Кальциевые каналы низкой проводимости в плазматической мембране макрофагов: Активация инозитол (1,4,5)-трифосфатом тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Семенова, Светлана Борисовна

• Семенова, Светлана Борисовна
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Семенова, Светлана Борисовна

Содержание

Введение (4)

1. Обзор литературы (8)

1.1. Роль инозитол (1,4,5)-трифосфата в передаче внутриклеточного сигнала (8)

1.2. Структура и функции рецептора 1Р3 (10)

1.2.1. Локализация и типы рецептора 1Рз (10)

1.2.2. Молекулярная структура 1Рз-рецептора (12)

1.2.3. Функциональные свойства Са2+-канала рецептора IP3 (14)

1.3. Са2+ вход в клетку, индуцированный инозитол (1,4,5)-трифосфатом (17)

О 4-

1.3.1.1Р3-активируемые Са -каналы в плазматической мембране клеток (18)

1.3.2. Вход Са2+ в клетку, активирующийся после опустошения Са2+ депо (19)

1.3.2.1 Потенциал-зависимость, селективность и

проводимость тока, активируемого опустошением Са2+-

депо (Icrac) (21)

1.3.3. Модели «депо-зависимого» кальциевого входа (25)

1.3.3.1. Модели с участием водорастворимых факторов (26)

1.3.3.2. Конформационная модель взаимодействия «coupling model» (28)

1.4. Арахидоновая кислота - модулятор внутриклеточных процессов (35)

1.4.1. Механизмы образования свободной арахидоновой кислоты

(36)

1.4.2. Роль арахидоновой кислоты в регуляции ионных каналов и внутриклеточного Са2+ (38)

2. Материалы и методы исследования (43)

2.1. Клетки (43)

2.2. Флуоресцентные измерения цитоплазматического Са (43)

2.3. Регистрация ионных токов и обработка данных (43)

2.4. Растворы (45)

3. Результаты исследования (46)

3.1. Активация входа Са2+ в клетку при действии уридинтрифосфата (11ТР) (46)

3.2. Активация ионных токов в ответ на приложение 1Рз (48)

3.3. Прямое воздействие 1Р3 на ионные каналы (53)

2+

3.4. 1Рз-зависимая инактивация Са -каналов (55)

3.5. Зависимость ЫР0 каналов от концентрации 1Р3 (58)

3.6. Механизмы модуляции 1Рз-активируемых Са2+ каналов (59)

3.7. Са2+ каналы, активируемые в условиях нативной клетки при действии иТР (62)

4. Обсуждение результатов (66)

4.1.Заключение (73) Выводы (75) Список литературы (77)

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АТР - аденозин 5'-трифосфат

[Ca2+]j - концентрация свободного цитоплазматического кальция

DAC - каналы активируемые опустошением депо

GDP - гуанозин 5'-дифосфат

GTP - гуанозин 5'-трифосфат

GTPyS - гуанозин 5'-0-тиотрифосфат

Лжас - ток через каналы, активируемые выбросом кальция

1Р3 - инозитол (1,4,5)-трифосфат

IP3R - рецептор 1Р3

NP0 - вероятность открытого состояния канала

PLA2 - фосфолипаза А2

PLC - фосфолипаза С

TG - тапсигаргин

UTP - уридин 5'-трифосфат

АК - арахидоновая кислота

4-БФБ - 4-бромфенацилбромид

CP - саркоплазматический ретикулум

ЭР - эндоплазматический ретикулум

ЭФР - эпидермальный фактор роста

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Кальциевые каналы низкой проводимости в плазматической мембране макрофагов: Активация инозитол (1,4,5)-трифосфатом»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Одним из первичных и общих для всех типов клеток ответов на внеклеточную стимуляцию является повышение концентрации ионов Са2+ в цитозоле, реализующееся как высокоорганизованный в пространстве и времени кальциевый сигнал, наименее ясным звеном которого остается рецептор-индуцированный

9 4-

вход ионов Са , сопровождающий выброс кальция из внутриклеточных депо.

Известно, что выброс С а из депо осуществляется после связывания инозитол (1,4,5)-трифосфата (1Рз) с рецептором (IP3R), расположенным в мембране эндоплазматического ретикулума. 1Р3

мобилизует Са2 из ретикулума, увеличивая концентрацию свободного

2+

внутриклеточного Са в цитозоле ([Са ]¡) как за счет опустошения

гл 2+

кальциевых депо, так и за счет последующей активации входа Са из наружной среды в клетку. Существуют экспериментальные данные о том, что 1Рз-зависимый вход Са2+ опосредуется особым типом высокоселективных Са2+-каналов низкой проводимости, активация которых регулируется состоянием Са2+-депо, которые по мере их опустошения от кальция посылают сигнал к плазматической мембране клеток и запускают его вход внутрь клетки -«емкостная модель» входа Са [Putney 1990; Putney, Bird 1993]. В пользу этой модели свидетельствуют данные о регистрации кальциевых токов (7сгас) в условиях принудительного опустошения внутриклеточных кальциевых хранилищ [Hotli., Penner 1993; Luckhoff , Clapham 1994]. Природа сигнала, поставляющего к мембране сведения о степени заполнения депо Са2+, неизвестна и остается предметом дискуссий. В качестве возможных причин рассматриваются как формирование некоего водорастворимого мессенджера [Parekh, Terlau 1993], так и передача сигнала благодаря конформационным изменениям IP3R и прямому взаимодействию его с кальциевыми каналами, расположенными в

плазматической мембране - «конформационная» модель (coupling model) [Berridge, 1995]. Свойства токов, активируемых выбросом кальция -«Са2+ release-activated current» - CRAC [Hoth, Penner, 1992] в значительной степени охарактеризованы: они высокоселективны для Са2+, усиливаются при гиперполяризации мембраны, имеют четко выраженную зависимость от внутриклеточного Са2+ и обладают уникально низкой проводимостью (от фСм до 1 пСм), вследствие чего их идентификация на уровне измерений токов через одиночные каналы признана невозможной. Основным аргументом "депо-зависимости" CRAC-каналов являются данные о том, что их активация возможна при опустошении кальциевых депо путем ингибирования эндосомальных АТФаз, без повышения концентрации 1Р3. С другой стороны появляются новые данные о способности 1Р3 непосредственно активировать Са2+-переносящие каналы в плазматической мембране со свойствами подобными CRAC-каналам [Kiselyov et al., 1997]. Свойства CRAC каналов, связь между процессами опустошения Са2+ депо и запуском Са2+ входа, участие в этом процессе активации рецептора 1Р3, взаимодействие IP3R и кальций-переносящих каналов - это основные проблемы кальциевой сигнализации. Исследование функциональных характеристик 1Р3-чувствительных кальциевых каналов в плазматической мембране и механизмов их регуляции позволит решить вопрос о ключевых звеньях в формировании кальциевого ответа клетки на стимуляцию рецепторов кальций-мобилизующими агентами (гормонами, ростовыми факторами и пр.).

Цели и задачи исследования. Цель данной работы состояла в исследовании участия в кальциевом сигнале Са2+-переносящих ионных каналов, способных непосредственно активироваться инозитол (1,4,5)-трифосфатом (IP,) и обеспечивать вход Са во время ответа клетки на рецепторный стимул.

Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить возможность 1Р3-зависимой активации кальций-переносящих

каналов в клетках перитонеальных макрофагов мыши.

2. Определить основные биофизические характеристики 1Р3-чувствительных каналов: проводимость, селективность по отношению к двухвалентным и одновалентным катионам, зависимость от мембранного потенциала.

3. Исследовать зависимость активности каналов от концентрации 1Р3.

4. Исследовать влияние на активность 1Р3-чувствительных кальциевых каналов блокаторов 1Р3-рецепторов эндоплазматического ретикулума - гепарина и арахидоновой кислоты.

5. Определить механизмы активации и регуляции исследуемых каналов.

Научная новизна исследования. Впервые описаны кальциевые каналы в мембране перитонеальных макрофагов мыши, активирующиеся непосредственно инозитол (1,4,5)-трифосфатом (1Р3) с цитоплазматической поверхности мембранного фрагмента.

Установлено, что исследуемые каналы высоко селективны для Са2+, имеют уникально низкую проводимость; характеризуются повышением активности при гиперполяризации мембраны. Эти свойства сближают идентифицированные в плазматической мембране макрофагов каналы с каналами, чувствительными к опустошению внутриклеточных Са депо (CRAC каналами). Определены рецепторные характеристики этих каналов: дозо-зависимость эффекта 1Р3,1Р3-зависимая десенситизация рецептора, ингибирование гепарином, ингибирующее влияние арахидоновой кислоты. Сходства рецепторных характеристик исследуемых каналов с известными свойствами рецептора 1Р3 эндоплазматического ретикулума позволяют предполагать возможность регуляции обнаруженных каналов через активацию этого рецептора.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты важны для понимания сложного механизма регуляции поступления Са2+ в клетку и роли инозитол (1,4,5)-трифосфата в этом процессе. Анализ полученных результатов свидетельствует в пользу справедливости конформационной модели передачи сигнала при запуске рецептор- управляемого входа ионов Са2+ в невозбудимых клетках. Выяснение биохимических и биофизических механизмов рецептор-зависимой передачи кальциевого сигнала, запускающего основные физиологические функции, приведет к решению таких проблем как нарушение дифференцировки, пролиферации, секреции и других жизненно важных функций живой клетки.

1. Обзор литературы.

1.1. Роль инозитол (1,4,5)-трифосфата в передаче внутриклеточного сигнала.

Среди первых работ, показавших участие мембранных фосфолипидов в образовании вторичных мессенджеров, следует отметить работу Мичела [Michell, 1982]. Он выдвинул предположение о том, что стимулированное нейротрансмиттерами увеличение внутриклеточного Са2+ сопровождается гидролизом инозитол-содержащего липида фосфотидилинозитол 4,5-дифосфата (PIP2). И, уже в 1983 году Стреб с соавторами показали, что инозитол (1,4,5)-трифосфат (1Р3), являющийся продуктом рецептор- активированного гидролиза PIP2, участвует как вторичный мессенджер в образовании Са2+ сигнала. В опытах на пермеабилизованных клетках поджелудочной железы аппликация 1Р3 вызывала быстрое высвобождение Са2+ из внутриклеточных хранилищ в цитоплазму [Streb, Irvin, 1983]. Взрыв последовавших вслед за этим научных исследований показал всю важность этого открытия. Было продемонстрировано, что 1Р3-зависимый

/-1 2+ U к*

Ca сигнал опосредует действие гормонов, неиротрансмиттеров, ростовых факторов и других биологически активных веществ, которые регулируют такие жизненно важные процессы клетки, как мышечное сокращение, клеточный метаболизм и секрецию, а также рост клеток, их дифференцировку и пр. На нервной ткани было показано, что активация рецепторов (для глутамата, ацетилхолина, серотонина, брадикинина) и других, связанных с G-белками, приводит к образованию IP3 [Fisher, Agranoff, 1987; Fisher, et al., 1990].

Сейчас известно, что образование 1Р3 является ключевым событием в цепи двух путей клеточной сигнализации, один из которых берет начало со стимуляции рецепторов, связанных с G-белками, активирующихся ацетилхолином, гистамином, брадикинином,

глутаматом, вазопрессином, ATP, и т.д., другой - с активации рецепторов с тирозинкиназной активностью, к которым относятся ростовые факторы, такие как фактор роста тромбоцитов (PDGF), эпидермальный фактор роста (EGF) и пр. Эти отдельные рецепторные механизмы, используя энергию GTP или АТР, объединяются в конечном итоге в единый, который активирует фосфолипазу С (PLC).

В результате активации рецептора, связанного с G-белком, GDP, связанный с сс-субъединицей, заменяется на GTP и гетеротримерный G-белок диссоциирует с образованием Ga и Gpy субъединиц одна и другая из которых может активировать различные изоформы фосфолипазы С (PLC).

Другой путь клеточной сигнализации, осуществляющий высвобождение 1Рз, начинается с активации тирозинкиназного рецептора, который передает информацию через прямую связь с у-формой PLC. Ростовые факторы соединяют два рецептора вместе, их киназные цитоплазматические домены при этом фосфорилируют друг друга по тирозиновому остатку, образуя место для связывания с PLC-yl. В не стимулированных клетках PLC- yl находится в цитозоле, но переходит в мембранносвязанную форму сразу же после того как ее SH2 домен связывается с активированным рецептором. Активированная PLC гидролизует мембраносвязанный фосфолипид - фосфотидилинозитол 4,5- дифосфат (PIP2), в результате чего образуется водорастворимый посредник инозитол (1,4,5)-трифосфат и диацилглицерол (DAG). И 1Р3 и DAG являются в клетке вторичными мессенджерами, 1Р3 увеличивает внутриклеточную концентрацию Са в клетке, DAG активирует протеинкиназу С.

1Р3-вызванная мобилизация Са , включает два основных процесса:

л ,

1) - это быстрое (сек) высвобождение Са из внутриклеточных кальций содержащих пулов в ответ на связывание 1Р3 с рецепторами, расположенными в мембранах эндоплазматического ретикулума или

2+

кальциосомах и 2) - более продолжительная фаза входа Ca снаружи внутрь клетки. В то время как механизм выброса Са2+ из внутриклеточных депо хорошо изучен; рецептор, связывающий 1Р3 и одновременно являющийся каналом, проводящим Са2+, клонирован, изучена его молекулярная структура и механизмы регуляции, вторая фаза Са2+ ответа - 1Рз-зависимый вход внеклеточного Са2+ остается малопонятным процессом и, несмотря на усилия многих научных лабораторий, работающих в этом направлении, вызывает на сегодняшний день наибольшее количество споров и противоречивых толкований

1.2. Структура и функции рецептора IP3. 1.2.1. Локализация и типы рецептора IP3.

При проведении экспериментов по связыванию радиоактивного 1Р3 наибольшая плотность рецепторов IP3 (IP3R) была обнаружена в различных отделах мозга, в особенности, в мозжечке [Worley et al., 1987а; Worley et al., 1987b]. Специфическое связывание радиоактивного 1Рз было также показано при работе с микросомами периферических тканей, однако плотность рецепторов оказалась в среднем в 100 раз меньше. IP3R найдены во фракциях гладких мышц [Chadwick et al., 1990], печени [Pietri et al., 1990], коре надпочечников [Guillemette et al., 1990] и ооцитах [Parys, et al., 1992]. Многочисленные наблюдения IP3-индуцированного выброса Ca2+ из внутриклеточных депо в различных типах клеток позволили расширить этот список еще дальше.

Использование методики связывания с радиоактивным IP3 в качестве специфического маркера позволило осуществить выделение IP3R в виде индивидуального белка. В настоящее время рецептор IP3 выделен и очищен из клеток мозжечка, гладкомышечных клеток, и тромбоцитов. Очищенный рецептор является гликозилированным протеином (гликопротеином). Методами молекулярного клонирования

было обнаружено существование трех изоформ 1РзЯ, кодируемых разными генами. Это изоформа 1 (ТигшсЫ & а1., 1989; М1§пегу е1 а1., 1990], изоформа 2 [БисШоГ & а1„ 1991; Уатато1о-Нто а1., 1994;], изоформа 3 1Р3Я [В1оп<1е1, Таке(1а, 1993; Yamamoto-Hino & а1., 1994].

Среди других типов рецепторов 1Рз, изоформа 1 является наиболее распространенной, она состоит из 2749 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 313 к Да. Структурно и функционально она разделяется на три части: лиганд связывающий ТЧН2-концевой домен занимающий примерно 24 % молекулы; СООН-концевой участок, формирующий Са2+-канал; и домен расположенный между двумя концевыми участками (около 60 %), обеспечивающий сопрягающую и модулирующую функцию между ними [М^пегу, БисШоГ 1990].

Изоформа 2 рецептора ГРз состоит из 2701 аминокислотных остатка и имеет молекулярную массу 307 кДа, 68 % процентов ее последовательности тождественны изоформе 1 1РзЫ [БисИк^ et а1., 1991]. Изоформа 3 1Р3Я состоит из 2670 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 304 кДа, 62 % и 64 % её аминокислотной последовательности тождественны изоформе 1 и изоформе 2 рецептора 1Р3, соответственно [ТататоШ-Нто & а1., 1994]. Лиганд-связывающий домен является наиболее консервативным участком молекулы рецептора, в то время как сопрягающий домен является менее консервативным, что предполагает различие в регуляции этих трех изоформ 1Р3 Я.

Наибольшая плотность изоформы 1 1Р3Я найдена в клетках Пуркинье и поэтому основные молекулярные свойства были изучены у рецептора из клеток мозжечка, кроме того изоформа 1 была обнаружена в обонятельных нейронах, в коре головного мозга, в некоторых клетках гиппокампа [ТшшсЫ, Бшоп-СЬагойев, 1993], а также в гладкомышечных клетках, тромбоцитах и многих других, но в небольших количествах [№\у!:оп е1 а1., 1994]. Изоформа 2 и изоформа 3 1Р3Я имеют гораздо меньшее распространение. Методом

иммуноблоттинга было показано, что изоформа 2 экспрессируется в клетках печени, поджелудочной железы, легкого, селезенки и в небольших количествах в клетках мозга, включая мозжечок. Изоформа 3 экспрессируется в клетках поджелудочной железы, легкого, почек, мозга.

В основном, все изоформы рецепторов 1Р3 экспрессируются в разной степени в клеточных линиях независимо от их происхождения. [Newton et al., 1994; Wojcikiewicz, 1995].

1.2.2. Молекулярная структура 1Р3-рецептора.

Данные электронной микроскопии [Chadwick et al., 1990], метода поперечных сшивок [Maeda et al., 1991], центрифугирования в градиенте плотности сахарозы [Mignery et al., 1989] показали, что комплекс рецептора/канала 1Р3, так же как и рианодиновый рецептор (RyR), образует тетрамеры из четырех нековалентно связанных субъединиц, которые объединяются, формируя IP3-активируемый Са2+ канал. Каждая субъединица связывает одну молекулу 1Р3, а тетрамерный рецепторный комплекс может связать четыре молекулы. Однако, ни само связывание, ни открывание канала не являются кооперативным процессом: как в измерениях связывания меченого лиганда [Worleyet et al., 1987; Chadwick et al., 1990], так и в исследованиях зависимости вероятности открытого состояния канала от концентрации IP3 [Ehrlich, Watras, 1988]; коэффициенты Хилла были найдены равными или близкими 1. Использование моноклональных антител показало, что NH2-KOHeu белка рецептора IP3 обращен в цитоплазму и около 650 его аминокислотных остатков участвуют в связывании IP3. Центр связывания 1Р3 находится между 226 и 578 аминокислотными остатками, где основные аминокислоты (Arg-265, Lys-508, Arg-511) сохраняются среди всех подтипов рецептора IP3 [Yoshikawa et al., 1996].

Клонирование рецептора привело к созданию его структурной модели. Считается, что каждая из субъединиц рецептора имеет от 6 [УоэЫка^/а е1 а1., 1992] до 8 [М^пегу, БисИю^ 1990] гидрофобных трансмембранных сегментов, которые объединяются в мембране эндоплазматического ретикулума, формируя Са2+-канал.

Делеция транс-мембранных участков с СООН-конца 1Р3-рецептора мозжечка приводила к синтезу растворимого рецепторного белка, который эффективно связывал 1Р3, но не образовывал тетрамеры, а оставался мономерным. Это привело к предположению о том, что тетрамерный ком-плекс рецептора 1Р3 образуется в результате взаимодействия трансмембранных участков субъединиц [М1§пегу, 8шШо£ 1990].

Ligand binding

Coupling or modulatory

Ca2+ channel

NH2-I

COOH

SI

S2

.Ml M2 M3 M4 M5 pore M6,

Tiansmembrane-soanninc sccmenls

Рис.1. Схема строения одной из 4-х субъединиц рецептора 1Р3 эндоплазматического ретикулума (по Yoshida, Imai, 1997; с сокращением) .

ИНг-концевой участок имеет место для связывания с IP3, СООН-концевой участок имеет гидрофобные фрагменты (Ml - Мб), которые формируют Са2+-канал в мембране эндоплазматического ретикулума, между ними участок, осуществляющий сопрягающие и модулирующие функции рецептора IP3. S1 и S2 - участки сплайсинга.

Структурные особенности домена, отделяющего лиганд-связывающий участок, локализованный на ]ЧН2-конце каждой субъединицы, от образующих Са2+ канал трансмембранных участков обусловлены его регуляторными функциями. Он содержит места для связывания таких модуляторов ионных каналов как АТР, Са2+, кальмодулина и места для

фосфорилирования протеинкиназами, включая сАМР-зависимую протеинкиназу (РКА), cGMP- зависимую протеинкиназу (PKG), РКС и Са2+-кальмодулин-зависимую протеинкиназу II (СаМКП).

Этот же домен передает сигнал о связывании 1Р3 с рецептором Са2+-каналу. Как уже было отмечено, гомология между различными изоформами рецептора 1Р3 наиболее низкая именно в сопрягающем домене, что указывает на разные типы регуляции в них [Yoshida, Imai 1997].

1.2.3. Функциональные свойства Са канала рецептора 1Р3.

Выделенный из мозжечка IP3R, был встроен в фосфолипидные протеолипосомы, получившие после этого способность к 1Р3-

/у, t

индуцированному транспорту Са [Ferris et al., 1989]. На реконструированных в бислойные липидные мембраны рецепторах 1Р3 эндоплазматического ретикулума были изучены функциональные

Л I

свойства 1Р3-активируемых Са -каналов [Watras et al., 1991]. Было показано, что канал имеет четыре кратных уровня проводимости 20, 40, 60 и 80 пСм при использованиии 50 мМ Са2+ в качестве носителя тока. Значения амплитуд тока при потенциале -50 мВ, были равны 1.7, 3.5, 4.9 и 6.6 пА и составляли 29%, 35%, 35% и 1% от общей активности каналов. Время открытого состояния канала для 3 уровня составляло 2,7 мсек, для других уровней < 1.5 мсек, это предполагало, что канал более стабилен на 3 уровне. Наличие нескольких проводящих подсостояний у IРеактивируемого канала могло быть приписано либо кооперативной работе нескольких каналов, либо существованию нескольких уровней проводимости для одиночного канала. Проведенный авторами количественный анализ позволил сделать выбор в пользу модели с четырьмя подсостояниями одного работающего канала, сформированного четырьмя субъединицами, а механизм возникновения этих подсостояний объяснить через взаимодействие

белковых субъединиц, образующих тетрамерный комплекс 1Рз/рецептора-канала. Было показано также, что ионные каналы рецептора 1Р3 слабо селективны для двухвалентных катионов относительно ионов калия Рца/Рк = 6.3. Исследование свойств проводимости рецептора позволило авторам построить следующий ряд селективности для 55 мМ двухвалентных катионов против 110 мМ К+: Ba2+>Sr2+>Ca2+>Mg2+. Проводимости для перечисленных выше катионов определенные при потенциале 0 мВ убывали в той же последовательности: Ва (85 пСм) > Sr (77 пСм) > Ca (53пСм) > Mg (42 пСм ) [Bezprozvanny, Ehrlich, 1994].

Теми же авторами были исследованы механизмы регуляции ионных каналов рецептора 1Рз. Было показано, что 1Р3-активируемые каналы регулируются цитоплазматическим Ca . Кривая зависимости вероятности открытого состояния каналов от уровня цитоплазматического Са2+, полученная авторами, имела вид колокола: вероятность открытого состояния каналов возрастала при повышении уровня свободного Са2+ от O.OImkM до 0.25 мкМ и уменьшалась при дальнейшем увеличении цитоплазматического Са2+ [Bezprozvanny et al., 1991]. Изменение активности рецептора 1Р3 в ответ на изменение уровня цитоплазматического Са2+ представляется наиболее очевидным способом реализации обратной связи в процессе 1Рз-индуцированного выброса Са2+. Также было показано, что адениновые нуклеотиды (AMP и АТР) являются регуляторами активности 1Р3-активируемых Са2+-каналов, они одновременно увеличивали вероятность открывания канала и стабилизировали канал в открытом состоянии.

Полумаксимальная вероятность открытого состояния канала наблюдалась при концентрации IP3, равной 0.2 мкМ. Коэффициент Хилла для полученной концентрационной зависимости оказался равным 1. Полученные данные позволили авторам предположить, что связывание одной молекулы 1Р3 на любом из четырех рецепторов,

составляющих тетрамерный белковый комплекс, достаточно для открывания Ca2 -канала.

Сейчас известно, что IP3R и рианодиновый рецептор (RyR) представляют два вида внутриклеточных кальциевых каналов, ответственных за мобилизацию кальция из кальциевых депо. Са2+ может быть выброшен из внутриклеточных пулов, как при увеличении внутриклеточной концентрации 1Р3, так и посредством механизма Ca -индуцированного Са2+ выброса. Алкалоид растительного происхождения рианодин оказался специфическим агентом, позволившим идентифицировать и выделить белки из мембран саркоплазматического ретикулума сердечных и скелетных мышц. [Anderson et al., 1989], он открывает каналы при низких наномолярных концентрациях и закрывает их при достаточно высоких микромолярных. Эти два рецептора обладают значительной структурной и функциональной гомологией. Подобно рецептору 1Р3 рианодиновый рецептор существует как тетрамер, С-концы которого достаточно гидрофобны и пронизывают мембрану, формируя кальциевый канал, а большой N-конец, обращенный в цитозоль формирует трехмерную луковицу для связывания с рецептором.

В настоящее время показано существование рианодинового рецептора и его участие в распространении кальциевого сигнала во многих типах клеток (клетках скелетных и сердечных мышц, нейронах, хромафинных клетках, гладких мышцах и др.). Значительное структурное сходство, которое существует между рецептором 1Р3 и рианодиновым рецептором, возможно отражает общее эволюционное происхождение, которое подтверждается особенно тесной гомологией двух мембрано-связанных доменов, а также свободного С-концевого участка.

1.3. Са2+ вход в клетку, индуцированный инозитол (1,4,5)-

трифосфатом.

Кальциевый вход в клетку может регулироваться несколькими механизмами, например активацией потенциал - зависимых кальциевых каналов, как правило, в возбудимых клетках; активацией рецепторов на мембране в невозбудимых клетках; а также, при участии вторичных посредников, среди которых инозитолфосфаты занимают лидирующее место [Irvin, 1990]. Как уже было отмечено ранее, в то время, как IP3-индуцированный выброс Са2+ из внутриклеточных депо являлся предметом детального исследования, другой, не менее важный участник клеточного Са2+ ответа, 1Р3-зависимый вход Са2+ в клетку еще очень мало изучен.

Согласно одной гипотезе мембрана клетки содержит кальциевые ионные каналы, способные активироваться непосредственно IP3. В пользу этого предположения накоплен целый ряд, как электрофизиологических [Kuno, Gardner, 1987; Mozhayeva et al., 1991; Vaca, Kunze 1995], так и иммуноцитохимических данных [Khan et al., 1992; Khan et al., 1992]. Согласно другой - Независимый вход Са2+ осуществляется через высокоселективные Ca каналы низкой проводимости, активация которых регулируется состоянием Са2+-депо [Hoth, Penner, 1993; Luckhoff, Clapham, 1994; Premack et al 1994], которые по мере их опустошения от кальция посылают сигнал к плазматической мембране клеток и запускают его вход в клетку («емкостная» модель входа Ca2') [Putney, 1990; Putney, Bird, 1993; Putney, Bird, 1994].

1.3.1.1Р3-активируемые Ca2+каналы в плазматической мембране клеток.

Первые данные о существовании 1Рз-активируемых Са2+ каналов в плазматической мембране клеток были получены на Т-лимфоцитах

[Kuno, Gardner, 1987]. Каналы имели проводимость порядка 7 пСм, ингибировались повышением [Ca2+]¡ и были проницаемы для Ва2+. Вскоре было обнаружено, что плазматическая мембрана клеток А431 содержит два типа 1Р3-активируемых ионных каналов проводимостью 4 и 10 пСм в 100 мМ Са2+. [Mozhayeva et al., 1990], эти же авторы показали, что эпидермальный фактор роста, гистамин и брадикинин

О А-

активирует тот же тип Ca -.каналов [Mozhayeva et al., 1991]. В обонятельных клетках были найдены 1Р3-чувствительные кальциевые каналы [Fadool, Ache, 1992]. Эти каналы были одинаково чувствительны и к 1Р3, и к инозитол (1,3,4,5)-тетракифосфату (IP4) [Kalinoski et al.,

I

1992]. В B-лимфоцитах были показаны 1Р3-активируемые Ca каналы с проводимостью порядка 8 пСм [Brent et al., 1993].В эндотелиальных клетках прямое приложение 1Р3 на изолированные фрагменты плазматической мембраны активировало каналы, которые проводили ионы Na+ в отсутствии ионов Са2+ снаружи клетки, незначительное добавление ионов Са2+ в наружный раствор смещало кривую вольт-амперной характеристики в сторону положительных потенциалов, из чего был сделан вывод что каналы хоть и могут проводить ионы Na+, но более селективны для ионов Са2+. Было также показано, что активность каналов модулировалась цитоплазматическим Са2+, в микромолярном диапазоне концентраций [Vaca, Kunze, 1995].

Иммунологическими методами было подтверждено существование белка подобного рецептору 1Р3 эндоплазматического ретикулума в плазматической мембране эндотелиальных клеток, гладкомышечных клетках, а также в гепатоцитах [Fujimoto et al., 1992]. В 1995 году впервые Флейчер и др.[Мауг1екпег et al., 1995] выделили и очистили рецептор 1Р3 из плазматической мембраны клеток печени крысы (LPM-1Р3). Очищенный рецептор был встроен в искусственные мембраны, где исследовались его свойства. Каналы LPM-IP3 активировались 1Р3 (1мкМ) и ингибировались 1Р4 и гепарином. Было показано, что LPM-IP3

проницаем как для Са2+ так и для других двухвалентных и моновалентных катионов (Ca2+>K+»CU и Cs > К ). Проводимость каналов не зависела от потенциала и присутствия АТР и Са . Было показано, что внутриклеточный кальций модулирует LPM-IP3 в присутствии 1Р3, вероятность открытого состояния канала имела колоколообразную зависимость от [Са ];.

LPM-IP3 и IP3R эндоплазматического ретикулума имели как ряд сходных характеристик (близкие значения действующих концентраций 1Р3, ингибирование гепарином), так и различий. Каналы LPM-IP3 имели более низкую проводимость (8 пСм для 53 мМ Са(ОН)2) по сравнению с 33 пСм IP3R гладкомышечных клеток и 20-26 пСм клеток мозжечка. Для

rs .

их активации требовалась концентрация [Са ]j и АТР в 10 раз большая, чем для активации IP3R. Из этого авторы сделали вывод, что LPM-IP3 и IP3R - это, по-видимому, разные изоформы рецептора IP3.

Несмотря на усилия, затрачиваемые многими лабораториями для того, чтобы выделить рецептор IP3 из плазматической мембраны, пока удачные результаты в этом направлении единичны.

1.3.2. Вход Са2+ в клетку, активирующийся после опустошения Са2+ депо.

Подавляющее большинство исследователей, занимающихся проблемой кальциевой сигнализации, придерживается точки зрения, что 1Рз-зависимый вход Са в клетку происходит не в результате активации рецептора, расположенного в плазматической мембране клетки, а после сигнала, поступающего от опустошенных Са2+ депо в ответ на активацию IP3-R в ретикулярной мембране и выброс Са2+ из внутриклеточных кальциевых депо.

О А-

Концепция «депо-зависимого» Са -входа берет свое начало из серии пионерских работ Патни с соавторами на клетках околоушных

желез. Авторы исследовали вход Са2+ через активацию Са2+-зависимых К+ каналов и выход 42К+ и 86Rb из клетки. Ими было замечено, что аппликация агониста мускаринового рецептора - карбахола вызывает двухфазный выход 86Rb+ и 42К+, которым клетки предварительно загружались. Первая, быстрая фаза не зависела от присутствия Ca во

внеклеточной среде, в то время как вторая, более медленная и

/-i 2+

продолжительная, исчезала после связывания Ca с кальциевым буфером и блокировалась La3+. [Putney, 1976] Эта и ряд последующих работ с 45Са2+ привели исследователей к выводу, что стимуляция рецептора вызывает двухфазное увеличение концентрации Са2+ в цитоплазме в результате выброса Са2+ из внутриклеточных депо и последующего затем входа Са2+ снаружи внутрь клетки. Это привело в дальнейшем к развитию идеи о зависимости активации Са2+ входа от степени опустошенности внутриклеточных Са2+-хранилищ. По аналогии с конденсатором в электрической цепи Патни назвал этот вход «емкостным» («capacitative» Ca24 influx) [Putney, 1986; Putney, 1990]. Исследование этого входа получило широкое развитие с появлением новых флуоресцентных зондов quin2, fura2 и др. для регистрации внутриклеточного Са2+. В настоящее время существование «депо-зависимого», («емкостного») Са2+-входа широко показано на многих типах клеток. «Емкостной» вход

Са2+ может быть запущен как в результате активного опустошения кальциевых депо, а именно: введением 1Р3 в клетку [Hoth, Penner, 1992; Parekh et al., 1997], при аппликации кальциевого ионофора иономицина [Hoth, Penner, 1992], при воздействии агонистов, которые увеличивают уровень 1Р3 в клетке. А также при пассивном опустошении в условиях, когда депо не могут заполняться и постепенно теряют Са2+. Пассивное опустошение достигается при введении в клетки различных ингибиторов кальциевых АТРаз (тапсигаргина, BHQ и пр.) [Zweifach, Lewis, 1993; Petersen, Berridge, 1994], а также диализом клеток высококонцентрированными Са2+ буферами EGTA

или ВАРТА, которые связывают Ca , тем самым

препятствуя заполнению кальциевых депо. [Hoth, Penner, 1992; Hoth, Penner, 1993; Zweifach, Lewis, 1993].

1.3.2.1. Потенциал-зависимость, селективность и проводимость тока, активируемого опустошением Са -депо (Icrac)•

Первые измерения «депо-зависимого» входа Са2+ с использованием patch-clamp техники в конфигурации whole-cell были сделаны на тучных клетках и получили название - CRAC - «Са2+ release-activated Са2+ current» [Hoth, Penner, 1992]. В настоящее время /crac зарегистрирован во многих типах клеток, изучены его свойства, измерены основные параметры. Независимо от типа клеток и способа опустошения Са -депо, активируемый при этом ток имеет фактически идентичные свойства.

/crac не активируется изменением потенциала на мембране, однако проявляет свойства потенциал-зависимости после своей активации. Ток гораздо больше при отрицательных потенциалах и имеет положительный потенциал реверсии. В отличие от потенциал управляемых Са2+ каналов каналы /crac не проводят наружу Са2+ и К+ при положительных потенциалах, если только наружный Са2+ не снижается ниже 2 мМ [Hoth, 1995]. При более низком Са2+ были зарегистрированы выходящие токи переносимые ионами калия через эти каналы. В стандартных условиях регистрации, при использовании пилообразной развертки напряжения (voltage ramps) от -100 до +100 мВ, было показано, что /crac имеет свойства входящего выпрямления. [Hoth, Penner, 1993] .

Изменения наружного Na+ не влияют на значения /crac, указывая на низкую проницаемость этих каналов для Na+ в присутствии наружного С a2' [Hoth, Penner, 1993; Lepple-Wienhues, Cahalan, 1996]. Методом сравнения величины входящего Са2+ за единицу времени (интегрального Са2+ тока) и измерениями [Ca2+]j с использованием

флуоресцентного Ca зонда fura 2, было вычислено, что /crac в тучных

2+

и клетках RBL имеет более высокую селективность для Ca , чем потенциал-управляемые Са2+-каналы. [Hoth, Penner, 1993]. Также было показано, что селективность CRAC каналов для Са2+ относительно моновалентных катионов одинаково высока для разных типов клеток: лимфоцитов человека (Jurkat), тучных клеток, крысиных базофилов -RBLP (Са/Рм= ЮОО/1). [Hoth, 1995].

i

Было показано также, что селективность для Ca выше в ряду двухвалентных катионов (Са2+ > Ва2+ ~ Sr2+) и, что есть различия в проницаемости CRAC токов для ионов Ва в тучных и клетках RBL по сравнению с токами в клетках Jurkat. Отношение токов /ва//са было много меньше в клетках Jurkat по сравнению с отношением токов в тучных клетках и клетках линии RBL и для всех трех типов клеток отношения /ва//са строго зависело от мембранного потенциала. При отрицательном потенциале (от - 40 до - 60 мВ) токи Ва2+ составляли

О 4-

около 50 % от токов Ca в клетках Jurkat, тогда как в тучных клетках и клетках RBL они были одинаковыми.

Как было показано, токи /crac имеют чрезвычайно низкую проводимость. Из суммарного тока /crac, зарегистрированного в тучных клетках, было вычислено, что примерная величина проводимости одиночного канала должна составлять менее 1пСм [Hoth, Penner, 1992]. В работе на Т-лимфоцитах после обработки клеток тапсигаргином были зарегистрированы токи, имеющие проводимость порядка ~ 24 фСм, [Zweifach, Lewis, 1993]. Это почти на 3 порядка ниже величины проводимости, типичной для большинства каналов, и соответствует проводимости около 11000 Ca ионов/сек. Для сравнения, 1Р3-рецептор проводит примерно

1.5 10б Са2+

за тот же интервал времени. Несмотря на столь низкую проводимость тока, шумовой анализ проведенный авторами показал, что это работает канал, а не ионный обменник.

Наряду с токами /crac описаны так называемые - «depletion-activated Са2+ channels» (DAC) - токи также связанные с опустошением Са2+-депо, но имеющие другие чем CRAC характеристики [Luckhoff, Clapham, 1994; Vaca, Kunze, 1994]. Так, проводимость одиночных каналов, активированных опустошением Са2+-депо, в эндотелиальных клетках была порядка 5 пСм в симметричных Na2S04 растворах и 11 пСм после добавления 10 мМ Ca2f в наружный раствор, и каналы были менее селективны для Са2+ (Рса/^а>Ю/1).

Другие «depletion-activated Са2+ channels» были описаны в клетках А431 [Luckhoff, Clapham, 1994]. В конфигурации cell-attached были зарегистрировали Са и Ва токи, вызванные диализом клеток 10 мМ раствором кальциевого буфера ВАРТА и тапсигаргином. Каналы имели проводимость порядка 2 пСм с 200 мМ Са2+ и 16 пСм с 160 мМ Ва2+ в пипетке. Активность прекращалась при отрыве фрагмента мембраны и переходе в конфигурацию inside-out и не восстанавливалась добавлением 30 мкМ 1Р3 и 1Р4. Тот факт, что зарегистрированные каналы активировались в условиях ингибирования заполнения Са2+-депо, авторы считали прямым подтверждением «депо-зависимого» входа. Однако, авторы пришли в затруднение при обсуждении механизма передачи информации от опустошенных депо к каналам в плазматической мембране. Растворимый фактор типа CIF (calcium influx factor) [Randriamapita, Tsien, 1993], или чувствительные к фосфорилированию вторичные мессенжеры [Parekh et al., 1993] исключались, поскольку в условиях длительного диализа при эксперименте концентрация этих веществ катастрофически бы снижалась. Альтернативная идея, предложенная Ирвином [Irvine, 1990; Irvine, 1991] и предполагающая прямое взаимодействие между Са каналами в плазматической мембране и рецептором 1Р3 эндоплазматического ретикулума, ими отвергалась, поскольку в данных

экспериментах не удалось зарегистрировать вход Са2+ на приложение

1Рз-

"у.

Возможно, одним из наиболее важных свойств «емкостного» Са

входа является его чувствительность к концентрации Са2+. В работе на крысиных тучных клетках было показано, что /crac, активированный диализом клеток кальциевым буфером - EGTA, и усиленный гиперполяризацией быстро инактивируется в пределах от 10 до 100 мс. Инактивация устранялась после замены в регистрирующей пипетке раствора EGTA на буфер, более быстро связывающий Са2+ - ВАРТА. Из чего был сделан вывод, о том, что инактивация CRAC токов происходит в результате локального повышения концентрации кальция сразу при поступлении его в клетку. Далее на лимфоцитах Zweifach и Lewis показали, что быстрая инактивация связана с открыванием одиночного Са2+-.канала и представляет собой двух- экспонентный процесс с

/у,

быстрой и медленной константой времени 10 и 100 мс и, что Са -связывающий участок находится в нескольких нм от устья канала. [Zweifach, Lewis, 1995]. Такая близкая локализация места связывания Са предполагает, что CRAC каналы могут реагировать на локальное изменение концентрации Са2+ и не реагировать на изменение концентрации Са2" внутри клетки, если оно не продолжительно, или не связано с опустошением внутриклеточных депо. [Hoth, Penner, 1992; Hoth, Penner, 1993; Zweifach, Lewis, 1995].

До сих nop CRAC каналы не идентифицированы. Однако было выдвинуто предположение, что найденный в фоторецепторах дрозофилы белок, кодируемый геном trp («transient reseptor potential»-кратковременный рецепторный потенциал) мог бы функционировать как канал «емкостного» кальциевого входа [Hoth, Penner, 1992; Hoth, Penner, 1993; Selinger et al., 1993]. В ответ на действие света в фоторецепторах дрозофилы увеличивается концентрация 1Р3, которая в свою очередь активирует светочувствительный вход Са , приводящий к

деполяризации мембраны и передаче импульса к следующим структурам. Молекулярные генетики показали, что в мутантных линиях с нарушенной функцией фосфолипазы С клетки не способны генерировать рецепторный потенциал. Было найдено, что аминокислотная последовательность белка trp и потенциалзависимых Са2+ каналов обнаруживает значительное сходство, а также, что перенесенный в клетки Sf9 trp канал чувствителен к опустошению кальциевых депо [Ни,, Schilling, 1995].

Гены, гомологичные trp, на сегодняшний день найдены в клетках человека [Harteneck et al., 1995], мыши и ооцитах Xenopus [Petersen, Berridge, 1995]. В случае с Trp белком богатый пролином участок на гидрофильном С-конце мог бы взаимодействовать с рецептором 1Р3 [Vaca, et al., 1994; Petersen et al., 1995]. Это могло бы быть дополнительным доказательством того, что trp является функциональным аналогом CRAC каналов в клетках млекопитающих, если бы эти два типа каналов не имели существенных различий в проводимости, селективности и др. свойствах. Однако, существующие функциональные особенности этих каналов показывают, что фоторецепторы дрозофилы являются удобной моделью в вопросе изучения механизма кальциевого входа.

1.3.3. Модели «депо-зависимого» кальциевого входа.

Как уже было сказано выше, наиболее трудной проблемой является решить, каким образом информация об опустошении внутриклеточных кальциевых пулов передается с эндоплазматического ретикулума плазматической мембране клеток. Модели, которые были предложены делятся на две группы: одна предполагает существование растворимого посредника, через который осуществляется передача информации [Randriamapita, Tsien, 1993], согласно другой - информация передается непосредственно в результате белок-белкового взаимодействия между

двумя мембранами [Fasolato et al., 1994; Putney, Berd, 1993; Putney, Berd, 1994].

1.3.3. l.Modenu с участием водорастворимых факторов.

Ряд авторов полагает, что сигнал к плазматической мембране передается низкомолекулярным специфическим фактором, который образуется по мере опустошения кальциевых депо и диффундирует к мембране клеток, активируя Icrac; этот фактор был назван «фактором входа кальция» (СIF - calcium influx factor). Первое предположение о существовании CIF было основано на измерении Са2+ сигналов после добавления неочищенных клеточных экстрактов интактным клеткам [Randriamampita, Tsien, 1993; Davies, Hallet, 1995]. Этот эффект был воспроизведен другими авторами на клетках слюнной железы и гепатоцитах, ими же было показано, что предполагаемый активатор депо-зависимого входа - CIF действует через механизм, блокируемый гепарином и атропином, доказывая тем самым участие в этом процессе активации наружного рецептора, приводящей к увеличению концентрации IP3 [Gilon et al., 1995]. Некоторые из противоречий могли бы быть разрешены при допущении, что неочищенные экстракты клеток содержат, по крайней мере, два фактора, один из которых действует снаружи клетки, другой после инъекции в нее [Thomas, Hanley, 1995].

Несмотря на большое число попыток выделить CIF и выяснить его биохимическую природу, он до сих пор плохо охарактеризован и данные о нем противоречивы [Randriamampita, Tsien, 1993; Premack et al., 1995].

Существует также предположение, что ключевую роль в передаче информации от кальциевых депо к плазматической мембране играет фосфорилирование белков по тирозину [Vostal et al., !991]. В пользу этих предположений говорит тот факт, что ингибитор тирозинкиназ -

генистеин ингибирует вход кальция в фибробластах [Lee et al., 1993], клетках поджелудочной железы крысы [Yule et al, 1994], лимфоцитах [Tepel et al., 1994], тромбоцитах [Sargeant, et al., 1994] и др. клетках. Поскольку в некоторых из этих клеток есть рецепторы с собственной тирозинкиназной активностью, активирующие фосфолипазу С, воздействие генистеина может влиять на уровень образования 1Р3.

л ,

Однако генистеин обладает способностью ингибировать вход Са , индуцированный тапсигаргином, подтверждая тем самым более прямое

•у,

участие тирозинового фосфорилирования в входе Са [Sargeant et al.-, 1994; Fleming et al., 1995; Крутецкая, Лебедев, 1998].

До недавнего времени участие тирозинкиназ в процессах внутриклеточной сигнализации рассматривалось только в связи с активацией рецепторов с собственной тирозинкиназной активностью, таких как рецепторы ростовых факторов, рецепторы инсулина и др. В настоящее время появляется все больше данных о том, что рецепторы, связанные с G-белками и не имеющие собственной тирозинкиназной активности, могут также вызывать быстрое фосфорилирование по тирозину различных белковых субстратов, а также и самих рецепторов [Malarkey et al, 1995]. К числу таких рецепторов относятся рецепторы брадикинина, ангиотензина 2, бомбезина и др.

Востал и ряд других авторов предположили, что цитоплазматический и люминальный Са2+, могут осуществлять фосфорилирование специфических белков по тирозину в тромбоцитах, регулируя вход Са в клетку. Согласно их гипотезе повышение концентрации Са2+ в цитоплазме активирует тирозинкиназу, что приводит к фосфорилированию специфических белков (130 кДа) в тромбоцитах и открывает вход Са2+ в клетку, по-видимому, путем прямого влияния на Са2+ каналы в плазматической мембране.

a I

Повышение концентрации люминального Са активирует тирозинфосфатазы, локализованные в мембране эндоплазматического

/■у,

ретикулума и предотвращает фосфорилирование белков и вход Са в

клетку. [Vostal et al., 1991; Sargeant et al., 1994; Yule et al., 1994]. В последующей работе Востал и Шульман установили, что этот белок молекулярной массой 130 кДа представляет собой винкулин. [Vostal, Shulman, 1992]. Предполагается, что фосфорилирование винкулина по тирозину может участвовать в регуляции проницаемости плазматической мембраны для по-видимому, путем

взаимодействия со структурами цитоскелета .

1.3.3.2. «Конформационная» модель взаимодействия - «coupling model».

«Конформационная» модель взаимодействия предполагает непосредственное участие рецептора 1Рз в передаче информации, через его движение от одной мембраны к другой. Согласно этой модели рецептор 1Р3 участвует в высвобождении Са2+ из эндоплазматического ретикулума в цитозоль и также передает сигнал к кальциевому каналу в плазматической мембране, инициируя вход Са2+ в клетку.

При условии, что существуют отдельные изоформы IP3R, эти две сигнальные функции могли бы осуществляться различными рецепторами. В пользу этого предположения свидетельствуют данные, полученные на клетках Jurkat, в которых трансфекция антисмысловой кДНК изоформы I IP3R приводила к потере клетками способности высвобождать Са2+ из внутриклеточных пулов, однако вход Са2+ в клетку осуществлялся после искусственного опустошения кальциевых депо тапсигаргином [Jayaraman et al., 1995]. Аналогичные данные были полученны на ооцитах Xenopus, где повышенная экспрессия изоформы

л |

1 IP3R увеличивала скорость опустошения Са из депо, но не влияла на 1Р3-индуцируемый вход наружного кальция в клетку, а экспрессия изоформы 3 IP3R наоборот не влияла на 1Р3-зависимое высвобождение Са2+ из депо, но существенно увеличивало вход Са2+ в клетки [Berridge, 1995]. Поэтому логично было бы предположить, что процесс

высвобождения Са2+ из депо может быть опосредован изоформой 1 рецептора 1Р3, а вход Са2+ , в клетку возможно, изоформой 3, поскольку, как предполагают авторы, эти две группы рецепторов функционально различны. Авторы также предположили, что клетки могут не только изменять уровень экспрессии присущего данному типу клеток IP3R, «настраиваясь» на определенную функцию, но также могут включать другой тип рецептора, тем самым изменяя 1Р3-вызванный кальциевый ответ. [DeLisle et al., 1996].

Истинная природа белок-белкового сопряжения между IP3R и CRAC каналом неизвестна. Одним из возможных объяснений этого механизма могло быть то, что непосредственно IP3R является звеном, передающим информацию с эндоплазматического ретикулума на плазматическую мембрану клеток [Irvin, 1990; Berridge, 1990]. Эта модель была впервые представлена согласно аналогии с процессами возбуждения-сокращения скелетной мышцы, где ключевым событием является высвобождение Са2+ из саркоплазматического ретикулума в ответ на деполяризацию плазмалеммы, а сопрягающим звеном в этой цепочке является дигидропиридиновый рецептор (DHPR) плазмалеммы.

DHPR представлен как в скелетномышечных клетках, так и в кардиомиоцитах, но механизм контроля за высвобождением Са2+ в этих типах клеток различен. В сердечномышечных клетках DHPR функционирует как Са2+ канал, который при деполяризации мембраны активируется с быстрой скоростью, запуская вход ионов Са2+ в клетку, что приводит к последующему выбросу Са2+ через Са2+-активируемые каналы саркоплазматического ретикулума. В клетках скелетных мышц DHPR играет двойную роль: функционирует как медленно активируемый Са2+ канал и как датчик потенциала, который и контролирует выход Са2+ из саркоплазматического ретикулума. [Garcia et al., 1994]. На схеме 2 представлена модель, согласно которой

осуществляется этот механизм. В этой модели открывание и закрывание ЯуЯ контролируется конформационным состоянием цитоплазматического участка дигидропиридинового рецептора. В покое каналы и ЭНРЯ и И-уЛ закрыты для Са2+ тока. При деполяризации мембраны происходит конформационная перестройка цитоплазматического участка БНР11, которая влечет за собой в первую

О 4-

очередь открывание каналов ЯуЯ и выброс Са в цитоплазму а затем и

2+

открывание ОНР-чувствительных каналов и вход Са в клетку.

С <-* С <-»• С <->• U

С <-* С <-О <-> О

Рис.2 Упрощенная модель взаимодействия DHPR и рианодинового рецептора (по Garcia et al., 1994).

Дигидропиридиновый рецептор находится в мембране Т-трубочек (T-tubule) рианодиновый рецептор в близкорасположенной мембране саркоплазматического ретикулума (SR). На левой стороне рисунка, в состоянии покоя наружная сторона мембраны Т-трубочек заряжена положительно относительно внутренней и рецепторы не активированы. При деполяризации мембраны Т-трубочек происходят конформационные изменения DHPR и рианодинового рецептора (правая сторона рисунка), в результате чего сперва происходит выброс Са2+, а затем его вход в клетку. (С) - закрытое, (О)- открытое состояние для DHPR и рианодинового рецептора.

По аналогии с тем, как происходит сопряжение в мышечных клетках между рианодиновым рецептором саркоплазматического ретикулума (СР) и дигидропиридиновым рецептором Т-трубочек сарколеммы, цитоплазматическая часть молекулы 1Рз11 могла бы передавать информацию с эндоплазматического ретикулума каналам в плазматической мембране клеток. Идея состоит в том, что цитоплазматическая часть рецептора сообщается с двумя Са2+ каналами, один из которых локализован в эндоплазматическом ретикулуме, другой в плазматической мембране клеток. Связывание 1Р3 с рецептором может вызывать конформационные изменения последнего, что приводит к открыванию кальциевого канала эндоплазматического ретикулума, а как только кальциевое депо истощится, рецептор может изменить свою конформацию, которая повлечет за собой открывание Са2+ каналов, но теперь уже в плазматической мембране. Ирвином было высказано предположение о возможности участия 1Р4 в открывании этих каналов. Это было бы объяснением тех случаев где необходимы были оба инозитолфосфата для активирования каналов. [1гап, 1990,1тп, 1991].

Факты в поддержку такой модели сопряжения между рецептором 1Р3 эндоплазматического ретикулума и плазматической мембраной получены в последних работах по связыванию 1Р311 с антителами, полученными к мембранному фосфолипиду фосфотидилинозитол (4,5)-дифосфату (Р1Р2) [Ьири е1 а1., 1998]. С использованием методики встраивания 1Р3Я в бислойную липидную мембрану было показано, что рецептор 1Р3 формирует стабильный комплекс с Р1Рг. Разрушение этого комплекса при добавлении специфических моноклональных антител (апй-Р1Р2) приводило к 3-4-кратному увеличению активности рецептора 1Р3 и 10-кратному увеличению его чувствительности к 1Р3. Экзогенно добавленный Р1Р2 блокировал связывание 1Рз с рецептором, искусственно синтезированный, водорастворимый аналог Р1Р2

(диоктаноил-(4,5)Р1Р2), оказывал тот же эффект и на связывание рецептора с 1Р3 и на активность каналов IP3R. Тот факт, что экстракция эндогенного PIP2 из комплекса с IP3R при использовании анти-Р1Р2 антител приводила к повышению чувствительности рецептора к IP3, а экзогенный Р1Р2 в микромолярных концентрациях ингибировал специфическое связывание 1Р3 с микросомами, выделенными из мозжечка, и блокировал рецептор 1Р3, встроенный в бислои, привел авторов работы к предположению, что одно и то же место на IP3R является и точкой для связывания с 1Р3, и точкой его взаимодействия с Р1Р2. Поскольку N-конец 1Р3 связывающего домена находится на противоположном от трансмембранного С-конца молекулы рецептора IP3, a in vivo Р1Р2 взаимодействует с N-конца молекулы, авторы предположили, что Р1Р2 и IP3R находятся в разных, но расположенных поблизости мембранах. Существование таких комплексов IP3R-PIP2 в клетках подтверждено и иммунологическими методами [Satoh et al., 1990]. Основываясь на данных, полученных в этих экспериментах авторы, предложили новый тип модели сопряжения, согласно которой IP3R, расположенный в эндоплазматическом ретикулуме, либо в кальциосомах, в нестимулированных клетках связан напрямую с Р1Р2, находящемся в близкорасположенной, соседней мембране. При стимуляции агонистом активированная фосфолипаза С расщепляет эту связь таким образом, что 1Р3 остается связанным с рецептором и активирует его, инициируя выброс Са2+ из хранилищ.

Осуществление такого сопряжения требует определенного, пространственного расположения между внутриклеточными кальциевыми депо и рецепторами, связанными с активацией фосфолипазы С, которое могло бы поддерживаться цитоскелетом. В настоящее время есть работы, доказывающие правомерность этих предположений. Так на клетках поджелудочной железы мыши было показано, что агонист-вызванное высвобождение Са2+ из 1Р3-

чувствительных секреторных гранул происходит главным образом на апикальном полюсе клетки, тогда как вход Са2+, сопровождающий опустошение гранул, осуществляется через базальную мембрану. В этих экспериментах кальциевые депо были опустошены с использованием ацетилхолина в бескальциевом растворе, а подача Са2+ производилась только через регистрирующую пипетку заполненную 10 мМ раствором Са2+ с базолатеральной поверхности клетки в конфигурации cell-attached. Спустя определенный промежуток времени стимуляция клетки ацетилхолином приводила к повторному выбросу Са2+ из депо. И хотя поступление Са2+ происходило только исключительно через тонкую пипетку с базолатеральной стороны клетки, повторно вызванный ацетилхолином кальциевый сигнал стартовал всегда с апикальной (богатой секреторными гранулами) стороны. Использование ингибитора кальциевых АТРаз тапсигаргина, предотвращало возможность заполнения гранул на апикальной стороне через центр клетки. Таким образом, в этой работе было продемонстрировано, что «емкостной» вход Са2+ в поляризованных клетках может осуществляться через Са2+-туннель, соединяющий апикальный и базальный полюс клетки, этот вход может заполнять Са2+-пулы на противоположной стороне клетки, минуя цитозоль. Единственная система органелл способная обеспечивать такую связь,

л ,

это эндоплазматический ретикулум. Наиболее вероятно, что Са , входящий через участок мембраны ограниченный кончиком пипетки, не поступает в общий объем цитоплазмы, а захватывается локально эндоплазматическим ретикулумом, прилегающим к участку плазматической мембраны, и диффундирует через него к апикальному участку, содержащему секреторные гранулы. Естественно, что только упорядоченная структурная организация клетки, с четкой локализацией внутриклеточных органелл может обеспечить механизм такой транспортировки Са2+ [Mogami et al., 1997].

При использовании методики patch-clamp в сочетании с

флуоресцентными измерениями [Parekh et al., 1997] было показано, что

можно функционально разъединить опустошение внутриклеточных

Са2+-депо и депо-индуцированный вход Са2+ (/crac) по их

чувствительности к 1Р3. Для этого в клетки вводили различные

концентрации 1Р3 через пэтчевую пипетку и оказалось, что низкие (60л ■

600 нМ) концентрации 1Р3 вызывают существенное опустошение Са -депо, не приводя к активации 1Р3, и только микромолярные

О 4-

концентрации 1Р3 активируют вход Са . Очень любопытным оказался тот факт, что активация /crac имела высокую нелинейную зависимость от концентрации 1Р3. При введении от 60-3 мкМ 1Р3 в клетки наблюдался максимальный вход Са , при дальнейшем незначительном уменьшение концентрации 1Р3 до 1 мкМ /crac не наблюдался вовсе. Концентрации 1Р3, которые были слишком низкими для активации входа Са2+ вызывали значительное опустошение Са2+-депо.

На основании своего исследования авторы пришли к выводу, что функционально не все, а только некоторые 1Р3-чувствительные депо могут быть вовлечены в активацию /crac- Эти депо, по-видимому, характеризуются пониженной чувствительностью к 1Р3, предположительно по причине активного метаболизма, который быстро уменьшает концентрацию свободного 1Р3, воспринимаемую рецептором 1Р3 этих депо. Также, на основании полученных ранее данных, авторы полагают что эти депо очень близко расположены к плазматической мембране [Parekh, Penner, 1995].

Рядом авторов было замечено, что в крысиных гепатоцитах [Chiavaroli et al., 1994] гладкомышечных клетках [lino et al., 1993], тучных клетках [Matthews et al., 1989] и др., рецептор-индуцированный выброс Са2+ является процессом, работающим по принципу «все или ничего» и все эти клетки имеют «депо-зависимый» вход Са2+. Поэтому вполне возможно, что вход Са2 в этих клетках работает тоже по

принципу «все или ничего», и высоко нелинейная активация /crac в ответ на 1Р3 может быть характерна для многих невозбудимых клеток.

1.4. Арахидоновая кислота - модулятор внутриклеточных

процессов.

Жирные кислоты до недавнего времени рассматривались главным образом, как структурная часть разнообразных липидных молекул и как предшественники синтеза эйкозаноидов. Однако, многочисленные работы последних лет свидетельствуют о том, что сами жирные кислоты, а не только их метаболиты, могут выступать регуляторами передачи и реализации внешних сигналов [Крутецкая, Лебедев 1995]. В связи с этим, например, свободную арахидоновую кислоту многие авторы относят к числу вторичных посредников в действии гормонов.

Среди наиболее важных известных регуляторных эффектов свободных жирных кислот - модуляция активности ферментов, участвующих в передаче гормонального сигнала, регуляция ионных каналов, уровня внутриклеточного Са2+, транскрипции генов, влияние на связывание рецептора с гормоном и др. [Nozawa et al., 1991; Graber et al., 1994; Khan et al., 1995]..

Арахидоновая (5,8,11,14-цис-эйкозатетраеновая) кислота представляет собой полиненасыщенную, жирную кислоту и является одним из основных компонентов фосфолипидов клеточных мембран. В эндотелиальных клетках арахидоновая кислота входит главным образом в состав фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина и фосфатидилинозитола [Whatley et al., 1990]. В макрофагах AK составляет 25 % жирных кислот мембран [Scott et al., 1980].

Моноциты/макрофаги отвечают на различные физиологические, воспалительные и фармакологические стимулы (а именно; фагоцитоз, эндотоксин, форболовый эфир, Са2+-ионофоры) высвобождением арахидоновой кислоты (AK) [Unanue, 1989]. Показано, что АК сама

может участвовать в аутокринной к паракринной регуляции клеточных функций, в макрофагах она необходима для распластывания и прикрепления клеток к субстрату [Teslenko et al., 1996].

1.4.1 Механизмы образования свободной арахидоновой кислоты.

Различают несколько механизмов высвобождения арахидоновой кислоты из клеточных мембран в ответ на стимуляцию клеток. АК высвобождается из мембранных фосфолипидов в результате активации фосфолипазы А2 (PLA2), или в результате совместного действия фосфолипазы С (PLC) и диацилглицеролипазы, а также при активации фосфолипазы D (PL D) [Axelrod, 1990; Dennis et al., 1991]. Наиболее прямой механизм включает в себя гидролиз сложноэфирной связи между арахидоновой кислотой и глицерофосфолипидом, который катализируется фосфолипазой А2.

Активация фосфолипазы А2 является наиболее широко распространенным механизмом высвобождения АК. Этот фермент присутствует в любом типе клеток и играет важную роль как во внутриклеточном липидном метаболизме (реакции деацилирования /реацилирования), так и в передаче и реализации сигналов, поступающих в клетку. В настоящее время выделены и очищены разнообразные изоформы фермента, отличающиеся размерами, субстратной специфичностью, оптимумом pH и различной зависимостью от Са2+.

Семейство фосфолипаз А2 подразделяется на 5 больших групп: низкомолекулярная (13-18 кДа) секретируемая sPLA2 делится еще на I, II и III группы; цитозольная Са2+-зависимая cPLA2 (85 кДа) - IV группа; и цитозольная Са2+-независимая iPLA2 (40-80 кДа) [Dennis, 1994; Marshall, Roshak, 1993]. Известно, что как sPLA2, так и cPLA2 участвуют в высвобождении арахидоновой кислоты в макрофагах в ответ на такие стимулы, как зимозан, фактор активации тромбоцитов, эндотоксин [Barbour, Dennis, 1993; Xu et al., 1994].

Секретируемая (sPLA2) и цитозольная (cPLA2) фосфолипазы различаются не только молекулярным весом, но также и разной зависимостью от концентрации Са , если cPLA2 активируется при цитозольной (микромолярной) концентрации Са2+, то для активации sPLA2 необходима милимолярная концентрация Са . Для перитонеальных макрофагов мыши показана прямая корреляция между внеклеточной концентрацией Са2+ и активностью фосфолипазы А2, что позволило предположить участие рецептор-зависимого входа Са2+ в активации фосфолипазы А2 [Balsinde et al., 1990]. Одним из механизмов активации фосфолипазы А2 является ее транслокация из цитозоля в мембраны, которая стимулируется ионами кальция [Yoshihara, Watanabe, 1990].

К настоящему времени накапливаются данные, что для активации фосфолипазы А2 увеличение концентрации Са в цитозоле необходимо но недостаточно. Было показано, что для активации PLA2 необходимо также последующее фосфорилирование протеинкиназами. Установлено значительное увеличение активности фосфолипазы А2 из тромбоцитов человека при включении диацилглицерола в фосфолипидный субстрат (фосфотидилхолин). Предполагают, что диацилглицерол, образующийся в активированных тромбоцитах, может стимулировать фосфолипазу А2, через активацию протеинкиназы С (РКС) [Kramer et al., 1987].

Лин с соавторами показали, что агенты, которые стимулируют высвобождение арахидоновой кислоты, также приводят к фосфорилированию и активации cPLA2. Существует широкий спектр агентов, включая эпидермальные факторы роста (EGF), факторы роста тромбоцитов (PDGF), тромбин, АТР, форболовые эфиры, обеспечивающие фосфорилирование и активацию cPLA2 [Lin et al., 1992а]. Теми же авторами было также показано, что cPLA2 является субстратом для митоген- активируемой протеин (MAP) киназы, более того, фосфорилирование MAP киназой увеличивало ферментативную активность cPLA2. В опытах с заменой одной аминокислоты (Ser-505) на

другую (Ala) cPLA2 переставала быть субстратом для фосфорилирования MAP киназой; клетки, в которых происходила эта замена, теряли способность к агонист-стимулированному производству арахидоновой кислоты [Lin et al., 1993]. Авторы данной работы предложили модель активации cPLA2, соединяющую в себе два необходимых фактора активации - это увеличение Са2+ в цитоплазме и фосфорилирование MAP киназой. В стимулированных АТР или PDGF и прочими агонистами клетках активируется фосфолипаза С, участвующая в наработке IP3 и диацилглицерола. IP3 увеличивает внутриклеточную концентрацию Ga2+, что приводит к транслокации фосфолипазы А2 из цитозоля в мембрану, DAG активирует в свою очередь РКС, а через нее и MAP киназу. Активированная MAP киназа фосфорилирует cPLA2, которая уже связана со своим субстратом в мембране, увеличивая ее ферментативную активность, в результате чего происходит гидролиз сложноэфирной связи и образуется свободная арахидоновая кислота. Эта модель раскрывает механизм, который включает необходимую цепочку процессов от активации рецептора в плазматической мембране до образования свободной арахидоновой кислоты.

1.4.2. Роль арахидоновой кислоты в регуляции ионных каналов и внутриклеточного Са2+.

К настоящему времени в литературе накоплено достаточно много доказательств того, что свободная арахидоновая кислота оказывает влияние практически на все известные ионные каналы, активируя одни из них и блокируя другие. Механизм действия арахидоновой кислоты на ионные каналы является различным для различных типов каналов. Модулирующие действие жирных кислот на ионные каналы может состоять в их прямом взаимодействии, а может быть более сложным -через активацию протеинкиназы С (ПКС) с последующим

фосфорилированием каналообразующего белка или генерацией свободно-радикальных продуктов перекисного окисления [Linden, Routtenberg, 1989].

В тех случаях, когда на эффект арахидоновой кислоты не оказывают влияние ингибиторы липоксигеназного и циклооксигеназного пути окисления жирных кислот, а также ингибиторы и активаторы протеинкиназы С, влияние арахидоновой кислоты признается прямым.

Впервые прямое действие арахидоновой кислоты на ионные каналы было показано в 1989 году на К+ каналах гладкомышечных клеток [Ordway et al., 1989]. И хотя в подавляющем числе случаев прямое влияние арахидоновой кислоты осуществляется в изолированных пэтчах только с цитоплазматической стороны мембраны, К+ каналы гладкомышечных клеток желудка она активировала и с наружной стороны мембраны и с внутренней [Ordway et al., 1989]. Было показано, что жирные кислоты ингибировали АТФ-зависимые К+ каналы в клетках желудочка крысы [Kim, Duff, 1990] и ингибировали активность К+ каналов в апикальных мембранах собирательных трубочек почки крысы [Wang et al., 1992], но активировали АТФ-нечувствительные К+ каналы в предсердии [Kim, Clapham, 1989]. Арахидоновая кислота, действуя непосредственно на К+ канал, уменьшала амплитуду калиевых токов в олигодендроцитах, что приводило к деполяризации мембраны [Soliven, Wang, 1995]. Модулирующий эффект арахидоновой кислоты на высоко- и низкопороговые кальциевые каналы был обнаружен в нейронах [Schmitt, Meves, 1995]. На мышиных фибробластах в методике inside-out было показано, что аппликация 1 мкМ арахидоновой кислоты и ее не метаболизируемого аналога (ETYA) с цитоплазматической поверхности мембраны приводила к активации Са2+ токов проводимостью порядка 8 пСм. В этой же работе было показано, что митогенный фактор роста фибробластов (bFGF) активировал каналы с теми же свойствами, что и

арахидоновая кислота. Это вполне объяснимо, поскольку ростовые факторы связанные с тирозинкиназными рецепторами активируют, протеинкиназы (МАРК) и фосфолипазы А2, и, как следствие этого, увеличивают концентрацию свободной арахидоновой кислоты в клетке. [Munaron et al., 1997].

В настоящее время показано участие арахидоновой кислоты в регуляции внутриклеточного кальциевого обмена. Она может быть одним из возможных регуляторов 1Рз-зависимого высвобождения Са2+. Так показано, что арахидоновая кислота стимулирует высвобождение Са2+ из немитохондриальных кальциевых депо в клетках островков Лангерганса поджелудочной железы [Wolf et al., 1986], в мезангиальных клетках почки [Force et al., 1991], в тромбоцитах человека [Fuse, Tai 1988]. В культуре клеток HL-60, нагруженных фура-2, арахидоновая кислота и другие ненасыщенные жирные кислоты вызывали 2-х фазный подъем внутриклеточного Са2+ за счет быстрой мобилизации Са2+ из внутриклеточных депо и более медленной и длительной по времени активацией входа ионов кальция в клетку [Packham et al.,1995].

Негативный контроль арахидоновой кислоты на 1Р3-вызванную мобилизацию Са2+ был впервые показан Мариямой [Maruyama, 1993]. В методике whole-cell на клетках поджелудочной железы крысы было показано, что стимулирование поверхности клеток ацетилхолином или внутриклеточная перфузия 1Р3 активирует быстро проходящие (в

О 4-

пределах минуты) Са -зависимые хлорные токи. Введение в наружный раствор ингибитора фосфолипазы А2 4-бромофенацилбромида (4-БФБ) усиливало и продлевало активность каналов на несколько минут. Было также показано, что в присутствии 4-БФБ сходный эффект проявляли и инозитол (2,4,5)- трифосфат и инозитол (1,3,4,5)-тетракифосфат. На активированные токи не действовали ингибиторы окислительного метаболизма арахидоновой кислоты индометацин, NDGA, и проадефин (SKF525A), хотя добавление арахидоновой кислоты сразу ингибировало вызванную активность. Эти результаты подтвердили предположение,

что 4-БФБ потенцирует токи, ингибируя активность фосфолипазы А2, тем самым предотвращая образование свободной арахидоновой кислоты, которая вероятно блокирует эти токи.

Позже, методом patch-clamp на клетках поджелудочной железы мыши было показано, что в условиях ингибирования фосфолипазы А2 (1,3,4,5)-1Р4 может вызывать и выброс Са2+ из внутриклеточных депо, и его вход снаружи внутрь клетки, подобно IP3 [Rowles, Gallacher, 1996}. Арахидоновая кислота блокировала токи, вызванные 1Р3 и 1Р4+4-ВРВ, однако ее эффект нельзя было объяснить прямой блокадой ионных каналов, поскольку Са2+ ионофор иономицин в присутствии АК восстанавливал активацию этих токов. Наиболее вероятным объяснением действия ингибитора фосфолипазы А2 авторы считают увеличение чувствительности рецептора IP3 к инозитол- фосфатам, в результате ингибирования арахидоновой кислоты. Поскольку принято считать, что (1,4,5,) 1Р3 и (1,3,4,5) 1Р4 действуют на различные специфические рецепторы, возможно, что эффект 4-бромофенацилбромида заключается в появлении функциональных связей между ними, так что оба они становятся способны регулировать выброс Са2+ из внутриклеточных хранилищ. Таким образом, показано, что (1,3,4,5) 1Р4, может участвовать во внутриклеточном Са2+ обмене при условии отсутствия негативного контроля со стороны арахидоновой кислоты.

Последние исследования [Striggow, Ehrlich, 1997] показали, что Са2+ каналы рецептора 1Р3 эндоплазматического ретикулума: и рианодинового рецептора (RyR), регулируются арахидоновой кислотой. Природа этой регуляции является рецептор-специфичной; IP3R ингибируется арахидоновой кислотой в то время, как рианодиновый рецептор активируется продуктом липоксигеназного пути окисления арахидоновой кислоты - лейкотриеном В4 (ЬТВ4). В этих экспериментах каналы IP3R, встроенного в искусственные мембраны, активировали, добавляя с цитоплазматической стороны 2 мкМ 1Р3 и 0.5 мМ АТФ;

введение в этот раствор 100 мкМ арахидоновой кислоты полностью ингибировало активность каналов, в то время как олеиновая кислота, являясь также полиненасыщенной жирной кислотой, не влияла ни на вероятность открытого состояния каналов, ни на их амплитуду. В этой работе были протестированы также продукты циклооксигеназного пути окисления арахидоновой кислоты (простагландин 02 (РСБ2), и простагландин Н2 (РСН2)). Как оказалось, ни Р002 ни РОН2 не участвуют ни в активации, ни в ингибировании рецептора 1Рз. В то время, как лейкотриен В4 увеличивал и вероятность и время открытого состояния каналов рианодинового рецептора.

Регуляция уровня внутриклеточного Са2+ арахидоновой кислотой и продуктами ее метаболизма вносит дополнительный элемент в сложную систему внутриклеточной Са2+ сигнализации.

Существующее в настоящее время многообразие научной литературы в области исследования 1Р3-зависимого входа Са2+ показывает огромный интерес к этой проблеме. Но, несмотря на разнообразие применяемых методов в изучении данной проблемы, до сих пор этот вопрос остается до конца не исследованным и спорным.

Данная работа представляет собой исследование участия в кальциевом входе Са -переносящих каналов, способных непосредственно активироваться 1Р3 и обеспечивать вход Са2+ во время ответа клетки на рецепторный стимул.

2. Материалы и методы исследования.

2.1. Клетки. Исследования проводили на резидентных перитонеальных макрофагах, выделенных из взрослых самцов мыши линии Balb. Резидентные макрофаги мышей получали промыванием брюшной полости средой RPMI 1640 (Москва) с добавлением 10 % эмбриональной сыворотки ("Flow", Англия ), 5 ЕД/мл гепарина, 1000 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки культивировали в пластиковых чашках Петри на покровных стеклах размером 4x4 мм в инкубаторе с 5 % С02 при 37 °С. Через 2 ч после выделения клеток среду заменяли на свежую, не содержащую гепарин. Опыты ставили на 2-5 сутки культивирования макрофагов.

Тест на эстеразную активность с использованием а-нафтил- ацетата показал, что не менее 98 % выделяемых клеток - макрофаги.

>у . <-\,

2.2. Флуоресцентные измерения цитоплазматического Са . [Са ]¡ в

одиночных резидентных перитонеальных макрофагах измеряли с помощью флуоресцентного зонда fura-2 AM (Molecular Probes, США). Клетки окрашивались 30-45 мин при 37°С в среде с 5 мкМ fura-2 AM. Бескальциевую среду получали добавлением к раствору, не содержащему СаС12, 0,1 мМ EGTA. Флуоресценцию fura-2 поочередно возбуждали светом с длинами волн 340 и 380 нм с помощью ксеноновой лампы ДКСШ-150, а регистрировали при 520 нм. Для определения [Са ]¡ использовали отношение флуоресценции при длинах волн F340/F380 (Grynkiewiez et al., 1985).

2.3. Регистрация ионных токов и обработка данных. В работе использовали метод локальной фиксации потенциала (patch clamp) в двух конфигурациях - cell-attached и inside-out.

Конфигурация cell-attached позволила нам регистрировать токи одиночных каналов на участке плазматической мембраны,

ограниченном поверхностью регистрирующей пипетки практически без нарушения целостности клетки и состава её цитоплазмы.

В конфигурации inside-out регистрировали токи на изолированном фрагменте мембраны в условиях, когда наружная поверхность плазматической мембраны обращена в регистрирующую пипетку, а цитоплазматическая сторона мембраны доступна для смены растворов. Потенциал внеклеточного раствора принимали за нулевой. Микропипетки изготавливались из молибденового стекла, покрывались силгардом 184 и оплавлялись непосредственно перед экспериментом. Использовались пипетки, имеющие сопротивление от 4 до 12 MQ. Токи регистрировали при помощи "patch-clamp"- усилителя PC 501A (Warner Instr.) с сопротивлением в цепи обратной связи 10 ГОм и фильтровали 6-полюсным фильтром Бесселя с частотой среза 200 Гц, затем записывали в компьютер с помощью аналого-цифрового преобразователя PCL-718 (Laboratory Technologies Corp.) с частотой считывания 1-2 кГц. Для выделения сигнала из шумов при обработке данных проводилась дополнительная цифровая фильтрация с частотой среза от 50 до 100 Гц.

Обработку данных и подготовку графиков проводили при помощи прикладной программы для обработки токовых записей активности одиночного ионного канала pClamp 6.0.2 (Axon Instruments) и графической программы Microcal Origin 5.

Активность каналов оценивалась по вероятности открывания NP0, (произведение числа каналов N на вероятность открывания канала Ро), вычислявшейся по формуле: NP0 = <I> / i, где <1> - средний ток через фрагмент за определенный промежуток времени; i - амплитуда тока через одиночный канал. Значения амплитуд токов определяли в результате анализа амплитудных гистограмм, которые описывались гауссовским распределением.

2.4. Растворы. В начале опыта стекла с прикрепленными на них клетками помещали в экспериментальную камеру, заполненную контрольным наружным раствором следующего состава (мМ): 145 NaCl, 5 КС1, 20 HEPES/KOH, 2 СаС12, 1 MgCl2, (рН 7.4). После достижения плотного контакта между поверхностью регистрирующей пипетки и мембраной, раствор в камере заменяли на аналогичный, в котором все ионы Na+ были заменены на К+ для компенсации потенциала покоя клетки. Раствор в регистрирующей пипетке содержал (мМ): 105 ВаС12, 10 Трис / НС1. Присутствие ионов Ва способствовало предотвращению активации Са -зависимых калиевых каналов. В некоторых экспериментах в качестве проникающего катиона использовали 100 мМ Са2+. Внутриклеточный раствор содержал (в мМ): 140 К-глутамат, 5 NaCl, 10 HEPES/KOH, 5.98 СаС12, 10 EGTA, 1 MgCl2, (рН 7.4, рСа 7). Концентрации Са рассчитывали на основании формул, приведенных в статье Fabiato А. и Fabiato F.(1979). 1Р3, гепарин, GTPyS, 4-бромфенацилбромид (4-БФБ), мепакрин, тапсигаргин, арахидоновую кислоту (АК) (Sigma), хранили в замороженном виде; растворы приготавливали непосредственно перед экспериментом. Подачу свежеприготовленного раствора производили путем перфузии камеры 35-кратным объемом, что обеспечивало полную смену раствора менее чем за 1 сек.

о

Опыты проводили при температуре 22-24 С

3 Результаты исследования.

3.1. Активация входа Са2+ в клетку при действии уридинтрифосфата (UTP).

Активация пуринэргических рецепторов в макрофагах приводит к

« гл 2 +

увеличению внутриклеточной концентрации Са как за счет мобилизации Са2+ из внутриклеточных депо, так и за счет его поступления снаружи внутрь клетки. Опустошение кальциевых хранилищ может быть инициировано стимуляцией Р2и подтипа пуринорецептора, сопряженного с активацией фосфолипазы С [Alonso-Torre, Trautmann, 1993].

В данной серии экспериментов исследовался вход Са снаружи внутрь клеток, возникающий после 1Рз-зависимого выброса Са из внутриклеточных депо. Для изучения природы этого входа мы использовали UTP - агонист группы пуринэргических рецепторов, не имеющий рецепторов Са2+ каналов в плазматической мембране .макрофагов, но запускающий фосфоинозитидный обмен в клетке, приводящий к опустошению внутриклеточных кальциевых пулов.

Измерение уровня цитоплазматического Са2+ проводилось с использованием Са2+-чувствительного зонда fura-2AM на одиночных клетках культуры перитонеальных макрофагов мыши. Иммобилизованные на стекле макрофаги нагружали в течение 40 мин в культуральной среде, содержащей 1мкМ раствора fura-2AM и после этого отмывали физиологическим раствором и переносили в экспериментальную камеру. Подачу агониста проводили в бескальциевой среде, для того, чтобы добиться максимального опустошения внутриклеточных Са2+ депо. Затем проводили повторную подачу UTP в бескальциевом растворе. Как видно на рисунке 3, при стимуляции макрофага 100 мкМ UTP в среде, не содержащей Са2+, наблюдался резкий подъем цитоплазматического Са2+ и быстрый его спад до исходного уровня, что может быть объяснено ГРз-зависимым выбросом Са2+ из внутриклеточных кальциевых депо. При дальнейшем выдерживании клеток в бескальциевой среде повторная подача агониста

2+

не вызывала повторный выброс Са из внутриклеточных хранилищ. Последующее добавление Са во внешнюю среду вызывало длительный стационарный подъем внутриклеточной концентрации Са2+. Этот подъем указывал на вход Са2+ в клетку через внешнюю плазматическую мембрану.

[Са2^ мкМ

юоо - и

800 -

600 -

400 -

200 -

итр

итр

Са

2+

600 -

400 -

200 -

УТР

Са

2+

итр

1\П

.2+

-г-

200

I

400

600

время (сек)

Са

2+

.2+

—г~

800

1000

Рис.З Вход Са2+ в клетку, активируемый опустошением внутриклеточных Са2+- депо.

Концентрация [Са2+]; измерялась с помощью флуоресцентного красителя Шга-2АМ.

вверху: Аппликация иТР вызывает выброс Са2+ из депо; повторная подача ИГР не приводит к выбросу Са2+. Вход Са2+ снаружи приводит к заполнению депо и обеспечивает повторный выброс Са2+ в ответ на ШТ.

внизу: Ионы "№2+ блокируют поступление Са2+ в клетку.

После выдерживания клеток в кальций-содержащей среде (2 мМ СаСЬ), регистрировался повторный выброс Са2+ при действии иТР. Таким образом, было продемонстрировано, что выброс Са2+ из внутриклеточных депо влечет за собой вход Са2+ снаружи внутрь клетки, необходимый для пополнения кальциевых запасов. Этот вход известен в литературе как «депо-зависимый» или «емкостной» кальциевый вход.

Добавление в кальций-содержащий раствор (2-10 мМ) №2+ или

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Семенова, Светлана Борисовна

Выводы.

1. Методом локальной фиксации потенциала на изолированном фрагменте мембраны показано, что инозитол (1,4,5)-трифосфат прямо активирует ионные каналы в плазматической мембране перитонеальных макрофагов мыши.

2. Методом локальной фиксации потенциала на нативной клетке показано, что уридинтрифосфат (UTP) активирует Са2+ каналы со свойствами идентичными каналам, зарегистрированным при действии 1Р3 в изолированном фрагменте мембраны.

3. Зарегистрированные каналы характеризуются низкой проводимостью (около 1 пСм для 100 мМ Са2+ и 105 мМ Ва2+), высокой селективностью для Са относительно К (Рса/Рк^ООО); вероятность их открытого состояния возрастает при гиперполяризации мембраны. Указанные свойства резко отличают эти каналы от 1Рз-активируемых каналов эндоплазматического ретикулума, но позволяют причислить их к семейству CRAC каналов.

4. Для исследуемых каналов характерна 1Рз-зависимая десенситизация рецептора, они блокируются гепарином и арахидоновой кислотой, их активность можно продлить, используя блокаторы фосфолипазы А2. Рецепторные свойства исследуемых каналов близки свойствам рецептора 1Р3 эндоплазматического ретикулума.

5. Полученные факты позволяют предположить, что исследуемые нами

2+

1Р3-чувствительные Са каналы, возможно, регулируются через рецептор 1Р3 эндоплазматического ретикулума, который путем неких конформационных изменений при связывании с 1Р3 передает сигнал с эндоплазматического ретикулума к высокоселективному Са2+ каналу плазматической мембраны.

В заключение я хотела бы выразить глубокую благодарность моему научному руководителю профессору Г.Н. Можаевой за постоянную помощь и поддержку при проведении экспериментальной части работы, обсуждении полученных результатов и написании диссертации.

Мне также хотелось бы поблагодарить моих коллег Вадима Алексеенко, Антона Мамина, Игоря Клюбина, Лену Ведерникову, Алену Казначееву, и всех остальных сотрудников лаборатории ионных каналов клеточных мембран за непосредственную помощь в экспериментальной работе и в оформлении диссертационной работы, а также за дружеское отношение, которое очень помогало при выполнении данного исследования.

4.1. Заключение.

Таким образом, в настоящей работе показано, что инозитол-трифосфат прямо активирует ионные каналы в плазматической мембране перитонеальных макрофагов мыши. Свойства данных каналов идентичны, тем которые зарегистрированы при действии Са2+-мобилизующего агониста - уридинтрифосфата. Низкая проводимость, высокая селективность к двухвалентным ионам, способность этих каналов активироваться при высоких отрицательных потенциалах на мембране резко отличают эти каналы от известных 1Р3-активируемых каналов в эндоплазматическом ретикулуме, однако позволяют их сопоставить с каналами, чувствительными к опустошению внутриклеточных Са -депо (CRAC каналами). Примечательно, что рецепторные характеристики изучаемых каналов - значения действующих концентраций 1Р3, 1Р3-зависимая десенситизация рецептора, ингибирование гепарином и арахидоновой кислотой -подобны свойствам IP3R эндоплазматического ретикулума.

Полученные нами данные на изолированных фрагментах мембраны, позволяют исключить влияние на активность каналов процессов, сопряженных с опустошением Са2+-депо. Это позволяет нам предположить, что фактором, запускающим активность исследуемых каналов является их прямое взаимодействие с активированным в результате связывания с 1Р3 рецептором 1Р3 эндоплазматического ретикулума, расположенным в непосредственной близости к плазматической мембране. Такая точка зрения согласуется с известной в литературе «конформационной» моделью взаимодействия, подкрепленной многими морфологическими и иммуноцитохимическими данными.

Естественно, эта гипотеза нуждается в дополнительных экспериментальных исследованиях, в том числе включая современные молекулярные методы. И мы надеемся, что наши данные найдут поддержку в дальнейших исследованиях этой модели.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Семенова, Светлана Борисовна, 1998 год

Список литературы.

1. Крутецкая З.И., Лебедев О.В. Модуляция активности ионных каналов клеток арахидоновой кислотой, продуктами ее метаболизма и другими жирными кислотами. // Цитология. - 1995, - 37, -с.26-44.

2. Крутецкая З.И., Лебедев О.В. Роль тирозинового фосфорилирования в регуляции активности ионных каналов клеточных мембран.// СПб.: Изд.Айю, -1998, -с.94-112.

3. Alonso-Torre S.R., Trautmann A. Calcium responces elicited by nucleotides in macrophages. // J.Biol.Chem. -1993, - 268, -p. 1864018647.

4. Anderson K., Lai F.A., Liu Q.Y., Rousseau E., Erickson H.P., Meissner G. Structural and functional characterization of the purified cardiac ryanodine receptor - Ca2+ release channel complex // J.Biol.Chem. -

1989,- 264. - p. 1329-1335.

5. Axelrod J. Receptor-mediated activation of phospholipase A2 and arachidonic acid release in signal transduction. // Biochem. Soc. Trans. -

1990, - 18. - p.503-507

6. Barbour SE, Dennis EA Antisense inhibition of group II phospholipase A2 expression blocks the production of prostaglandin E2 by P388D1 cells. //J. Biol. Chem. -1993, -268, - p.21875-21882

7. Berridge M.J. Calcium oscillations. // J. Biol. Chem. -1990, -15, -265. -p. 9583-9586

8. Berridge M.J. Capacitative calcium entry. // Biochem.J. -1995, -312 -p.l-11.

9. Bezprozvanny I., Ehrlich B.E. Inositol (l,4,5)-trisphosphate (InsP3)-gated Ca channels from cerebellum:conduction properties for divalent cations and regulation by intraluminal calcium. // J.Gen.Phys. -1994, -104, -p.821-856.

10. Beprozvanny 1, Watras J, Ehrlich BE Bell-shaped calcium-response curves of Ins(l,4,5)P3- and calcium-gated channels from endoplasmic reticulum of cerebellum.//Nature. - 1991, - 351, - p.751-754

11. Blondel O., Takeda J., Janssen H., Seino S. and Bell G.I.: Sequence and functional characterization of a third inositol trisphosphate receptor subtype, IP3R-3, expressed in pancreatic islets, kidney, gastrointestinal tract, and other tissues. //J Biol. Chem. -1993,-268, -p. 11356-11363.

12. Balsinde J., Fernandez B., Diez E. Regulation of arachidonic acid release in mouse peritoneal macrophages.The role of extracellular calcium and protein kinase. H Immunol. -1990, -144, -p.4298-4304.

13. Bourguignon LY, Jin H Identification of the ankyrin-binding domain of the mouse T-lymphoma cell inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) receptor and its role in the regulation of IP3-mediated internal Ca2+ release. // J. Biol. Chem. - 1995, -270, -p.7257-7260

14. Bourguignon L.Y., Jin H., Iida N., Brandt N.R., Zhang S.H. The involvement of ankyrin in the regulation of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor-mediated internal Ca24 release from Ca2+ storage vesicles in mouse T-lymphoma cells. //J. Biol. Chem. -1993, -268, -p.7290-7297.

15. Brent LH, Gong Q, Ross JM, Wieland SJ Mitogen-activated Ca++ channels in human B lymphocytes. // J. Cell Physiol. - 1993, - 155, -p.520-529

16. Chadwick C.C., Saito A., Fleischer S. Isolation and characterisation of the inositol trisphospate receptor from smooth muscle. // Proc.Natl.Acad. Sci. USA -1990, -87, -p.2132-2136.

17. Chiavaroli C., Bird G., Putney J.W. Jr. Delayed "all-or-none" activation of inositol 1,4,5-trisphosphate-dependent calcium signaling in single rat hepatocytes. // J. Biol. Chem. -1994, -269, -p.25570-25575.

18. Davies E.V., Hallett M.B. A soluble cellular factor directly stimulates Ca2+ entry in neutrophils. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1995, -206, -p. 348-354.

19. DeLisle S., Blondel O., Longo F.J., Schnabel W.E., Bell G.I., Welsh M.J. Expression of inositol 1,4,5-trisphosphate receptors changes the Ca2+signal of Xenopus oocytes. // Am. J. Physiol. -1996, -270, -p. 12551261.

20. Dennis E.A. Diversity of group types, regulation, and function of phospholipase A2. // J. Biol. Chem. -1994, -269, - 6, -p. 13057-13060. "

21. Dennis E.A., Rhee S.G., Billah M.M., Hannun Y.A. Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction. // FASEB J. -1991, -5,-p.2068-2077

22. Ehrlich B.E., Watras J. Inositol 1,4,5-trisphosphate activates a channel from smooth muscle sarcoplasmic reticulum. // Nature -1988, -336, -c.583-586.

23. Fabiato A., Fabiato F. Calculator programs for computing the composition of the solutions containing multiple metals and ligands used for experiments in skinned muscle cells. // J. Physiol. Paris -1979, -75, -p.463-505.

24. Fadool D.A., Ache B.W. Plasma membrane inositol 1,4,5-trisphosphate-activated channels mediate signal transduction in Lobster olfactory receptor neurons. // Neuron -1992, -9, -p.907-918.

25. Fasolato C., Innocenti B., Pozzan T. Receptor-activated Ca2+ influx: how many mechanisms for how manychannels? // Trends. Pharmacol. Sci. -1994, -15, -p.77-83

26. Ferris C.D., Huganir R.I., Supattapone S. and Snyder S.H. Purified inositol 1,4,5-trisphosphate receptor mediates calcium flux in reconstituted lipid viscles. //Nature, - 1989, - 342, - p. 87-89.

27. Fisher S.K., Agranoff B.W. Receptor activation and inositol lipid hydrolysis in neural tissues. // J. Neurochem. -1987, - 48, -p.999-1017

28. Fisher SK, Heacock AM, Seguin EB, Agranoff BW Polyphosphoinositides are the major source of inositol phosphates in

carbamoylcholine-stimulated SK-N-SH neuroblastoma cells// Mol Pharmacol. - 1990, - 38, - p.54-63.

29. Fleming I, Fisslthaler B, Busse R Calcium signaling in endothelial cells involves activation of tyrosine kinases and leads to activation of mitogen-activated protein kinases. // Circ. Res. -1995, -76, -p.522-529.

30. Force T., Hyman G., Hajjar R., Sellmayer A., Bonventre J.V. Noncyclooxygenase metabolites of arachidonic acid amplify the vasopressin-induced Ca signal in glomerular mesangial cells by releasing Ca2+ from intracellular stores. // J. Biol. Chem. -1991, -266, -5, -p.4295-4302.

31. Furuichi T„ Yoshikava S., Miyawaki A., Wada K., Maeda N., Mikoshiba K. Primary structure and functional expression of the inositol 1,4,5-trisphosphate-binding protein P400. // Nature -1989, -342, -p.32-38.

32. Furuichi T., Simon-Chazottes D., Fujino I, Yamada N., Hasegawa M., Miyawaki A., Yoshikawa S., Guenet J.L. and Mikoshiba K.: Widespread expression of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1 gene (Insp3rl) in the mouse central nervous system. // Recept Channels. -1993, -1, -p. 11-24.

33. Fuse I., Tai H.H. Does protein kinase C activation mediate thrombin-induced arachidonate release in human platelets? // Biochim. Biophys. Acta. -1988, - 972, -p.54-59.

34. Fujimoto T., Nakade S., Miyawaki A., Mikoshiba K. and Ogawa K.: Localization of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor-like protein in plasmalemmal caveolae. // J. Cell Biol. - 1992, - 119, - p. 1507-1513.

35. Gacia J., Tanabe T. and Beam K.G. Relationship of calcium transients to calcium currents and charge movements in myotubes expressing skeletal and cardiac dyhidropyridine receptor// J.Gen.Physiol. - 1994, - 103, -p.125-147

36. Gilon P., Bird G.J., Bian X., Yakel J.L., Putney J.W. Jr. The Ca2+-mobilizing actions of a Jurkat cell extract on mammalian cells and Xenopus laevis oocytes. //J. Biol. Chem. -1995, -270, -7, -p.8050-8055.

37. Graber R., Sumida C., Nunez E.A. Fatty acids and cell signal transduction. // J. Lipid Mediat. Cell Signal. -1994, -9, -91-116.

38. Grynkiewiez G., Poenie M., Tsien R.Y. A new generation of calcium indicators with greatly improved fluorescent indicator // J. Biol. Chem. -1985, - 260, - p. 3440-3450.

39. Guillemette, G., I. Favreau, G. Boulay. Solubilization and partial characterization of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor of bovine adrenal cortex reveal similarities with the receptor of rat cerebellum. // Mol. Pharmacol.-1990,-38,-p.841-847.

40. Hajnoczky G., Thomas A.P. The inositol trisphosphate calcium channel is inactivated by inositol-trisphosphate. // Nature -1994, -370, -p.474-477.

41. Hardie R.C., Minke B. Novell Ca2+ channels underlying transduction in Drosophila photoreceptors: implications for phosphoinisitide-mediated Ca2+ mobilization. // Trends in Neurosciences. -1993, -16, -p.371-376.

42. Harnick D. J, Jayaraman T., Ma Y., Mulieri P., Go LO, Marks A.R. The human type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptor from T lymphocytes. Structure, localization, and tyrosine phosphorylation. // J Biol Chem. -1995, - 270, -p.2833-2840

43. Harteneck C., Obukhov A.G., Zobel A., Kalkbrenner F., Schultz G. The Drosophila cation channel trpl expressed in insect Sf9 cells is stimulated by agonists of G-protein-coupled receptors. // FEBS Lett. -1995, -p.297-300

44. Hille B. Ionic Channels of Excitable Membranes. // Sunderland, MA: Sinauer Associates. - 1992.

45. Hoth M. Calcium and barium permeation through calcium-release-activated calcium (CRAC) channels. // Pfluegers Arch. -1995, -430, -p.315-322.

46. Hoth M., Penner R. Depletion of intracelular calcium stores activates a calcium current in mast cells. // Nature -1992, -355, -p.353-356.

47. Hoth M., Penner R. Calcium release-activated calcium current in rat mast cells. //J.Physiol. -1993, -465, -p.359-386.

48. Hu Y., Schilling W.P. Receptor-mediated activation of recombinant Trpl expressed in Sf9 insect cells. // Biochem. J. -1995, -305, -p.605-611

49. lino M., Yamazawa T., Miyashita Y., Endo M., Kasai H. Critical intracellular Ca2+ concetration for all-or-none Ca2+ spiking in single muscle cells. // EMBO. -1993, -p.5287-5291.

50. Ioshii S.O., Yoshida T., Imanaka-Yoshida K., Izutsu K. Distribution of a Ca storing site in PtK2 cells during interphase and mitosis. Aii immunocytochemical study using an antibody against calreticulin. // Eur. J. Cell Biol. -1995, -66, - p.82-93

51. Irvine R.F. Calcium control and InsP4. // Nature. -1991, -352(6331), -p.115

52. Irvine R.F. 'Quantal' Ca2+ release and the control of Ca2+ entry by inositol phosphates—a possible mechanism. // FEBS Lett. -1990, 263, -p.5-9

53. Jayaraman T., Ondriasova E., Ondrias K., Harnick D.J., Marks A.R. The inositol 1,4,5-trisphosphate receptor is essential for T-cell receptor signaling. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1995, -92, -p.6007-6011.

54. Joseph S.K., Samanta S. Detergent solubility of the inositol trisphosphate receptor in rat brain membranes. Evidence for association of the receptor with ankyrin. // J. Biol. Chem. -1993, -268, -p.6477-6486.

55. Kim D., Clapham D.E. Potassium channels in cardiac cells activated by arachidonic acid and phospholipids. // Science. -1989, -244, -p. 11741176

56. Kim D., Duff R.A. Regulation of K+ channels in cardiac myocytes by free fatty acids. // Circ. Res. -1990, - 67, -p. 1040-1046.

57. Kiselyov K.I., Mamin A.G., Semyonova S.B., Mozhayeva G.N. Low-conductance high selective inositol (l,4,5)-trisphosphate activated Ca2+ channels in plasma membrane of A431 cells. // FEBS Letters -1997, -407, -p.309-312.

58. Khan W.A., Blobe G.C., Hannun Y.A. Arachidonic acid and free fatty acids as second messengers and the role of protein kinase C. // Cell Signal. -1995, -p. 171-184

59. Khan A.A., Steiner J.P., Snyder S.H. Plasma membrane inositol 1,4,5-trisphosphate receptor at lymphocytes: Selective enrichment in sialic acid and unique binding specificity. // Proc.Natl.Acad.Sci. USA -1992b, -89, -p.2849-2853.

60. Khan A.A., Steiner J.P., Klein M.G., Schneider M.F., Snyder S.H. IP3 receptor: localization to plasma membrane of T cells and cocapping with the T cell receptor. // Science -1992a, -257, -p.815-818.

61. Kramer R.M., Checani G.C., Deykin D. Stimulation of Ca2+-activated human platelet phospholipase A2 by diacylglycerol. // Biochem. J. -1987, -248, -p.779-783.

62. Kuno M., Gardner P. Ion channels activated by inositol 1,4,5-trisphosphate in human T-lymphocytes. // Nature -1987, -326, -p.301-304.

63. Kunze D.L., Ritchie A.K. Multiple conductance levels of the dihydropyridine-sensitive calcium channel in GH3 cells. // J. Membr. Biol. - 1990,-1 18,-p.171-178.

64. Lapetina E.G., Billah M.M., Cuatrecasas P. The phosphatidylinositol cycle and the regulation of arachidonic acid production. // Nature. -1981, -292, -p.367-369

65. Lee K.M., Toscas K., Villereal M.L. Inhibition of bradykinin- and thapsigargin-induced Ca2+ entry by tyrosine kinase inhibitors. // J. Biol. Chem. -1993, -268, -p.9945-9948.

66. Lepple-Wienhues A., Cahalan M.D. Conductance and permeation of

fS ,

monovalent cations through depletion-activated Ca channels (ICRAC) in Jurkat T cells. // Biophys. J. -1996, -71, -p.787-794

67. Lievremont J.P., Hill A.M., Hilly M., Mauger J.P. The inositol 1,4,5-trisphosphate receptor is localized on specialized sub-regions of the endoplasmic reticulum in rat liver. // Biochem. J. -1994, -300, -p. 419427

68. Lin L.L., Lin A.Y., Knopf J.L. Cytosolic phospholipase A2 is coupled to hormonally regulated release of arachidonic acid. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA . -1992, -89, - p. 6147-6151

69. Lin L.L., Wartmann M., Lin A.Y., Knopf J.L., Seth A., Davis R.J. cPLA2 is phosphorylated and activated by MAP kinase. // Cell. - 1993, -72, -p. 269-278.

70. Linden D.J., Routtenberg A. cis-Fatty acids, which activate protein kinase C, attenuate Na+ and Ca2' currents in mouse neuroblastoma cells. //J. Physiol. (Lond), -1989, -419, -p.95-119.

71. Luckhoff A., Clapham D.E. Calcium channels activated by depletion of internal calcium stores in A431 cells. // Biophys.J. -1994, -67, -p. 177182.

72. .Lupu V.D., Kaznacheyeva E., Krishna U.M., Falck J.R., Bezprozvanny I. Functional coupling of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate to inositol 1,4,5-trisphosphate receptor. // J. Biol. Chem. -1998, -273, -p. 14067-14070

73. Maeda N, Kawasaki T, Nakade S, Yokota N, Taguchi T, Kasai M and Mikoshiba K: Structural and functional characterization of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor channel from mouse cerebellum. // J Biol Chem. -1991,-266,-p. 1109-1116.

74. Malarkey K„ Belham C.M., Paul A., Graham A., McLees A., Scott P.H., Plevin R. The regulation of tyrosine kinase signalling pathways by growth factor and G-protein-coupled receptors. // Biochem. J. -1995, -309, -p. 361-375

75. Marshall L.A., Roshak A. Coexistence of two biochemically distinct phospholipase A2 activities in human platelet, monocyte, and neutrophil. // Biochem. Cell Biol. -1993, - 71, -p.31-39

76. Maruyama Y. Control of inositol polyphosphate-mediated calcium mobilization by arachidonic acid in patcreatic acinar cells of rat. // J.Physiol. -1993, -463, -p.C.729-746.

77. Matthews G, Neher E, Penner R J. Second messenger-activated calcium influx in rat peritoneal mast cells. // J. Physiol (Lond). - 989, -418, -p.105-130

78. Mayrleitner M., Schafer R., Fleischer S. IP3 receptor purified from liver plasma membrane is an (l,4,5)IP3-activated and (l,3,4,5)IP4-inhibited calcium permeable ion channel. // Cell Calcium -1995, -17, -p. 141-153.

79. McGivney A., Morita Y., Crews F.T., Hirata F., Axelrod J., Siraganian R.P. Phospholipase activation in the IgE-mediated and Ca2+ ionophore A23187-induced release of histamine from rat basophilic leukemia cells. // Arch. Biochem. Biophys. -1981, -212, -p.572-580.

80. Michell R.H. Is phosphatidylinositol really out of the calcium gate? // Nature. -1982, - 296, -p.492-493.

81. Mignery G.A., Newton C.L., Archer B.T. Ill and Sudhof T.C: Structure and expression of the rat inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor. // J. Biol.. Chem. -1990, - 265, -p. 12679-12685

82. Mignery G.A., Sudhof T.C. Putative receptor for (1,4,5)IP3 similar to ryanodine receptor. // Nature -1989, -342, -p. 192-195.

83. Mignery G.A., Sudhof T.C. The ligand binding site and transduction mechanism in the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor. // EMBO -1990, -9, -p.3893-3898.

84. Mogami H., Nakano K., Tepikin A.V., Petersen O.H. Ca2+ flow via tunnels in polarized cells: recharging of apical Ca stores by focal Ca entry through basal membrane patch. // Cell. -1997, - 88, -p.49-55

85. Mozhayeva G.N., Naumov A.P., Kuryshev Y.A. Activation of Ca2+-sensitive potassium channels in A431 cells by epidermal growth factor and histamine. // Bioligicheskie Membrany -1989, -6, -p.629-636.

86. Mozhayeva G.N., Naumov A.P., Kuryshev Y.A. Calcium-permeable channels activated via guanine nucleotide-dependent mechanism in human carcinoma cells. // FEBS Letters -1990, -277, -p.227-229.

87. Mozhayeva G.N., Naumov A.P., Kuryshev Y.A. Variety of Ca-permeable ion channels in human carcinoma A431 cells. // J.Membr.Biol. -1991, -124, -p. 113-127.

88. Munaron L., Antoniotti S., Distasi C., Lovisolo D. Arachidonic acid mediates calcium influx induced by basic fibroblast growth factor in Balb-c 3T3 fibroblasts // Cell Calcium.- 1997, - 22, -p. 179-188.

89. Newton C.L., Mignery G.A. and Shdhof T.C.: Co-expression of vertebrate tissues and cell lines of multiple inositol 1,4,5-trisphosphate (insP3) receptors with distinct affinities for InsP3. // J Biol. Chem. -1994, -269,-c. 28613-28619.

90. Nozawa Y, Nakashima S, Nagata K Phospholipid-mediated signaling in receptor activation of human platelets.// Biochim. Biophys. Acta. - 1991, -1082, -p.219-238

91. Ordway R.W., Walsh J.V. Jr., Singer J.J. Arachidonic acid and other fatty acids directly activate potassium channels in smooth muscle cells. // Science. - 1989, - 244, -p. 1176-1179.

92. Packham D.E., Jiang L., Conigrave A.D. Arachidonate and other fatty acids mobilize Ca ions and stimulate beta-glucuronidase release in a Ca2+-dependent fashion from undifferentiated HL-60 cells. // Cell Calcium. -1995, -17, -p.399-408

93. Parekh A.B., Penner R.J. Activation of store-operated calcium influx at resting InsP3 levels by sensitization of the InsP3 receptor in rat basophilic leukaemia cells. // Physiol. (Lond), -1995, -489, -p.377-382.

94. Parekh A.B., Fleig A., Penner R. The store-operated calcium current ICRAC: nonlinear activation by InsP3 and dissociation from calcium release. // Cell. - 1997, - 89, - p.973-980.

95. Parekh A.B., Terlau H., Stuhmer W. Depletion of InsP3 stores activates a Ca2+ and K+ current by means of a phosphatase and a diffusible messenger. // Nature. -1993, -364, -p.814-818.

96. Parys J.B., Bezprozvanny I. The inositol trisphosphate receptor of Xenopus oocytes. // Cell Calcium. -1995, -19, -p.353-363.

97. Parys, J.B., S. DeLisle and K.P. Campbell. Purification and characterization of an inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) receptor in Xenopus Laevis oocytes and eggs. // Biophysical J. -1992, -61, -A260.

98. Petersen, C.C.H., M.J. Berridge. The regulation of capacitative calcium entry by calcium and protein kinase C in Xenopus oocytes. // J. Biol.Chem. - 1994, - 269, - p.32246-32253.

99. Petersen C.C., Berridge M. J. G-protein regulation of capacitative calcium entry may be mediated by protein kinases A and C in Xenopus oocytes. // J. Biochem. - 1995, -307, -p. 663-668

100.Petersen C.C., Berridge M.J., Borgese M.F., Bennett D.L. Putative capacitative calcium entry channels: expression of Drosophila trp and evidence for the existence of vertebrate homologues. // Biochem. J. -1995, -311, -p.41-44.

101.Pietri F., Hilly M., Mauger J.P. Calcium mediates the interconversion between two states of the liver inositol 1,4,5-trisphosphate receptor. // J.Biol.Chem. -1990, -265, -p. 17478-17485.

102.Premack B.A., McDonald T.V., Gardner P. Activation of Ca2+ current in Jurkat T cells following the depletion of Ca2+ stores by microsomal Ca2+-ATP-ase inhibitors. // J.Immunol. -1994, -152, -p.5226-5240.

103.Premack B.A., Thomas D.W., Hanley M.R., Gardner, P. Ca2+ channel modulation by calcium influx factors produced following the depletion of intracellular Ca2" stores. // Biophysical Journal -1995, -68, -p.A54

104.Putney J.W.Jr. Biphasic modulation of potassium release in rat parotid gland by carbachol and phenylephrine. // J. Pharmacol. Erp. Ther. - 1976, - 198, -p.375-384.

105.Putney J.W.Jr. A model for receptor-regulated calcium entry. // Cell Calcium. - 1986, - 7, - p. 1-12.

106.Putney J.W.Jr. Capacitative calcium entry revisited. // Cell Calcium -1990, -11, -p.611-624.

107.Putney J.W.Jr., Bird G.S.J. The inositol phosphate-calcium signaling system in nonexciteble cells. // Endocrine Reviews -1993, -14, -p.610-631.

108.Putney J.W. Jr, Bird G.S. The inositol phosphate-calcium signalling system in lacrimal gland cells. // Adv. Exp. Med. Biol. -1994, -350, -p.115-119.

109.Randriamampita C. & Tsien R.Y. Emptying of intracellular Ca2+ stores releases a novel small messen ger that stimulates Ca2+ influx. // Nature -1993, -364, -p.809-814.

110.Ross C.A., Meldolesi J., Milner T.A., Satoh T., Supattapone S., Snyder S.H. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor localized to endoplasmic reticulum in cerebellar Purkinje neurons. // Nature. -1989, -339, -p.468-470.

111.Rossier M.F., Bird G.S., Putney J..W Jr. Subcellular distribution of the calcium-storing inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive organelle in rat liver. Possible linkage to the plasma membrane through the actin microfilaments. // Biochem. J. -1991, - 274, -p.643-650.

112.Rowles S., Gallacher D.V. Ins(l,3,4,5)P4 is effective in mobilizing Ca2+ in moused exocrine pancreatic acinar cells if phospholipase A2 is inhibited. // Biochem. J. -1996, -319, -p.C.913-918.

113.Ruchnudin A., Song M.J., Sachs F. The ultrastructure of patch-clamped membranes: a study using high voltage electron microscopy. // J.Cell.Biol. -1991, -112, -p.125-134.

114.Sargeant P, Farndale RW, Sage SO. Calcium store depletion in dimethyl BAPTA-loaded human platelets increases protein tyrosine phosphorylation in the absence of a rise in cytosolic calcium. // Exp. Physiol. -1994, 79, -p 269-272

115.Satoh T., Ross C.A., Villa A., Supattapone S., Pozzan T, Snyder SH, Meldolesi J The inositol 1,4,5,-trisphosphate receptor in cerebellar Purkinje cells: quantitative immunogold labeling reveals concentration in an ER subcompartment. // J. Cell Biol. -1990, -111, -p.615-624.

116.Scott W.A., Zrike J., Hamill A., Kempe J.,Cohn Z. Regulation of arachidonic acid metabolites in macrophages. // J. Exp. Med. -1980, -152, -p.324-335

117.Selinger Z., Doza Y.N., Minke B. Mechanisms and genetics of photoreceptors desensitization in Drosophila flies. // Biochim. Biophys. Acta. - 1993, -1179, -p.283-299.

118.Schmitt H., Meves H. Modulation of neuronal calcium channels by arachidonic acid and related substances. // J. Membr. Biol. -1995, -145, -233-244.

119.Soliven B., Wang N. Arachidonic acid inhibits potassium conductances in cultured rat oligodendrocytes. // Am. J. Physiol. -1995, - 269, - 341348.

120.Streb H., Irvine R.F., Berridge M.J., Schulz I. Release of Ca2+ from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate. //Nature. -1983, - 306, -p.67-69.

121.Striggow F., Ehrlich B.E. Regulation of intracellular calcium release channel function by arachidonic acid and leukotriene B4. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1997, - 237, - p.413-418

122.Sudhof T.C, Newton C.L, Archer B.T.III, Ushakov Y.A.and Mignery G.A: Structure of a novel InsP3 receptor. // EMBO J. -1991, -10, -p. 3199-3206.

123.Teslenko V., Rogers M., Lefkowith J.B. Macrophage arachidonate release via both the cytosolic Ca2+-dependent and -independent phospholipases is necessary for cell spreading. // Biochim. Biophys. Acta. -1997, -1344, -p. 189-199

124.Tepel M, Kuhnapfel S, Theilmeier G, Teupe C, Schlotmann R, Zidek W Filling state of intracellular Ca2+ pools triggers trans plasma membrane Na+ and Ca2- influx by a tyrosine kinase-dependent pathway. // J. Biol. Chem. - 1994, -269, -p.26239-26242

125.Thomas D.W., Hanley M.R. Evaluation of calcium influx factors from stimulated Jurkat T-lymphocytes by microinjection into Xenopus Oocytes. // J.Biol.Chem. -1995, -270, -p.6429-6432.

126.Thastrup 0., Cullen P.J., Drobak B.K., Hanley M.R., Dawson A.P. Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca2+- ATPase. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -1990, -87, -p.2466-2470

127.Unanue E.R. // in Fundamental Immunology (Paul. W.E., ed)// New York, Raven Press, - 1989, - p.95-116.

128.Vaca L., Kunze D:L. Depletion of intracellular Ca2+ stores activates a Ca2+-selective channel in vascular endothelium. // Am.J.Physiol. -1994, -267, -P.C920-C925.

129.Vaca L., Kunze D.L. IP3-activated Ca2+ channels in the plasma membrane of cultured vascular endothelial cells. // Am. J.Physiol. -1995, -269, -P.C733-C738.

130.Vaca L., Sinkins W.G., Hu Y., Kunze D.L., Schilling W.P. Activation of recombinant tip by thapsigargin in Sf9 insect cells. // Am.J.Physiol. -1994, -267, -p.C 1501-C1505.

131.Vostal J.G., Jackson W.L., Shulman N.R. Cytosolic and stored calcium antagonistically control tyrosine phosphorylation of specific platelet proteins. //J. Biol. Chem. -1991, -266, - p.16911-16916.

132.Wang W., C-assola A., Giebisch G. Arachidonic acid inhibits the secretory K+ channel of cortical collecting duct of rat kidney. // Am. J. Physiol. -1992, - 262, - p.554-559.

133.Watras J., Bezprozvanny I., Ehrlich B.E. Inositol 1,4,5-trisphosphate-gated channels in cerebellum: presence of multiple conductance states. // J.Neurosci. -1991, -11, -p.3239-3245.

134.Whatley R.E., Zimmerman G.A., Mclntyre T.M., Prescott S.M. Lipid metabolism and signal transduction in endothelial cells. // Prog. Lipid. Res. -199, -29, -p.45-63

135.Worleyet P.F., Baraban J.M., Supattapone S., Wilson V.S., Snyder S.H. Characterisation of inositol trisphosphate receptor binding in brain. // J.Biol.Chem. -1987, -262, -p. 12132-12136.

136.Wojcikiewicz RJH. Type I, II and III inositol 1,4,5-trisphosphate receptors are unequally susceptible to down-regulation and are expressed in markedly different proportions in different cell types. // J Biol. Chem. -1995,-270,-p. 11678-11683.

137.Wolf B.A., Turk J., Sherman W.R., McDaniel M.L. intracellular Ca2f mobilization by arachidonic acid. Comparison with myo-inositol 1,4,5-trisphosphate in isolated pancreatic islets. // J. Biol. Chem. -1986, - 261, -p.3501-351 1

138.Xu X.X., Rock C.O., Qiu Z.H., Leslie C.C, Jackowski S. Regulation of cytosolic phospholipase A2 phosphorylation and eicosanoid production by colony-stimulating factor 1.// J. Biol. Chem. -1994, - 2693, - p. 16931700.

139.Yoshikawa F, Morita M, Monkawa T, Mishikawa T, Furuichi T and Mikoshiba K: Mutation analysis of the ligand binding site of inositol

1,4,5-trisphosphate receptor. // J Biol. Chem. -1996, -271, -p. 1827718284.

140.Yoshikawa S, Tanimura T, Miyawaki A, Nakamura M, Yuzaki M, Furuchi T and Mikoshiba K. Molecular cloning and characterization of the inositol 1,4,5-trisphospate receptor in Drosopila melanogaster. // J.Biol.Chem. - 1992, - 365, -p.3199-3206.

141.Yoshihara Y, Watanabe Y. Translocation of phospholipase A2 from cytosol to membranes in rat brain induced by calcium ions.// Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1990, - 170, - p.484-490.

142.Yule DI, Kim ET, Williams JA. Tyrosine kinase inhibitors attenuate "capacitative" Ca influx in rat pancreatic acinar cells.// Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1994, - 202, - p. 1697-1704

143.Yoshida Y, Imai S. Structure and function of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor. // Jpn. J.Pharmacol. - 1997, - 74, - p.125-137.

144.Yamamoto-Hino M, Sugiyama T., Hikichi K, Mattei M.G, Hasegawa K, Sekine S, Sakurada K, Miyawaki A, Furuichi T, Hasegawa M and Mikoshiba K: Cloning and characterization of human type 2 and type 3 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors. // Recept Channel -1994, -2, -p.9-22

145.Zweifach A., Lewis R.S. Mitogen-regulated Ca2+ current of T lymphocytes is activated by depletion of intracellular Ca2+ stores. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA -1993, -90, -p.6295-6299.

146.Zweifach A., Lewis R.S. Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (Icrac) due to local calcium feedback. // J.Gen.Phys. -1995, -105, -p.209-226