydon virus 787 to eliminate distant prostate tumor xenografts / D. Yu., Y. Chen., M. Seng et al. // Cancer Res. 1999. Vol. 59. - P. 4200- 4203.-T cJj,. ¿7- SX

162. Toda M. Treatment of numan breast cancer in a brain metastatic model by G207, a replication-competent multimutated herpes simplex virus 1 / M. Toda., S. Rabkin., R. Martuza // Hum Gene Ther. 1998. - vol. 9. -P. 2177-2185.

163. Treatment of intracranial gliomas in immunocompetent mice using herpes simplex viruses that express murine interleukins / S. Andreansky., He B, van Cott J. et al. // Gene Ther. 1998. - Vol. 5. - P. 121-130.

164. Vile R. Tumor vaccines / R. Vile., B. Souberbielle., A. Dalgleish // Immnotherapy in Cancer / Eds. Gore M., Riches P. London, 1996. -P.

165. Murray., W. Cassel., A. Torbin et al.//Clinical studies//Cancer (Philad.). Vol. 40. - P. 680-686.

166. Virus- modified homologous tumor cell extract in the treatment of vulvar carcinoma / R. Freedman., J. Bowen., J. Herson et al. // Cancer Immunol. Immunother. - 1980. - Vol. 8. - P. 33-38.

167. Wallack M. Vaccinia virus augmented tumor vaccines as a form of immunotherapy / M. Wallack // Immunological Xenogenization of Tumor Cells: GANN Mongr. Cancer Res. 1979. - Vol. 23. - P. 273-284.

168. Wallack M. Specific immunotherapy with vaccinia oncolysates / M. Wallack// Cancer Immun. Immunother.- 1981. -Vol. 12. P. 1- 4.

169. Yew P. Inhibition of p53 transactivation required for transformation by adenovirus early E1B protein / P. Yew., A. Berk // Nature. 1992. - Vol. 357. - P. 82-85.157.191.

170. Viral oncolysates in the management of malignant melanoma. II / D.