Регуляция Ca2+ токов L-типа L-аргинином через активацию α2-адренорецепторов в изолированных желудочковых кардиомиоцитах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Ненов, Мирослав Николаевич

• Ненов, Мирослав Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ненов, Мирослав Николаевич

Список сокращений

Введение

1 .Обзор литературы

1.1.L-Аргинин

1.1.1. Действие L-аргинина на сердечно-сосудистую систему в экспериментальных и клинических исследованиях

1.1.2. «Аргининовый парадокс» 1 з

1.2. NO-синтазы и NO-cGMP сигнальный каскад

1.2.1. Классификация, характеристика и структура NO-синтаз

1.2.2. Регуляция активности NO-синтаз

1.2.3 Роль конститутивных NO-синтаз в сердце

1.2.4 Оксид азота - NO

1.2.5 Биологические эффекты NO

1.2.6 Гуанилатциклаза

1.2.7 cGMP-зависимая протеинкиназа

1.3. Типы потенциал-зависимых Са -каналов и их классификация

1.3.1. Структура потенциал-зависимых Са2+-каналов

1.3.2. Регуляция Са2+ канала L-типа серин/треониновыми протеинкиназами

2. Материалы и методы исследования

2.1. Выделение клеток

2.2. Метод перфорированного пэтча

2.2.1. Растворы

2.2.2. Приготовление и заполнение пипеток

2.2.3. Регистрация токов

2.3. Флуоресцентная микроскопия

2.3.1. Прокраска клеток

2.3.2. Измерение продукции N0 и [Са2+]г 54 3. Результаты и обсуждения

3.1. Исследование действия L-аргинина на базальную амплитуду Са2+ тока L-типа в изолированных кардиомиоцитах крыс Spraque Dawlay

3.2. Исследование действия L-аргинина на базальную амплитуду Са2+ тока L-типа в изолированных кардиомиоцитах крыс SD на фоне ингибиторов NO-cGMP каскада

3.3. Исследование действия L-аргинина па базальную амплитуду Са2+ тока L-типа в изолированных кардиомиоцитах крыс SD на фоне антагонистов а2-адренорецепторов и ингибиторов PI3K-Akt сигнального каскада

3.4. Исследование действия агматина на базальную амплитуду

Са2+ тока L-типа в изолированных кардиомиоцитах крыс SD

3.5. Исследование действия гуанабенц ацетата на базальную амплитуду Са2+ тока L-типа в изолированных кардиомиоцитах крыс SD на фоне ингибиторов PI3K-akt и NO-cGMP сигнальных каскадов

3.6. Исследование действия L-аргинина и гуанабенц ацетата на базальную амплитуду Са2+ тока L-типа в изолированных кардиомиоцитах крыс SHR

3.7. Изменение скорости продукции оксида азота в кардиомиоцитах при дополнительном введении 5шМ аргинина или гуанабенц ацетата на фоне электрической стимуляции в кардиомиоцитах крыс SD и SHR 80 Заключение

Выводы

Цитируемая литература

Список сокращений. сАМР - циклический аденозинмонофосфат cGMP - циклический гуанозинмонофосфат

РКА - сАМР-зависимая протеинкиназа (протеинкиназа А)

РКВ - протеинкиназа В (протеинкиназа Akt)

PKG - cGMP-зависимая протеинкиназа (протеинкиназа G)

РКС - протеинкиназа С

PDE - фосфодиэстераза

PI3K - фосфотидилинозитол-3 киназа

PDK - фосфотидилинозитол-зависимая киназа

NFAT - ядерный фактор активированных Т-клеток

NOS - NO-синтаза nNOS - нейрональная NO-синтаза eNOS - эндотелиальная NO-синтаза iNOS - индуцибельная NO-синтаза

СаМ - кальмодулин sGC - цитозольная гуанилатциклаза

SD - Spraque Dawlay крысы

SHR - спонтанно-гипертензивные крысы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Регуляция Ca2+ токов L-типа L-аргинином через активацию α2-адренорецепторов в изолированных желудочковых кардиомиоцитах»

L-аргинин - условно незаменимая аминокислота, которой наука и медицина в последние десятилетия уделяет большое внимание. Исследования по действию L-аргинина па сердечно-сосудистую систему показывают, что данная аминокислота может использоваться в качестве профилактики и при лечении сердечнососудистых заболеваний - стенокардии, гипертензии, коронарной болезни, гипертрофии миокарда, сердечной недостаточности и т.д. (Appleton J., 2002; Gornik H.L. and Creager M.A., 2004). В организме из L-аргинина группой ферментов NO-синтаз синтезируется оксид азота (N0). Оксид азота активирует гуанилатциклазу, что приводит к росту cGMP и активации протеинкиназы G (NO-cGMP сигнальный каскад). Большинство эффектов L-аргинина связаны с модуляцией активности NO-синтаз и NO-cGMP каскада. Отклонения от нормы в синтезе NO и нарушения biзапускаемом им NO-cGMP каскаде могут приводить к развитию гипертензии, эректильной дисфункции, сердечной недостаточности, гипертрофии миокарда и т.д. Часто, эти процессы могут сопровождаться нарушением в работе Са2+-транспортирующих систем, регулируемых NO-cGMP сигнальным каскадом. Так известно, что в сердечнососудистой системе NO-cGMP каскад принимает участие в модуляции активности Са2+ каналов L-типа, которые играют важную роль в формировании потенциала действия, электромеханическом сопряжении, регуляции частоты и силы сердечных сокращений. Нарушения в работе NO-cGMP каскада могут приводить к Са2+ перегрузке кардиомиоцитов, связанной с Са2+ каналами L-типа и активации сигнальных каскадов (кальциньюрин/NFAT сигнальный каскад), принимающих участие в развитие нефункциональной гипертрофии миокарда, что в'Конечном счете может приводить к сердечной недостаточности (Kempf Т. end'Wollert К. С., 2004). Нарушения в работе NO-cGMP каскада и Са2+ каналов L-типа отмечается у спонтанно-гипертензивных крыс (Shorofsky S.R. et. а!.,

1999). Также значительные нарушения Са2+ гомеостаза и изменения в функционировании Са каналов L-типа отмечаются у животных с нокаутами по генам NO-синтаз (Wang Н. et. al., 2008). Поэтому при исследовании функционирования NO-cGMP каскада в сердечнососудистой системе, для целости картины, нужно пытаться учитывать как модуляцию синтеза NO и N0у. cGMP каскада, так и регуляцию им Са транспорта.

Однако, исследования о влиянии NO-cGMP каскада на активность Са2+ канала L-типа носят противоречивый характер, доноры оксида азота и активаторы протеинкиназы G либо не оказывают эффект на Са2+ токи, либо ингибируют их, либо активируют. Столь противоречивые результаты связывают как с прямым нитрозилированием Са2+ канала L-типа, так и с рефляцией его фосфорилирования cGMP-завиеимыми фосфодиэстеразами II и

III типа и протеинкиназой G (Gallo М.Р. et al., 1998; Imai Y. et al., 2001; Mery

P.F. et al, 1991; Hartzell H.C. and Fischmeister R., 1986; Fishmeister R. and Hartzell

H.C., 1987; Sumii K. and Sperelakis N., 1995; Tohse N. and Sperelakis N., 1991).

Расхождения в результатах объяснялись особенностями регуляции Са2+ каналов в синусе, предсердиях, желудочках или в разных видах животных.

Противоречивые результаты наблюдались и при' исследовании животных с нокаутами по генам NO-синтаз (Vandecasteele G. et. al., 1999; Wang H. et. al.,

2008). Одной из причин различных результатов также может быть отсутствие Lаргинина (субстрата NO-синтаз) в экспериментальных средах. Так показано, что добавление этой аминокислоты в экспериментальный раствор улучшает брадикинин-вызванную продукцию NO и подавление изопротеренол

21. актививированных Са каналов L-типа интерликином-1 (Rozanski G.J. and Witt R.C., 1994; Flam B.R. at. ah, 2001).

Следует учесть, что на сегодняшний день также' не до конца понятна регуляция активности NO-синтаз и NO-cGMP каскада L-аргинином. Положительные эффекты L-аргинина, оказываемые им при лечении ряда заболеваний и связанные с регуляцией активности NO-синтаз, вызывают большой интерес в научном сообществе. В организме уже содержится достаточное количество L-аригинина для поддержания нормальной активности NO-синтаз. Так содержание L-аргинина в плазме крови достигает 400мкМ, а эндотелиальные клетки могут накапливать его до 2 мМ, при этом Km всех форм NO-синтаз для L-аргинина варьирует в пределах 2-10 мкМ. Тем не менее, экзогенно-добавленный in vivo, in situ и in vitro L-аргинин способен модулировать активность NO-синтазы, в научной литературе этот феномен известен как «аргининовый парадокс». Ситуация осложняется тем, что на сегодняшний день существует несколько гипотез о природе «аргининового парадокса»: недоступность внутриклеточного пула L-аргинина и близкое расположение NO-синтазы и переносчика L-аргинина (McDonald К.К. et. al. 1997; Li С. et. al., 2005); конкуренция NOS и аргиназы за субстрат (Li Н. et. al., 2001; Zhang С. et. al., 2001; Chicoine L.G. et. al., 2004); повышенное содержание конкурентного ингибитора - ассиметричного диметиларгинина (Boger R.H. 2004); действие L-аргинина через а2-адренорецепторы, модулирующие активность NOS (Joshi M.S. et al., 2007). Последняя гипотеза основана на том, что L-аргинин содержит гуанидиновую группу, поэтому существует вероятность взаимодействия L-аргинина или его декарбоксилированного производного - агматина с рецепторами, имеющими сродство к гуанидинам. Гипотеза рецепторного действия L-аргинина является последней по времени И' интересна тем, что, в отличие от предыдущих, не связана с субстратным действием L-аргинина. Настоящая работа является логическим продолжением работ,, проводящихся в нашей группе. В данной' работе уделяется особое I внимание как регуляции Са тока L-типа, так и NO-cGMP каскада L-аргинином в контексте «аргининового парадокса».

Цель данной работы - изучение возможности действия L-аргинина через а2-адренорецепторы на активность NO-cGMP каскада и на амплитуду Са2+токов L-типа в изолированных кардиомиоцитах в норме и патологии. Задачи исследования:

1. Подобрать условия в которых эффект L-аргинина на амплитуду Са2+тока L-типа будет максимальным. Оценить, связан ли эффект, оказываемый L-аргинином на Са2+ток, с NO-cGMP сигнальным каскадом.

2. Исследовать рецепторную гипотезу «аргининового парадокса» т.е. влияние L-аргинина на активность NO-cGMP каскада и амплитуду Са2+ тока L-типа через его воздействие на а2-адренорецепторы.

3. Исследовать действие агматина, на амплитуду Са2+тока L-типа.

4. Исследовать рецепторную гипотезу «аргининового парадокса» и активность NO-cGMP каскада в изолированных кардиомиоцитах спонтанно-гипертензивных крыс.

1. Обзор литературы 1.1. L-Аргинин.

L-Аргинин впервые был выделен из семян люпина в 1886 году, а в 1895 его идентифицировали как компонент животных белков. Аргинин (условно незаменимая аминокислота) в организме млекопитающих используется не только для синтеза белков, но и является предшественником креатина, мочевины и таких сигнальных молекул, как оксид азота (N0), глутамат и агматин. Аргинин (а-амино-8-гуанидино-валериановая кислота) одна из самых поляризованных, положительно заряженных аминокислот.

L-аргинин единственный субстрат в организме, из которого может синтезироваться N0. Синтез оксида азота из L-аригинина осуществляется группой ферментов NO-синтаз (NOS). Существуют три формы NO-синтаз -конститутивные, эндотелиальная - eNOS и нейрональная nNOS и индуцибельная (iNOS) (Alderton W.K. et al., 2001). Синтезируемый, оксид азота взаимодействует со своими мишенями, в частности с цитозольной гуанилатциклазой (sGC). Активированная оксидом азота sGC производит цГМФ из ГТФ. цГМФ в свою очередь активирует цГМФ-зависимую протеинкиназу (протеинкиназа G, PKG). Оксид азота играет важную роль в поддержании нормального функционирования сердечнососудистой системы. Нарушение в синтезе N0 часто сопутствуют различного рода сердечнососудистых заболеваний, поэтому L-аргинин широко используется при лечении и профилактики данных патологий (Appleton J., 2002).

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Ненов, Мирослав Николаевич

Выводы:

1. L-аргинин в концентрации 5мМ эффективно подавляет пиковую

2+ амплитуду Са токов L-типа в изолированных кардиомиоцитах SD. Действие

2+

L-аргинина на Са ток реализуется через NO-cGMP каскад.

2. а^-адренорецепторы принимают участие в реализации «аргининового парадокса» в изолированных кардиомиоцитах SD. L-аргинин, взаимодействуя с о^-адренорецепторами через PI3K-Akt сигнальный путь,

2+ активирует NO-cGMP каскад и подавляет амплитуду С а тока L-типа.

2+

3. Эффект агматина на амплитуду Са тока L-типа не связан с его действием на а2-адренорецепторы и NO-синтазу

4. В кардиомиоцитах SHR «аргининовый парадокс» отсутствует. Скорость

2+ продукции оксида азота и амплитуда Са тока L-типа не изменяются в ответ на добавление L-аргинина. Реактивность а -адренорецепторов снижена.

Заключение

Основной проблемой в исследовании регуляции Са" каналов L-типа NO-cGMP каскадом было большое разнообразие получаемых результатов. Противоречия объяснялись либо спецификой cGMP-завиеимой регуляции у различных типов клеток и разных видов животных, либо различиями в экспериментальных методах. Нами было предположено, что при отсутствии в рабочих средах единственного эндогенного источника NO - L-аргинина. происходит изменение в функционировании NO-cGMP каскада, что и приводит к противоречивым результатам. Действительно, в наших экспериментах в условиях без L-аргинина также не наблюдалось какого-либо значимого эффекта при добавлении L-аргинина (1-5мМ). В присутствии 1мМ

L-аргинина во всех рабочих средах добавка 5мМ L-аргинина приводила к ji подавлению базального Са тока L-типа в кардиомиоцитах крыс SD. Эффект L-аргинина снимался 7NI, ODQ, КТ5823, что говорит о том, что действие этой аминокислоты на амплитуду Са тока связано с модуляцией активности NO-cGMP каскада и cGMP-зависимым фосфорилированием. Полученный результат моделирует «аргининовый парадокс», т.к. 5мМ L-аргинина оказывают эффект при том, что в растворе уже находится 1мМ этой аминокислоты. Получается, что в наших экспериментальных условиях (с избыточностью L-аргинина в среде) «аргининовый парадокс» хорошо выражен и легко оценивается по влиянию L-аргинина на амплитуду потенциал-зависимого Са2+ тока L-типа. Таким образом, появляется возможность исследовать природу «аргининового парадокса» на изолированных кардиомиоцитах. Нами была исследована рецепторная гипотеза «аргининового парадокса». Селективные антагонисты а2-адренорецепторов иохимбин и раувольсцин снимали эффект L-аргинина на

94амплитуду Са токов L-типа. Показано, что а2-адренорецепторы активируют NO-синтазу через PI3K-Akt сигнальный каскад. В наших экспериментах эффект L-аргинина на амплитуду Са тока снимался вортманнином и ингибитором Aktl/2 киназы, соответственно блокатарами PI3K и Akt. По аналогии с L-аргинином селективный агонист а2-адренорецепторов -гуанабенц ацетат подавлял амплитуду Са2+ тока в изолированных кардиомиоцитах. Эффект гуанабенц ацетата снимался вортманнином, 7NI, КТ5823. Однако существовало предположение, что не L-аргинин, а агматин (синтезируемый из L-аргинина) взаимодействует с сх2-ад ренорецепторами. Агматин также подавлял Са ток, однако, его эффект не снимался ни иохимбином, ни 7NI. Для дальнейшей проверки рецепторной гипотезы «аргининового парадокса» мы исследовали регуляцию скорости продукции

2-Ь оксида азота и

Са токов L-типа L-аргинином и гуанабенц ацетатом в кардиомиоцитах спонтанно-гипертензивных крыс. L-аргинин не оказывал влияния на амплитуду Са тока, доза-зависимый эффект гуанабенц ацетата на кальцивае токи смешался вправо по сравнению с кардиомиоцитами SD. L-аргинин и гуанабенц ацетат также не оказывали влияния на скорость продукции оксида азота в кардиомиоцитах SHR по сравнению с SD. Полученные нами данные свидетельствуют об отсутствии «аргининового парадокса» и снижении реактивности а2-адренорецепторов в кардиомиоцитах этих крыс.

На основе полученных результатов, можно сделать заключенее, что L-аргинин принимает участие в регуляции Са2+ токов L-типа» в изолированных кардиомиоцитах. Для достижения эффекта необходимо чтобы на момент своего действия L-аргинин уже присутствовал в экспериментальных растворах, что создает «аргининовый парадокс». В этих условиях дополнительный L-аргинин, взаимодействуя с а2-адренорецепторами, активирует NO-синтазу через PI3K-Akt путь, что приводит к GMP-зависимому подавлению амплитуды Са2+ тока L-типа. ,

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ненов, Мирослав Николаевич, 2009 год

1. Турпаев К.Т. Роль окиси азота в передаче сигнала между клетками // Молекулярная биология. 1998. V. 32. N. 4. Р. 581-591.

2. Adams M.R., Forsyth C.J., Jessup W., Robinson J., Celermajer D.S. Oral L-arginine inhibits platelet aggregation but does not enhance endothelium-dependent dilation in healthy young men. // J. Am. Coll. Cardiol. 1995. V. 26. P. 1054-1061.

3. Alden K.J., Goldspink P.H., Ruch S.W., Buttrick P.M., Garcia J. Enhancement of L-type Ca2+ current from neonatal mouse ventricular myocytes by constitutively active PKC-betall. // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2002 V. 282 N. 4 P. 768-774.

4. Alderton W.K., Cooper. C.E., Knowles R.G. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition //Biochem. J. 2001. V. 357. P. 593-615.

5. Alekseev A.E., Korystova A.F., Mavlyutova D.A., Kokoz Yu.M. Potential-dependent Ca2+ current in isolated heart cells of hibernators // Biochemistry and Molecular biology International. 1994. V. 33. N. 2. P. 365-376.

6. Aletta J.M., Cimato T.R., Ettinger M.J. Protein methylation: a signal event in post-translational modification. // Trends Biochem. Sci. 1998. V. 23 P. 89-91.

7. Alkon, D.L., Naito, S. Long-term synergistic regulation of ionic channels by C-kinase and Ca2+/CaM-type II kinase // Adv Exp Med Biol. 1987. V. 221. P. 275-290.

8. Altman J.D., Trendelenburg A.U., MacMillan L., Bernstein D., Limbird L., Starke K., Kobilka B.K., Hein L. Abnormal regulation of the sympathetic nervous system in оьд-adrenergic receptor knockout mice. // Mol. Pharmacol. 1999. V. 56. P: 154-161.

9. Appleton J. Arginine: Clinical Potential of a Semi-Essential Amino Acid // Alternative Medicine Review 2002. V. 7. N. 6. P. 512-522.

10. Arnar D.O., Xing D., Martins J.B. Alpha-2 adrenergic antagonism enhances risk of ventricular tachycardia during acute ischemia. // Scand Cardiovasc. J. 2007. V. 41(6) P. 378-385.14