Механизмы обратимой метаболической депрессии и гибели гепатоцитов миноги речной (Lampetra fluviatilis L.) в период преднерестовой миграции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Коновалова, Светлана Александровна

• Коновалова, Светлана Александровна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Коновалова, Светлана Александровна

Содержание

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика метаболической депрессии

1.2. Внутриклеточные механизмы развития метаболической депрессии

1.2.1. Организация энергетического метаболизма клетки

1.2.2. Синтез и расход АТФ при метаболической депрессии

1.2.3. Регуляция ионного гомеостаза

1.2.4. Протонная утечка через митохондриальные мембраны в период метаболической депрессии

1.2.5. Обратимое фосфорилирование белков

1.2.6. Изменение внутриклеточного рН в состоянии гипометаболизма

1.3. Регуляция концентрации свободного кальция

1.4. Жизненный цикл миноги

1.5. Механизмы гибели клеток

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Экспериментальные животные

2.2. Выделение гепатоцитов миноги

2.3. Определение концентрации адениновых нуклеотидов в гепатоцитах и кусочках печени миноги

2.3.1. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

2.3.2. Люциферин-люциферазный метод

2.4. Определение митохондриального мембранного потенциала в гепатоцитах миноги

2.5. Определение выживаемости клеток

2.6. Измерение внутриклеточной концентрации свободного кальция

([Са2+]0

2.7. Измерение внутриклеточного рН гепатоцитов миноги

2.8. Выявление апоптотических клеток

2.8.1. Выявление апоптотических и некротических клеток путем последовательного окрашивания акридиновым оранжевым и пропидием йодидом

2.8.2. Определение активности каспаз 3, 7, 9

2.8.3. Определение активности катепсина Б

2.8.4. Определение выхода цитохрома с из митохондрий методом

имму ноблоттинга

2.9. Статистическая обработка полученных результатов

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Концентрации адениновых нуклеотидов в кусочках печени и в гепатоцитах миноги в период преднерестовой миграции

3.2. Изменения митохондриального мембранного потенциала (ММП) в гепатоцитах миноги

3.3. Влияние ингибиторов и субстрата окисления на величину ММП и концентрацию АТФ в гепатоцитах миноги

3.4. Динамика внутриклеточной концентрации свободного кальция и состояние внутриклеточных кальциевых депо

3.4.1. Внутриклеточная концентрация свободного кальция

3.4.2. Состояние внутриклеточных кальциевых депо

3.5. Внутриклеточный рН в гепатоцитах миноги в период преднерестовой миграции

3.6. Выявление апоптотических клеток

4. ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Динамика митохондриального мембранного потенциала и концентрации адениновых нуклеотидов при метаболической депрессии

4.2. Роль свободного кальция в регуляции метаболической депрессии

4.3. Снижение внутриклеточного рН при метаболической депрессии

4.4. Механизмы гибели гепатоцитов. Апоптоз и аутофагия

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений

[Ca2']j - внутриклеточная концентрация свободного кальция

АО - акридиновый оранжевый

DiOC6(3) - 3,3'-ДИгексилоксакарбоцианин йодид

FCCP - карбонилцианид-р(трифлуорометокси)-фенилгидразон

FRET - флуоресцентная резонансная передача энергии (Fluorescence

resonance energy transfer)

HEPES -К-[гидроксиэтил]пиперазин-К'-[2-этилсульфоновая кислота]

IP3 - инозитол-1,4,5-трифосфат

MES - 2(1Ч-морфолино)этилсульфоновая кислота

MTG - митотрекер зеленый (MitoTracker Green)

NAD - никотинамидадениндинуклеотид

NADH - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный

PI - пропидий йодид

РКА - протеинкиназа А

РКС - протеинкиназа С

PKG - протеинкиназа G

RPP - обратимое фосфорилирование белков (reversible protein phosphorylation)

SEM - ошибка среднего (standard error of mean)

SERCA - Са2+-АТФаза эндоплазматического ретикулума (SarcoEndoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase)

SNARF-1 AM - carboxy SemiNaphthoRhodaFluor acetoxymethyl ester TMRM - тетраметилродамин (tetramethyl rhodamine methyl ester) AjxH - электрохимический градиент протонов A\|/m- митохондриальнцый мембранный потенциал Лст- длина волны излучения

- длина волны возбуждения АГ - аппарат Гольджи

АДФ - аденозин - 5'- дифосфат

АМФ - аденозин - 5'- монофосфат

АТФ - аденозин - 5'- трифосфат

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

дбцАМФ - дибутирил циклический аденозинмонфосфат

ММП - митохондриальный мембранный потенциал

ПВК - пировиноградная кислота

рНе - рН внеклеточной среды

рН] - рН внутриклеточной среды

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

ЭГТА - этиленгликольтетраацетат

ЭЗ - энергетический заряд Аткинсона

ЭР - эндоплазматический ретикулум

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизмы обратимой метаболической депрессии и гибели гепатоцитов миноги речной (Lampetra fluviatilis L.) в период преднерестовой миграции»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Метаболическая депрессия - адаптивный биологический процесс, направленный на сохранение энергии в неблагоприятных условиях окружающей среды. Одной из актуальных проблем современной биоэнергетики является исследование механизмов метаболической депрессии, которая сопровождает множество заболеваний у высших животных, в том числе и у человека (например, врожденные митохондриальные заболевания, нейродегенеративные заболевания, сепсис [Зеррй е1 а1., 2009]). Клинические случаи метаболической депрессии необратимы и часто имеют летальный исход. В то же время обратимая метаболическая депрессия является неотъемлемой частью жизненного цикла многих животных. Учитывая эволюционный консерватизм биоэнергетических процессов, эти животные дают возможность изучать механизмы, обеспечивающие вход в метаболическую депрессию, поддержание жизнедеятельности в период метаболической депрессии и выход из этого состояния.

В настоящее время накоплено некоторое количество данных по молекулярным механизмам развития метаболической депрессии, вызванной дефицитом кислорода. Однако практически отсутствуют исследования, посвященные изучению метаболической депрессии, вызванной голоданием. В частности, динамика митохондриального мембранного потенциала в клетках, переживающих метаболическую депрессию, ранее не была исследована.

Объектом наших исследований были гепатоциты миноги. Эти животные представляют особый интерес в изучении феномена метаболической депрессии. Миноги моноцикличны и на протяжении всего преднерестового периода, который длится 8-9 месяцев, не питаются. В течение всей фазы

естественного голодания жизнь миног поддерживается исключительно за счет мобилизации гликогена, липидов и белков, главным образом, мышечной ткани. Большая часть органов в этот период не проявляет каких-либо признаков гипометаболизма, в то время как в печени наблюдается существенное подавление энергетического обмена, связанное с ограничением доступности субстратов. Содержание гликогена в печени очень низкое (50-125 мг%) и не меняется на протяжении всего преднерестового периода [Плисецкая, 1975], содержание белка также не меняется [Savina and Gamper, 1998]. Липидные капли, которыми заполнены гепатоциты, не расходуются до весны. Система кровоснабжения не в состоянии восполнить недостаток субстратов в печени, поскольку 80% крови поступает в печень через портальную вену, а пищеварительная система миноги в этот период полностью атрофирована. Это приводит к глубокой метаболической депрессии.

Однако данная ситуация обратима. Весной под действием гипофизарных гормонов в гепатоцитах активируется липолиз, обеспечивающий энергией синтез вителлогенина - белка, необходимого для созревания икринок [Mommsen and Walsh, 1988]. В этот период энергетические характеристики изолированных гепатоцитов миноги возвращаются к осенним значениям, но на короткое время. Поскольку миноги сразу после нереста погибают, представляло интерес изучение механизмов гибели гепатоцитов.

Гибель клетки может происходить по двум основным путям -некротическому и апоптотическому. Некроз сопровождается разрушением плазматической мембраны и лизисом клеток. В зимний период метаболической депрессии небольшое количество клеток (10-15%) погибает некротической смертью. Остальные гепатоциты весной после окончания синтеза вителлогенина, погибают путем апоптоза. Апоптоз представляет собой более медленный, регулируемый процесс гибели. При этом клетка постепенно фрагментируется и поглощается соседними клетками [Kerr et al.,

1972]. Апоптоз - это запрограммированная смерть клетки, сопровождающаяся активацией каскадов каспаз, митохондриальными событиями (образованием поры высокой проводимости во внутренней митохондриальной мембране и выходом цитохрома с из митохондрий) и фрагментацией ядерной ДНК.

Изучение механизмов апоптоза является одним из наиболее актуальных направлений современной медицинской науки. Это связано с тем, что запрограммированная клеточная гибель связана со многими патологическими состояниями. Несмотря на большое количество экспериментальных данных, до сих пор остаются не выясненными многие механизмы этого явления. В частности, остается неизвестным, что является первопричиной биоэнергетических сдвигов при развитии апоптоза, и в какой взаимосвязи находятся различные пути гибели клетки.

Цели и задачи

Целью настоящей работы было изучение механизмов, лежащих в основе развития и регуляции обратимой метаболической депрессии, а также выявление механизмов гибели гепатоцитов миноги речной в период преднерестовой миграции.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить энергетические параметры гепатоцитов миноги при развитии метаболической депрессии: концентрации адениновых нуклеотидов (в ткани печени и гепатоцитах) и митохондриальный мембранный потенциал (ММП).

2. Изучить действие митохондриальных ингибиторов на выживаемость клеток и концентрации АТФ при метаболической депрессии.

3. Определить концентрацию свободного внутриклеточного кальция и состояние внутриклеточных кальциевых депо при метаболической депрессии.

4. Исследовать динамику внутриклеточного рН при развитии метаболической депрессии.

5. Оценить активность ключевых ферментов митохондриального и лизосомального путей гибели клеток (каспаз 3, 7, 9 и катепсина Б, соответственно), а также определить выход цитохрома с из митохондрий миноги в весенний период.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Вход в метаболическую депрессию в гепатоцитах миноги сопровождается снижением концентрации АТФ, энергетического заряда Аткинсона (АТФ+1/2АДФ)/(АТФ+АДФ+АМФ) и митохондриального мембранного потенциала.

2. Выживаемость клеток в условиях метаболической депрессии обусловлена: снижением внутриклеточного рН, а также умеренным увеличением концентрации свободного цитозольного кальция, создающим условия для координированного ареста ионных каналов через систему обратимого фосфорилирования.

3. Гибель гепатоцитов миноги в весенний период обусловлена выходом цитохрома с из митохондрий и активацией как митохондриального, так и лизосомального путей апоптоза.

Научная новизна результатов исследования

В результате проведенных исследований выявлена динамика изменений митохондриального мембранного потенциала, обнаружены изменения рН и концентрации свободного внутриклеточного кальция в клетке при метаболической депрессии. Исследованы механизмы, обеспечивающие контроль метаболической депрессии. Обнаружено параллельное развитие митохондриального и лизосомального путей гибели клеток.

Теоретическое и практическое значение работы

Работа имеет, прежде всего, значение для фундаментальной науки в области эволюционной биохимии и биоэнергетики. Теоретическое значение работы состоит в расширении представлений о механизмах развития и регуляции обратимой метаболической депрессии. Результаты исследования могут быть полезны для понимания механизмов гибели клеток и взаимосвязи сигнальных путей, задействованных в этом процессе, а также для выявления возможных механизмов защиты клеток от гибели.

Результаты исследования могут быть использованы для дальнейшего изучения механизмов обратимой метаболической депрессии, а также в прикладных целях, например, при разработке новых методических подходов в диагностике и лечении митохондриальных заболеваний и заболеваний, связанных с развитием апоптоза.

Апробация работы

Результаты исследования докладывались на Седьмой международной конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2009 г.); на Международной конференции «Современные методы микроскопии в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2009 г.); на Шестнадцатой Европейской Биоэнергетической конференции (ЕВЕС 2010) (Варшава, Польша, 2010 г.); на Седьмой конференции по митохондриальной физиологии (Обергургл, Австрия, 2010 г.); на XIV Международном совещании и VII Школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2011).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 4 статьи, одна из которых в зарубежном журнале, и 11 тезисов, 6 из которых опубликованы в иностранных изданиях.

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методики, результатов исследования, их обсуждения, выводов, списка литературы из 260 источников, включая 6 отечественных и 254 зарубежных, работа изложена на 135 страницах, иллюстрирована 35 рисунками и 6 таблицами.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика метаболической депрессии

В настоящее время общепризнано, что метаболическая депрессия является неотъемлемой частью жизненного цикла многих животных и встречается у большинства видов беспозвоночных и всех классов позвоночных [Guppy, 2004]. Гипометаболические состояния могут возникать, когда животные сталкиваются с неблагоприятной окружающей средой [Hand and Hardewig, 1996; Guppy and Withers, 1999; Storey, 2007; Hand et al, 2011a], либо когда гипометаболизм онтогенетически запрограммирован, в то время как условия среды в данный момент позволяют поддерживать метаболизм на нормальном уровне [Hand, 2001; Denlinger, 2002; Reynolds and Hand, 2004]. Целью метаболической депрессии является максимальное увеличение продолжительности жизни в течение периода, когда условия окружающей среды или генетическая программа животного препятствуют нормальной жизнедеятельности. Время, в течение которого организм может пережить неблагоприятные условия среды (отсутствие или ограничение питания, кислорода или воды), напрямую зависит от достигнутой степени метаболической депрессии [Hand 1996].

Метаболическая депрессия выражается снижением интенсивности метаболизма, как минимум, на 30%, а чаще - на 60 - 80% [Hulbert and Else, 2000; Guppy, 2004] и может продолжаться от нескольких часов или суток до нескольких месяцев или даже лет [Storey and Storey, 1990; Castellini et al., 1992; Clegg, 1993; Hand and Hardewig, 1996; Hochachka and Lutz, 2001; Wharton, 2002].

Факторами, вызывающими гипометаболические состояния, могут быть: температура (гибернация у млекопитающих [Guppy et al., 1994; Hulbert and Else, 2005]), аноксия/гипоксия (моллюски [Nicolai et al., 2011], ныряющие млекопитающие [Storey and Storey, 1990; Castellini et al., 1992], амфибии [Boutilier et al., 1997], рептилии и др.), дегидратация (ангидробиоз у цист

13

Artemia [Hand, 1991]), отсутствие экзогенного питания (синхония у миноги [Савина, 1992]), сочетание нескольких факторов (диапауза у насекомых [Tauber et al., 1986] и млекопитающих (некоторые грызуны [Mead, 1993; Storey, 2010]), эстивация (улитки [Brooks and Storey, 1990]), торпор у мелких млекопитающих и птиц [Storey and Storey, 1990]).

Наиболее изученными примерами метаболической депрессии являются гипометаболические состояния, связанные с дефицитом кислорода (анаэробная метаболическая депрессия у Artemia franciscana [Hand, 1991; Covi et al., 2005; Hand et al., 2011], черепах [Storey, 2007; Biggar and Storey, 2009], моллюсков [Brooks and Storey, 1990; Guppy et al., 2000; Larade and Storey, 2002]), низкой температурой (эстивирующие лягушки [Hand, 1991; Flanigan et al, 1993; Biggar et al., 2009]) и гибернацией (млекопитающие [Hiffel and Storey, 2002; Eddy and Storey, 2003; Abnous et al., 2008]). В основе этого литературного обзора лежат данные, полученные именно на этих животных. Будут обсуждены следующие вопросы: внутриклеточные механизмы развития метаболической депрессии, регуляция метаболических путей, направленных на получение энергии, регуляция энергетически зависимых процессов.

1.2. Внутриклеточные механизмы развития метаболической депрессии

Фенотипически метаболическая депрессия сопровождается рядом это логических и физиологических изменений: животные значительно снижают двигательную активность [Agostini et al., 1991; Wickler et al., 1991], прекращают питаться и переваривать пищу, стремятся изолировать себя от контакта с внешней средой (раковины, коконы, берлоги), у них снижается дыхание [Pehowich and Wang, 1984], частота сердечных сокращений и электрическая активность мозга. Что происходит с метаболизмом клетки в этот период, что позволяет ей войти в состояние гипометаболизма, какие механизмы контролируют и координируют эти процессы, каким образом ей

удается не только сохранить жизнь в неблагоприятных условиях, но и вернуться к нормальному метаболизму? До настоящего времени молекулярные механизмы и процессы, связанные с контролем гипометаболизма, остаются до конца не изученными, и фундаментальное явление метаболической депрессии остается с биохимической и физиологической точек зрения слабо освещенным.

В целом можно выделить ряд характерных особенностей клеток в состоянии метаболической депрессии. К ним относятся: общая супрессия метаболизма; дифференциальная регуляция многих АТФ-зависимых процессов: поддержание одних (работа ионных насосов) [Guppy et al., 2000; Hochachka, 2003], и прекращение других (синтез белка, рост и развитие) [Kwast and Hand, 1993; Smith et al., 1996; Rubtsov, 2001; Biggar and Storey, 2004]; изменение степени фосфорилирования многих белков [Brooks and Storey, 1995]; изменение экспрессии генов; активация защитных систем организма, стабилизирующих макромолекулы (антиоксидантные системы) [Storey, 2007]; снижение внутриклеточного pH [Guppy and Withers, 1999; Pörtner et al., 1998] и другие.

Таким образом, животные, способные длительное время переживать состояние гипометаболизма, а затем выходить из него, имеют различные биохимические приспособления, наиболее важным среди которых является способность резко снижать интенсивность метаболизма [Storey, 2003].

Метаболическая депрессия на клеточном уровне, прежде всего, сказывается на процессах энергообмена [Hand and Menze, 2008; Boutilier and St-Pierre, 2002]. В последнее время был достигнут определенный прогресс в понимании того, как различные клеточные энергетические процессы подавляются в ответ на неблагоприятные условия среды. Для того, чтобы перейти к описанию особенностей энергообмена в состоянии гипометаблизма, рассмотрим принципы организации энергетического метаболизма клетки.

1.2.1. Организация энергетического метаболизма клетки

В основе энергетического обмена всех типов клеток лежат процессы производства и потребления АТФ. В клетках синтез АТФ происходит, главным образом, в митохондриях и сопряжен с потреблением (восстановлением) кислорода. Митохондриальное дыхание представляет собой окисление КАБН или РАБН2, образующихся в результате окисления углеводов, жирных кислот и аминокислот. Посредством электрон-транспортной цепи окисление этих субстратов сопряжено с транспортировкой протонов через внутреннюю мембрану митохондрий в межмембранное пространство (рис. 1).

Как известно, электрон-транспортная цепь митохондрий состоит из четырех мультиферментных комплексов: I - НАДН: убихинон-оксиредуктаза; II - Сукцинат: убихинон-оксиредуктаза; III - Убихинон: ферроцитохром с-оксидоредуктаза; IV - Цитохром с: кислород-оксидоредуктаза. Электроны между комплексами переносятся с помощью подвижных переносчиков -убихинона (Ко 0) и цитохрома с. Комплексы I и II переносят электроны на убихинон от двух различных электронных доноров: от НАДН (для комплекса I) и от сукцината и жирных кислот (для комплекса II). Комплекс III передает электроны от восстановленного КоС) на цитохром с, и комплекс IV завершает этот процесс, передавая электроны с цитохрома с на кислород. Движущей силой для переноса электронов по компонентам дыхательной цепи служит разность восстановительных потенциалов между редокс-парами.

матрикс

Рис. 1. Схема окислительного фосфорилирования в митохондриях (с изменениями по Lehninger et al., 2003)

Работа электрон-транспортной цепи создает электрохимический трансмембранный потенциал, называемый также протон-движущей силой, которая выражается: Ар = Дц/-2,3(RT/F)Apl I. Этот физико-химический параметр состоит из двух компонентов: Avy - трансмембранного электрического потенциала и дрН - градиента протонов, который создается на внутренней митохондриальной мембране в результате работы дыхательной цепи [Mitchell. 1961; Mitchell and Moyle, 1969].

Пумпированпые протоны возвращаются обратно по градиенту либо свободно (утечка протонов), либо через АТФ-синтетазный комплекс, сопрягающий транспорт прогонов через мембрану с синтезом АТФ из АДФ и неорганического фосфата в митохондриальном матриксе.

АТФ-синтетаза функционирует в тесном сопряжении как с фосфатным переносчиком, с помощью которого неорганический фосфат переносится из цитозоля в митохондрии, так и с транслоказой адениновых нуклеотидов, ответственной за доставку АДФ в митохондрии в обмен на АТФ в стехиометрическом отношении 1:1.

Таким образом, все энергозависимые процессы в аэробной клетке тесно связаны с электрохимическим потенциалом протонов на внутренней мембране митохондрий. Поэтому величина митохондриального мембранного потенциала (ММП) не только отражает функциональное состояние митохондрий, но и является одним из центральных параметров, ответственных за регуляцию клеточного метаболизма. Она определяется как векторным движением электронов по цепи дыхательных ферментов, сопряженным с выбросом протонов из матрикса в межмембранное пространство митохондрий, так и процессами возврата протонов в ходе синтеза АТФ и свободной утечки [Brand et al., 1994; Nicholls, 2004].

Прежде чем приступить к рассмотрению биоэнергетических перестроек в период гипометаболизма, следует отметить, что механизмы окислительного фосфорилирования одинаковы у всех эукариот, в частности, у пойкилотермных и гомойотермных позвоночных. Однако, базальные метаболические скорости, а также метаболические скорости в состоянии активности у млекопитающих и птиц в 6-10 раз выше, чем у пойкилотермных животных той же массы, даже при равной температуре тела. Низкая скорость окислительного метаболизма пойкилотермных позвоночных обусловлена низкой транспортной скоростью кислорода, определяемой скоростью кровотока (ритм сердца и минутный выброс) и кислородной емкостью крови. Изолированные клетки гомойотермных и пойкилотермных животных сохраняют те же самые различия в скоростях поглощения кислорода, как и целые животные, что связано с особенностями структуры их плазматических мембран (разное количество каналов или разная активность каналов для пассивной утечки ионов, о чем будет сказано ниже). Этих различий не

существует на изолированных митохондриальных фракциях, выделенных из тканей пойкилотермных животных, находящихся в состоянии активности. При метаболической депрессии, вызванной различными причинами, интенсивность окислительного фосфорилирования изолированных митохондриальных фракций резко снижается [ОеИепсЬ й а1., 2004].

1.2.2. Синтез и расход АТФ при метаболической депрессии

Наиболее изученными примерами метаболической депрессии являются гипометаболические состояния, связанные с дефицитом кислорода. Рассмотрим изменения в энергетическом обмене, возникающие в условиях аноксии у неустойчивых и устойчивых к ней видов.

Поддержание устойчивого равновесия между процессами синтеза и потребления АТФ в клетке является важнейшим механизмом, обеспечивающим переживание гипоксии и метаболической депрессии в целом. В клетках организмов, неустойчивых к гипоксии, при депривации кислорода, потребление АТФ превышает скорость её производства, и концентрация АТФ снижается ниже критического уровня, что приводит к гибели клеток [Кгит8сЬпаЬе1 е! а1. 19976]. Это происходит по следующим причинам. В условиях аноксии единственным способом получения энергии остаются анаэробные механизмы, энергетический выход которых, в пересчете на производство АТФ на молекулу субстрата, гораздо меньше, чем при окислительном фосфорилировании. Для того чтобы компенсировать этот низкий выход и поддержать производство АТФ на уровне, характерном для нормоксии, увеличивается интенсивность гликолиза. Это так называемый эффект Пастера. Этот способ, однако, ведет к расходу огромного количества субстратов и накоплению конечных продуктов, в частности протонов. Эффект Пастера был обнаружен в различных органах и тканях. Механизмом этого явления, предположительно, является аллостерическая регуляция активности ферментов [вирру е1 а1., 1994]. Однако, гликолитическое производство АТФ недостаточно для поддержания жизнедеятельности

клетки. У животных, устойчивых к гипоксии, имеет место гипометаболическое перепрограммирование клеток , которое подразумевает переход в новое стационарное состояние, обеспечивающее баланс процессов производства и потребления АТФ [Storey, 1996]. При этом, если снижение метаболической скорости хорошо синхронизировано, то концентрация АТФ в клетке при переходе в гипометаболическое состояние может существенно не измениться. А в случае, если имеет место менее синхронизованная "настройка" процессов, концентрация АТФ может снижаться значительно [Krumschnabel et al., 19976]. Некоторые факультативные анаэробы (морской червь {Sipunculus nudus), золотая рыбка, мидии {Mytilus edulis)) способны сохранять уровень АТФ во время анаэробиоза [de Zwaan and Wijsman, 1976; van den Thillart et al., 1989; Hardewig et al., 1991]. Другие животные (эмбрионы Artemia franciscana, саранча (Schistocerca gregaria), снижают уровень АТФ в условиях гипоксии и аноксии [Hand and Gnaiger 1988; Hochachka et al., 1993; Reddy et al., 1993; Anchordoguy and Hand, 1994].

Энергетический заряд Аткинсона (АТФ+0.5АДФ)/(АТФ+АДФ+АМФ), определяющий энергетический статус клетки, также может либо оставаться прежним, либо падать при гипометаболизме [Kelly and Storey, 1988; Churchill and Storey, 1989; Chih et al., 1989; Storey and Storey, 1990; Reddy and Davies, 1993]. Снижение энергетического заряда необходимо для поддержания баланса между процессами производства и потребления АТФ в условиях метаболической депрессии.

Есть основания полагать, что одной из стратегий переживания гипометаболического состояния является регуляция работы FoFi-АТФ-синтетазы [Hochachka and Lutz, 2001]. Как известно, в обычных условиях этот интегральный белок внутренней мембраны митохондрий является основным производителем АТФ. Однако на первых стадиях гипоксии и аноксии, АТФ-синтетаза начинает усиленно откачивать протоны из матрикса, пытаясь сохранить мембранный потенциал (A\j/) митохондрий (рис. 1). Это означает, что при низком напряжении кислорода, митохондрии

переключаются с «производственной деятельности на потребительскую», активно используя АТФ, образуемую в ходе гликолиза [Lisa et al., 1998]. Данная стратегия иногда используется клетками, которые лимитированы в доступе кислорода. Другой подход, помогающий избежать этих негативных последствий аноксии, - снижение потребления АТФ. Эта стратегия характерна для факультативно анаэробных животных, способных длительное время переживать отсутствие или ограничение кислорода. Для всех этих животных продолжительность жизни в условиях аноксии точно коррелирует со способностью снижать потребление АТФ. Также обращает на себя внимание тот факт, что чувствительные к аноксии клетки, например, гепатоциты крысы, не снижают скорость расхода АТФ и не живут более 2 часов в условиях аноксии [Andersson et al., 1987], тогда как гепатоциты болотной черепахи (Chrysemys picta) в тех же условиях снижают оборот АТФ на 90% и способны выживать в течение нескольких месяцев [Buck and Hochachka, 1993].

1.2.3. Регуляция ионного гомеостаза.

Известно, что плазматическая мембрана поддерживает ионные концентрационные градиенты (20-30-кратный по К+, 10-кратный по Na+, 1000-кратный по Са ). Ионный гомеостаз позволяет сохранить неизменным потенциал покоя, осуществлять рецепторную, сократительную, секреторную функцию, а также генерировать электрические сигналы. Принято различать пассивный и активный транспорт веществ через клеточные мембраны. Пассивный вход и выход ионов через каналы в мембране происходит благодаря наличию электрических и химических градиентов. Для компенсации результатов передвижения ионов клетка использует активные транспортные механизмы, которые затрачивают энергию на перемещение ионов в направлении, противоположном их электрохимическим потенциалам. Следовательно, функционирование насосов и ионных каналов, должно быть скоординировано не только между собой, но и с

интенсивностью метаболизма [Hochachka, 1988]. Как у млекопитающих, так и у пойкилотермных позвоночных основная доля АТФ (30-60%, а в отдельных тканях до 90%), произведенная организмом в условиях отсутствия двигательной активности, тратится на воспроизведение и поддержание ионного гомеостаза посредством работы Ыа+,К+-АТФазы [Clausen et al., 1991]. Таким образом, поддержание потенциала на плазматической мембране имеет решающее значение для выживания клетки, и, несмотря на общее снижение производства АТФ при гипометаболизме, ионный градиент должен сохраняться. Исследования на гепатоцитах болотной черепахи, находящейся в состоянии аноксии [Buck and Hochachka, 1993] и мышцах лягушки в период гибернации [Flanigan et al., 1993] подтверждают это предположение: электрический мембранный потенциал в клетках, способных к метаболической депрессии, не меняется при переходе в гипометаболическое состояние. Если поддержание ионного баланса требует таких больших затрат АТФ, возникает вопрос: как в условиях гипометаболизма может поддерживаться ионный гомеостаз? В очень чувствительном к аноксии и ишемии мозге млекопитающих нарушение ионного гомеостаза наблюдается уже в первые минуты аноксии. Это ведет к потере электрической активности и, в конечном итоге, к гибели клетки [Doli et al., 1991]. Как уже было сказано, гипометаболическое состояние у пойкилотермных позвоночных и беспозвоночных предполагает дифференциальную перестройку метаболизма от полного «отключения» отдельных функций, которые не являются жизненно необходимыми, до полного сохранения других функций, имеющих решающее значение для выживания. Гепатоциты болотной черепахи ОChrysemys picta bellii) хорошо иллюстрируют это положение: в условиях аноксии общий оборот АТФ в этих клетках снижается на 94%, при этом активность разных АТФ-зависимых процессов снижается по-разному. Из четырех основных потребителей АТФ (синтез белка, Ыа+,К+-АТФаза, протеолиз и синтез глюкозы) наибольшей депрессии подвергаются протеолиз и глюконеогенез. В результате основным потребителем АТФ в клетке

становится Ыа+,К+-АТФаза (62% оборота АТФ по сравнению с 28% в условиях нормоксии), процессы синтеза и деградации белка подавлены (приблизительно на 90%), а глюконеогенез практически прекращен [Hochachka et al., 1996].

Таким образом, механизмы метаболической депрессии должны включать регуляцию ионных потоков в обоих направлениях: во-первых, снижение активности АТФ-зависимых ионных насосов, а во-вторых, уменьшение пассивной ионной проницаемости плазматической мембраны. Клетки млекопитающих неспособны эффективно регулировать эти процессы, особенно перемещение ионов по градиенту концентрации через трансмембранные ионные каналы, что ведет к деполяризации плазматической мембраны и гибели клетки в условиях гипометаболизма [Storey, 1996]. Однако в нейронах черепахи перемещение ионов через плазматическую мембрану в ответ на снижение кислорода эффективно контролируется, в результате чего поддерживается ионный гомеостаз. Пассивная проницаемость мембраны для ионов через белковые каналы может регулироваться либо изменением плотности каналов, либо регулированием активности существующих каналов [Perez-Pinzon et al., 1992]. Хочачка [Hochachka, 1986] предположил, что в плазматической мембране клеток пойкилотермных позвоночных количество каналов для пассивной утечки гораздо меньшее, чем в плазматической мембране гомойотермных. Гипотеза Хочачки, широко известная как "арест каналов -арест метаболизма", нашла свое подтверждение в многочисленных исследованиях: с помощью радиоактивных Na+ и Rb+ (аналог К+) было показано, что клеточные мембраны печени, почек, мышечных волокон, нейронов пойкилотермных позвоночных содержат в несколько раз меньшее количество каналов(или такое же количество каналов с меньшей активностью) для пассивной утечки ионов, чем мембраны аналогичных клеток млекопитающих [Hochachka, 1988; Doll et al., 1991].

Гипотеза «ареста» каналов предполагает, что ионная проводимость плазматических мембран в условиях аноксии будет снижаться для того, чтобы сократить ионный транспорт и таким образом снизить потребление АТФ. Был сделан вывод о том, что изменение проводимости ионных каналов является основным фактором в снижении энергетических потребностей при гипометаболизме [Edwards et al., 1989]. Главным образом, этот механизм изучался на мозге черепахи [Perez-Pinzon et al., 1992; Ну Hand et al., 1997; Bickler et al., 2001; Hochachka and Lutz, 2001; Lutz and Nilsson, 2004]. Данные, полученные на других тканях и органах пойкилотермных позвоночных и беспозвоночных животных, подтверждают снижение активности ионных каналов при аноксии, что предотвращает снижение ионного градиента при уменьшении активности Na ,К -АТФазы. В изолированных гепатоцитах черепахи активность 1Ча+,К+-АТФазы снижается на 75%, в то время как мембранный потенциал клетки остается постоянным [Buck and Hochachka, 1993]. Эстивирующая лягушка {Neobatrachus wilsmorey) снижает потребление кислорода до 20% от уровня в активный период, при этом сохраняется Na+,K+ градиент на плазматической мембране [Flanigan et al, 1993]. Предполагается, что первичными механизмами регуляции ионных каналов является изменение структуры канала путем обратимого фосфорилирования [Catterall, 1984; Reuter, 1987; Story, 1996]. Возможным механизмом регуляции активности Ка+,К -АТФазы в ответ на гипоксию является фосфорилирование а-субъединицы, либо удаление канала из мембраны с помощью эндоцитоза [Buck and Hochachka, 1993].

1.2.4. Протонная утечка через митохондриальные мембраны в период метаболической депрессии

Известно, что 90% клеточного дыхания составляет митохондриальное дыхание, из которого 20-40% приходится на долю дыхания, связанного с утечкой протонов (proton leak) через внутреннюю мембрану митохондрий [Brand et al., 1994; Rolfe and Brown, 1997; Hulbert and Else, 2000; St-Pierre et al., 20006; Boutilier, 2001]. Утечка протонов представляет собой возврат Н+ во внутримитохондриальное пространство по электрохимическому градиенту (Д[дН+). Несмотря на то, что этот процесс не сопряжен с синтезом АТФ, он не является «дефектом» метаболизма, и, по-видимому, выполняет ряд функций, среди которых поддержание клетки в состоянии готовности к совершению работы [Rolfe and Brand, 1996а; Rolfe and Brand 19966] и предотвращение образования активных форм кислорода [Skulachev, 1998]. Что касается протонной утечки в условиях метаболической депрессии, то в ряде ранних работ показано, что в состоянии гибернации протонная утечка уменьшается по сравнению с активным состоянием [Fedotcheva et al., 1985; Brustovetsky et al., 1989]. Однако более поздние работы показали, что протонная проницаемость митохондриальной мембраны в ходе метаболической депрессии не меняется или меняется незначительно, а меняется лишь ее вклад в общее потребление кислорода клетками [Savina and Gamper, 1998; Martin et al., 1999; St-Pierre et al., 2000c; Bishop et al., 2002; Kayes et al., 2009]. Такое расхождение представлений можно объяснить методическими сложностями и выбором объектов исследований.

1.2.5. Обратимое фосфорилирование белков

Очевидно, что биохимические механизмы, регулирующие состояние гипометаболизма, должны быть, с одной стороны, достаточно эффективными, а с другой, легко обратимыми, чтобы организм мог вернуться к существованию в нормальных условиях среды.

Предполагают, что основным наиболее доступным и действенным механизмом перестройки метаболизма в состоянии гипометаболизма является обратимое фосфорилирование белков (RPP - Reversible protein phosphorylation). Процессы фосфорилирования и дефосфорилирования позволяют быстро изменить кинетические свойства множества регуляторных белков [Storey and Storey, 2004; Dieni and Storey, 2009]. Эти процессы катализируются ферментами, выделяемыми в особый класс киназ, или иначе фосфотрансфераз, обеспечивающими перенос конечной фосфатной группы молекулы АТФ на белки. В настоящее время открыто более 500 протеинкиназ и 300 протеинфосфатаз [Manning et al., 2002; Lin et al., 2010]. Активность протеинкиназ и протеинфосфатаз регулируется различными вторичными посредниками - цАМФ, цГМФ, Ca , фосфолипидами и т.д. Обратимое фосфорилирование белков регулирует активность рецепторов, ионных каналов, АТФаз, а также многих белков, участвующих в транскрипции генов, синтезе и деградации белка и регуляции клеточного цикла [Cowan and Storey, 2003; MacDonald, 2004]. Впервые обратимое фосфорилирование белков при гипометаболизме было исследовано на морских моллюсках в условиях аноксии, у которых регуляция гликолиза осуществлялась за счет вызванной фосфорилированием инактивации пируваткиназы [Storey and Storey, 1990]. Позже было обнаружено, что при аноксии путем обратимого фосфорилирования регулируется также фосфофруктокиназа и гликогенфосфорилаза [Storey, 1993]. Подобные механизмы участвуют в регуляции гликолиза не только в условиях аноксии, но также и в аэробных условиях при эстивации и гибернации (изменение активности пируватдегидрогеназы [Brooks and Storey, 1997]). Кроме того, с помощью обратимого фосфорилирования контролируются Na+-, K+-, Са2+-ионные каналы, а также мембранные рецепторы [Hochachka and Lutz, 2001; Bickler et al., 2001; Bickler and Buck, 2007]. Было показано, что путем обратимого фосфорилирования регулируется активность Na+, К+-АТФазы клеток гибирнирующих и эстивирующих млекопитающих [Bertorello and

Katz, 1995; Ewart and Klip; 1995; MacDonald and Storey, 1999; Ramnanan and Storey, 20066]. Также имеются данные, согласно которым, №',К+-АТФаза мышечных клеток эстивирующих улиток имеет низкую активность при высокой степени фосфорилирования, в то время как дефосфорилированная форма соответствует высокой активности фермента и характерна для активных улиток. Эти примеры указывают на широкий филогенетический консерватизм процесса обратимого фосфорилирования в регуляции гипометаболизма.

Фосфорилирование отдельных ферментов связано с регуляцией метаболизма у различных организмов [Storey and Storey, 1990]. Эта регуляция связана с изменениями в уровне циклических нуклеотидов. Брукс и Стори [Brooks and Storey, 1990] получили доказательства участия цГМФ в фосфорилировании пируваткиназы у брюхоногого моллюска Busycon contrarium при аноксии. Изменения экспрессии генов также могут регулироваться с помощью сигнального каскада, в котором участвуют протеинкиназы и протеинфосфатазы. Например, было обнаружено, что обработка протеинкиназой С лизатов, полученных из эмбрионов Artemia, находящихся в аэробных условиях, вызывает снижение интенсивности трансляции до уровня, характерного для аноксических эмбрионов [Hand, 1996]. Гипометаболические состояния сопровождаются изменением активности протеинкиназ и протеинфосфатаз [Bertorello et al., 1991; Béguin et al., 1994]. Известно, что цГМФ-зависимая протеинкиназа (протеинкиназа G) эстивирующих моллюсков участвует в регуляции Na ,К -АТФазы [Brooks and Storey, 1990; Michaelidis and Storey, 1990; Larade and Storey, 2002; Brooks and Storey, 1994; Bertorello et al., 1991; Béguin et al., 1994]. В настоящее время доказано, что при аноксии киназы (протеинкиназа А и протеинкиназа С) и фосфатазы принимают самое активное участие в регуляции не только синтеза белков, но и в модуляции активности различных типов каналов, ферментов гликогенолиза, приспосабливая скорость клеточных процессов к условиям гипоксии. Механизмы, обеспечивающие ингибирование белкового синтеза,

также могут включать в себя изменения в уровне матричной РНК, и/или регуляцию на этапе трансляции. Основным механизмом, регулирующим синтез белка, является фосфорилирование/дефосфорилирование транскрипционных факторов, в частности, факторов инициации и элонгации [Hershey, 1991]. Белковый синтез во многих клетках регулируется фосфорилированием а-субъединицы эукариотического фактора инициации.

1.2.6. Изменение внутриклеточного рН в состоянии гипометаболизма

Поддержание и контроль рН в узком диапазоне имеет важное функционально-регуляторное значение для клетки. Даже небольшой сдвиг кислотно-основного состояния изменяет скорость многих ферментативных реакций [Portner and Bock, 2000]. Депрессия энергетического метаболизма часто сопровождается сдвигом в кислую область рН внутриклеточного пространства в тканях позвоночных животных. Было отмечено, что акклиматизация животных к низким температурам и метаболическая депрессия ведут к снижению внутриклеточного рН [Portner et al., 2000].

Первые сведения о защитном эффекте снижения рН среды инкубации (рНе) на культуры гепатоцитов и кардиомиоцитов крысы, подвергнутые воздействию гипоксии и аноксии, были получены в 90-годы прошлого века [Currin et al., 1991; Bond et al., 1991; Bond et al., 1993]. С появлением pH-чувствительных флуоресцентных красителей было показано, что сами клетки, при неблагоприятных условиях, приводящих к резкому падению внутриклеточной концентрации АТФ (энергетическая депрессия), снижают рН внутриклеточной среды (рН;), что является одним из наиболее эффективных способов защиты клетки от некроза. Известно, что снижение pHj ингибирует убиквитин-зависимый протеолиз, увеличивая тем самым период полураспада белков [Rapoport et al., 1985]. Убиквитин - небольшой регуляторный белок, обнаруженный почти во всех тканях эукариот. Убиквитинирование (посттрансляционное присоединение ферментами

убиквитин-лигазами одного или нескольких мономеров с помощью ковалентной связи к боковым аминогруппам белка-мишени) играет ключевую роль в деградации короткоживущих белков. Для активации убиквитина необходима АТФ [Ciechanover, 1994; Kravtsova-Ivantsiv and Ciechanover, 2011], кроме того, деградация убиквитинированных белков осуществляется АТФ-зависимыми протеазами [Goldberg, 1995; Lowe, 1995]. Обнаружено, что аноксия у эмбрионов Artemia вызывает снижение уровня убиквинтин-связанных белков на 93%, при этом концентрация АТФ падает на 95% [Anchordoguy and Hand, 1995]. Эти эффекты легко снимались в аэробных условиях. При искусственном закислении в аэробных условиях (увеличение уровня углекислого газа в аэробных условиях, при котором значение pHj резко падает, а концентрация АТФ сохраняется в течение часа) уровень убиквинтин-связанных белков снижался на 42%. Таким образом, можно утверждать, что и снижение pHj и изменение аденилатного пула участвуют в регуляции убиквитин-зависимого протеолиза.

Имеются данные, согласно которым, снижение рН среды повышает устойчивость клеток к действию различных ингибиторов. Так, например, изменение рН с 7.4 до 6.0 в среде культивируемых гепатоцитов крысы повышает их устойчивость к цианиду [Guppy et al., 1994]. Предполагают также, что внутриклеточный ацидоз предотвращает образование поры высокой проводимости во внутренней митохондриальной мембране [Zorov et al., 2009].

Обнаружено, что изменение внутриклеточного рН может вызывать изменения в факторах трансляции (инициации и элонгации) и таким образом влиять на экспрессию генов [Hand, 1996]. Обнаружено, что снижение рН на 0.8 единиц в клетках голодающих Tetrahymena thermophilic! связано с обратимым фосфорилированием рибосомальной субъединицы 40S, что, в свою очередь, влияет на синтез белка [Goumard et al., 1990]. Закисление внутриклеточной среды ингибирует белковый синтез в митохондриях эмбриона Artemia: снижение экстрамитохондриального рН с 7.5 до 6.7

вызывает ингибирование митохондриального белкового синтеза на 80% [Kwast and Hand, 1996]. Таким образом, снижение рН; может служить внутриклеточным сигналом для регуляции различных метаболических процессов, и рассматриваться одновременно и как протекторный и как инициирующй фактор метаболической депрессии.

В настоящее время предложена гипотеза, согласно которой основная роль в регуляции концентрации протонов в клетке в условиях гипометаболизма принадлежит АТФазам вакуолярного типа [Covi and Hand, 2005; Covi et al., 2005; Covi and Hand, 2007]. Однако окончательно механизмы эффекта закисления до сих пор не выяснены.

1.3. Регуляция концентрации свободного кальция

Концентрация внутриклеточного свободного кальция очень тонко регулируется и поддерживается на уровне в 10000 раз меньшем, чем его концентрация во внеклеточной среде [Collins and Thomas, 2001]. Это обеспечивается, главным образом, двумя кальциевыми насосами: Са2+-АТФазой плазматической мембраны и

Ca -АТФазой эндоплазматического ретикулума (SERCA - sarcoendoplasmic reticulum Са2+-ATPase) [Ichas et al., 1997; Wussling et al., 1999; Крутецкая и др. 2003; Landgraf et al., 2004]. В клетках, неустойчивых к аноксии, дефицит кислорода вызывает немедленное и резкое увеличение концентрации кальция, что приводит к активации фосфолипаз, эндонуклеаз, протеаз и, в конечном итоге, к гибели клеток [Buck, 2004]. Например, в течение нескольких минут депривации кислорода в нейронах млекопитающих наступает более чем 10-кратное увеличение свободного внутриклеточного кальция, что приводит к гибели клеток [Bickler et al., 2001]. В отличие от млекопитающих, в нейронах черепахи увеличение цитоплазматического кальция гораздо меньшее (примерно в 2 раза) в течение первых нескольких часов гипоксии и не меняется на протяжении нескольких недель [Bickler, 1998]. Была высказана идея, что увеличение концентрации внутриклеточного кальция может приводить к совершенно разным

последствиям: большой подъем концентрации Са , вызванный неконтролируемым входом кальция, является типичным для клеток, неустойчивых к аноксии, что, в конечном итоге, приводит к гибели клеток; умеренное увеличение внутриклеточного кальция в клетках, устойчивых к аноксии (как было показано на нейронах черепахи), не только не губительно для клеток, но и является необходимым условием для выживания клеток в условиях аноксии. Умеренное повышение Са2+ стимулирует протеинкиназы или протеинфосфотазы, что ведет к «аресту» ионных каналов [Bicker, 2002].

Этот процесс был детально изучен на примере регуляции ионотропного N-methil-D-aspartate(NMDA)-rayTaMaTHoro рецептора в нейронах черепахи [Bickler and Buck, 2007; Shin et al., 2005]. Показано, что при аноксии протеинфосфатазы, активированные умеренно возросшим уровнем

Са2+,

дефосфорилируют определенный участок канала, и, таким образом, переводят его в неактивное состояние (рис. 2).

NMDAR

NORMOXIA

NMDAR. Ca""

ANOXIA

Рис. 2. Схема регуляции NMDA-глутаматного рецептора в нейронах черепахи, устойчивой к аноксии (но [Bickler et al., 2002; Bickler and Buck, 2007]). NMDAR - NMDA-глутаматный рецептор, PKC - протеинкиназа С, PP 1 - протинфосфатаза 1, PP 2A - протеинфосфатаза 2A, ER — эндоплазматический ретикулум.

Как уже отмечалось выше, в клетке имеются кальциевые депо: эндоплазматический ретикулум, митохондрии, аппарат Гольджи [Wuytack et ah, 2003; Vandecaetsbeek et al., 2011], Первостепенная роль в регуляции внутриклеточной концентрации Са:' принадлежит эндоплазматическому

ретикулуму. Очевидно, что процессы высвобождения ионов Са2 из полостей ретикулума и их последующего обратного транспорта должны быть тонко отрегулированы. Механизм функционирования Са21"-АТФазы эЩцо плазматического ретикулума к настоящему времени хорошо изучен и описан в ряде обзоров [Inesi, 1985; MacLennan et al., 1997]. Фермент в конформации El, которая характеризуется высоким сродством к Са~ , связывает два иона Са2 и АТФ с цитоплазматической стороны, после чего фосфорялируется, при этом концевая фосфатная группа АТФ переносится на остаток Asp351 фермента. Это индуцирует конформационные изменения: фермент переходит из кон формаций Е1 в конформацию Е2, при этом происходит снижение сродства С а -АТФазы к ионам Са~ и высвобождение их во внутреннюю полость ретикулума. Затем происходит Mg -зависимый гидролиз фосфофермеита с освобождением неорганического фосфата в цитоплазму, и изомеризация: фермент из конформации П2 переходит в EI [De Foresta et al., 1990].Было показано, что для нормального функционирования Са2 -АТФазы необходимо высокое соотношение АТФ/АДФ [Wilding et al., 2006]. Очевидно, что при метаболической депрессии, сопряженной со значительными перестройками метаболизма, заметные изменения должны происходить и в работе Са~ -АТФазы саркоплазматического ретикулума.

Показано, что активности Na7K+-АТФазы плазматической мембраны и Са -АТФазы эидопдазматического ретикулума тонко регулируются и сильно подавляются в период гибернации, эстивации, диапаузы [MacDonald and Storey, 1999; Hemmings and Storey, 2001; Malysheva et al., 2001; Ramnanan and Storey, 2006; Ramnanan and Storey, 2008; McMiillen and Storey, 2008]. Аноксия и гипоксия также вызывает снижение активности С а2 -АТФазы эндоплазматического ретикулума [Pei et al., 2003; Henrich and Buckler, 2008]. Так, было обнаружено снижение активности Са* -АТФазы в скелетных мышцах гибернирующего суслика Spermophilus undulates на 50% от активности в мышцах бодрствующего животного [Malysheva et al., 20011, Такое подавление активности Са~ -АТФазы саркоплазматического

ретикулума связано с посттрансляционной модификацией белка [Ramnanan et al., 2010].

Были получены данные, позволяющие предположить, что активность Са~ -А ГФазы эндоплазматического ретикулума при гипометаболизмс может регулироваться посредством фосфорили ро вани я/дефосфорил ирова! i ия фермента и/или регуляторных белков при участии протеинкиназ и протеинфосфатаз [Greenway and Storey, 2000; Rider et a!., 2009].

Таким образом, в регуляцию метаболизма, направленную на выживание в неблагоприятных условиях, вовлечено множество механизмов. Биохимическая регуляция метаболической депрессии имеет молекулярные принципы, которые являются общими не только среди различных филогенетических групп, но и для разных типов метаболической адаптации (гипоксия, гибернация, эстивация и т. д.) [Storey, 2003].

1.4. Жизненный цикл миноги

Для пойкилотермных животных состояние гипометаболизма носит, как правило, сезонный характер [Withers and Cooper, 2010] и связано с гипо- или гипертермией, гипоксией или дефицитом пищи и воды. Минога речная, представитель класса Kpyi лоротых, на определенном этапе своего жизненного цикла также переживает состояние метаболической депрессии, поэтому, целесообразно остановиться на описании жизненного цикла объекта нашего исследования.

Анадромная паразитическая минога речная (Lampetm jluviatilis L.) обладает своеобразным жизненным циклом. В течение 4-5 лет личинки миноГ (пескоройки) лежат, зарывшись в грунт в устье Невы. Питание на этой стадии осуществляется путем пассивной фильтрации микроорганизмов. Переход во взрослую форму сопровождается метаморфозом. В этот период у животных развивается ротовой диск, появляются зубы, прорезаются глаза, увеличиваются плавники, меняется структура жаберных отверстий. Существенные изменения претерпевает пищеварительная система:

атрофируется желчный пузырь и вся дренажная Система печени. После метаморфоза взрослые особи мигрируют в Балтийское море, где на протяжении 18 месяцев ведут активный образ жизни, питаясь кровью разнообразных костистых рыб [Hardisty and Potter, 1971; Youson and Sower, 2001]. Лнадромная преднерестовая миграция половозрелых миног начинается в конце лета - начале осени и достигает своего максимума в ноябре. Мигранты, пришедшие на нерест, проводят в реке всю зиму, ведут малоподвижный образ жизни и не питаются. Отсутствие экзогенного питания у взрослых особей представляет собой генетически запрограммированный поведенческий феномен, названный «синхонией» [Larscn, 1980]. В период естественного голодания у миног существенно снижается масса тела, атрофируется пищеварительный тракт и зарастает передняя часть пищеварительной трубки.

В течение всей фазы естественного голодания жизнь миног поддерживается исключительно за счет мобилизации липидов и белков, главным образом, мышечной ткани, накопленных в морской период активного питания [Савина, 1985]. Большая часть органов в этот период не проявляет каких-либо признаков гииометаболизма и поддерживает энергетический заряд Лткинсона на уровне 0.7-0.8 в течение всего периода голодания. Однако в печени в этот период наблюдается подавление метаболизма. Содержание гликогена в печени очень низкое (50-125 мг%) и не меняется на протяжении всего преднерестового периода [Плисецкая, 1975также не меняется содержание белка [Savina and Gamper, 1998]. Метаболизм гепатоцитов, таким образом, является исключительно аэробным и базируется на окислении жирных кислот, но, несмотря на то, что гепатоциты заполнены лилидными каплями, они не расходуются на протяжении всего зимнего периода. Система кровоснабжения не в состоянии восполнить недостаток субстратов в печени, т. к. 80% крови, поступающей в печень через портальную вену, отходит от пищеварительной системы, которая в этот период атрофирована. Это приводит к глубокой

метаболической депрессии. После нескольких месяцев голодания гепатоциты миноги имеют низкие скорости дыхания [Savina and Gamper, 1998], а также низкую концентрация АТФ и высокую степень восетановленности системы NAD/NAD! i [Savina and Derkachev, 1983]. Однако данная ситуация обратима.

Начиная с марта, когда у миног развиваются вторичные половые признаки и созревают гонады, энергетический обмен в гепатоцитах миноги резко меняется, Причиной этих изменений является гормональная индукция — многократное увеличение концентрации эстрадиола в крови, ведущее к липолизу липидных капель и синтезу вителлогенина в гепатоцитах миноги [Mommsen and Walsh, 1988]. Сухая масса гепатоцитов снижается на 40% по сравнению с гепатоцитами в зимний период, что связано с уменьшением содержания липидных капель. Таким образом, митохондрии получают субстраты в виде жирных кислот, и энергетическое состояние гепатоцитов возвращается к осеннему уровню - возрастает концентрация АТФ, увеличиваются скорости дыхания [Savina and Gamper. 1998].

Резкое изменение метаболического состояния гепатоцитов миноги подтверждает тот факт, что гепатэктомированные в зимний период животные в течение нескольких недель не отличаются от ложно-оперированных, в то время как в весенний период гепатэктомия прекращает созревание половых продуктов и приводит к преждевременной гибели миног [Larsen, 1978; Larsen, 1980].

11осле нереста, миноги, являясь моноцикличными животными, погибают [Hardistyand Potter, 1971].

В следующем разделе мы остановимся на рассмотрении механизмов гибели клеток.

1.5. Механизмы гибели клеток

Гибель клетки может происходить по двум основным путям -некротическому и апоптотическому. Некроз сопровождается разрушением плазматической мембраны и лизисом клеток.

Лпоптоз представляет собой более медленный, регулируемый процесс гибели. Апоптоз (в переводе с греч, - «опадание листьев») -программируемая гибель клетки, впервые был описан в 1972 году [Kerr el at.j. Лпоптоз сопровождается изменениями клеточной мембраны ("отшнуровывание" пузырьков, так называемых аноптотических телец), распадом клеточного ядра, уплотнением хроматина и фрагментацией ДНК. Клетки, подвергшиеся апоптозу, распознаются макрофагами и другими фагоцитирующими клетками и быстро элиминируются.

Характерными биохимическими признаками апоптоза являются снижение трансмембранного потенциала митохондрий, продукция АФК, выход фосфатидилсерипа па поверхность клеточной мембраны, селективный протсолиз, о л и гону к л еосомная фрагментация молекул ДНК [Darzynkiewicz et al., 2004J.

Выделяют 2 стадии апоптоза: первая стадия - стадия обратимых изменений, во время которой процесс апоптоза может быть остановлен и клеточные структуры будут репарированы. Длится первая стадия от инициации апоптоза до начала фрагментации ДНК. Вторая, необратимая фаза, во время которой клеточные структуры разрушаются и клетка образует апоптотические тельца [Johnstone et al., 2002; Jaattela, 2004; Lockshin and Zakeri, 2004; Nicotera and Melino. 2004; Okada and Mak, 2004].

Ключевым этапом исполнения апоптозной программы является активация уникального класса цротеаз, называемых каспазами (от caspase -eisteine aspartase или цистеиновые аснартазы). Эти протеазы содержат в своем активном центре цистеип и ведут расщепление субстратов вблизи остатков аспарагиновой кислоты. Предшественники каспаз - прокаспазы

состоят из продомена и двух субъединиц: большой и малой. Каспазы способны активировать друг друга, при этой активации dt прокаспазы отщепляется продомен, а большие и малые субъединицы двух прокаспаз формируют активную каспазу - гстрамер, обладающую двумя активными центрами [Green, 1998]*

Существует два пути апоптоза - внешний и внутренний (рис. 3). При реализации первого пути инициации апоптоза происходит связывание внеклеточных белков-лигандов (ФНО-а, FasL, TRAIL и Apo-3L) с их рецепторами на поверхности плазматической мембраны [Haunstetter and Izumo, 1998]. Все эти рецепторы состоят из трех частей: цистеин-богатого внеклеточного домена, трансмембранного домена и цитоплазматического DD-домена (death domain, домен смерти) [Bratton et al., 2001]. При этом взаимодействие лиганда с рецепторами вызывает их тримеризацию в плазматической мембране, в результате чего рецептор получает возможность взаимодействовать с адаптерной молекулой через свой цитоплазматический DD-домен. При этом вследствие конформационного изменения адаптера появляется возможность его взаимодействия с двумя прокасиазами-8, которые в сближенном состоянии обладают способностью активировать друг друга. Функция адаптера заключается в сближении каспаз. Комплекс, состоящий из рецептора, адаптерной молекулы и прокаспаз называется DISC (death inducing signaling complex, сигнальный комплекс, вызывающий смерть) [Raft; 1998].

Каспаза-8 способна далее активировать прокаспазу-3 с образованием зрелой каспазы-3, участвующей в терминальных стадиях апоптоза [Debatin and Krammer, 2004]. Кроме этого каспаза-8 участвует в расщеплении белка Bid с образованием его активной формы tBid, которая способна транспонироваться к митохондриям и запускать митохондриальный путь апоптоза.

Рис. 3. Схема внутреннего и внешнего путей [http://www.icins.qmul.ac.ii k/flowcy to m е try/uses/a po ptosis/).

апоптоза

При развитии внутреннего (митохондриального) пути ап о птоз а разрыв наружной мембраны митохондрий вызывает высвобождение из внутримитохондриального пространства белков, запускающих апоптоз. Это в первую очередь цитохром с, который объединяясь в цитозоле с фактором APAF-1 (англ. Apoptotic peptidase activating factor 1) и прокаспазой 9 образует апоптосому - белковый комплекс, превращающий прокаспазу 9 в активную каспазу 9 [Adrain and Martin, 2001]. Каспаза 9 является инициаторной каспазой, активирующей, в свою очередь, каспазу 3 и другие эффекторные каспазы. Таким образом, запускается каскад каспаз и идет стремительное разрушение клетки. Каким же образом разрывается внешняя митохондриальная мембрана? Существуют две гипотезы. Согласно одной, разрыв мембраны производится проапопготическими белками Вах, Bid и другими представителями этих семейств. Эти белки находятся в неактивной

форме в здоровых клетках, но получают сигнал об активации при начале апоптоза. Клеточное выживание определяется балансом между антиапоптотическими и проапоптотичсскими белками. Вторая гипотеза описывает совершенно другой механизм разрыва наружной митохондриальной мембраны, и согласно ей, первоначально пора образуется в контактных местах внутренней и наружной мембран митохондрий, и эти контактные места образованы следующими белками - вольт-зависимым анионным каналом (VDAK), локализованном в наружной мембране, растворимым матричным белком циклофилином D и транслоказой адениновых нуклеотидов, локализованной во внутренней митохондриальной мембране.

Известно, что аденозинтрифосфат является обязательным компонентом апоптосомы [Seppel et al., 2009], поэтому апоптоз происходит лишь в том случае, если энергетический статус клетки более или менее сохраняется (уровень АТФ не может снижаться ниже 30% от исходного уровня).

Помимо апоптоза и некроза, существует еще одна форма гибели клетки - аутофагия, описанная почти одновременно с апоптозом [Schweichel and Merker, 1973], как альтернативный вариант программируемой гибели клетки, в том числе, и при метаболической депрессии. Основу этого процесса составляют события, аналогичные таковым при фагоцитозе (Рис. 4): обертывание мембраной подлежащей деградации части клетки с Образованием аутофагосомы и последующее слияние с лизосомой с формированием аутофаголизосомы [Go/uacik and Kimchi, 2004; Lockshin and Zakeri, 2004; Okada and Mak, 2004; Levine, 2005]. Аутофагия сопровождает жизнедеятельность любой нормальной клетки в обычных условиях как способ обновления органелл [Lockshin and Zakeri. 2004; Kondo et al., 2005]. Особенно важна роль аутофагии в процессе эмбриогенеза. Однако под влиянием некоторых стрессорных факторов указанные явления могут значительно активизироваться. Аутофагия может быть индуцирована активными формами кислорода, ионизирующей радиацией и, особенно,

НАЯ

снижением содержания аминокислот и АТФ в цитозоле клетки [Kondo et al., 2005; Levine, 2005; Hait et al., 2006].

Сейчас различают три типа аутофагии — микроаутофагию, макроаутофагию и шаперон-зависимую аутофагию. При микроаутофагии макромолекулы и обломки клеточных мембран просто захватываются лизосомой. Таким путем клетка может переваривать белки при дефиците энергии или строительного материала (например, при голодании).

При макроаутофагии участок цитоплазмы (часто содержащий какие-либо органоиды) окружается мембранным компартментом, похожим на цистерну эндоплазматической сети. В результате этот участок оказывается отгорожен от остальной цитоплазмы двумя мембранами - формируется аутофагосома, которая затем сливается с лизосомой, и ее содержимое переваривается. Третий тип аутофагии -— шаперон-зависимая. При этом способе происходит направленный транспорт частично денатурировавших белков из цитоплазмы сквозь мембрану лизосомы в ее полость.

PrrMutophagoitMn о

Autophagy

Cytiibolic chapcronc complex

Cytosofic p rote in

Macroairtophagy

Cvtosoi

CMA

Autopliagic vacuole

Miooautopliûgy

[ST]

yL ► «

P/oteasome

LAMP-2A

Lysosorttti

Рис. 4. Схема развития трех типов аутофагии: микроаутофагии, макроаутофагии и шаперон-зависимой аутофагии.

В настоящее время на дрожжах детально изучаются генетические механизмы, регулирующие аутофагию. Так, для образования аутофагосом необходима активность многочисленных белков Atg-семейства (autophagosome-related proteins). Гомологи этих белков найдены у млекопитающих (в том числе и человека) и растений.

Как и при апоптозе, эффекторными молекулами аутофагии являются различные протеазы - ферменты, вызывающие гидролиз пептидной связи [Uchiyama, 2001], Лизосомальные гидролазы, известные как катепсины, в зависимости от их ферментативной активности, можно разделить на несколько групп: цистеиновые, сериновые и катепсины аспарагиновой кислоты, которые вместе с другими факторами вызывают основные изменения при аутофагии [Kaminskyy and Zhivotovsky, 2012].Кроме того, имеются данные, указывающие на го, что сигнальные пути апоптоза и некроза перекрываются [Elmore et al., 2001]. В частности, обнаружено, что активированные катепсины могут усиливать апонтотичеекий сигнал [Repnik et al., 2012], а инактивация катепсина Г> замедляет апоптоз в печени [Baskin-Bey et al., 2005]. 11а рис. 5 представлена схема возможного взаимодействия протсаз, активированных при апоптозе и аутофагии.

Таким образом, в настоящее время исследованы далеко не все молекулярные механизмы метаболической депрессии, в частности, отсутствуют данные по изменению митохондриального мембранного потенциала, очень малочисленны сведения, касающиеся внутриклеточной концентрации свободного кальция и рН. Изучению именно этих механизмов и посвящена представленная работа. Исследование механизмов гибели клеток также остается актуальным направлением, как в биологии, так и в медицине - лишь в последнее время стали появляться работы, в которых делается попытка выяви ть взаимосвязь между различными путями клеточной гибели. Гепатоциты миноги в период преднерестовой миграции дают возможность изучать мало описанные молекулярные механизмы, сопровождающие постепенный вход в метаболическую депрессию,

непосредственно метаболическую депрессию, и выход из нес, который заканчивается гибелью. В следующих главах мы рассмотрим особенности развития метаболической депрессии, а также механизмы гибели гепатоцитов миноги в период преднерестовой миграции.

Рис. 5. Схема возможного взаимодействия протеаз при апоптозе и лизосомальной гибели клетки (Liu et al., 2006J.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Экспериментальные животные

Работа выполнена на самках миног (Lampetra fluviatilis L.). Животных вылавливали в сентябре-октябре в дельте Невы во время преднерестовой миграции из Балтийского моря в реку и содержали в аквариумах с чистой, холодной (+2-+4°С) и хорошо аэрируемой водой. В отдельных экспериментах для температурной адаптации миног в течение 48 часов содержали в теплой воде (+17-+18°С). Все эксперименты проводились с 2008 по 2011 гг.

2.2. Выделение гепатоцитов миноги

Гепатоциты из печени миноги выделяли коллагеназным методом, описанным Т. Моммсен [Mommsen et al, 1994] с изменениями. Печень наркотизированного животного (40 мг нембутала на 50 г живого веса) перфузировали in situ через sinus venosus охлажденной средой выделения (136.9 мМ NaCl, 5.4 мМ КС1, 0.81 мМ MgS04, 0.44 мМ КН2Р04, 0.33 мМ Na2HP04, 5.0 мМ NaHC03, 10 мМ HEPES, 5 мМ глюкозы, рН 7.6). Скорость потока, создаваемого перистальтическим насосом, была 12.5 мл/мин. По окончании перфузии печень изолировали и измельчали ножницами на кусочки размером 1-2 мм. Кусочки отмывали средой для перфузии и инкубировали в 10 мл той же среды с добавлением 0.1% коллагеназы VIII типа в течение 1 часа при комнатной температуре (20-22°С). Диспергированные кусочки печени пропускали через нейлоновый фильтр. Полученную суспензию клеток отмывали 3 раза путем центрифугирования в течение 3 минут при 60g. Супернатант осторожно сливали, а клеточный осадок ресуспендировали в среде выделения, содержащей СаС12 (1.5 тМ) и 0.5% бычьего сывороточного альбумина (БСА).

С конца октября до середины марта рН сред выделения был 6.5 вместо 7.6, при этом HEPES (рКа = 7.5) во всех растворах был заменен на MES (рКа

= 6.1) [Savina and Gamper, 1998]. Подсчет клеток проводили в камере Фукса-Розенталя. Витальность гепатоцитов оценивали по окрашиванию 0.5% раствором трипанового синего. Обычно суспензия содержала около 40-60 млн. клеток в мл, а количество прокрашенных трипановым синим гепатоцитов не превышало 5%. Выделенные гепатоциты хранили на льду.

2.3. Определение концентрации адениновых нуклеотидов в гепатоцитах и кусочках печени миноги

2.3.1. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

Получение тканевых экстрактов

После декапитации животных печень быстро изолировали и немедленно замораживали в жидком азоте. Затем кусочки замороженной ткани растирали до порошкообразного состояния в охлажденной фарфоровой ступке с жидким азотом. Гомогенизированную ткань обрабатывали 1 М НСЮ4 (из расчета 5 мкл/мг ткани) в течение 30 мин, затем гомогенат центрифугировали при 4°С в течение 10 мин при lOOOOg. Надосадочную жидкость нейтрализовали 1.5 М К2С03, приготовленном на 0.5 М триэтаноламине (45 мкл/100 мкл экстракта) и выдерживали на льду 15 мин, после чего осадок удаляли центрифугированием. Супернатант хранили до анализа при -80°С.

Получение клеточных экстрактов

К 100 мкл суспензии гепатоцитов, содержащей 5-10 млн клеток, добавляли на льду 100 мкл 1 М НСЮ4. Через 20 минут пробу центрифугировали при 4°С в течение 10 мин при lOOOOg. Экстракт нейтрализовали 1.5 М К2С03, приготовленном на 0.5 М триэтаноламине (45 мкл/100 мкл экстракта) и выдерживали на льду 10 мин, после чего осадок удаляли центрифугированием. Супернатант хранили до анализа при -80°С.

Условия хроматографирования

Определение нуклеотидов в образцах проводили методом ионообменной ВЭЖХ на хроматографе марки «Knauer» (Германия) с использованием колонки «Phenomenex Luna NH2» (4,6 * 250 мм, 5 мкм) (США). Детектирование проводили на одно лучевом спектрофотометре при

длине волны 254 нм. Для полного разделения нуклеотидов применяли линейную градиентную элюцию с использованием деионизованной воды (А) и 1 М фосфатного буфера рН 6.8 (В). Использовали следующую схему хроматографического разделения: 0-30 мин от 10% В до 100% В, 30 - 37 мин 100% В, 37 - 42 мин от 100% В до 10% В, 42 - 52 мин 90% А и 10% В. Скорость объемной подачи элюента составляла 1 мл/мин, давление - 8,0 МПа, объем вводимой пробы - 20 мкл. Расчет количественного состава нуклеотидов в образцах проводили методом внешнего стандарта с применением программы MultiChrom 1.52.0.0 для Windows (рис. 2).

мВ Mi

АМФ

АДФ

А--

АТФ

0 2 4 «

10 12 11 1« 1« 20 11 И

~20 30 32 М М 30 40 42 U it к

Рис. 6. Хроматограмма разделения стандартной смеси адениновых нуклеотидов.

2.3.2. Люциферин-люциферазный метод

Концентрацию АТФ в изолированных гепатоцитах миноги измеряли люциферин-люциферазным методом [Brown, 1982] на люминометре ЛЮМ-1 компании "Люмтек" (Россия) с использованием стандартных наборов реактивов "Люмтек".

2.4. Определение митохондриального мембранного потенциала в гепатоцитах миноги

Для измерения митохондриального мембранного потенциала (ММП) использовали витальные флуоресцентные красители tetramethyl rhodamine methyl ester (TMRM) [Emaus, 1986; Ehrenberg et al., 1988], DiOC6(3) (3,3'-dihexyloxacarbocyanine iodide) [Pringle et al., 1989] и MitoTracker Green (MTG) [Zhang, 1994]. Окрашенные клетки анализировали на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе и на проточном цитометре.

В работе использовался лазерный сканирующий конфокальный микроскоп Leica TCS SP5 ("Leica Microsystems, Heidelberg", Germany), оборудованный иммерсионным объективом НСХ PL АРО CS 63.0x1.40 OIL UV. Диаметр конфокальной диафрагмы составлял 95.5 мкм. Флуоресцентный сигнал поступал через разделитель лучей FW TD 488/543/633. Скорость сканирования - 400 Гц. Пиксельный формат сканирования - 1024 х 1024. Одну и ту же рамку сканировали 4 раза. Для улучшения разрешения изображения дополнительно использовали электронное масштабирование области сканирования (коэффициент увеличения - 3.62). Анализ изображений, полученных на конфокальном микроскопе, проводили с помощью стандартного программного обеспечения Leica, программы Image J 1.41 (Wayane Rasband, National Institutes of Health, USA; http://rsb.info.nih.gov/ij) а также с помощью специально разработанной программы MicroPhoto (ИЭФБ РАН).

При цитометрическом анализе использовали проточный цитометр EPICS XL ("Beckman Coulter", USA). Среднюю интенсивность флуоресценции красителя получали от не менее 10000 клеток из каждой пробы. Анализ данных, полученных на проточном цитометре, проводили в программе WinMDI 2.9 (Joseph Trotter, Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA). Для определения фоновой флуоресценции использовали клетки, преинкубированные с протонофором carbonyl cyanide /?-(trifluoromethoxy)

phenylhydrazone (FCCP, 40 мкМ), сбрасывающим митохондриальный потенциал.

Определение ММП с помощью TMRM

Суспензию клеток (1 млн/мл) инкубировали с TMRM (500 нМ) при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут. Затем гепатоциты отмывали 2 минуты при 60g и ресуспендировали в среде выделения, содержащей 0.25% BSA. Флуоресценцию красителя на конфокальном микроскопе возбуждали синим светом аргонового лазера (hex = 488 нм), а регистрировали при длине волны > 560 нм. При анализе клеток на проточном цитометре интенсивность флуоресценции регистрировали во втором канале FL2 (575±15 нм).

Определение ММП с помощью DiOCf/3)

Гепатоциты (1 млн/мл) инкубировали с 1 нМ DiOC6(3) в течение 40 минут при комнатной температуре в темноте [Rottenberg and Wu, 1998]. Для выявления погибших клеток к каждой пробе непосредственно перед анализом добавляли пропидий йодид (PI, 5 мкг/мл). При анализе клеток на проточном цитометре флуоресценцию DiOC6(3) и PI возбуждали синим аргоновым лазером (488 нм), а регистрировали в первом канале FL1 для DiOC6(3) (525±20 нм) и в третьем канале для PI (620±15 нм). При конфокальной микроскопии интенсивность флуоресценции регистрировали в зеленой области (Хет = 500-520 нм) при возбуждении синим светом аргонового лазера (À,ex = 488 нм).

Определение ММП с помощью FRET (Fluorescence resonance energy transfer) анализа

Суть метода флуоресцентной резонансной передачи энергии при исследовании ММП заключается в том, что митохондрии метятся двумя флуорохромами (TMRM и MTG) со спектром испускания донора (MTG), перекрывающимся со спектром поглощения акцептора (TMRM). Оба флуорохрома аккумулируются в митохондриях. При деполяризации митохондрий TMRM выходит из них, a MTG остается, поскольку он

ковалентно связывается с тиоловыми группами внутримитохондриальных белков. TMRM обратимо гасит флуоресценцию MTG только если митохондрии имеют достаточно высокий мембранный потенциал. Этот феномен необходим для визуализации деполяризованных и поляризованных митохондрий в живой клетке, т.е. является показателем энергетической гетерогенности в митохондриальной популяции клеток.

Суспензию гепатоцитов (1 млн/мл) в течение 1 часа инкубировали с MTG (500 нМ), затем клетки отмывали и окрашивали TMRM (500 нМ) в течение 30 минут, после чего клетки снова отмывали. Анализ проводили на конфокальном микроскопе: для возбуждения флуоресценции MTG использовали аргоновый лазер (Хех = 488 нм), флуоресцентный сигнал от MTG регистрировали в зеленом канале (Хет = 500-520 нм), от TMRM в красном канале (А,ет > 560 нм).

Для оценки ММП по изображениям, полученным с конфокального микроскопа, была разработана специальная программа MicroPhoto (ИЭФБ РАН). В программе MicroPhoto изображения анализировались по следующему алгоритму.

1. Изображение разрешением 1024 х 1024 пикселей представлялось в виде матрицы, содержащей значения яркости каждого пикселя. Минимальная яркость пикселя равна 0, максимальная - 255.

2. Вычислялась средняя яркость пикселей, составляющих внеклеточную среду, причем из расчета исключались те значения яркости, которые превышали моду (наиболее часто встречающееся значение) больше чем на 1.

3. Для каждого пикселя, находящегося внутри клетки, рассчитывалась величина в процентах от максимального значения (log 255) по формуле:

Ни 100%

л = 1о~

lout loglbS '

где Ijn - яркость пикселя внутри клетки, Iout - средняя яркость пикселей вне клетки. Яркость пикселя прямо пропорциональна интенсивности

флуоресценции красителя, которая в свою очередь линейно зависит от его концентрации. Логарифмическое преобразование отражает зависимость потенциала на мембране от концентраций положительно заряженных ионов, (в данном случае ТМЯМ), по обе стороны мембраны.

4. Для наглядного изображения распределения флюоресценции ТМКМ внутри клетки весь диапазон возможных значений X (от 0 до 100 %) был разбит на 9 интервалов, как показано на рисунке 3. Каждому интервалу был присвоен определенный цвет.

0-20 s 41-50 51-S0 61-70 71-80 1 1

Рис. 7. Распределение значений X по интервалам в программе MieroPhoto.

Изображения, полученные на конфокальном микроскопе, кроме того, были количественно проанализированы с помощью программы Image J. По каждому образцу было проанализировано не менее 50 клеток из неперекрывающихся областей изображения. Для каждой клетки была определена средняя интенсивность флуоресценции TMRM, затем из этого значения была вычтена фоновая флуоресценция (флуоресценция после добавления 40 мкМ FCCP). Полученные средние значения флуоресценции TMRM представлены в процентах от исходного значения. При анализе сезонной динамики данные за октябрь были приняты за исходное значение, при анализе влияния гормонов и дбцАМФ - контрольные значения (параллельные пробы без добавления гормонов и дбцАМФ) были приняты за исходные данные.

2.5. Определение выживаемости клеток

Выживаемость клеток определяли по окрашиванию пропидием йодидом. Клетки в течение 5 мин инкубировали при комнатной температуре с пропидием йодидом (5 мкг/мл). Флуоресценцию клеток оценивали на проточном цитометре = 488 нм, = 675±15 нм).

2.6. Измерение внутриклеточной концентрации свободного кальция ([Са2+Ю

Для определения [Са ]j гепатоциты нагружали флуоресцентным зондом Fura 2-АМ (5 мкМ). Флуоресценцию красителя возбуждали двумя длинами волн 340 и 380 нм, а эмиссию регистрировали при 510 нм. Измерение флуоресценции проводили как в среде содержащей кальций (1.5 мМ), так и в бескальциевой среде (с добавлением ЭГТА (0.5 мМ)). В суспензии гепатоцитов измерения выполняли с помощью спектрофлуорофотометра Shimadzu RF - 1501 (Япония), а для регистрации сигнала от отдельной клетки использовали компьютерную систему анализа внутриклеточного содержания ионов (Intracellular Imaging & Photometry System, USA). Внутриклеточную концентрацию свободных ионов

Са ([Са ];) рассчитывали по уравнению

Гринкевича [Grynkiewicz, 1985]:

[Ca2+]j = [(R - Rmin)/(R.max - R)] Kd*(Sf2/Sb2), где

KD - константа диссоциации Fura-2 (135 нмоль/л при t = 20°C

[Krumschnabel et al., 1997a]);

(3 - отношение интенсивности флуоресценции несвязанной с Са2+ Fura-2

к интенсивности флуоресценции связанной с

Са2+ Fura-2 при Хех - 380

нм;

Я - отношение интенсивности флуоресценции при двух длинах волн

А.ех=340 нм и 1ех=380 нм в исследуемой точке;

К-тах _ отношение интенсивности флуоресценции Рига-2, насыщенной

Са2+ при двух длинах волн Хсх=340 нм и А,ех=380;

К-шт - отношение интенсивностей флуоресценции Рига-2, свободной от

Са2+ при двух длинах волн Хех=340 нм и А,ех=380;

8+2 - максимальная интенсивность флуоресценции при А,ех=380 нм;

8Ь2 - минимальная интенсивность флуоресценции при А-ех=380 нм;

Максимальное и минимальное значение флуоресценции измеряли в конце каждого опыта после добавления Тритона Х-100 (0.1 %) и ЭГТА (100 мкМ) (рис. 8).

Состояние внутриклеточных кальциевых депо оценивали по изменению [Са2+^ в ответ на действие Са2+-мобилизующих агентов: антибиотика брефелдина А (50 мкМ), разрушающего мембраны аппарата Гольджи (АГ), и тапсигаргина (1 мкМ) - специфического ингибитора Са -АТФазы эндоплазматического ретикулума (ЭР), вызывающего мобилизацию кальция из ретикулума.

м

сз

3

Р-.

Время, с Время, с

Рис. 8. Типичные кривые, полученные при измерении [Са2+];. А -Интенсивность флуоресценции Еига-2 при двух длинах волн Хех=340 (а) нм и >.ех=380 (б). Б - отношение интенсивностей флуоресценции Рига-2, свободной от Са2+ при двух длинах волн ^ех=340 нм и 1ех=380.

2.7. Измерение внутриклеточного рН гепатоцитов миноги

Для измерения внутриклеточного рН в гепатоцитах миноги использовали рН-чувствительный флуоресцентный краситель SNARF-1 AM (carboxy SemiNaphthoRhodaFluor acetoxymethyl ester). Калибровочную кривую строили по нигерициновому методу [Choe and Hedley, 1997]. Для этого использовали буферные растворы с высокой концентрацией ионов калия (140 мМ) в диапазоне рН от 6.0 до 8.0 с интервалом в 0.2 единицы рН. К каждой калибровочной пробе добавляли аликвоту суспензии клеток, преинкубированных со SNARF-1 AM (5 мкМ). Кроме того, в каждую пробу при калибровке вводили ионофор нигерицин (2 мкг/мл), являющийся К+/Н+-обменником, в присутствии которого равновесный рН цитозоля становится равным рН калибровочного раствора. Измерения калибровочных и опытных проб проводили на проточном цитометре. Флуоресценцию SNARF-1 возбуждали синим аргоновым лазером (488 нм), а регистрировали во втором канале FL2 (575±15 нм) и в четвёртом канале FL4 (675±15 нм). Отношение интенсивностей флуоресценций 675/575 пропорционально внутриклеточному рН. Типичная калибровочная кривая представлена на рис. 5.

ю 600

г~-

ю

ю

>s 500

ф SS-

о о

m s 0 1 а> <: \— LL СС 400

1- <

X s Z 300

а> (п

s X а? s s u 200

3 X

о а>

X zr

I- о

О а> а. о >. с; 100

0

6 6,5 7 7,5 8

рН калибровочного раствора

Рис. 9. Пример калибровочной кривой для измерения внутриклеточного рН в гепатоцитах миноги.

2.8. Выявление апоптотических клеток

2.8.1. Выявление апоптотических и некротических клеток путем последовательного окрашивания акридиновым оранжевым и пропидием йодидом

Для выявления живых, некротических и апоптотических клеток гепатоциты последовательно окрашивали акридиновым оранжевым (АО) и пропидием йодидом (PI). К суспензии гепатоцитов (1 млн/мл) добавляли АО (5 мкг/мл). Затем клетки инкубировали в течение 10 минут в темноте на льду и отмывали 2 минуты при 60g и температуре +4°С. К полученной суспензии добавляли PI (5 мкг/мл). Флуоресценцию АО и PI возбуждали лучом аргонового лазера (488 нм), а регистрировали в зеленой (525 нм) и красной (620 нм) областях. Полученные изображения проанализированы в программе Image J как, описано в работе Мироновой и др. [Mironova et al., 2007]. Этот метод позволяет выявить некротические, апоптотические и живые клетки.

2.8.2. Определение активности каспаз 3,7,9

Активность внутриклеточных протеолитических ферментов каспаз (3, 7, 9) была определена с помощью Carboxyfluorescein FLICA Apoptosis detection kit. Fluorochrome Inhibitor of Caspases (FLICA) имеет способность легко проходить через клеточную мембрану и ковалентно связываться с цистеиновыми остатками активных каспаз. После ковалентного связывания FLICA остается в клетке, в то время как несвязанный реагент легко выходит из клетки. Флуоресценцию FLICA возбуждали синим лазером (Хех = 488-492 нм), а регистрировали в зеленой области (Хеш = 515-535 нм). Существует несколько типов FLICA реагентов, с помощью которых можно определить активность разных типов каспаз. В наших исследованиях использовались FLICA FAM-DEVD-FMK (для определения активности каспаз 3, 7) и FLICA FAM-LEHD-FMK (для определения активности каспазы 9).

Для окрашивания клетки (1 млн/мл) в течение 1 часа инкубировали с FLICA реагентом, а затем дважды отмывали (60g, 2 мин.) Флуоресценцию окрашенных клеток измеряли на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе. Анализ изображений, проводили в программе Image J. Оценивали среднюю интенсивность флуоресценции клеток.

2.8.3. Определение активности катепсина Б

Активность лизосомального протеолитического фермента катепсина Б определяли с помощью Magic Red Cathepsin Detection Kit (Immunochemistry Technologies, LLC). Magic Red - производное флуорохрома крезила фиолетового, присоединение к нему группы аргинин-аргинин или другой группы ведет к тому, что он становится нефлуоресцирующим. Ферментативное взаимодействие субстратных производных крезила фиолетового с катепсинами ведет к отщеплению 1 или 2 аргининовых амидных связывающих сайтов, что в свою очередь вызывает флуоресценцию моно- и незамещенного крезила фиолетового в красной области (Ает = 628 нм) при возбуждении желто-оранжевым светом (Ает = 550-590 нм). Для окрашивания суспензию гепатоцитов (1 млн/мл) в течение часа инкубировали с Magic Red реагентом при комнатной температуре. Регистрацию флуоресценции проводили на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе. Анализ изображений, проводили в программе Image J. Оценивали среднюю интенсивность флуоресценции клеток.

2.8.4. Определение выхода цитохрома с из митохондрий методом иммуноблоттинга

Получение цитозольной и митохондриалъной фракции

100 мг ткани печени гомогенизировали в 300 мкл буфера (250мМ сахарозы, ЮОмМ КС1, 5мМ MgCl2, 5мМ 2-меркаптоэтанол, 40мМ Tris-HCl, 1:1000 ингибиторы протеаз, рН 7,4). Из гомогената получали митохондрии (осадок при 12000xg) и цитозоль (супернатант при 22000 xg).

Электрофоретическое разделение белков и их молекулярно-весовой анализ проводили в 8 % полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии 0,1 % додецил-сульфата натрия по методу Laemmli [Laemmli, 1970] с использованием камеры для вертикального электрофореза фирмы «BioRad» (США). Белки, разделенные электрофоретическим методом в ПААГ, переносили на нитроцеллюлозный фильтр («BioRad», США) в электрофоретической ячейке для блоттинга «Mini Trans-Blot» фирмы "BioRad" (США) при постоянной силе тока 350 мА в течение 1 часа. После переноса проводили неспецифическую забивку фильтра раствором BLOTTO (5 % раствор обезжиренного молока, приготовленный на PBS, содержащем 0,2 % "Tween-20" (PBS-T)) в течение ночи при 4°С. Затем мембраны инкубировали с первыми антителами в течение 1 часа. После инкубации фильтр отмывали в PBS-T по схеме: 1 раз 1 минуту, 1 раз 15 минут и 2 раза по 5 минут при комнатной температуре. Затем мембраны инкубировали со вторыми антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, фирмы "Amersham" (Великобритания) в течение 1 часа. После инкубации фильтр отмывали в PBS-T по схеме: 1 раз 1 минуту, 1 раз 15 минут и 4 раза по 5 минут при комнатной температуре. Для выявления иммунореактивных полипептидов использовали детекционную систему "ECL western blotting detection reagent" фирмы "Amersham" (Великобритания). Визуализацию иммунореактивных зон проводили с помощью хемилюминесцентного проявителя на рентгеновской пленке "Hyperfilm ECL" фирмы "Amersham" (Великобритания).

В качестве первых антител использовали кроличьи поликлональные антитела к цитохрому с (Cytochrome С (Н-104) rabbit polyclonal antibody) фирмы Santa Cruz biotechnology, Inc. (США).

2.9. Статистическая обработка полученных результатов

Полученные данные обрабатывали статистически с применением двустороннего критерия Стьюдента с использованием пакета прикладных

компьютерных программ «Statistiea», версия 5.11. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0.05.

В работе использованы реактивы марки «хч» отечественного производства, фирм Sigma (США), Serva (Германия), Fluca (Швейцария) и Invitrogen (США).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Концентрации адениновых нуклеотидов в кусочках печени и в гепатоцитах миноги в период преднерестовой миграции.

В наших исследованиях было показано, что на протяжении

преднерестовой миграции концентрации адениновых нуклеотидов, определенные в кусочках печении миноги подвергаются значительным колебаниям (рис. 10). Так, концентрация АТФ с октября по февраль снижается с 0.81±0.04 до 0.23±0.05 нмоль/мг влажной массы, при этом возрастает концентрация АМФ (с 0.10±0.03 до 0.38±0.07 нмоль/мг влажной массы), одновременно наблюдается снижение энергетического заряда Аткинсона с 0.75±0.05 до 0.41±0.05. Весной, начиная с марта, наблюдается резкое увеличение концентрации АТФ до 0.88±0.09 нмоль/мг влажной массы (апрель), энергетический заряд достигает осенних значений - 0.71±0.05 (апрель), а аденилатный пул возрастает до 1.64±0.11 нмоль/мг влажной массы.

I 2 0,5

% Ж

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Коновалова, Светлана Александровна

выводы

1. В гепатоцитах миноги в зимний период преднерестовой миграции наблюдается обратимая метаболическая депрессия, характеризующаяся обратимым снижением концентрации АТФ и энергетического заряда Аткинсона и обратимым нарастанием концентрации АМФ.

2. Обратимая метаболическая депрессия в гепатоцитах миноги сопровождается снижением митохондриального мембранного потенциала в 2-3 раза по сравнению с периодами метаболической активности.

3. В период метаболической депрессии в гепатоцитах миноги внутриклеточная концентрация свободных ионов кальция умеренно возрастает (на 50-80%), при этом внутриклеточные кальциевые депо опустошены.

4. В период метаболической депрессии наблюдается стойкое снижение внутриклеточного рН, что может являться одним из механизмов, защищающим клетки от гибели.

5. Гепатоциты миноги, изолированные в период метаболической депрессии, способны выживать в условиях химической аноксии in vitro в течение нескольких суток.

6. Гибель гепатоцитов миноги в весенний период обусловлена выходом цитохрома с из митохондрий и активацией как митохондриального, так и лизосомального путей апоптоза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выяснение механизмов метаболической депрессии как адаптивной реакции организма, направленной на сохранение энергии в неблагоприятных условиях среды, является актуальнейшей проблемой современной биологии и медицины. Исследования в этом направлении были начаты очень недавно, и в настоящее время имеются лишь единичные работы, посвященные изучению метаболической депрессии при аноксии, выполненные на единичных видах. Данные по метаболической депрессии, вызванной голоданием, вовсе отсутствуют. В имеющихся на сегодняшний день работах отсутствуют данные по динамике митохондриального мембранного потенциала, очень мало данных, касающихся регуляции гипометаболизма через систему вторичных посредников.

Изучение феномена обратимой метаболической депрессии в гепатоцитах миноги позволило выявить ряд защитных механизмов, позволяющих клеткам в течение длительного времени существовать в условиях глубокого гипометаболизма. Во-первых, это умеренное увеличение внутриклеточной концентрации свободного кальция, что создает условия для регуляции активности ионных каналов через систему обратимого фосфорилирования. Такая система регуляции была детально изучена на примере ионотропного NMDA-глутаматного рецептора в нейронах болотной черепахи [Shin et al., 2005; Bickler and Buck, 2007]. Во-вторых, устойчивое снижение внутриклеточного рН, наблюдаемое в гепатоцитах миноги при метаболической депрессии, что является эффективным механизмом защиты клеток от некроза в условиях гипометаболизма [Donohoe and Boutiler, 1998].

Обнаруженное в поздний весенний период параллельное развитие митохондриального и лизосомального путей гибели клеток указывает на возможную взаимосвязь сигнальных путей этих процессов.

Таким образом, метаболическая депрессия в гепатоцитах миноги развивается по принципам, описанным в последние годы на клетках пока что единичных видов пойкилотермных позвоночных, переживающих аноксию. Полученные в представленной работе данные позволят глубже понять как механизмы, лежащие в основе развития и регуляции обратимой метаболической депрессии, так и механизмы, задействованные в гибели клеток.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Коновалова, Светлана Александровна, 2011 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Емельянова Л. В., Савина М. В., Беляева Е. А., Брайловская И. В. Особенности функционирования митохондрий печени речной миноги Lampetra fluviatilis и травяной лягушки Rana temporaria в периоды подавления и активации энергетического обмена // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2007. Т. 43. С. 474-481.

2. Крутецкая З.И., Лебедев О.Е., Курилова Л.С. Механизмы внутриклеточной сигнализации. - Санкт-Петербург, 2003. - 208 с.

3. Николе Дж., Мартин Р., Валлас Б., Фукс П. От нейрона к мозгу. - М.: УРСС, 2003. - С. 207.

4. Плисецкая Е.М. Гормональная регуляция углеводного обмена у низших позвоночных. - Л.: Наука, 1975. - 215 с.

5. Савина М.В. Механизмы адаптации тканевого дыхания в эволюции позвоночных. - СПб.: Наука, 1992. - 200 с.

6. Савина М.В. Особенности структуры и функции тканевых энергетических систем круглоротых (Lampetra fluviatilis L.). Дисс. д.б.н., Л., 1985.

7. Abnous К., Dieni С.А., Storey К.В. Regulation of Akt during hibernation in Richardson's ground squirrels // Biochim. Biophys. Acta-Gen. Subjects. 2008. Vol. 1780, P. 185-193.

8. Adrain C., Martin S.J. The mitochondrial apoptosome: a killer unleashed by the cytochrome seas // Trends Biochem. Sci. 2001. Vol. 26. P. 390-397.

9. Agostini В., De Martino L., Soltau В., Hasselbach W. The modulation of the calcium transport by skeletal muscle sarcoplasmicreticulum in the hibernating European hamster // Z. Naturforsch. 1991. Vol. 46. P. 11091126.

1 O.Ahmed Kh.H., Pelster В., Krumschnabel G. Signalling pathways involved in hypertonicity- and acidification-induced activation of Na+/H1 exchange in trout hepatocytes // J. Exp. Biol. 2006. Vol. 209. P. 3101-3113.

1 l.Anchordoguy T.J., Hand S.C. Acute blockage of the ubiquitin-mediated proteolytic pathway during invertebrate quiescence // Am. J. Physiol. 1994. Vol. 267. P. 895-900.

12. Anderson W.M., Wood J.M., Anderson A.C. Inhibition of mitochondrial and Paracoccus denitrificans NADH-ubiquinone reductase by oxacarbocyanine dyes. A structure-activity study // Biochem Pharmacol. 1993. Vol. 45. № 10. P. 2115-2122.

13.Andersson B.S., Aw T.Y., Jones D.P. Mitochondrial transmembrane potential and pH gradient during anoxia // Am. J. Physiol. 1987. Vol. 252. P. 349-355.

14.Apoptosis [Электронный ресурс] / Institute of Cell and Molecular Science. 2011. URL: http://www.icms.qmul.ac.uk/flowcytometry/uses /apoptosis/ (дата обращения: 25.11.2011).

15.Aronica S.M., Kraus W.L., Katzenellenbogen B.S. Estrogen action via the cAMP signaling pathway: stimulation of adenylate cyclase and cAMPregulated gene transcription // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. Vol. 91. P. 8517-8521.

16.Autuori F., Bertolini B. A study of some acid hydrolases in the liver of the larval and adult lamprey // Cell and Tissue Research. 1965. V. 68, Number 6, P. 818-829.

17.Barger J.L., Brand M.D., Brian M.B., Boyer B.B. Tissue-specific dipression of proton leak and substrate oxidation in hibernating arctic ground squirrels // Am. J. Physiol. Regul. Interg. Сотр. Physiol. 2003. Vol. 284. P. 13061313.

18.Baskin-Bey E.S., Canbay A., Bronk S.F., Werneburg N., Guicciardi M.E., Nyberg S.L. and Gores G.J. Cathepsin В inactivation attenuates hepatocyte apoptosis and liver damage in steatotic livers after cold ischemia-warm reperfusion injury // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2005. Vol. 288. P. 396-402.

19.Beguin P., Beggah A.T., Chibalin A.V., Burgener-Kairuz P., Jaisser F., Mathews P.M., Rossier B.C., Cotecchia S., Geering K. Phosphorylation of the Na,K-ATPase alpha-subunit by protein kinase A and C in vitro and in intact cells. Identification of a novel motif for PKCmediated phosphorylation // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269. P. 24437-24445.

20.Bertorello A.M., Aperia A., Walaas S.I., Nairn A.C., Greengard P. Phosphorylation of the catalytic subunit of Na+ K+-ATPase inhibits the activity of the enzyme // Proc. Natl. Acad. Sci. 1991. Vol. 88. P. 1135911362.

21.Bertorello A.M., Katz A.I. Regulation of Na+-K+ pump activity: pathways between receptors and effectors // News Physiol. Sci. 1995. Vol. 10. P. 253259.

22.Bicker P.E., Donohoe P.H., Buck L.T. Molecular adaptations for survival during anoxia: lessons from lower vertebrates // Neuroscientist. 2002. Vol. 8. P. 234-242.

23.Bickler P.E. Cerebral anoxia tolerance in turtles: regulation of intracellular calcium and pH // Am. J. Physiol. 1992. Vol. 263. P. 1298-R1302.

24.Bickler P.E. Clinical perspectives: neuroprotection lessons from hypoxia-tolerant organisms // J. Exp. Biol. 2004. Vol. 207. P. 3243-3249.

25.Bickler P.E., Buck L.T. Adaptations of vertebrate neurons to hypoxia and anoxia: maintaining critical Ca concentrations // J. Exp. Biol. 1998. Vol. 201. P. 1141-1152.

26.Bickler P.E., Buck L.T. Hypoxia tolerance in reptiles, amphibians, and fishes: life with variable oxygen availability // Ann. Rev. Physiol. 2007. Vol. 69. P. 145-170.

27.Bickler P.E., Donohoe P.H., Buck L.T. Molecular adaptations for survival during anoxia: lessons from lower vertebrates // Neuroscientist. 2002. Vol. 8. № 3. P. 234-242.

28.Bickler P.E., Donohoe P.H., Buck L.T. The hypoxic brain: suppressing energy expensive membrane functions by regulation of receptors and ion

channels. In: Storey K. B. (Ed.) Mechanisms of metabolic arres, 2001. - P. 77-102.

29.Bickler P.E., Gallego S.M. Inhibition of brain calcium channels by plasma proteins from anoxic turtles // Am. J. Physiol. 1993. Vol. 265. P. 277-281.

30.Bickler P.E., Gallego S.M., Hansen B.M. Developmental changes in intracellular calcium regulation in rat cerebral cortex during hypoxia // J. Cereb. Blood Flow Metab. 1993. Vol. 13. P. 811-900.

31.Biggar K.K., Storey K.B. Metabolic rate depression in animals: transcriptional and translational controls // Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 2004. Vol. 79. № 1. P. 207-233.

32.Biggar K.K., Storey K.B. Perspectives in cell cycle regulation: lessons from an anoxic vertebrate // Curr. Genomics. 2009. Vol. 10. № 8. P. 573-584.

33.Biggar, K.K., Dubuc A., Storey K.B. MicroRNA regulation below zero: differential expression of miRNA-21 and miRNA-16 during freezing in wood frogs // Cryobiology. 2009. Vol. 59, P. 317-321.

34.Bishop T., St-Pierre J., Brand M.D. Primary causes of decreased mitochondrial oxygen consumption during metabolic depression in snail cells // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2002. Vol. 282. P. 372-382.

35.Bj6rnstrom L., Sjoberg M. Mechanisms of estrogen receptor signaling: convergence of genomic and nongenomic actions on target genes Molecular endocrinology. 2005. Vol. 19. № 4. P. 833-842

36.Bond J.M., Chacon E., Herman B., Lemasters J.J. Intracellular pH and Ca homeostasis in the pH paradox of reperfusion injury to neonatal rat cardiac myocytes // Am. J. Physiol. 1993. Vol. 265. № 1. P. 129-137.

37.Bond J.M., Herman B., Lemasters J.J. Protection by acidotic pH against anoxia/reoxygenation injury to rat neonatal cardiac myocytes // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. Vol. 179. № 2. P. 798-803.

38.Boutilier R.G. Mechanisms of metabolic defense against hypoxia in hibernating frogs // Resp. Physiol. 2001. Vol. 128. P. 365-377.

39.Boutilier R.G., Donohoe P.H., Tattersall G.J., West T.G. Hypometabolic homeostasis in overwintering aquatic amphibians // J. Exp. Biol. 1997. Vol. 200. P. 387-400.

40.Boutilier R.G., St-Pierre J. Adaptive plasticity of skeletal muscle energetics in hibernating frogs: mitochondrial protone leak during metabolic depression // J. Exp. Biol. 2002. Vol. 205. P. 2287-2296.

41.Brand M.D. The efficiency and plasticity of mitochondrial energy transduction//Biochem. Soc. Trans. 2005.Vol. 33. P. 897-904.

42.Brand M.D., Chien L.F., Ainscow E.K., Rolfe D.F., Porter R.K. The causes and functions of mitochondrial proton leak // Biochim. Biophys. Acta. 1994. Vol. 1187. P. 132-139.

43.Bratton S.B., Walker G., Roberts D.L., Cain K., Cohen G.M. Caspase-3 cleaves Apaf-1 into an approximately 30 kDa fragment that associates with an inappropriately oligomerized and biologically inactive approximately 1.4 MDa apoptosome complex // Cell Death Differ. 2001 Vol. 8. № 4. P. 425433.

44.Brooks S.P., Storey K.B. Glycolytic controls in estivation and anoxia: a comparison of metabolic arrest in land and marine mollusks // Сотр. Biochem. Physiol. 1997. Vol. 118A. P. 1103-1114.

45.Brooks S.P.J., Storey К. B. Metabolic depression in land snails: in vitro analysis of protein kinase involvement in pyruvate kinase control in isolated Otala lactea tissues // J. Exp. Zool. 1994. Vol. 269. P. 507-514.

46.Brooks S.P.J., Storey K.B. cGMP-stimulated protein kinase phosphorylates pyruvate kinase in an anoxia-tolerant marine mollusk // J. Сотр. Physiol. 1990. Vol. 160. P. 309-316.

47.Brooks S.P.J., Storey K.B. Protein phosphorylation patterns during aestivation in the land snail Otala lactea // Mol. Cell. Biochem. 1995. Vol. 143. P. 7-13.

48.Brown A.M. ATP and ATPase determinayion in red blood cells. In Red Cells Membranes. A Methodological Approach. -N.Y.: Acad. Press, 1982. -P. 223-238.

49.Brustovetsky N.N., Mayevsky E.I., Grishina E.V., Gogvadze V.G., Amerkhanov Z.G. Regulation of the rate of respiration and oxidative phosphorylation in liver mitochondria from hibernating ground squirrels, Citellus undulates // Comp. Biochem. Physiol. 1989. Vol. 94. P. 537-541.

50.Buck L.T. Adenosine as a signal for ion channel arrest in anoxiatolerant organisms // Comp. Biochem. Physiol. 2004. Vol. 139B. P. 401-414.

51.Buck L.T., Hochachka P.W. Anoxic suppression of Na+ K+-ATPase and constant membrane potential in hepatocytes: support for channel arrest // Am. J. Physiol. 1993. Vol. 265. P. 1010-1025.

52.Buck L.T., Pamenter M.E. Adaptive responses of vertebrate neurons to anoxia - matching supply to demand // Respir. Physiol. Neurobiol. 2006. Vol. 154. P. 226-240.

53.Busk M., Boutilier R.G. Metabolic arrest and its regulation in anoxic eel hepatocytes // Physiol. Biochem. Zool. 2005.Vol. 78. № 6. P. 926-936.

54.Castellini M.A., Kooyaman G.L., Ponganis P.J. Metabolic rates of freely diving Weddel seals: correlations with oxygen stores, swim velocity and diving duration // J. Exp. Biol. 1992. Vol. 165. P. 181-194.

55.Catterall W.A. The molecular basis of neuronal excitability // Science. 1984. Vol. 223. № 4637. P. 653-661.

56.Chen Q., Camara A.K., Stowe D.F., Hoppel C.L., Lesnefsky E.J. Modulation of electron transport protects cardiac mitochondria and decreases myocardial injury during ischemia and reperfusion // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2007. Vol. 292. № l. p. 137-147

57.Chen W.C., Cheng J.S., Chou K.J., Tang K.Y, Huang J.K., Tseng L.L., Wang J.L., Lee K.C., Jan C.R. Effect of 17|3-estradiol on intracellular Ca2+ levels in renal tubular cells // Pharmacology. 2002. Vol. 64. P. 84-90.

58.Chih C.P., Feng Z.C., Rosenthal M., Lutz P.L., Sick T.J. Energy metabolism, ion homeostasis, and evoked potentials in anoxic turtle brain // Am. J. Physiol. 1989. Vol. 257. P. 854-860.

59.Chih C.P., Rosental M., Sick T.J. Ion leakage is reduced during anoxia in turtle brain: a potential survival strategy // Am. J. Physiol. 1989. Vol. 257. P. 1562-1564.

60.Choe S., Hedley D. Current Protocols in Cytometry. N.Y.: John Wiley & Sons, Inc., 1997. P. 9.3.1-9.3.10

61.Churchill T.A., Storey K.B. Intermediary energy metabolism during dormancy and anoxia in the land snail Otala lacteal // Physiol. Zool. 1989. Vol. 62. P. 1015-1030.

62.Ciechanover A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway // Cell. 1994. Vol. 79. №1. P. 13-21.

63.Clausen T., Van Hardeveld C., Everts M.E. Significance of cation transport in control of energy metabolism and thermogenesis // Physiol. Rev. 1991. Vol. 71. P. 733-774.

64.Clegg J.S. Respiration of Artemia franciscana embryos after continuos anoxia over 1-yaer period // J. Comp. Physiol. 1993. Vol. 163B. P. 48-51.

65.Collins R.O., Thomas R.C. The effect of calcium pump inhibitors on the response of intracellular calcium to caffeinein snail neurons // Cell Calcium. 2001. Vol. 30. P. 41-48.

66.Covi J.A., Hand S.C. Energizing an invertebrate embryo: bafilomycin-dependent respiration and the metabolic cost of proton pumping by the V-ATPase // Physiol. Biochem. Zool. 2007. Vol. 80. № 4. P. 422-432.

67.Covi J.A., Hand S.C. V-ATPase expression during development of Artemia franciscana embryos: potential role for proton gradients in anoxia signaling // J. Exp. Biol. 2005. Vol. 208. P. 2783-2798.

68.Covi J.A., Treleaven W.D., Hand S.C. V-ATPase inhibition prevents recovery from anoxia in Artemia franciscana embryos: quiescence signaling

through dissipation of proton gradients // J. Exp. Biol. 2005. Vol. 208. P. 2799-2808.

69.Cowan K. J., Storey K. B. Mitogen-aetivated protein kinases: new signaling pathways functioning in cellular responses to environmental stress //J. Exp. Biol. 2003. Vol. 206. P. 1107-1115.

70.Cowan K. J., Storey K. B. Reversible phosphorylation control of skeletal muscle pyruvate kinase and phosphofructokinase during estivation in the spadefoot toad, Scaphiopus couchii II Molecular and Cellular Biochemistry. 1999. Vol. 195. P. 173-181.

71.Currin R.T., Gores G.J., Thurman R.G., Lemasters J.J. Protection by acidotic pH against anoxic cell killing in perfused rat liver: evidence for a pH paradox//FASEB J. 1991. Vol. 5. P. 207-210.

72.Darzynkiewicz Z., Huang X., Okafuji M. and King M.A., Cytometric methods to detect apoptosis // Methods in cell biology. 2004. Vol. 75. P. 307-341.

73.De Foresta B, Champeil P, le Maire M. Different classes of tryptophan residues involved in the conformational changes characteristic of the sarcoplasmic reticulum Ca -ATPase cycle // Eur. J. Biochem. 1990. Vol. 194.

74.de Zwaan A., Wijsman T.C.M. Anaerobic metabolism in bivalvia (mollusca). Characteristics of anaerobic metabolism // Comp. Biochem. Physiol. 1976. Vol. 43A. P. 53-58.

75.Debatin K.M., Krammer P.H. Death receptors in chemotherapy and cancer // Oncogene. 2004. Vol. 23. № 16. P. 2950-2966.

76.Denlinger D. L. Regulation of diapauses // Annu. Rev. Entomol. 2002. Vol. 47. P. 93-122.

77.Dieni C.A., Storey K.B. Creatine kinase regulation by reversible phosphorylation in frog muscle // Comp. Biochem. Physiol. & Biochem. Mol. Biol. 2009. Vol. 152. № 4. P. 405-412.

78.Doll C.J., Hochachka P.W., Reiner P.B. Channel arrest: implications from membrane resistance in turtle neurons // Am. J. Physiol. 1991. Vol. 261. P. 1321-1324.

79.Donohoe P.H., West T.G., Boutiler R.G. Respiratory, metabolic and acid-base correlates of aerobic metabolic rate reduction in overwintering frogs // Amer. J. Physiol. 1998. Vol. 274. P. 704-710.

80.Du H., Yang W., Chen L., Shi M., Seewoo V., Wang J., Lin A., Liu Z., Qiu W. Role of autophagy in resistance to oxaliplatin in hepatocellular carcinoma cells // Oncol. Rep. 2011. Vol. 27. №1. P. 143-150.

81.Earnshaw W.C., Martins L.M., Kaufmann S.H. Mammalian caspases: structure, activation, substrates, and functions during apoptosis // Annu. Rev. Biochem. 1999. Vol. 68. P. 383^124.

82.Eddy S.F., Storey K.B. Differential expression of Akt, PPAR, and PGC-1 during hibernation in bats // Biochem. Cell Biol. 2003. Vol. 81, P. 269-274.

83.Edwards R.A., Lutz P.L., Baden D.G. Relationship between energy expenditure and ion channel density in the turtle and rat brain // Am. J. Physiol. 1989. Vol. 257. P. 1354-1358.

84.Ehrenberg B.V., Montana V., Wei M.-D., Wuskell J.P., Loew L.M. Membrane potential can be determined in individual cells from the Nernstian distribution of cationic dyes // Biophys. J. 1988. Vol. 53. P. 785794.

85.Elmore S.P., Qian T., Sherry F. Grissom and John J. Lemasters. The mitochondrial permeability transition initiates autophagy in rat hepatocytes // FASEB J. 2001. Vol. 15. № 12. P. 2286-2287.

86.Emaus R.K., Grunwald R., Lemasters J.J. Rhodamine 123 as a probe of transmembranepotential in isolated rat-liver mitochondria: Spectral and metabolic properties // Biochim. Biophys. Acta. 1986. Vol. 850. P. 436^448.

87.Ewart H.S., Klip A. Hormonal regulation of the Na+K+-ATPase: mechanisms underlying rapid and sustained changes in pump activity // Am. J. Physiol. 1995. Vol. 38. P. 295-311.

88.Fedotcheva N.J., Sharyshev A.A., Mironova G.D., Kondrashova M.N. Inhibition of succinate oxidation and K+ transport in mitochondria during hibernation // Comp. Biochem. Physiol. 1985. Vol. 82. P. 191-195.

89.Flanigan J.E., Wither P.C., Fuery C.J., Guppy M. Metabolic depression and Na+/K+ gradients in the aestivating Australian goldfields frog, Neobatrachus wilsmorei //J. Comp. Physiol. 1993. Vol. 163. P. 587-593.

90.Gamper N.L., Savina M.V. Reversible metabolic depression in hepatocytes of lamprey (Lampetra fluviatilis) during pre-spawning: regulation by substrate availability // Comp. Biochem. Physiol. 2000. Vol. 127B. P. 147154.

91.Gamper N.L., Savina M.V., Brailovskaya I.V., Vereninov, A.A. Respiration rates, ATP content and ionic regulation in hepatocytes of starving lamprey during pre-spawning period of their life cycle // J. Fish. Biol. 2001. Vol. 58. P. 230-239.

92.Gellerich F.N., Trumbeckaite S., Muller T., Deschauer M., Chen Y., Gizatullina Z., Zierz S. Energetic depression caused by mitochondrial dysfunction // Mol. Cell Biochem. 2004. Vol. 256. P. 391-405.

93.Goldberg A.L. Functions of the proteasome: the lysis at the end of the tunnel // Science. 1995. Vol. 268 № 5210. P. 522-523.

94.Goodwin W., McCabe D., Sauter E., Reese E., Walter M., Buckwalter J.A., Martin J.A. Rotenone prevents impact-induced chondrocyte death // J. Orthop. Res. 2010. Vol. 28. № 8. P. 1057-1063.

95.Goumard G., Cuny M., Sripati C.E., Hayes D.H. Monovalent cation-dependent reversible phosphorylation of a 40 S ribosomal subunit protein in growth-arrested Tetrahymena: correlation with changes in intracellular pH // FEBS Lett. 1990. Vol. 262. № 2. P. 335-338.

96.Gozuacik D., Kimchi A. Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism // Oncogene. 2004. Vol. 23. № 16. P. 2891-2906.

97.Green D.R. Apoptosis. Death deceiver //Nature. 1998. Vol. 396 № 6712. P. 629-630.

98.Greenway S.C., Storey K.B. Mitogen-aetivated protein kinases and anoxia tolerance in turtles // J. Exp. Zool. 2000. Vol. 287. P. 477-484.

99.Grivennikova V.G., Vinogradov A.D. Mitochondrial Complex I // Usp. Biol. Khim. 2003. Vol. 13. P. 19-58.

100. Grynkiewicz G., Poenie M., Tsien R.Y. A new generation of Ca indicators with greatly improved fluorescence properties // J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260. P. 3440-3450.

101. Guppy M. The biochemistry of metabolic depression: history of perceptions // Comp. Biochem. Physiol. 2004. Vol. 139. P. 435-442.

102. Guppy M., Fuery C.J., Flanigan J.E. Biochemical principles of metabolic depression // Comp. Biochem. Physiol. 1994. Vol. 109B. P. 175189.

103. Guppy M., Reeves D.C., Bishop T., Withers P., Buckingham J.A., Brand M.D. Intrinsic metabolic depression in cells isolated from the hepatopancreas of estivating snails // FASEB J. 2000. Vol. 14. № 7. P. 9991004.

104. Guppy M., Withers P. Metabolic depression in animals: physiological perspectives and biochemical generalizations // Biol. Rev. 1999. Vol. 74. P. 1-40.

105. Hait W.N., Jin S., Yang J.M. A matter of life or death (or both): understanding autophagy in cancer // Clin Cancer Res. 2006. Vol. 12. № 7. P. 1961-1965.

106. Hall J.M., Couse J.F., Korach K.S. The multifaceted mechanisms of estradiol and estrogen receptor signaling // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. P. 36869-36872.

107. Hammes S.R., Levin E.R. Extranuclear steroid receptors: nature and actions // Endocr. Rev. 2007. Vol. 28. P. 726-741.

108. Hand S.C. Heat dissipation during long-term anoxia in Artemia franciscana embryos: identification and fate of metabolic fuels // J. Comp. Physiol. 1990. Vol. 160. № 4. P. 357-363.

109. Hand S.C. Metabolic dormancy in aquatic invertebrates // Adv. Comp. Environ. Physiol. 1991. Vol. 8. P. 1-50.

110. Hand S.C., Gnaiger E. Quantification of anaerobic dormancy in Artemia embryos: a calometric test of the control mechanism // Science. 1988. Vol. 239. P. 1425-1427.

111. Hand S.C., Hardewig I. Downregulation of cellular metabolism during environmental stress: mechanisms and implications // Annu. Rev. Physiol. 1996. Vol. 58. P. 539-563.

112. Hand S.C., Hardewig I. Downregulation of cellular metabolism during environmental stress: mechanisms and implications // Ann. Rev. Physiol. 1996. Vol. 58. P. 539-563.

113. Hand S.C., Menze M.A. Mitochondria in energy-limited states: Mechanisms that blunt the signaling of cell death // J. Exp. Biol. 2008. Vol. 211. P. 1829-1840.

114. Hand S.C., Menze M.A., Borcar A., Patil Y., Covi J.A., Reynolds J.A., Toner M. Metabolic restructuring during energy-limited states: insights from Artemia franciscana embryos and other animals // J. Insect. Physiol. 201 la. Vol. 57. № 5. P. 584-594.

115. Hand S.C., Menze M.A., Toner M., Boswell L., Moore D. LEA Proteins during water stress: not just for plants anymore // Annu. Rev. Physiol. 20116. Vol. 43. P. 115-134.

116. Hand S.C., Podrabsky J.E., Eads B.D., Van Breukelen F. Interrupted development in aquatic organism: ecological context and physiological mechanism. In: D. Atkinson, M. Thorndyke (Eds.) Environment and Animal Development. Genes, Life Histories and Plasticity. - Oxford: BIOS Scientific Publishers, 2001. P. 219-234.

117. Hardewig I., Addink A.D.F., Griechaber M.K., Portner H. Metabolic rates at different oxygen levels determined by direct and indirect calorimetry in the oxyconformers Sipunculus nudus HO // J. Exp. Biol. 1991. Vol. 157. P. 143-160.

118. Hardewig I., Anchordoguy T. J., Crawford D. L. and Hand S. C. Profiles of nuclear and mitochondrial encoded mRNAs in developing and quiescent embryos of Artemia franciscana // Mol. Cell. Biochem. 1996. Vol. 158. P. 139-147.

119. Hardewig I., Kreutzer U., Portner H.O., Greischaber M.K. The role of phosphofructikinase in glycolyiic control in the facultative anaerobe Sipunculus nudus // J. Comp. Physiol. 1991. Vol. 161B. P. 581-589.

120. Hardisty M.W., Potter I.S. The Biology of lampreys. - N.Y.: Acad. Press., 1971, V. 1.423 p.

121. Haunstetter A., Izumo S. Apoptosis: basic mechanisms and implications for cardiovascular disease // Circ. Res. 1998. Vol. 82. № 11. P. 1111-1129.

122. Hemmings S.J., Storey K.B. Characterization of sarcolemma and sarcoplasmic reticulum isolated from skeletal muscle of the freeze tolerant wood frog, Rana sylvatica: the (32-adrenergic receptor and calcium transports systems in control, frozen and thawed states // Cell. Biochem. Funct. 2001. Vol. 19. P. 143-152.

123. Hengartner M.O. The biochemistry of apoptosis // Science. 2000. Vol. 407. P. 770-776.

124. Henrich M., Buckler K.J. Effects of anoxia and aglycemia on cytosolic calcium regulation in rat sensory neurons // J. Neurophysiol. 2008. Vol. 100. P. 456-473.

125. Hershey J.W. Translational control in mammalian cells // Annu. Rev. Biochem. 1991. Vol. 60. P. 717-755.

126. Hittel D., Storey K.B. The translation state of differentially expressed mRNAs in the hibernating 13-lined ground squirrel (Spermophilus tridecemlineatus) // Arch. Biochem. Biophys. 2002. Vol. 401, P. 244-254.

127. Hochachka P.W. Defense strategies against hypoxia and hypothermia // Science. 1986. Vol. 231. P. 234-241.

128. Hochachka P.W. Intracellular convection, homeostasis and metabolic regulation // J. Exp. Biol. 2003. Vol. 206. P. 2001-2009.

129. Hochachka P.W. Metabolic-, channel-, and pump-coupled functions: constraints and compromises of coadaptation // Canadian Journal of Zoology. 1988. Vol. 66. № 5. P. 1015-1027

130. Hochachka P.W., Bulk L.T., Doll C.J. and Land S.C. Unifying theory of hypoxia tolerance: molecular/metabolic defence and rescue mechanisms for surviving oxygen lack // Proc. Natl. Acad. Sci. 1996. Vol. 93. P. 94939498.

131. Hochachka P.W., Lutz P.L. Mechanism, origin, and evolution of anoxia tolerance in animals // Comp. Biochem. Physiol. 2001 Vol. 130B. P. 435-459.

132. Hochachka P.W., Nener J.C., Hoar J., Saurez R.K., Hand S.C. Disconnecting metabolism from adenylate control during extreme oxygen limitation // Canadian Journal of Zoology. 1993. Vol. 71. P. 1267-1270.

133. Hulbert A.J., Else P.L. Mechanisms underlying the cost of living in animals // Annu. Rev. Physiol. 2000. Vol. 62. P. 207-235.

134. Hulbert A.J., Else P.L. Membranes and the setting of energy demand // The Journal of Experimental Biology. 2005. Vol. 208. P. 1593-1599.

135. Hylland P., Milton S., Pek M., Nilsson G. E. and Lutz P. L. Brain Na+/K+-ATPase activity in two anoxia tolerant vertebrates: crucian carp and freshwater turtle // Neurosci. Lett. 1997. Vol. 235. P. 89-92.

136. Ichas F., Jouaville L.S., Mazat J.P. Mitochondria are excitable organelles capable of generating and conveying electrical and calcium signals // Cell. 1997. Vol. 89. P. 1145-1153.

137. Improta-Brears T., Whorton A.R., Codazzi F., York J.D., Meyer T., McDonnell D.P. Estrogen-induced activation of mitogen-activated protein kinase requires mobilization of intracellular calcium // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. Vol. 96. P. 4686—4691.

138. Inesi G. Mechanism of calcium transport // Annu. Rev. Physiol. 1985. Vol. 47. P. 573-601.

139. Jaattela M. Multiple cell death pathways as regulators of tumour initiation and progression // Oncogene. 2004. Vol. 23. № 16. P. 2746-2756.

140. Jackson D.C. Hibernating without oxygen: physiological adaptations of the painted turtle // J. Physiol. 2002. Vol. 543. P. 731-737.

141. Jin Z., El-Deiry W.S. Overview of cell death signaling pathways // Cancer. Biol. Ther. 2005. Vol. 4. P. 139-163.

142. Johnstone R.W., Ruefli A.A., Lowe S.W. Apoptosis: a link between cancer genetics and chemotherapy // Cell. 2002.Vol. 108. № 2. P. 153-64.

143. Kaminskyy V., Zhivotovsky B. Proteases in autophagy // Biochim Biophys Acta. 2012. Vol. 1824. №1. P. 44-50

144. Kang L., Zhang X, Xie Y., Tu Y., Wang D., Liu Z., Wang Z.-Yi Involvement of estrogen receptor variant ER-a36, not GPR30, in nongenomic estrogen signaling // Mol. Endocrinol. 2010. Vol. 24. № 4. P. 709-721.

145. Kayes S.M., Cramp R.L., Hudson N.J., Franklin C.E. Surviving the drought: burrowing frogs save energy by increasing mitochondrial coupling // J. Exp. Biol. 2009. Vol. 212. P. 2248-53.

146. Kelly D.A., Storey K.B. Organ-specific control of glycolysis in anoxic turtles // Am. J. Physiol. 1988. Vol. 255. P. 774-779.

147. Kerr J.F., Wyllie A.H., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics // Br. J. Cancer. 1972. Vol. 26. № 4. P. 239-257.

148. Kondo Y., Kanzawa T., Sawaya R., Kondo S. The role of autophagy in cancer development and response to therapy // Nat. Rev. Cancer. 2005 Vol. 5. №9. P. 726-734.

149. Kravtsova-Ivantsiv Y., Ciechanover A. Ubiquitination and degradation of proteins // Methods Mol. Biol. 2011. Vol. 753. P. 335-357.

150. Krumschnabel G., Biasi C., Schwarzbaum P.J., Weiser W. Acute and chronic effects of tempreture and of nutritional state, on ion homeostasis and energy metabolism in teleost hepatocytes // J. Comp. Physiol. 1997a. Vol. 167B. P. 280-286.

151. Krumschnabel G., Schwarzbaum P.J., Biasi C., Dorigatti M., Wieser W. Effect of energy limitation on Ca and K homeostasis m anoxia-tolerant and anoxia-intolerant hepatocytes // Am. J. Physiol. 19976. Vol. 273. P. 307-316.

152. Kwast K.E., Hand S.C. Oxygen and pH regulation of protein synthesis in mitochondria from Artemia franciscana embryos // Biochem. J. 1996. Vol. 313. P. 207-213.

153. Kwast K.E., Hand S.C. Regulatory features of protein synthesis in isolated mitochondria from Artemia embryos // Am. J. Physiol. 1993. Vol. 265. P. 1238-1246.

154. La Noue K.F., Schoolwerth A.C. Metabolite transport in mitochondria // Ann. Rev. Biochem. 1979. Vol. 48. P. 871-922.

155. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227. № 5259. P. 680-685.

156. Landgraf G., Gellerich F.N., Wussling M.H.P. Inhibitors of SERCA and mitochondrial Cauniporter decrease velocity of calcium waves in rat cardiomyocytes // Mol. Cell. Biochem. 2004. Vol. 256/257. P. 379-386.

157. Larade K., Storey K.B. A profile of the metabolic responses to anoxia in marine invertebrates. In: K.B. Storey, J.M. Storey (Eds) Sensing, Signaling and Cell Adaptation. - Amsterdam: Elsevier Science, 2002. - P. 27-46.

158. Larade K., Storey, K. A profile of the metabolic responses to anoxia in marine invertebrates // Cell Mol. Resp. Stress. 2002. Vol. 3, P. 27^16.

159. Larsen L.O. Physiology of adult lampreys, with special regard to natural starvation, reproduction and death after spawning // Can. J. Fish Aquat. Sci. 1980. Vol. 37. P. 1762-1779.

160. Larsen L.O. Subtotal hepatectomy in intact and hypophysectomized river lampreys {Lampetra fl. L.): effects on regeneration, blood glucose regulation and vitellogenesis // Gen. Comp. Endocrinol. 1978. Vol. 35. P. 197-204.

161. Lehninger A.L. Principles of Biochemistry, Fourth Edition. - D.L. Nelson, M.M. Cox, 2003. - 1118 p.

162. Levine B. Autophagy in development, tumor suppression, and innate immunity // Harvey Lect. 2003-2004. Vol. 99. P. 47-76.

163. Lin Fu-H., Chang J.B., Brigman B.E. Role of mitogen-activated protein kinase in osteoblast differentiation. 2010. Vol. 29. № 2. P. 204-210.

164. Lisa Di.F., Menabo R, Canton M., Petronilli V. The role of mitochondria in the salvage and the injury of the ischemic myocardium // Biochim. Biophys. Acta. 1998. Vol. 1366. P. 69-78.

165. Liu C., Wu W., Liu Y., Guo F., Shumilak K., Fang Q. The Cysteine Protease Network in Tumor Progression and Therapy. 2006 http://www.scripps.edu/news/scientificreports/sr2006/imm061iu.html

166. Lockshin R.A., Zakeri Z. Apoptosis, autophagy, and more // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004. Vol. 36. № 12. P. 2405-2419.

167. Lowe J., Stock D., Jap B., Zwickl P., Baumeister W., Huber R. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution // Science. 1995. Vol. 268. № 5210. P. 533-539.

168. Lutz P.L. Nilsson G.E. Vertebrate brains at the pilot light // Respir. Physiol. Neurobiol. 2004. Vol. 141. P. 285-296.

169. Lutz P.L., Milton S.L. Negotiating brain anoxia survival in the turtle // J. Exp. Biol. 2004. Vol. 207. P. 3141 -3147.

170. MacDonald J.A. Signal transduction pathways and the control of cellular responses to external stimuli. In: K. B. Storey (Ed.) Functional Metabolism: Regulation and Adaptation. Hoboken, NJ: Wiley-Liss. - 2004. -P. 87-123

171. MacDonald J.A., Storey K.B. Regulation of ground squirrel Na+ K+-ATPase by reversible phosphorylation during hibernation // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. Vol. 254. P. 424-429.

172. MaeLennan D.H., Rice W.J., Green N.M. The mechanism of Ca2+ transport by sarco(endo)plasmic reticulum Ca-ATPases // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272 № 46. P. 28815-28818.

173. Malysheva A.N., Storey K.B., Lopina O.D., Rubtsov A.M. Ca-ATPase activity and protein composition of sarcoplasmic reticulum membranes isolated from skeletal muscles of typical hibernator, the ground squirrel Spermophilus undulatus // Biosci Rep. 2001. Vol. 21. № 6. P. 831838.

174. Manning G., Whyte D.B., Martinez R., Hunter T., Sudarsanam S. The protein kinase complement of the human genome // Science. 2002. Vol. 298. №5600. P. 1912-1934.

175. Martin S.L., Maniero G.D., Carey S., Hand S.C. Reversible depression of oxygen consumption in isolated liver mitochondria during hibernation // Physiol. Biochem. Zool. 1999. Vol. 72. P. 255-264.

176. McDonnell D.P., Norris J.D. Connections and regulation of the human estrogen receptor // Science Vol. 2002. Vol. 296. P. 1642-1644.

177. McMullen D.C., Storey K.B. Suppression of Na+,K+-ATPase activity by reversible phosphorylation over the winter in a freeze-tolerant insect // J. Insect Physiol. 2008. Vol. 54. P. 1023-1027.

178. Mead R.A. Embryonic diapause in vertebrates // J. Exp. Zool. 1993. Vol. 266. P. 629-624.

179. Mewes K.R., Latz M., Golla H., Fischer A. Vitellogenin from female and estradiol-stimulated male river lampreys (Lampetra fluviatilis L.) // J. Exp. Zool. 2002. Vol. 292. P. 52-72.

180. Michaelidis B., Storey K. B. Phosphofructokinase from the anterior byssus retractor muscle of Mytilus edulis: modification of the enzyme in

anoxia and by endogenous protein kinases // Int. J. Biochem. 1990. Vol. 22. P. 759-765.

181. Mironova E.V. Evstratova A.A. Antonov S.M. A fluorescence vital assay for the recognition and quantification of excitotoxic cell death by necrosis and apoptosis using confocal microscopy on neurons in culture // J. Neurosci. Methods. 2007. Vol. 163. P. 1-8.

182. Mitchell P., Moyle J. Estimation of membrane potential and pH difference across the cristae membrane of rat liver mitochondria // Eur J Biochem. 1969. Vol. 7. № 4. P. 471-484.

183. Mitchell, P. 1961. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism // Nature. Vol. 191. P. 144-148.

184. Mommsen T.P., Moon T.W., Walsh P.J. 1994. Hepatocytes: isolation, maintenance and utilization. In: Hochachka P.W., Mommsen T.P. (Eds.), Biochemistry and molecular biology of fishes. Amsterdam: Elsevier Science. P. 355-373.

185. Mommsen T.P., Walsh P.J. Vitellogenesis and oocyte assembly. In Fish Physiology. - London: Acad. Press., 1988. Vol. 11. P. 347-406.

186. Nicholls D.G. Mitochondrial membrane potential and aging // Aging cell. 2004. Vol. 3. P. 35-40.

187. Nicolai A., Filser J., Lenz R., Bertrand C., Charrier M. Adjustment of metabolite composition in the haemolymph to seasonal variations in the land snail Helix pomatia // J. Comp. Physiol. 2011. Vol. 181. № 4. P. 457-466.

188. Nicotera P., Melino G. Regulation of the apoptosis-necrosis switch // Oncogene. 2004. Vol. 23. № 16. P. 2757-2765.

189. Nilsson S., Makela S., Treuter E., Tujague M., Thomsen J., Andersson G., Enmark E., Pettersson K., Warner M., Gustafsson J.A. Mechanisms of estrogen action. // Physiol Rev. 2001. Vol. 81. P. 1535-1565.

190. Okada H, Mak TW. Pathways of apoptotic and non-apoptotic death in tumour cells //Nat Rev Cancer. 2004. Vol. 4. № 8. P. 592-603.

191. Oligomycin, inhibitor of the FO part of H+-ATP-synthase, suppresses the TNF-induced apoptosis.

192. Pehowich D.J., Wang L.C.H. Seasonal changes in mitochondrial succinat dehydrogenase activity in a hibernator Spermophilus richardsonii // J. Comp. Physiol. 1984. Vol. 154B. P. 495-501.

193. Pei J.M., Kravtsov G.M., Wu S., Das R., Fung M. L., Wong T. M. Calcium homeostasis in rat cardiomyocytes during chronic hypoxia: a time course study // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2003. Vol. 285. P. 1420-1428.

194. Perez-Pinzon M.A., Rosenthal M., Sick T.J., Lutz P.L., Pablo J., Mash D. Downregulation of sodium channels during anoxia: a putative survival strategy of turtle brain // Am. J. Physiol. 1992. Vol. 262. P. 712-715.

195. Pfister T.D., Storey K.B. Responses of protein phosphatases and cAMP-dependent protein kinase in a freeze-avoiding insect, Epiblema scudderiana // Arch. Insect. Biochem. Physiol. 2006. Vol. 62. № 1. P. 43-54.

196. Portner H.O. Contributions of anaerobic metabolism to pH regulation in animal tissues: theory // J. exp. Biol. 1987. Vol. 131. P. 69-81.

197. Portner H.O., Bock C., Reipschlager A. Modulation of the cost of pHj regulation during metabolic depression: a (31) P-NMR study in invertebrate (Sipunculus nudus) isolated muscle // J. Exp. Biol. 2000. Vol. 203. P. 24172428.

198. Portner H.O., Bock Ch. In: Life in the cold G. Heldmaier, M. Klingespor (Eds), Berlin: Springer verlag, 2000. - P. 443-458

199. Portner H.O., Reipschlager A., Heisler N. Acid-base regulation, metabolism and energetics in Sipunculus nudus as a function of ambient carbon dioxide // J. Exp. Biol. 1998. Vol. 201. P. 43-55.

200. Prats C., Donsmark M., Qvortrup K., Londos C., Sztalryd C., Holm C., Galbo H., Ploug T. Decrease in intramuscular lipid droplets and translocation of HSL in response to muscle contraction and epinephrine // J. Lipid Res. 2006. Vol. 47. №11. P. 2392-2399.

201. Pringle J.R., Preston R.A., Adams A.E., Stearns T., Drubin D.G., Haarer B.K., Jones E.W. Fluorescence microscopy methods for yeast // Methods Cell Biol. 1989. Vol. 31. P. 357-435.

202. Raff M. Cell suicide for beginners // Nature. 1998. Vol. 396. № 6707. P. 119-122

203. Ramnanan C.J., Storey K.B. Glucose-6-phosphate dehydrogenase regulation during hypometabolism // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006a. Vol. 339. P. 7-16.

204. Ramnanan C.J., Storey K.B. Suppression of NaKT-ATPase activity during estivation in the land snail Otala lacteal // J. Exp. Biol. 20066. Vol. 209. P. 677-688.

205. Ramnanan C.J., Storey K.B. The regulation of thapsigargin-sensitive sarcoendoplasmic reticulum Ca -ATPase activity in estivation // J. Comp. Physiol. 2008. Vol. 178B. P. 33-45.

206. Ramnananl C.J., McMullen D.C, Bielecki A., Storey K.B. Regulation of sarcoendoplasmic reticulum Ca -ATPase (SERCA) in turtle muscle and liver during acute exposure to anoxia // J. Exp. Biol. 2010. Vol. 213. P. 1725.

207. Rapoport S., Dubiel W., Muller M. Proteolysis of mitochondria in reticulocytes during maturation is ubiquitin-dependent and is accompanied by a high rate of ATP hydrolysis // FEBS Lett. 1985. Vol. 180. № 2. P. 249252.

208. Razandi M., Pedram A., Greene G.L., Levin E.R. Cell membrane and nuclear estrogen receptors (ERs) originate from a single transcript: studies of ER and ER expressed in Chinese hamster ovary cells // Mol. Endocrinol. 1999. Vol. 13. P. 307-319.

209. Reddy D.C., Davies R.W. Metabolic adaptations by the leech Nephelopsis obscura during long-term anoxia and recovery // J. Exp. Zool. 1993. Vol. 265. P. 224-230.

210. Reddy D.C., Ronald D., Davies R.W. Metabolic adaptations by the leech Nephelopsis obscura during long-term anoxia and recovery // Journal of Experimental Zoology. 1993. Vol. 265. P. 224-230.

211. Repnik U., Stoka V., Turk V., Turk B. Lysosomes and lysosomal cathepsins in cell death // Biochim. Biophys. Acta. 2012. Vol. 1824. P. 2233.

212. Reuter H. Calcium channel modulation by beta-adrenergic neurotransmitters in the heart // Experientia. 1987. Vol. 43. № 11. P. 11731175.

213. Reynolds J.A., Hand S.C. Differences in isolated mitochondria are insufficient to account for respiratory depression during diapause in artemia franciscana embryos // Physiol. Biochem. Zool. 2004. Vol. 77. P. 366 -377.

214. Rider M.H., Hussain N., Dilworth S.M., Storey K.B. Phosphorylation of translation factors in response to anoxia in turtles, Trachemys scripta elegans: role of the AMP-activated protein kinase and target of rapamycin signalling pathways // Mol. Cell. Biochem. 2009. Vol. 332. P. 207-213.

215. Rolfe D.F., Brown G.C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals // Physiol. Rev. 1997. Vol. 77. № 3. P. 731-758.

216. Rolfe D.F.S., Brand M.D. Contribution of mitochondrial proton leak to skeletal muscle respiration and to standard metabolic rate // Am. J. Cell Physiol. 1996a. Vol. 271. P. 1380-1389.

217. Rolfe D.F.S., Brand M.D. Proton leak and control of oxidative phosphorylation in perfused, resting rat skeletal muscle // Biochim. Biophys. Acta. 19966. Vol. 1276. P. 45-50.

218. Rottenberg H., Wu S. Quantitative assay by flow cytometry of the mitochondrial membrane potential in intact cells // Biochim. Biophys. Acta. 1998. Vol. 1404. P. 393-404.

219. Rubtsov A.M. Hibernation: protein adaptations. In: K.B. Storey, J.M. Storey, (Eds.) Cell and Molecular Responces to Stress, Vol. 2. -Amsterdam: Elsevier Science, 2001. - P. 57-71

220. Savina M.V., Derkachev E.F. Switch on and switch off phenomenon of liver gluconeogenic function in lamprey (Lampetra fluviatilis L.) under the influence of season and temperature // Comp. Biochem. Physiol. 1983. Vol. 75B.P. 531-539.

221. Savina M.V., Emelyanova L.V., Belyaeva E.A. Bioenergetic parameters of lamprey and frog liver mitochondria during metabolic depression and activity // Comp. Biochem. Physiol. 2006. Vol. 145. P. 296305.

222. Savina M.V., Gamper N.L. Respiration and adenine nucleotides of Baltic lamprey {Lampetra fluviatilis L.) hepatocytes during spawning migration // Comp. Biochem. Physiol. 1998. Vol. 120. P. 375-383.

223. Savina M.V., Wojtczak A.B. Enzymes of gluconeogenesis and the synthesis of glycogen from glycerol in various organs of the lamprey (Lampetra fluviatilis L.) // Comp. Biochem. Physiol. 1977. Vol. 57B. P. 185-190.

224. Schweichel J.U., Merker H.J. The morphology of various types of cell death in prenatal tissues // Teratology. 1973. Vol. 7. № 3. P. 253-266.

225. Schwerdt G., Freudinger R, Schuster C., Silbernagl S., Gekle M. Inhibition of mitochondria prevents cell death in kidney epithelial cells by intra- and extracellular acidification // Kidney Int. 2003. Vol. 63. № 5. P.1725-1735.

226. Segars J.H., Driggers P.H. Estrogen action and cytoplasmic signaling cascades // Trends. Endocrinol. Metab. 2002. Vol. 13. P. 349-354.

227. Seppet E., Gruno M., Peetsalu A., Gizatullina Z., Nguyen H.P., Vielhaber S., Wussling M., Trumbeckaite S., Arandarcikaite O., Jerzembeck F., Sonnabend M., Jegorov K., Zierz S., Striggow F., Gellerich F.N.

Mitochondria and energetic depression in cell pathophysiology // Int. J. Mol. Sci. 2009. Vol. 10. P. 2252-2303.

228. Shchepina L.A., Pletjushkina O.Y., Avetisyan A.V., Bakeeva L.E., Fetisova E.K., Izyumov D.S., Saprunova V.B., Vyssokikh M.Y., Chernyak B.V., Skulachev V.P. // Oncogene. 2002. Vol. 21. № 53. P. 8149-8157.

229. Shin D.S-H., Wilkie M.P., Pamenter M.E., Buck L.T. Calcium and protein phosphatase 1/2A attenuate N-methyl-D-aspartate receptor activity in the anoxic turtle cortex // Сотр. Biochem. Physiol. 2005. Vol. 142. P. 5057.

230. Sidoti-de Fraisse C., Rincheval V., Risler Y., Mignotte В., Vayssiere J.L. TNF-alpha activates at least two apoptotic signaling cascades // Oncogene. 1998. Vol. 17. № 13. P. 1639-1651.

231. Skulachev V.P. Uncoupling: new approaches to an old problem of bioenergetics // Biochim Biophys Acta. 1998 Vol. 1363. № 2. P. 100-24.

232. Smith R.W., Houlihan D.F., Nilsson G.E. and Brechin J.G. Tissue-specific changes in synthesis rates in vivo during anoxia in crucian carp // Am. J. Physiol. 1996. Vol. 271. P. 897-904.

233. Storey К. B. Molecular mechanisms of metabolic arrest in mollusks in Surviving Hypoxia: mechanisms of control and adaptation, Boca Raton: CRC Press, 1993. P. 253-269

234. Storey K.B. Anoxia tolerance in turtles: metabolic regulation and gene expression // Сотр. Biochem. Physiol. 2007. Vol. 147. P. 263-276.

235. Storey K.B. Dormancy and Resistance in Harsh Environments Mammalian Hibernation: Physiology, Cell Signaling, and Gene Controls on Metabolic Rate Depression, 2010. 283 p.

236. Storey K.B. Metabolic adaptations supporting anoxia tolerance in reptiles: recent advances // Сотр. Biochem. Physiol. 1996. Vol. 113B. P. 23-35.

237. Storey K.B. Molecular Mechanisms of Metabolic Arrest. - Oxford: BIOS Scientific Publishers, 2000. - P. 1-21.

238. Storey K.B., J.M. Storey Metabolic rate depression in animals: transcriptional and translational controls // Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 2004. Vol. 79. № 1. P. 207-233.

239. Storey K.B., McMullen D.C., Ramnanan C. In cold-hardy insects, seasonal, temperature, and reversible phosphorylation controls regulate sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) // J. Physiol. Biochem. Zool. 2010. Vol. 83. № 4. P. 677-686.

240. Storey K.B., Storey J.M. Metabolic rate depression and biochemical adaptation in anaerobiosis, hibernation and estivation // Q. Rev. Biol. 1990. Vol. 65. № 2. P. 145-174.

241. Storey K.B., Storey J.M. Tribute to P.L. Lutz: Putting life on 'pause' -molecular regulation of hypometabolism // J. Exp. Biol. 2007. Vol. 210. P. 1700-1714.

242. St-Pierre J., Brand M.D., Boutilier R.G. Mitochondria as ATP consumers: cellular treason in anoxia // PNAS. 2000a. Vol. 97. № 15. P. 8670-8674.

243. St-Pierre J., Brand M.D., Boutilier R.G. The effect of metabolic depression on proton leak rate in mitochondria from hibernating frogs // J. Exp. Biol. 20006. Vol. 203. P. 1469-1476.

244. St-Pierre J.A., Tattersall G.J., Boutilier R.G. Metabolic depression and enhanced 02 affinity of mitochondria in hypoxic hypometabolism // Am. J. Physiol. 2000b. Vol. 279. P. 1205-1214.

245. Tauber, M. J., Tauber C. A., Masaki S. Seasonal adaptations of insects. New York: Oxford University Press. 1986. 41 lp.

246. Tsai M.J., O'Malley B.W. Molecular mechanisms of action of steroid/thyroid receptor superfamily members // Annu Rev Biochem. 1994. 63. P. 451—486.

247. Uchiyama Y. Autophagic cell death and its execution by lysosomal cathepsins // Arch. Histol. Cytol. 2001. Vol. 64. № 3. P. 233-246.

248. van den Thillart G., van Waarde A., Muller H.J., Erkelens C., Addink A., Lugtenburg J. Fish muscle energy metabolism measured by in vivo 31P-NMR during anoxia and recovery // Am. J. Physiol. 1989. Vol. 256. P. 922929.

249. Vandecaetsbeek I., Vangheluwe P., Raeymaekers L., Wuytack F., Vanoevelen J. The Ca2+ Pumps of the Endoplasmic Reticulum and Golgi Apparatus // Cold Spring Harbor Perspect. Biol. 2011. Vol. 3. № 5. P. 484499.

250. Wharton D.A. Life at the limits. Organisms in extreme environments. - Cambridge: Cambridge University Press, 2002. 555 p.

251. Wickler S.J., I-Ioyt D.F., van Breukelen F. Disuse atrophy in the hibernating golden-mantled ground squirrel, Spennophilus lateralis // Am. J. Physiol. 1991. Vol. 261. P. 1214-1217.

252. Wilding J.R., Joubert F., de Araujo C., Fortin D., Novotova M., Veksler V., Ventura-Clapier R. // J. Physiol. 2006. Vol. 575. P. 191-200.

253. Withers P.C., Cooper C.E. Metabolic Depression: A Historical Perspective // Progress in Molecular and Subcellular Biology. 2010. Vol. 49. P.1-23.

254. Wussling M.H.P., Krannich K., Landgraf G., Herrmann-Frank A., Wiedenmann D., Gellerich F.N., Podhaisky H. Sarcoplasmatic reticulum vesicles embedded in agarose gel exhibit propagating calcium waves // FEBS Lett. 1999. Vol. 463. P. 103-109.

255. Wuytack F., Raeymaekers L., Missiaen L. PMR1/SPCA Ca2+ pumps

2+

and the role of the Golgi apparatus as a Ca store // Eur. J. Physiol. 2003. Vol. 446. P. 148-153.

256. Yin X.M., Ding W.X., Gao W. Autophagy in the liver // Hepatology. 2008. Vol. 47. № 5. P. 1773-1785.

257. Youson J.H., Sower S.A. Theory on the evolutionary history of lamprey metamorphosis: role of reproductive and thyroid axes // Comp. Biochem. Physiol. 2001. Vol. 129B. P. 337-345.

258. Zhang Y.Z. Novel fluorescent acidic organelle-selective dyes and Mitochondrion-selective dyes that are well retained during cell fixation and permeabilization // Mol. Biol. Cell. 1994. Vol. 5. P. 113-653.

259. Zorov D.B., Juhaszova M., Yaniv Y., Nuss H.B., Wang S., Sollott S.J. Regulation and pharmacology of the mitochondrial permeability transition pore // Cardiovascular Research. 2009. Vol. 83. P. 213-225.

260. Zou H., Li Y., Liu X., Wang X. APAF-1, cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9 // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274. P. 11549-11556.