Капсулирование биологически активных веществ в матрицы на основе биосовместимых полимеров и их использование для биомедицины тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат химических наук Сташевская, Кира Сергеевна

• Сташевская, Кира Сергеевна
• кандидат химических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат химических наук Сташевская, Кира Сергеевна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Механизмы регенерации тканей.

1.1.1. Особенности заживления кожных ран

1.1.2. Особенности заживления язвы желудка.;.

1.2. Покрытия для терапии ран.

1.3. Биологически активные вещества, ускоряющие репарацию тканей.

1.3.1. Факторы роста.

1.3.2. Тромбин.

1.3.3. Пептиды, имитирующие действие тромбина.

1.4. Системы доставки БАВ и методы их получения.

1.4.1. Микрочастицы и микрокапсулы.

1.4.2. Методы капсулирования БАВ в биосовместимые полимерные микрочастицы и микрокапсулы.

1.4.2.1. Метод простой эмульсии (В/М).

1.4.2.2. Метод двойной эмульсии (ТВ/М/В).

1.4.2.3. Метод двойной эмульсии (В1/М/В2).

1.4.3. Полимерные материалы для капсулирования БАВ.

1.4.3.1. Сополимеры молочной и гликолевой кислот.

1.4.3.1.1. Основные характеристики Р1ЛА.

1.4.3.1.2. Механизм и особенности деструкции РЬОА.

1.4.3.1.3. Механизм выделения БАВ из РЬОА микрочастиц.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Капсулирование биологически активных веществ в матрицы на основе биосовместимых полимеров и их использование для биомедицины»

Одной из сложнейших задач современной биомедицины, а также одной из центральных проблем фундаментальной биохимии, является репарация тканей после повреждения. В настоящее время известно большое число биологически активных веществ (БАВ), влияющих на эффективность регенерации животных тканей. Например, компоненты матрикса раны (фибронектин [1], гиалуроновая кислота [2], различные факторы роста [3] глокозаминогликаны [4] и т.д.), БАВ растительного происхождения (подорожник [5], алоэ [6] и т.д.). Под влиянием различных БАВ происходит улучшение обменных процессов, ускорение регенерации тканей, стимуляция неспецифического иммунитета. Препараты на основе БАВ, используемые в фазах регенерации и рассасывания рубца с эпителизацией, должны обладать определенными свойствами: стимулировать регенеративные процессы, способствуя росту грануляций и ускорению эпителизации, защищать грануляционную ткань от вторичной инфекции и подавлять рост микрофлоры в ране.

Среди прочих биологически активных веществ, способных ускорить процесс заживления ран, повышенное внимание в последнее время уделяется белкам и пептидам (гормонам, различным факторам роста др.). Особое место среди них занимает тромбин (сериновая протеаза семейства трипсина), который, являясь фактором роста, не только регулирует свертывающие и противосвертывающие механизмы и ангиогенез, но также включается в воспалительную и пролиферативную фазы ранозаживления, стимулируя при этом пролиферацию клеток эндотелия, фибробластов и продукцию последними коллагена. Однако применение тромбина ограничено его высокой лабильностью и высокой стоимостью. Ранее в ИБХ РАН для стабилизации тромбина был разработан метод его инкапсулирования в пленки биосовместимого гидрогеля и продемонстрировано ускорение процесса заживление наружных ран под этими покрытиями в моделях in vivo. Кроме того, возможно еще одно решение данной проблемы. Некоторые синтетические пептиды могут имитировать действие тромбина в процессе регенерации ткани. Являясь более дешевыми по сравнению с тромбином, пептиды, однако, очень быстро расщепляются пептидазами в организме.

Разработка транспортных форм с контролируемым выделением пептидов, а именно, их капсулирование в биосовместимые полимерные матрицы позволит, как защитить пептиды от разрушения, так и направленно регулировать скорость их выхода in vivo. В связи с этим особую значимость приобретает правильный выбор полимерной матрицы.

Использование полиэфиров на основе молочной и гликолевой кислот позволяет получать матрицы, которые являются не только биосовместимыми, но и биодеградируемыми, а, следовательно, могут быть предложены для лечения как внешних, так и внутренних ран (раны после хирургических вмешательств, язвы и др.). Варьируя состав полимерной матрицы, размеры микрочастиц, количество капсулированных пептидов, можно контролировать скорость их выхода. Период выхода может варьироваться от нескольких часов до нескольких недель, в зависимости от свойств используемого полимера. Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось капсулирование биологически активных веществ, в частности, пептида-агониста тромбинового рецептора TRAP-6 (thrombin receptor agonist peptide) и его аналога TRAP-6(M) в биосовместимые биодеградируемые микрочастицы на основе сополимера (d,l)-молочной и гликолевой кислот (PLGA) и исследование возможности применения этих пептидов для репарации тканей.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Изучить биологическую активность пептидов in vitro.

2. Разработать и оптимизировать метод инкапсулирования TRAP-6 и TRAP-6(М) в PLGA микрочастицы.

3. Исследовать некоторые физико-химические свойства микрочастиц с инкапсулированными пептидами (распределение микрочастиц по размерам, морфологию поверхности и скорость их деструкции in vitro).

4. Исследовать кинетику выхода пептидов из микрочастиц, а также их адсорбцию на поверхность микрочастиц in vitro.

5. Исследовать ранозаживляющие эффекты инкапсулированных пептидов на процесс репарации тканей как в случае наружных резаных ран, так и для модели язвы желудка (мыши, крысы).

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Сташевская, Кира Сергеевна

выводы

1. Синтезирован новый пептид TRAP-6(M) и изучена его биологическая активность методом агрегации тромбоцитов. Показано, что замещение одной аминокислоты в агонисте тромбинового рецептора TRAP-6 (agonist PAR-1) позволяет сохранить способностью TRAP-6 (М) активировать рецептор PAR-1.

2. Разработаны и оптимизированы методы (двойной и простой эмульсии) инкапсулирования TRAP-6 и TRAP-6(M) в биодеградируемые биосовместимые PLGA микрочастицы.

3. Исследованы некоторые физико-химические свойства микрочастиц с инкапсулированными пептидами (в частности, распределение их по размерам, морфология поверхности и скорость деструкции in vitro).

4. Исследована кинетика выхода пептидов из микрочастиц. Показано, что параллельно с выходом пептидов происходят процессы адсорбции/десорбции на/с поверхности PLGA микрочастиц, причем характер этой адсорбции зависит от типа пептида.

5. Впервые продемонстрирован положительный эффект TRAP-6(M) на процесс репарации тканей.

6. Показано, что инкапсулированные пептиды TRAP-6 и TRAP-6(M) ускоряют заживление кожных резаных ран и язвы желудка в моделях на мышах и крысах.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор благодарен И.А. Прудченко за синтез пептидов TRAP-6 и TRAP-6(M), С.М. Струковой за сотрудничество при исследовании эффективности пептидов, инкапсулированных в микрочастицы in vivo на моделях кожных ран у мышей и язвы желудка у крыс, Ш. Шуженс за помощь в проведении эксперментов. Отдельная благодарность научным руководителям Марквичевой Е.А. и Грандфису К. за возможность ознакомиться с широкими практическими навыками при выполнении этой работы, помощь в проведении экспериментов, своевременные и полезные советы, а также плодотворные обсуждения и помощь в подготовке этой работы.

1.5. Заключение

Разработка перспективных транспортных форм с контролируемым высвобождением активного вещества является одним из важнейших направлений современных исследований. Как следует из обзора литературы, для ускорения заживления ран представляется интересным использование пептидов-агонистов рецептора тромбина. Капсулирование таких пептидов в микрочастицы на основе РЬвА может позволить получить новые эффективные препараты с контролируемым выделением пептидов для заживления различных ран.

2. ЭКСПЕРИМЕНТНАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2.1. Материалы 2.1.1. Реагенты

В работе были использованы следующие синтетические пептиды, синтезированные в Лаборатории химии пептидов ИБХ РАН:

- TRAP-6: Ser-Phe-Leu-Leu-Arg-Asn-NH2 (Mw 976 Да).

- TRAP-6(M): модифицированный TRAP-6.

- PLGA: (Resomer RG 503 P(D,L-)LA/GA: (50/50); Mw 24,6 кДа, Mn 14,3 кДа, [т\]

- 0.4 дл/г) производства фирмы «Boehringer Ingelheim» (Германия).

- Желатин - типа A (G2500) производства фирмы «Sigma» (США).

- Поливиниловый спирт (ПВС): (Mw 18 кДа, ацетатных групп - 17%) марки Mowiol VP 3-83, производства фирмы «Hoechst» (Германия).

2.1.2. Буферные растворы

Буфер для исследования кинетики выхода и адсорбции/десорбции пептидов на/с поверхности PLGA микрочастиц: (HEPES (5 mM) NaN3 - 0.001 %, pH 7,5); Буфер для исследования биологической активности пептидов: фосфатно-солевой буфер (PBS): (Na2HP04 (5 mM) /КН2Р04 (5 mM), NaCl - 0.9 %, pH 7,2) производства фирмы Henogen (Бельгия).

2.1.3. Растворители

Использовали сл едущие растворители марки х.ч.: метиленхлорид (113460025), ацетонитрил (258560010) и толуол (176850010) производства фирмы Acros Organics (Бельгия); этилацетат (А3611) производства фирмы

Labscan (Бельгия); диметил сульфоксид - DMSO (16785.04) производства Janssen Chimica (Бельгия); тетрагидрофуран - THF (8075) и ацетон (8003) производства фирмы Mallinckrodt Baker (Голландия).

2.2. Лабораторное оборудование

В работе использовали гомогенизатор Omni International 2000; термостатируемую качалку SW 20С (Julabo); механическую мешалку RW20 (ПСА) с диаметром пропеллера 2.5 см; тахометр DZM1 (Ika-Tron); бумажные фильтры диаметром 10 см (Schleicher & Schuell) и диаметром 7 см (Whatman); световой микроскоп OLYMPUS PROVIS АХ-70 с камерой Olympus DP50; сканирующий электронный микроскоп JSM-840 (JEOL); установку для напыления Au-PD слоя SCP-20 (Sputtering Balzer); счетчик частиц Coulter Multisizer II (Beckman); центрифугу Allegra 21R (Beckman); лиофилизатор Speed Vac (Savant); хроматограф «System Gold», (Beckman), оснащенный градиентным насосом 126, UV детектором 166, колонкой С18 125 х 4 мм (Lichrosphere 100 Merck) и автосамплером (Hitachi/Merck L7200); установку для очистки воды Simlicity (Millipore); весы аналитические (Mettler РМ460); автоматические микропипетки (Pipetman); стеклянные пробирки PCS (5 мл); полипропиленовые пробирки (5 мл); полипропиленовые пробирки Eppendorf (0,5 мл), Пастеровские стеклянные пипетки длиной 230 мм (Deltalab), стеклянные конические колбы (250 мл), шейкер Vortex RX-3 (Velp, Италия), магнитную мешалку MR1000 (Heidolph), водяную баню TW-2 (Julabo), лиофилизатор ALPHA 1-4 LD (Martin Christ).

2.3. Методы

2.3.1. Капсулирование пептидов методом двойной эмульсии (В|/М/В2)

Процесс получения микрочастиц с методом В|/М/В2 состоит из 3-х стадий (рис. 13):

1) Приготовление первичной эмульсии. Первичную эмульсию В|/М получают гомогенизацией внутренней водной фазы, представленной раствором пептида, и внешней органической фазы, представленной раствором РЬОА в метнленхлориде. Первичная эмульсия стабилизируется желатином.

2) Эмульгирование первичной эмульсии во вторичной видной фазе, представленной раствором ПВС, с образованием двойной эмульсии В1/М/В2;

3) Испарение растворителя с образованием твердых микрочастиц.

-N м X1 о ••••• сч

Р1СА + Пептид Желатин

СН2С12 Растворитель А

В,/М

В/М/Вг

Твердые микрочастицы

Рис. 13. Схема получения капсулиронапия ТЯАР-б и ТЯАР-6{М) в Р1,ОА микрочастицы методом В1/М/В2

Для капсулирования пептидов были приготовлены следующие растворы:

- 0,703 г PLGA растворяли в 6,37 мл метиленхлорида в стеклянном флаконе (10 мл) при перемешивании на магнитной мешалке в течение 30 мин при комнатной температуре;

- 12,5 мг TRAP-6 и 10.1 мг TRAP-6(M) растворяли в 750 мкл деионизированной воды в стеклянной пробирке PCS при комнатной температуре;

- 0,2 г желатина растворяли в 1 мл деионизированной воды в стеклянной пробирке PCS при 50°С на водяной бане в течение 1 часа;

- 3,75 мг ПВС растворяли в 150 мл деионизированной воды в конической стеклянной колбе (250 мл) при перемешивании на магнитной мешалке в течение 1 часа при RT;

Первичную эмульсию получали из растворов, нагретых до температуры 40°С. Для получения первичной эмульсии, 300 мкл 1,6 % раствора пептида добавляли к 100 мкл 20% раствора желатина и перемешивали в течение 30 сек при помощи гомогенизатора Omni International 2000 (скорость п° 2). К полученной дисперсии водной фазы, не прекращая перемешивания, добавляли 1,8 мл раствора PLGA.

Добавив раствор полимера, увеличивали скорость перемешивания (п°3-4) и продолжали процесс еще 30 с. Далее полученную первичную эмульсию (Bj/M) добавляли к 30 мл вторичной водной фазы (2,5 % раствор ПВС), находящейся в термостатируемой качалке (Julabo SW 20С) при 15°С и перемешиваемой со скоростью 500 об/мин механической мешалкой (IKA RW20, тахометр Ika-Tron: DZM1). Перемешивание продолжали 15 мин при 15°С для получения вторичной эмульсии (В1/М/В2). Затем температуру увеличивали до 30°С и продолжали перемешивание еще 30 мин до полного испарения растворителя. К полученной суспензии микрочастиц добавляли 40 мл деионизированной воды комнатной температуры и останавливали процесс через 1 мин. Осажденные микрочастицы промывали на бумажном фильтре (Whatman/Schleicher & Schuell) и лиофильно сушили. После лиофилизации микрочастицы взвешивали и перемещали из бумажных фильтров в пластиковые пробирки Eppendorf. Микрочастицы хранили при - 25°С до проведения последующих анализов. Количественный выход тщательно промытых и лиофильно высушенных микрочастиц определяли как процентное отношение массы частиц к суммарной массе полимера и пептида по формуле:

Мм/ч

М= —-- :|:100%

-^пол + М-пепт

•■пол где Мм/, - масса промытых и лиофильно высушенных микрочастиц; Мп масса и Мпепт - соответственно массы полимера и пептида, использованных для микрокапсулирования.

2.3.2. Капсулирование пептидов методом простой эмульсии (В/М)

Капсулирование проводили в стеклянной пробирке с использованием этилацетата или смеси метиленхлорид/ацетон (90/10% масс.). Метод заключался в диспергировании пептида в твердом виде непосредственно в этилацетате и в смеси метиленхлорид/ацетон, содержащих PLGA, а последовательность всех последующих операций была, как описано ранее для метода Bi/M/B2 (см. главу Экспериментальная часть, п/п 2.3.1.).

2.3.3. Исследование стабильности двойной эмульсии и распределения

PLGA микрочастиц по размерам

Наблюдение и фотографирование для исследования стабильности капель двойной эмульсии проводили с помощью светового микроскопа (Olympus PROVIS АХ 70), оснащенного камерой (DP 50). Аликвоту суспензии капель двойной эмульсии отбирали непосредственно после внесения первичной эмульсии (В[/М) во вторичную водную фазу. ч

Определение формы и распределения по размерам лиофильно высушенных контрольных микрочастиц и микрочастиц с пептидами также проводили с помощью светового микроскопа. Распределение микрочастиц по размерам определяли с помощью программного обеспечения (Lucia Karyo). Подсчитывали количесто частиц различного размера, оказавшихся в поле зрения микроскопа. Процедуру повторяли несколько раз, сдвигая поле микроскопа на новое место. По результатам анализа строили зависимость суммарного объема частиц от их размера.

2.3.4. Получение образцов для исследований

2.3.4.1. Получение образцов для исследования скорости деструкции PLGA микрочастиц

Для получения образцов в стеклянные пробирки (32 х 11,5 мм; 1,5 мл; Merck), содержащие 0,5 мл буферного раствора HEPES (pH 7,5), вносили, по 5 мг микрочастиц с пептидами и контрольных микрочастиц. Из каждого образца отбирали (0,1 мг) микрочастиц до инкубации и через 1 день, 2 дня, 5 дней, 7 дней, и 15 дней после начала инкубации. После инкубирования образцы микрочастиц трижды промывали деионизированной водой для очистки от солей и лиофильно высушивали. Образцы микрочастиц хранили при -25°С до проведения анализа.

2.3.4.2. Получение образцов для исследования кинетики выхода пептидов и их адсорбции/десорбции с/на поверхности PLGA микрочастиц

Для получения образцов в стеклянные пробирки PCS, содержащие 1 мл буферного раствора HEPES (pH 7,5), вносили:

1) 10 мг микрочастиц с пептидами (для исследования кинетики выхода пептидов);

2) 10 мг контрольных микрочастиц и 0,2 мг пептида (для исследования адсорбции/десорбции пептидов на/с поверхности микрочастиц);

3) 0,2 мг пептида (для контролирования стабильности пептида в буферном растворе).

Полученные образцы инкубировали в термостатируемой качалке Julabo SW 20С (37°С, 100 об/мин). Из каждого образца в стеклянные пробирки для автосэмплеров проб ВЭЖХ (1,5 мл; Waters) через 5 мин, 30 мин, 1 ч, 4 ч, 8 ч, 1 день, 2 дня, 5 дней, 7 дней и 15 дней после начали инкубации отбирали следующие аликвоты супернатантов:

1) 100 мкл из инкубируемых образцов, содержащих 0,2 мг пептида;

2) 750 мкл из образцов, содержащих контрольные микрочастицы и 0,2 мг пептидов.

3) 750 мкл из образцов, содержащих микрочастицы с пептидами.

Вместо отобранных аликвот супернатантов в каждый образец добавляли соответствующий объем буферного раствора.

Аликвоты супернатантов хранили при -25°С до проведения экспериментов.

2.3.4.3. Получение образцов для исследования биологической активности пептидов

Образцы для исследования методом агрегации тромбоцитов получали разбавлением буфером PBS (рН 7,2) исходных водных растворов пептидов (10 мМ) по схеме, приведенной в таблице 2.

Растворы пептидов в концентрациях 2, 5, 10, 20, 40 мкМ использовали для построения калибровочной кривой и определения значений полумаксимальной стимулирующей концентрации пептидов. Растворы пептидов (10 мкМ) использовали для исследования стабильности каждой используемой фракции отп.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Сташевская, Кира Сергеевна, 2006 год

1. K.M. Yamada. Fibronectin peptides in cell migration and wound repair. - J. Clin. 1.vest., 2000, v. 105, N 11, p. 1507-1509.

2. S.R. King, W.L. Hickerson, K.G. Proctor. Beneficial actions of hyaluronic acid on wound healing. Surgery, 1991, v. 109, N 1, p. 76-84.

3. G.F. Pierce, T.A. Mustoe, B.W. Altrock, T.F. Deuel, A. Thomason. Role of platelet-derived growth factor in wound healing. J. Cell. Biochem., 2004, v. 45, N4. p. 319-326.

4. P.V. Peplow. Glycosaminoglycan: a candidate to stimulate the repair of chronic wounds. Thromb. Haemost., 2005, v. 94, N 1, p. 4-16.

5. A.B. Samuelsen. The traditional uses, chemical constituents and biological activities of Plantago major L. J. Ethnopharmacol., 2000, v. 71, N 1-2, p. 1-21.

6. S.W. Choi, B.W. Son, Y.S. Son, Y.I. Park, S.K. Lee, M.H. Chung. The wound healing effect of a glycoprotein fraction isolated from aloe vera. Br. J. Dermatol., 2001, v. 145, N4, p. 535-545.

7. R.A.F. Clark. Wound repair: Overview and general considerations. In: The Molecular and Cell Biology of Wound Repair. Second Edition. (R.A.F. Clark - Ed.), Plenum Press, New York, 1996, p. 3-50.8. http://connection.lww.com/Products/porth7e/Ch20.asp

8. L. Russel. Understanding physiology of wound healing and how dressings can help. Br. J. Nurs., 2000, v. 9, N 1, p. 10-21.

9. P. Martin. Wound healing aiming for perfect skin regeneration. - Science, 1997, v. 276, p. 75-81.

10. D.J. Cullen, B.J. Collins, K.J. Christiansen, J. Epis, J.R. Warren, I. Surveyor, K.J. Cullen. When is Helicobacter pylori infection acquired? Gut., 1993, v. 34, N 12, p. 1681-1682.

11. J.R. Warren. Gastric pathology associated with Helicobacter pylori. -Gastroenterol. Clin. North. Am., 2000, v. 29, N 3, p. 705-751.13. http://www.glycoforum.gr.jp/science/word/proteoglycan/PGC03E.html

12. M. Bradley, N. Cullum, E.A. Nelson, M. Petticrew, T. Sheldon, D. Torgerson. Systematic reviews of wound care management: (2) Dressings and topical agents used in the healing of chronic wounds. Health. Technol. Assess., 1999; v. 3, N 17, p. 1-35.

13. T. Natsume, 0. Ike, T. Okada, N. Takimoto, Y. Shimizu, Y. Ikada. Porous collagen sponge for esophageal replacement. J. Biomed. Mater. Res., 1993, v. 27, N 7, p. 867-875.

14. J.A. Rowley, G. Madlambayan, D.J. Mooney. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials, 1999, v. 20, N 1, p. 45-53.

15. K. Lay-Flurrie. The properties of hydrogel dressings and their impact on wound healing. Prof. Nurse., 2004, v. 19, N 5, p. 269-273.

16. Z. Wu, Z. Sheng, T. Sun, M. Geng, J. Li, Y. Yao, Z. Huang. Preparation of collagen-based materials for wound dressing. Chin. Med. J., 2003, v. 116, N 3, p. 419-423.

17. H.C. Segal, B.J. Hunt, K. Gilding. The effects of alginate and non-alginate wound dressings on blood coagulation and platelet activation. J. Biomater. Appl., 1998, v. 12, N 3, p. 249-257.

18. H. Ueno, H. Yamada, I. Tanaka, N. Kaba, M. Matsuura, M. Okumura, T. Kadosawa, T. Fujinaga. Accelerating effects of chitosan for healing at early phase of experimental open wound in dogs. Biomaterials, 1999, v. 20, N 15, p. 1407-1414.

19. L. Morris. Clinical efficacy of C-View transparent film wound dressing. Br. J. Nurs., 2001, v. 10, N 9, p. 616-620.

20. CJ. Doillon. Porous collagen sponge wound dressings: in vivo and in vitro studies. J. Biomater. Appl., 1988, v. 2, N 4, p. 562-578.

21. S. Thomas. Hydrocolloids update. J. Wound Care, 1992, v. 1, p. 27-30.

22. V. Jones. Alginate dressings and diabetic foot lesions. Diab. Foot., 1999, v. 2, p. 8-14.

23. S. Thomas, N.P. Hay. Assessing the hydroaffinity of hydrogel dressings. J. Wound Care, 1995, v. 3, p. 89-91.

24. S. Werner, R. Grose. Regulation of wound healing by growth factors and cytokines. Physiol. Rev., 2003, v. 83, p. 835-870.

25. D.G. Greenhalgh. The role of growth factors in wound healing. J. Trauma, 1996, v. 41, p. 159-167.

26. G.S. Schultz, M. White, R. Mitchel, G. Brown, J. Lynch, D.R. Twardzik, G.J. Todaro. Epithelial wound healing enhanced by transforming growth factor-a and vaccinia growth factor. Science, 1987, v. 235, p. 350-352.

27. D.L. Steed. Modifying the wound healing response with exogenous growth factors. Clin. Plast. Surg., 1998, v. 25, p. 397-405.

28. S.T. Schuschereba, P.D. Bowman, R.E. Ferrando, D.J. Lund, J.A. Quong, J.A. Vargas. Accelerated healing of laser-injured rabbit retina by basic fibroblast growth factor. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 1994, v. 35, p. 945-954.

29. R. Tsubai, D.B. Rifkin. Recombinant basic fibroblast growth factor stimulates wound healing in healing-impaired db/db mice. J. Exp. Med., 1990, v. 172, p. 245251.

30. S.E. Lynch, R.B. Colvin, H.N. Antoniades. Growth factors in wound healing. Single and synergistic effects on partial thickness porcine skin wounds. J. Clin. Invest., 1989, v. 84, p. 640-646.

31. R.A. Clark. Regulation of fibropasia in cutaneous wound repair. Am. J. Med.

32. Sci., 1993, v. 306, p. 42-48.

33. C.H. Heldin, B. Westermark. Mechanism of action and in vivo role of platelet-derived growth factor. Physiol. Rev., 1999, v. 79, p. 1283-1316.

34. T.G. Terrell, P.K. Working, C.P. Chow, J.D. Green. Pathology of recombinant human transforming growth factor-beta 1 in rats and rabbits. Int. Rev. Exp. Pathol., 1993, v. 34, p. 43-67.

35. P. Carmeliet. VEGF gene therapy: stimulating angiogenesis or angioma-genesis? -Nat. Med, 2000, v. 6, p. 1102-1103.

36. N. Celebi, N. Erden, B. Gonul, M. Koz. Effects of epidermal growth factor dosage forms on dermal wound strength in mice. J. Pharm. Pharmacol, 1994, v. 46, p. 386-387.

37. C.K. Derian, B.P. Damiano, M.R. D'Andrea, P. Andrade-Gordon. Thrombin Regulation of Cell Function through Protease-Activated Receptors: Implications for Therapeutic Intervention. Biochemistry, 2002, v. 67, N. 1, p. 56-64.

38. SR. Coughlin, E. Camerer. PARticipation in inflammation. J. Clin. Invest, 2003, v. Ill, p. 25-27.

39. R.C. Chambers, K. Dabbagh, R.J. McAnulty, A.J. Gray, O.P. Blanc-Brude, G.J. Laurent. Thrombin stimulates fibroblast procollagen production via proteolytic activation of protease-activated receptor 1. Biochem J, 1998, v. 333, N 1, p. 121127.

40. K. Dabbagh, G.J. Laurent, R.J. McAnulty, R.C. Chambers. Thrombin stimulates smooth muscle cell procollagen synthesis and mRNA levels via a PAR-1 mediated mechanism. Thromb. Haemost, 1998, v. 79, N 2, p. 405-409.

41. R.J.A. Grand, A.S. Turnell, P.W. Grabham. Cellular consequences of thrombin-receptor activation. Biochem J., 1996, v. 313, p. 353-368.

42. T.K. Vu, D.T. Hung, V.I. Wheaton, S.R. Couglin, Molecular cloning of a functional thrombin receptor reveals a novel proteolytic mechanism of receptor activation. Cell, 1991, v. 64, N 6, p. 1057-1068.

43. R.E. Gerszten, J. Chen, M. Ishii, L. Wang, T. Natevicz, C.W. Turk, T.K. Vu, S.R. Couglin. Specificity of the thrombin receptor for agonist peptide is defined by its extracellular surface. Nature, 1994, v. 368, N 6472, p. 648-651.

44. W.F. Bahou, J.L. Kutlok, A. Wong, C.L. Potter, B.S. Coller. Identification of a novel thrombin receptor sequence required for activation-dependent responses. -Blood, 1994, v. 84, N 12, p. 4195-202.

45. S.M. Strukova, T.N. Dugina, I.V. Chistov, E.A. Markvicheva, S.V. Kuptsova, E.G. Kolokol'chikova, L.D. Rumsh, V.P. Zubov, E. Gluza. Thrombin a regulator of reparative processes in wound healing. - Bioorg Khim., 1998, v. 24, N 4, p. 288-292.

46. R.R Vassalo, T. Kieber-Emmons, K. Cichowski, L.F. Brass. Structure-function relationships in the activation of platelet thrombin receptors by receptor-derived peptides. J. Biol.Chem., 1992, v. 267, p. 6081-6085.

47. T.K. Vu, D.T. Hung, V.I. Wheaton, S.R. Coughlin. Cell, 1991, v. 64, p. 10571068.

48. E. Van Obberghen-Schilling, U.B. Rasmussen, V. Vouret-Craviari, K.U. Lentes, A. Pavirani, J. Pouyssequr. Structure-activity analysis of synthetic alpha-thrombin-receptor-activating peptides. Biochem. J., 1993, v. 292, p. 667-671.

49. V. Vouret-Craviari, E. Van Obberghen-Schilling, J.C. Scimeca, E. Van Obberghen, J. Pouyssequr. Differential activation of p44mapk (ERK1) by alpha-thrombin and thrombin-receptor peptide agonist. Biochem. J., 1993, v. 289, p. 209214.

50. A. Kawabata. The G Protein-Coupled Protease Receptor PAR (Protease-Activated Receptor) as a Novel Target for Drug Development. Yakugaku Zasshi, 2001, v. 121, N 1, p. 1—7.

51. S.M. Strukova, T.N. Dugina," I.V. Chistov, M. Lange, E.A. Markvicheva, S. Kuptsova, V.P. Zubov, Glusa E. (2001) Immobilized thrombin receptor agonist peptide accelerates wound healing in mice. Clin. Appl. Thromb. Hemost., 2001, v. 7, N4, p. 325-329.

52. K, Petrak. Essential properties of drug-targeting delivery systems. Drug Discov. Today, 2005, v. 10, N 23-24, p. 1667-1673.

53. L.M. Mainardes, L.P. Silva. Drug delivery systems: past, present, and future. -Curr. Drug. Targets, 2004, v. 5, N 5, p. 449-455.

54. Л.И. Валуев, Т.А. Валуева, И.JI. Валуев, Н.А. Платэ. Полимерные системы для контролируемого выделения биологически активных веществ. Усп. Биол. Хим., 2003, т. 3, с. 307-328.

55. D. Eisenbud, Н. Hunter, L. Kessler, К. Zulkowski. Hydrogel wound dressings: where do we stand in 2003? Ostomy Wound Manage, 2003, v. 49, N 10, p. 52-57.

56. C. Dai, B. Wang, H. Zhao, B. Li, J. Wang. Preparation and characterization of liposomes-in-alginate (LIA) for protein delivery system. Colloids. Surf. В Biointerfaces, 2006, v. 47, N 2, p. 205-210.

57. R. Singh, S.P. Vyas. Topical liposomal system for localized and controlled drug delivery. J. Dermatol. Sci., 1996, v. 13, p. 107-111.

58. F. Gu, B. Amsden, R. Neufeld. Sustained delivery of vascular endothelial growth factor with alginate beads. J. Control. Release, 2004, v. 96, N 3, p. 463-472.

59. S. Dumitriu. Polymeric Biomaterials. 2nd Ed. Marcel Dekker, New York, 2002. 79. М.И. Штильман. Полимеры в биологически активных системах. -Соросовский образовательный журнал, 1998, v. 4, N 5, р. 48-53.

60. K.S. Soppimath, Т.М. Aminabhavi, A.R. Kulkarni, W.E. Rudzinski. Biodegradable polymeric nanoparticles as drug delivery devices. J. Control. Release, 2001, v. 70, p. 1-20.

61. M.H. Lameiro, A. Lopes, L.O. Martins, P.M. Alves, E. Melo. Incorporation of a model protein into chitosan-bile salt microparticles. Int. J. Pharm., 2006, v. 312, N 1-2, p. 119-130.

62. A. Grenha, B. Seijo, C. Remunan-Lopez. Microencapsulated chitosan nanoparticles for lung protein delivery. Eur. J. Pharm. Sci., 2005, v. 25, N 4-5, p. 427-437.

63. G. Lambert, E. Fattal, P. Couvreur. Nanoparticulate systems for the delivery of antisense oligonucleotides. Adv. Drug. Deliv. Rev., 2001, v. 47, N 1, p. 99-112.

64. G. De Rosa, F. Quaglia, M. La Rotonda, M. Besnard, E. Fattal. Biodegradable microparticles for the controlled delivery of oligonucleotides. Int. J. Pharm., 2002, v. 242, N1-2, p. 225-228.

65. Y. Hattori, Y. Maitani. Folate-linked lipid-based nanoparticle for targeted gene delivery. Curr. Drug. Deliv., 2005, v. 2, N 3, p. 243-252.

66. L. Lu, M.J. Yaszemski, A.J. Mikos. TGF-B1 Release from Biodegradable

67. Polymer Microparticles: Its Effects on Marrow Stromal Osteoblast Function. The Journal of Bone and Joint Surgery, 2001, v. 83, p. 82-92.

68. D.T. Birnbaum, L. Brannon-Peppas. Microparticle drug delivery systems. In: Drug Delivery Systems in Cancer Therapy. (Brown D.M. Ed.) pp. 117-136, Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2003.

69. R.P. Batycky, J. Hanes, R. Langer, D.A. Edwards. A theoretical model of erosion and macromolecular drug release from biodegrading microspheres. J. Pharm. Sci, 1997, v. 86, N12, p. 1464-1477.

70. C.S. Brazel, N.A. Peppas. Modelling of drug release from swellable polymers. -Eur. J. Pharm. Biopharm, 2000, v. 49, N 1, p. 47-58.81. http://www.drugdel.com/polymer.htm

71. S. Freitas, H.P. Merkle, B. Gander Microencapsulation by solvent extraction/evaporation: reviewing the state of the art of microsphere preparation process technology. J. Control. Release, 2005, v. 102, p. 313-332.

72. I.D. Rosea, F. Watari, M. Uo. Microparticle formation and its mechanism in single and double emulsion solvent evaporation. J. Control. Release, 2004, v. 99, N 2, p. 271-280.

73. C.H. Chang, S.M. Tung, D.W. Lu, M.K. Yeh. In vitro and in vivo evaluation of an ocular delivery system of 5-fluorouracil microspheres. J. Ocul. Pharmacol. Ther, 2001, v. 17, N 6, p. 545-553.

74. Vracken M.N, Claeys. 3.526.906. Unated States Patent Office. 1970.

75. De Jaeger N.C, Tavernier B.H. 1.405.108. British Patent. 1971.

76. N. Nihant, Ch. Shugens, Ch. Grandfils, R. Jerome, Ph. Teyssie. Polylactide microparticles prepared by double emulsion/evaporation technique. I. Effect of primary emulsion stability. Pharmaceutical Research, 1994, v. 11, N 10, p. 14791484.

77. N. Nihant, Ch. Schugens, Ch. Grandfils, R. Jerome, Ph. Teyssie. Polulactide microparticles prepared by double emulsion-evaporation. II. Effect of poly(lactideco-glycolide) composition on the stability of the primary and secondary emulsions.

78. J. Colloid. Interfacal. Sci., 1995, v. 173, p. 55-65.

79. N.B. Viswanathan, P.A. Thomas, J.K. Pandit, M.G. Kulkarni, R.A. Mashelkar. Preparation of non-porous microspheres with high entrapment efficiency of proteins by a (water-in-oil)-in oil emulsion technique. J. Control. Release, 1999, v. 58, p. 920.

80. Sh. Takada, Y. Yamagata, M. Misaki, K. Taira, T. Kurokawa. Sustained release of human growth hormone from microcapsules prepared by a solvent evaporation technique. J. Control. Release, 2003, v. 88, p. 229-242.

81. Castellanos I.J., Carrasquillo K.G., de Jesus Lopez J., Alvarez M., Griebnow K. Encapsulation of bovine serum albumin in poly(lactide-co-glycolide) microspheres by the solid-in-oil-in-water technique. J. Pharm. Pharmacol., 2001, v. 53, p. 167178.

82. R. Jain, N.H. Shah, A.W. Malick, C.T. Rhodes. Controlled drug delivery by biodegradable poly(ester) devices: different preparative approaches. Drug. Dev. Ind. Pharm, 1998, v. 24, N 8, p. 703-727.

83. S.K. Dordunoo, J.K. Jackson, L.A. Arsenault, A.M.C. Oktaba, W.L. Hunter, H.M. Burt. Taxol encapsulation in poly(£-caprolactone) microspheres. Cancer Chemother Pharmacol, 1995, v. 36, N 4, p. 279-282.

84. F. Ahmed, D.E. Discher Self-porating polymersomes of PEG-PLA and PEG-PCL: hydrolysis-triggered controlled release vesicles. J Control Release. 2004; 96(1): 37-53.

85. Y. Deyrail, N. Zydowicz, P. Cassagnau. Polymer crosslinking controlled by release of catalyst encapsulated in polycarbonate micro-spheres. Polymer, 2003, v. 45, N 18, p. 6123-6131.

86. S. Bogdansky. Natural Polymers as Drug Delivery Systems In: Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (M. Chasin, R. Langer, Eds.), p. 231-259. Marcel Dekker, New York, 1990.

87. M. Vert, G. Schwach, R. Engel, J. Coudane. Something new in the field of PLA/GA bioresorbable polymers? J. Control. Release, 1998, v. 53, p. 85-92.

88. R. Jeyanthi, B.C. Thanoo, R.C. Metha, P.P. DeLuca. Effect of solvent removal technique on the matrix characteristics of polylactide/glycolide microspheres for •peptide delivery. J. Control. Release, 1996, v. 38, p. 235-244.

89. W-I. Li, K.W. Amderson, R.C. Mehta, P.P. DeLuca. Prediction of solvent removal profile and eeffect on properties for peptide-loaded PLGA microspheres prepared by solvent extraction/evaporation method. J. Control. Release, 1995, v. 37, p. 199-214.

90. C. Thies. Formulation of degradable drug-loaded microparticles by in-liquid drying processes. In: Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy (M. Dunbrow, Ed.), p. 47-71, CRC, Boca Raton, FL, 1992.

91. F. Ungaro, M. Biondi, L. Indolfi, G. De Rosa, M.I. La Rotonda, F. Quaglia, P. Netti. Bioactivated Polymer Scaffolds for Tissue Engineering. Topics in Tissue Engineering, 2005, v. 2, p. 1-38.

92. Piskin E. Biodegradable polymers as biomaterials. J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 1995, v. 6, N9, p. 775-795.

93. K.Y. Win, S. Feng. Effects of particle size and surface coating on cellular uptake of polymeric nanoparticles for oral delivery of anticancer drugs. Biomaterials, 2005, v. 26, p. 2713-2722.105. www.puracbiomaterials.com

94. L.D. Shea, D. Wang, R.T. Franceschi, D.J. Mooney. Engineered bone development from a pre-osteoblast cell line on three-dimensional scaffolds. Tissue Eng., 2000, v. 6, N 6, p. 605-617.

95. J. Mayer, E. Karamuk, T. Akaike, E. Wintermantel. Matrices for tissue engineering-scaffold structure for a bioacrtificial liver support system. J. Control.

96. Release, 2000, v. 64, N 1, p. 81-90.

97. N.K. Varde, D.W. Pack. Microspheres for controlled release drug delivery. -Expert. Opin. Biol. Ther., 2004, v. 4, p. 35-51.

98. V.R. Sinha, A. Trehan. Biodegradable microspheres for protein delivery. J. Control. Release, 2003, v. 90, p. 261-280.

99. I. Engelberg, J. Kohn. Physico-mechanical properties of degradable polymers used in medical applications: a comparative study. Biomaterials, 1991, v. 12, p. 292-304.

100. L. Lu, Ch.A. Garcia, A.G. Mikos. In vitro degradation of thin poly(DL-lactic-co-glycolic acid) films. J. Biomed. Mater. Res., 1999, v. 46, N 2, p. 236-244.

101. U. Edlund, A.C. Albertsson. Degradable polymer microspheres for controlled drug delivery. Advances in Polymer Science, 2002, v. 157, p. 67-112.

102. V. Lemaire, J. Belair, P. Hildgen. Structural modeling of drug release from biodegradable porous matrices based on a combined diffusion/erosion process. Int. J. Pharm., 2003, v. 258, p. 95-107.

103. C. Washington. Drug release from microparticulate systems. In: Microencapsulation. (S. Benita, ed.) p. 155-182, Marcel Dekker, New York, 1996.

104. G. Crotts, T.G. Park. Protein delivery from poly(lactic-co-glycolic acid) biodegradable microspheres: release kinetics and stability issues. J. Microencapsul., 1998, v. 15, p. 699-713.

105. H.S. Okabe, J.L.A. Roth, C.J. Pfeiffer. A method for experimental, penetratinggastric and duodenal ulcers in rats. Observations on normal healing. Amer. J. Digestive Disease, 1971, v. 16, N 3, p. 277-284.120. http://en.wikipedia.org/wiki/Aminoacid

106. T. Nose, T. Fujita, M. Nakajima, Y. Inoue, T. Costa, Y. Shimohigashi. Interaction mode of the Phe-Phenyl group of thrombin receptortethered ligand SFLLRNP in receptor activation. J. Biochem, 1998, v. 124, p. 354-358.

107. C.K Derian, B.E. Maryanoff, P. Andrade-Gordon, H.C. Zhang. Design and evaluation of peptide-mimetic PAR-1 antagonists. Drug Development Res, 2003, v. 59, p. 355-366.

108. M. Weber, F. Gerdsen, K. Gutensohn, V. Schoder, B. Eifring, D.K. Hossfeld. Enhanced platelet aggregation with TRAP-6 and collagen in platelet aggregometry in patients with venous thromboembolism. Thrombosis Res, 2002, v. 107, N 6, p. 325-328.

109. D. Glaser, T. Hilberg. The influence of bromelain on platelet count and plateletactivity in vitro. Platelets, 2006, v. 17, N 1, p. 37-41.

110. S. Kulkarni, S.M. Dopheide, C.L. Yap, C. Ravanat, M. Freund, P. Mangin, K.A. Heel, A. Street, I.S. Harper, F. Lanza, S.P. Jackson. A revised model of platelet aggregation. J. Clin. Invest., 2000, v. 105, N 6, p. 699-701.

111. K.J. Clemetson. Primary haemostasis: sticky fingers cement the relationship. -Curr. Biol., 1999, v. 9, p. 110-112.

112. J.G. White. EDTA-induced changes in platelet structure and function: clot retraction. Platelets, 2000, v. 11, N 1, p. 49-55.

113. R. Qi, Y. Yatomi, Y. Ozaki. Effect of incubation time, temperature and anticoagulants on platelet aggregation in whole blood. Thrombosis Res., 2001, v. 101, p. 139-144.

114. F.S. London, M. Marcinkiewicz, P.N. Walsh. A Subpopulation of Platelets Responds to Thrombin- or SFLLRN-stimulation with Binding Sites for Factor IXa. -J. Biol. Chem., 2004, v. 279, N 19, p. 19854-19859.

115. N. Moran, A. Kiernan, E. Dunne, R.J. Edwards, D.C. Shields, D. Kenny. Monitoring modulators of platelet aggregation in a microtiter plate assay. Analyt. Biochem., 2006, v. 357, p. 77-84.

116. J. Vandervoort, K. Yoncheva, A. Ludwig. Influence of the homogenization procedure on the physico-chemical properties of PLGA nanoparticles. Chem. Pharm. Bull, 2004, v. 52, N 11, p. 1273-1279.

117. Y.F. Maa, C.C. Hsu. Effect of primary emulsions on microsphere size and protein-loading in the double emulsion process. J. Microencapsulation, 1997, v. 14, p. 225-241.

118. M.A. Benoit, B. Baras, J. Gillard. Preparation and characterization of proteinloaded poly(£-caprolactone) microparticles for oral vaccine delivery. Int. J. Pharmaceut, 1999, v. 184, p. 73-84.

119. H. Sah, R. Toddywala, Y. Chien. The influence of biodegradable microcapsule formulations on the controlled release of a protein. J. Control. Release, 1994, v. 30, p. 201-211.

120. D.T. O'Hagan, H. Jeffery, S.S. Davis. The preparation and characterization of PLGA microspheres: III. Microparticle/polymer degradation rates and the in vitro release of a model protein. Int. J. Pharm, 1994, v. 103, p. 37-45.

121. X. Huang, C.S. Brazel. On the importance and mechanisms of burst release in matrix-controlled drug delivery systems. J. Control. Release, 2001, v. 73, p. 121136.

122. Chaw, CS.; Yang, YY.; Lim, IJ.; Phan, IT. Water-soluble betamethasone-loaded poly(lactide-co-glycolide) hollow microcapsules as a sustained release dosage form. J. Microencapsulation, 2001, v. 20, N 3, p. 349-359.

123. T. Tsai, R.C. Mehta, P.P. DeLuca. Adsorption of peptides to poly(D,L-lactide-co-glycolide): 2. Effect of solution properties on the adsorption. Int. J. Pharm., 1996, v. 127, p. 43-52.

124. R. Ghaderi, J. Carlfors. Biological activity of lysozyme after entrapment in poly(D,L-lactide-co-glycolide)-microspheres. Pharm. Res., 1997, v. 14, p. 1556— 1562.

125. M. van de Weert, J. Hoechstetter, W.E. Hennink, D.J. Crommelin. The effect of a water/organic solvent interface on the structural stability of lysozyme. J. Control. Release, 2000, v. 68, p. 351-359.

126. Y.M. Kwon, M. Baudys, K. Knutson, S.W. Kim. In situ study of insulin aggregation induced by water-organic solvent interface. Pharm. Res., 2001, v. 18, p. 1754-1759.

127. R.S. Raghuvanshi, S. Goyal, O. Singh, A.K. Panda, Stabilization of dichloromethane-induced protein denaturation during microencapsulation. Pharm. Dev. Technol., 1998, v. 3, p. 269-276.

128. K. Griebenow, A.M. Klibanov. On protein denaturation in aqueous-organic mixtures but not in pure organic solvents. J. Am. Chem. Soc., 1996, v. 118, p. 11695-11700.

129. C.L.Stevenson. Characterization of Protein and Peptide Stability and Solubility in Non-Aqueous Solvents. Current Pharmaceutical Biotechnology, 2000, v. 1, p. 165-182.