Механизмы торможения димефосфоном процессов активации тромбоцитов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Минуллина, Изида Ренатовна

• Минуллина, Изида Ренатовна
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Минуллина, Изида Ренатовна

Введение

Глава 1. Обзор литературы. Механизмы активации и ингибирования

тромбоцитов

1.1. Механизмы активации тромбоцитов

1.1.1. Адгезия тромбоцитов. Рецепторный аппарат, опосредующий процесс адгезии

1.1.2. Агрегация тромбоцитов. Рецепторный аппарат, опосредующй агрегацию

1.1.3. Система вторичных посредников в активации тромбоцитов

1.1.3.1. Активация фосфолипазы С

1.1.3.2. Система инозитолфосфатов

1.1.3.3. Обмен внутриклеточного кальция

1.1.3.4. Система диацилглицерин - протеинкиназа С

1.1.3.5. Активация тромбоцитарной фосфолипазы А2

1.2. Механизмы ингибирования тромбоцитов

1.2.1. Регуляция метаболизма и роль цАМФ

1.2.2. Регуляция метаболизма и роль цГМФ

Глава 2. Материалы и методы исследования

Глава 3. Антиагрегационный эффект димефосфона в системе сильных и

слабых агонистов

3.1. Выраженность антиагрегационного эффекта димефосфона при использовании АДФ и адреналина в качестве активаторов тромбоцитов

3.2. Влияние димефосфона на звено аденилатциклаза - цАМФ

3.2.1. Активность аденилатциклазной системы и влияние на нее

димефосфона, определяемые в функциональных тестах

3.2.2. Прямое определение внутриклеточного содержания цАМФ и

влияние на него димефосфона

3.3. Влияние димефосфона на путь активации арахидоновая кислота

- тромбоксан А2

3.4. Влияние димефосфона на метаболизм фосфоинозитолов

Глава 4. Кальцийзависимые процессы клеточной активации как основное

звено реализации антиагрегационного эффекта димефосфона

4.1. Эффект димефосфона на агрегацию тромбоцитов, индуцированную кальциевым ионофором А23187

4.2. Сравнительная активность димефосфона и кальциевого хелатора БАФТА-АМ по отношению к агрегации тромбоцитов

4.3. Изучение влияния димефосфона на базальный и АДФ-стимулированный уровень кальция в тромбоцитах

Глава 5. Антиагрегационный потенциал димефосфона в условиях

взаимодействия с эндотелием

5.1. Факторы, обусловливающие антиагрегационную активность сосудистой стенки

5.2. Влияние димефосфона на выраженность антиагрегационного действия эндотелиальных факторов

Глава 6. Обсуждение результатов

Выводы

Практические рекомендации

Список литературы

Приложение

Список сокращений, использованных в диссертации:

АДФ - аденозиндифосфат АК - арахидоновая кислота АСК - ацетилсалициловая кислота

БАФТА-АМ - 1,2 бис(2-аминофенокси)-этан-М,К,К,Н'-тетраацетатной кислоты

ацетоксиметильный эфир БТП - богатая тромбоцитами плазма ГП - гликопротеин ДАГ - диацилглицерин Дф - димефосфон Кд - константа диссоциации ОТП - обедненная тромбоцитами плазма ПК С - протеинкиназа С РОК - рецептороперируемые каналы ФАТ - фактор активации тромбоцитов ФВ - фактор Виллебранда ФДЭ - фосфодиэстераза цАМФ - циклический аденозинмонофосфат цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат ЭД50 - 50-процентная эффективная доза

[Са2+][ - внутриклеточная концентрация свободных ионов кальция 1Р3 - инозитолтрисфосфат РО - простагландин

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизмы торможения димефосфоном процессов активации тромбоцитов»

Введение

Актуальность проблемы. Димефосфон представляет собой диметило-вый эфир 1,1-диметил-З-оксобутилфосфоновой кислоты, синтезированный А.О. Визелем под руководством Б.А. Арбузова в ИОФХ им. А.Е. Арбузова (Арбузов Б.А. и соавт., 1968).

Препарат обладает широким спектром терапевтического действия. Он проявляет антидотный эффект при отравлении ингибиторами холинэстеразы (Гараев P.C., Студенцова И.А., 1968), эффективно применяется при патологии нервной системы для нормализации мозгового кровообращения и повышения устойчивости ткани к гипоксии (Хафизьянова Р.Х., 1991; Гараев P.C., Студенцова И.А., 1995; Данилов В.И. и соавт., 1996 и др.), оказывает кардиопротек-торное действие (Латфуллин И.А., 1985), нормализует функции вегетативной нервной системы (Исмагилов М.Ф., 1986 и др.), обладает иммуностимулирующей активностью (Цыремпилов П.Б., 1987; Зернов И.Н., Володина Н.В., 1988; Курбанов Р.З., 1991), проявляет стресспротективные свойства (Хафизьянова Р.Х., 1991), применяется при лечении бронхиальной астмы и гиперреактивности бронхов (Святкина О.Б. и соавт., 1989; Цибулькина В.Н., 1995), имеет выраженный противовоспалительный эффект с подавлением хемотаксиса ней-трофилов (Зиганшина Л.Е., 1988; Цибулькина В.Н. и соавт., 1996), оказывает противосудорожное действие (Студенцова И.А., Гараев P.C., 1969), а также подавляет секрецию соляной кислоты париетальными клетками желудка (Цибулькина В.Н. и соавт, 1995).

Тем не менее, существующие представления о механизмах действия ди-мефосфона чаще всего могут объяснить какой-то один или группу его эффектов, но не обладают универсальностью (Зиганшина Л.Е. и соавт., 1992; Гараев P.C., 1993; Хафизьянова Р.Х., 1993). Актуальным является поиск механизма, объясняющего если не все, то многие наблюдаемые эффекты препарата. Углубление изучения механизма действия димефосфона важно для расширения сферы клинического применения препарата и опредения новых направлений в исследовании его биологических эффектов.

Оптимальная модель для поиска универсального механизма терапевтического эффекта димефосфона должна отвечать определенным требованиям: 1) исследования должны проводиться на гомогенной клеточной популяции, 2) желательно, чтобы для получения ее не приходилось применять физические и химические методы выделения, которые могут активировать клетку, 3) физиологические факторы и основные механизмы активации этих клеток должны быть хорошо изучены, 4) необходимо иметь воспроизводимую методику регистрации степени клеточной активации, 5) должны существовать изученные варианты патологии, связанные с нарушенной или чрезмерной активацией этой группы клеток; 6) желательно также получить клинические подтверждения эффективности применения димефосфона при данных видах патологии.

После тщательного анализа существующих моделей было обнаружено, что модель стимулированной агрегации тромбоцитов человека соответствует всем перечисленным выше требованиям: 1) тромбоциты представляют собой достаточно гомогенную популяцию (Маркосян A.A., 1970); 2) методы их выделения обеспечивают сохранность функциональных, метаболических и морфологических свойств тромбоцитов (Самаль А.Б. и соавт., 1990); 3) за последние 10-15 лет был достигнут большой прогресс в изучении механизмов активации и функционирования тромбоцитов (Kroll М.Н., Schafer A.I., 1989; Ashby В. et al., 1990; Ruggeri Z.M., 1994); 4) разработаны методики, позволяющие воспроизвести и количественно оценить в условиях in vitro все последовательные этапы в развитии ответной реакции тромбоцитов на разнообразные физиологические стимулы (Габбасов З.А. и соавт., 1989; Hohnsen Н., 1994); 5) нарушения в тромбоцитарном звене гемостаза могут быть причиной либо кровоточивости, либо повышенного тромбообразования (Баркаган З.С., 1988; Гаврилов O.K., 1981; Белоусов Ю.Б., 1986); 6) важным фактором выбора модели агрегации тромбоцитов послужила клиническая эффективность препарата в состояниях с гиперагрегационной активностью последних (данные по антиагрегационному эффекту препарата были получены в работах Д.Ш. Еналеевой (1981, 1996), В.И. Покровского и соавт. (1982), B.C. Морокова (1988), В.Х. Фазылова (1995),

а также в наших совместных работах с В.Н. Цибулькиной и О.Б. Ибрагимовым (1996)).

В связи с вышеперечисленным мы выбрали указанную модель с использованием разнообразных групп агонистов, реализующих свой эффект через различные биохимические пути активации тромбоцитов, для выполнения запланированного исследования. Изложенный в диссертации материал представляет собой логическое продолжение совместных работ с В.Н. Цибулькиной и

0.Б. Ибрагимовым, предположивших возможность наличия у препарата антагонизма кальцийзависимым звеньям активации.

Цель исследования - на модели антиагрегационного действия димефос-фона на тромбоциты раскрыть механизмы реализации влияния препарата на универсальные процессы клеточной активации.

Задачи исследования:

1. В прямых исследованиях оценить особенности изменения концентрации внутриклеточных ионов кальция как фактора, определяющего характер антиагрегационного действия димефосфона.

2. Изучить возможность подавления димефосфоном клеточной активации через влияние на системы внутриклеточных посредников.

3. Исследовать особенности тромбоцитарной активации при взаимодействии димефосфона с соединениями, обладающими свойствами усиления трансмембранного тока ионов кальция или снижения его внутриклеточного содержания за счет комплексообразования.

4. Изучить влияние выявленных универсальных механизмов антиагрегационного действия димефосфона на особенности клеточного взаимодействия в системе «тромбоцит - эндотелиальная клетка».

Научная новизна. Проведено углубленное исследование универсальных механизмов действия димефосфона на модели активации тромбоцитов с использованием расширенного комплекса индукторов их агрегации. Доказано отсутствие прямой связи антиагрегационного эффекта препарата с изменениями в системе аденилатциклаза - цАМФ. Исключена возможность реализации тера-

певтического действия препарата через звено циклооксигеназного метаболизма арахидоновой кислоты.

Впервые доказано, что в основе воздействия препарата на процессы клеточной активации лежит его способность модулировать движение ионов кальция через клеточные мембраны.

Впервые исследованы механизмы действия димефосфона в комплексной системе взаимодействующих компонентов: сосудистая стенка - тромбоциты.

Практическая значимость. Влияние димефосфона на универсальный механизм клеточной активации - трансмембранный перенос ионов кальция с последующим изменением его внутриклеточной концентрации - определяет широту клинического применения препарата.

Способность димефосфона подавлять кальцийзависимые процессы клеточной активации позволит прогнозировать еще не выявленные эффекты в области клинического применения препарата.

Выявление разнонаправленных эффектов действия препарата в комплексных клеточных системах предполагает проведение клинических испытаний с формированием оптимальных схем применения димефосфона с целью получения максимального клинического эффекта.

Положения, выносимые на защиту.

1. Антиагрегационное действие димефосфона реализуется за счет влияния препарата на один из универсальных механизмов клеточной активации - содержание ионизированного внутриклеточного кальция. Торможение увеличения внутриклеточной концентрации ионов кальция в ответ на АДФ определяет подавление агрегации тромбоцитов.

2. Регуляция димефосфоном системы внутриклеточного кальция реализуется на уровне непосредственного влияния препарата на функционирование кальцийтранспортирующих систем.

3. В системе эндотелий - тромбоциты антиагрегационное действие димефосфона может нивелироваться под влиянием подавления выработки эндотелием гуморальных кальцийзависимых факторов с антиагрегационной активностью.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

- научно-практической конференции «Актуальные проблемы кардиологии», г.

Казань, 1995;

- II республиканской научной конференции молодых ученых и специалистов, г.

Казань, 1996;

- Республиканской научно-практической конференции «Новые методы диагно-

стики и лечения», г. Казань, 1996;

- Российской конференции «Фармакология и токсикология фосфорорганиче-ских и других биологически активных веществ», г. Казань, 1996;

- научных конференциях молодых ученых Казанской государственной медицинской академии, 1997, 1998;

- V Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» г. Москва,

1998;

- заседании сотрудников кафедры биохимии Казанскогогосударственного уни-

верситета (1998).

Внедрение результатов исследования. Основные положения диссертации внедрены и используются в учебном процессе на кафедре клинической иммунологии с аллергологией, а также на кафедре фармакологии Казанского государственного медицинского университета.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы (90 отечественных и 169 иностранных источников). Работа объемом 132 страницы включает 23 таблицы и иллюстрирована 10 рисунками.

10

Глава 1 Обзор литературы Механизмы активации и ингибирования тромбоцитов

Тромбоциты представляют собой безъядерные клетки, в цитозоле которых располагаются характерные органеллы: ос-гранулы, плотные гранулы и ли-зосомы, а также митохондрии, вакуоли, пероксисомы, аппарат Гольджи и структуры, не имеющие мембран: гранулы гликогена, микротрубочки и мик-рофиламенты. Кроме того, тромбоциты содержат систему открытых каналов и плотную тубулярную систему, функционирование которых связано с секреторными процессами (Самаль А.Б. и др., 1990).

К основным свойствам тромбоцитов относится способность к адгезии, изменению формы, агрегации и реакции высвобождения содержимого их внутриклеточных гранул. Кроме того, тромбоциты секретируют некоторые белки, участвующие в процессе коагуляции, а также факторы роста, задействованные в репарации повреждений. Все эти биологические реакции тромбоцитов запускаются в ответ на разнообразные экзогенные стимулы и являются частью гемо-статического процесса. Развитию тромбообразования противостоит другая группа агентов, предотвращающих секрецию и агрегацию кровяных пластинок. Для реализации соответствующих тромбоцитарных ответов как на стимулирующие, так и на ингибиторные воздействия необходимо наличие определенных механизмов передачи сигнала с активированных поверхностных рецепторов во внутриклеточное пространство. Слаженное функционирование всех внутриклеточных систем обеспечивает нормальное выполнение тромбоцитами своих биологических функций.

1.1. Механизмы активации тромбоцитов

В состоянии покоя тромбоциты имеют форму гладких двояковыпуклых дисков и не взаимодействуют ни друг с другом, ни с другими клетками крови, ни с поверхностью сосуда, покрытой сплошным слоем эндотелиальных клеток (Мазуров A.B., Васильев С.А., 1994). Сохранение эндотелия является важней-

тттим условием атромбогенности сосудистой стенки (Долгов В.В., 1988). Повреждение сосудистого эндотелия механическими факторами либо в результате патологических процессов приводит к потере им своих атромбогенных свойств, в этом случае тромбоциты подвергаются воздействию различных активирующих стимулов.

1.1.1. Адгезия тромбоцитов. Рецепторный аппарат, опосредующий процесс адгезии Формирование тромбоцитарной пробки начинается с изменения формы кровяных пластинок от дисковидной к сферической (Шитикова A.C. и др., 1997) и их адгезии к субэндотелиальным структурам сосудистой стенки. В участках с медленным током крови и низкой скоростью сдвига (в крупных венах) адгезия тромбоцитов происходит при их взаимодействии с коллагеном, фибро-нектином и ламинином (Bennett J.S., Kolodziej М.А., 1992).

Фибронектин, часто называемый главным адгезирующим фактором, вызывает прилипание и распластывание клеток на фибрине и коллагене (Литвинов Р.И. и др., 1987). Домен молекулы фибронектина, взаимодействующий с клеточными рецепторами тромбоцитов и других клеток, имеет в своем составе аминокислтную последовательность RGD (Arg-Gly-Asp), которая является общей для ряда адгезирующих белков (Юранек И.О. и др., 1989). Не исключено, что фибронектин выступает в роли регионального регулятора взаимодействия тромбоцитов с поврежденной сосудистой стенкой.

Одним из возможных рецепторов к коллагену является мембранный гли-копротеин IV, прежде идентифицировавшийся как рецептор к тромбоспонди-ну. Он представляет собой единичную полипептидную цепь с молекулярной массой 97 кДа (Tsuji Т., Osawa Т., 1986). Другим предполагаемым коллагено-вым рецептором является гликопротеин VI, протеин массой 62 кДа (Arai М. et al., 1995; Moroi М., Jung S.M., 1997). Кроме того, адгезия тромбоцитов к коллагену медиируется комплексом гликопротеинов Ia-IIa (Staatz W.D. et al., 1989; Depraetere H. et al., 1997). Вместе с рецептором к фибронектину и ламинину -

гликопротеином Ic-IIa он входит в состав группы поздних антигенов активации (VLA) семейства интегринов (Sonnenberg A. et al., 1988; NurdenA.T., Nurden P., 1993). Белковые комплексы этой группы имеют одинаковые легкие цепи типа (31 и различные тяжелые а-цепи. В более поздней классификации гликопроте-ин 1а, входящий в состав этого комплекса, получил обозначение а2 (Smyth S.S. et al., 1993), а гликопротеин Ic представляет собой смесь двух цепей: а5 и аб (Мазуров А.В., Васильев С.А., 1994). Таким образом, тромбоцитарные интег-рины класса J31 являются рецепторами для белков внеклеточного матрикса и опосредуют адгезию тромбоцитов к различным субстратам.

В условиях быстрого тока крови и высокой скорости сдвига (в артериях) для обеспечения адгезии тромбоцитов необходимо участие фактора Виллеб-ранда (ФВ) (Frojmovic М.М. et al., 1997; Andrews R.K. et al., 1997). ФВ представляет собой высокомолекулярный гликопротеин, образующий в плазме комплекс с коагуляционным фактором VIII (Grima J.-P. et al., 1987). Он синтезируется в эндотелиальных клетках и мегакариоцитах в виде мономеров с молекулярной массой 220-270 кДа, а затем полимеризуется в мультимеры различного размера (Головина О.Г. и др., 1994). В условиях высоких скоростей сдвига молекулы ФВ принимают форму вытянутых филаментов и приобретают способность связывать сразу несколько тромбоцитарных рецепторов. Такое увеличение числа контактов значительно повышает аффинность связи (Federici А.В. et al., 1989). Взаимодействие тромбоцитов с фактором Виллебранда опосредовано двумя различными комплексами гликопротеинов: Ib-IX-V и Ilb-IIIa, причем взаимодействие с последним медиируется гликопротеином lb (Savage В. et al., 1992).

Фибриноген, не являясь нативным белком субэндотелия, способен быстро иммобилизоваться в местах сосудистого повреждения путем адсорбции. Адгезию тромбоцитов к поверхностно-связанному фибриногену медиирует мембранный комплекс гликопротеинов Ilb-IIIa (интегрин allb(33), относящийся к группе цитоадгезинов (Elangbam C.S. et al., 1997).

Его а-субъединица, или гликопротеин IIb, представляет собой интегральный мембранный белок, состоящий из двух связанных дисульфидной связью цепей с молекулярной массой 114 и 22 кДа (Calvete J .J., Gonzales-Rodrigues J., 1986). ß-субъединица, или гликопротеин Ilia, является интегральным белком, состоящим из простой полипептидной цепи со множеством внутрицепо-чечных дисульфидных связей (Jennings L.K., Philips D.R., 1986). Гликопротеи-ны lib-Ilia проявляют способность связывать лиганды только в составе ком-плекса-гетеродимера, образование и стабильность которого зависят от присутствия ионов кальция (Williams J.A. et al., 1990).

Нерастворимый фибриноген/фибрин и ФВ инициируют процесс формирования тромба благодаря своей способности обеспечивать адгезию тромбоцитов к месту повреждения еще до того как они будут активированы (Ruggeri Z.M., 1994). Однако, недавно было обнаружено, что если тромбоциты предварительно активированы, они могут приклеиваться и к интактному эндотелию. В этом случае процесс адгезии медиируется интегринами allbß3 на поверхности тромбоцитов и тромбоцитарными адгезивными белками (фибриногеном, фибронектином, фактором Виллебранда), а также эндотелиальными рецепторами ICAM-1, интегринами avß3 и, в меньшей степени, гликопротеинами Iba (Bombeli T. et al., 1998).

Вслед за первоначальной адгезией кровяных пластинок к тромбогенной поверхности начинается их приклеивание к первично адгезировавшим тромбоцитам.

1.1.2. Агрегация тромбоцитов. Рецепторный аппарат, опосредующий агрегацию

Непосредственное взаимодействие тромбоцитов друг с другом, или агрегация, обеспечивает последующее увеличение гемостатической пробки. Местами связывания тромбоцитов друг с другом при их агрегации являются комплексы интегринов allbß3. Моноклональные антитела против этого комплекса имитируют условия тромбастении, ингибируя как связывание фибриногена, так

и агрегацию тромбоцитов (Вызова Т.В. и др., 1994; Панченко Е.П., 1997; Newman P.J. et al., 1987; Schafer A.I., 1997). Однако в участках с быстрым током крови для обеспечения полноценной агрегации необходимо участие фактора Виллебранда и гликопротеина Iba, которые способны инициировать образование межтромбоцитарных связей независимо от состояния активации (Goto S. et al., 1998).

Установлено, что allbß3 распознает в лигандах определенную аминокислотную последовательность RGD (Ruoslahti Е., Pierschbacher M.D., 1987; Marcinkiewic С. et al., 1997; Fisher M.J. et al., 1997). Тем не менее, все адгезивные белки имеют различные участки связывания на поверхности интегрина (Мазуров A.B., Васильев С.А., 1994).

Связывание лигандов приводит к дополнительным конформационным изменениям и появлению новых антигенных детерминант, так называемых "лиганд-индуцируемых участков связывания" (Хаспекова С.Г. и др., 1996). Изменение конформации комплекса интегринов allbß3 и связывание с ним фибриногена является ключевым механизмом агрегации тромбоцитов.

Механизмы регуляции интегринов чрезвычайно разнообразны; они осуществляются как на уровне экспрессии рецепторов, так и на уровне последующей модуляции их аффинности.

Запас рецепторов к фибриногену содержится в а-гранулах, плотных гранулах и системе открытых канальцев тромбоцитов (Niiya К., 1987; Youssefian Т. et al., 1997). В течение первых минут активации они мобилизуются из внутриклеточного пула на поверхность и становятся доминирующими белками на мембране тромбоцитов. Изменение количества экспрессируемых рецепторов представляет собой механизм медленной регуляции интегринов продолжительностью от нескольких минут до нескольких часов. В отличие от этого, модуляция аффинности интегринов в ответ на стимуляцию клеток агонистами развивается в считанные секунды. На мембране покоящихся тромбоцитов главный интегрин представлен в неактивной форме, не способной к связыва-

нию адгезивных белков. Активация тромбоцитов различными агонистами (АДФ, тромбин, тромбоксан А2) приводит к дозозависимому увеличению аффинности интегринов. Так, при воздействии АДФ на каждом тромбоците экс-прессируется до 50 ООО сайтов связывания фибриногена с константой диссоциации от 50 до 500 нМ (Plow E.F., Marguerie G.A., 1980). Клеточной активации интегринов сопутствуют увеличение внутриклеточной концентрации кальция, активация множества протеинкиназ, изменение липидной композиции плазматической мембраны и перестройка цитоскелета тромбоцитов (Бочков В.Н.идр., 1995).

К механизмам модулирования ответной реакции тромбоцитов относится и обратимость активации рецептора к фибриногену. Так, например, одному из основных механизмов активации рецептора агрегации - фосфорилированию его субъединицы РЗ протеинкиназой С противостоит его дефосфорилирование под воздействием фосфатазы; кроме того, при повышении уровня внутриклеточного циклического аденозинмонофосфата цАМФ-зависимая протеинкиназа А фосфорилирует G-белок, который прикрывает уже активированную субъединицу (33 (Ермолаева Т.А. и др., 1996). Механизм регуляции аффинности ин-тегрина аПЬрЗ также подразумевает взаимодействие его цитоплазматических доменов с определенными внутриклеточными белками (Naik U.P. et al., 1997). В свою очередь, подобное взаимодействие обусловливает передачу внутрь клетки сигналов извне, облегчая группирование в единый сигнальный комплекс различных ферментов, субстратов и адапторных молекул (Hato Т. et al., 1997; Shattil S.J. etal., 1997).

Агрегация тромбоцитов - сложная биологическая реакция, требующая участия ряда внешних и внутренних стимуляторов, энергетических затрат, глубокой функциональной перестройки кровяных пластинок. Она представляет наибольший интерес с точки зрения тромбоцитарного гемостаза. Активацию тромбоцитов вызывают разнообразные экзогенные стимулы: коллаген субэндотелия, высвобождающийся из поврежденных клеток АДФ, образующийся в ре-

зультате инициации каскада свертывания тромбин, содержащиеся в плазме адреналин и серотонин, синтезируемый различными клетками фактор активации тромбоцитов, а также образующиеся в результате активации в самих тромбоцитах простагландины и тромбоксан А2. Все вышеперечисленные агонисты активируют тромбоциты, взаимодействуя со специфическими рецепторами на их поверхности.

В ответ на действие раздражителей разной силы функциональные превращения тромбоцитов происходят в различном объеме. При повреждении крупных сосудов в качестве первичных активаторов выступают тромбин и коллаген, под воздействием которых развивается секреция пула хранения кровяных пластинок и массивная необратимая агрегация (Ермолаева Т.А. и др., 1996). Агонисты, вызывающие такую тромбоцитарную реакцию, относятся к категории «сильных».

Тромбин активирует тромбоциты по различным путям и соответственно имеет 2 типа рецепторов (Bradford H.N. et al., 1997). Рецепторы 1-го типа активируются при продолжительном воздействии низких доз тромбина (0.5-1 нМ). Они представляют собой комплекс, образованный четырьмя полипептидами: ГП Iba, ГП Ibp, ГПIX, ГП V (Dong J. F. et al., 1997). Высокоаффинный участок связывания тромбина (Кд=0,3 нМ) локализован в N-концевом домене глико-протеина Ib (Takamatsu J. et al., 1986; De-Candia E. et al., 1997). В этом же сегменте локализован сайт связывания фактора Виллебранда (Greco N.J. et al., 1996; Andrews R.K. et al., 1997; Ravanat C. et al., 1997). Активация данного рецептора связана с ингибированием аденилатциклазы, секрецией кислых гидро-лаз и активацией фосфолипазы А2.

Рецепторы второго типа (Кд=11 нМ) активируются при кратковременном воздействии тромбина в средних концентрациях (более 2 нМ) и сопряжены с G-белками (Jamieson G.A., 1997; Molino М. et al., 1997). Расщепление тромбином этого протеина из 425 аминокислот приводит к активации фосфолипазы С (Максименко А.В., 1993).

Коллаген также является сильным тромбоцитарным агонистом и, кроме адгезии, способен вызывать и агрегацию тромбоцитов (Niewenhius Н.К. et al., 1985). Агрегация тромбоцитов в ответ на коллаген связана с синтезом и секрецией таких агрегирующих агентов, как АДФ и тромбоксан А2.

Эндопероксиды простагландинов и тромбоксан А2, мощные индукторы агрегации и вазоконстрикторы, образуются при активации тромбоцитов в процессе метаболизма арахидоновой кислоты (Vane J.R. et al., 1990). Предполагают, что тромбоксан А2 и его предшественник PG Н2 взаимодействуют с общим рецептором (Colman R.W., 1991). Действие тромбоксана А2 опосредуется через регуляторные белки Gq, Ge и Gs, связанные с фосфолипазой С (Ohkubo S. et al., 1996; Kinsella В.Т. et al., 1997) и аденилатциклазой клеток-мишеней (Люсов В.А. и др., 1995). Фармакологические эксперименты позволяют предположить существование двух форм тромбоксановых рецепторов на поверхностной мембране тромбоцитов, ответственных за изменение формы и развитие агрегации.

Слабые агонисты, такие как АДФ, адреналин, серотонин, вазопрессин, вызывают фокальную адгезию и обратимую агрегацию кровяных пластинок. Для осуществления всей последовательности тромбоцитарных реакций такими агонистами требуется дополнительная аутокринная стимуляция. Дальнейшее развитие и усиление первичного тромбоцитарного ответа, а также активацию новых тромбоцитов обеспечивают секретируемые во внешнее пространство АДФ, ионы Са , серотонин. Высвобождение содержимого плотных и а-гранул тромбоцитов в свою очередь зависит от изменения в системе вторичных мес-сенджеров.

Под воздействием АДФ происходит изменение формы тромбоцитов, экспозиция сайтов связывания с фибриногеном на поверхности интегрина allbp3, a также обратимая агрегация в присутствии физиологических концентраций ионов кальция. АДФ-индуцированная реакция секреции также обеспечивается микромолярными концентрациями

Са . На

поверхности тромбоцитов существует два типа рецепторов к АДФ. Один из них принадлежит к семейству P2Y,

рецепторов, связанных с G-белками, он отвечает за ингибирование аденилат-циклазы и агрегацию тромбоцитов. Другой тромбоцитарный рецептор к АДФ относится к семейству P2Xi рецепторов, ответственных за поступление ионов кальция и изменение формы (Mills D.C.B., 1996; Gachet С. et al., 1997). Дальнейшее усиление агрегационного ответа связано с активацией фосфолипазы А2 и обменом арахидоновой кислоты, а также с высвобождением из запасающих органелл дополнительных порций АДФ.

Тромбоцитарные реакции в ответ на адреналин опосредованы высокоаффинными а2-адренергическими рецепторами (Сергеев П.В., Шимановский H.JL, 1987). Взаимодействие адреналина с рецепторами приводит к ингибиро-ванию аденилатциклазной активности с последующим снижением уровня внутриклеточного цАМФ (Hamilton С., Reid J.L., 1986). Агрегация тромбоцитов, индуцируемая адреналином, сопровождается выделением а-липопротеинов, щелочной фосфатазы и 5'-нуклеотидазы одновременно с тром-боцитарным тромбопластином (Бышевский A.M. и др., 1993). Существуют противоречивые данные о способности адреналина к увеличению внутриклеточного уровня ионов

Са (Scrutton М.С., 1993; Alarayyed N.A. et al., 1997; NakamuraT. et al., 1997).

Серотонин активирует тромбоциты, связываясь с рецепторами 5-НТ2 типа, сопряженными с G-белками (Peters J.R., Grahame-Smith D.G., 1980; Spigset О., Mjorndal Т., 1997). Первичным ответом на стимуляцию серотониновых рецепторов является ускорение оборота фосфоинозитольных липидов (Валеева JI.H. и др., 1997).

Вазопрессин стимулирует кровяные пластинки через рецепторы V! типа (Bennett J.S., Kolodziej М.А., 1992; Holmsen Н., 1994).

1.1.3. Система вторичных посредников в активации тромбоцитов

Передача сигнала тромбоцитарными рецепторами опосредована через G-протеины, получившими свое название из-за способности связывать гуанино-вые нуклеотиды. Эти белки взаимодействуют с эффекторными энзимами, сти-

мулируя образование вторичных мессенджеров, либо с ионными каналами в плазматической мембране, обеспечивающими поступление ионов (Bourne H.R. et al., 1991). В регуляции активности эффекторных систем тромбоцитов основную роль играют три функционально самостоятельных типа ГТФ-связывающих белков (Neer E.J., Clapham D.E., 1988): Gs опосредует воздействие тромбоцитарных антагонистов и активирует аденилатциклазу; Gi медииру-ет действие некоторых тромбоцитарных агонистов, ингибирующих аденилатциклазу; Gp связан с активацией фосфолипазы С.

Каждый из этих G-протеинов представляет собой гетеротримерный комплекс, состоящий из субъединиц а, ß и у. Различия между G-белками заключаются в строении их а субъединиц. Две другие субъединицы (ß и у) у белков Gs и Gi идентичны, поскольку имеют высоко консервативную структуру (Утешев B.C., 1992; Ashby В. et al., 1990).

Передача сигнала G-белками представляет собой последовательность нескольких ассоциаций и диссоциаций. При активации рецептора происходит освобождение ГДФ из единого комплекса с G-белком и его замена на ГТФ. Связывание ГТФ с а-субъединицей приводит к диссоциации G-белка на два комплекса: а-ГТФ и ßy. Комплекс а-ГТФ взаимодействует с определенным мембрано-связанным белком и вызывает его активацию. Благодаря наличию ГТФазной активности а-субъединица гидролизует ГТФ и реассоциируется с субъединицами ß и у. После этого система возвращается в исходное состояние, и передача сигнала терминируется (Kroll М.С., Schafer A.I., 1989).

1.1.3.1. Активация фосфолипазы С В тромбоцитах первым событием, связанным с действием стимулирующих агонистов, является активация фосфолипазы С.

Тромбоциты человека содержат фосфоинозитид-специфичную фосфоли-пазу С, которая в ответ на связывание агониста с рецептором гидролизует минорный фосфолипид мембран - фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат. В мембранах и цитоплазме тромбоцитов обнаружены разнообразные формы фосфо-

липазы С, отличающиеся своей аффинностью к субстрату, уровнем катализа и потребностью в ионах кальция (Banno Y. et al., 1986).

Феномен превращений фосфоинозитидов признан ведущим механизмом тромбоцитарной активации. Активация тромбоцитарной фосфолипазы С приводит к образованию инозитолтрисфосфата и диацилглицерина. Эти молекулы влияют на различные пути тромбоцитарной активации и обладают синергизмом (Kaibuchi К. et al., 1983).

1.1.3.2. Система инозитолфосфатов Инозитолтрисфосфат является одним из универсальных вторичных мес-сенджеров. Кроме его основной изоформы, инозитол-1,4,5-трисфосфата, в тромбоцитах были найдены и другие изомеры: инозитол-1,3,4-трисфосфат (Irvine R.F. et al., 1984), инозитол-1,3,4,5-тетракисфосфат (Batty I.R. et al., 1985) а также инозитол-1,2-цикло-4,5-трисфосфат (Ishii H. et al., 1986). Возможно, все они имеют важную роль в функциональной активности тромбоцитов, приводя к изменению концентрации ионов кальция в цитозоле.

Чувствительность клетки к очень небольшим колебаниям концентрации кальция обусловлена тем, что его нормальное внутриклеточное содержание очень мало. В покоящихся тромбоцитах оно находится на уровне 80-120 нМ, что в 10 ООО раз меньше, чем в окружающей среде и на несколько порядков ниже содержания таких катионов, как К+, Na+ и Mg2+ (Титов В.Н., 1996).

1.1.3.3. Обмен внутриклеточного кальция Инозитолтрисфосфат вызывает высвобождение ионов Са из немито-хондриальных внутриклеточных запасов. Чувствительные к инозитолтрифос-фату органеллы, являющиеся специализированной частью эндоплазматическо-го ретикулума и депонирующие кальций, получили название кальциосом (Утешев Б.С., 1992).

Специфический рецептор к инозитол-1,4,5-трисфосфату на плотной ту-булярной системе представляет собой протеин массой 250 кДа. В опытах C.D. Ferris с соавт. (1989) было показано, что этот белок одновременно выполняет

функцию кальциевого канала: рецептор имеет 2 связывающих центра, один из которых отвечает за связывание инозитолтрисфосфата, а другой - за высвобождение кальция. При активации рецептора открывается рН-чувствительный кальциевый канал, запускающий поток ионов Са в цитозоль (O'Rourke F. et al., 1987). Основным способом регуляции рецептора, вероятно, является его фосфорилирование протеинкиназой A (Ferris C.D. et al., 1991). Некоторые исследователи полагают, что инозитолтрифосфат может непосредственно влиять и на рецепторы плазматической мембраны, связанные с поступлением кальция (Irvine R.F., 1990).

Вызванные гормонами изменения [Са ]i в одиночных клетках вовсе не являются плавными, а скорее напоминают периодические квантованные подъемы, или осцилляции (Rapp Р.Е., Berridge M.J., 1981). Наложение множества кальциевых осцилляций дает картину плавных изменений [Ca2+]i, которая наблюдается при регистрации интегрального кальциевого ответа клеточной популяции (Авдонин П.В., Ткачук В.А, 1994). Помимо временной организации кальциевых ответов клетки, проявляющейся в виде периодических флуктуаций

Л I

[Са ]i, имеется четкая пространственная организация изменений концентрации этого иона в цитоплазме. Кальциевые осцилляции начинаются в ограниченном объеме клетки, а затем распространяются по всей клеточной цитоплазме. Для каждой отдельно взятой клетки расположение очага возбуждения, от которого кальциевая волна расходится по клеточному объему, и направления распространения кальциевого фронта фиксированы (Rooney Т.A. et al., 1990).

Помимо инозитолтрифосфаточувствительного пула, существует инози-толтрифосфатрезистентное депо ионов кальция, отличное от запасов в плотной тубулярной системе. Эти внутриклеточные фракции находятся в динамическом равновесии и, вероятно, способны взаимодействовать между собой. Предполагают, что возникающая под воздействием агонистов секреция ионов Са2+ из 1Р3-чувствительного пула индуцирует выход ионов кальция из 1Р3-нечувствительного пула (Authi K.S., 1993).

Существенный вклад в повышение уровня цитозольного Са2+ имеет его поступление из внешней среды. Согласно «потенциирующей» модели после

-л |

начальной фазы повышения [Са ]i за счет мобилизации внутриклеточных запасов происходит усиление активного трансмембранного переноса ионов кальция или, что более вероятно, раскрытие кальциевых каналов в плазматической мембране (Putney J.V., 1986).

Кальциевые каналы в плазматической мембране подразделяются на ре-цепторуправляемые и потенциалзависимые. Различные исследования позволяют сделать вывод о том, что в тромбоцитах человека поступление ионов Са2+ обусловлено активацией рецептороперируемых каналов, которые не являются строго селективными по отношению к двухвалентным катионам (Авдонин П.В. и др., 1990; Ткачук В.А. и др., 1991; Williams J.A. et al., 1990).

Некоторые агонисты, например АДФ, могут непосредственно открывать кальциевые каналы и вызывать приток ионов кальция еще до его секреции из внутриклеточных запасающих структур (Hallam Т.J., Rink Т.J., 1985; Sage S.О. et al., 1989). Поступление кальция через рецепторуправляемые каналы компенсирует недостаточную активность АДФ в отношении формирования инозитол-фосфатов (Authi K.S., 1993).

Терминация кальциевого этапа в трансмембранном переносе сигналов осуществляется при помощи активного транспорта ионов Са2+ из цитоплазмы в запасающие структуры и во внешнее пространство против концентрационного градиента. Обмен цитоплазматического пула с внешней средой происходит достаточно быстро (ti/2 17 мин) (Brass L.F., 1984) и регулируется при помощи Na /Са обмена (Rengasamy A., Feinberg H., 1987). Обратный захват ионов кальция во внутриклеточные депо осуществляется медленно (t1/2 300 мин) и поддерживается АТФ-зависимыми кальциевыми помпами: кальциевыми и кальций-магниевыми АТФазами, которые активизируются при низких концентрациях ионов Са2+ (Hack N. et al., 1986). Предполагается существование в тромбоцитах двух различных Са2+АТФаз (Enyedi A. et al., 1986), причем одни исследователи предполагают существование одной из них в плазматической, а

другой - во внутриклеточных мембранах тромбоцитов, другие же считают, что обе АТФазы локализованы во внутренних мембранах (Authi К.S., 1993; Dean W.L. etal., 1997).

Таким образом, тромбоциты поддерживают практически постоянную концентрацию кальция в цитозоле. При воздействии внешнего стимула она возрастает лишь на короткое время и быстро возвращается к первоначальному уровню (Расмуссен Г., 1989). Кратковременное повышение концентрации кальция в цитозоле способствует образованию его комплексов с кальмодули-ном. Активируемые при этом специфические протеинкиназы фосфорилируют определенные клеточные белки, что в конечном результате изменяет клеточное поведение.

Кальций влияет на различные пути тромбоцитарной активации. К настоящему времени известно его влияние не только на кальций/кальмодулин зависимые протеинкиназы (в том числе и на протеинкиназу С), но и на различные протеазы, фосфолипазы С и А2 (Kroll М.Н., Schäfer A.I., 1989).

1.1.3.4. Система диацилглицерин - протеинкиназа С

Если кальмодулиновый путь действует в начальной фазе клеточной реакции, то для поддержания длительной реакции реализуется другой путь. Японскими учеными (Kishimoto A. et al., 1980) впервые было показано, что изолированная ими из тканей мозга протеинкиназа С с молекулярной массой 80 к Да активируется диацилглицерином (ДАГ).

В матриксе плазматической мембраны большая часть диацилглицерина конвертируется в фосфатидную кислоту, которая является кальциевым ионо-фором. Мембрано-связанный ДАГ запускает транслокацию неактивной протеинкиназы С из цитоплазматического пространства в мембранное, а затем активирует ее в присутствии ионов Ca и мембранного фосфолипида фосфатидил-серина (Ashby В. et al., 1990). Предполагаемыми регуляторами протеинкиназы С являются сфингозин и лизосфингозин (Hannum Y.A. et al., 1986; Hannum Y.A., Bell R.M., 1987).

Основным субстратом протеинкиназы С в тромбоцитах является белок с массой 47 кДа, чья функция полностью до конца не расшифрована. Активация протеинкиназы С запускает агрегацию тромбоцитов (без изменения формы), реакцию секреции и метаболизм арахидоновой кислоты (Kajikawa N. et al., 1983). Протеинкиназа С может обеспечивать независимое от ионов кальция модифицирование мембранного комплекса гликопротеинов Ilb-IIIa, приводящее к связыванию фибриногена (Shattil S.J., Brass L.F., 1987). Есть данные о том, что протеинкиназа С модулирует метаболизм фосфоинозитидов (Maclntyre D.E. et al., 1985; Fleischman L.F. et al., 1986). Кроме того, протеинкиназа С способна модулировать Са2+-индуцированную активацию фосфолипазы А2 (Halenda S.P., Rehm A.G., 1987).

1.1.3.5. Активация тромбоцитарной фосфолипазы А2

В тромбоцитах содержатся различные изоформы фосфолипазы А2, которые отличаются по своей специфичности в отношении ацильной связи в sn-2 положении фосфолипидов (Loeb L.A., Gross R.W., 1986). В тромбоцитах фос-фолипаза А2 отвечает как за отщепление арахидоновой кислоты, так и за обеспечение лизофосфолипидным субстратом формирование ФАТ (Kroll М.Н., Schafer A.I, 1989).

Основным источником арахидоновой кислоты, появляющейся при активации тромбоцитов, является фосфатидилхолин, но фосфолипаза А2 также гид-ролизует фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин и в меньшей степени фосфатидилинозитол (Prescott S.M, Majerus P.W., 1981). Некоторое количество арахидоновой кислоты также образуется из диацилглицерина и фосфатидной кислоты (Mahadevappa V.G, Holub B.J, 1986).

После деацилирования арахидоновая кислота подвергается быстрому циклооксигеназному и липоксигеназному превращению с образованием разнообразных биологически активных продуктов - эйкозаноидов. В тромбоцитах человека циклооксигеназа окисляет арахидоновую кислоту в эндопероксиды простагландинов (PG G2/PG Н2), которые далее конвертируются в ТХ А2. Эти химически нестабильные соединения являются сильными тромбоцитарными

индукторами, которые связываются со специфическими рецепторами и через G-протеин активируют фосфолипазу С. Небольшое количество арахидоновой кислоты также превращается в более слабые ингибиторные эйкозаноиды PG D2, PG F2a и PG Е2, которые могут ослаблять тромбоцитарную активность (Needleman Р. et al., 1986). Арахидоновая кислота также окисляется 12-липоксигеназой с образованием жирных кислот: 12-моногидроперокси- и 12-моногидроксиэйкозатетраеновой. In vitro они ингибируют ряд тромбоцитарных ответов на арахидоновую кислоту и ее производные (Aharony D. et al., 1982), но их физиологическое значение пока неизвестно.

Фосфолипаза А2 играет важную роль в образовании тромбоцитарного агониста ФАТ (1-0-алкил-2-ацетил-зп-глицерил-3-фосфохолина), участвуя в лимитирующей стадии его синтеза (Lapetina E.G., 1983).

Регуляция фосфолипазы А2 в тромбоцитах осуществляется достаточно сложно. Она зависит от увеличения уровня Са2+ в цитозоле, от Na7H+ обмена, от эндогенного белкового ингибитора липокортина, не зависит от кальмодули-на и, вероятно, модулируется при оккупации фибриногенового рецептора (Touqui L. et al., 1986; Watanabe Т. et al., 1986; Zavoico G.B. et al., 1986).

1.2. Механизмы ингибирования тромбоцитов

Активации тромбоцитов противостоят другие биохимические процессы, которые вызывают подавление различных тромбоцитарных ответов.

Важнейшая роль в регуляции тромбоцитарных функций принадлежит сосудистому эндотелию и нижележащим слоям гладкомышечных клеток, вырабатывающим мощные тромбоцитарные ингибиторы - простациклин и оксид азота (Motte S. et al., 1995).

Образование этих медиаторов запускается различными механическими (высокие скорости сдвига) или химическими (АДФ, тромбин, гистамин, бради-кинин) воздействиями на клеточную мембрану (Forsberg E.J. et al., 1987; Fajardo L.F., 1988; Brenner B.M. et al., 1989) и имеет много общих черт. Оба соединения образуются при активации одних и тех же пуринэргических рецепто-

ров, их синтез запускается при увеличении внутриклеточной концентрации ионов кальция (Раевский К.С., 1997; Munzel Т. et al., 1997), реакция секреции бывает синхронизированной (Schmitz G. et al., 1991), а антиагрегационные эффекты характеризуются синергизмом (Radomski M.W. et al., 1987; MacDonald P.S. et al., 1988).

Синтез простациклина инициирует фосфолипаза А2, высвобождающая арахидоновую кислоту из мембранных фосфолипидов. Фермент циклооксиге-наза конвертирует арахидоновую кислоту в эндопероксиды простагландинов, а затем простациклин-синтетаза формирует простациклин из простагландина Н2. Образовавшийся простациклин не накапливается в клетках, а немедленно сек-ретируется в кровоток. В плазме он быстро трансформируется в 6-кето-простагландин-Fia, и период его полужизни не превышает одного круга обращения (Vane J.R. et al., 1990).

Эндогенный оксид азота представляет собой высоколабильный, корот-коживущий, реактивный свободный радикал. Он образуется из L-аргинина за счет окисления азота аминогруппы гуанидинового фрагмента под действием L-аргинин-NO синтазы, использующей в качестве кофактора аденин динуклеотид фосфат (Ряпосова И.К. и др., 1994; Palmer R.M., Moneada S., 1989; Riddell D.R. et al., 1997). Энзиматический путь превращения протекает в цитозоле, является кальций-кальмодулинзависимым и блокируется моноокисью углерода (Feron О. et al., 1998). Эндотелиальная и тромбоцитарная NO-синтазы являются конститутивными ферментами (Раевский К.С., 1997; Freedman J.E. et al., 1997), но в клетках сосудистого эндотелия при определенных воздействиях может экс-прессироваться индуцибельная NO-синтаза (Rudic R.D. et al., 1998). Характерной особенностью оксида азота является его способность быстро диффундировать через мембрану синтезировавшей его клетки в межклеточное пространство и проникать в клетки-мишени, не нуждаясь в специализированных рецепторах (Журавлева И.А. и др., 1997).

С физиологической точки зрения простациклин и оксид азота представляют собой не циркулирующие гормоны, а местные, поскольку они действуют

только в непосредственной близости от секретировавших их клеток. Так как эти соединения не способны резервироваться, а выходя из эндотелиальных клеток подвергаются быстрому разрушению (Kanamaru К. et al., 1987), их уровень в кровотоке слишком низок, чтобы оказывать на организм системное действие (Blair I.A. et al., 1982).

PG I2 и NO представляют собой две составные части единого защитного механизма эндотелия (De Nucci G. et al, 1988; MacDonald P.S. et al., 1988): первый предотвращает агрегацию тромбоцитов, стимулируя в этих клетках адени-латциклазу, а второй ингибирует как адгезию, так и агрегацию тромбоцитов путем активации в них гуанилатциклазы и последующего повышения внутриклеточного уровня цГМФ (Vane J.R. et al., 1990).

К числу тромбоцитарных ингибиторов, вырабатываемых эндотелиаль-ными и гладкомышечными клетками, следует отнести и нуклеотидазы. Они представляют собой ряд мембрано-связанных и цитоплазматических ферментов, осуществляющих последовательное дефосфорилирование АТФ, АДФ и АМФ (Зубаиров Д.М., 1983; Pearson J.D. et al., 1980; Robson S.C. et al., 1997; Schafer A.I., 1997). Метаболизируя выделяемый различными клетками АДФ, АДФазы поддерживают тромбоциты в неактивном состоянии. Антиагрегаци-онная активность нуклеотидаз опосредована еще и тем, что в результате деградации различных адениновых нуклеотидов образуется аденозин. Связываясь с рецепторами А2а типа (Gasser J.А. et al., 1993; Ledent С. et al., 1997), широко распространенными на поверхности тромбоцитов и сосудистого русла, аденозин активирует в этих клетках аденилатциклазу (Grenegard М. et al., 1996). Последующее увеличение концентрации циклического АМФ обусловливает инги-бирование тромбоцитарной агрегации и вазодилатацию (Anfossi G. et al., 1995).

Исследованиями последних лет предполагается существование еще одного медиатора, ингибирующего кровяные пластинки и вырабатываемого эндоте-лиальными и гладкомышечными клетками. Этим соединением является монооксид углерода, действие которого медиируется через стимуляцию гуанилат-

циклазы и увеличение внутриклеточного уровня цГМФ (Durante W. et al., 1997).

Таким образом, действие основных физиологических антагонистов тром-боцитарной активации в конечном итоге реализуется через изменение внутриклеточной концентрации цАМФ и цГМФ. Система циклических нуклеотидов имеет наиболее важное значение среди компонентов системы ингибирования, куда также относятся 5'-фосфомоноэстераза инозитолтрисфосфата, липокор-тин, метаболиты липоксигеназы и протеинкиназа С.

1.2.1. Регуляция метаболизма и роль цАМФ

Циклический АМФ оказывает на тромбоциты плейотропное ингибирую-щее действие: уменьшает связывание тромбоцитов с тромбином, ингибирует образование под действием фосфолипазы С диацилглицерина и инозитолтрисфосфата, ускоряет возвращение диацилглицерина в пул фосфоинозитидов, непосредственно влияет на активность протеинкиназы С, фосфорилирует ß-субъединицу гликопротеина lb, является антагонистом кальцийзависимых путей активации (Knight D.E., Scrutton М.С., 1984; Lapetina E.G., 1986; Lerea K.M. et al., 1987; Kroll M.H. et al., 1988). Исследования показывают, что цАМФ влияет как на выброс ионов Са2+ из плотной тубулярной системы, так и на поступление в нее ионов кальция. Возможно, что последнее связано с фосфорилиро-ванием цАМФ-зависимыми протеинкиназами некоторых структур плотной тубулярной системы (Adunyah S.E., Dean W.L., 1987). Однако молекулярный механизм регуляции циклическим АМФ инозитолтрисфосфат-опосредованных кальциевых ответов в интактных тромбоцитах еще полностью не установлен.

Циклический АМФ формируется под воздействием тромбоцитарных антагонистов на аденилатциклазу. Такие физиологические агенты, как простаг-ландины Еь Е2, D2,12, а также аденозин стимулируют аденилатциклазу, воздействуя через поверхностные рецепторы на ее Gs-субъединицу (Feinstein M.B. et al., 1983). Сайты связывания простагландинов на тромбоцитах были идентифицированы и выделены с разной степенью очистки (Dutta Roy А.К., Sinha А.К.,

1987; Tsai A.-L., 1989). Оказалось, что PG Ei и простациклин имеют общий рецептор, a PG G2 имеет отдельный связывающий центр (Chirkov Y.Y. et al., 1995). Аденилатциклаза тромбоцитов стимулируется также растительными ди-терпенами и форсколином, которые связываются непосредственно с аденилат-циклазой, минуя рецепторы и Gs. Простациклин и форсколин могут вызывать увеличение концентрации цАМФ более чем в 30 раз по сравнению с базальным уровнем, а аденозин - только двукратное увеличение, но этого бывает достаточно для подавления тромбоцитарной активации (Ashby В. et al., 1990).

Другие агенты, воздействующие на рецепторы, связанные с Gi-белком аденилатциклазы (тромбин, АДФ, адреналин), вызывают ее ингибирование (Brass L.F. et al., 1988). Все эти агенты являются активаторами таких тромбоци-тарных реакций, как изменение формы и агрегация.

Внутриклеточная концентрация цАМФ в тромбоцитах поддерживается на постоянном уровне благодаря его гидролизу различными фосфодиэстераза-ми (ФДЭ). Тромбоциты содержат две изоформы ФДЭ циклического аденозин-монофосфата (Grant P.G., Colman R.W., 1984). Одна из них характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью к цАМФ и аллостерически активируется цГМФ. Другой изофермент фосфодиэстеразы имеет низкое сродство к субстрату. Между двумя изоформами ФДЭ существует возможность взаимопереходов (Федоров H.A. и др., 1990).

Предполагается несколько возможных механизмов действия цАМФ: 1) цАМФ-зависимая протеинкиназа медиирует фосфорилирование и стимуляцию

94-

АТФ-зависимой системы поглощения кальция, удаляющей Ca из цитозоля (Feinstein M.B. et al., 1983); 2) цАМФ-зависимая протеинкиназа медиирует фосфорилирование киназы легкой цепи миозина, и ведет к снижению ее активности (Conti М.А., Adelstein R.S., 1981); 3) цАМФ подавляет механизмы поступления ионов кальция в цитоплазму тромбоцитов (Rink Т.J., Smith S.W., 1983).

1.2.2. Регуляция метаболизма и роль цГМФ Активация тромбоцитов некоторыми агонистами (АДФ, серотонином, коллагеном, арахидоновой кислотой) сопровождается стимуляцией в них гуа-

нилатциклазы (Северина И.С, 1995). Гуанилатциклаза существует в двух формах: растворимой и мембраносвязанной, катализирует биосинтез циклического 3',5'-гуанозинмонофосфата - мощного регулятора метаболизма клетки - и имеет сложный механизм регуляции. Изменения в функционировании тромбоцитар-ной гуанилатциклазы происходят на самых ранних стадиях развития процесса агрегации. Образование цГМФ представляет собой механизм тонкой регуляции активности тромбоцитов, в физиологических условиях этот нуклеотид не инги-бирует, а скорее ослабляет тромбоцитарный ответ. В условиях in vitro увеличение уровня цГМФ осуществляет негативный контроль над агрегацией тромбоцитов и опосредует их сигнал к дезагрегации (Северина И.С, 1995; Alheid U. et al, 1987; Furlong В. et al, 1987). Гидролиз цГМФ в тромбоцитах осуществляется преимущественно цГМФ-специфичной фосфодиэстеразой с низкой константой Михаэлиса (Sheth S.B, Colman R.W, 1995).

Предполагается, что эффект цГМФ связан с изменением концентрации ионов кальция (Koch K.W, Stryer L, 1988), либо с модуляцией активности фосфолипазы С (Nakashima S. et al, 1986), либо со стимуляцией цГМФ-зависимой протеинкиназы, дефосфорилирующей легкие цепи миозина (Brenner В.М. et al, 1989).

Представленный материал по функциональным процессам, характерным для активированных тромбоцитов, позволяет считать их удачной модельной системой для изучения универсальных механизмов клеточной активации. Выделение тромбоцитов человека осуществляется доступными способами, а существующие методики обеспечивают достоверное воспроизведение в условиях in vitro активации данной группы клеток, имеющей место in vivo. Процессы активации тромбоцитов объединяют в себе черты, типичные и для других клеточных систем. Так, при стимуляции кровяных пластинок сильными индукторами инициируется метаболизм полифосфатинозитолов с последующим выходом на звено внутриклеточного кальция; при использовании слабых индукторов типа АДФ активация и последующая агрегация тромбоцитов модулируется усилением секреции как эндогенного кальция, так и добавочных порций эндо-

генного АДФ, а также образованием вторичного агониста тромбоксана А2 в ходе циклооксигеназного метаболизма арахидоновой кислоты; тромбоцитар-ные реакции контролируется с помощью различных механизмов циклическим АМФ. Таким образом, все известные системы вторичных посредников, принимающие участие в активации и функционировании различных клеточных групп, можно изучить на популяции тромбоцитов. Полноценные выводы об универсальных механизмах действия димефосфона можно получить только с применением комплекса индукторов физиологической активации тромбоцитов. В их числе рекомендуется использование АДФ и адреналина в качестве слабых агонистов, а также арахидоновой кислоты и тромбина - в качестве сильных индукторов.

32

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Минуллина, Изида Ренатовна

104 Выводы

1. Универсальный механизм влияния димефосфона, определяющий его широкий терапевтический эффект, связан со снижением степени нарастания внутриклеточного содержания ионизированного кальция в стимулированных клетках.

2. Димефосфон не оказывает влияния на внутриклеточную концентрацию ионизированного кальция в нестимулированных тромбоцитах.

3. Системы аденилатциклаза - цАМФ и метаболиты арахидоновой кислоты не входят в число вторичных посредников, через которые может реализоваться эффект препарата на активированные клетки.

4. Результаты проведенных исследований не позволяют исключить систему инозитолфосфатов в качестве пути реализации антиагрегационного действия димефосфона на тромбоциты.

5. Спектр антиагрегационной активности димефосфона, исследованный с использованием расширенного комплекса тромбоцитарных агонистов, аналогичен спектру вещества БАФТА-АМ, снижающего уровень внутриклеточного кальция.

6. Димефосфон препятствует активации тромбоцитов ионофором А23187, увеличивающим внутриклеточную концентрацию ионизированного кальция, однако его действие не обусловлено связыванием ионов Са2+ в неактивные комплексы.

7. Кальцийзависимые механизмы выработки эндотелиальных факторов с антиагрегационной активностью также подавляются димефосфоном, что может видоизменить характер и степень выраженности действия препарата в условиях целого организма.

Практические рекомендации

1. Способность димефосфона оказывать антиагрегационное воздействие на фоне развивающегося процесса агрегации может служить обоснованием для применения препарата в период острых стадий заболеваний, сопровождающихся гиперагрегацией тромбоцитов.

2. В ситуациях, связанных с массированным тромбообразованием, сопряженным с появлением тромбина в кровотоке, применение димефосфона не целесообразно.

3. При терапевтическом применении димефосфона следует учитывать возможность видоизменения конечного эффекта его действия за счет подавления выработки эндотелиальных кальцийзависимых факторов с антиагрегаци-онной активностью.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Минуллина, Изида Ренатовна, 1998 год

Список литературы

1. Авдонин П.В., Ткачук В.А. Рецепторы и внутриклеточный кальций - М., 1994. - 288 с.

2. Авдонин П.В., Чеглаков И.Б., Ткачук В.А. Ионная проницаемость и регуляция рецепторуправляемых каналов плазматической мембраны тромбоцитв человека // Биол. мембраны - 1990. - Т. 7, №1. - С. 12-22.

3. Анчикова Л.И., Валеева И.Х., Поздняк А.О. и др. К механизму антиацидотиче-ского действия димефосфона // Казанский мед. ж. - 1988. - Т. 69, №5. -С. 362-364.

4. Арбузов Б.А., Визель А.О., Ивановская K.M. и др. Синтез и новые биологические эффекты фосфорорганических соединений с низкой токсичностью // Доклады АН СССР. - 1968. - Т. 182, №1. - С. 101-104.

5. Балуда В.П., Лакин K.M., Лукоянова Т.И. и др. Ингибирующее действие адреналина на антиагрегационную активность стенки артерий // Фармакол. Токсикол. - 1980. - № 4. - С. 381-383.

6. Баркаган З.С. Геморрагические заболевания и синдромы. - М., 1988. - 525 с.

7. Белоусов Ю.Б. Гемореологические исследования при ишемической болезни сердца // Кардиология. - 1986. - №6. - С. 115-118.

8. Бочков В.Н., Сорокин Е.В., Вызова Т.В. и др. Участвуют ли гликопротеиды Ilb/IIIa в активации тромбоцитов человека липопротеидами низкой плотности?//Биохимия. - 1995.-Т. 60, №8.-С. 1187-1194.

9. Вызова Т.В., Власик Т.Н., Мазуров A.B. Ингибирование агрегации тромбоцитов моноклональными антителами к комплексу гликопротеидов Ilb-IIIa // Бюлл. эксп. биол. мед. - 1994. - Т. 118, №10. - С. 402-405.

Ю.Бышевский А.Ш., Зубаиров Д.М., Терсенов O.A. Тромбопластин. - Новосибирск., 1993.- 178 с.

11 .Валеева И.Х. Влияние физиологически активных ФОС на систему окислительного фосфориллирования митохондрий // Автореф. дисс ... канд. биол. наук. - Купавна, 1985.

12.Валеева JI.H., Сергеев П.В., Шимановский H.J1. Рецепторы серотонина (результаты фармакологического анализа) // Эксп. клин, фармакол. - 1997. -№6. -С. 57-61.

13.Габбасов З.А., Попов Е.Г., Гаврилов И.Ю. и др. Новый высокочувствительный метод анализа агрегации тромбоцитов // Лабораторное дело. - 1989. -№10.-С. 15-18.

14.Гаврилов O.K. Использование свойств тромбоцитов в разработке методов управления системой PACK // В сб.: Проблемы и гипотезы в учении о свертывании крови - М., 1981.- С. 58-63.

15.Гараев P.C., Студенцова И. А. Влияние диметилового эфира 3-кетобутилфосфиновой кислоты на холинергические процессы // В сб.: Действие нейротропных средств на нервную и гормональную регуляцию. - Л., 1968. - С. 49-50.

16.Гараев P.C. Особенности взаимодействия димефосфона с цитохромом Р-450 // Фармация и фармакология. Тез. докл. Международной науч.-практ. конф. -Пермь, 1993. С. 81.

17.Гараев P.C., Студенцова И.А. Новые лекарственные средства на основе не-антихолинэстеразных фосфорорганических соединений // Каз. мед. журн. -1995. - №4. - С. 324-327.

18.Гатауллин И.А. Гистоэнзимологические параллели в диагностике острого экспериментального панкреатита // В сб.: Актуальные вопросы клинической патологии. - Казань, 1980. Вып. 2. - С. 22-24.

19.Головина О.Г., Нягулов Д.Ф., Папаян Л.П. и др. Иммуноферментный метод определения тромбоцитарного фактора Виллебранда // Клиническая лабораторная диагностика. - 1994. - №-6. - С. 29-31.

20.Данилов В.И., Исмагилов М.Ф., Студенцова И.А. и др. Влияние димефосфона на динамику неврологического дефицита у больных сосудистыми поражениями головного мозга // Фарм. и токсикол. фосфорорганических и других биол. акт. веществ. Вып. 3. Тез. докл. Росс. конф. - Казань, 1996. - С. 48.

21.Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов - М., 1989. - 580 с.

22.Долгов В.В. Морфо-функциональная характеристика эндотелия сосудистой стенки в норме и при атеросклерозе // Автореф. дисс.... докт. мед. наук. - М., 1987.

23.Еналеева Д.Ш. Профилактика и терапия нарушений кровообращения и гемостаза при шоке у инфекционных больных // Автореф. дисс. ... докт. мед. наук.-М., 1981.

24.Еналеева Д.Ш., Мороков B.C., Созинов A.C. и др. Димефосфон в комплексном лечении больных гриппом, осложненным пневмонией, коррегирует иммунитет и гомеостаз // Тез. докл. III Росс, национ. конг. "Чел. и лек." - 1996. - С. 116.

25.Ермолаева Т.А., Пономаренко В.М., Головина О.Г. Система мегакариоцит-тромбоцит. - Вестник РАМН. - 1996. - №12. - С. 34-43.

26.Журавлева И.А., Мелентьев И.А., Виноградов H.A. Роль окиси азота в кардиологии и гастроэнтерологии // Клин. мед. - 1997. - №4. - С. 18-21.

27.3адионченко B.C., Багатырова K.M., Кузнецова Е.И. и др. Возможности лечебной коррекции нарушений тромбоцитарно-сосудистого гемостаза и реологии крови у больных ишемической болезнью сердца // Кардиология - 1996.

- №5. - С. 22-26.

28.3ернов И.Н., Володина Н.В. Влияние димефосфона на иммунный статус детей с пиелонефритом // Педиатрия. - 1988. - №5. - С. 23-25.

29.3иганшин А.У., Студенцова И.А., Заиконникова И.В. Влияние димефосфона на систему адениловых нуклеотидов // Фарм. и токсикол. - 1988. - №4. - С. 80-82.

ЗО.Зиганшина JI.E. Экспериментальное изучение противовоспалительной активности димефосфона// Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. - Казань, 1988.

31 .Зиганшина Л.Е., Студенцова И.А., Большакова Е.В. Влияние димефосфона на гемолитическую стойкость мембран эритроцитов // Каз. мед. журн. - 1988.

- №2. - С. 125.

32.3иганшина JI.E., Студенцова И.А., Зиганшин А.У. и др. Механизм действия димефосфона // Эксп. клин, фармакол. - 1992. - №2. - С. 43-45.

ЗЗ.Зубаиров Д.М., Андрушко И.А., Литвинов Р.И., Попова Л.Г. Физиологическая внутрисосудистая активация свертывания крови // Гематология и трансфузиология. - 1983. - Т. 28, №8. - С. 3-7.

34.Исмагилов М.Ф. Церебральные вегетативные нарушения пубертатного периода//Автореф. дисс. ... докт. мед. наук. - Казань, 1986.

35.Карпов Ю.А., Соболева Г.Н. Антагонисты кальция - препараты первой линии в современной кардиологии // Тер. архив - 1995. - Т. 67, №6 - С. 81-84.

36.Костюк П.Г. Кальций и клеточная возбудимость. - М., 1986. - 256 с.

37.Курбанов Р.З. Эффективность патогенетических методов и средств при лечении телят, больных бронхопневмонией // Автореф. дисс. ... докт. вет. наук. -Казань, 1991.

38.Лакин K.M., Маневич Е.М., Муляр А.Г. и др. Действие антагонистов кальция на агрегацию тромбоцитов // Фармакол. и токсикол. - 1987. - Т. 50, №5. - С. 78-88.

39.Латфуллин И.А. Изменения гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы при инфаркте миокарда и их коррекция препаратом димефосфон // Автореф. дисс.... докт. мед. наук. - М., 1985.

40.Лейтин В.Л., Миссельвитц Ф., Авдонин П.В. и др. Стимуляция распластывания и агрегации тромбоцитов на иммобилизованном коллагене V типа: механизмы, зависящие от Са2+ и протеинкиназы С // Биология. - 1989. - №54. -С. 1565-1570.

41.Литвинов Р.И., Измайлов С.Г., Зинкевич О.Д. и др. Влияние экзогенного фибронектина на заживление кожных ран по данным тензиометрии // Бюлл. эксп. биол. мед. - 1987. - №12. - С. 727-730.

42.Люсов В.А., Утешев Д.В., Волов H.A. и др. Препараты, влияющие на метаболизм арахидоновой кислоты в тромбоцитах при лечении ишемической болезни сердца // Эксп. клин, фармакол. - 1995. - №4. - С. 76-79.

43.Мазуров A.B., Васильев С.А. Структура и функции мембранных гликопро-теинов тромбоцитов // Гематол. и трансфузиол. - 1994. - Т. 39, №1. - С. 29-34.

44.Максименко A.B. Тромбин: структурно-функциональные характеристики в биохимических реакциях //Биохимия. - 1993. - Т. 58, №9. - С. 1373-1383.

45.Манухина Е.Б., Лапшин A.B., Машина С.Ю. и др. Функциональное состояние эндотелия и продукция окиси азота в организме крыс, адаптированных к периодической гипоксии // Бюлл. эксп. биол. мед. - 1995. - №11. - С. 495-498.

46.Маркосян A.A. Физиология тромбоцитов. - Л., 1970. - 164 с.

47.Мороз Т.Б. Результаты применения димефосфона у детей с обострением хронического холецистохолангита // Каз. мед. журн. - 1990. - №4. - С. 263-264.

48.Мороков B.C. Изменения гемостаза и их коррекция при гриппе, осложненном пневмонией // Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. - Л., 1988.

49.Мрасова В.К. Клинико-диагностическое значение состояния показателей почечных цитомембран при сахарном диабете у детей // Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. - Казань, 1991.

50.Негреску Е.Б., Балденков Г.Н., Григорян Г.Ю. и др. Биохимические особенности альфа2-адренорецепторов тромбоцитов и их связь с повышением концентрации внутриклеточного Са2+ // Биология - 1989. - Т. 54, №6. - С. 909-915.

51 .Панченко Е.П. Ингибиторы Ilb/IIIa рецепторов тромбоцитов - новое направление в антитромботической терапии // Тер. архив - 1997. - Т. 69. - №9. - С. 66-71.

52.Покровский В.И., Ломазова К.Д., Астрина С.С. Патогенез тромбогеморрагиче-ского синдрома у больных менингококковой инфекцией // Сб. науч. тр.: Патогенетические основы лечения острых инфекционных болезней. - М., 1982. - С.63-67

53.Пряникова H.A., Духанин A.C., Стаховская Л.В. и др. Влияние нимодипина на внутриклеточный уровень кальция и агрегацию тромбоцитов больных с ишемическим инсультом // Бюлл. эксп. биол. мед. - 1996. - №3. - С. 317-320.

54.Разумов В.Б., Гуткин А.Б., Омельяновский В.В. Механизмы активации тромбоцитов и возможности их фармакологической регуляции // Кардиология. - 1988. - №5. - С. 118-122.

55.Раевский К.С. Оксид азота - новый физиологический мессенджер: возможная роль при патологии центральной нервной системы // Бюлл. эксп. биол. мед. - 1997. - Т. 123, №5. - С. 484-490.

56.Расмуссен Г. Циркуляция кальция и внутриклеточная передача внешних сигналов // В мире науки. - 1989. - №-12. - С. 36-43.

57.Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Каюшин Л.П. Цикл окиси азота в организме млекопитающих и нитритредуктазная активность гемсодержащих белков // Вопросы мед. химии - 1994. - №.6 - С. 31-35.

58.Ряпосова И.К., Григорьев Н.Б., Северина И.С. Новый класс активаторов растворимой гуанилатциклазы, генерирующих оксид азота // Биохимия. - 1994. -Т. 59, №4. - С. 537-542.

59.Самаль А.Б., Черенкевич С.Н., Хмара Н.Ф. Агрегация тромбоцитов: методы изучения и механизмы. - Минск, 1990. - 104 с.

60.Святкина О.Б. Патогенетическое значение структурно-функциональных изменений мембран иммунокомпетентных клеток и возможности их коррекции при атопической бронхиальной астме у детей // Автореф. дисс. ... докт. мед. наук.-М., 1987.

61.Святкина О.Б., Погомий H.H., Круглый Б.И. и др. Антиаллергическое действие димефосфона и его использование для лечения атопической бронхиальной астмы и поллиноза у детей // Педиатрия. - 1989. - №1. - С. 85-88.

62.Северина И.С. Растворимая формы гуанилатциклаз. Механизм активации оксидом азота, роль в агрегации тромбоцитов // Вестник РАМН - 1995. - №2. -С. 41-46.

63.Сергеев П.В., Шимановский Н.Л. Рецепторы. - М., 1987. - 400 с.

64.Соловьева И.З., Цибулькина В.Н., Ибрагимов О.Б., Минуллина И.Р., Мотина Н.В. Дезагрегационное действие препарата димефосфон у больных ИБС и больных с синдромом гиперагрегации тромбоцитов // Тез. докл. Республиканской науч.-практ. конф. «Новые методы диагностикии лечения». - Казань, 1996.-Т. 2.-С. 73-74.

65.Справочник ВИДАЛБ. Лекарственные препараты в России: Справочник. -М., 1996. - 1296 с.

66.Студенцова И.А., Визель А.О., Мокринская И.С. и др. Влияние малотоксичных фосфорорганических соединений на биоэнергетические процессы // Фармакология и научно-технический прогресс: Тез. докл. VI Всесоюзного съезда фармакологов. - Ташкент, 1988. - С. 354-360.

67.Студенцова И.А., Гараев P.C. Влияние диметилового эфира 1,1-диметил-З-кетобутилфоефиновой кислоты на токсическое действие некоторых стимуляторов нервной системы. // Тез. докл. конф. «Фармакология и токсикология фосфорорганических соединений и других биологически активных веществ». - Казань, 1969. - С. 69-70.

68.Титов В.Н. Методические и диагностические аспекты определения содержания кальция // Клиническая лабораторная диагностика. - 1996. - №2. - С. 23-26.

69.Ткачук В.А., Авдонин П.В., Панченко М.П. Новые эффекторные системы клетки, регулируемые GTP-связывающими белками // Биол. мембраны -1991.-Т. 8, №11.-С. 1137-1138.

70.Утешев Б.С. Инозитолфосфат и Са2+ как вторичные мессенджеры // Экспе-рим. и клин, фармакол. - 1992. - Т. 55, №-4. - С. 69-74.

71.Фазылов В.Х. Корригирующее влияние димефосфона на параметры гемостаза при роже // Тез. докл. II Росс, национ. конг. "Чел. и лек." - 1995. - С. 216.

72.Фазылов В.Х. Нарушения гемостаза и иммунитета при формировании рецидивов рожи, их терапевтическая коррекция // Автореф. дисс. ... докт. мед. наук. - С.-Петербург, 1996.

73.Файзуллин Ш.Б., Хафизьянова Р.Х., Изменение некоторых показателей углеводного и энергетического обмена на фоне антихолинэстеразных и неан-тихолинэстеразных фосфорорганических соединений // Тез. докл. II Российского нац. конгресса «Чел. и лек». - М., 1995. - С. 36.

74.Федоров H.A., Радуловацкий М.Г., Чехович Т.Е. Циклические нуклеотиды и их аналоги в медицине. М., 1990. - 192 с.

75.Ферстрате М., Фермилен Ж. Тромбозы. М., 1986. - 236 с.

76.Хаспекова С.Г., Вызова Т.В., Лукин В.В. и др. Конформационные изменения комплекса гликопротеидов Ilb-IIIa мембраны тромбоцитов, стимулированные моноклональным антителом к N-концевому участку гликопротеида Ша // Биохимия. - 1996. - Т. 61, №3. - С. 412-427.

77.Хафизьянова Р.Х. Состояние перекисного окисления липидов мозга крыс при введении неантихолинэстеразных ФОС фосфобензида и димефосфона // Тез. докл. науч-практ. конф. - Пермь, 1993. - С. 131.

78.Хафизьянова Р.Х. Церебропротекторные свойства малотоксичных неантихолинэстеразных ФОС // Автореф. дисс. ... докт. мед. наук. - 1991.

79.Цибулькина В.Н. Влияние димефосфона на гиперреактивность бронхов // Междунар. конф. «Улучшение качества жизни при астме и аллергии». Сб. резюме. - С.-Петербург, 1995. - С. 89.

80.Цибулькина В.Н. Оптимизация клинического применения димефосфона на основе исследования ведущих механизмов его действия // Автореф. дисс. ... докт. мед. наук. - Казань, 1997.

81 .Цибулькина В.Н., Зинкевич О.Д., Гараев P.C. Кальцийзависимые механизмы подавления димефосфоном активности лейкоцитов // Тез. докл. Российской конференции «Фармакология и токсикология фосфорорганических и других биологически активных веществ». Вып. 3. - Казань, 1996. - С. 149.

82.Цибулькина В. Н., Ибрагимов О. Б., Минуллина И. Р. Дезагрегационная активность препарата димефосфон in vitro. Тез. докл. республиканской науч.-практ. конф. "Новые методы диагностики и лечения". - Казань, 1996. - Т.2. -С. 191-192.

83.Цибулькина В.Н., Кузнецов В.А., Новожилова A.A. Димефосфон в лечении эрозивных поражений желудка // Материалы Республиканской науч.-практ. конф. «Новые методы диагностики и лечения». Казань, 1995. - С. 213-215.

84.Цибулькина В.Н., Минуллина И.Р., Цибулькин А.П. Пути реализации антиагре-гационного действия димефосфона на уровне внутриклеточных посредников. Тез. докл. Российской конф. "Фармакология и токсикология фосфорорганических и других биологически активных веществ". Вып.З. - Казань, 1996. - С. 150.

85.Цибулькина В.Н., Соловьева И.З., Ибрагимов О.Б., Гараев P.C. Дезагрегаци-онное действие препарата димефосфон // Тез. докл. III Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М., 1996. - С. 56.

86.Цыремпилов П.Б. Действие 2,4-Д диметиламмониевой соли на иммунобиологическую реактивность организма животных // Автореф. дисс. ... канд. вет. наук. - Казань, 1987.

87.Шарипова Г.Х., Парфенова Е.В., Вихерт О.А. и др. Влияние кардила (дилтиазема) на агрегацию тромбоцитов при гипертонической болезни // Клин. мед. - 1995. - №1. - С. 20-22.

88.Шварц Ю.Г., Соколов И.М. Гипоксия и сосудисто-тромбоцитарный гемостаз у больных с острой коронарной недостаточностью // Анест. и реанима-тол. - 1997.-№1.-С. 18-20.

89.Шитикова А.С., Белязо О.Е., Тарковская J1.P. и др. Метод определения внут-рисосудистой активации тромбоцитов и его значение в клинической практике // Клиническая лабораторная диагностика - 1997. - №2. - С. 23-35.

90.Юранек И.О., Федоров Н.А., Титов М.И., Дейгин В.И. Зависимость агрегации тромбоцитов от фибронектина плазмы и трипептида аргинил-глицил-аспарагилин // Бюлл. эксп. биол. мед. - 1989. - Т. 107, №5. - С. 536-537.

91.Adunyah S.E., Dean W.L. Redulation of human platelet membrane Ca2+ transport by cAMP- and calmodulin-dependent phosphorylation // Biochym. Biophys. Acta. - 1987. - Vol. 930. - P. 401-409.

92.Aharony D., Smith J.B., Silver M.J. Regulation of arachidonate-induced platelet aggregation by the lipoxygenase product, 12-hydroperoxyeicosatetraenoic acid // Biochim. Biophys. Acta - 1982. - Vol. 718. - P. 193-200.

93.Akiyama M., Takami H., Yoshida Y. The mechanism of cold-induced platelet aggregation in the presence of heparin // Tohoku J. Exp. Med. - 1995.- Vol. 177, №4. - P. 365-374.

94.Alarayyed N.A., Cooper M.B., Prichard B.N. et al. In vitro adrenaline and collagen-induced mobilization of platelet calcium and its inhibition by naftopidil, doxazosin and nifedipine // Br. J. Clin. Pharmacol. - 1997. - Vol. 43, № 4. _ p. 415-420.

95.Alheid U., Frolich J.C., Forstermann U. Endothelium-derived relaxing factor from cultured human endothelial cells inhibits aggregation of human platelets // Thromb. Res. - 1987. - Vol. 47. - P. 561-571.

96.Andersen M.R., Stender S. Endothelial nitric oxide synthase activity in vascular endothelial cells from normo-cholesterolemic rabbits // XI international symposium on atherosclerosis. - Paris, 1997. - P. 238.

97.Andrews R.K., Lopez J.A., Berndt M.C. Molecular mechanisms of platelet adhesion and activation // Int. J. Biochem. Cell. Biol. - 1997 - Vol. 29, № 1. - P. 91-105.

98.Anfossi G., Massucco P., Piretto V. et al. Glyceryl trinitrate enhances the adeno-sine-induced inhibition of platelet responces: a mechanism potentially involved in the in vivo antiaggregating effects of organic nitrates // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. - 1995.-Vol. 22, №11.-P. 803-811.

99.Arai M., Yamamoto N., Morroi M. et al. Platelets with 10% of the normal amount of glycoprotein VI have an impaired response to collagen that results in a mild bleeding tendency // Br. J. Haematol. - 1995. - Vol. 89, №1. - P. 124-130.

100.Ashby B., Daniel J.L., Smith J.B. Mechanisms of platelet activation and inhibition // Hematology Oncology Clinics of North America - 1990. - Vol. 4, №.1 - P. 1-26.

101.Authi K.S. Ca2+ homeostasis and intracellular pools in human platelets // In: Authi K.S., Watson S.P., Kakkar V.V. eds. Mechanisms of platelet activation and control. - Plenum press New York and London, 1993. - P. 83-104.

102.Banno Y., Shigeru N., Nozawa Y. Partial purification of phospholipase C from human platelet cytosol: characerization of its three forms // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1986. - Vol. 136. - P. 713-721.

103.Batty I.R., Nahorshi S.R., Irvine R.F. Rapid formation of inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate following muscarinic receptor stimulation of rat cerebral cortical slices // Biochem. J. - 1985. - Vol. 232. - P. 211-215.

104.Bennett J.S., Kolodziej M.A. Disorders of platelet function // Disease-a-month -1992. - Vol. 38, №. 2 - P. 589-631.

105.Bennett W.F., Lynch G. Low-temperature induction of calcium-dependent protein phosphorylation in blood platelets // J. Cell Biol. - 1980. - Vol. 86, №1. -P. 280-285.

106.Bick R.L. Platelet function defects: a clinical review // Semin. Thromb. Hemost. - 1992. - Vol. 18, №2. - P. 167-185.

107.Blair I.A., Barrow S.E., Waddell K.A. Prostacyclin is not a circulating hormone in man // Prostaglandins. - 1982. - Vol. 23. - P. 579-589.

108.Bombeli T., Schwartz B.R., Harlan J.M. Adhesion of activated platelets to endothelial cells: evidence for a GPIIbllla-dependent bridging mechanism and novel roles for endothelial intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1), av(33 integrin, and GPIbot // J. Exp. Med. - 1998. - Vol. 187, №3. - P. 329-339.

109.Bonitati A.E., Agarwal K.C., Rounds S. A simple assay for ecto-5'-nucleotidase using intact pulmonary artery endothelial cells. Effect of endotoxin-induced cell injury // Biochem. Pharmacol. - 1993. Vol. 46, № 8. - P. 1467-1473.

110.Born G.V.R. Quantitative investigation into the aggregation of blood platelets // J.Physiol. - 1962 - P. 67P-68P.

111.Bourne H.R., Sanders S.A., McCornic F. The DTPase superfamily: conserved structure and molecular mechanism // Nature. - 1991. - Vol. 349. - P. 117-127.

112.Bradford H.N., Dela-Cadena R.A., Kunapuli S.P. et al. Human kininogens regulate thrombin binding to platelets through the glycoprotein Ib-IX-V complex //Blood. - 1997.-Vol. 90, №4.-P. 1508-1515.

113.Brass L.F. Ca2+ homeostasis in unstimulated platelets // J. Biol. Chem. - 1984. -Vol. 259.-P. 12563-12570.

114.Brass L.F., Woolkalis M.J., Manning D.R. Interactions in platelets between G proteins and the agonists that stimulate phospholipase C and inhibit adenylyl cyclase // J. Biol. Chem. - 1988. - Vol. 263. - P. 5348-5355.

115.Brenner B.M., Troy J.L., Ballermann B.J. Endothelium-dependent vascular re-sponces // J. Clin. Invest. - 1989. - Vol. 84, №5. - P. 1373-1378.

116.Burnstock G. Local control of blood pressure by purines // Blood Vessels. -1987. - Vol. 24, №3. - P. 156-160.

117.Calvete J.J., Gonzales-Rodrigues J. Isolation and biochemical characterization of the a- and P-subunits of glycoprotein lib of human platelet plasma membrane // Biochem. J. - 1986. - Vol. 240, №1. - P. 155-161.

118.Chang M.C., Yang R.S., Lin C.H. et al. Integrin alpha v beta 3 and phospholipase C regulate prostacyclin formation of endothelial cells caused by ancrod-generated fibrin // Eur. J. Pharmacol. - 1996. - Vol. 297, №1-2. - P. 129-136.

119.Chirkov Y.Y., Chirkova L.P., Sage R.E. et al. Impaired responsiveness of platelets from patients with stable angina pectoris to antiaggregating and cyclicAMP-elevating effects of prostaglandin El // J. Cardiovasc. Pharmacol. -1995.-Vol. 25, №6. -P. 961-966.

120.Colman R.W. Receptors that activate platelets // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. -1991. - Vol. 197, №3. - P. 242-248.

121.Conti M.A., Adelstein R.S. The relationship between calmodulin binding and phosphorylation of smooth muscle myosin kinase by the katalytic subunit of 3',5! cAMP-dependent protein kinase//J. Biol. Chem. - 1981. - Vol. 256. - P. 3178-3181.

122.De Nucci G., Gryglewski R.J., Warner T.D. et al. Receptor-mediated release of endothelium-derived relaxing factor and prostacyclin from bovine aortic endothelial cells is coupled // Proc. Natl. Acad. Sci USA - 1988. - Vol. 85, №4. -P. 2334-2338.

123 .Dean W.L., Chen D., Brandt P.C. et al. Regulation of platelet plasma membrane Ca2+-ATPase by cAMP-dependent and tyrosine phosphorylation // J. Biol. Chem. - 1997. - Vol. 272, №24. - P. 15113-15119.

124.De-Candia E., De-Cristofaro R., De-Marco L. et al. Thrombin interaction with platelet GpIB: role of the heparin binding domain // Thromb. Haemost. - 1997. -Vol. 77, №4.-P. 735-740.

125.Depraetere H., Wille C., Gansemans Y. et al. The integrin alpha 2 beta 1 (GPIa/IIa)-I-domain inhibits platelet-collagen interaction // Thromb. Haemost. -1997. - Vol. 77, № 5. - P. 981-985.

126.Dong J.F., Sae-Tung G., Lopez J.A. Role of glycoprotein V in the formation of the platelet high-affinity thrombin-binding site // Blood. - 1997. - Vol. 89, № 12. -P. 4355-4363.

127.Durante W., Kroll M.H., Christodoulides N. et al. Nitric oxide induces heme oxygenase-1 gene expression and carbon monoxide production in vascular smooth muscle cells // Circ. Res. - 1997. - Vol. 80, № 4. - P. 557-564.

128.Dutta Roy A.K., Sinha A.K. Purification and properties of prostaglandin El/prostacyclin receptor of human platelets // J. Biol. Chem. - 1987. - Vol. 262. -P. 12685-12691.

129.Elangbam C.S., Quails C.W., Dahlgren R.R. Cell adhesion molecules - update // Vet. Pathol. - 1997. - Vol. 34, № 1. - P. 61-73.

130.Ely S.W., Berne R.M. Protective effects of adenosine in myocardial ischemia // Circulation - 1992. - Vol. 85, №3. - P. 893-904.

131.Enyedi A., Sarkadi B., Foldes-Papp Z. et al. Demonstration of two distinct Ca2+ pumps in human platelet membrane vesicles // J. Biol. Chem. - 1986. - Vol. 261. -P. 9558-9563.

132.Fajardo L.F. The complexity of endothelial cells // Am. J. Clin. Pathol. - 1989. -Vol. 92, №2. - P. 241-250.

133.Falet H., Rendu F. Calcium mobilisation controls tyrosine protein phosphorylation independently of the activation of proteinkinase C in human platelets // FEBS Lett. - 1994. - Vol. 345. - P. 87-91.

134.Federici A.B., Bader R., Pagani S. Et al. Binding of von Willebrand factor to glycoproteins lb and Ilb-IIIa complex: affinity is related to multimeric size // Br. J. Haematol. - 1989. - Vol. 73. - P. 93-99.

135.Feinstein M.B., Egan J.J., Shaafi R.I. et al. The cytoplasmic concentration of free calcium in platelets is controlled by stimulators of cyclic AMP production (PG D2, PG El, forskolin) // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1983. - Vol. 113. -P. 598-604.

136.Fenton R.A., Dobson J.G. Measurement by fluorescence of interstitial adenosine levels in normoxic, hypoxic, and ischemic perfused rat hearts // Circ. Res. - 1987. -Vol. 60, №2. - P. 177-184.

137.Feron O., Saldana F., Michel J.B. et al. The endothelial nitric-oxide syntase-caveolin regulatory cycle // J. Biol. Chem. - 1998. - Vol. 273, №6. - P. 3125-3128.

138.Ferris C.D., Cameron A.M., Bredt D.S. et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor is phosphorylated by cyclic AMP-dependent protein kinase at serine 1755 and 1589 //Biochim. Biophys. Res. Commun. - 1991. - Vol. 175. - P. 192-198.

139.Ferris C.D., Huganir R.L., Supattapone S. et al. Purified inositol 1,4,5-trisphosphate receptor mediates calcium flux in reconstituted lipid vesicles // Nature - 1989. - Vol. 342. - P. 87-89.

140.Fisher M.J., Gunn B., Harms C.S. et al. Non-peptide RGD surrogates which mimic a Gly-Asp beta-turn: potent antagonists of platelet glycoprotein Ilb-IIIa // J. Med. Chem. - 1997. - Vol. 40, № 13. - P. 2085-2101.

141.Fleischman L.F., Chahwala S.B., Cantley L. Ras-transformed cells: altered levels of phosphatidyl-inositol 4,5-bisphosphate and catabolites // Science - 1986. -Vol. 231.-P. 407-410.

142.Forsberg E.J., Feuerstein G., Shohami E. et al. Adenosine-triphosphate stimulates inositol-phospholipid metabolism and prostacyclin formation in adrenal medullary endothelial cells by means of P2 purinergic receptors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1987. - Vol. 84. - P. 5630-5634.

143.Freedman J.E., Loscalzo J., Barnard M.R. et al. Nitric oxide released from activated platelets inhibits platelet recruitment // J. Clin. Invest. - 1997. - Vol. 100, №2.-P. 350-356.

144.Frojmovic M.M., Kasirer-Friede A., Goldsmith H.L. et al. Surface-secreted von Willebrand factor mediates aggregation of ADP-activated platelets at moderate shear stress: facilitated by GPIb but controlled by GPIIb-IIIa // Thromb. Haemost. - 1997 - Vol. 77, № 3. - P. 568-576.

145.Furlong B., Henderson A.H., Lewis M.J. et al. Endothelium-derived relaxing factor inhibits in vitro platelet aggregation // Br. J. Pharmacol. - 1987. - Vol. 90. -P. 687-692.

146.Gachet C., Hechler B., Leon C. et al. Activation of ADP receptors and platelet function // Thromb. Haemost. - 1997. - Vol. 78, №1. - P. 271-275.

147.Gallery E.D., Rowe J., Campbell S. Alteration of in vitro human decidual endothelial cell growth, endothelin-1 and prostaglandin secretion, by growth

factors and intracellular calcium // Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids -1996. - Vol. 54, №6. - P. 411-418.

148.Gasser J.A., Cooper M.B., Tan K.C. et al. Decreased sensitivity to adenosine in platelets from patients with familial hypercholesterolaemia - a change reversed by cholestyramine treatment // Eur. J. Clin. Invest. - 1993. - Vol. 23, №12. - P. 803-811.

149.Gosink E.C., Forsberg E.J. Effects of ATP and bradykinin on endothelial cell Ca2+ homeostasis and formation of cGMP and prostacyclin // Am. J. Physiol. -1993. - Vol. 265, №6, Part 1. - P. CI620-1629.

150.Goto S., Ikeda Y., Saldivar E. et al. Distinct mechanisms of platelet aggregation as a consequence of different shearing flow conditions // J. Clin. Invest. - 1998. -Vol. 101, №2.-P. 479-486.

151.Grant P.G., Colman R.W. Purification and characterisation of a human platelet cyclic nucleotide phosphodiesterase //Biochemistry - 1984. - Vol. 23. - P. 1801-1807.

152.Greco N.J., Jones G.D., Tandon N.N. et al. Differentiation of the two forms of GP lb functioning as receptors for alpha-thrombin and von Willebrand factor // Biochemistry - 1996. - Vol. 35, №3. - P. 915-921.

153.Grenegard M., Gustaffson M.C., Andersson R.G. et al. Synergistic inhibition of thrombin-induced platelet aggregation by the novel nitric oxide-donor GEA 3175 and adenosine // Br. J. Pharmacol. - 1996. - Vol. 118, №8. - P. 2140-2144.

154.Grynkiewicz G., Poenie M., Tsien R.Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties // J. Biol. Chem. - 1985. - Vol. 260, №6. - P. 3440-3450.

155.Gurubhagavatula I., Amrani Y., Pratico D. et al. Engagement of human PEC AM-1 (CD31) on human endothelial cells increases intracellular calcium ion concentration and stimulates prostacyclin release // J. Clin. Invest. - 1998. - Vol. 101, №1.-P. 212-222.

156.Hack N., Croset M., Crawford N. Studies on the bivalent cation activated ATPase activities of highly purified human platelet surface and intracellular membranes // Biochem. J. - 1986. - Vol. 233. - P. 661-668.

157.Halenda S.P., Rehm A.G. Thrombin and C-kinase activators potentiate calcium-stimulated arachidonic acid release in human platelets // Biochem. J. - 1987. - Vol. 248.-P. 471-475.

158.Hallam T.J., Rink TJ. Agonists stimulate divalent cation channels in the plasma membrane of human platelets // FEBS Letters - 1985. - Vol. 186, №2. - P. 175-179.

159.Hamilton C.A., Reid J.L. Platelet a-adrenoceptors - a valid model for brrain or vascular adrenoceptors? // Br. J. Pharmacol. - 1986. - Vol. 22. - P. 623-626.

160.Hannum Y.A., Bell R.M. Lysosphingolipids inhibit protein kinase C: implications for the sphingolipidoses // Science - 1987. - Vol. 235. - P. 670-674.

161.Hannum Y.A., Loomis C.R., Merril A.H. et al. Spingosine inhibition of protein kinase C activity and of phorbol dibutyrate binding in vitro and in human platelets // J. Biol. Chem. - 1986. - Vol. 261. - P. 12604-12609.

162.Hato T., Oda A., Ozaki Y. et al. Outside-in signaling from integrin alpha lib beta 3 into platelets in the absence of agonist-induced signaling // Int. J. Hematol. -1997. - Vol. 65, № 4. - P. 385-395.

163.Himmel H.M., Whorton A.R., Strauss H.C. Intracellular calcium, currents, and stimulus-response coupling in endothelial cells // Hypertension - 1993. - Vol. 21, №1. - P. 112-127.

164.Holmsen H. Significance of testing platelet functions in vitro // Eur. J. Clin. Invest. - 1994. - Vol. 24, Suppl. 1. - P. 3-8.

165.1rvine R.F. "Quantal" calcium release and the control of Ca2+ entry by inositol phosphates: a possible mechanism // FEBS Letters - 1990. - Vol. 263. - P. 5-9.

166.1rvine R.F., Letcher A.J., Lander D.J. et al. Inositol trisphosphates in carbachol-stimulated rat parotid glands // Biochem. J. - 1984. - Vol. 223. - P. 237-243.

167.1shii H., Connoly T.M., Bross T.E. et al. Inositol cyclic trisphosphate (inositol l,2(cyclic)-4,5-triphosphate) is formed upon thrombin stimulation of human platelets // Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 1986. - Vol. 83. - P. 6397-6401.

168.Jamieson G.A. Pathophysiology of platelet thrombin receptors // Thromb. Haemost. - 1997. - Vol. 78, № 1. - P. 242-246.

169 Jennings L.K., Philips D.R. Purification of glycoproteins lib and III from human plasma membranes and characterisation of a calcium-dependent glycoprotein Ilb-III complex // J. Biol. Chem. - 1986. - Vol. 100, №4. - P. 1077-1085.

170.Jeremy J.Y., Barradas M.A., Mikhailidis D.P. The effect of nifedipine, ni-modipine and nisoldipine on agonist- and trauma-stimulated vascular prostacyclin synthesis in vitro // Brit. J. Clin. Pharmacol. - 1986. - Vol. 22, №2. - P. 201-202.

171.Kaibuchi K., Takai Y., Sawamura M. et al. Synergistic function of protein phosphorylation and calcium mobilisation in platelet activation // J. Biol. Chem. -1983. - Vol. 258. - P. 6701-6704.

172.Kajikawa N., Kaibuchi K., Matusubara T. et al. A possible role of proteinkinase C in signal-induced lysosomal enzyme release // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1983. - Vol. 116. - P. 743-750.

173.Kanamaru K., Waga S., Kojima T. et al. Endothelium-dependent relaxation of canine basilar arteries. Inhibition by hemoglobin // Stroke - 1987. - Vol. 18. - P. 938-943.

174.Kinsella B.T., O'Mahony D.J., Fitzgerald G.A. The human thromboxane A2 receptor alpha isoform (TP alpha) functionally couples to the G proteins Gq and G11 in vivo and is activated by the isoprostane 8-epi prostaglandin F2 alpha // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 1997. - Vol. 281, № 2. - P. 957-964.

175.Kishi F., Nakaya Y., Takahashi A. et al. Intracellular and extracellular Ca2+ regulate histamine-induced release of nitric oxide in vascular endothelial cells as shown with sensitive and selective nitric oxide electrodes // Pharmacol. Res. -1996. - Vol. 33, №2. - P. 123-126.

176.Kishimoto A., Takai Y., Terutoshi M. et al. Activation of calcium and phospholipid-dependent protein kinase by diacylglycerol, its possible relation to phosphatidylinositol turnover // J. Biol. Chem. - 1980. - Vol. 255. - P. 2273-2776.

177.Knight D.E., Scrutton M.C. Cyclic nucleotides control a system which regulates Ca2+ sensitivity of platelet secretion // Nature - 1984. - Vol. 309. - P. 66-68.

178.Koch K.W., Stryer L. Highly cooperative feedback control of retinal rod guanilate cyclase by calcium ions // Nature - 1988. - Vol. 334. - P. 64-72.

179.Kroll M.H., Schafer A.I. Biochemical mechanisms of platelet activation // Blood - 1989. - Vol. 74, №4. - P. 1181-1195.

180.Kroll M.H., Zavoico G.B., Schafer A.I. Control of platelet proteinkinase C activation by cyclic AMP // Biochim. Biophys. Acta - 1988. - Vol. 970. - P. 61-67.

181.Lapetina E.G. Incorporation of synthetic 1,2-diacylglycerol into platelet phosphatydilinositol is increased by cyclic AMP // FEBS Lett. - 1986. - Vol. 195. -P. 111-114.

182.Lapetina E.G., Siegel F.L. Shape change induced in human platelets by platelet-activating factor // J. Biol. Chem. - 1983. - Vol. 258. - P. 7241-7244.

183.Le Cras T.D., Tyler R.C., Horan M.P. et al. Effects of chronic hypoxia and altered hemodynamics on endothelial nitric oxide synthase expression in the adult rat lung // J. Clin. Invest. - 1998. - Vol. 101. - P. 795-801.

184.Ledent C., Vaugeois J.M., Cchiffman S.N. et al. Aggressiveness, hypoalgesia and high blood pressure in mice lacking the adenosine A2a receptor // Nature. -1997. - Vol. 388, №6643. - P. 674-678.

185.Lerea K.M., Glomset J.A., Krebs E.G. Agents that elevate cAMP levels in platelets decrease thrombin binding // J. Biol. Chem. - 1987. - Vol. 262. - P. 282-288.

186.Loeb L.A., Gross R.W. Identification and purification of sheep platelet phospholipase A2 isoforms // J. Biol. Chem. - 1986. - Vol. 261. - P. 10467-10470.

187.MacDonald P.S., Read M.A., Dusting D.J. Synergistic inhibition of platelet aggregation by endothelium-derived relaxing factor and prostacyclin // Thromb. Res. - 1988. - Vol. 49. - P. 437-449.

188.MacIntyre D.E., McNichol A., Drummond A.H. Tumour-promoting phorbol esters inhibit agonist-induced phosphatidate formation and Ca2+ flux in human platelets //FEBS Lett. - 1985. - Vol. 180. - P. 160-164.

189.Mahadevappa V.G., Holub B.J. Diacylglycerol lipase pathway is a minor source of released arachidonic acid in thrombin-stimulated human platelets // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1986. - Vol. 134. - P. 1327-1333.

190.Marcinkiewicz C., Vijay-Kumar S., McLane M.A. et al. Significance of RGD loop and C-terminal domain of echistatin for recognition of alphallb beta3 and

alpha(v) beta3 integrins and expression of ligand-induced binding site 11 Blood. -1997. - Vol. 90, № 4. P. - 1565-1575.

191.Mellwig K.P., Jakobs K.H. Inhibition of adenylate cyclase by ADP // Thromb. Res. - 1980. - Vol. 18.-P. 7-17.

192.Mills D.C.B. ADP receptors on platelets // Thromb. Haemost. - 1996. - Vol. 76. -P. 835-856.

193.Molino M., Bainton D.F., Hoxie J.A. et al. Thrombin receptors on human platelets. Initial localization and subsequent redistribution during platelet activation // J. Biol. Chem. - 1997. - Vol. 272, №9. - P. 6011-6017.

194.Monge A., Aldana I., Losa M.J. et al. A novel class of cardiotonic agents: synthesis and biological evaluation of pyridazino[4,5-b]indoles with cyclic AMP phosphodiesterases inhibiting properties // J. Pharm. Sci. - 1993. - Vol. 82, №5. -P. 526-530.

195.Moroi M., Jung S.M. Platelet receptors for collagen // Thromb. Haemost. - 1997. -Vol. 78, № 1,-P. 439-444.

196.Munzel T., Heitzer T., Harrison D.G. The physiology and pathophysiology of the nitric oxide/superoxide system // Herz. - 1997. - Vol. 22, № 3. - P. 158-172.

197.Naik U.P., Patel P.M., Parise L.V. Identification of a novel calcium-binding protein that interacts with the integrin alphallb cytoplasmic domain // J. Biol. Chem. - 1997. - Vol. 272, № 8. - P. 4651-4654.

198.Nakamura T., Ariyoshi H., Kambayashi J. et al. Effect of low concentration of epinephrine on human platelet aggregation analyzed by particle counting method and confocal microscopy // J. Lab. Clin. Med. - 1997. - Vol. 130, № 3. - P. 262-270.

199.Nakashima S., Tohmatsu T., Hattori H. et al. Inhibitory action of cyclic GMP on secretion, polyphosphoinositide hydrolysis, and calcium mobilisation in thrombin-stimulated human platelets // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1986. - Vol. 135.-P. 1099-1107.

200.Needleman P., Turk J., Jakschik B.A. et al. Arachidonic acid metabolism // Annu. Rev. Biochem. - 1986. - Vol. 55. - P. 820-826.

201.Neer E.J., Clapham D.E. Roles of G protein subunits in transmmbrane signalling // Nature - 1988. - Vol. 333. - P. 129-134.

202.Newman P.J., McEver R.D., Doers M.P. et al. Synergistic action of two murine monoclonal antibodies that inhibit ADP-induced platelet aggregation without blocking fibrinogen binding // Blood - 1987. - Vol. 69, №2. - P. 668-676.

203.Niewenhius H.K., Akkerman J.W.N., Houdijk W.P.M. et al. Human blood platelets showing no response to collagen fail to express suurface glycoprotein la //Nature - 1985. - Vol. 318. - P. 470-472.

204.Niiya K., Hodson E., Bader R. et al. Increased surface expression of the membrane glycoprotein Ilb/IIIa complex induced by platelet activation // Blood -1987. - Vol. 70. - P. 475-483.

205.Nurden A.T., Nurden P. A review of the role of platelet membrane glycoproteins in the platelet-vessel wall interaction // Baillieres. Clin. Haematol. - 1993. - Vol. 6, №3. - P. 653-690.

206.O'Brien J.R. Platelet aggregation. Some results of a new study // J. Clin. Pathol. -1962.-Vol. 15.-P. 452-455.

207.0dawara A., Kikkawa K., Katoh M. et al. Inhibitory effects of TA-933, a new 1,5-benzothiazepine derivative, on platelet aggregation // Circ. Res. - 1996. - Vol. 78, №4. - P. 643-639.

208.0hkubo S., Nakahata N., Ohizumi Y. Thromboxane A2-mediated shape change: independent of Gq-phospholipase C-Ca2+ pathway in rabbit platelets // Br. J. Pharmacol. - 1996. - Vol. 117, №6. - P. 1095-1104.

209.0'Rourke F., Zavoico G.B., Smith J.H. et al. Stimulus-response coupling in a cell-free platelet membrane system // FEBS Lett. - 1987. - Vol. 214. - P. 176-180.

210.Packham M.A., Bryant N.L., Guccione M.A. et al. Effect of concentration of Ca2+ in the suspending medium on the responces of human and rabbit platelets to aggregating agents // Thromb. Haemost. - 1989. - Vol. 62. - P. 968-976.

211.Palmer R.M., Moncada S. A novel citruline-forming enzyme implicated in the formation of nitric oxide in vascular endothelial cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1989. - Vol. 158, №4. - P. 348-352.

212.Papapetropulos A., Garcia-Cardena G., Madri J.A., Sessa W.C. Nitric oxide production contributes to the angiogenic properties of vascular endothelial growth factor in human endothelial cells // J. Clin. Invest. - 1997. - Vol. 100, №12. - P. 3131-3139.

213.Parsaee H., McEwan J.R., MacDermot J. Bradykinin-induced release of PG122 from aortic endothelial cell lines: responses mediated selectively by Ca2+ ions or a staurosporine-sensitive kinase // Br. J. Pharmacol. - 1993. - Vol. 110, №1. - P. 411-415.

214.Pearson J.D., Carleton J.S., Gordon J.L. Metabolism of adenine nucleotides by ectoenzymes of vascular endothelial and smooth-muscle cells in culture // Biochem. J. - 1980. - Vol. 180, №2. - P. 421-429.

215.Pellegatta F., Folli F., Ronchi P. Et al. Deranged platelet calcium homeostasis in poorly controlled IDDM patients // Diabetes care. - Vol. 16, №1. - P. 178-183.

216.Perez-de-Leon A.A., Tabachnick W.J. Apyrase activity and adenosine diphosphate induced platelet aggregation inhibition by the salivary gland proteins of Culicoides variipennis, the North American vector of bluetongue viruses // Vet. Parasitol. - 1996. - Vol. 61, № 3-4. - P. 327-338.

217.Peters J.R., Grahame-Smith D.G. Human 5-HT receptors: characyerisation and functional association // Eur. J. Pharmacol. - 1980. - Vol. 68. - P. 243-256.

218.Plow E.F., Marguerie G.A. Induction of the fibrnogen receptor on human platelets by epinrphrine and the combination of epinephrine and ADP // J. Biol. Chem. - 1980. - Vol. 255. - P. 10971-10979.

219.Prescott S.M., Majerus P.W. The fatty acid composition of phosphatidylinositol from thrombin-stimulated human platelets // J. Biol. Chem. - 1981. - Vol. 256. - P. 579-586.

220.Putney J.W. A model for receptor regilated calcium entry // Cell Calcium - 1986. -Vol. 7. - P. 1-12.

221.Radomski M.W., Palmer R.M., Moncada S. The anti-aggregating properties of vascular endothelium: the interactions between prostacyclin and nitric oxide // Br. J. Pharmacol. - 1987. - Vol. 92. - P. 639-646.

222.Ravanat C., Morales M., Azorsa D.O. et al. Gene cloning of rat and mouse platelet glycoprotein V: identification of megakaryocyte-specific promoters and demonstration of functional thrombin cleavage // Blood. - 1997. - Vol. 89, № 9. -P. 3253-3262.

223.Rengasamy A., Feinberg H. Platelet Ca2+ homeostasis; Na+/Ca2+ exchange in plasma membrane vesicles // Thromb. Haemost. - 1987. - Vol. 57. - P. 337-340.

224.Riddell D.R., Graham A., Owen J.S. Apolipoprotein E inhibits platelet aggregation through the L-arginine:nitric oxide pathway. Implications for vascular disease // J. Biol. Chem. - 1997 - Vol. 272, №1. - P. 89-95.

225.Rink T.J., Smith S.W., Tsien R.Y. Cytoplasmic free Ca2+ in human platelets: Ca2+ thresholds and Ca-independent activation for shape-change and secretion // FEBS Lett. - 1982. - Vol. 148, № 1. - P. 21-26.

226.Rink T.J., Smith S.W. Inhibitory prostaglandins supress Ca2+ influx, the release of intracellular Ca2+ and the responsiveness to cytoplasmic Ca2+ in human platelets // J. Physiol. - 1983. - Vol. 338. - P. 66P-67P.

227.Robson S.C., Kaczmarek E., Siegel J.B. et al. Loss of ATP diphosphohydrolase activity with endothelial cell activation // J. Exp. Med. - 1997. - Vol. 185, №1. - P. 153-163.

228.Rooney T.A., Sass E.J., Thomas A.P. Agonist-induced cytosolic calcium oscillations originate from a specific locus in single hepatocytes // J. Biol. Chem. -1990. - Vol. 265, №18. - P. 10792-10796.

229.Rudic R.D., Shesely E.G., Maeda N. et al. Direct evidence for the importance of endothelium-derived nitric oxide in vascular remodeling // J. Clin Invest. - 1998. -Vol. 101, №4.-P. 731-736.

230.Ruggeri Z.M. New insights into the mechanism of platelet adhesion and aggregation // Seminars Hematol. - 1994. - Vol. 31, №3. - P. 229-239.

231 .Ruoslahti E., Pierschbacher M.D. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins // Science - 1987. - Vol. 238. - P. 491-497.

232.Sage S.O., Merrit J.E., Hallam T.J. et al. Receptor mediated Ca2+ entry in Fura-2 loaded human platelets stimulated with ADP and thrombin // Biochem. J. - 1989. -Vol. 258.-P. 923-926.

233.Sage S.O., Rink T.J. Kinetic differences between thrombin induced and ADP induced calcium influx and release from internal stores in Fura-2 loaded human platelets // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1986. - Vol. 136. - P. 1124-1129.

234.Savage B., Shattil S.J., Ruggeri Z.M. Modulation of platelet function through adhesion receptors: a dual role for glycoprotein Ilb-IIIa (integrin allb(33) mediated by fibrinogen and glycoprotein Ib-von Willebrand factor // J. Biol. Chem. - 1992. -Vol. 267. - P. 11300-11306.

235.Schafer A.I. Antiplatelet therapy with glycoprotein Ilb/IIIa receptor inhibitors and other novel agents // Tex. Heart. Inst. J. - 1997. - Vol. 24, № 2. - P. 90-96.

236.Schafer A.I. Vascular endothelium: in defence of blood fluidity // J. Clin. Invest. - 1997. - Vol. 99, №6. - P. 1143-1144.

237.Schmitz G., Hankowitz J., Kovacs E.M. Cellular processes in atherogenesis: potential targets of Ca2+ channel blockers // Atherosclerosis - 1991. - Vol. 88. - P. 109-132.

238.Scrutton M.C. Platelet as a Ca2+-driven cell: mechanisms which may modulate Ca2+-driven responces // In: Authi K.S., Watson S.P., Kakkar V.V. eds. Mechanisms of platelet activation and control. - Plenum press New York and London, 1993. - P. 1-16.

239.Seuter F., Scriabine A. Platelets and platelet aggregation inhibitors // In: Cardiovascular Pharmacology. - N.Y., 1984. - P. 475-518.

240.Shattil S.J., Brass L.F. Induction of the fibrinogen receptor on human platelets by intracellular mediators // J. Biol. Chem. - 1987. - Vol. 262. - P. 992-1000.

241.Shattil S.J., Gao J., Kashiwagi H. Not just another pretty face: regulation of platelet function at the cytoplasmic face of integrin alpha lib beta 3 // Thromb. Haemost. - 1997. - Vol. 78, № 1. - P. 220-225.

242.Sheth S.B., Colman R.W. Regulatory and catalytic domains of platelet cAMP phosphodiesterases: targets for drug design // Seminars Hematol. - 1995. - Vol. 32, №2.-P. 110-119.

243.Smyth S.S., Joneckis C.C., Parise L.V. Regulation of vascular integrins // Blood - 1993.-Vol. 81, №11.-P. 2827-2843.

244.Sonnenberg A., Modderman P.W., Hogervorst F. Laminin receptor on platelets is the integrin VLA-6 // Nature - 1988. - Vol. 336. - P. 487-489.

245.Spigset O., Mjorndal T. Serotonin 5-HT2A receptor binding in platelets from healthy subjects as studied by [3H]-lysergic acid diethylamide ([3H]-LSD): intra-and interindividual variability // Neuropsychopharmacology. - 1997. - Vol. 16, №4.-P. 285-293.

246.Staatz W.D., Rajpara S.M., Wayner E.A. et al. The membrane glycoprotein Ia-Ila complex mediates the Mg++ dependent adhesion of platelets to collagen // J. Cell Biol. - 1989. - Vol. 108. - P. 1917-1924.

247.Steen V.M., Holmsen H., Aarbakke G.M. The platelet-stimulating effect of adrenaline through a2-adrenergic receptors requires simultaneous activation by a true stimulatory platelet agonist. Evidence that adrenaline per se does not induce human platelet activation in vitro // Thromb. Haemost. - 1993. - Vol. 70. - P. 506-513.

248.Stender S., Andersen M.R. Endothelial nitric oxide synthase activity in vascular endothelial cells from normo-cholesterolemic rabbits // XI international symposium on atherosclerosis. - Paris, 1997. - P. 238.

249.Takamatsu J., Home M.K., Gralnick H.R. Identification of the thrombin receptor on human platelets by chemical crosslinking // J. Clin. Invest. - 1986. - Vol. 77. -P. 362-368.

250.Touqui L., Rothhut B., Shaw A.M. et al. Platelet activation - a role for a 40K antiphospholipase A2 protein indistinguishable from lipocortin // Nature - 1986. -Vol. 321.-P. 177-180.

251.Tsai A.-L., Hsu M.-J., Vijjeswarapu H. et al. Solubilization of prostacyclin membrane receptors from human platelets // J. Biol. Chem. - 1989. - Vol. 264. - P. 61-67.

252.Tsien R.Y. New calcium indicators and buffers wiyh high selectivity against magnesium and protons: design and properties of prototype structures // Biochemistry - 1980. - Vol. 19. - P. 2396-2404.

253.Tsuji T., Osawa T. Purification and chemical characterisation of human platelet membrane glycoprotein IV // Biochem. J. - 1986. - Vol. 100, №4. - P. 1077-1085.

254.Vane J.R., Anggard E.E., Botting R.M. Regulatory functions of the vascular endothelium // New Engl. J. Med. - 1990. - Vol. 323, №1. - P. 27-36.

255.Watanabe T., Hashimoto Y., Teramoto T. et al. Calmodulin-independent inhibition of platelet phospholipase A2 by calmodulin antagonists // Arch. Biochem. Biophys. - 1986. - Vol. 246. - P. 699-709.

256.Watson S.P., Blake R.A., Walker T.L. et al. The use of inhibitors of protein kinases and protein phosphatases to investigate the role of protein phosphorylation in platelet actination // In: Authi K.S., Watson S.P., Kakkar V.V. eds. Mechanisms of platelet activation and control. - Plenum press New York and London, 1993. -P. 105-118.

257.Williams J.A., Ashby B., Daniel J.D. Ligands to the platelet fibrinogen receptor glycoprotein Ilb-IIIa do not affect agonist-induced second messengers Ca2+ or cyclic AMP // Biochem. J. - 1990. - Vol. 270. - P. 149-155.

258.Youssefian T., Masse J.M., Rendu F. et al. Platelet and megakaryocyte dense granules contain glycoproteins lb and Ilb-IIIa // Blood. - 1997. - Vol. 89, № 11. -P. 4047-4057.

259.Zavoico G.B., Cragoe E.J., Feinstein M.B. Regulation of intracellular pH in human platelets//J. Biol. Chem. - 1986. - Vol. 2661. - P. 13160-13167.