Новый механизм Ca2+-зависимой регуляции родопсинкиназы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Григорьев, Илья Игоревич

• Григорьев, Илья Игоревич
• кандидат химических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат химических наук Григорьев, Илья Игоревич

Оглавление

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы: «Родопсинкиназа как представитель семейства протеинкиназ рецепторов, сопряжённых с О-белками»

1.1. Рецепторы, сопряжённые с О-белками, и их протеинкиназы

1.1.1. Рецепторы, сопряжённые с О-белками

1.1.2. Десенситизация рецепторов, сопряжённых с О-белками

1.1.3. Семейство протеинкиназ рецепторов, сопряжённых с О-белками

1.2. Экспрессия вИК в различных клетках и тканях

1.3. Структурная организация протеинкиназ рецепторов, сопряжённых с О-белками

1.4. Устройство генов, кодирующих протеинкиназы О-белок-сопряжённых рецепторов

1.5. Внутриклеточная локализация протеинкиназ О-белок-сопряжённых рецепторов

1.6. Механизм активации протеинкиназ рецепторов, сопряжённых с О-белками, активированными рецепторами

1.7. Регуляция активности протеинкиназ рецепторов, сопряжённых с О-белками

1.7.1. Аутофосфорилирование и фосфорилирование под действием других протеинкиназ

1.7.2. Са2+-зависимая регуляция

1.7.3. Другие механизмы регуляции активности ОМС

1.8. Родопсинкиназа и фосфорилирование родопсина

1.8.1. Общая схема фототрансдукции

1.8.2. Взаимодействие родопсинкиназы с родопсином и его фосфорилирование

1.8.3. Участки фосфорилирования родопсина родопсинкиназой

1.8.4. Рековерин как Са -сенсор родопсинкиназы

2. Материалы и методы

2.1. Использованные материалы и бактериальные штаммы

2.2. Приготовление Са -буферных растворов

2.3. Выделение наружных сегментов палочек сетчатки

2.4. Получение фоторецепторных мембран, отмытых мочевиной или гипотоническим буфером

2.5. Очистка родопсинкиназы из наружных сегментов палочек

2.6. Очистка кальмодулина из мозга быка

2.7. Приготовление химически компетентных бактериальных клеток

2.8. Трансформация бактериальных клеток плазмидной ДНК

2.9. Выделение плазмидной ДНК

2.10. Экспрессия в бактериальных клетках и очистка рекомбинантного рековерина

2.11. Определение активности родопсинкиназы

2.12. Получение рекомбинатных фрагментов родопсинкиназы

2.12.1. Конструирование генов, кодирующих фрагменты родопсинкиназы в виде химерных белков с глутатион 8-трансферазой

2.12.2. Отбор клонов

2.12.3. Экспрессия в бактериальных клетках и очистка химерных белков 08Т-МС

2.13. Спектроскопия поверхностного плазмонного резонанса

2.13.1. Иммобилизация рекомбинантных фрагментов родопсинкиназы на поверхности сенсорного чипа

2.13.2. Изучение взаимодействия фрагметов родопсинкиназы с кальмодулином и родопсином

2.13.3. Определение констант диссоциации комплексов кальмодулина с фрагментами родопсинкиназы

2.14. Метод аффинного соосаждения

2.15. Аналитические процедуры

2.15.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.15.2. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия

2.15.3. Иммуноблоттинг

2.15.4. Измерение концентрации белков

3. Результаты и обсуждение

3.1. Са2+-зависимая регуляция родопсинкиназы кальмодулином

3.1.1. Изучение влияния кальмодулина на фосфорилирование родопсина

3.1.2. Выявление участков связывания кальмодулина в молекуле родопсинкиназы

3.1.2.1. Изучение взаимодействия 1\Г- и С-концевого регуляторных доменов родопсинкиназы с кальмодулином

3.1.2.2. Изучение взаимодействия фрагментов ]Ч-концевого домена родопсинкиназы с кальмодулином

3.1.2.3. Изучение взаимодействия кальмодулина с рековерин-связывающим участком родопсинкиназы

3.2. Са2+-зависимая регуляция родопсинкиназы рековерином и кальмодулином

3.2.1. Изучение Са2+-зависимой регуляции фосфорилирования родопсина в присутствии кальмодулина и рековерина

3.2.2. Теоретическая модель механизма последовательного связывания рековерина и кальмодулина с родопсинкиназой

3.3. Изучение роли кальмодулин-связывающего участка в функционировании родопсинкиназы

3.4. Заключение

Выводы

Приложение

Список литературы

Список сокращений

нкс нсп

ПЦР Трис АТР АСС

Нейрональные кальциевые сенсоры Наружный сегмент палочки Полимеразная цепная реакция Трис(гидроксиметил)-аминометан Аденозинтрифосфат Суперсемейство протеинкиназ А, О и С

5,5'-дибромо- 1,2-бис(о-амино-5-бромофенокси)этан-^К,К',1Ч'-

ВАРТА

[Са ]Своб.

БМ

БТТ

ЕБС

ЕБТА

ЕвГА

С-белок

Са

Сру

СРСЯ

СЯК

С8Т

СТР

НЕРЕ8

1С50

1РТС

Кв

п

N118

2+

тетрауксусная кислота Концентрация свободного Сах Додецил-Р-Б-мальтозид Дитиотреит

1-Этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид К,М,№,№-этилендиаминтетрауксусная кислота Этиленгликоль-бисф-аминоэтиловый эфир)-1М,К,]Ч',М'-

тетрауксусная кислота

Белок, связывающий гуаниловые нуклеотиды

а-субъединица й-белка

(Зу-субъединицы О-белка

Рецепторы, сопряжённые с в-белками

Протеинкиназы рецепторов, сопряжённых с О-белками

Глутатион Э-трансфераза

Гуанозинтрифосфат

4-(2-гидроксиэтил)-1 -пиперазинэтансульфоновая кислота

Концентрация полумаксимального ингибирования

Изопропил-Р-Б-тиогалактозид

Равновесная константа диссоциации

Коэффициент Хилла

]М-гидроксисукцинимид

РН-домен PIP2 PMSF RH-домен

Rho

Rho*

RK

SPR

TEMED

Домен гомологии с плекстрином (англ. Pleckstrin Homology)

Фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат

Фенилметилсульфонилфторид

Домен гомологии с белками-регуляторами сигналов, передаваемых G-белками (англ. 'Regulator of G Protein Signaling Homology') Родопсин

Фотовозбуждённый родопсин Родопсинкиназа

Поверхностный плазмонный резонанс 1Ч^,]\[',1чГ-тетраметилэтилендиамин

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новый механизм Ca2+-зависимой регуляции родопсинкиназы»

Введение

Ключевые аспекты функционирования нейронов, начиная от передачи нервного импульса и заканчивая экспрессией генов, регулируются за счёт изменения концентрации свободного кальция. Эффекты кальция на различные внутриклеточные процессы опосредуются Са2+-связывающими белками, принадлежащими преимущественно к суперсемейству ЕБ Иапё-содержащих белков. Важнейшим свойством этих белков является способность изменять свою конформацию при связывании катиона, что придаёт им способность связываться с различными белками-мишенями и регулировать их активность, тем самым передавая сигнал Са2+ различным эффекторным молекулам. Среди последних можно выделить семейство протеинкиназ рецепторов, сопряженных с в-белками (ОМС), функция которых состоит в фосфорилировании агонист-связанных форм в-белок-сопряжённых рецепторов, за счет чего инициируется выключение передачи сигнала от рецептора к в-белку.

В клетках большинства тканей эффекты Са2+ опосредуются, в основном, повсеместно представленным универсальным кальциевым сенсором кальмодулином. Однако в нейронах экспрессируются дополнительные Са -чувствительные белки, которые принадлежат к семейству нейрональных кальциевых сенсоров (НКС). Эти белки регулируют различные аспекты функционирования нейронов, в том числе высвобождение нейромедиаторов, регуляцию ионных каналов и рецепторов, контроль транскрипции генов, рост и выживание нейронов. НКС обеспечивают тонкую настройку регуляторных механизмов, запускаемых изменениями в уровне кальция в нейронах, в то время как кальмодулин работает больше как универсальный сенсор сигналов кальция.

Некоторые из белков-мишеней являются общими и для кальмодулина, и для белков из семейства НКС, и в ряде случаев было показано, что они конкурируют за одни и те же сайты связывания в молекулах-мишенях. Поскольку концентрация кальмодулина в нейронах сопоставима с уровнем экс-

прессии белков семейства НКС, кальмодулин и НКС могли бы конкурировать между собой за взаимодействие с эффекторными молекулами. В этом случае одним из возможных механизмов, лежащих в основе эффективного функционирования НКС, может быть различное сродство НКС и кальмоду-лина к ионам кальция, позволяющее кальмодулину и НКС регулировать определенные белки-мишени в различных диапазонах цитоплазматической концентрации кальция. В дополнение к конкурентной регуляции, основанной на различной Са -чувствительности, эффективное функционирование НКС и кальмодулина может осуществляться за счет их взаимодействия с белками-мишенями посредством различных участков связывания.

Типичным представителем семейства нейрональных кальциевых сенсоров является рековерин, высокоспецифичный для фоторецепторных клеток сетчатки. Функция рековерина в фоторецепторной клетке заключается в Са2+-зависимой регуляции активности родопсинкиназы (вЯЮ или МС) - фермента, который осуществляет быстрое выключение фотоактивированного родопсина путём его множественного фосфорилирования. Са2+-зависимое ингиби-рование фосфорилирования родопсина происходит при непосредственном взаимодействии родопсинкиназы и рековерина.

В то время как активность протеинкиназ ОЫК1 и ОЛК7 регулируется Са /рековерином, активность других незрительных протеинкиназ из семейства ОЛК регулируется Са /кальмодулином. При этом к моменту начала настоящей работы в литературе имелись сведения о том, что кальмодулин спо-

о а-

собен Са -зависимым образом связываться с родопсинкиназой. Однако информация о влиянии кальмодулина на функциональную активность родопсинкиназы, то есть на способность фермента фосфорилировать фотоактивированный родопсин, отсутствовала. Настоящая работа посвящена изучению роли кальмодулина в Са2+-зависимой регуляции родопсинкиназы и исследованию совместной регуляции родопсинкиназы кальмодулином и рековерином.

1. Обзор литературы: «Родопсинкиназа как представитель семейства протеинкиназ рецепторов, сопряжённых с G-белками»

Настоящий обзор описывает имеющиеся на текущий момент в научной литературе сведения о структуре и функции протеинкиназ рецепторов, сопряжённых с G-белками, а также о регуляции их активности и участии белков из этого семейства в различных физиологических процессах.

1.1. Рецепторы, сопряжённые с G-белками, и их протеинкина-зы

Рецепторы, сопряжённые с гетеротримерными G-белками (англ. 'G protein-coupled receptor', GPCR) присутствуют на поверхности практически всех клеток многоклеточных организмов и играют ведующую роль в межклеточной сигнализации. Различные субтипы GPCR отвечают за восприятие как сигналов из внутренней (гормонов, нейротрансмиттеров, хемокинов), так и из внешней (обонятельных, вкусовых и световых стимулов) среды организма. GPCR представляют собой наиболее обширный класс фармакологических мишеней, активность которых призваны модулировать до 40% применяемых в клинической практике лекарственных препаратов. Лекарства, вызывающие активацию GPCR, часто запускают механизмы выключения активности рецепторов, которые ограничивают эффективность действия лекарств, особенно при хроническом лечении. Поэтому существует большой интерес к пониманию того, как регулируется активность GPCR, обусловленный стремлением к разработке лекарственных препаратов, способных избегать этого регулирования.

1.1.1. Рецепторы, сопряжённые с G-белками

Рецепторы, сопряжённые с G-белками - наиболее многочисленное суперсемейство белков-рецепторов клеточной поверхности [1]. В геноме человека в настоящее время насчитывают более 800 генов, кодирующих такие ре-

цепторы [2]. Данные рецепторы служат для восприятия огромного количества биологически активных молекул, таких как биогенные амины (дофамин, норадреналин, серотонин, гистамин), нуклеотидные и аминокислотные ней-ротрансмиттеры (аденозин, глутамат, у-аминомасляная кислота), пептидные и белковые гормоны (опиоиды, тахикинины, нейротензин, соматостатин, хо-лецистокинин и большинство либеринов), хемокины и липидные производные (сфингозин-1-фосфат, лизофосфатидная кислота, эйкозаноиды) [3] [4]. GPCR являются посредниками множества физиологических процессов в различных системах организма, играют фундаментальную роль в восприятии света, запаха, вкуса, а также в регуляции сердечного ритма, кровяного давления, иммунного ответа и метаболизма глюкозы [5].

GPCR характеризуются общей пространственной структурой, включающей семь трансмембранных а-спиралей, соединенных тремя цитоплазма-тическими и тремя внеклеточными петлями, а также N- и С-концевые хвосты (рис. 1). На основании такой топологии рецепторы данного семейства в литературе также часто именуют семи-трансмембранными рецепторами. Когда подходящая молекула-агонист связывается с лиганд-связывающим карманом, расположенным во внеклеточном домене рецептора, внутриклеточный домен рецептора изменяет свою конформацию, формируя с внутриклеточной стороны поверхность для белок-белковых взаимодействий, которая недоступна в неактивном состоянии рецептора [6]. Такой «активированный рецептор» может взаимодействовать с белком, связывающим гуаниловые нуклеотиды (G-белком). G-белки являются гетеротримерами и состоят из а-, (3- и у-субъединиц. а-субъединица отвечает за связывание GDP и GTP и гидролиз GTP, в то время как (3- и у-субъединицы связаны в прочный (Зу-комплекс, который функционирует как единое целое [7]. К настоящему времени установлено, что каждая из этих субъединиц является членом семейства генов; на текущий момент известны 16 а-, 5 |3- и 12 у-субъединиц.

Активированный рецептор инициирует обмен гуаниловых нуклеотидов G-белком, вызывая диссоциацию GDP и связывание GTP, что приводит к

11

Внеклеточное пространство

Цитоплазма

Рисунок 1. Общий вид пространственной структуры рецепторов, сопряжённых с G-Щлками на примере структур 02 - адр ei юр ег / сит ори человека (слева, PDB 2RH!) н родопсина быка (справа. PDB IF88). В виде линии, соединяющей Си-атомы, показан общий ход иолипеитидной цепи белкой. Градиентная окраска от синего к красному символизирует переход от N-конца к С-концу. Атомы связанных с рецепторами а гони сто в (5)-каразолола (слева) и полиостью-транс-ретиналя (справа) показаны в виде ван-дер-Ваальсовых сфер. Серым показано предполагаемое расположение фосфолипидпого бислоя.

диссоциации G-белка на активированную Ga-субъединицу и Gßy-димер. Освобождённые субъединицы G-белка, в свою очередь, регулируют активность одного или нескольких эффекторов: Ga-субъединицы из подсемейства Gas стимулируют аденилилциклазу [8], а белки из подсемейства Gct; её ингиби-руют [9]; активация Ga4 соггряжена с активацией фосфолипазы Cß [10]; некоторые другие а-субъединицы модулируют активность cGMP-фосфодиэстераз, кальциевых ионных каналов [11]. В конечном счёте, изменение активности эффекториых ферментов или ионных каналов изменяет внутриклеточную концентрацию вторичных мессенджеров — молекул или ионов, которые опосредуют клеточный ответ на связывание агониста с

р2-Адренергический рецептор

Клеточный ответ

Рисунок 2. Классический пример передачи сигнала рецептором, сопряжённым с G-белком, па примере ¡И-адренорецептора [5]. В отсутствие аюниста GPCR находится в неактивном состоянии. При связывании агонмега рецептор активируется и приобретает способность катализировать обмен G-белком GDP па GTP, что приводит к диссоциации гетеротримерного Gs-бслка на а-субъедииицу и ßy-димср, оба из которых в дальнейшем активируют различные эффекторы. Например. Gas активирует аденилшпшклазу, что ведёт к повышению внутриклеточной концентрации циклического AMP (сАМР). Повышение концентрации сАМР, в свою очередь, активирует протеинкиназу А (РКА), которая фосфорилирует остатки серина и треонина во множестве различных субстратов, включая GPCR, другие протеинкиназы и транскрипционные факторы.

рецептором. Общая схема передачи сигнала с помощью сигнального каскада «GPCR-G-белок—эффекторный фермент» представлена на рис. 2 на примере аденилилциклазной системы,

1.1.2. Десенситизация рецепторов, сопряжённых с G-белками

Все системы G-белок-сопряжешшх рецепторов обладают способностью регулировать свою активность стимул-зависимым образом [12]. Это означает, что чувствительность рецептора меняется в зависимости от интенсивности стимуляции клетки данным агонистом. Другими словами, рецепто-

ры подстраивают свою чувствительность к тому диапазону концентраций агонистов, которые на них действуют. Рецепторы снижают свою чувствительность при продолжительном или повторяющемся воздействии высокой концентрации агониста и восстанавливают её, когда стимуляция агонистом некоторое время отсутствует. Феномен быстрого выключения передачи сигнала рецептором, даже в присутствии продолжающейся стимуляции агонистом, получил название «десенситизации» [13]. Механизмы десенситизации работают как на уровне самого рецептора, так и на последующих этапах сигнального каскада, например, на уровне G-белков.

Быстрое выключение функционирования рецептора опосредуется его фосфорилированием, которое может осуществляться как протеинкиназами, активируемыми вторичными мессенджерами, имеющими широкую субстратную специфичность (например, протеинкиназой А или протеинкиназой С), так и с помощью специализированных Ser/Thr-протеинкиназ рецепторов, сопряжённых с G-белками, объединяемых в семейство GRK (англ. 'G proteincoupled receptor kinases') [14]. Дуэт протеинкиназы из семейства GRK и регу-ляторного белка аррестина составляет важнейший инструмент, выработанный клетками в ходе эволюции для гомологической (агонист-специфической) десенситизации GPCR, регулирующей реактивность рецепторов.

Подобно тому, как G-белки узнают только активированные рецепторы, протеинкиназы из семейства GRK также распознают и связывают только активированные (связавшие агонист) конформации GPCR, что приводит к каталитической активации самих протеинкиназ GRK и фосфорилированию активированного рецептора по специфическим сайтам на внутриклеточных петлях и С-конце рецептора (рис. 3). Вследствие такого узнавания, самыми лучшими субстратами для GRK являются активированные рецепторы: по сравнению с активированными рецепторами, синтетические пептиды с последовательностями аминокислотных остатков, соответствующими С-концевым последовательностям рецепторов, являются в 100-10 ООО раз худшими субстратами для GRK, о чём можно судить по соотношению Утах/Км

14

Неактивный

Активный

Фосфорилирование под действием GRK

Связывание аррестина

/"v

Активация G-белка

Блокировка G-белков

Плазматическая мембрана

Цитоплазма

\

Сигнализация, опосредованная аррестином

Рисунок 3. Общая схема десенситизаиии G-белот&оЩяженного рецептора [1]. В отсутствие активирующего ai оииста (А) рецептор, сопряжённый с G-белком (GPCR) находится в неактивной конформации и не активирует никаких сигнальных путей. При связывании соответствующего шониета с внеклеточным доменом рецептора в последнем происходят конформационные изменения, в результате чего он приобретает способность активировать G-белок. Пока агонист связан с рецептором, рецептор находится в активированном сосотоянин и продолжает активировать G-белок. Актвпрованный GPCR также узнается протеинкиназой G-бслок-сопряженного рецептора (GRK). которая при связывании с ним каталитически активируется и фосфоридирует (Р) по остаткам Ser и Thr внутриклеточные домены рецептора. Фосфорплированный под действием GRK рецептор прочно связывает регуляторный белок p-аррсстин, который прекращает дальнейшую активацию молекул G-белка и запускает интреиапичацпю рецептора посредством окаймленных клатрипом ямок, или играет роль адатпорного белка для передачи сигналов по аррестин-зависимым (G-белок-независимым) путям.

[15] [16]. Фосфорилирование рецептора само по себе снижает эффективность активации рецептором G-белка [17]. Однако, что более важно, будучи фос-форилированными, рецепторы становятся мишенями для связывания регуля-торных белков аррести нов, которые предотвращают дальнейшую активацию рецептором G-белка [18]. Фосфорилирование под действием GRK и связывание аррестина приводят к потере способности рецептора активировать G-белок, даже несмотря на продолжающееся присутствие активирующего рецептор агониста. Семейство аррестинов включает в себя четыре гена. Два из них (зрительные аррестин палочек и аррестин колбочек) экспрессируются исключительно в сетчатке, остальные два - называемые |3-аррестин-1 и аррестин-2 - экспрессируются повсеместно [19]. Совместное действие про-теиикиназ GRK и аррестинов также выполняет другие функции, такие как запуск удаления рецептора с клеточной поверхности (интернализации) посредством окаймленных клатрином ямок [20] [21]. Связывая дополнительные

сигнальные белки, GRK и аррестины также функционируют как переключатели, переводя активированные рецепторы с активации G белок-сопряжённых путей на G белок-независимые пути [22].

1.1.3. Семейство протеинкиназ рецепторов, сопряжённых с G-белками

Семейство GRK млекопитающих включает семь генов, которые, на основании гомологии первичных структур, выявлянных клонированием соответствующих кДНК, объединяют в три подсемейства [3]: подсемейство ро-допсинкиназы или подсемейство зрительных GRK (включает GRK1 и GRK7), подсемейство протеинкиназы ß-адренорецептора (включает GRK2 и GRK3) и подсемейство GRK4 (включает GRK4, GRK5 и GRK6). Члены подсемейства протеинкиназы ß-адренорецептора имеют 84% идентичных аминокислотных остатков, а члены подсемейства GRK4 - 70%. Среди всех этих ферментов сходство в аминокислотной последовательности варьирует от 53 до 93%, причем наибольшее различие наблюдается между GRK1 и GRK2 [14]. Подсемейства GRK2 и GRK4 разошлись в ходе эволюции, по оценкам, больше 1 миллиарда лет назад, и протеинкиназы этих семейств имеются у большинства, а возможно, и у всех животных, включая Drosophila melanogaster и Caenorhabditis elegans [23]. Протеинкиназы подсемейства GRK1 на настоящий момент обнаружены только у позвоночных.

Эволюционная консервативность среди GRK, выделенных из нематод, насекомых и млекопитающих, подчёркивает их биологическую значимость. Гены GPRK1 и wj283.2 кодируют белки Drosophila melanogaster [24] и Caenorhabditis elegans [25], соответственно, которые имеют 62% и 51% идентичности первичной структуры с GRK2 быка. Подобным образом, гены GPRK2 и fl9c6.1 кодируют белки Drosophila и С. elegans с 50-53% идентичности аминокислотной последовательности по отношению к GRK5 быка [24] [25]. Другие GRK-родственные ферменты идентифицированы как родопсин-киназа осьминога (ORK) [26] и родопсинкиназа кальмара (SQRK) [27]. Ро-допсинкиназы осьминога и кальмара являются специфичными для сетчатки,

16

однако GPRK1 и GPRK2 плодовой мушки, помимо сетчатки, выявлены во многих других тканях. Следует отметить, что GRK беспозвоночных в большей степени родственны подсемейству протеинкиназы p-адренорецептора (GRK2), чем подсемейству родопсинкиназы (GRK1). Кроме того, недавно проведённый с помощью биоинформатических методов анализ расшифрованных геномов организмов различной сложности - от одноклеточных эука-риот до человека - показал, что белки с характерным для GRK сочетанием RH- и киназного доменов (подробнее о доменах GRK см. п. 1.3.) имеются даже у примитивных эукариот не из царства животных, включая хоанофла-гелляту Monosiga brevicolis, оомицетов Phytophotra infestans и Albugo laibachii, и коричневую водоросль Ectocarpus siliculosus [28]. Все беспозвоночные и головохордые, чьи геномы были секвенированы, имеют два гена, кодирующих GRK-подобные белки, в то время как все одноклеточные организмы имеют только один.

С функциональной точки зрения, для протеинкиназ рецепторов, сопряженных с G-белками, характерны следующие основные черты:

1. Эти ферменты предпочтительно фосфорилируют активированные (связанные с агонистом), а не неактивные или связанные с антагонистом рецепторные субстраты.

2. Взаимодействие между GRK и активированными GPCR приводит к сильному повышению каталитической активности ферментов.

3. Фосфорилирование GPCR под действием GRK требует наличия механизмов, обеспечивающих мембранную локализацию ферментов и узнавание рецепторов.

1.2. Экспрессия GRK в различных клетках и тканях

Экспрессия GRK1 и GRK7 млекопитающих, в основном, ограничена фоторецепторными клетками сетчатки - палочками и колбочками, хотя оба этих фермента присутствуют и в пинеалоцитах эпифиза, которые, по непонятным пока причинам, содержат полный набор белков, участвующих в пе-

17

редаче зрительного сигнала [29] [30] [31] [32]. Почти каждая клетка млекопитающих экспрессирует несколько различных незрительных вЮС с ранних стадий эмбрионального развития. ОИС2 и родственная ей ОЯКЗ экспресси-руются повсеместно, хотя ОЮС2 и представлена в тканях на более высоком уровне, чем ОККЗ. вЯК4 экпрессируется на высоком уровне только в яичках [33]. Кроме того, экспрессия вЯК4 также была обнаружена в клетках проксимальных канальцев почек, в которых сплайс-варианты ОШС4а и ОКК4у, как сообщается, регулируют передачу сигналов Б1- и БЗ-дофаминовыми рецепторами [34] [35]. СЯК4 также экспрессируется в мозжечке [36] и миомет-рии матки [37]. Напротив, протеинкиназы СЮС5 и вЛКб экспрессируются повсеместно [38]. Таким образом, большинство рецепторов в живых клетках, возможно, регулируются только четырьмя из протеиназ семейства СЯК: ОЫК2, ОМСЗ, СШС5 и ОЯКб. Действительно, все эти четыре вИК были обнаружены в мозге крысы уже на 14-й день эмбрионального развития [39]. К сожалению, детальная информация об экспрессии протеинкиназ вШС на уровне различных типов клеток ограничена. В основном о распределении вМС известно на уровне тканей. Набор СТ1К, экспрессирующихся в тех или иных клетках, может оказаться важным фактором, определяющим специфичность ОЮС по отношению к различным рецепторам. К примеру, и ОЮС1, и вКК2 эффективно фосфорилируют родопсин, и обе эти протеинкиназы представлены в фоторецепторных клетках-палочках. Однако ОШС2, которая также экспрессируется в фоторецепторных клетках, не может компенсировать отсутствие функционально активной ОЮС1 у трансгенных мышей с инактивированным геном вЯЮ, о чём свидетельствует развивающаяся у таких мышей слепота вследствие быстрой фото дегенерации сетчатки [40].

1.3. Структурная организация протеинкиназ рецепторов, сопряжённых с О-белками

Все СЯК являются мультидоменными белками, в структуре которых имеется высококонсервативный Ы-концевой участок (первые ~ 25 аминокис-

лотных остатков), уникальный для протеинкиназ из семейства GRK, за которым следует домен гомологии с белками-регуляторами сигнализации G-белков (англ. 'regulator of G protein signaling homology', RGS homology, RH)

[41] (~ 150 остатков), умеренно консервативный внутри семейства GRK (27% идентичных остатков) (рис. 4). RH-домен GRK2 и GRK3 способен связывать а-субъединицу Gq-белка. Это осуществляется, в том числе, за счёт остатков Argl06 и Asp 110, которые заменены на неконсервативные в RH-доменах GRK других подсемейств. В центре полипептидной цепи GRK находится консервативный Ser/Thr-киназный домен 330 остатков, 47% идентичных), который принадлежит суперсемейству протеинкиназ A, G и С (AGC). Киназ-ный домен GRK наиболее близок киназным доменам протеинкиназ А, В и PDK1, и, как следствие, состоит из малой и большой долей, за которыми следует так называемое «продолжение киназного домена», опоясывающее обе доли киназного домена и проходящее через расселину активного центра [6]

[42]. Ключевую роль в катализе переноса у-фосфата АТР на остатки Ser и Thr в пептиде субстрата играют остатки лизина в положении 215-220 (для разных GRK). Точечные замены этих остатков лизина на другие аминокислоты приводят к каталитически неактивным формам фермента. Киназный домен GRK5 также имеет консенсусный сигнал ядерной локализации (остатки 388— 395) [43]. Тандем из RH- и киназного доменов (~ 500-520 аминокислотных остатков) является общим для всех GRK.

С-концевые участки GRK размером ~ 80-180 остатков не являются консервативными внутри семейства. Они содержат структурные элементы, отвечающие за связывание этих ферментов с фосфолипидными мембранами. Как и гетеротримерные G-белки, мембраносвязывающие участки GRK способствуют выполнению ферментами своей основной функции, но не являются абсолютно необходимыми для этого, поскольку показано, что GRK могут фос-форилировать солюбилизированные GPCR [44], а также что GRK, лишенные мембраносвязывающих участков, способны фосфорилировать рецепторы, хотя и с меньшей активностью [45]. Разные представители семейства GRK

N-концевой участок RH-домен

Киназный домен

1 42

1 36

GRK2

GRK3

184

184

RH-домен

454 514 532 563

GRK1 " | К219 <

| 1 40 185 455 513 531 553

GRK7 К220 I шп<

РН-домен

454 513 553 661 6S9

454 513 553

661 SS9

1 38

GRK40

181

К216К217

Л_

450

508 525

578

1 33

180

450

507 525

590

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Григорьев, Илья Игоревич

Выводы о I

1. Кальмодулин Са -зависимым образом ингибирует фосфорилирование родопсина, катализируемое родопсинкиназой.

2. Участки связывания рековерина и кальмодулина в родопсинкиназе не перекрываются и расположены в пределах 1-25 и 150-175 аминокислотных остатков фермента, соответственно.

3. Связывание рековерина и кальмодулина с родопсинкиназой происходит последовательно: сначала образуется комплекс родопсинкиназы с реко-верином, с которым затем происходит связывание кальмодулина.

4. Кальмодулин и рековерин синергически ингибируют фосфорилирование родопсина, катализируемое родопсинкиназой.

5. Участки связывания родопсинкиназы с родопсином и кальмодулином перекрываются и локализованы в пределах последовательности 150-175 аминокислотных остатков фермента.

3.4. Заключение

На основании полученных в работе результатов можно предложить следующую модель Са2+-зависимой регуляции фосфорилирования фотовозбужденного родопсина, катализируемого родопсинкиназой в фо-торецепторных клетках. В темноте, когда уровень [Са2+]СВОб. в цитоплазме НСП высокий и составляет величину ~ 0,5-0,6 мкМ, родопсинкиназа находится в комплексе с рековерином и кальмодулином. После поглощения родопсином кванта света, пока концентрация [Са ]СВОб. высокая, рековерин ал-лостерически ингибирует фосфорилирование родопсина родопсинкиназой, однако не влияет на взаимодействие фермента с цитоплазматическими петлями рецептора. В то же время, кальмодулин предотвращает это взаимодействие, тем самым позволяя активированному рецептору активировать G-белок трансдуцин. Это важно для способности фоторецепторных клеток-палочек отвечать даже на низкие уровни освещённости. Инициируемое активацией фосфодиэстеразного каскада снижение внутриклеточной концентрации [Са2+]св0б. вызывает диссоциацию рековерина из комплекса с родопсинкиназой, что приводит к аллостерическому снижению сродства фермента к кальмодулину. В этих условиях кальмодулин продолжает ингибировать ро-допсинкиназу, хотя и намного менее эффективно, чем совместно с рековери-ном. Дальнейшее снижение концентрации свободного Са вплоть до 25-50 нМ, вызванное световым стимулом, приводит к диссоциации оставшихся комплексов родопсинкиназы с кальмодулином, позволяя молекулам фермента с наибольшей эффективностью десенситизировать рецептор.

Высказанная выше модель совместной Са -зависимой регуляции фосфорилирования родопсина родопсинкиназой под действием кальмодулина и рековерина основывается на более низком сродстве последнего к ионам кальция (IC50 ингибирования родопсинкиназы = 1,36 мкМ [Са ]СВОб.) по сравнению с кальмодулином (1С50 = 0,36 мкМ [Са ]своб.), наблюдаемым в наших экспериментах in vitro при 10 мкМ концентрации родопсина и субмикромолярной концентрации родопсинкиназы. Однако, экстраполяция к условиям in

105 vivo, то есть к очень высокому содержанию мембран в наружных сегментах фоторецепторных клеток, содержащих до 6 мМ родопсина, и сопоставимой с рековерином концентрации родопсинкиназы (7 мкМ) показывает, что полумаксимальный эффект ионов кальция на ингибирование родопсинкиназы ре-коверином может снизиться до 0,28 мкМ [Са ]своб. [137]. При этом, такая экстраполяция лишь незначительно снизит 1С50 Са2+-чувствительности инги-бирования родопсинкиназы кальмодулином, поскольку наличие мембран не влияет на связывание Са2+ с кальмодулином. В таком случае, Са2+-чувствительность рековерина оказывается сопоставима с таковой для каль-модулина, и при понижении [Са2+]св0б. в ходе передачи светового сигнала или адаптации фоторецепторной клетки от темнового уровня (0,5-0,6 мкМ [Са2+]св0б.) до уровня световой адаптации (25-50 нМ [Са2+]своб.) диссоциация

9-1обоих Са -связывающих белков из комплекса с родопсинкиназой будет происходить одновременно. С этой точки зрения, роль кальмодулина в Са2+-зависимой регуляции активности родопсинкиназы будет заключаться только в усилении Са -зависимого ингибирования родопсинкиназы под действием рековерина. Подобная ситуация, как известно, имеет место и в других типах клеток нейрональной ткани, когда тот или иной белок из семейства нейро-нальных кальциевых сенсоров (НКС) и кальмодулин вместе ингибируют какую-либо мишень, и при этом нейрональный кальциевый сенсор осуществляет тонкую настройку Са -чувствительности активности белка-мишени, в то время как кальмодулин лишь дополняет регуляцию под действием НКС [184] [185].

Подводя итог проделанной работе стоит отметить, что наше исследование предложило новый механизм регуляции десенситизации родопсина под действием родопсинкиназы с участием Са -чувствительных белков кальмодулина и рековерина. Дальнейшие исследования необходимы для более глубокого понимания физиологической значимости этого явления и установления деталей функционирования предложенной модели.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Григорьев, Илья Игоревич, 2012 год

Список литературы

R. T. Premont and R. R. Gainetdinov, "Physiological roles of G

1] protein-coupled receptor kinases and arrestins," Annu. Rev. Physiol., vol. 69, pp. 511-534, 2007.

R. Fredriksson, M. C. Lagerstrom, L. G. Lundin and H. B. Schioth,

2] "The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints," Mol. Pharmacol., vol. 63, no. 6, pp. 1256-1272, 2003.

R. T. Premont, J. Inglese and R. J. Lefkowitz, "Protein kinases that

3] phosphorylate activated G protein-coupled receptors," FASEB J., vol. 9, no. 2, pp. 175-182,1995.

R. R. Gainetdinov, R. T. Premont, L. M. Bohn, R. J. Lefkowitz and M.

4] G. Caron, "Desensitization of G protein-coupled receptors and neuronal functions," Annu. Rev. Neurosci., vol. 27, pp. 107-144, 2004.

K. L. Pierce, R. T. Premont and R. J. Lefkowitz, "Seven-

5] transmembrane receptors," Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., vol. 3, no. 9, pp. 639950., 2002.

C. C. Huang and J. J. Tesmer, "Recognition in the face of diversity:

6] interactions of heterotrimeric G proteins and G protein-coupled receptor (GPCR) kinases with activated GPCRs," J. Biol. Chem., vol. 286, no. 10, pp. 7715-7721,2011.

A. G. Gilman, "G proteins: transducers of receptor-generated signals,"

7] Annu. Rev. Biochem., vol. 56, pp. 615-649, 1987.

M. Rodbell, L. Birnbaumer, S. L. Pohl and H. M. Krans, "The

8] glucagon-sensitive adenyl cyclase system in plasma membranes of rat liver. V. An obligatory role of guanylnucleotides in glucagon action," J. Biol.

Chem., vol. 246, no. 6, pp. 1877-1882, 1971.

T. Katada, G. M. Bokoch, J. K. Northup, M. Ui and A. G. Gilman,

9] "The inhibitory guanine nucleotide-binding regulatory component of adenylate cyclase. Properties and function of the purified protein," J. Biol. Chem., vol. 259, no. 6, pp. 3568-3577, 1984.

A. V. Smrcka, J. R. Hepler, K. O. Brown and P. C. Sternweis,

10] "Regulation of polyphosphoinositide-specific phospholipase C activity by purified Gq," Science, vol. 251, no. 4995, pp. 804-807, 1991.

B. Kwok-Keung Fung and L. Stryer, "Photolyzed rhodopsin catalyzes

11] the exchange of GTP for bound GDP in retinal rod outer segments," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 77, no. 5, pp. 2500-2504, 1980.

W. P. Hausdorff, M. G. Caron and R. J. Lefkowitz, "Turning off the

12] signal: desensitization of beta-adrenergic receptor function," FASEB J., vol. 4, no. 11, pp. 2881-2889, 1990.

S. S. Ferguson, "Evolving concepts in G protein-coupled receptor

13] endocytosis: the role in receptor desensitization and signaling," Pharmacol. Rev., vol. 53, no. 1, pp. 1-24, 2001.

J. A. Pitcher, N. J. Freedman and R. J. Lefkowitz, "G protein-coupled

14] receptor kinases," Annu. Rev. Biochem., vol. 67, pp. 653-692, 1998.

J. J. Onorato, K. Palczewski, J. Regan, M. Caron, R. J. Lefkowitz and

15] J. L. Benovic, "Role of acidic amino acids in peptide substrates of the beta-adrenergic receptor kinase and rhodopsin kinase," Biochemistry, vol. 30, no. 21, pp. 5118-5125, 1991.

J. L. Benovic, J. Onorato, M. J. Lohse, H. G. Dohlman, C.

16] Staniszewski, M. G. Caron and R. J. Lefkowitz, "Synthetic peptides of the hamster beta 2-adrenoceptor as substrates and inhibitors of the beta-adrenoceptor kinase," Br. J. Clin. Pharmacol., vol. 30, no. Suppl 1, pp. 3S-

12S, 1990.

U. Wilden, "Duration and amplitude of the light-induced cGMP

17] hydrolysis in vertebrate photoreceptors are regulated by multiple phosphorylation of rhodopsin and by arrestin binding," Biochemistry, vol. 34, no. 4, pp. 1446-1454, 1995.

J. G. Krupnick, V. V. Gurevich and J. L. Benovic, "Mechanism of

18] quenching of phototransduction. Binding competition between arrestin and transducin for phosphorhodopsin," J. Biol Chem., vol. 272, no. 29, pp. 18125-18131, 1997.

J. G. Krupnick and J. L. Benovic, "The role of receptor kinases and

19] arrestins in G protein-coupled receptor regulation," Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., vol. 38, pp. 289-319, 1998.

O. B. J. Goodman, J. G. Krupnick, F. Santini, V. V. Gurevich, R. B.

20] Penn, A. W. Gagnon, J. H. Keen and J. L. Benovic, "Beta-arrestin acts as a clathrin adaptor in endocytosis of the beta2-adrenergic receptor," Nature, vol. 383, no. 6599, pp. 447-450, 1996.

S. A. Laporte, R. H. Oakley, J. Zhang, J. A. Holt, S. S. Ferguson, M.

21] G. Caron and L. S. Barak, "The beta2-adrenergic receptor/betaarrestin complex recruits the clathrin adaptor AP-2 during endocytosis," Proc. Natl. Acad. Set USA, vol. 96, no. 7, pp. 3712-3717, 1999.

E. Reiter and R. J. Lefkowitz, "GRKs and beta-arrestins: roles in

22] receptor silencing, trafficking and signaling," Trends Endocrinol. Metab., vol. 17, no. 4, pp. 159-165, 2006.

R. T. Premont, A. D. Macrae, S. A. Aparicio, H. E. Kendall, J. E.

23] Welch and R. J. Lefkowitz, "The GRK4 subfamily of G protein-coupled receptor kinases. Alternative splicing, gene organization, and sequence conservation," J. Biol. Chem., vol. 274, no. 41, pp. 29381-29389, 1999.

J. A. Cassill, M. Whitney, C. A. Joazeiro, A. Becker and C. S. Zuker,

24] "Isolation of Drosophila genes encoding G protein-coupled receptor kinases," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 88, no. 24, pp. 11067-11070, 1991.

R. Wilson, R. Ainscough, K. Anderson, C. Baynes, M. Berks, J.

25] Bonfield, J. Burton, M. Connell, T. Copsey, J. Cooper n e. al., «2.2 Mb of contiguous nucleotide sequence from chromosome III of C. elegans,» Nature, t. 368, № 6466, pp. 32-38, 1994.

S. Kikkawa, N. Yoshida, M. Nakagawa, T. Iwasa and M. Tsuda, "A

26] novel rhodopsin kinase in octopus photoreceptor possesses a pleckstrin homology domain and is activated by G protein betagamma-subunits," J. Biol. Chem., vol. 273, no. 13, pp. 7441-7447, 1998.

L. H. Mayeenuddin and J. Mitchell, "cDNA cloning and

27] characterization of a novel squid rhodopsin kinase encoding multiple modular domains," Vis. Neurosci., vol. 18, no. 6, pp. 907-915, 2001.

A. Mushegian, V. V. Gurevich and E. V. Gurevich, "The origin and

28] evolution of g protein-coupled receptor kinases," PLoS One, vol. 7, no. 3, p. e33806, 2012.

R. L. Somers and D. C. Klein, "Rhodopsin kinase activity in the

29] mammalian pineal gland and other tissues," Science, vol. 226, no. 4671, pp. 182-184, 1984.

X. Zhao, F. Haeseleer, R. N. Fariss, J. Huang, W. Baehr, A. H. Milam

30] and K. Palczewski, "Molecular cloning and localization of rhodopsin kinase in the mammalian pineal," Vis. Neurosci., vol. 14, no. 2, pp. 225-232, 1997.

X. Zhao, K. Yokoyama, M. E. Whitten, J. Huang, M. H. Gelb and K.

31] Palczewski, "A novel form of rhodopsin kinase from chicken retina and pineal gland," FEBS Lett., vol. 454, no. 1-2, pp. 115-121, 1999.

E. N. Pugh and T. D. Lamb, "Phototransduction in vertebrate rods and

32] cones ¡molecular mechanisms of amplification, recovery and light adaptation," in Handbook of Biological Physics, Vols. 3, Molecular

Mechanisms of Visual Transduction, D. G. Stavenga, W. J. de Grip and E. N. J. Pugh, Eds., Amsterdam, Elsevier, 2000, pp. 183-255.

R. T. Premont, A. D. Macrae, R. H. Stoffel, N. Chung, J. A. Pitcher, C.

33] Ambrose, J. Inglese, M. E. MacDonald and R. J. Lefkowitz, "Characterization of the G protein-coupled receptor kinase GRK4. Identification of four splice variants," J. Biol. Chem., vol. 271, no. 11, pp. 6403-6410,1996.

R. A. Felder, H. Sanada, J. Xu, P. Y. Yu, Z. Wang, H. Watanabe, L. D.

34] Asico, W. Wang, S. Zheng, I. Yamaguchi, S. M. Williams, J. Gainer, N. J. Brown, D. Hazen-Martin, L. J. Wong, J. E. Robillard, R. M. Carey, G. M. Eisner and P. A. Jose, "G protein-coupled receptor kinase 4 gene variants in human essential hypertension," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 99, no. 6, pp. 3872-3877,2002.

V. A. Villar, J. E. Jones, I. Armando, C. Palmes-Saloma, P. Yu, A. M.

35] Pascua, L. Keever, F. B. Arnaldo, Z. Wang, Y. Luo, R. A. Felder and P. A. Jose, "G protein-coupled receptor kinase 4 (GRK4) regulates the phosphorylation and function of the dopamine D3 receptor," J. Biol. Chem., vol. 284, no. 32, pp. 21425-21434, 2009.

M. Sallese, L. Salvatore, E. D'Urbano, G. Sala, M. Storto, T. Launey,

36] F. Nicoletti, T. Knopfel and A. De Blasi, "The G-protein-coupled receptor kinase GRK4 mediates homologous desensitization of metabotropic glutamate receptor 1," FASEB J., vol. 14, no. 15, pp. 2569-2580, 2000.

C. B. Brenninkmeijer, S. A. Price, A. Lopez Bernal and S. Phaneuf,

37] "Expression of G-protein-coupled receptor kinases in pregnant term and nonpregnant human myometrium," J. Endocrinol., vol. 162, no. 3, pp. 401-408, 1999.

R. R. Gainetdinov, R. T. Premont, M. G. Caron and R. J. Lefkowitz,

38] "Reply: receptor specificity of G-protein-coupled receptor kinases," Trends

Pharmacol. Sci., vol. 21, no. 10, pp. 366-367, 2000.

E. V. Gurevich, J. L. Benovic and V. V. Gurevich, "Arrestin2

39] expression selectively increases during neural differentiation," J. Neurochem., vol. 91, no. 6, pp. 1404-1416, 2004.

C. K. Chen, M. E. Burns, M. Spencer, G. A. Niemi, J. Chen, J. B.

40] Hurley, D. A. Baylor and M. I. Simon, "Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 96, no. 7, pp. 3718-3722, 1999.

D. P. Siderovski, A. Hessel, S. Chung, T. W. Mak and M. Tyers, "A

41] new family of regulators of G-protein-coupled receptors?," Curr. Biol., vol. 6, no. 2, pp. 211-212,1996.

C. S. Pao, B. L. Barker and J. L. Benovic, "Role of the amino terminus

42] of G protein-coupled receptor kinase 2 in receptor phosphorylation," Biochemistry, vol. 48, no. 30, pp. 7325-7333, 2009.

L. R. Johnson, M. G. Scott and J. A. Pitcher, "G protein-coupled

43] receptor kinase 5 contains a DNA-binding nuclear localization sequence," Mol. Cell. Biol., vol. 24, no. 23, pp. 10169-10179, 2004.

K. R. Dean and M. Akhtar, "Phosphorylation of solubilised dark-

44] adapted rhodopsin. Insights into the activation of rhodopsin kinase," Eur. J. Biochem., vol. 213, no. 2, pp. 881-890, 1993.

P. Singh, B. Wang, T. Maeda, K. Palczewski and J. J. Tesmer,

45] "Structures of rhodopsin kinase in different ligand states reveal key elements involved in G protein-coupled receptor kinase activation," J. Biol. Chem., vol. 283, no. 20, pp. 14053-14062, 2008.

J. A. Pitcher, J. Inglese, J. B. Higgins, J. L. Arriza, P. J. Casey, C.

46] Kim, J. L. Benovic, M. M. Kwatra, M. G. Caron and R. J. Lefkowitz, "Role of beta gamma subunits of G proteins in targeting the beta-adrenergic receptor kinase to membrane-bound receptors," Science, vol. 257, no. 5074,

pp. 1264-1267,1992.

W. J. Koch, J. Inglese, W. C. Stone and R. J. Lefkowitz, "The binding

47] site for the beta gamma subunits of heterotrimeric G proteins on the beta-adrenergic receptor kinase," J. Biol. Chem., vol. 268, no. 11, pp. 8256-8260, 1993.

S. K. DebBurman, J. Ptasienski, J. L. Benovic and M. M. Hosey, "G

48] protein-coupled receptor kinase GRK2 is a phospholipid-dependent enzyme that can be conditionally activated by G protein betagamma subunits," J. Biol. Chem., vol. 271, no. 37, pp. 22552-22562, 1996.

R. H. Stoffel, R. R. Randall, R. T. Premont and R. J. Lefkowitz,

49] "Palmitoylation of G protein-coupled receptor kinase, GRK6. Lipid modification diversity in the GRK family," J. Biol. Chem., vol. 269, no. 45, pp. 27791-27794, 1994.

X. Jiang, J. L. Benovic and P. B. Wedegaertner, "Plasma membrane

50] and nuclear localization of G protein coupled receptor kinase 6A," Mol. Biol. Cell., vol. 18, no. 8, pp. 2960-2969, 2007.

J. A. Pitcher, Z. L. Fredericks, W. C. Stone, R. T. Premont, R. H.

51] Stoffel, W. J. Koch and R. J. Lefkowitz, "Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2)-enhanced G protein-coupled receptor kinase (GRK) activity. Location, structure, and regulation of the PIP2 binding site distinguishes the GRK subfamilies," J. Biol. Chem., vol. 271, no. 40, pp. 24907-24913, 1996.

M. M. Thiyagarajan, R. P. Stracquatanio, A. N. Pronin, D. S. Evanko,

52] J. L. Benovic and P. B. Wedegaertner, "A predicted amphipathic helix mediates plasma membrane localization of GRK5," J. Biol. Chem., vol. 279, no. 17, pp. 17989-17995,2004.

D. T. Lodowski, J. F. Barnhill, R. M. Pyskadlo, R. Ghirlando, R.

53] Sterne-Marr and J. J. Tesmer, "The role of G beta gamma and domain

interfaces in the activation of G protein-coupled receptor kinase 2," Biochemistry, vol. 44, no. 18, pp. 6958-6970, 2005.

D. T. Lodowski, J. A. Pitcher, W. D. Capel, R. J. Lefkowitz and J. J.

54] Tesmer, "Keeping G proteins at bay: a complex between G protein-coupled receptor kinase 2 and Gbetagamma," Science, vol. 300, no. 5623, pp. 12561262, 2003.

V. M. Tesmer, T. Kawano, A. Shankaranarayanan, T. Kozasa and J. J.

55] Tesmer, "Snapshot of activated G proteins at the membrane: the Galphaq-GRK2-Gbetagamma complex," Science, vol. 310, no. 5754, pp. 1686-1690, 2005.

D. T. Lodowski, V. M. Tesmer, J. L. Benovic and J. J. Tesmer, "The

56] structure of G protein-coupled receptor kinase (GRK)-6 defines a second lineage of GRKs," J. Biol. Chem., vol. 281, no. 24, pp. 16785-16793, 2006.

K. Palczewski, J. Buczylko, M. W. Kaplan, A. S. Polans and J. W.

57] Crabb, "Mechanism of rhodopsin kinase activation," J. Biol. Chem., vol. 266, no. 20, pp. 12949-12955, 1991.

C. Y. Chen, S. B. Dion, C. M. Kim and J. L. Benovic, "Beta-

58] adrenergic receptor kinase. Agonist-dependent receptor binding promotes kinase activation," J. Biol. Chem., vol. 268, no. 11, pp. 7825-7831, 1993.

C. A. Boguth, P. Singh, C. C. Huang and J. J. esmer, "Molecular basis

59] for activation of G protein-coupled receptor kinases," EMBO J., vol. 29, no. 19, pp. 3249-3259,2010.

M. K. Higgins, D. D. Oprian and G. F. Schertler, "Recoverin binds

60] exclusively to an amphipathic peptide at the N terminus of rhodopsin kinase, inhibiting rhodopsin phosphorylation without affecting catalytic activity of the kinase," J. Biol Chem., vol. 281, no. 28, pp. 19426-19432, 2006.

E. V. Gurevich, J. J. Tesmer, A. Mushegian and V. V. Gurevich, "G protein-coupled receptor kinases: more than just kinases and not only for

61] GPCRs," Pharmacol Ther., vol. 133, no. 1, pp. 40-69,2012.

M. Sallese, S. Mariggio, G. Collodel, E. Moretti, P. Piomboni, B.

62] Baccetti and A. De Blasi, "G protein-coupled receptor kinase GRK4. Molecular analysis of the four isoforms and ultrastructural localization in spermatozoa and germinal cells," J. Biol. Chem., vol. 272, no. 15, pp. 1018810195, 1997.

B. Virion, D. Firsov, L. Cheval, E. Reiter, C. Troispoux, F. Guillou

63] and J. M. Elalouf, "Rat G protein-coupled receptor kinase GRK4: identification, functional expression, and differential tissue distribution of two splice variants," Endocrinology, vol. 139, no. 6, pp. 2784-2795, 1998.

D. Firsov and J. M. Elalouf, "Molecular cloning of two rat GRK6

64] splice variants," Am. J. Physiol., vol. 273, no. 3 Pt 1, pp. C953-561, 1997.

J. Inglese, J. F. Glickman, W. Lorenz, M. G. Caron and R. J.

65] Lefkowitz, "Isoprenylation of a protein kinase. Requirement of farnesylation/alpha-carboxyl methylation for full enzymatic activity of rhodopsin kinase," J. Biol. Chem., vol. 267, no. 3, pp. 1422-1425, 1992.

O. Hisatomi, S. Matsuda, T. Satoh, S. Kotaka, Y. Imanishi and F.

66] Tokunaga, "A novel subtype of G-protein-coupled receptor kinase, GRK7, in teleost cone photoreceptors," FEBSLett., vol. 424, no. 3, pp. 159-164, 1998.

C. M. Krispel, D. Chen, N. Melling, Y. J. Chen, K. A. Martemyanov,

67] N. Quillinan, V. Y. Arshavsky, T. G. Wensel, C. K. Chen and M. E. Burns, "RGS expression rate-limits recovery of rod photoresponses," Neuron, vol. 51, no. 4, pp. 409-416,2006.

H. Ktihn, "Light-regulated binding of rhodopsin kinase and other

68] proteins to cattle photoreceptor membranes," Biochemistry, vol. 17, no. 21, pp. 4389-4395,1978.

J. S. Anant and B. K. Fung, "In vivo farnesylation of rat rhodopsin kinase," Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 183, no. 2, pp. 468-473,

69] 1992.

J. Inglese, W. J. Koch, M. G. Caron and R. J. Lefkowitz,

70] "Isoprenylation in regulation of signal transduction by G-protein-coupled receptor kinases," Nature, vol. 359, no. 6391, pp. 147-150, 1992.

H. Zhang, S. Li, T. Doan, F. Rieke, P. B. Detwiler, J. M. Frederick and

71] W. Baehr, "Deletion of PrBP/delta impedes transport of GRK1 and PDE6 catalytic subunits to photoreceptor outer segments," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 104, no. 21, pp. 8857-8862, 2007.

K. Haga and T. Haga, "Activation by G protein beta gamma subunits

72] of agonist- or light-dependent phosphorylation of muscarinic acetylcholine receptors and rhodopsin," J. Biol. Chem., vol. 267, no. 4, pp. 2222-2227, 1992.

J. A. Pitcher, K. Touhara, E. S. Payne and R. J. Lefkowitz, "Pleckstrin

73] homology domain-mediated membrane association and activation of the beta-adrenergic receptor kinase requires coordinate interaction with G beta gamma subunits and lipid," J. Biol. Chem., vol. 270, no. 20, pp. 1170711710, 1995.

R. P. Loudon and J. L. Benovic, "Altered activity of palmitoylation-

74] deficient and isoprenylated forms of the G protein-coupled receptor kinase GRK6," J. Biol. Chem., vol. 272, no. 43, pp. 27422-27427, 1997.

R. H. Stoffel, J. Inglese, A. D. Macrae, R. J. Lefkowitz and R. T.

75] Premont, "Palmitoylation increases the kinase activity of the G proteincoupled receptor kinase, GRK6," Biochemistry, vol. 37, no. 46, pp. 1605316059, 1998.

T. M. Tran, R. Jorgensen and R. B. Clark, "Phosphorylation of the

76] beta2-adrenergic receptor in plasma membranes by intrinsic GRK5," Biochemistry, vol. 46, no. 50, pp. 14438-14449., 2007.

P. Vatter, C. Stoesser, I. Samel, P. Gierschik and B. Moepps, "The

77] variable C-terminal extension of G-protein-coupled receptor kinase 6 constitutes an accessorial autoregulatory domain," FEBS J., vol. 272, no. 23, pp. 6039-6051,2005.

J. S. Martini, P. Raake, L. E. Vinge, B. R. J. DeGeorge, J. K. Chuprun,

78] D. M. Harris, E. Gao, A. D. Eckhart, J. A. Pitcher and W. J. Koch, "Uncovering G protein-coupled receptor kinase-5 as a histone deacetylase kinase in the nucleus of cardiomyocytes," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 105, no. 34, pp. 12457-12462, 2008.

B. M. Binder, M. S. Biernbaum and M. D. Bownds, "Light activation

79] of one rhodopsin molecule causes the phosphorylation of hundreds of others. A reaction observed in electropermeabilized frog rod outer segments exposed to dim illumination," J. Biol. Chem., vol. 265, no. 25, pp. 15333-15340, 1990.

B. M. Binder, T. M. O'Connor, M. D. Bownds and V. Y. Arshavsky,

80] "Phosphorylation of non-bleached rhodopsin in intact retinas and living frogs," J. Biol. Chem., vol. 271, no. 33, pp. 19826-19830, 1996.

G. W. Shi, J. Chen, F. Concepción, K. Motamedchaboki, P. Marjoram,

81] R. Langen and C. J., "Light causes phosphorylation of nonactivated visual pigments in intact mouse rod photoreceptor cells," J. Biol. Chem., vol. 280, no. 50, pp. 41184-41191, 2005.

C. Fowles, R. Sharma and M. Akhtar, "Mechanistic studies on the

82] phosphorylation of photoexcited rhodopsin," FEBS Lett., vol. 238, no. 1, p. 56-60, 1988.

J. L. Benovic, F. J. Mayor, R. L. Somers, M. G. Caron and R. J.

83] Lefkowitz, "Light-dependent phosphorylation of rhodopsin by beta-adrenergic receptor kinase," Nature, vol. 321, no. 6073, pp. 869-872,1986.

K. Palczewski, "GTP-binding-protein-coupled receptor kinases—two

84] mechanistic models," Eur. J. Biochem., vol. 248, no. 2, pp. 261-269, 1997.

L. Menard, S. S. Ferguson, L. S. Barak, L. Bertrand, R. T. Premont, A.

85] M. Colapietro, R. J. Lefkowitz and M. G. Caron, "Members of the G proteincoupled receptor kinase family that phosphorylate the beta2-adrenergic receptor facilitate sequestration," Biochemistry, vol. 35, no. 13, pp. 41554160, 1996.

M. L. Rankin, P. S. Marinec, D. M. Cabrera, Z. Wang and P. A. Jose,

86] "The D1 dopamine receptor is constitutively phosphorylated by G proteincoupled receptor kinase 4," Mol. Pharmacol., vol. 69, no. 3, pp. 759-769. , 2006.

Q. M. Yu, Z. J. Cheng, X. Q. Gan, G. B. Bao, L. Li and G. Pei, "The

87] amino terminus with a conserved glutamic acid of G protein-coupled receptor kinases is indispensable for their ability to phosphorylate photoactivated rhodopsin," J. Neurochem., vol. 73, no. 3, pp. 1222-1227, 1999.

C. C. Huang, K. Yoshino-Koh and J. J. Tesmer, "A surface of the

88] kinase domain critical for the allosteric activation of G protein-coupled receptor kinases," J. Biol. Chem., vol. 284, no. 25, pp. 17206-17215, 2009.

R. Sterne-Marr, P. A. Leahey, J. E. Bresee, H. M. Dickson, W. Ho, M.

89] J. Ragusa, R. M. Donnelly, S. M. Amie, J. A. Krywy, E. D. Brookins-Danz, S. C. Orakwue, M. J. Carr, K. Yoshino-Koh, Q. Li and J. J. Tesmer, "GRK2 activation by receptors: role of the kinase large lobe and carboxyl-terminal tail," Biochemistry, vol. 48, no. 20, pp. 4285-4293, 2009.

C. C. Huang, T. Orban, B. Jastrzebska, K. Palczewski and J. J.

90] Tesmer, "Activation of G protein-coupled receptor kinase 1 involves interactions between its N-terminal region and its kinase domain," Biochemistry, vol. 50, no. 11, pp. 1940-1949, 2011.

K. Palczewski, J. Buczylko, L. Lebioda, J. W. Crabb and A. S. Polans,

91] "Identification of the N-terminal region in rhodopsin kinase involved in its

interaction with rhodopsin," J. Biol. Chem., vol. 268, no. 8, pp. 6004-6013, 1993.

P. Scheerer, J. H. Park, P. W. Hildebrand, Y. J. Kim, N. Krauss, H. W.

92] Choe, K. P. Hofmann and O. P. Ernst, "Crystal structure of opsin in its G-protein-interacting conformation," Nature, vol. 455, no. 7212, pp. 497-502, 2008.

X. Q. Gan, J. Y. Wang, Q. H. Yang, Z. Li, F. Liu, G. Pei and L. Li,

93] "Interaction between the conserved region in the C-terminal domain of GRK2 and rhodopsin is necessary for GRK2 to catalyze receptor phosphorylation," J. Biol. Chem., vol. 275, no. 12, pp. 8469-8474, 2000.

X. Gan, Z. Ma, N. Deng, J. Wang, J. Ding and L. Li, "Involvement of

94] the C-terminal proline-rich motif of G protein-coupled receptor kinases in recognition of activated rhodopsin," J. Biol. Chem., vol. 279, no. 48, pp. 49741-49746, 2004.

G. K. Dhami, L. B. Dale, P. H. Anborgh, K. E. O'Connor-Halligan, R.

95] Sterne-Marr and S. S. Ferguson, "G Protein-coupled receptor kinase 2 regulator of G protein signaling homology domain binds to both metabotropic glutamate receptor la and Galphaq to attenuate signaling," J. Biol. Chem., vol. 279, no. 16, pp. 16614-16620, 2004.

F. Baameur, D. H. Morgan, H. Yao, T. M. Tran, R. A. Hammitt, S.

96] Sabui, J. S. McMurray, O. Lichtarge and R. B. Clark, "Role for the regulator of G-protein signaling homology domain of G protein-coupled receptor kinases 5 and 6 in beta 2-adrenergic receptor and rhodopsin phosphorylation," Mol. Pharmacol, vol. 77, no. 3, pp. 405-415, 2010.

H. W. Choe, Y. J. Kim, J. H. Park, T. Morizumi, E. F. Pai, N. Krauss,

97] K. P. Hofmann, P. Scheerer and O. P. Ernst, "Crystal structure of metarhodopsin II," Nature, vol. 471, no. 7340, pp. 651-655, 2011.

S. G. Rasmussen, H. J. Choi, J. J. Fung, E. Pardon, P. Casarosa, P. S.

98] Chae, B. T. Devree, D. M. Rosenbaum, F. S. Thian, T. S. Kobilka, A. Schnapp, I. Konetzki, R. K. Sunahara, S. H. Gellman, A. Pautsch, J. Steyaert, W. I. Weis and B. K. Kobilka, "Structure of a nanobody-stabilized active state of the P(2) adrenoceptor," Nature, vol. 469, no. 7329, pp. 175-180, 2011.

J. Standfuss, P. C. Edwards, A. D'Antona, M. Fransen, G. Xie, D. D.

99] Oprian and G. F. Schertler, "The structural basis of agonist-induced activation in constitutively active rhodopsin," Nature, vol. 471, no. 7340, pp. 656-660, 2011.

S. G. Rasmussen, B. T. DeVree, Y. Zou, A. C. Kruse, K. Y. Chung, T.

100] S. Kobilka, F. S. Thian, P. S. Chae, E. Pardon, D. Calinski, J. M. Mathiesen, S. T. Shah, J. A. Lyons, M. Caffrey, S. H. Gellman, J. Steyaert, G. Skiniotis, W. I. Weis, R. K. Sunahara and B. K. Kobilka, "Crystal structure of the p2 adrenergic receptor-Gs protein complex," Nature, vol. 477, no. 7366, pp. 549-555,2011.

R. Panetta and M. T. Greenwood, "Physiological relevance of GPCR

101] oligomerization and its impact on drug discovery," Drug Discov. Today, vol. 13, no. 23-24, pp. 1059-1066, 2008.

A. A. Kaczor and J. Selent, "Oligomerization of G protein-coupled

102] receptors: biochemical and biophysical methods," Curr. Med. Chem., vol. 18, no. 30, pp. 4606-4634, 2011.

T. H. Bayburt, S. A. Vishnivetskiy, M. A. McLean, T. Morizumi, C.

103] C. Huang, J. J. Tesmer, O. P. Ernst, S. G. Sligar and V. V. Gurevich, "Monomeric rhodopsin is sufficient for normal rhodopsin kinase (GRK1) phosphorylation and arrestin-1 binding," J. Biol. Chem., vol. 286, no. 2, pp. 1420-1428,2011.

B. A. Shoemaker, J. J. Portman and P. G. Wolynes, "Speeding

104] molecular recognition by using the folding funnel: the fly-casting

mechanism," Proc. Natl Acad. Sci. USA, vol. 97, no. 16, pp. 8868-8873, 2000.

M. S. Cortese, V. N. Uversky and A. K. Dunker, "Intrinsic disorder in

105] scaffold proteins: getting more from less," Prog. Biophys. Mol. Biol., vol. 98, no. l,pp. 85-106, 2008.

C. M. Kim, S. B. Dion and J. L. Benovic, "Mechanism of beta-

106] adrenergic receptor kinase activation by G proteins," J. Biol. Chem., vol. 268, no. 21, pp. 15412-15418, 1993.

S. K. DebBurman, J. Ptasienski, E. Boetticher, J. W. Lomasney, J. L.

107] Benovic and M. M. Hosey, "Lipid-mediated regulation of G protein-coupled receptor kinases 2 and 3," J. Biol. Chem., vol. 270, no. 11, pp. 5742-5747, 1995.

Y. Daaka, J. A. Pitcher, M. Richardson, R. H. Stoffel, J. D. Robishaw

108] and R. J. Lefkowitz, "Receptor and G betagamma isoform-specific interactions with G protein-coupled receptor kinases," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 94, no. 6, pp. 2180-2815, 1997.

P. Kunapuli and J. L. Benovic, "Cloning and expression of GRK5: a

109] member of the G protein-coupled receptor kinase family," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90, no. 12, pp. 5588-5592, 1993.

J. Buczylko, C. Gutmann and K. Palczewski, "Regulation of rhodopsin

110] kinase by autophosphorylation," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 88, no. 6, pp. 2568-2572, 1991.

K. Palczewski, J. Buczylko, P. Van Hooser, S. A. Carr, M. J.

111] Huddleston and J. W. Crabb, "Identification of the autophosphorylation sites in rhodopsin kinase," J. Biol. Chem., vol. 267, no. 26, pp. 18991-18998, 1992.

A. Pulvermuller, K. Palczewski and K. P. Hofmann, "Interaction between photoactivated rhodopsin and its kinase: stability and kinetics of

112] complex formation," Biochemistry, vol. 32, no. 51, pp. 14082-14088, 1993.

K. Palczewski, H. Ohguro, R. T. Premont and J. Inglese, "Rhodopsin

113] kinase autophosphorylation. Characterization of site-specific mutations," J. Biol Chem., vol. 270, no. 25, pp. 15294-15298, 1995.

T. J. Horner, S. Osawa, M. D. Schaller and E. R. Weiss,

114] "Phosphorylation of GRK1 and GRK7 by cAMP-dependent protein kinase attenuates their enzymatic activities," J. Biol Chem., vol. 280, no. 31, pp. 28241-28250, 2005.

S. Osawa, R. Jo and E. R. Weiss, "Phosphorylation of GRK7 by PKA

115] in cone photoreceptor cells is regulated by light," J. Neurochem., vol. 107, no. 5, pp. 1314-1324, 2008.

S. Osawa, R. Jo, Y. Xiong, B. Reidel, N. Tserentsoodol, V. Y.

116] Arshavsky, P. M. Iuvone and E. R. Weiss, "Phosphorylation of G proteincoupled receptor kinase 1 (GRK1) is regulated by light but independent of phototransduction in rod photoreceptors," J. Biol Chem., vol. 286, no. 23, pp. 20923-20929, 2011.

P. Kunapuli, V. V. Gurevich and J. L. Benovic, "Phospholipid-

117] stimulated autophosphorylation activates the G protein-coupled receptor kinase GRK5," J. Biol Chem., vol. 269, no. 14, pp. 10209-10212, 1994.

A. C. Newton, "Analyzing protein kinase C activation," Methods

118] Enzymol., vol. 345, pp. 499-506, 2002.

L. R. Pearce, D. Komander and D. R. Alessi, "The nuts and bolts of

119] AGC protein kinases," Nat. Rev. Mol. Cell Biol., vol. 11, no. 1, pp. 9-22, 2010.

A. N. Pronin and J. L. Benovic, "Regulation of the G protein-coupled

120] receptor kinase GRK5 by protein kinase C," J. Biol Chem., vol. 272, no. 6, pp. 3806-3812,1997.

T. T. Chuang, H. 3. LeVine and A. De Blasi, "Phosphorylation and

121] activation of beta-adrenergic receptor kinase by protein kinase C," J. Biol. Chem., vol. 270, no. 31, pp. 18660-18665,1995.

R. Winstel, S. Freund, C. Krasel, E. Hoppe and M. J. Lohse, "Protein

122] kinase cross-talk: membrane targeting of the beta-adrenergic receptor kinase by protein kinase C," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 93, no. 5, pp. 21052109, 1996.

M. Cong, S. J. Perry, F. T. Lin, I. D. Fraser, L. A. Hu, W. Chen, J. A.

123] Pitcher, J. D. Scott and R. J. Lefkowitz, "Regulation of membrane targeting of the G protein-coupled receptor kinase 2 by protein kinase A and its anchoring protein AKAP79.," J. Biol. Chem., vol. 276, no. 18, pp. 1519215199, 2001.

S. Sarnago, A. Elorza and F. J. Mayor, "Agonist-dependent

124] phosphorylation of the G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) by Src tyrosine kinase," J. Biol. Chem., vol. 274, no. 48, pp. 34411-34416, 1999.

S. Mariggió, C. García-Hoz, S. Sarnago, A. De Blasi, F. J. Mayor and

125] C. Ribas, "Tyrosine phosphorylation of G-protein-coupled-receptor kinase 2 (GRK2) by c-Src modulates its interaction with Galphaq," Cell Signal., vol. 18, no. 11, pp. 2004-2012, 2006.

J. A. Pitcher, J. J. Tesmer, J. L. Freeman, W. D. Capel, W. C. Stone

126] and R. J. Lefkowitz, "Feedback inhibition of G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) activity by extracellular signal-regulated kinases," J. Biol. Chem., vol. 274, no. 49, pp. 34531-34534,1999.

A. Elorza, S. Sarnago and F. J. Mayor, "Agonist-dependent

127] modulation of G protein-coupled receptor kinase 2 by mitogen-activated protein kinases," Mol. Pharmacol., vol. 57, no. 4, pp. 778-783, 2000.

L. M. Luttrell, F. L. Roudabush, E. W. Choy, W. E. Miller, M. E.

128] Field, K. L. Pierce and R. J. Lefkowitz, "Activation and targeting of

extracellular signal-regulated kinases by beta-arrestin scaffolds," Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 98, no. 5, pp. 2449-2454, 2001.

J. L. Freeman, P. Gonzalo, J. A. Pitcher, A. Claing, J. P. Lavergne, J.

129] P. Reboud and R. J. Lefkowitz, "Beta 2-adrenergic receptor stimulated, G protein-coupled receptor kinase 2 mediated, phosphorylation of ribosomal protein P2," Biochemistry, vol. 41, no. 42, pp. 12850-12857, 2002.

J. H. Wu, R. Goswami, X. Cai, S. T. Exum, X. Huang, L. Zhang, L.

130] Brian, R. T. Premont, K. Peppel and N. J. Freedman, "Regulation of the platelet-derived growth factor receptor-beta by G protein-coupled receptor kinase-5 in vascular smooth muscle cells involves the phosphatase Shp2," J. Biol. Chem., vol. 281, no. 49, pp. 37758-37772, 2006.

J. H. Wu, R. Goswami, L. K. Kim, W. E. Miller, K. Peppel and N. J.

131] Freedman, "The platelet-derived growth factor receptor-beta phosphorylates and activates G protein-coupled receptor kinase-2. A mechanism for feedback inhibition," J. Biol. Chem., vol. 280, no. 35, pp. 31027-31035, 2005.

B. W. Schäfer and C. W. Heizmann, "The SI00 family of EF-hand

132] calcium-binding proteins: functions and pathology," Trends Biochem. Sei., vol. 21, no. 4, pp. 134-140, 1996.

M. Ikura, "Calcium binding and conformational response in EF-hand

133] proteins," Trends Biochem. Sei., vol. 21, no. 1, pp. 14-17, 1996.

F. Haeseleer, I. Sokal, C. L. Verlinde, H. Erdjument-Bromage, P.

134] Tempst, A. N. Pronin, J. L. Benovic, R. N. Fariss and K. Palczewski, "Five members of a novel Ca(2+)-binding protein (CABP) subfamily with similarity to calmodulin," J. Biol. Chem., vol. 275, no. 2, pp. 1247-1260, 2000.

M. Sallese, L. Iacovelli, A. Cumashi, L. Capobianco, L. Cuomo and A.

135] De Blasi, "Regulation of G protein-coupled receptor kinase subtypes by

calcium sensor proteins," Biochim. Biophys. Acta, vol. 1498, no. 2-3, pp. 112-121,2000.

C. K. Chen, J. Inglese, R. J. Lefkowitz and J. B. Hurley, "Ca(2+)-

136] dependent interaction of recoverin with rhodopsin kinase," J. Biol. Chem., vol. 270, no. 30, pp. 18060-18066, 1995.

V. A. Klenchin, P. D. Calvert and M. D. Bownds, "Inhibition of

137] rhodopsin kinase by recoverin. Further evidence for a negative feedback system in phototransduction," J. Biol. Chem., vol. 270, no. 27, pp. 1614716152, 1995.

D. K. Satpaev, C. K. Chen, A. Scotti, M. I. Simon, J. B. Hurley and V.

138] Z. Slepak, "Autophosphorylation and ADP regulate the Ca2+-dependent interaction of recoverin with rhodopsin kinase," Biochemistry, vol. 37, no. 28, pp. 10256-10262, 1998.

J. B. Ames, K. Levay, J. N. Wingard, J. D. Lusin and V. Z. Slepak,

139] "Structural basis for calcium-induced inhibition of rhodopsin kinase by recoverin," J. Biol. Chem., vol. 281, no. 48, pp. 37237-37245, 2006.

K. E. Komolov, I. I. Senin, N. A. Kovaleva, M. P. Christoph, V. A.

140] Churumova, I. I. Grigoriev, M. Akhtar, P. P. Philippov and K. W. Koch, "Mechanism of rhodopsin kinase regulation by recoverin," J. Neurochem., vol. 110, no. 1, pp. 72-79, 2009.

K. J. Strissel, P. V. Lishko, L. H. Trieu, M. J. Kennedy, J. B. Hurley

141] and V. Y. Arshavsky, "Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors," J. Biol. Chem., vol. 280, no. 32, pp. 29250-29255, 2005.

C. L. Makino, R. L. Dodd, J. Chen, M. E. Burns, A. Roca, M. I. Simon

142] and D. A. Baylor, "Recoverin regulates light-dependent phosphodiesterase activity in retinal rods," J. Gen. Physiol., vol. 123, no. 6, pp. 729-741, 2004.

A. P. Sampath, K. J. Strissel, R. Elias, V. Y. Arshavsky, J. F.

143] McGinnis, J. Chen, S. Kawamura, F. Rieke and J. B. Hurley, "Reeoverin improves rod-mediated vision by enhancing signal transmission in the mouse retina," Neuron, vol. 46, no. 3, pp. 413-420, 2005.

C. K. Chen, M. L. Woodruff, F. S. Chen, D. Chen and G. L. Fain,

144] "Background light produces a recoverin-dependent modulation of activated-rhodopsin lifetime in mouse rods," J. Neurosci., vol. 30, no. 4, pp. 12131220, 2010.

E. De Castro, S. Nef, H. Fiumelli, S. E. Lenz, S. Kawamura and P.

145] Nef, "Regulation of rhodopsin phosphorylation by a family of neuronal calcium sensors," Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 216, no. 1, pp. 133140, 1995.

D. Arinobu, S. Tachibanaki and S. Kawamura, "Larger inhibition of

146] visual pigment kinase in cones than in rods," J. Neurochem., vol. 115, no. 1, pp. 259-268,2010.

A. N. Pronin, D. K. Satpaev, V. Z. Slepak and J. L. Benovic,

147] "Regulation of G protein-coupled receptor kinases by calmodulin and localization of the calmodulin binding domain," J. Biol. Chem., vol. 272, no. 29, pp. 18273-18280, 1997.

R. T. Premont, W. J. Koch, J. Inglese and R. J. Lefkowitz,

148] "Identification, purification, and characterization of GRK5, a member of the family of G protein-coupled receptor kinases.," J. Biol. Chem., vol. 269, no. 9, pp. 6832-6841,1994.

E. J. Whalen, M. W. Foster, A. Matsumoto, K. Ozawa, J. D. Violin, L.

149] G. Que, C. D. Nelson, M. Benhar, J. R. Keys, H. A. Rockman, W. J. Koch, Y. Daaka, R. J. Lefkowitz and J. S. Stamler, "Regulation of beta-adrenergic receptor signaling by S-nitrosylation of G-protein-coupled receptor kinase 2," Cell, vol. 129, no. 3, pp. 511-522, 2007.

H. Shichi and R. L. Somers, "Light-dependent phosphorylation of

150] rhodopsin. Purification and properties of rhodopsin kinase," J. Biol. Chem., vol. 253, no. 19, pp. 7040-7046,1978.

K. Palczewski, J. H. McDowell and P. A. Hargrave, "Purification and

151] characterization of rhodopsin kinase," J. Biol. Chem., vol. 263, no. 28, pp. 14067-14073, 1988.

D. I. Papac, J. E. J. Oatis, R. K. Crouch and D. R. Knapp, "Mass

152] spectrometric identification of phosphorylation sites in bleached bovine rhodopsin," Biochemistry, vol. 32, no. 23, pp. 5930-5934,1993.

M. J. Kennedy, K. A. Lee, G. A. Niemi, K. B. Craven, G. G. Garwin,

153] J. C. Saari and J. B. Hurley, "Multiple phosphorylation of rhodopsin and the in vivo chemistry underlying rod photoreceptor dark adaptation," Neuron, vol. 31, no. l,pp. 87-101,2001.

S. Zozulya and L. Stryer, "Calcium-myristoyl protein switch," Proc.

154] Natl. Acad. Sci. USA, vol. 89, no. 23, pp. 11569-11573, 1992.

I. I. Senin, A. A. Zargarov, A. M. Alekseev, E. N. Gorodovikova, V.

155] M. Lipkin and P. P. Philippov, "N-myristoylation of recoverin enhances its efficiency as an inhibitor of rhodopsin kinase," FEBS Lett., vol. 376, no. 1-2, pp. 87-90, 1995.

K. Sanada, F. Shimizu, K. Kameyama, K. Haga and Y. Fukada,

156] "Calcium-bound recoverin targets rhodopsin kinase to membranes to inhibit rhodopsin phosphorylation," FEBS Lett., vol. 384, no. 3, pp. 227-230, 1996.

D. M. Bers, C. W. Patton and R. Nuccitell, "A practical guide to the

157] preparation of Ca2+ buffers," in Methods in Cell Biology, vol. 40, R. Nuccitelli, Ed., Elsevier Inc., 1994, pp. 3-29.

D. S. Papermaster and W. J. Dreyer, "Rhodopsin content in the outer

158] segment membranes of bovine and frog retinal rods.," Biochemistry, vol. 13, no. 11, pp. 2438-2444, 1974.

I. I. Senin, T. Fischer, K. E. Komolov, D. V. Zinchenko, P. P.

159] Philippov and K. W. Koch, "Ca2+-myristoyl switch in the neuronal calcium sensor recoverin requires different functions of Ca2+-binding sites," J. Biol. Chem., vol. 277, no. 52, pp. 50365-50372,2002.

H. Kiihn, "Interactions of Rod Cell Proteins with the Disk Membrane:

160] Influence of Light, Ionic Strength, and Nucleotides," in Current Topics in Membranes and Transport, vol. 15, F. Bronner and A. Kleinzeller, Eds., Elsevier Inc., 1981, pp. 171-201.

K. E. Komolov and K. W. Koch, "Application of surface plasmon

161] resonance spectroscopy to study G-protein coupled receptor signalling," in Methods in Molecular Biology, vol. 627, N. J. de Mol and M. J. E. Fischer, Eds., Humana Press, 2010, pp. 249-260.

R. Gopalakrishna and W. B. Anderson, "Ca2+-induced hydrophobic

162] site on calmodulin: application for purification of calmodulin by phenyl -Sepharose affinity chromatography," Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 104, no. 2, pp. 830-836,1982.

O. H. Weiergraber, I. I. Senin, E. Y. Zernii, V. A. Churumova, N. A.

163] Kovaleva, A. A. Nazipova, S. E. Permyakov, E. A. Permyakov, P. P. Philippov, J. Granzin and K. W. Koch, "Tuning of a neuronal calcium sensor," J. Biol Chem., vol. 281, no. 49, pp. 37594-37602, 2006.

E. Stenberg, B. Persson, H. Roos and C. Urbaniczky, "Quantitative

164] determination of surface concentration of protein with surface plasmon resonance using radiolabeled proteins," J. Colloid and Interface Science, vol. 143, no. 2, pp. 513-526,1991.

D. G. Myszka, "Improving biosensor analysis," J. Mol. Recognit., vol.

165] 12, no. 5, pp. 279-284, 1999.

U. K. Laemmli, "Cleavage of structural proteins during the assembly

166] of the head of bacteriophage T4," Nature, vol. 227, no. 5259, pp. 680-685,

1970.

H. Towbin, T. Staehelin and J. Gordon, "Electrophoretic transfer of

167] proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 76, no. 9, pp. 43504354, 1979.

W. C. J. Johnson, K. Palczewski, W. A. Gorczyca, J. H. Riazance-

168] Lawrence, D. Witkowska and A. S. Polans, "Calcium binding to recoverin: implications for secondary structure and membrane association," Biochim. Biophys. Acta, vol. 1342, no. 2, pp. 164-174, 1997.

R. W. Wallace, E. A. Tallant and W. Y. Cheung, "Assay of calmodulin

169] by Ca2+-dependent phosphodiesterase," in Methods in Enzymology, vol. 102, A. R. Means and B. W. O'Malley, Eds., Academic Press, 1983, pp. 39-47.

M. M. Bradford, "A rapid and sensitive method for the quantitation of

170] microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding," Anal. Biochem., vol. 72, pp. 248-254, 1976.

K. Levay, D. K. Satpaev, A. N. Pronin, J. L. Benovic and V. Z.

171] Slepak, "Localization of the sites for Ca2+-binding proteins on G proteincoupled receptor kinases," Biochemistry, vol. 37, no. 39, pp. 13650-13659, 1998.

T. T. Chuang, L. Paolucci and A. De Blasi, "Inhibition of G protein-

172] coupled receptor kinase subtypes by Ca2+/calmodulin," J. Biol. Chem., vol. 271, no. 45, pp. 28691-28696, 1996.

S. Kakiuchi, S. Yasuda, R. Yamazaki, Y. Teshima, K. Kanda, R.

173] Kakiuchi and K. Sobue, "Quantitative determinations of calmodulin in the supernatant and particulate fractions of mammalian tissues," J. Biochem., vol. 92, no. 4, pp. 1041-1048, 1982.

R. E. Kohnken, J. G. Chafouleas, D. M. Eadie, A. R. Means and D. G. McConnell, "Calmodulin in bovine rod outer segments," J. Biol. Chem., vol.

174] 256, no. 23, pp. 12517-12522, 1981.

P. A. Liebman, "Microspectrophotometry of photoreceptors," in

175] Handbook of Sensory Physiology, vol. VII, Berlin, Springer, 1972, pp. 481528.

M. L. Woodruff, A. P. Sampath, H. R. Matthews, N. V. Krasnoperova,

176] J. Lem and G. L. Fain, "Measurement of cytoplasmic calcium concentration in the rods of wild-type and transducin knock-out mice," J. Physiol., vol. 542, no. 3, pp. 843-854, 2002.

M. P. Gray-Keller and P. B. Detwiler, "The calcium feedback signal in

177] the phototransduction cascade of vertebrate rods," Neuron, vol. 13, no. 4, pp. 849-861, 1994.

R. Dagher, S. Peng, S. Gioria, M. Fève, M. Zeniou, M. Zimmermann,

178] C. Pigault, J. Haiech and M. C. Kilhoffer, "A general strategy to characterize calmodulin-calcium complexes involved in CaM-target recognition: DAPK and EGFR calmodulin binding domains interact with different calmodulin-calcium complexes," Biochim. Biophys. Acta, vol. 1813, no. 5, pp. 10591067, 2011.

N. E. McCarthy and M. Akhtar, "Function of the farnesyl moiety in

179] visual signalling," Biochem. J., vol. 347, no. 1, pp. 163-171, 2000.

J. B. Ames, T. Porumb, T. Tanaka, M. Ikura and L. Stryer, "Amino-

180] terminal myristoylation induces cooperative calcium binding to recoverin," J. Biol. Chem., vol. 270, no. 9, pp. 4526-4533., 1995.

I. I. Senin, D. Höppner-Heitmann, O. O. Polkovnikova, V. A.

181] Churumova, N. K. Tikhomirova, P. P. Philippov and K. W. Koch, "Recoverin and rhodopsin kinase activity in detergent-resistant membrane rafts from rod outer segments," J. Biol. Chem., vol. 279, no. 47, pp. 4864748653,2004.

J. M. Shifman, M. H. Choi, S. Mihalas, S. L. Mayo and M. B.

182] Kennedy, "Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) is activated by calmodulin with two bound calciums," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 103, no. 38, pp. 13968-13973,2006.

E. Y. Zernii, K. E. Komolov, S. E. Permyakov, T. Kolpakova, D.

183] Dell'orco, A. Poetzsch, E. L. Knyazeva, 1.1. Grigoriev, E. A. Permyakov, I. I. Senin, P. P. Philippov and K. W. Koch, "Involvement of the recoverin C-terminal segment in recognition of the target enzyme rhodopsin kinase," Biochem. J., vol. 435, no. 2, pp. 441-450, 2011.

H. V. McCue, L. P. Haynes and R. D. Burgoyne, "The diversity of

184] calcium sensor proteins in the regulation of neuronal function," Cold Spring Harb. Perspect. Biol., vol. 2, no. 8, p. a004085, 2010.

M. Mikhaylova, J. Hradsky and M. R. Kreutz, "Between promiscuity

185] and specificity: novel roles of EF-hand calcium sensors in neuronal Ca2+ signalling," J. Neurochem., vol. 118, no. 5, pp. 695-713, 2011.