Основные факторы, управляющие кальциевыми каналами L-типа в кардиоцитах гомойотермных и пойкилотермных животных тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат физико-математических наук Гриченко, Алексей Станиславович

• Гриченко, Алексей Станиславович
• кандидат физико-математических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Гриченко, Алексей Станиславович

1 Введение.

2 Обзор литературы.

2.1 Типы Са2+-каналов и их классификация.

2.2 Структура потенциалзависимых Са2+-каналов.

2.3 Электрические и кинетические характеристики кальциевых токов.

2.4 Рецепторзависимая регуляция кальциевых токов L-типа.

2.5 Роль фосфорилирования в регуляции кальциевого тока L-типа.

2.6 Зимняя спячка — адаптация организма к экстремальным условиям

2.7 Метод перфорированного пэтча.

2.7.1 Свойства перфорирующих соединений.

2.7.2 Особенности заполнения пипеток.

2.7.3 Преимущества методики перфорируемого пэтча.

2.7.4 Ограничения методики перфорированного пэтча.

3 Материалы и методы исследования.

3.1 Метод выделения кардиоцитов.

3.2 Контроль качества кардиомиоцитов.

3.2.1 Морфологический контроль.

3.2.2 Толерантность кардиомиоцитов к ионам Са2+.

3.2.3 Контроль потенциала покоя и потенциала действия.

3.3 Метод перфорированного пэтча.

3.3.1 Растворы.

3.3.2 Приготовление и заполнение пипеток.

3.3.3 Регистрация токов.

3.3.4 Выделение Са2+-компоненты входящего тока у крыс и сусликов.

3.4 Математическая обработка результатов.

3.4.1 Статистический анализ.

3.4.2 Методы аппроксимации данных.

4 цАМФ-зависимая и цАМФ-независимая регуляция Са2+-токов.

4.1 Потенциалзависимость действия изопротеренола на Са2+-токи L-типа

4.2 Обращение действия изопротеренола ацетилхолином: за и против.

4.3 Независимость механизмов регуляции Са2+-токов изопротеренолом и BAY К 8644.

4.4 Особенности регуляции кальциевого тока у гибернирующих животных

Двухцентровая модель фосфорилирования Са2+-канала.

5.1 Описание модели.

5.2 Анализ действия изопротеренола с использованием двухцентровой модели Са2+-канала.

5.3 Попытка анализа двойственного действия BAY К 8644.

5.4 Кинетические характеристики Са2+-тока L-типа в кардиоцитах крыс.

5.5 Анализ изменений, происходящих в кардиоцитах гибернирующих животных во время цикла спячка-бодрствование.

Выводы.

Список основных сокращений и обозначений

ACh ацетилхолин

BAY BAY К

Iso изопротеренол

РКА протеинкиназа А

РКХ протеинкиназа X

РР1 протеинфосфатаза

РР2А протеинфосфатаза 2А

АТФ аденозин-5'-трифосфат

АЦ аденилатциклаза

ГДФ гуанозин-5-дифосфат

ГТФ гуанозин-5'-трифосфат

ДГП дигидропиридины цАМФ циклический аденозин-5-монофосфат

Са2+]0 внеклеточная концентрация Са2+

Ca2+]i внутриклеточная концентрация Са2+

V потенциал, тестовый потенциал

V], поддерживаемый потенциал d, f переменные активации и инактивации Са2+-тока gca максимальная Са2+ проводимость

Vc;i, Vrev потенциал реверсии Са2+-тока

Со, Сд, Сх, Сах состояния Са -канала и доля каналов в соответствующем состоянии

Кд, Кх константы равновесия реакций фосфорилирования центров А и X lea интегральный Са2+-ток

Ia, Ix, 1ах удельные токи через каналы в соответствующем состоянии

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Основные факторы, управляющие кальциевыми каналами L-типа в кардиоцитах гомойотермных и пойкилотермных животных»

Потенциалзависимые Ca -каналы L-типа играют ключевую роль в регуляции частоты и силы сердечных сокращений, генерации потенциалов действия, выбросе нейротрансмиттеров, модуляции нейронной активности (McDonald et al., 1994). В свою очередь, активность этих каналов регулируется большим количеством физико-химических факторов различной природы. К важнейшим из этих факторов можно отнести фосорилирование канала1. В частности, эффект многих гормонов и нейротрансмиттеров связан с изменением активности протеинфосфатаз и протеинкиназ, увеличением или уменьшением количества фосфорилированных каналов и, как следствие, ростом или падением кальциевого тока, протекающего через данные каналы, за счет изменения вероятности открывания одиночного канала или числа активных каналов. Например, увеличение токов L-типа агонистами ß-адренорецепторов опосредуется ростом активности цАМФ-зависимой протеинкиназы (Hartzell et al., 1991), а подавление тех же токов агонистами М-холинорецепторов — активацией соответствующей протеинфосфатазы (Herzig et al., 1995). Наличие сложной системы регуляции каналов L-типа приводит к тому, что действие даже хорошо изученных соединений оказывается иногда непредсказуемым, зависящим от различных внешних факторов (температура, pH, потенциал на мембране, частота стимуляции и т.п.). Так изменение поддерживаемого на мембране потенциала (Vh) сильно влияет на подавление токов ацетилхолином (McMorn et al., 1996) и их активацию изопротеренолом (Tiaho et al., 1991). Дигидропиридиновый агонист BAY К 8644 при деполяризации мембраны превращается из мощного активатора тока в блокатор (Hadley and Lederer, 1992). Внутриклеточный кальций в низких концентрациях действует как активатор каналов L-типа, но блокирует их при повышении концентрации (Hirano and Hiraoka, 1994). Подобная зависимость направления эффекта от концентрации наблюдается и в случае ингибиторов фосфатаз в гладкомышечных клетках (Obara and Yabu, 1993). Приведенные примеры показывают, что для адекватной интерпретации свойств того или иного регулятора кальциевого тока необходимо учитывать множество факторов, влияющих на активность каналов. В большинстве случаев эта задача решается детальным анализом действия того или иного

1 Под фосфорилированием канала здесь и далее подразумевается фосфорилирование не только белков, непосредственно образующих канал, но и, возможно, различных структур, тесно связанных с каналом и влияющих на его свойства. соединения в различных условиях как самостоятельно, так и совместно с другими регуляторами.

Многообразие путей регуляции Са2+-токов L-типа определяется, в основном, двумя свойствами канала. Прежде всего, канал может находиться в одной из нескольких стабильных (с временами жизни порядка секунд) конформаций с различной быстрой (миллисекундной) кинетикой открываний и закрываний (т.н. моды канала) (Hess et al., 1984). Обычно рассматривают одну неактивную моду (0) и две активных (1 и 2). Некоторые авторы вводят в рассмотрение дополнительную активную моду la (Yue et al., 1990). Скорости перехода канала между различными модами зависят от различных внешних факторов, таких как потенциал, внутриклеточная концентрация кальция, влияние регуляторных соединений и т.п. Наличие нескольких активных мод означает, что популяция каналов в мембране неоднородна и может быть разделена на несколько групп, включающих каналы, находящиеся в одном состоянии. При этом токи, протекающие через различные группы каналов, обладают разными амплитудными и кинетическими характеристиками. Следует учитывать, что измеряемый экспериментально суммарный Са2+-ток L-типа является суммой токов, протекающих через каналы каждой группы, что часто затрудняет интерпретацию результатов экспериментов.

Второе важное свойство каналов L-типа — наличие нескольких центров фосфорилирования (McDonald et al., 1994). Для каналов в кардиоцитах известно, по крайней мере, два различных центра, фосфорилирование которых влияет на характеристики тока. Принято считать, что фосфорилирование одного из этих центров переводит канал из неактивного состояния в активное (чувствительное к изменениям потенциала), а фосфорилирование второго центра увеличивает вероятность нахождения канала в открытом состоянии.

Целью данной работы стали исследование системы фосфорилирования канала L-типа и влияния на нее мембранного потенциала, разработка и анализ модели, объясняющей ряд парадоксальных свойств канала, а также выявление и анализ изменений в системе фосфорилирования канала, происходящих при входе в состояние гибернации.

2 Обзор литературы