Химиолучевое лечение местнораспространенного рака шейки матки и факторы прогноза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.13, доктор наук Мкртчян Лиана Сирекановна

• Мкртчян Лиана Сирекановна
• доктор наук
• 2020

Оглавление диссертации доктор наук Мкртчян Лиана Сирекановна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Обзор литературы

1.1. Эпидемиологические аспекты рака шейки матки

1.2. Лечение местнораспространенного рака шейки матки

1.2.1. Сочетанная лучевая терапия

1.2.2. Химиолучевая терапия

1.2.2.1. Одновременное химиолучевое лечение

1.2.2.2. Последовательное химиолучевое лечение

1.3. Вирус папилломы человека высокого (ВПЧ) канцерогенного риска

(ВКР) при инвазивном раке шейки матки

1.3.1. ВПЧ ВКР и его молекулярно-генетические параметры: распространенность, связь с клинико-морфологическими характеристиками РШМ и прогностическое значение

1.3.1.1. Генотип ВПЧ ВКР

1.3.1.2. Множественная ВПЧ-инфекция

1.3.1.3. Вирусная нагрузка

1.3.1.4. Интеграция ДНК ВПЧ в клеточный геном

1.3.2. ВПЧ-отрицательный РШМ: распространенность, связь с клинико-морфологическими характеристиками РШМ и прогностическое значение

1.3.3. Молекулярно-клеточные механизмы влияния папилломавирусной инфекции на чувствительность опухолевых клеток к радиационному

и химическому воздействиям

1.3.3.1. Наличие/отсутствие ВПЧ и чувствительность клеток

к противоопухолевым воздействиям

1.3.3.2. Генотип ВПЧ как фактор чувствительности опухолевых

клеток к ионизирующему излучению

1.3.3.3. Влияние интеграции ДНК ВПЧ в клеточный геном и вирусной нагрузки на радио- и химиочувствительность опухолевых клеток

1.3.3.4. Папилломавирусная инфекция и проблема опухолевых

стволовых клеток

1.4. Современные подходы к оценке и повышению качества жизни

больных РШМ после специализированного лечения

ГЛАВА 2. Материал и методы исследования

2.1. Характеристика групп исследования

2.1.1. Клинико-морфологическая характеристика больных когорты I

2.1.2. Клинико-морфологическая характеристика больных когорты II

2.1.3. Клинико-морфологическая характеристика больных когорты III

2.1.4. Клинико-анамнестическая характеристика больных когорты IV

2.2. Методы исследования

2.2.1. Характеристика методов лечения

2.2.1.1. Методика сочетанной лучевой терапии

2.2.1.2. Методика одновременного химиолучевого лечения

2.2.1.3. Методика последовательного химиолучевого лечения

2.2.1.4. Методы оценки эффективности и переносимости

сочетанной лучевой/химиолучевой терапии

2.2.2. Методика выявления наличия ВПЧ ВКР, его генотипа, количественных и качественных параметров

2.2.3. Методика оценки и повышения качества жизни больных после сочетанной лучевой и химиолучевой терапии

2.2.4. Методы статистической обработки результатов

ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований

3.1. Оценка эффективности различных вариантов временного сочетания СЛТ и ПХТ при лечении больных РШМ II-III стадий (когорта I)

3.1.1. Непосредственные результаты лечения

3.1.2. Отдалённые результаты лечения

3.1.3. Побочные реакции и осложнения лечения

3.1.3.1. Лучевые реакции

3.1.3.2. Гематологическая и гастроинтестинальная токсичность

3.1.3.3. Осложнения после лучевого/химиолучевого лечения

3.2. Особенности ВПЧ ВКР-инфицированности у больных РШМ

(когорта II)

3.2.1. Сопоставление клинико-морфологических показателей опухолевого процесса с наличием /отсутствием и различными генотипами ДНК ВПЧ ВКР

3.2.2. Сопоставление клинико-морфологических показателей опухолевого процесса с вирусной нагрузкой

3.2.3. Сопоставление клинико-морфологических показателей опухолевого процесса с физическим статусом ДНК ВПЧ

3.2.4. Сопоставление качественных и количественных параметров

ВПЧ ВКР у больных РШМ

3.2.5. Многофакторный анализ особенностей ВПЧ-инфицирования

и клинико-морфологических характеристик больных РШМ

3.3. Оценка значимости ВПЧ-инфицирования и молекулярно-генетических параметров ВПЧ ВКР для прогнозирования результатов лечения местнораспространенного РШМ (когорта III)

3.3.1. Изучение результатов лечения в зависимости от уровня вирусной нагрузки ВПЧ 16/18

3.3.2. Изучение результатов лечения в зависимости от физического статуса ВПЧ 16/18

3.3.3. Сравнительное изучение результатов лечения в зависимости от отсутствия ВПЧ ВКР и физического статуса ДНК ВПЧ 16/18

с разработкой биомаркера неблагоприятного прогноза заболевания

3.3.4. Выявление молекулярно-генетических и клинико-морфологических прогностических факторов клинического исхода местнораспространенного рака шейки матки

3.3.4.1. Одномерный анализ

3.3.4.2. Многомерный анализ

3.3.4.3. Анализ динамики развития неблагоприятного исхода

заболевания

3.4. Повышение качества жизни больных РШМ после сочетанной

лучевой и химиолучевой терапии (когорта IV)

3.4.1. Изучение качества жизни больных РШМ после сочетанной

лучевой и химиолучевой терапии

3.4.2. Изучение качества жизни больных РШМ после

восстановительного лечения

ГЛАВА 4. Обсуждение результатов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Химиолучевое лечение местнораспространенного рака шейки матки и факторы прогноза»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования

Рак шейки матки (РШМ) является одним из самых распространенных злокачественных новообразований, занимающим 4-е место по заболеваемости и смертности у женщин [177].

Ежегодно в мире регистрируется более 500 тыс. больных РШМ, из которых почти половина умирает в течение первого года в связи с поздней диагностикой и высоким удельным весом (46%) запущенных форм заболевания [177, 244].

В Российской Федерации наблюдается непрерывная тенденция к увеличению показателей заболеваемости РШМ, прирост которого за последние 10 лет составил 24,8%. В возрастной группе 30-44 года среди всех злокачественных новообразований РШМ занимает второе место, лидируя среди причин смертности у женщин 3039 лет [41, 42].

Неуклонный рост распространенных форм злокачественных опухолей шейки матки, а также высокий уровень заболеваемости и смертности среди женщин молодого возраста диктуют необходимость разработки новых и совершенствования уже существующих методов лечения данного заболевания.

Лучевая терапия является ведущим методом при лечении местнораспростр-ненного РШМ в самостоятельных радикальных программах и важным этапом в комбинированном или комплексном лечении более 80% больных цервикальным раком [79, 105, 106, 58, 13, 32].

Несмотря на постоянное совершенствование терапевтических программ, дозиметрического обеспечения, внедрение различных вариантов фракционирования доз и применение радиомодификаторов, тем не менее, до 30-45 % больных РШМ погибают от прогрессирования основного заболевания на первом году после лучевого лечения [33, 54, 69, 40, 28].

Среди них с каждым годом увеличивается доля больных репродуктивного возраста, что может быть связано с особенностями ВПЧ-инфекции, играющей ключевую роль в цервикальном канцерогенезе [6, 501, 172].

Анализ современного состояния проблемы позволяет заключить, что в настоящее время формируется значительный контингент больных местнораспростра-ненным РШМ, для которых возможности эффективного лечения в рамках традиционных методов весьма ограничены. Это обусловливает необходимость поиска новых подходов к лечению таких больных с оптимальным использованием всех возможных компонентов противоопухолевого воздействия, в том числе системной лекарственной терапии.

Степень разработанности темы исследования

Рак шейки матки относится к числу тех опухолей, у которых возможности дополнительного использования химиотерапевтических препаратов ограничены в силу известной резистентности. Однако использование новых цитостатиков, теоретическое обоснование системного канцерицидного действия последних привели к широкому совместному применению химиопрепаратов и радикальной лучевой терапии, что открыло новые перспективы в повышении эффективности лечения местнораспространенных форм РШМ [498, 239, 446].

Первые попытки использования комбинации химиопрепаратов с сочетанной лучевой терапией (СЛТ) при РШМ были сделаны за рубежом более 20 лет тому назад [513, 447]. Обнадеживающие результаты международных мета-анализов инициировали ряд одноцентровых исследований в отечественных онкологических учреждениях, в том числе и в МРНЦ им. А.Ф. Цыба, где были одними из первых получены данные (в рамках Гранта Президента РФ, 2003-2004гг.), вошедшие в диссертационную работу. К настоящему времени во многих международных и отечественных клинических исследованиях показана возможность улучшения результатов сочетанной лучевой терапии местнораспространенного РШМ при применении полихимиотерапии [212, 415, 53, 28].

Несмотря на многочисленные исследования, многие вопросы остаются открытыми, идет активный поиск наиболее эффективных химиотерапевтических препаратов, а также адекватных дозовых режимов, комбинаций и оптимальной последовательности их применения в рамках курсов химиолучевого лечения, позво-

ляющих усилить лучевое воздействие без ухудшения качества жизни больного, что является неотъемлемой составляющей эффективности противоопухолевой терапии [150].

При наличии разнообразных программ химиолучевого лечения необходимость прогнозирования ответа на противоопухолевую терапию не вызывает сомнения. В последние годы учет факторов, коррелирующих с прогнозом заболевания, неуклонно успешно интегрируется в процесс оптимизации лучевой терапии [58, 39].

Проведенные клинические исследования, в основе которых лежал многофакторный анализ, выявили основные критерии, влияющие на эффективность лечения РШМ: форма роста, степень распространения, морфологическая структура опухоли, возраст пациентки и т.д. [323]. При этом выяснилось, что даже при одинаковых клинико-морфологических показателях опухолевого процесса эффективность лечения больных РШМ может сильно отличаться (как хорошо известно и для злокачественных новообразований других локализаций). Стремительное развитие молекулярной биологии в конце прошлого века сделало возможным поиск новых высокоэффективных маркеров прогнозирования течения и эффективности лечения онкологических заболеваний, в том числе РШМ. Поэтому в последние годы происходил активный поиск предикторов на основе исследования различных индивидуальных особенностей РШМ на молекулярном уровне, который продолжается до сих пор. В частности, была показана возможность использования ряда параметров па-пилломавирусной инфекции (ПВИ) высокого канцерогенного риска (ВКР) в качестве адекватного маркера прогноза течения и лечения РШМ [7, 388, 343].

Однако анализ данных литературы демонстрирует, что применение качественных (генотип вируса папилломы человека (ВПЧ), физический статус ДНК ВПЧ) и количественных (степень интеграции ДНК ВПЧ в клеточный геном, вирусная нагрузка) параметров ПВИ при прогнозировании эффективности лечения рака шейки матки имеет дискутабельный характер [314, 302, 492, 216, 456]. Причинами противоречий следует считать малый объём выборок обследованных больных, их гетерогенность по клинико-морфологическим показателям и методам лечения.

Кроме того, значение показателей ВПЧ для прогнозирования ближайших и отдаленных результатов лечения может различаться, что требует отдельного изучения.

Несмотря на включение химиолучевой терапии в стандарты лечения местно-распространенного рака шейки матки, существует ряд нерешенных проблем в этой области: не стандартизированы терапевтические подходы к выбору химиопрепара-тов и режимов их введения; отсутствуют объективные критерии временных аспектов сочетания с облучением в зависимости от прогностических факторов; не определены эффективность и целесообразность применения цитостатиков в рамках предлучевых курсов. В дальнейшем изучении нуждаются и вопросы переносимости химиолучевого лечения: недостаточный учет токсичности применяемых хи-миопрепаратов совместно с лучевым лечением может быть одной из ведущих причин, снижающих эффективность лечения в связи с развивающимися осложнениями совместного генеза. По-прежнему остается актуальной проблема повышения качества жизни больных после многокомпонентных программ радикального лечения РШМ, особенно у лиц социально-активного возраста. В детальном изучении нуждается и вопрос о возможности прогнозирования противоопухолевого ответа в зависимости от особенностей ВПЧ-инфицированности: наличия/отсутствия ВПЧ ВКР, его генотипа, физического статуса и количественной нагрузки. Оценка влияния совокупности клинико-морфологических и биологических факторов на ответ опухоли и клинический исход заболевания может сыграть решающую роль в оптимальном планировании специализированного лечения местнораспространенного РШМ.

Таким образом, в настоящее время возникла необходимость в индивидуализации подходов к лечению местнораспространенного РШМ и разработке оптимальной стратегии сочетанной лучевой и химиолучевой терапии с учетом совокупности неблагоприятных факторов прогноза заболевания.

Цель исследования

Целью работы является повышение эффективности лечения, качества жизни больных местнораспространенным раком шейки матки при использовании системной химиотерапии в различном временном сочетании с лучевым лечением и разра-

ботка методических подходов к персонализированной терапии с учетом факторов прогноза - клинико-морфологических характеристик опухоли и молекулярно-генетических параметров ВПЧ-инфицирования.

Задачи исследования

1. Разработать методики лечения местнораспространенного рака шейки матки с использованием химиотерапии в различной временной комбинации с сочетан-ным лучевым лечением.

2. Провести сравнительный анализ эффективности сочетанной лучевой и хи-миолучевой терапии в зависимости от клинико-морфологических факторов прогноза.

3. Изучить особенности ВПЧ-инфицированности у больных раком шейки матки: наличие ВПЧ ВКР, качественные (генотип, физический статус ДНК ВПЧ) и количественные (вирусная нагрузка, степень интеграции) показатели.

4. Оценить прогностическую значимость ВПЧ-инфицирования, молекулярно-генетических параметров ВПЧ ВКР в отношении результатов лечения местнорас-пространеного рака шейки матки.

5. Оценить возможность персонализации специализированного лечения местнораспространенного рака шейки матки с учетом совокупности прогностических факторов опухолевого процесса и ВПЧ-инфицированности.

6. Изучить качество жизни больных раком шейки матки после радикальных курсов лучевой или химиолучевой терапии и разработать методику восстановительного лечения.

Научная новизна

Впервые на достаточно большом количестве клинических наблюдений, однородных по клинико-морфологическим характеристикам и лечебным протоколам, изучены особенности и оценено прогностическое значение ВПЧ-инфицированности, его молекулярно-генетических показателей при РШМ. Получены новые данные о взаимосвязи между клиническими и вирусологическими параметрами, что имеет не только фундаментальное значение для понимания приро-

ды опухолевого процесса, но важно и в практическом плане для разработки и планирования лечебных программ с учетом информации о механизмах радио-/химиочувствительности, обусловленной факторами ВПЧ-инфицированности.

Впервые разработан алгоритм прогнозирования клинического исхода мест-нораспространенного РШМ на основании клинических и молекулярно-генетических факторов - стадии заболевания, возраста и статуса ВПЧ - с высокой статистической значимостью, специфичностью и чувствительностью модели.

Разработаны методики химиолучевого лечения местнораспространенного рака шейки матки с использованием предлучевой и одновременной полихимиотерапии (ПХТ), позволившие повысить эффективность лечения прогностически неблагоприятных форм местнораспространенного РШМ. На основании полученных данных впервые показана возможность персонализации лечебных подходов в соответствии с совокупностью прогностических критериев опухолевого процесса и моле-кулярно-генетических параметров ВПЧ-инфицирования.

Впервые разработан лечебно-диагностический алгоритм оценки и повышения качества жизни больных РШМ после радикальных курсов сочетанной лучевой и химиолучевой терапии.

Теоретическая и практическая значимость работы

В соответствии с результатами исследования разработаны методические подходы к лечению местнораспространенного рака шейки матки с учетом совокупности предикторов - клинических факторов и молекулярно-генетических параметров ВПЧ-инфицирования.

Обоснована целесообразность ВПЧ-тестирования больных местнораспро-страненным РШМ до специализированного лечения с определением наличия/отсутствия ВПЧ ВКР, генотипа ВПЧ, при обнаружении ВПЧ 16/18 типов - интеграции ДНК в клеточный геном, что позволяет оценить прогноз заболевания с последующей индивидуализацией тактики лечения.

Внедрение разработанной прогностической модели неблагоприятного клинического исхода заболевания предоставляет объективную возможность выбора

оптимальных программ лечения местнораспространенных форм РШМ с персона-лизацией химиолучевой терапии, а также идентификацией больных, для которых проведение СЛТ без химиотерапии является адекватным методом и приводит к сокращению временных и финансовых затрат без потери эффективности.

Использование разработанного алгоритма диагностики позволяет эффективно выявлять больных РШМ с атрофическими изменениями слизистой влагалища после радикальных курсов лучевой/химиолучевой терапии и своевременно проводить восстановительное лечение с использованием объемообразующих гелей на основе гиалуроновой кислоты, тем самым повысить качество жизни женщин социально-активной категории.

Методология и методы исследования

В основе методологии данного исследования лежит концепция о возможности прогнозирования и контроля чувствительности опухолевых клеток к радиационным и химическим воздействиям. В частности, в соответствии с современными теоретическими представлениями и экспериментальными данными радио- и хи-миочувствительность клеток РШМ зависит от наличия ВПЧ ВКР, который, хотя и обнаруживается у подавляющего большинства больных раком этой локализации, характеризуется значительным разнообразием по таким признакам как генотип, вирусная нагрузка и физический статус ДНК ВПЧ (эписомальная или интегрированная форма). Использованные в диссертационной работе методические подходы к поиску прогностических биомаркеров среди молекулярно-генетических параметров ВПЧ-инфекции основаны на известных данных о способности ВПЧ влиять на внутриклеточные процессы, связанные с чувствительностью к противоопухолевым воздействиям - на репарацию повреждений ДНК, клеточную пролиферацию, апоптотическую гибель клеток и др.

Для реализации поставленных задач в исследование включено 486 больных с морфологически верифицированным РШМ 1-111 стадий, разделенных на 4 пересекающиеся когорты. В работе использован комплекс современных методов клини-ко-радиологического обследования больных для оценки степени распространенно-

сти опухолевого процесса и анализа эффективности лечения (ультразвуковое исследование с цветовым допплеровским картированием, магнитно-резонансная и/или компьютерная томография, эндоскопические методы и др.), а также выполнены молекулярно-генетические исследования с использованием метода полиме-разной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени для выявления ДНК ВПЧ 14 генотипов ВКР, определения вирусной нагрузки и интеграции вирусной ДНК в клеточный геном.

Для изучения эффективности сочетанной лучевой и химиолучевой терапии в зависимости от клинико-морфологических факторов прогноза сформирована когорта I, включающая больных РШМ II-III стадий, которым проводилась СЛТ в традиционном режиме (1-я группа), химиолучевое лечение с одновременной (2-я группа) или предлучевой (3-я группа) ПХТ. При оценке эффективности лечения изучены непосредственные и отдалённые результаты по критериям регрессии опухоли, частоте и срокам возникновения прогрессирования заболевания, продолжительности жизни больных. Проведена оценка частоты и тяжести реакций и осложнений, возникающих в различные сроки лечения.

Для анализа особенностей ВПЧ-инфицированности сформирована когорта II, в которую вошли больные РШМ I-III стадий. В соскобах и биоптатах шейки матки больных до начала лечения методом ПЦР в режиме реального времени проведено изучение наличия/отсутствия ВПЧ ВКР, генотипа вируса, варианта его присутствия (моно-/полиинфекция), физического статуса (эписомальная/интегрированная формы, степень интеграции ДНК ВПЧ) и уровня вирусной нагрузки. С использованием методов одно- и многофакторного анализа изучены возможные ассоциативные связи между указанными молекулярно-генетическими параметрами ВПЧ ВКР и клинико-морфологическими факторами опухолевого процесса (стадия заболевания, гистотип, форма роста опухоли, вариант распространения опухолевого процесса).

Изучение прогностического значения инфицированности ВПЧ, молекулярно-генетических параметров ВПЧ ВКР в отношении результатов лучево-го/химиолучевого лечения проведено в когорте III, включающей ВПЧ-

отрицательных и ВПЧ16/18-положительных больных РШМ II-III стадий, у которых до начала лечения были определены вирусная нагрузка и физический статус ДНК ВПЧ одновременно. Проведено изучение непосредственных и отдалённых результатов лечения больных в зависимости от отсутствия /наличия ВПЧ ВКР, уровня вирусной нагрузки ВПЧ 16/18 и отсутствия/наличия интеграции (степени интеграции) ДНК ВПЧ 16/18, на основании которых разработан биомаркер неблагоприятного клинического исхода заболевания и определена его прогностическая ценность по критериям относительного шанса (OR) неблагоприятного исхода, чувствительности (Se) и специфичности (Sp). С целью определения факторов, влияющих на исход заболевания, проведен многомерный анализ методом логистической регрессии с включением параметров ВПЧ-инфицированности и клинико-морфологических характеристик опухолевого процесса. На основании разработанной модели прогнозирования клинического исхода РШМ II-III стадий и полученных результатов сочетанной лучевой/химиолучевой терапии больных когорты I показана возможность персонализации лечения местнораспространенных форм заболевания.

Для изучения качества жизни сформирована когорта IV, включающая больных РШМ Ib2-III стадий, которым проводились радикальные курсы лучевой или химиолучевой терапии. Оценка параметров качества жизни проводилась с использованием опросников и объективных методов исследования состояния слизистой влагалища с определением кислотности (рН) транссудата, индекса вагинального здоровья (ИВЗ) и др. Больным проведено восстановительное лечение по разработанной методике с последующей оценкой динамики изучаемых показателей качества жизни с помощью тестов непараметрической статистики.

Положения, выносимые на защиту

1. Использование платиносодержащей полихимиотерапии независимо от временного режима комбинации с СЛТ повышает эффективность лечения при III стадии РШМ, при двустороннем параметральном варианте распространения опухолевого процесса. Последовательное химиолучевое лечение целесообразно про-

водить при объеме опухоли > 50 см3, метастатическом варианте, билатеральной па-раметральной опухолевой инфильтрации до стенок таза в сочетании с двусторонним метастатическим поражением лимфоузлов, а одновременную химиолучевую терапию - при железистых и недифференцированных формах опухоли.

2. Сочетанная лучевая терапия является адекватным методом выбора при лечении РШМ II стадии, при объеме опухоли до 50 см3, эндофитной форме роста опухоли, отсутствии/односторонней параметральной опухолевой инфильтрации.

3. Молекулярно-генетические параметры ВПЧ-инфицированности (отсутствие ВПЧ ВКР, ВПЧ-инфицирование несколькими генотипами, генотип ВПЧ ВКР, вирусная нагрузка или интеграция ДНК вируса в геном хозяина) ассоциированы с клинико-морфологическими факторами больных РШМ (возраст, стадия заболевания, гистологический тип или форма роста опухоли). Между уровнем вирусной нагрузки и степенью интеграции ДНК ВПЧ в клеточный геном хозяина наблюдается отрицательная линейная корреляция.

4. Отсутствие (невыявление) ВПЧ ВКР или наличие интеграции ДНК ВПЧ16/18 в геном клетки-хозяина при местнораспространенном РШМ независимо от стадии заболевания значимо ассоциировано с низкими показателями общей и безрецидивной выживаемости по сравнению с таковыми у ВПЧ16/18-позитивных больных с эписомальной формой вирусной ДНК.

5. Факторами, определяющими эффективный алгоритм прогнозирования клинического исхода РШМ II-III стадий, являются статус ВПЧ ВКР (отсутствие (невыявление) ВПЧ ВКР, отсутствие/наличие интеграции ДНК ВПЧ 16/18), стадия заболевания и возраст, на основе которых можно проводить персонализацию лечения с обоснованным подходом к назначению системной ПХТ при радикальных курсах СЛТ.

6. После радикальных курсов лучевой/химиолучевой терапии наблюдается значительное снижение качества жизни больных РШМ, обусловленное атрофиче-скими вагинитами тяжелой степени, эффективное лечение которых обеспечивает дифференцированное (перинеальное и интравагинальное) введение объемообразу-ющих гелей на основе гиалуроновой кислоты.

Степень достоверности и апробация результатов

Результаты диссертационной работы снабжены подробными доказательствами, доложены и обсуждены на российской научной конференции «Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии», Санкт-Петербург, 2008 г.; VII съезде онкологов России, Москва, 2009 г.; VI Международной конференции «Современные аспекты реабилитации в медицине», Армения, 2013 г.; VIII съезде онкологов, Санкт-Петербург, 2013 г.; International multidisciplinary conference EUROGIN 2015 «HPV Infection and Related Cancers», Sevilla, Spain, 2015; Международной научно-практической конференции «Репродуктивные технологии в онкологии», Обнинск, 2015 г.; 4-th International medical congress of Armenia, Yerevan, 2015; 11-th Congress of the European Society of Gynecology. Prague, 2015; I Национальном научно-образовательном конгрессе «Онкологические проблемы от менархе до постменопаузы», Москва, 2017 г.; IX Съезд онкологов России, Уфа, 2017 г.; IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика», Москва, 2017 г.; 12-th Congress of the European Society of Gynecology, Barcelona, Spain 2017; VIII Международной конференции «Современные аспекты реабилитации в медицине», Армения, Ереван, 2017 г.; IV Петербургском онкологическом форуме «Белые ночи - 2018», Санкт-Петербург, 2018 г.; III Национальном конгрессе «Онкология репродуктивных органов: от профилактики и раннего выявления к эффективному лечению», Москва, 2018 г.; III Национальном научно-образовательном Конгрессе «Онкологические проблемы от менархе до постменопаузы», Москва, 2019 г.; X Съезде онкологов, Нижний Новгород, 2019 г., II Международном форуме онкологии и радиологии, Москва, 2019 г., научно-практической конференции «Радиация и организм», Обнинск, 2019 г.

По теме диссертации опубликованы 72 работы, включая 21 публикацию (13 статей, 3 патента на изобретение, 2 свидетельства на программу для электронных вычислительных машин, 3 базы данных) в рецензируемых изданиях, рекомендуемых ВАК; материалы использованы для написания 2-х монографий, 2-х национальных руководств для врачей.

Результаты исследования внедрены в работу отделения лучевых и комбинированных методов лечения гинекологических заболеваний и отдела радиационной биохимии МРНЦ им. А.Ф. Цыба - филиал «НМИЦ радиологии» Минздрава России.

Работа проводилась в рамках основных научных направлений МРНЦ им. А.Ф. Цыба в соответствии с подтемой «Разработка и совершенствование лучевых и комбинированных методов лечения гинекологического рака» (2011-2015 гг.); гранта Президента РФ для поддержки молодых российских ученых и ведущих научных школ Российской Федерации (2003-2004 гг.), ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» (НИР «Разработка метода диагностики и прогнозирования течения гиперпролиферативных заболеваний тела и шейки матки на основе интеграции молекулярно-генетических и клинико-радиологических методов», 2011-2012 гг.); клинической апробации Минздрава России «Коррекция генитоуринарного синдрома методом использования объемообразующих наполнителей у онкогине-кологических больных после специализированного лечения» (2018 - 2019 гг.).

Разработана и разрешена для использования новая медицинская технология «Сочетанная лучевая терапия рака шейки матки в условиях традиционного и нетрадиционного фракционирования дозы и лекарственного лечения» (разрешение ФС № 2010/317 от 31.08.2010 г.).

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 335 страницах, иллюстрирована 51 таблицей и 90 рисунками. Список литературы содержит 534 источника, в том числе отечественных - 139 и зарубежных - 395.

Выражаю огромную признательность и благодарность научным консультантам доктору медицинских наук, профессору Людмиле Ивановне Крикуновой и доктору биологических наук, профессору Ирине Александровне Замулаевой за оказанное доверие и всестороннюю поддержку, неоценимую помощь и содействие в планировании и выполнении данной работы.

Большую искреннюю благодарность выражаю коллегам и коллективу отделения лучевых и комбинированных методов лечения гинекологических заболеваний МРНЦ им. А.Ф. Цыба и отдела радиационной биохимии МРНЦ им. А.Ф. Цы-ба, без многолетней ежедневной плановой работы которых эта диссертационная работа была бы невозможной. Отдельную благодарность автор выражает кандидату биологических наук Валентине Ивановне Киселевой за ценные советы и оказанную помощь при проведении экспериментальных работ.

Глубокую признательность выражаю наставникам член-корреспонденту РАН, доктору медицинских наук, профессору Юрию Станиславовичу Мардынскому - одному из основоположников радиационной онкологии России; доктору биоло-

гических наук, профессору Александру Семеновичу Саенко - радиобиологу мирового уровня.

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Мкртчян Лиана Сирекановна, 2020 год

у /

0 20 40 60 80 100

Рисунок 47 - Вирусная нагрузка (ВН) у больных РШМ в зависимости от возраста

Рисунок 48 - Корреляционный анализ между низкой вирусной нагрузкой и возрастом

Изучение вирусной нагрузки у больных, инфицированных наиболее распространёнными генотипами, показало, что при ВПЧ 16 наиболее часто встречалась высокая нагрузка вируса, а при ВПЧ 18 - умеренная и высокая нагрузки встречались одинаково часто (рисунок 49). При этом средний уровень вирусной нагрузки при ВПЧ 16 (6,0±1,7; медиана 5,9; LQ 5,1; иО 6,6) оказался статистически значимо выше аналогичного показателя при ВПЧ 18 (5,0±1,1; медиана 5,0; LQ 4,6; UQ 5,5) (р < 0,001 по тесту Манна-Уитни).

%

100 80 60 40 20 0

44,8

78,9

48,3

А 16,3

У 4,8 1 6,9

ВН > 5

3<ВН<5

ВН<3

ВПЧ 16

ВПЧ 18

Рисунок 49 - Вирусная нагрузка (ВН) у ВПЧ-позитивных больных РШМ

в зависимости от генотипа вируса

Данная закономерность сохранялась для всей филогенетической группы, к которым принадлежали указанные генотипы. Средний уровень вирусной нагрузки при генотипах группы А9 оказался статистически значимо выше аналогичного показателя при генотипах группы А7 - соответственно 6,0±1,6 (медиана 5,9; LQ 5,1; UQ 6,6) и 4,9±1,3 (медиана 4,8; LQ 4,5; UQ 5,5) (р < 0,001 по тесту Манна-Уитни).

Проведено изучение уровня вирусной нагрузки в зависимости от клинико-морфологических характеристик опухолевого процесса больных РШМ.

Средний уровень вирусной нагрузки при I стадии составил 5,4±1,9 (медиана 5,5; LQ 4,7; UQ 6,1), при II стадии - 5,4±2,1 (медиана 5,4; LQ 4,6; UQ 6,3), что оказалось статистически значимо ниже, чем при III стадии 6,2±1,6 (медиана 6,0; LQ 4,6; UQ 6,8), соответственно р = 0,006 и р = 0,02 по тесту Манна-Уитни (рисунок 50).

В сравнительном аспекте при плоскоклеточном раке было установлено больше случаев высокой вирусной нагрузки (73,9%) (р = 0,08 по критерию Фишера), а при прогностически неблагоприятной аденокарциноме - низкой нагрузки (13,3%) (р = 0,07 по критерию Фишера) (рисунок 51). Соответственно, средний уровень вирусной нагрузки был выше при плоскоклеточном раке (5,8±1,6, медиана 5,7; LQ 4,9; UQ 6,5) по сравнению с аденокарциномой (5,0±1,6, медиана 5,0; LQ 4,2; UQ 6,4) (р = 0,10 по тесту Манна-Уитни).

По форме роста и варианту распространения опухолевого процесса статистически значимых отличий по распределению вирусной нагрузки среди больных также не наблюдалось.

Вирусная нагрузка, 1д Е7/10л5 клеток С0 — — 0Л0ЛС0С0О1О10Э0Э 5 о 5 о 5 о 5 о 5 о 5

]

' □ □

1 2 3 Стадии заболевания □ Среднее [] Среднее±Ст.ош. I Среднее±Ст.откл.

Рисунок 50 - Уровень вирусной нагрузки (ВН) у больных РШМ в зависимости

от стадии заболевания

%

100 80 60 40 20 0

ВН>5

3<ВН<5

ВН<3

плоскоклеточныи рак аденокарцинома

Рисунок 51 - Вирусная нагрузка (ВН) у ВПЧ-позитивных больных РШМ в зависимости от морфологической формы опухоли.

3.2.3. Сопоставление клинико-морфологических показателей опухолевого процесса с физическим статусом ДНК ВПЧ

В работе проведено также изучение наличия/отсутствия интеграции ДНК вируса у 176 ВПЧ-позитивных больных РШМ. Наличие интеграции и её степень устанавливались при инфицировании ВПЧ 16 (140 (79,5%) случаев) и ВПЧ 18 (28 (15,9%) случаев). При других наиболее распространённых вирусах (45, 39, 35 типы) устанавливалось только наличие полной (100%) интеграции.

В исследуемой когорте у большинства больных установлена интеграция ДНК вируса (интегрированная форма) - у 108 (61,4%), из них со степенью интеграции <50% - в 26 (14,8%), > 50% - в 82 (46,6%) случаях. Необходимо отметить, что у значительного числа пациенток с интегрированной формой, наблюдалась полная (100%) интеграция ДНК вируса - у 50 (46,7%) из 108 больных. У остальных 68 (38,6%) больных зарегистрировано отсутствие интеграции (эписомальная форма).

Интегрированная форма ВПЧ ВКР наиболее часто наблюдалась в старшей возрастной группе - в 66,7% случаев у больных старше 65 лет, при этом в 44,4%

случаев в виде полной (100%) интеграции (р = 0,5) (рисунок 52).

—

100% 80% 60% 40% 20% 0%

Ж

58,3

41,7

62,0

38,0

61,8

38,2

58,6

41,4

66,7

33,3

_

^30л. 30-44л. 45-55л. 56-65л. старше .

~>\J интегрированная форма

65л.

■ эписомальная форма

Рисунок 52 - Распределение различных форм ВПЧ ВКР по возрастным группам

ВПЧ-позитивных больных РШМ

При инфицировании ВПЧ 16 по сравнению с ВПЧ 18 преобладали эписо-мальные формы вируса - соответственно 44,3% против 17,9% (различия статистически значимы, р = 0,010 по двустороннему критерию Фишера) (рисунок 53). При ВПЧ 18 чаще наблюдались высокоинтегрированные формы (интеграция > 50%) -64,3 против 40,7% при ВПЧ 16 (различия статистически значимы, р = 0,019), высокий удельный вес занимала полная интеграция вируса - соответственно 50,0 против 20,7% случаев (различия статистически значимы, р = 0,003).

Анализ рассматриваемого критерия в зависимости от клинико-морфологических характеристик показал превалирование интегрированных форм вируса ВПЧ ВКР у больных с III стадией заболевания (63,2%), а также при адено-

карциноме (73,3%) и недифференцированном раке (100,0%), при экзофитных (70,0%) и смешанных (63,5%) формах роста опухоли, параметральных (61,3%) и метастатических (63,6%) вариантах распространения опухолевого процесса (р > 0,05 по критерию Фишера) (рисунок 54).

17,9 17,8 64,3 1

44,3 15,0 40,7 Р

О 20 40 60 80 100

%

Я интеграция (-) ■ интеграция < 50% ■ интеграция > 50%

Рисунок 53 - Интеграция ВПЧ 16 и ВПЧ 18 у больных РШМ

интеграция (-) интграция (+)

25

50

%

75

100

Рисунок 54 - Распределение отсутствия/наличия интеграции у больных РШМ в зависимости от клинико-морфологических характеристик

Однако при анализе распределения высокоинтегрированных форм ВПЧ ВКР было обнаружено, что интеграция > 50% наиболее часто наблюдалась при наличии экзофитного компонента опухоли (экзофитная и смешанная формы) (50,0%) при сравнении с эндофитной формой роста (35,7%) (р = 0,074), при оценке встречаемости полной (100%) интеграции ДНК вируса данная взаимосвязь приобретала статистически значимый характер - у 32,1 против 16,7% больных соответственно (р = 0,037). Причем полная интеграция с достаточно высокой значимостью была ассоциирована с экзофитной формой при сравнении с эндофитной - у 46,7 против 16,7% больных соответственно (р = 0,006).

3.2.4. Сопоставление качественных и количественных параметров ВПЧ ВКР у больных РШМ

Изучено распределение молекулярно-генетических критериев вирусной инфекции у ВПЧ-позитивных больных РШМ, у которых были определены как качественные, так и количественные показатели (174 случая).

Проведённый анализ показал, что низкая вирусная нагрузка только в единичном случае (14,3%) сопровождала эписомальную форму вируса; все остальные случаи низкой вирусной нагрузки (85,7%) сочетались с 100% интеграцией (таблица 25). По мере повышения степени вирусной нагрузки наблюдалось статистически значимое увеличение количества неинтегрированных и уменьшение высокоинте-грированных форм вируса (р = 0,02 по критерию Фишера).

Таблица 25 - Распределение больных РШМ в зависимости от качественных и количественных параметров ВПЧ ВКР

Форма вируса Вирусная нагрузка Эписомальная абс (%) Интегрированная абс (%)

< 50% > 50%

ВН < 3 (п = 7) 1 (14,3)* 0 6 (85,7)*

3< ВН < 5 (п = 43) 12 (27,9) 5 (11,6) 26 (60,5)

ВН > 5 (п = 124) 55 (44,4)* 21 (16,9) 48 (38,7)*

* уровень статистической значимости - р = 0,02 по критерию Фишера.

Для изучения взаимосвязи молекулярно-генетических параметров ВПЧ ВКР выполнен корреляционный анализ Спирмена. Сравнительное исследование количества копий ДНК ВПЧ и наличия интеграции/степени интеграции ДНК вируса у ВПЧ-позитивных больных, выявило обратную линейную корреляцию: коэффициент корреляции по Спирмену г = -0,41 при уровне значимостир < 0,0001 (рисунок 55).

Количество копий ДНК ВПЧ ВКР, lg Б7/10л5 клеток

Рисунок 55 - Корреляционный анализ молекулярно-генетических параметров у ВПЧ-позитивных больных РШМ (n=174): 0% - отсутствие интеграции (эписомальная

форма вируса), 100% - полная интеграция ДНК ВПЧ в геном клетки-хозяина

3.2.5. Многофакторный анализ особенностей ВПЧ-инфицирования и клинико-морфологических характеристик больных РШМ

В целях изучения возможных ассоциативных связей между различными параметрами, характеризующими опухолевый процесс и ВПЧ-инфекцию, был проведён многофакторный анализ с использованием метода кластеризации.

Для проведения кластерного анализа на 1-м этапе были отобраны следующие переменные: возраст (5 возрастных категорий), стадия заболевания (I-III стадия), морфологическая структура опухоли (4 гистотипа), форма роста опухоли (3 вида), вариант распространения опухолевого процесса (наличие/отсутствие параметраль-ной инфильтрации), метастатический вариант (есть/нет), ВПЧ ВКР (есть/нет). В результате агломеративной кластеризации (Agglomerative Nesting, AGNES) с помо-

щью метода полной связи построена дендрограмма, объединяющая в кластеры наиболее близкие параметры, демонстрируя возможную патогенетическую взаимосвязь (рисунок 56).

Дендрограмма для 7 перемен.

Метод полной связи Евклидово расстояние

Возраст ■ ■

Стадия ■ ■

Вариант распространения ■ ■

Форма роста ■ ■

Метастатический вариант ■ ■

Морф. форма ■ ■

ВПЧ ВКР ■ ■

5 10 15 20 25 30 35 40 45

Рисунок 56 - Дендрограмма больных РШМ (п = 240)

Согласно представленным данным, сформировались 2 очевидные группировки (Евклидово расстояние ближе к 10): кластер № 1 объединил стадию и вариант распространения опухолевого процесса; кластер № 2 - морфологическую форму опухоли и фактор инфицированности ВПЧ ВКР.

На 2-м этапе иерархический кластерный анализ был проведён у ВПЧ-позитивных больных. Кроме вышеуказанных переменных, в кластеризацию были включены генотипы ВПЧ ВКР, количество генотипов ВПЧ ВКР (моно-/полиинфекция), вирусная нагрузка (3 степени), интеграция (есть/нет).

Согласно проведённой алгоритмической группировке, сформировались 4 кластера:

- кластер № 1 - возраст и форма роста опухоли;

- кластер № 2 - стадия, вариант распространения опухолевого процесса и вирусная нагрузка;

- кластер № 3 - морфологическая форма опухоли, инфицирование одним или несколькими генотипами, типовая принадлежность ВПЧ ВКР;

- кластер № 4 - интеграция ВПЧ ВКР и метастатический вариант распространения опухолевого процесса.

При этом наиболее близкими оказались факторы, которые объединились в кластер № 3 и кластер № 4 (Евклидово расстояние меньше 10) (рисунок 57).

Возраст Форма роста Стадия

Вариант распространения Вирусная нагрузка Морф.форма Количество серотипов Генотипы ВПЧ Метастатический вариант Наличие интеграции

Дендрограмма для 10 перемен. Метод полной связи Евклидово расстояние

5

Рисунок 57 - Дендрограмма ВПЧ-позитивных больных РШМ (п = 174)

На 3-м этапе в иерархический анализ был включён критерий степени интеграции (менее/более 50%), что позволило выявить лишь один кластер на аналогичном расстоянии (Евклидово расстояние меньше 10) - кластер, объединяющий морфологическую форму, количество серотипов ВПЧ ВКР и его генотип (рисунок 58).

Возраст Форма роста Вирусная нагрузка Стадия

Вариант распространения Морф.форма Количество серотипов Генотип ВПЧ ВКР Степень интеграции Метастатический вариант

Дендрограмма для 10 перемен. Метод полной связи Евклидово расстояние

5

Рисунок 58 - Дендрограмма больных РШМ с использованием параметра степени

интеграции (п = 174)

Анализ кластерообразующих признаков с позиции построения алгоритмов диагностического поиска показал, что, по всей видимости, только морфологическая форма опухоли имеет явную ассоциативную взаимосвязь с фактором инфици-рованности одним или несколькими генотипами ВПЧ ВКР и типовой принадлежности вируса. Данное обстоятельство диктует при интерпретации результатов лечения ориентироваться на особенности генотипа ВПЧ, который, как было показано при однофакторном анализе, сопряжен со степенью интеграции.

Таким образом, в результате однофакторного анализа выявлен ряд статистически значимых ассоциациативных связей между молекулярно-генетическими параметрами ВПЧ-инфекции и клинико-морфологическими показателями опухолевого процесса:

- ВПЧ-отрицательных случаев с возрастом (повышение доли больных старше 55 лет, p = 0,003 при сравнении с ВПЧ-позитивными), с III стадией заболевания (p = 0,001 при сравнении со II стадией, p = 0,05 - с I стадией);

- полиинфекции с плоскоклеточным раком (p < 0,0001 при сравнении с железистым раком, p = 0,038 - с недифференцированным);

- морфологической формы опухоли с генотипом ВПЧ ВКР: плоскоклеточного рака - с ВПЧ 16 (р = 0,002), аденокарциномы - с ВПЧ 18 (p < 0,0001).

- вирусной нагрузки с возрастом: повышение доли случаев низкой вирусной нагрузки с увеличением возраста (коэффициент прямой корреляции по Спирмену r = 0,86 прир = 0,04);

- стадии заболевания с вирусной нагрузкой: при III стадии средний уровень вирусной нагрузки выше, чем при менее распространённых формах -1 и II стадиях (р=0,006 ир=0,02 по тесту Манна-Уитни);

- полной (100%) интеграции ДНК ВПЧ с экзофитной формой роста опухоли (р = 0,006 и р = 0,045 при сравнении с эндофитной и смешанной формами соответственно).

Кроме того, продемонстрированы связи ряда молекулярно-генетических показателей ВПЧ инфекции между собой:

- генотипа ВПЧВКР и уровня вирусной нагрузки: при ВПЧ16 средний уровень вирусной нагрузки выше по сравнению с ВПЧ 18 (р < 0,001 по тесту Манна-Уитни);

- генотипа ВПЧ ВКР и степени интеграции: при ВПЧ 18 превалировали высо-коинтегрированные (> 50%) формы по сравнению с ВПЧ 16 (р = 0,019);

- вирусной нагрузки и степени интеграции ДНК ВПЧ в геном клетки хозяина: снижение уровня вирусной нагрузки при повышении степени интеграции (коэффициент обратной корреляции по Спирмену r = -0,41 при р = 0,0001). Наличие взаимосвязи ряда молекулярно-генетических параметров ВПЧ-

инфекции с прогностически важными показателями опухолевого процесса дополнительно обосновывает необходимость прямой оценки их прогностического значения в отношении ближайших и отдалённых результатов лечения больных РШМ.

Результаты многофакторного анализа, проведенного с целью построения алгоритмов диагностического поиска, показали, что, по всей видимости, только морфологическая форма опухоли имеет явную ассоциативную взаимосвязь с фактором инфицированности одним или несколькими генотипами ВПЧ ВКР и типовой принадлежности вируса. Данное обстоятельство диктует необходимость учета всего спектра молекулярно-генетических параметров типовой принадлежности ВПЧ при разработке прогностического биомаркера, что и было выполнено в главе 3.3 диссертационной работы с помощью методов как одно-, так и многофакторного анализа.

3.3. Оценка значимости ВПЧ-инфицирования, молекулярно-генетических параметров ВПЧ ВКР для прогнозирования результатов лечения местнораспространенного РШМ (когорта III)

Целью данного раздела работы явился многофакторный анализ с изучением прогностической значимости факторов ВПЧ-инфицированности: наличие/отсутствие ВПЧ ВКР, вирусная нагрузка, физический статус ДНК ВПЧ (отсутствие/наличие интеграции, её степень) - в отношении результатов лечения местнораспространённого РШМ до проведения радикального специализированного лечения, что позволит оце-

нить возможность персонализации многокомпонентных курсов лучевой/химиолуче-вой терапии в целях повышения эффективности лечения.

В связи с этим проведено изучение непосредственных и отдаленных результатов лучевого/химиолучевого лечения 135 больных РШМ II-III стадий с ВПЧ-отрицательными (20 случаев: II стадия - 25%, III стадия - 75%) и ВПЧ 16/18-положительными (115 случаев: II стадия - 50,4%, III стадия - 49,6%) формами заболевания (когорта III). Включение в группу исследования только тех больных, которые были инфицированы ВПЧ 16/18 генотипами, было обусловлено тем, что именно при данных типах вируса совместно с вирусной нагрузкой, определялось также наличие интеграции и её степень в соответствии c разработанным алгоритмом (методика описана в главе 2.2.2). Мы исходили из положения, что комплексный подход позволит максимально точно определить прогностическую значимость всего спектра молекулярно-генетических параметров ВПЧ ВКР в оценке клинического исхода местнораспространённого РШМ до проведения специализированного радикального лечения.

Больным проводились радикальные курсы специализированного лучевого/химиолучевого лечения (методики лечения представлены в главе 2.2.1): СЛТ в традиционном режиме (СЛТ) - 58 (1-я группа); одновременная химиолучевая терапия (ХЛЛ) - 66 (2-я группа); последовательная химиолучевая терапия (НАХТ+СЛТ) - 11 (3-я группа). Исследуемые клинические группы не отличались значимо по клинико-морфологическим характеристикам больных - по степени и варианту распространения опухолевого процесса, морфологической структуре и форме опухоли (клинико-морфологическая характеристика представлена в главе 2.1.3), а также по фактору ВПЧ-инфицирования - наличие/отсутствие ВПЧ ВКР (рисунок 59).

В связи с этим, изучение возможности использования молекулярно-генетических параметров ВПЧ 16/18 генотипов в качестве прогностических маркеров для оценки эффективности специализированного лечения проводилось в объ-единённной группе больных.

Рисунок 59 - ВПЧ 16/18-инфицированность у больных РШМ в клинических группах

3.3.1. Изучение результатов лечения в зависимости от уровня вирусной нагрузки ВПЧ 16/18

При определении вирусной нагрузки ВПЧ16/18 у 115 ВПЧ-инфицированных больных низкая вирусная нагрузка зафиксирована в 4 (3,5%), умеренная - в 23 (20,0%), высокая - в 88 (76,5%) случаях. Статистически значимых различий в распределении больных со II и III стадиями заболевания в зависимости от уровня вирусной нагрузки не наблюдалось (р > 0,05 по критерию Фишера), что позволило адекватно оценить результаты лечения, в том числе, и независимо от стадии заболевания (рисунок 60).

ВН > 5 47,7 52,3 л

3< ВН < 5 V 60,9 39,1 Л

ВН < 3 V 50,0 50,0 ■л

0% 20% 40% 60% 80% 100%

■ II стадия ■ III стадия

Рисунок 60 - Распределение ВПЧ-инфицированных больных в зависимости от вирусной нагрузки (ВН) и стадии заболевания

Изучение непосредственных результатов лечения у 115 ВПЧ16/18-положительных больных РШМ II-III стадий (II стадия - 57 (50,4%), III стадия - 58 (49,6%)) показало, что полная регрессия опухоли наиболее часто наблюдалась у больных с высокой вирусной нагрузкой - у 38 (43,1%); при низкой нагрузке полной регрессии зафиксировано не было (таблица 26). Указанная закономерность наблюдались и при анализе эффективности лечения в зависимости от стадии заболевания. Однако во всех случаях отличия были статистически незначимы -р > 0,05 (по критерию Фишера).

Таблица 26 - Непосредственные результаты ВПЧ-инфицированных больных РШМ

в зависимости от вирусной нагрузки (ВН)

Уровень вирусной нагрузки,

Уровень вирусной нагрузки (1§ числа копий ви-

Непосредственные русной ДНК на 105 клеток)

результаты лечения ВН < 3 3 < ВН < 5 ВН > 5

n = 4 n = 23 n = 88

абс (%) абс (%) абс (%)

Полный II-III ст. 0 8 (34,8) 38 (43,1)

ответ II ст. 0 7 (50,0) 22 (52,3)

III ст. 0 1 (11,1) 16 (34,8)

Частичный II-III ст. 4 (100,0) 15 (65,2) 50 (56,9)

ответ II ст. 2 (50,0) 7 (50,0) 20 (47,7)

III ст. 2 (50,0) 8 (88,9) 30 (65,2)

Анализ отдалённых результатов лучевого/химиолучевого лечения в зависимости от уровня вирусной нагрузки методом Каплан-Мейера выявил, что на сроке 1 год общая и безрецидивная выживаемости больных с высокой вирусной нагрузкой оказались выше, чем с низкой и умеренной нагрузками (таблица 27). На сроках 3 и 5 лет наиболее высокие результаты общей и безрецидивной выживаемости зафиксированы у больных с низкой вирусной нагрузкой, а низкие - с умеренной нагрузкой.

Таблица 27 - Отдаленные результаты лечения больных РШМ в зависимости от уровня вирусной нагрузки (ВН)

Выживаемость (%) Уровень вирусной Продолжительность наблюдения, годы

нагрузки 1 3 5

ВН < 3 80,0±17,9 80,0±17,9 80,0±17,9

Общая 3 < ВН < 5 96,1±3,8 69,2±11,4 57,7±14,2

ВН > 5 97,7±1,6 74,5±5,6 71,9±5,9

ВН < 3 80,0±17,9 80,0±17,9 80,0±17,9

Безрецидивная 3 < ВН < 5 84,6±7,1 61,8±12,5 51,5±12,4

ВН > 5 88,6±3,3 69,9±5,7 67,3±6,1

Однако сравнительный анализ не выявил статистически значимых различий как в общей, так и в безрецидивной выживаемости больных в зависимости от уровня вирусной нагрузки на всех сроках наблюдения - р > 0,05 по критерию Log Rank (рисунок 61).

Общая кумулятивная доля выживших Безрецидивная кумулятивная доля выживших

(Каплан-Мейер) (Каплан-Мейер)

о Заверш. Цензурир. о Заверш. Цензурир.

8

_f___|

|

3 I

i 08 | 6 ......i

ГС ' t • 1

с ' 1 ~ g 0,8 6

гс 0,7 ■ •.........".........; •

• и 1.........;

S 1 S ■ ®

£ 1 гс 0,7 *-----jt-ivvi---;.........;

^ 0 6 9.------------1 с 1 ф

i. 1 J. 1

1

0 6

0,5 04 0 5 *-------

ВН<3 ^^ ВН<3

0 2 3 4 5 - - 3<ВН<5 0 2 3 4 5 - - 3<ВН<5

Время жизни, годы ••• ВН>5 Время жизни, годы ••• ВН>5

а) б)

Рисунок 61 - Общая (а) и безрецидивная (б) выживаемость ВПЧ-инфицированных больных РШМ с различным уровнем вирусной нагрузки

Проведенный анализ по стадиям заболевания также не выявил значимых различий общей и безрецидивной выживаемостей больных в зависимости от уровня вирусной нагрузки (р > 0,05 по критерию Log Rank). Так, общая 5-летняя кумулятивная выживаемость больных со II стадией заболевания при низкой нагрузке составила 100%, при умеренной - 66,7±15,7%, при высокой - 85,6±6,7% (р = 0,213); с III

стадией 50,0±35,3%, 40,9±21,3 и 51,9±9,2% - соответственно (р = 0,446). Безрецидивная кумулятивная выживаемость больных со II стадией при низкой нагрузке на данном сроке составила 100%, при умеренной - 65,0±14,9%; при высокой -81,7±7,4% (р = 0,067); при III стадии - 50,0±35,3%, 36,4±20,2 и 47,3±9,4% - соответственно (р = 0,864).

При умеренной и высокой вирусной нагрузках наиболее часто наблюдалось локо-регионарное прогрессирование, а при низкой нагрузке - единственный случай прогрессирования был в виде отдалённого метастаза, однако эти отличия не были статистически значимыми (p > 0,05 по критерию Фишера) (таблица 28).

Таблица 28 - Локализация очагов прогрессирования у больных РШМ в зависимости от уровня вирусной нагрузки (ВН)

Уровень вирусной нагрузки Первичный очаг и/или регионарные лимфоузлы абс (%) Отдалённые метастазы Всего абс (%)

парааортальные лимфоузлы абс (%) печень абс (%) лёгкие абс (%)

ВН < 3 - - 1(100) - 1(100)

3< ВН < 5 5 (71,4) - - 2 (28,6) 7(100)

ВН > 5 14 (63,6) 3 (13,6) 1 (4,5) 4 (18,3) 22(100)

3.3.2. Изучение результатов лечения в зависимости от физического статуса ВПЧ 16/18

При определении физического статуса ДНК ВПЧ 16/18 у 115 ВПЧ16/18-положительных больных РШМ II-III стадий (II стадия - 57 (50,4%), III стадия - 58 (49,6%)) отсутствие интеграции ДНК вируса (эписомальная форма) зафиксировано в 49 (42,6%) случаях; у остальных 66 (57,4%) больных наблюдалась частичная или полная интеграция ДНК вируса. Статистически значимых различий в распределении больных со II и III стадиями при интегрированной и эписомальной формах ДНК ВПЧ ВКР не наблюдалось (р > 0,05 по критерию Фишера), что позволило адекватно оценить результаты лечения в зависимости от отсутствия/наличия интеграции (рисунок 62).

интегрированная форма

эписомальная форма

0% 20% 40% 60% 80% 100% ■ II стадия ■ III стадия

Рисунок 62 - Распределение ВПЧ-инфицированных больных в зависимости от отсутствия/наличия интеграции ДНК ВПЧ 16/18 и стадии заболевания

Изучение непосредственных результатов лучевой/химиолучевой терапии показало, что полная регрессия опухоли наиболее часто встречалась у больных с отсутствием (эписомальная форма) и низкой (< 50%) интеграцией ДНК вируса (таблица 29). При этом, если при II стадии заболевания частота полного ответа опухоли на проведённое лечение была выше у больных с низкоинтегрированной формой вируса (85,7%), то при III стадии - с эписомальной формой (39,1%).

Таблица 29 - Непосредственные результаты ВПЧ-инфицированных больных РШМ в зависимости от отсутствия/наличия интеграции ДНК ВПЧ 16/18 и степени интеграции

Непосредственные результаты лечения Качественные показатели ВПЧ 16/18

Эписомаль-ная форма n = 49 абс. (%) Интегрированная форма

n = 66 абс. (%) < 50% n = 20 абс. (%) > 50% n = 46 абс. (%)

Полный ответ II-III ст. 22 (44,9) 24 (36,4) 10 (50,0) 14 (30,4)

II ст. 13 (50,0) 15 (48,4) 6 (85,7) 9 (37,5)

III ст. 9 (39,1) 9 (25,7) 4 (30,8) 5 (22,7)

Частичный ответ II-III ст. 27 (55,1) 42 (63,6) 10 (50,0) 32 (69,6)

II ст. 13 (50,0) 16 (51,6) 1 (14,3) 15 (62,5)

III ст. 14 (60,9) 26 (74,3) 9 (69,2) 17 (77,3)

Наиболее высокий процент частичной регрессии опухоли зафиксирован у больных с высокоинтегрированной (> 50%) формой ДНК ВПЧ 16/18 (69,6%). Однако во всех случаях различия были статистически незначимыми - р > 0,05 (по критерию Фишера).

Однако анализ отдалённых результатов лечения в зависимости от отсутствия/наличия интеграции методом Каплан-Мейера показал, что общая и безрецидивная кумулятивная выживаемости больных с интегрированной формой ВПЧ 16/18 были ниже, чем с эписомальной (таблица 30).

Таблица 30 - Отдаленные результаты лечения больных РШМ в зависимости от отсутствия/наличия интеграции ДНК ВПЧ 16/18

Выживаемость (%) Форма ВПЧ 16/18 Продолжительность наблюдения, годы

1 3 5

Общая Эписомальная 100 92,9±3,9 88,7±5,6

Интегрированная 92,8±3,1 69,9±5,8 61,5±6,9

Безрецидивная Эписомальная 95,7±2,9 91,7±4,6 86,8±6,4

Интегрированная 81,4±4,6 59,6±6,5 53,5±7,1

Данные различия носили статистически значимый характер: р = 0,005 - для общей выживаемости; р = 0,004 - для безрецидивной выживаемости (по критерию Log Rank) (рисунок 63).

Общая кумулятивная доля выживших (Каплан-Мейер) о Заверш. + Цензурир.

I-----

А

Время наблюдения, годы

а)

^—Эписомальная форма » —Интегрированная форма

Безрецидивная кумулятивная доля выживших (Каплан-Мейер) о Заверш. Цензурир.

б)

Эписомальная форма " — Интегрированная форма

1,0

1,0

0,9

0,9

0,8

0,8

0,7

0,7

0,6

0,6

0,5

0,5

0,4

Рисунок 63 - Общая (а) и безрецидивная (б) выживаемость ВПЧ-инфицированных больных РШМ с различными формами ВПЧ 16/18

При этом необходимо отметить, что при сравнении результатов лечения в зависимости от степени интеграции (более или менее 50%), статистически значимых различий не выявлено ни в общей, ни в безрецидивной выживаемости больных (соответственно р = 0,408 и р = 0,436 по критерию Log Rank) (рисунок 64).

Общая кумулятивная доля выживших (Каплан-Мейер) о Заверш. + Цензурир.

Безрецидивная кумулятивная доля выживших (Каплан-Мейер) о Заверш. + Цензурир.

I-......

< 50% > 50%

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 < 50% Время, годы " " > 50%

1,0

1,0

0,9

0,9

2 0,8

S 0,8

0,7

0,7

0,6

0,6

0,5

0,5

0,4

0,4

а) б)

Рисунок 64 - Общая (а) и безрецидивная (б) выживаемость у ВПЧ-инфицированных больных РШМ с интегрированной формой ВПЧ 16/18 в зависимости

от степени интеграции

Проведенный отдельно по стадиям заболевания анализ результатов лечения больных в зависимости от физического статуса вируса, также выявил высокие показали выживаемости при эписомальной форме ВПЧ 16/18. Обращает на себя внимание, что при II стадии заболевания общая и безрецидивная кумулятивная выживаемость больных с эписомальной формой ВПЧ 16/18 на всех сроках наблюдения составила 100%, при интегрированной форме показатели общей выживаемости составили 100%, 83,3±6,8%, 72,2±9,3% - соответственно на 1 год, 3 года и 5 лет после лечения (различия статистически значимы, р = 0,022 по критерию Log Rank), а безрецидивной - соответственно 94,1±4,0%, 72,0±8,5%, 72,0±8,5% (различия статистически значимы, р = 0,018 по критерию Log Rank) (рисунок 65).

У больных с III стадией заболевания при отсутствии интеграции общая выживаемость на сроке 1 год составила 100%, на сроке 3 года - 81,2±9,7%, 5 лет -72,2±12,1%, что оказалость выше, чем при наличии интеграции - соответственно 86,1±5,7, 61,5±8,4, 51,1±9,7% (р = 0,084 по критерию Log Rank) (рисунок 66 а).

1,05 1,00

I 0,90

Общая кумулятивная доля выживших (Каплан-Мейер) о Заверш. + Цензурир.

е---.*..-.

Безрецидивная кумулятивная доля выживших (Каплан-Мейер) о Заверш. Цензурир.

12 3 4

Продолжительность жизни

эписомальная форма интегрированная форма

12 3 4

Продолжительность наблюдения, годы

— эписомальная форма « - интегрированная форма

а) б)

Рисунок 65 - Общая (а) и безрецидивная (б) выживаемость больных РШМ II стадии

в зависимости от формы ВПЧ 16/18

Статистически значимые результаты получены при сравнении на указанных сроках наблюдения показателей безрецидивной выживаемости: соответственно 90,9±6,1, 84,4±8,5 и 75,9±11,0% - при эписомальной форме; 69,4±7,6, 48,3±9,2 и 36,9±10,1% - при интегрированной форме (р = 0,011 по критерию Log Rank) (рисунок 66 б).

а) б)

Рисунок 66 - Общая (а) и безрецидивная (б) выживаемость больных РШМ III стадии

в зависимости от формы ВПЧ 16/18

Интересно отметить, что все наблюдаемые случаи прогрессирования заболевания при эписомальной форме вируса локализовались в области первичного очага и регионарных лимфоузлов - у 4 (100%), а при интегрированной форме - практи-

0

чески у половины больных встречались в виде отдалённых метастазов (печень, лёгкие, парааортальные лимфоузлы) - у 13 (44,4%), однако данные оказались статистически незначимы (р = 0,1) (таблица 31).

Таблица 31 - Локализация рецидивов и метастазов у больных РШМ II-III стадий в зависимости от отсутствия/наличия интеграции ДНК ВПЧ 16/18

Первичный очаг Отдалённые метастазы □ Итого

Статус (форма) ВПЧ 16/18 и/или регионарные лимфоузлы парааортальные лимфоузлы печень лёгкие Итого

абс. (%) абс. (%) абс. (%) абс. (%) абс. (%)

Эписомальная 4(100) - - - 4(100)

Интегрированная < 50% 6 1 1 1

> 50% 9 3 1 5

всего 15 (55,6) 4 (14,8) 2(7,4) 6(22,2) 27(100)

Проведено изучение зависимости отдаленных результатов лечения от непосредственного ответа опухоли при отсутствии/наличии интеграции ДНК ВПЧ 16/18. Было выявлено, что при интегрированной форме вируса доля неблагоприятного исхода заболевания (прогрессирование) статистически значимо выше при частичной регрессии опухолевого процессапосле проведенного лечения (р = 0,0001 по двустороннему критерию Фишера). Между непосредственными результатами лечения РШМ II-III стадий и клиническим исходом заболевания при интегрированной форме наблюдалась зависимость в виде прямой корреляции (коэффициент корреляции по Спирмену r = 0,56; p < 0,0001); при эписомальной форме - корреляция отсутствовала (коэффициент корреляции по Спирмену r = -0,09; p = 0,68).

Выполнен расчет относительного шанса (OR) неблагоприятного клинического исхода заболевания (прогрессирование) ВПЧ 16/18-инфицированных больных РШМ II-III стадий в зависимости от отсутствия/наличия интеграции ДНК ВПЧ 16/18. По данным анализа на всех сроках наблюдения, относительный шанс (OR) неблагоприятного клинического исхода заболевания при интегрированной форме вируса оказался в несколько раз выше, чем при эписомальной форме (различия ста-

тистически значимы на всех сроках наблюдения, р < 0,05), достигая на сроке 5 лет -8,7 раз (ДИ 2,4 - 31,4, р = 0,001 по двустороннему критерию Фишера ) (таблица 32).

Таблица 32 - Относительный шанс неблагоприятного клинического исхода больных РШМ II-III стадий с интегрированной формой ДНК ВПЧ 16/18

Стадия Время наблюдения, лет Относительный шанс неблагоприятного исхода заболевания, OR Уровень значимости по двустороннему критерию Фишера, р 95% доверительный интервал, ДИ

1 4,8 0,043 1,0-23,2

II-III 3 8,7 0,001 2,2-33,7

5 8,7 0,001 2,4-31,4

1 * 0,505 -

II 3 * 0,032 -

5 * 0,010 -

1 3,8 0,168 0,7-20,8

III 3 8,9 0,006 1,8-43,3

5 7,1 0,034 1,3-38,8

* Рассчитать относительный шанс неблагоприятного исхода заболевания у больных РШМ II стадии не представляется возможным, поскольку в знаменатель формулы расчёта попадает ноль из-за отсутствия в группе с эписомальной формой прогрессирова-ния заболевания.

Выявленная закономерность наблюдается и при III стадии РШМ: ОЯ неблагоприятного исхода заболевания при наличии интеграции ДНК ВПЧ 16/18 на сроках 1, 3 и 5 лет выше соответственно в 3,8 (ДИ 0,7 - 20,8), 8,9 (ДИ 1,8 - 43,3) и 7,1 (ДИ 1,3 - 38,8) раз, чем при отсутствии интеграции со статистической значимостью, начиная с 3-х лет (р < 0,05 по двустороннему критерию Фишера). Расчёт ОЯ для II стадии РШМ не является целесообразным, так как все находящиеся под наблюдением больные с эписомальной формой ВПЧ 16/18 живы на сроке 5 лет без прогрессирования заболевания.

3.3.3. Сравнительное изучение результатов лечения в зависимости от отсутствия ВПЧ ВКР и физического статуса ДНК ВПЧ 16/18 с разработкой биомаркера неблагоприятного прогноза заболевания

Проведено изучение отдаленных результатов лечения 20 ВПЧ-отрицатель-ных больных с II-III стадиями РШМ (II стадия - 5 (25%), III стадия - 15 (75%)). Показатели общей и безрецидивной выживаемости оказались достаточно низкими, составив на сроке 5 лет соответственно 49,0±12,4 и 41,3±13,2% (таблица 33).

Таблица 33 - Непосредственные и отдалённые результаты лечения ВПЧ-отрицательных больных РШМ

Сроки наблюдения Результаты лечения Стадия заболевания

II-III II III

По окончанию лечения Полный ответ 5 (25,0%) 1 (33,3%) 4 (24,5%)

Частичный ответ 15 (75,0%) 2 (66,7%) 13 (76,5%)

5 лет Общая выживаемость 49,0±12,4% 50,3±35,3% 48,5±13,1%

Безрецидивная выживаемость 41,3±13,2% 50,3±35,3% 39,2±14,3%

При сравнительной оценке частоты полных регрессий, а также общей и безрецидивной выживаемости больных РШМ II-III стадии с ВПЧ-отрицательными и ВПЧ 16/18 интегрированными формами опухоли значимых различий не выявлено: соответственно р = 0,25 по критерию Фишера; р = 0,15 и р = 0,36 по критерию Log Rank (рисунок 67).

Аналогичная закономерность наблюдалась и при сравнении результатов лечения отдельно по стадиям заболевания: при II стадии - соответственно р = 0,54 по критерию Фишера; р = 0,48 и р = 0,58 по критерию Log Rank; при III стадии - соответственно р = 0,57 по критерию Фишера; р = 0,23 и р = 0,96 по критерию Log Rank.

С учётом ранее выявленной выраженной обратной корреляции уровня вирусной нагрузки со степенью интеграции ДНК ВПЧ (r = -0,41 при уровне значимости р < 0,0001) можно предположить, что одной из причин невыявления ВПЧ может быть очень низкое количество его копий (ниже порога чувствительности опре-

деления) при высокой степени интеграции вируса. Полученные данные явились основанием для объединения больных с интегрированной ДНК ВПЧ 16/18 и ВПЧ-отрицательных в одну группу.

1,0 0,9

I 0,8

!07

§ 0,6 ЕЁ

С

0,5 0,4 0,3

Общая кумулятивная доля выживших (Каплан-Мейер) о Заверш. + Цензурир.

Безрецидивная кумулятивная доля выживших (Каплан-Мейер) о Заверш. + Цензурир.

Сроки наблюдения, годы

— интегрированная форма ВПЧ

- - ВПЧ-отрицательные формы

Сроки наблюдения, годы

интегрированная форма ВПЧ • ВПЧ-отрицательная форма

а) б)

Рисунок 67 - Общая (а) и безрецидивная (б) выживаемость больных РШМ II-III стадий с ВПЧ-отрицательными и ВПЧ 16/18 интегрированными формами

В соответствии с результатами лечения ВПЧ-отрицательных и ВПЧ 16/18-положительных больных РШМ II-III стадий с наличием или отсутствием интеграции, выполнен расчёт относительного шанса неблагоприятного клинического исхода заболевания (прогрессирование), а также величины AUC - интегрального показателя, объединяющего такие характеристики, как чувствительность и специфичность теста.

Относительный шанс (OR) неблагоприятного исхода заболевания оказался значительно выше у больных РШМ II-III стадий со следующими критериями: невыявление ВПЧ ВКР или наличие интеграции ДНК вируса в клеточный геном при ВПЧ16/18-позитивных формах РШМ, достигая 9,5 раз (ДИ 2,7 - 33,3) на сроке 5 лет (р = 0,0001 по двустороннему критерию Фишера) по сравнению с ВПЧ 16/18-позитивными больными с отсутствием интеграции ДНК вируса (таблица 34). При III стадии заболевания OR на данном сроке был выше в 6,7 раз (ДИ 1,4 - 32,6) (р = 0,017 по двустороннему критерию Фишера).

Для оценки прогностической эффективности выбранного маркера неблагоприятного прогноза местнораспространённого рака шейки матки - невыявление ВПЧ ВКР или интеграция ДНК ВПЧ 16/18 - проведён ROC-анализ (Receiver

Operating Characteristic). С помощью построения ROC-кривой установлен дискриминационный уровень, разделяющий больных на две группы: 1-ая объединяет ВПЧ-отрицательных больных и ВПЧ 16/18-позитивных пациентов с наличием интеграции ДНК вируса, 2-ая - ВПЧ 16/18-позитивых больных с отсутствием интеграции ДНК вируса (рисунок 68).

Таблица 34 - Относительный шанс (OR) негативного исхода заболевания у больных РШМ II-III стадий с неблагоприятными факторами (невыявление вируса или наличие интеграции ДНК ВПЧ 16/18 в клеточный геном)

Сроки Относительный шанс Уровень значимости 95% довери-

Стадия наблюдения, неблагоприятного по двустороннему тельный

лет исхода заболевания, OR критерию Фишера, р интервал, ДИ

II-III 1 5,2 0,0188 1,1-24,6

3 9,4 0,0001 2,5-35,3

5 9,5 0,0001 2,7 - 33,3

II 1 * 0,5111 -

3 * 0,0335 -

5 * 0,0117 -

III 1 3,8 0,1168 0,7 - 19,5

3 7,6 0,0045 1,7-33,5

5 6,7 0,0171 1,4-32,6

* Рассчитать относительный шанс неблагоприятного исхода заболевания у больных РШМ II стадии не представляется возможным, поскольку в знаменатель формулы расчёта попадает ноль из-за отсутствия в группе с эписомальной формой случаев про-грессирования заболевания.

В общей группе больных при II-III стадиях заболевания на всех сроках наблюдения уровень показателя AUC оказался > 0,7 (р < 0,001), что может свидетельствовать о высокой прогностической эффективности разработанного биомаркера - невыявление ВПЧ ВКР или наличие интеграции ДНК ВПЧ 16/18 (независимо от степени интеграции) в геном клетки хозяина (таблица 35).

100-Specificity 100-Specificity

а) б)