Изменение уровней экспрессии генов из критичных районов хромосомы 3 человека в эпителиальных опухолях разных локализаций тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Пронина, Ирина Валерьевна

• Пронина, Ирина Валерьевна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Пронина, Ирина Валерьевна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Критерии злокачественной трансформации и возникновения опухоли

1.2. Онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста

1.3. Нестабильность генома и повреждения «онкозначимых» генов в опухолях

Соматические повреждения в геноме

Эпигенетическая регуляция экспрессии генов в опухолях

1.4. Роль РНК в канцерогенезе

Альтернативный сплайсинг

Нонсенс-опосредованный распад РНК

РНК-интерференция и микроРНК

Редактирование РНК

Может ли РНК быть причиной злокачественной транформации клетки

1.5. Гены на коротком плече хромосомы 3, предположительно связанные с онкогенезом

Ген RASSF1A (3р21.3)

Ген SEMA3B (3р21.3)

Ген RHOA/ARHA (3р21.31)

Ген GPX1 (3р.21.31)

Ген RAR-beta 2 (Зр24)

Ген NKIRAS1 (Зр24.2)

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Реактивы, использованные в работе

2.2. Сбор гистологических образцов

2.3. Выделение суммарной (тотальной) РНК

2.4. Определение концентрации водного раствора суммарной

2.5. Денатурирующий электрофорез в агарозном геле

2.6. Определение содержания ДНК в препарате РНК с помощью полуколичественной ПЦР

2.7. Очистка образцов РНК от примеси ДНК

2.8. Реакция обратной транскрипции

2.9. ПЦР с продуктами реакции обратной транскрипции

2.10. Электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле

2.11. Статистическая обработка результатов 65 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Ген RASSF1A

3.2. Ген SEMA3B

3.3. Ген RHOA/ARHA

3.4. Ген GPX

3.5. Ген RAR-beta

3.6. Ген NKIRAS

3.7. Связь изменения экспрессии исследованных генов с генетическими и эпигенетическими событиями в опухолях

3.8. Сравнение экспрессии шести генов (SEMA3B, RASSF1A, RAR-beta2, GPX1, RHOA, N KIR AS) из критичных районов хромосомы

3 в эпителиальных опухолях

3.9. Корреляция изменения содержания мРНК генов RHOA и GPX1 в опухолях 121 ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ДАЛЬНЕЙШИЕ ПЕРСПЕКТИВЫ 123 ВЫВОДЫ 125 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 126 СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ а.о. - аминокислотные остатки

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ед. а. - единица активности кДНК - комплиментарная ДНК мРНК - матричная (информационная) РНК млн.п.н. - миллион пар нуклеотидов

ОП - оптическая плотность

ОТ-ПЦР - ПЦР, сопряженная с обратной транскрипцией п.н. - пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота рРНК - рибосомальная РНК

РНКаза - рибонуклеаза т.п.н. — тысяча пар нуклеотидов тРНК — транспортная РНК

Трис - Трис(гидроксиметил)аминометан

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

АР-20 - район короткого плеча хромосомы 3, перекрываемый Alu-ПЦР-клоном 20, содержащий множество генов-супрессоров опухолей

ВС - рак молочной железы (breast carcinoma)

В2М— ген бета-2-микроглобулина

СС - рак шейки матки (cervical carcinoma) сМ (сантиМорган) - единица расстояния на генетических картах, соответствующая 1% рекомбинации при мейозе dATP - 2 '-дезоксиаденозинтрифосфат dCTP - 2'-дезоксицитидинтрифосфат dGTP - 2'-дезоксигуанидинтрифосфат dTTP - 2'-дезокситимидинтрифосфат dNTP - 2'-дезоксинуклеотидтрифосфат

DMSO - диметилсульфоксид

DNMT - метилтрансфераза ДНК (DNA methyl transferase) DTT - дитиотреитол

DUTT1 - ген «отсутствующий» в линии клеток SCLC U2020 (Deleted in U Twenty Twenty)

E. coli — Escherichia coli

EOC - эпителиальные опухоли яичников (epithelial ovarian cancer)

FHIT- ген, перекрывающий участок ломкости FRA3B (Fragile Histidine Triad gene )

FISH - флуоресцентная гибридизация in situ (Fluorescence In Situ Hybridization)

FRA3B — участок ломкости на хромосоме 3 человека, В

GAPDH - глицеральдегидфосфат-дегидрогеназа (Glyceraldehyde-3 -phosphate dehydrogenase)

GIT - тест генов-супрессоров на инактивацию (Gene Inactivation Test) GPX1 - ген глутатионпероксидазы

LINE - длинный рассеянный повторяющийся элемент (long interspersed nuclear element)

LOH - потеря гетерозиготности

LUCA -район, содержащий гены -супрессоры рака легкого (lung cancer) MBP - белок, связывающийся с метилированными CpG-участками (Methyl-CpG binding protein)

МЕСАЗ -третий критичный район в области 3р21.3 (Meja Epithelial Cancer 3)

MLH1 — ген системы репарации ошибочно спаренных нуклеотидов (mut L homologue mismatch repair gene)

MST1 - ген макрофаг-стимулирующего фактора

MST1R/RON- ген рецептора MST1/MSP

NPRL2 - аналог 2 регулятора азот-пермеазы (nitrogen permease regulator like-2) NSCLC - немелкоклеточный рак легкого (non-small cell lung cancer) Зр - короткое плечо хромосомы 3 человека

RASSF1 - ген белка, содержащего домен гомологичный онкогену ras, семейства 1 (Ras association domain family 1)

CTDSPL / RBSP3 - ген малой С-концевой фосфатазы (полипептид А РНК полимеразы И); ген серин-специфичной фосфатазы на Зр, активирующей RB1 (RB1 serine phosphatase from human chromosome 3)

RHOA - член А семейства генов гомологичных Ras (Ras homolog gene family, member A)

RCC - почечноклеточный рак (renal cell carcinoma)

SAGE - серийный анализ экспрессии генов (serial analysis of gene expression)

SCLC - мелкоклеточный рак легкого (small cell lung cancer)

SCID - тяжелый комбинированный иммунодефицит (Severe Combined

Immunodeficient)

SEMA3B - ген семафорина семейства ЗВ siRNA - малая интерфирирующая РНК

SNP - одно-нуклеотидный полиморфизм (single nucleotyde polymorphism)

SSCP - одно-нитевой конформационный полиморфизм (single-strand conformation polymorphism)

STS - ДНК-маркеры с известной нуклеотидной последовательностью и единичной локализацией в геноме (sequence tagged site)

TEMED -N,N,N\N'- тетраметилэтилендиамин

TSG - ген-супрессор опухолевого роста (tumor suppressor gene)

VHL - ген синдрома фон Хиппель Линдау (von Hippel-Lindau disease gene)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изменение уровней экспрессии генов из критичных районов хромосомы 3 человека в эпителиальных опухолях разных локализаций»

За последние 15 лет наиболее перспективные методы фундаментальной онкологии адаптированы в практическую онкологию. С тех пор как было показано, что нуклеиновые кислоты, выделенные из плазмы крови, могут способствовать неинвазивной диагностике рака, с помощью молекулярно генетических методов проводится идентификация новых молекулярных мишеней, которые в конечном итоге могут быть использованы в клинике как маркеры рака.

Несмотря на значительные успехи в инструментальных методах исследования рака смертность от этого заболевания не уменьшается. Никаких реальных тестов для раннего выявления, например, рака легкого, молочной железы и почки не существует. Общепринятые опухолевые маркеры, являясь протеинами, недостаточно чувствительны, не строго специфичны и редко увеличиваются на ранних стадиях малигнизации.

В отличие от протеинов молекулы РНК и ДНК стабильны и для их выявления необходимо экстремально малое количество биологического материала. Известно, что первичный дефект при раке возникает в геномной ДНК, и одной из форм проявления этих дефектов является изменение уровня экспрессии гена, в котором произошли генетические или эпигенетические изменения, затрагивающие структуру гена, в том числе его регуляторные районы. Анализ изменения содержания мРНК и/или белка, а также статуса метилирования CpG-островков промоторных районов в специфических генах используют для раннего выявления рака, определения прогноза и предсказания терапевтического ответа.

Первые успехи в выявлении молекулярной природы рака вселили надежду на разработку новых более эффективных подходов к терапии онкологических заболеваний. Несмотря на то, что злокачественные новообразования чрезвычайно разнообразны и гетерогенны, в их основе находится относительно небольшое количество критических событий, одновременное проявление которых требуется для малигнизации. Необходимо определить и понять молекулярную анатомию основных этапов опухолевого патогенеза и разработать терапевтические схемы, направленные на элиминацию этих этапов.

Значительный прогресс в понимании механизмов канцерогенеза связан с открытием сначала онкогенов (и протонкогенов), а затем - антионкогенов или генов-супрессоров опухолевого роста. Онкогены активируются в опухолях по доминантному механизму и стимулируют развитие опухоли. Гены-супрессоры инактивируются в опухолях по рецессивному типу с повреждением обоих родительских аллелей.

В случае сохранности некоторых критичных генов-супрессоров (например, гена р53) в клетке, подверженной неопластическим изменениям, эти гены могут вызвать остановку клеточного цикла или ее программируемую смерть (апоптоз), и таким образом, остановить или замедлить опухолевый рост (Чумаков, 1998, 2000). Гены, подавляющие опухолевый рост, могут также участвовать в подавлении неоангиогенеза, инвазии и метастазирования, в регуляции теломеразной системы. Некоторые из них прямо или опосредованно участвуют в репарации мутаций, например, тот же р53 задерживает клеточный цикл до исправления нарушений с помощью белков системы репарации.

Последнее десятилетие характеризуется открытием многих новых онкозначимых генов. Определение нуклеотидной последовательности генома человека и создание общедоступных баз данных обеспечили мощный подъем онкогеномики и протеомики. Согласно данным GenBank, в настоящее время известно более сотни потенциальных онкогенов (клеточных и вирусных), несколько десятков генов-супрессоров и более 300 потенциальных супрессоров, расположенных на разных хромосомах человека. Следует отметить, что принятое разделение на онкогены и гены, подавляющие опухолевый рост, достаточно условно, поскольку с появлением новых методов и подходов наши представления о роли тех или иных генов и их взаимосвязи могут значительно меняться.

Несмотря на значительные успехи в идентификации генов, участвующих в злокачественной трансформации клетки и в ее подавлении, мы еще далеки от понимания взаимодействия между этими генами и их белковыми продуктами. Информация о генах, причинно связанных с онкогенезом или анти-онкогенезом, вносит важный вклад в понимание молекулярных процессов, протекающих при опухолеобразовании. Кроме того, наборы ключевых онкозначимых генов находят применение в качестве маркеров для диагностики опухолей, прогноза рецидивов и мониторинга терапии в клинике (Зборовская, 2000; Лихтенштейн и Потапова, 2003; Белохвостое и Румянцев, 2003а,б).

В представленной работе исследовано изменение экспрессии шести генов из критичных районов короткого плеча хромосомы 3 человека в эпителиальных опухолях разных локализаций: в опухолях легкого, почки, молочной железы, яичников и толстой кишки. Опухоли этих локализаций, как известно, широко распространены и характеризуются высокой частотой летальных исходов, которая составляет более половины от общего числа неблагоприятных исходов при онкологических заболеваниях. В работе показана связь изменения экспрессии некоторых генов с началом онкогенеза и с прогрессией онкологических заболеваний. Построены профили экспрессии ряда генов хромосомы 3, специфичные для опухолей пяти локализаций. Определена степень влияния метилирования и делеций/амплификаций на регуляцию уровня мРНК и выявлена взиамосвязь изменений экспрессии некоторых генов в опухолях.

Целью данного исследования является изучение экспрессии генов, эпигенетически и генетически измененных в эпителиальных опухолях, ранее обнаруженных при сканировании короткого плеча хромосомы 3 человека с помощью картирования аллельных дисбалансов и технологии Notl-микропанелей и изученных нами на уровне ДНК.

В результате исследования ожидается выявление новых маркеров опухолевого роста, применимых для ранней диагностики онкологических заболеваний и прогноза течения заболевания.

В обзоре литературы освещены современные представления о роли генов-супрессоров опухолевого роста и онкогенов в малигнизации клеток, рассмотрены генетические и эпигенетические факторы, нарушающие активность генов в опухолях, приведены литературные данные по локализации критичных районов на хромосоме 3 и по характеристике структурной организации и функций группы генов из этих районов, исследованию экспрессии которых посвящена данная работа.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Пронина, Ирина Валерьевна

выводы

1. Установлены опухоль-специфичные изменения экспрессии шести генов хромосомы 3: RASSF1A, SEMA3B, RAR-beta2, RHOA, GPX1, NKIRAS1 - при немелкоклеточном раке легкого, светлоклеточном раке почки и инфильтративно-протоковом раке молочной железы.

2. При немелкоклеточном раке легкого показано повышение количества мРНК в 5-1000 раз с достоверно высокой частотой для генов RHOA (в 80% случаев), GPX1 (73%), RAR-beta2 (63%) и NKIRAS1 (63%).

3. При светлоклеточном раке почки установлено достоверно частое снижение экспрессии генов SEMA3B (54%) и NKIRAS1 (62%) и достоверно частое повышение экспрессии гена RASSF1A (68%).

4. При раке молочной железы показано частое увеличение содержание мРНК генов RHOA (64%), GPXJ (51%) и NKIRASJ (51%).

5. Установлена корреляция изменения содержания мРНК генов RHOA и GPX1 при немелкоклеточном раке легкого и раке молочной железы.

6. С учетом клинико-гистологических данных образцов опухолей выявлены ассоциации изменения экспрессии генов со стадией и прогрессией рака. Полученные данные могут быть использованы для диагностики и прогноза течения онкозаболеваний.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. И.В. Пронина, В.И. Логинов, B.C. Прасолов, Е.А. Климов, Д.С. Ходырев, Т.П. Казубская, Р.Ф. Гарькавцева, Т.Е. Сулимова, Э.А. Брага Изменение уровня экспрессии гена SEMA3B в эпителиальных опухолях. Молекулярная биология, 43, №3: 439-445.

2. В.И. Логинов, Д.С. Ходырев, И.В. Пронина, А.В. Малюкова, Т.П. Казубская, В.Д. Ермилова, Р.Ф. Гарькавцева, Е.Р. Забаровский, Э.А. Брага Два CpG-островка гена SEMA3B: метилирование при светлокпеточном раке почки. Молекулярная биология, 43, №6: 1088-1092.

3. В.И. Логинов, Д.С. Ходырев, И.В. Пронина, Т.П. Казубская, В.Д. Ермилова, Р.Ф. Гарькавцева, Э.А. Брага Метилирование промоторной области гена RASSF1A и частота аллельных дисбалансов в критичных районах хромосомы 3 коррелируют с прогрессией светлоклеточного рака почки. Молекулярная биология, 2009,43, №3:429-438.

4. Т.В. Павлова, В.И. Кашуба, О.В. Муравенко, S.P. Yenamandra, Т.А. Иванова, В.И. Забаровская, Э.Р. Рахманалиев, Л.А. Петренко, И.В. Пронина, В.И. Логинов, О.Ю. Юркевич, Л.Л. Киселев, А.В. Зеленин, Е.Р. Забаровский Технология анализа эпигенетических и структурных изменений хромосомы 3 человека. Молекулярная биология, 2009, 43, №2: 339-347.

5. Д.С. Ходырев, В.И. Логинов, И.В. Пронина, Т.П. Казубская, Р.Ф. Гарькавцева, Э.А. Брага Метилирование промоторной области гена RAR-beta2 в опухолях почки, молочной железы и яичников. Генетика, 2008, 44, №8: 1126-1132.

6. В.И. Логинов, И.В. Базов, Д.С. Ходырев, И.В.Пронина, Т.П. Казубская, В.Д. Ермилова, Р.Ф. Гарькавцева, Е.Р. Забаровский, Э.А. Брага Районы потенциальных генов-супрессоров эпителиальных опухолей почки, молочной железы и яичников на хромосоме 3 человека. Генетика, 2008, 44, №2: 250-256.

7. Э.А. Брага, В.И. Логинов, Е.А. Климов, Г. Килосанидзе, Д.С. Ходырев, Н.Л. Каганова, Т.П. Казубская, В.Д. Ермилова, Р.Ф. Гарькавцева, И.В. Пронина, О.И. Рудько, Е.Р. Забаровский, Г.Е. Сулимова, Л.Л. Киселев Активация транскрипции гена RHOA в эпителиальных опухолях может быть вызвана умножением копий гена и/или деметилированием его промоторной области. Молекулярная биология, 2006, 40, №5: 865-877.

8. А.В. Малюкова, В.И. Логинов, Д.С. Ходырев, E.JI. Кадырова, И.В. Пронина, Т.А. Иванова, Ф.Л. Киселев, Е.Р. Забаровский, Н.П. Киселева, Э.А. Брага Метилирование предполагаемого гена-супрессора RASSF1A в опухолях шейки матки. Молекулярная биология. 2004, 38, №6: 1005-1013.

9. И.В. Пронина, Д.С. Ходырев Анализ изменения экспрессии генов SEMA3B и RHOA в эпителиальных опухолях человека. Материалы XVI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Москва, Апрель, 2009. Секция «Фундаментальная медицина», стр. 30-31.

10. Д.С. Ходырев, В.И. Логинов, И.В. Пронина, О.Г. Губина, Р.Ф. Гарькавцева, Э.А. Брага Анализ метилирования промоторных областей генов RAR-beta2 и SEMA3B для диагностики и прогноза эпителиальных опухолей почки, молочной железы и яичников. Материалы V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 2008, стр. 456.

11. В.И. Логинов, Д.С. Ходырев, И.В. Пронина, О.Г. Губина, Р.Ф. Гарькавцева, Э.А. Брага Анализ метилирования промоторных областей генов RAR-beta2 и SEMA3B для диагностики и прогноза эпителиальных опухолей почки, молочной железы и яичников. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, Май, 2008, стр. 230.

12. Г.И. Разумнова, Н.Л. Каганова, В.И. Логинов, Д.С. Ходырев, И.В. Пронина, Э.А. Брага, Е.А. Климов Оценка экспрессии генов RHOA и СКАР2 человека в норме и при онкозаболеваниях. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, Май, 2008, стр. 108.

13. Д.С. Ходырев, В.И. Логинов, Е.А. Климов, И.В. Пронина, О.Г. Губина, Т.П. Казубская, Р.Ф. Гарькавцева, Г.Е. Сулимова, Е.Р. Забаровский, Э.А. Брага Метилирование промоторной области гена SEMA3B при почечнокеточном раке. Материалы 4-й Российской конференции по фундаментальной онкологии "Петровские Чтения", Санкт-Петербург, Апрель, 2008, //«Вопросы Онкологии» 2008,т.54,№2: стр.31.

14. Д.С. Ходырев, В.И. Логинов, И.В. Пронина, О.Г. Губина, Т.П. Казубская, Р.Ф. Гарькавцева, Э.А. Брага Метилирование промоторной области гена RAR-beta2 в опухолях почки, молочной железы и яичников. Материалы 4-й Российской конференции по фундаментальной онкологии "Петровские Чтения", Санкт-Петербург, Апрель, 2008, // «Вопросы Онкологии» 2008, т. 54, № 2: стр. 31. (стенд)

15. И.В. Пронина, В.И. Логинов, Д.С. Ходырев, Р.Ф. Гарькавцева, Э.А. Брага Связь метилирования CpG-островка промоторного района гена SEMA3B с прогрессией эпителиальных опухолей. Материалы докладов на "11-й Пущинской школе - конференции молодых ученых", Пущино, Ноябрь, 2007, стр.108, (стенд)

16. В.И. Логинов, И.В. Пронина, Д.С. Ходырев, О.Г. Губина, Р.Ф. Гарькавцева, Е.Р. Забаровский, Э.А. Брага Метилирование промоторного района гена USP4 в эпителиальных опухолях разных локализаций. Материалы докладов на "11-й Пущинской школе - конференции молодых ученых", Пущино, Ноябрь, 2007, стр.98.

17. I.V. Pronina, D.S. Hodyrev, N.L. Kaganova, E.A. Klimov, G. Kilosanidze, E.R. Zabarovsky, W.I. Loginov, G.E. Sulimova, E.A. Braga Activation of RHOA transcription in epithelial tumors may be caused by gene amplification or demethylation of the promoter region. Abstract book: Conference for young scientists, PhD students and students of molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of M.I. Vavilov. Kyiv, Ukraine, 2007, 20-22 September, (стенд)

18. Д.С. Ходырев, В.И. Логинов, И.В. Пронина, В.Д. Ермилова, Т.ГТ. Казубская, Р.Ф. Гарькавцева, Е.Р. Забаровский, Л.Л. Киселев и Э.А. Брага. Роль метилирования промоторных районов генов хромосомы 3 в эпителиальных опухолях человека. Материалы 3-ей Российской конференции по фундаментальной онкологии "Петровские Чтения", Санкт-Петербург, Апрель, 2007, // «Вопросы Онкологии» 2007, т. 53, № 1: стр. 27-28.

19. И.В. Пронина, В.И. Логинов, Т.А. Иванова, Т. Павлова, Д. Сараев, Р.ф. Гарькавцева, О.В. Муравенко, Э.А. Брага, А.В. Зеленин, Л.Л. Киселев, В.И. Кашуба, Е.Р. Забаровский. Поиск новых онкозначимых генов с использованием NotI микропанелей и Notl-репрезентативных проб. Материалы 3-ей Российской конференции по фундаментальной онкологии "Петровские Чтения", Санкт

Петербург, Апрель, 2007, // «Вопросы Онкологии» 2007, т. 53, № 1: стр. 21. (доклад)

20. И.В.Пронина, Д.С. Ходырев, H.JL Каганова, Е.А.Климов, Г. Килосанидзе, Р.Ф. Гарькавцева, Е.Р. Забаровский, Л.Л.Киселев, В.И. Логинов, Г.Е. Сулимова, Э.А. Брага. Активация транскрипции протоонкогена RHOA может быть вызвана умножением копий гена и/или деметилированием его промоторной области. Материалы 3-ей Российской конференции по фундаментальной онкологии "Петровские Чтения", Санкт-Петербург, Апрель, 2007, // «Вопросы Онкологии» 2007, т. 53, № 1: стр. 21

21. Д.С. Ходырев, В.И. Логинов, И.В. Пронина, Е.А. Климов, Н.Л. Каганова, Р.Ф. Гарькавцева, Г.Е. Сулимова, Э.А. Брага. Изменение копийности и метилирования промоторного района протоонкогена RHOA в эпителиальных опухолях. Материалы докладов на международной конференции "Генетика в России и мире", Москва Июль, 2006, стр. 209.

22. И.В. Пронина, В.И. Логинов, Т.А. Иванова, Т. Павлова, Д. Сараев, Р.Ф. Гарькавцева, О.В. Муравенко, Э.А. Брага, А.В. Зеленин, Л.Л. Киселев, В.И. Кашуба, Е.Р. Забаровский. Notl-микропанели и Notl-репрезентативные пробы для скрининга онкозначимых генов. Материалы докладов на международной конференции "Генетика в России и мире", Москва, Июль, 2006, стр. 160. (доклад)

23. E.R. Zabarovsky, Т. Pavlova, Т. Ivanova, L. Petrenko, Е. Rakhmanaliev, О. Muravenko, I. Pronina, W. Loginov, D. Saraev, S.P. Yenamandra, V. Senchenko, V. Zabarovska, E. Braga, I. Skrypkina, A. Rynditch, E. Grigorieva, N. Kiseljova, F.L. Kiseljov, L.L. Kisselev, G. Klein, V. Kashuba, A.V. Zelenin Epigenetic analysis of cancer cells using NotI microarrays. Abstracts of Human Genome Meeting, 2006 (HGM2006), Helsinki, Finland, May 31 - June 3, 2006, page 215.

24. W. Loginov, E. Klimov, I. Pronina, D. Hodirev, G. Kilosanidze, A. Malyukova, R.F. Garkavtseva, G.E. Sulimova, E.R. Zabarovsky, E.A. Braga Expression and methylation analysis of some chromosome 3p "hot spots" genes in epithelial tumors. 31th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies, Istanbul, Turkey, October 2005, FEBSJ., 2005, 269: 126, A4-034P.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ДАЛЬНЕЙШИЕ ПЕРСПЕКТИВЫ

В настоящее время накоплено много экспериментальных данных о роли эпигенетических модификаций ДНК и гистонов в неоплазиях у человека. Сотни работ посвящены определению профилей метилирования генов при разнообразных видах рака и так называемых «ДНК гиперметилом» (см. обзор Esteller, 2007). Все эти работы вносят важный вклад в фундаментальную биологию и практическую онкологию, поскольку их результаты находят применение и для ранней диагностики опухолей, и для прогноза, и в так называемой «таргетной терапии» некоторых видов рака.

Однако в этих работах проводили анализ метилирования генов как маркеров опухолей, и не было уделено должное внимание связи метилирования с изменением экспрессии этих генов в опухолях. Как правило, такие исследования ограничивались анализом уровня мРНК опухоль-супрессорных генов в клеточных линиях рака, в которых действительно наблюдали частую потерю мРНК гена супрессора, которая в большинстве клеточных линий была ассоциирована с метилированием. (См. например, Dreijerink et al., 2001; Tomizawa et al, 2001; Kuroki et al, 2003; и в обзорах: Angeloni et al, 2007; Hesson et al, 2007). Однако и при анализе клеточных линий рака выявлялись случаи метилирования гена без снижения экспрессии (например, Dreijerink et al., 2001).

При анализе экспрессии группы опухоль ассоциированных генов хромосомы 3 на представительных выборках образцов первичных опухолей нами установлено, что снижение уровня мРНК ассоциировано с метилированием + делеции в 30-60% случаев и именно с метилированием - в среднем прибл. в 25% случаев. Более того, нами установлено, что в определенных видах рака такие типичные онкосупрессоры как RASSF1A (при ПКР) и RAR-beta2 (при НМКРЛ) не снижают, а с высокой частотой (68% и 63%, соотв.) повышают уровень мРНК.

На основании наших результатов о частом повышении экспрессии типичных онкосупрессоров RASSF1A и RAR-beta2 при некоторых видах рака, нами предложена гипотеза о том, что мутации в одном из аллелей гена-супрессора превращают его из супрессора опухолевого роста в активный онкоген с повышенной экспрессией, что способствует дальнейшему развитию рака. В пользу такой концепции свидетельствуют также данные по преобразованию онкосупрессора р53 в онкоген (Чумаков, 2007; Masuda et al., 2009) и выявленная в опухолях высокая частота мутаций в генах RASSF1A и RBSP3, ассоциированная с повышенной экспрессией этих генов (Kashuba et al., 2004, 2009). Однако, такие предположения требуют дальнейших исследований.

Можно отметить, что в последнее десятилетие научное сообщество уделяет существенно большее внимание анализу эпигенетических изменений ДНК при онкогенезе (чему посвящены сотни публикаций), чем исследованию экспрессии генов, которое отражает функциональное состояние гена. Так, например, в отношении HMPJ1 за 2004-2009 гг. опубликовано более 30 работ, посвященных анализу профилей метилирования генов и формированию систем маркеров на основе данных по метилированию. В базах данных содержится в 2-3 раза меньше публикаций по определению профилей экспрессии при этом виде рака. Причем, эти работы большей частью основаны на применении микропанелей, например, Boelens et al., 2009; Larsen et al., 2007; Taniwaki et al., 2006. Стало общепринятым мнение, что эпигенетические изменения строго отражают изменение экспрессии гена и более удобны в качестве молекулярных маркеров опухолей. Проведенное в нашей лаборатории комплексное исследование профилей изменения экспрессии и профилей изменения метилирования для шести генов при трех видах рака показало, что изменения содержания мРНК более однозначны и наблюдаются с более высокой частотой (до 80% и более), чем изменения метилирования этих же генов (включая известные гены-супрессоры: RASSF1A, RAR-beta2, SEMA3B). На основании полученных нами данных можно заключить, что анализ изменений содержания мРНК не менее, а более перспективен для диагностики и прогноза опухолей, чем анализ метилирования опухоль ассоциированных генов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Пронина, Ирина Валерьевна, 2010 год

1. Абелев Г. И., Эрайзер Т. JI. На пути к пониманию природы рака. Обзор. Биохимия, 2008, 73(5),605-618.

2. Белохвостов А.С., Румянцев А.Г. Онкомаркеры. Требования к онкомаркерам и области применения трех типов онкомаркеров. Москва, 2003а, 6-7.

3. Белохвостов А.С., Румянцев А.Г. Онкомаркеры. Молекулярно-генетические онкомаркеры и методы их определения. Москва, 20036, 7-42.

4. Брага Э. А., Кашуба В. И., Малюкова А. В. и др. Новые гены-супрессоры опухолевого роста в горячих точках хромосомы 3 человека: новые методы идентификации. Молекулярная биология. 2003, 37(2), 194-211.

5. Брага Э. А., Киселев JI. JL, Забаровский Е. Р. От идентификации геномного полиморфизма к диагностическим и прогностическим маркерам эпителиальных опухолей человека. Молекулярная биология. 2004, 38(2), 179-190

6. Ванюшин Б.Ф. Метилирование ДНК и эпигенетика. Генетика, 2006, 42(9), 1186— 1199.

7. Немцова М.В., Залетаев Д.В., Стрельников В.В., Бабенко О.В., Васильев Е.В., Землякова В.В., Жевлова А.И., Дрозд О.В. Диагностика эпигенетической патологии при наследственных и онкологических заболеваниях. Молекулярная биология, 2004, 38(2), 213-223

8. Зборовская И.Б. 2000. Молекулярно-биологические исследования онкогенов и генов-супрессоров опухолевого роста в клинической практике. Сборник обзорных статей «Канцерогенез», под ред. Д.Г. Заридзе. М.: Научн. Мир, 361-379.

9. Киселев JI. JL, Сенченко В. Н., Опарина Н. Ю. и др. Гены-супрессоры опухолевого роста, локализованные на коротком плече хромосомы 3 человека. Молекулярная медицина. 2005, 3, 17-28.

10. Киселев ФЛ. Гены стабилизации ДНК и канцерогенез. Молекулярная биология, 1998, 32, 197-205.

11. Киселева Н.П., Киселев Ф.Л. Деметилирование ДНК и канцерогенез (обзор) Биохимия, 2005, 70, 900-912.

12. Кленов М.С., Гвоздев В.А. Биохимия, 2005, 70, 1445-1458.

13. Копнин Б.П. 2000.0пухолевые супрессоры и мутаторные гены. Сборник обзорных статей «Канцерогенез», под ред. Д.Г. Заридзе, М: Научн. мир, стр. 75-92.

14. Лихтенштейн А.В., Потапова Г.И. Генетические дефекты как маркеры опухолевого роста. Молекулярная биология, 2003, 37, 181-193.

15. Пронина И.В., Логинов В.И., Прасолов B.C., Климов Е.А., Ходырев Д.С., Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф., Сулимова Г.Е., Брага Э.А. Изменение уровней экспрессии гена SEMA3B в эпителиальных опухолях. Молекулярная биология. 2009, 43(3), 429-435.

16. Пфайфер Г.П., Дамманн Р. Метилирование гена опухолевого супрессора RASSFIA в человеческих опухолях. Биохимия. 2005, 70(5), 699-708.

17. Рогаев Е.И., Боринская С.А., Исламгулов Д.В., Григоренко А.П. МикроРНК человека в норме и патологии. 2008, Молекулярная биология, 42(5), 751-764.

18. Ровенский Ю.А. и Васильев Ю.М. Морфогенетические реакции клеток и их нарушения при опухолевой трансформации. 2000. Сборник обзорных статей «Канцерогенез», под ред. Д.Г. Заридзе, М: Научн. Мир, стр. 260-283.

19. Рязанский С.С., Гвоздев В.А. Короткие РНК и канцерогенез. 2008, Биохимия, 73(5), 640-655

20. Татосян А.Г. 2000. Онкогены. Сборник обзорных статей «Канцерогенез», под ред. Д.Г. Заридзе, М: Научн. Мир, стр. 57-74.

21. Чумаков П.М. Роль р53 в программируемой клеточной смерти. Изв. Акад. Наук, сер. Биология, 1998, 2, 151-156.

22. Чумаков П.М. Функция генар53: выбор между жизнью и смертью. Биохимия, 2000, 65, 28-40.

23. Allis C.D., Junewein Т., Reinberg D., Capparos M.L. Epigenetics, 2006, CSHL Press, N.Y.

24. Alvarez-Garcia I., Miska E.A., MicroRNA functions in animal development and human disease, Development 132. 2005, 4653-4662.

25. Angeloni D., Ter Elst A., Wei M. H. et al. Analysis of a new homozygous deletion in the tumor suppressor region at 3pl2.3 reveals two novel intronic noncoding RNA genes. Genes Chromosomes Cancer. 2006, 45(7), 676-691.

26. Apicelli AJ, Uhlmann EJ, Baldwin RL, Ding H, Nagy A, Guha A, Gutmann DH. Role of the Rapl GTPase in astrocyte growth regulation. Glia, 2003, 42, 225-234.

27. Assoian RK. Stopping and going with p27kipl. Dev Cell., 2004, 6(4), 458-459.

28. Attwood JT, Yung RL, Richardson ВС. DNA methylation and the regulation of gene transcription. Cell Mol Life Sci., 2002, 59, 241-257.

29. Avraham H., Weinberg R.A. 1989. Characterization and expression of the human rhoH12 gene product. Mol. Cell Biol., 9, 2058-2066.

30. Bartel D.P. Cell, 2004, 116, 281-297

31. Bateman A., Birney E., Durbin R., Eddy S.R., Finn R.D. and Sonnhammer E.L. Pfam 1313 multiple alignments and profile HMMs match the majority of proteins. Nucleic Acids Res., 1999,27,260-262.

32. Batinac T, Gruber F, Lipozencic J, Zamolo-Koncar G, Stasic A, Brajac I. Protein p53 -Structure, Function, and Possible Therapeutic Implications. Acta Dermatovenerol Croat., 2003, 11, 225-230.

33. Bartkova J., Horejsi Z., Koed K., Kramer A., Tort F., Zieger K., et al., DNA damage response as a candidate anti-cancer barrier in early human tumorigenesis. Nature. 2005, 434, 864-870.

34. Baylin SB. Mechanisms underlying epigenetically mediated gene silencing in cancer. Semin Cancer Biol. 2002, 12, 331-337.

35. Baylin SB, Herman JG, Graf JR, Vertino PM, Issa JP. Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect of neoplasia. Adv. Cancer Res., 1998, 72, 141-196.

36. Bell DR, Van Zant G. Stem cells, aging, and cancer: inevitabilities and outcomes. Oncogene. 2004, 23(43), 7290-7296.

37. Benezra M, Chevallier N, Morrison DJ, MacLachlan TK, El-Deiry WS, Licht JD. BRCA1 augments transcription by the NF-kappaB transcription factor by binding to the Rel domain of the p65/RelA subunit. J. Biol. Chem., 2003, 278, 26333-26341.

38. Berezikov E., Plasterk R.H., Camels and zebrafish, viruses and cancer: a microRNA update. Hum. Mol. Genet. 2005,14, R183-R190.

39. Bjerkvig R, Tysnes BB, Aboody KS, Najbauer J, Terzis AJ. Opinion: the origin of the cancer stem cell: current controversies and new insights. Nat Rev Cancer. 2005, 5(11), 899-904.

40. Bird AP. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev., 2002, 16, 6-21. Bird A. Nature, 2007, 447, 396-398.

41. Bommer G.T., Gerin I., Feng Y., Kaczorowski A.J., Kuick R., Love R.E., Zhai Y., Giordano T.J. Qin Z.S., Moore B.B., Macdougald O.A. Cho K.R. and Fearon E.R. Curr.Biol., 2007, 17, 1298-1307.

42. Boudeau J, Sapkota G, Alessi DR. LKB1, a protein kinase regulating cell proliferation and polarity. FEBSLett., 2003, 546, 159-65.

43. Cahill D.P., Kinzler K.W., Vogelstein В., Lengauer C. Genetic instability and darwinian selection in tumours. Trends Cell Biol. 1999 9, M57-M60.

44. Calin G.A., Ferracin M., Cimmino A. MicroRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia. N.Engl. J.Med. 2005, 353, 1793-1801.

45. Castro-Rivera E., Ran S., Thorpe P., Minna J.D. Semaphorin 3B {SEMA3B) induces apoptosis in lung and breast cancer, whereas VEGF 165 antagonizes this effect. Proc Natl Acad Sci USA, 2004,101, 11432-11437.

46. Chambon P.A. Decade of molecular biology of retinoic acid receptors. FASEB J., 1996. 10, 940-954.

47. Chang T.C., Wentzel E.A., Kent O.A. Transactivation of miR-34a by p53 broadly influences gene expression and promotes apoptosis. Mol.Cell, 2007, 26, 745-752.

48. Chen Y., Vallee S., Wu J., et al. Inhibition of NF-kappaB activity by IkappaBbeta in association with kappaB-Ras. Mol. Cell. Biol., 2004, 24, 3048-3056.

49. Chen S, Paul P, Price BD. ATM's leucine-rich domain and adjacent sequences are essential for ATM to regulate the DNA damage response. Oncogene, 2003, 22, 63326339.

50. Chen C.Z., Lodish H.F. MicroRNAs as regulators of mammalian hematopoiesis. Semin. Immunol. 2005,17, 155-165.

51. Cheng A.M., Byrom M.W., Shelton J., Ford L.P. Antisense inhibition of human miRNAs and indications for an involvement of miRNA in cell growth and apoptosis. Nucleic Acids Res. 2005, 33, 1290-1297.

52. Choi C.H., Lee K.-M., Choi J.J. et al. Hypermethylation and loss of heterozygosity of tumor suppressor genes on chromosome 3p in cervical cancer. Cancer Letters, 2007, 255, 26-33.

53. Chou C.H., Lee K.-M., Choi J.J., Kim T.-J., Kim W.Y., Lee J.-W., Lee S.-J., Lee J.-H., Bae D.-S., Kim B.-G. Hypermethylation and loss of heterozygosity of tumor supressor genes on chromosome 3p in cervical cancer. Cancer Lett., 2007 255, 26-33.

54. Comoglio PM, Trusolino L. Invasive growth: from development to metastasis. J Clin Invest. 2002 109, 857-862. (Review)

55. Conover W.J. (1980). Practical Nonparametric Statistics. 2nd. ed. New York: Wiley

56. Corral T, Jimenez M, Hernandez-Munoz I, Perez de Castro I, Pellicer A. NF1 modulates the effects of Ras oncogenes: evidence of other NF1 function besides its GAP activity. J. Cell Physiol., 2003,197, 214-24.

57. Costello JF, Plass C. Methylation matters. J. Med. Genet., 2001, 38, 285-303.

58. Cote S., Sinnett D., Momparler R.L. Demethylation by 5-aza-2-deoxycytidine of specific 5-methylcytosine sites in the promoter region of the retinoic acid receptor beta gene in human colon carcinoma cells. Anticancer Drugs., 1998, 9, 743-50.

59. Dammann R., Li C., Yoon J.H., Chin P.L., Bates S. and Pfeifer G.P. Epigenetic inactivation of a RAS association domain family protein from the lung tumour suppressor locus 3p21.3. Nat Genet., 2000, 25, 315-319.

60. Das P.M. and Singal R. DNA methylation and cancer. J. Clin. Oncol. 2004, 22, 46324642.

61. Dasgupta B, Dugan LL, Gutmann DH. The neurofibromatosis 1 gene product neuroflbromin regulates pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-mediated signaling in astrocytes. JNeurosci., 2003, 23, 8949-8954.

62. Dikovskaya D, Zumbrunn J, Penman GA, Nathke IS. The adenomatous polyposis coli protein: in the limelight out at the edge. Trends Cell Biol., 2001, 11, 378-384

63. Diwadkar-Navsariwala V, Diamond AM. The link between selenium and. chemoprevention: a case for selenoproteins. J. Nutr., 2004, 134, 2899-2902.

64. Dodge JE, List AF, Futscher BW. Selective variegated methylation of the pl5 CpQ-island in acute myeloid leukemia. Int. J. Cancer, 1998, 78, 561-567.

65. Dowsett M., Daffada A., Chan C.M., Johnston S.R. Oestrogen receptor mutants and variants in breast cancer. Eur. J. Cancer, 1997, 33, 1177-1183.

66. Eden A. Chromosomal instability and tumors promoted by DNA hypomethylation. Science, 2003, 18, 300:455

67. Esquuela-Kerscher A. and Slack F.J. Nat.Rev.Cancer, 2006, 6, 259-269

68. Esteller M. Epigenetic gene silencing in cancer: the DNA hypermethylome. Hum Mol Genet., 2007,16(Spec No 1), R50-59.

69. Esteller M., Herman J.G. Cancer as an epigenetic disease: DNA methylation and chromatin alterations in human tumours. J Pathol., 2002, 196, 1-7.

70. Etienne-Manneville S., Hall A. Rho GTPases in cell biology. Nature, 2002, 420, 629-. 635.

71. Evan GI, Vousden KH. Proliferation, cell cycle and apoptosis in cancer. Nature, 2001 411, 342-348

72. Faucher K., Rabinovitch-Chable H., Barriere G., Cook-Moreau J., Rigaud lyj Overexpression of cytosolic glutathione peroxidase (GPX1) delays endothelial cell growth and increases resistance to toxic challenges. Biochimie, 2003, 85, 611-617.

73. Feinberg AP. Imprinting of a genomic domain of 1 lpl5 and loss of imprinting in cancer; an introduction. Cancer Res., 1999, 59, 1743-1746.

74. Feinberg AP, Oshimura M, Barrett JC. Epigenetic mechanisms in human disease. Cancer Res., 2002, 62(22), 6784-6787.

75. Fenwick C., Na S.Y., Voll R.E. A subclass of Ras proteins that regulate the degradation of IkappaB. Science, 2000, 287, 869-873.

76. Fernandez H.R. Heterochromatin: on the ADAR radar? Curr. Biol., 2005, 15, R132-R134.

77. Fritz G., Brachetti C., Bahlmann F., Schmidt M., Kaina B. Rho GTPases in human breast tumours: expression and mutation analyses and correlation with clinical parameters. Br. J. Cancer, 2002, 87, 635-644.

78. Fritz G., Just I., Kaina B. Rho GTPases are over-expressed in human tumors. Int. J. Cancer, 1999,819,682-687.

79. Fukuhara N., Ebert J., Unterholzner L., Lindner D., Izaurralde E., Conti E. SMG7 is a 14-3-3-like adaptor in the nonsense-mediated mRNA decay pathway. Mol. Cell, 2005, 17, 537-547.

80. Garcia P., Manterola C., Araya J.C., Villaseca M., Guzman P., Sanhueza A., Thomas M., Alvarez H., Roa J.C. Mol Carcinog., 2009, 48(1), 79-89.

81. Gehring N.H., Kunz J.B., Neu-Yilik G., Breit S., Viegas M.H., Hentze M.W., Kulozik A.E. Exon-junction complex components specify distinct routes of nonsense-mediated mRNA decay with differential cofactor requirements. Mol. Cell, 2005, 20, 65-75.

82. Gerber A.P., Keller W. RNA editing by base deamination: more enzymes, more targets, new mysteries. Trends Biochem. Sci., 2001, 26, 376-384.

83. Glenn ST, Jones CA, Liang P, Kaushik D, Gross KW, Kim HL. Expression profiling of archival renal tumors by quantitative PCR to validate prognostic markers. Biotechniques. 2007, 43(5), 639-640.

84. Green D.R. Apoptotic pathways: the roads to ruin. Cell, 1998, 94, 695-698 (Review).

85. Green D.R. Apoptotic pathways: paper wraps stone blunts scissors. Cell, 2000 102, 1-4. (Review).

86. Green R.E., Lewis B.P., Hillman R.T., Blanchette M., Lareau L.F., Garnett A.T. et al. Widespread predicted nonsense-mediated mRNA decay of alternatively-spliced transcripts of human normal and disease genes. Bioinformatics, 2003, 19, il 184121.

87. Greider C.W. Telomerase activity, cell proliferation, and cancer. Proc.Natl.Acad. Sci. USA, 1998, 95, 90-92 (Review).

88. Hall A. Rho GTPases and the actin cytoskeleton. Science, 1998, 279, 509-514.

89. Hanahan D, Weinberg R.A. Rules for making human tumor cells. N. Engl. J. Med. 2002, 347, 1593-1603. (Review)

90. Hanahan D., Weinberg R.A. The hallmarks of cancer. Cell, 2000, 100, 57-70 (Review).

91. Hansen S, Lane DP, Midgley CA. The N terminus of the murine p53 tumour suppressor is an independent regulatory domain affecting activation and thermostability. J Mol Biol., 1998, 275, 575-588.

92. Hasegawa Y., Takano Т., Miyauchi A., Matsuzuka F., Yoshida H., Kuma K., Amino N. Decreased expression of glutathione peroxidase mRNA in thyroid anaplastic carcinoma. Cancer Lett., 2002,182, 69-74.

93. He L., He X., Lim L.P. A microRNA component of the p53 tumor suppressor network. Nature, 2007, 447, 1130-1134.

94. Hesson L.B., Cooper W.N., LatifF. 2007. Evaluation of the 3p21.3 tumour-suppressor gene cluster. Oncogene, 26, 7283-7301.

95. Hirohashi S, Kanai Y. Cell adhesion system and human cancer morphogenesis. Cancer Sci., 2003, 94, 575-581. (Review)

96. Holbrook J.A, Neu-Yilik G, Hentze M. W, Kulozik A.E. Nonsense-mediated decay approaches the clinic Nat. Genet., 2004, 36, 801-808.

97. Homma MK, Li D, Krebs EG, Yuasa Y, Homma Y. Association and regulation of casein kinase 2 activity by adenomatous polyposis coli protein. Proc Natl Acad Sci USA., 2002, 99, 5959-64.

98. Hong W.K., Lippman S.M., Hittelmann W.N. and Lotan R. Retinoid chemoprevention of aerodigestive cancer:From basic research to the clinic. Clin. Cancer Res., 1995, 1, 677686.

99. Horiuchi A., Imai Т., Wang C., Ohira S., Feng Y., Nikaido Т., Konishi I. Up-regulation of small GTPases, RhoA and RhoC, is associated with tumor progression in ovarian carcinoma. Lab. Invest., 2003, 83, 861-870.

100. Hsu H.-S., Chen T.-P., Hung Ch.-H. et al. Characterization of a multiple epigenetic marker panel for lung cancer detection and risk assessment in plasma. Cancer, 2007,110, 2019-2026.

101. Hu Y.J., Diamond A.M. Role of glutathione peroxidase 1 in breast cancer: loss of heterozygosity and allelic differences in the response to selenium. Cancer Res., 2003, 63, 3347-3351

102. Jain PK. Epigenetics: the role of methylation in the mechanism of action of tumor suppressor genes. Ann N YAcad Sci., 2003, 983, 71-83.

103. Jannot G. and Simard M.J. Oncogene, 2006, 25, 6197-6201.

104. Jay C., Nemunaitis J., Chen P., Fulgham P., and Tong A.W. DNA Cell Biol., 2007, 26, 293-300.

105. Jenuwein T. Molecular biology, an RNA-guided pathway for the epigenome. Science, 2002,297, 2215-2218.

106. Jones PA and Laird PW. Cancer epigenetics comes of age. Nature Genet., 1999, 21, 163170.

107. Johnson S.M., Grosshans H., Shingara J., Byrom M., Jarvis R., Cheng A. et al. RAS is regulated by the let-7 microRNA family. Cell, 2005, 120, 635-647.

108. Kalnina Z., Zayakin P., Silina K., Line A. Alterations of premRNA splicing in cancer. Genes Chromosomes Cancer, 2005, 42, 342—357.

109. Kamai Т., Arai K., Tsujii Т., Honda M., Yoshida K. Overexpression of RhoA mRNA is associated with advanced stage in testicular germ cell tumor. BJU Int., 2001, 87, 227231.

110. Kamai Т., Kawakami S., Koga F., Arai G., Takagi K., Arai K., Tsujii Т., Yoshida K.I. RhoA is associated with invasion and lymph node metastasis in upper urinary tract cancer. BJU Int., 2003a, 91, 234-238.

111. Kamai Т., Tsujii Т., Arai K., Takagi K., Asami H., Ito Y., Oshima H. Significant association of Rho/ROCK pathway with invasion and metastasis of bladder cancer. Clin. Cancer Res., 20036., 9, 2632-2641.

112. Kamai Т., Yamanishi Т., Shirataki H., Takagi K., Asami H., Ito Y., Yoshida K. Overexpression of RhoA, Racl, and Cdc42 GTPases is associated with progression in testicular cancer. Clin. Cancer Res., 2004, 10, 4799-4805.

113. Kang W.K., Lee I., Ко U., Park C. Differential effects of RhoA signaling on anticancer agent-induced cell death. Oncol. Rep., 2005,13, 299-304.

114. Kashuba VI, Pavlova TV, Grigorieva EV, Kutsenko A, Yenamandra SP, Li J, Wang F, Protopopov Al, Zabarovska VI, Senchenko V, Haraldson K, Eshchenko T, Kobliakova J,

115. Vorontsova О, Kuzmin I, Braga E, Blinov VM, Kisselev LL, Zeng YX, Ernberg I, Lerman MI, Klein G, Zabarovsky ER High mutability of the tumor suppressor genes RASSF1 and RBSP3 (CTDSPL) in cancer. PLoS One. 2009, 4(5), e5231.

116. Karube Y., Tanaka H., Osada H., Tomida S., Tatematsu Y., Yanagisawa K. et al., Reduced expression of dicer associated with poor prognosis in lung cancer patients, Cancer Sci., 2005, 96, 111-115.

117. Kataoka N., Yong J., Kim V.N, Velazquez F., Perkinson R.A., Wang F., Dreyfuss G. Pre-mRNA splicing imprints mRNA in the nucleus with a novel RNA-binding protein that persists in the cytoplasm., Mol. Cell, 2000, 6, 673-682.

118. Kawasaki H., Taira K. Induction of DNA methylation and gene silencing by short interfering RNAs in human cells. Nature, 2004, 431, 211-217.

119. Kawasaki H., Taira K., Morris К. V. siRNA induced tran scriptional gene silencing in mammalian cells. Cell Cycle, 2005, 4, 442-448.

120. Keshet I, Schlesinger Y, Farkash S, Rand E, Hecht M, Segal E, Pikarski E, Young RA, Niveleau A, Cedar H, Simon I. Evidence for an instructive mechanism of de novo methylation in cancer cells. Nat Genet., 2006, 38(2), 149-153.

121. Kim V.N. Nat.Rev.Mol.CellBiol., 2005, 6, 376-385

122. Kim WY, Kaelin WG. Role of VHL gene mutation in human cancer .J Clin Oncol., 2004, 22, 4991-5004.

123. Kim YI, Giuliano A, Hatch KD, Schneider A, Nour MA, Dallal GE, Selhub J, Mason JB. Global DNA hypomethylation increases progressively in cervical dysplasia and carcinoma. Cancer., 1994, 74, 893-899.

124. Kinzler KV, Vogelstein B. Cancer-susceptibility genes. Gatekeepers and caretakers (news, comment). Nature, 1997, 386, 761-763

125. Knight J. Cancer comes under scrutiny in fresh genomics initiative, Nature, 2001, 410, 855,

126. Knudson AG. Hereditary cancer, oncogenes, and antioncogenes. Cancer Res., 1985, 45, 1437-1443.

127. Кок K, Naylor SL, Buys CHCM. Deletions of the short arm of chromosome 3 in solid tumors and the search for suppressor genes. Adv. Cancer Res., 1997, 71, 27

128. Korotkina RN, Matskevich GN, Devlikanova ASh, Vishnevskii AA, Kunitsyn AG, Karelin AA. Activity of glutathione-metabolizing and antioxidant enzymes in malignant and benign tumors of human lungs. Bull Exp Biol Med., 2002, 133, 606-608.

129. Koul D, Jasser SA, Lu Y, Davies MA, Shen R, Shi Y, Mills GB, Yung WK. Motif analysis of the tumor suppressor gene MMAC/PTEN identifies tyrosines critical for tumor suppression and lipid phosphatase activity. Oncogene., 2002, 21, 2357-2364.

130. Kuroki T, Trapasso F, Yendamuri S, Matsuyama A, Alder H, Williams NN, Kaiser LR and Croce CM. Allelic Loss on Chromosome 3p21.3 and Promoter Hypermethylation of Semaphoring in Non-Small Cell Lung Cancer. Cancer Res., 2003, 63, 3352-3355.

131. J., Gets G., MiskaE.A., Varez-Saavedra E., Lamb J., Peck D., Sweet-Cordero A., Ebert B.L., Мак R.H., Ferrando A.A., Downing J.R., Jacks Т., Horvitz H.R., and Golub T.R. Nature, 2005, 435, 834-838.

132. McGregor F., Muntoni A., Fleming J. et al. Molecular changes associated with oral dysplasia progression and acquisition of immortality: potential for its reversal by 5-azacytidine. Cancer Res., 2002, 62, 4757-66.

133. Maquat L.E. Nonsense-mediated mRNA decay: splicing, translation and mRNP dynamics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2004, 5, 89-99.

134. Maliekal TT, Antony ML, Nair A, Paulmurugan R, Karunagaran D. Loss of expression, and mutations of Smad 2 and Smad 4 in human cervical cancer. Oncogene, 2003, 22, 4889-4897.

135. Masuda A, Kamai T, Abe H, Arai K, Yoshida K. Is Stat3 and/or p53 mRNA expression a prognostic marker for renal cell carcinoma? Biomed Res., 2009, 30(3), 171-176.

136. Mattick J.S. RNA regulation: a new genetics? Nat. Rev. Genet. 2004, 5, 316-323.

137. Michael M.Z., O'Connor S.M., van Hoist Pellekaan N.G., Young G.P., and James RJ. Mol.CancerRes., 2003, 1, 882-891.

138. Miralem T, Avraham HK Extracellular matrix enhances heregulin-dependent BRCA1 phosphorylation and suppresses BRCA1 expression through its С terminus. Mol Cell Biol., 2003,23, 579-593.

139. Miyakura Y, Sugano K, Konishi F, Fukayama N, Igarashi S, Kotake K, Matsui T, Koyama Y, Maekawa M, Nagai H. Methylation profile of the MLH1 promoter region and their relationship to colorectal carcinogenesis. Genes Chromosomes Cancer, 2003, 36, 17-25.

140. Moren A, Hellman U, Inada Y, Imamura T, Heldin CH, Moustakas A. Differential ubiquitination defines the functional status of the tumor suppressor Smad4. J Biol Chem., 2003,278, 33571-33582.

141. Moscow J.A., He R., Gnarra J.R., Knutsen Т., Weng Y., Zhao W.P., Whang-Peng J., Linehan W.M., Cowan K.H. Examination of human tumors for rhoA mutations. Oncogene, 1994, 9, 189-194.

142. Murrell A., Rakyan V.K., Beck S. From genome to epigenome. Hum. Mol. Genet., 2005, 14, R3-R10.

143. Morris K.V. siRNA-mediated transcriptional gene silencing: the potential mechanism and a possible role in the histone code. Cell Mol. Life Sci., 2005, 62, 3057-3066.

144. Morris K.V., Chan S.W., Jacobsen S.E., Looney D.J. Small interfering RNA-induced transcriptional gene silencing in human cells. Science, 2004, 305, 1289-1292.

145. Na X, Duan HO, Messing EM, Schoen SR, Ryan CK, di Sant'Agnese PA, Golemis EA, Wu G. Identification of the RNA polymerase II subunit hsRPB7 as a novel target of the von Hippel-Lindau protein. EMBOJ., 2003, 22, 4249-4259.

146. Nakamoto M., Teramoto H., Matsumoto S., Igishi Т., Shimizu E. K-ras and rhoA mutations in malignant pleural effusion. Int. J. Oncol., 2001, 19, 971-976.

147. Nakayama Т., Watanabe M., Yamanaka M. et al. The role of epigenetic modifications in retinoic acid receptor beta2 gene expression in human prostate cancers. Lab. Invest., 2001, 81, 1049-57.

148. Narayan A, Ji W, Zhang XY, Marrogi A, Graff JR, Baylin SB, Ehrlich M. Hypomethylation of pericentromeric DNA in breast adenocarcinomas. Int J Cancer., 1998, 77, 833-838.

149. Nilsen T. W. The spliceosome: the most complex macromolecular machine in the cell? Bioessays, 2003, 25, 1147-1149.

150. Ochi К., Mori Т., Toyama Y., Nakamura Y., Arakawa H. Identification of semaphorin3B as a direct target of p53. Neoplasia, 2002, 4, 82-87.

151. O'Dnnell K.A., Wentzel E.A., Zeller K.I., Dang C.V., and Mendell J.T. Nature, 2005, 435, 839-843

152. Ohtani N, Yamakoshi K, Takahashi А, Нага E. The pl6INK4a-RB pathway: molecular link between cellular senescence and tumor suppression. J Med Invest. 2004, 51(3-4), 146-153.

153. Onay H., Pehlivan S., Koyuncuoglu M., Kirkali Z., Ozkinay F. Multigene methylation analysis of conventional renal cell carcinoma. Urol Int., 2009, 83(1), 107-12

154. O'Neill M.J. The influence of non-coding RNAs on allelespecific gene expression in mammals. Hum. Mol. Genet., 2005, 14, R113-R120.

155. O'Rourke J.R., Swanson M.S., and Harfe B.D. Birth Defects Res.C.Embryo.Today., 2006, 78, 172-179.

156. Orphanides G., Reinberg D. A unified theory of gene expression. Cell, 2002,108, 439451.

157. Pandolfl P.P. Aberrant mRNA translation in cancer pathogenesis: an old concept revisited comes finally of age. Oncogene, 2004, 23, 3134-3137.

158. Pang K.C., Stephen S., Engstrom P.G., Tajul-Arifin K., Chen W., Wahlestedt C. et al., RNAdb -a comprehensive mammalian noncoding RNA database. Nucleic Acids Res., 2005, 33, D125-D130.

159. Pan Y., Bi F., Liu N., Xue Y., Yao X., Zheng Y., Fan D. Expression of seven main Rho family members in gastric carcinoma. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2004, 315, 686691.

160. Parker R., Song H. The enzymes and control of eukaryotic mRNA turnover. Nat. Struct. Mol. Biol., 2004,11, 121-127.

161. Paterson H.F., Self A.J., Garrett M.D., Just I., Aktories K., Hall A. Microinjection of recombinant p21rho induces rapid changes in cell morphology. J. Cell Biol., 1990, 111, 1001-1007.

162. Perrin-Vidoz L., Sinilnikova O.M., Stoppa-Lyonnet D., Lenoir G.M., Mazoyer S. The nonsense-mediated mRNA decay pathway triggers degradation of most BRCA1 mRNAs bearing premature termination codons. Hum. Mol. Genet., 2002, 11, 2805-2814.

163. Ponder BAJ. Cancer genetics. Nature, 2001, 411, 336-341.

164. Qu GZ, Dubeau L, Narayan A, YuMC, Ehrlich M. Satellite DNA hypomethylation vs overall genomic hypomethylation in ovarian epithelial tumors of diVerent malignant potential. Mutat Res Fund Mol Mech Mutagens., 1999, 423, 91-101

165. Raschle M, Dufner P, Marra G, Jiricny J. Mutations within the hMLHl and hPMS2 subunits of the human MutL-alpha mismatch repair factor affect its ATP-ase activity, but not its ability to interact with hMutS-alpha. J Biol Chem., 2002, 277, 21810-21820.

166. Raver-Shapira N., andOren M. Cell Cycle, 2007, 6, 2656-2661.

167. Rihet S., Vielh P., Camonis J., Goud В., Chevillard S., de Gunzburg J. Mutation status of genes encoding RhoA, Racl, and Cdc42 GTPases in a panel of invasive human colorectal and breast tumors. J. Cancer Res. Clin. Oncol., 2001, 127, 733-738.

168. Roberts R.G., Gardner R.J., Bobrow M. Searching for the 1 in 2,400,000: a review of dystrophin gene point mutations. Hum. Mutat., 1994, 4, 1-11.

169. Robertson KD, Wolffe AP.DNA methylation in health and disease. Nat Rev Genet., 2000, 1, 11-19.

170. Roche J., Drabkin H.A. The role of semaphorins in lung cancer. Clin Lung Cancer, 2001, 3, 145-150.

171. Saaristo A., Karpanen Т., Alitalo K. Mechanisms of angiogenesis and their use in the inhibition of tumor growth and metastasis. Oncogene, 2000, 19, 6122-6129. (Review)

172. Sahai E., Marshall C.J. Rho-GTPases and cancer. Nature Rev., 2002, 2, 133-142.

173. Sanchez-Garcia I. Consequences of chromosomal abnormalities in tumor development. AnnuRev Genet., 1997, 31, 429-453.

174. Scholzova E, Malik R, Sevcik J, Kleibl Z. RNA regulation and cancer development. Cancer Lett. 2007, 246, 1-2,: 12-23.

175. Seeburg P.H., Higuchi M., Sprengel R. RNA editing of brain glutamate receptor channels: mechanism and physiology. Brain Res. Brain Res. Rev., 1998, 26, 217-229.

176. Shabalina S.A., Spiridonov N.A. The mammalian transcriptome and the function of non-coding DNA sequences. Genome Biol., 2004, 5, 105.

177. Sherr C.J. The pezcoller lecture: cancer cell cycles revisited. Cancer Res., 2000, 60, 3689-3695.

178. Shin S, Verma IM. BRCA2 cooperates with histone acetyltransferases in androgen receptor-mediated transcription. Proc Natl Acad Sci USA., 2003,100, 7201-7206.

179. Shivakumar L., Minna J., Sakamaki Т., Pestell R., White M.A. The RASSF1A tumor suppressor blocks cell cycle progression and inhibits cyclin D1 accumulation. Mol Cell Biol., 2002, 22, 4309-4318

180. Sirchia SM, Ren M, Pili R, Sironi E, Somenzi G, Ghidoni R, Toma S, Nicolo G, Sacchi N. Endogenous reactivation of the RARbeta2 tumor suppressor gene epigenetically silenced in breast cancer. Cancer Res., 2002, 62(9), 2455-2461.

181. Stamm S., Ben Ari S., Rafalska I., Tang Y., Zhang Z., Toiber D. et al. Function of alternative splicing. Gene, 2005, 344, 1-20.

182. Stoneley M., Willis A.E. Aberrant regulation of translation initiation in tumorigenesis. Curr. Mol. Med., 2003, 3, 597-603.

183. Stunnenberg, H.G., Garcia-Jimenez, C., and Betz J.L. Leukemia: the sophisticated subversion of hematopoiesis by nuclear receptor oncoproteins. Biochim. Biophys. Acta, 1999,1423, 15-33. (Review)

184. Su GH, Song JJ, Repasky EA, Schutte M, Kern SE. Mutation rate of MAP2K4/MKK4 in breast carcinoma. Hum Mutat., 2002,19, 81.

185. Takamizawa J., Konishi H., Yanagisawa K., Tomida S., Osada H., Endoh H. et al. Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival. Cancer Res., 2004, 64, 3753-3756.

186. Tan M., Li S., Swaroop M., Guan K., Oberley L.W., Sun Y. Transcriptional activation of the human glutathione peroxidase promoter by p53. J Biol Chem., 1999, 274, 1206112066.

187. Tang G. siRNA and miRNA: an insight into RISCs. Trends Biochem. Sci., 2005, 30, 106-114.

188. Tarasov V., Jung P., Verdoodt В., Lodygin D., Epanchintsev A., Menssen A., Meister G. and Hermeking H. Cell Cycle, 2007, 6, 1586-1593.

189. Tomari Y., ZamoreP.D. Perspective: machines for RNAi. Genes Dev., 2005,19, 517— 529.

190. Tommasi S., Dammann R., Zhang Z., Wang Y., Liu L., Tsark W.M., Wilczynski S.P., Li J., You M., Pfeifer G.P. Tumor susceptibility of Rassfla knockout mice. Cancer Res., 2005, 65, 92-98.

191. Tomlinson IP.M, Novelli MR, Bodmer WF. The mutation rate and cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1996, 93, 14800-14803.

192. Trusolino L. and Comoglio P.M. Scatter-factor and semaphorin receptors: cell signalling for invasive growth. Nature Reviews Cancer, 2002, 2, 289-300.

193. Tse C., Xiang R.H., Bracht T. and Naylor S.L. Human Semaphorin 3B (SEMA3B) located at chromosome 3p21.3 suppresses tumor formation in an adenocarcinoma cell line. Cancer Res., 2002, 62, 542-546.

194. Vachtenheim J, Horakova I, Novotna H. Hypomethylation of CCGG sites in the 3' region of H-ras protooncogene is frequent and is associated with H-ras allele loss in non-small cell lung cancer. Cancer Res., 1994, 54, 1145-1148.

195. Vial E., Sahai E., Marshall С.J. ERK-MAPK signaling coordinately regulates activity of Racl and RhoA for tumor cell motility. Cancer Cell, 2003, 4, 67-69.

196. Vidal A., Millard S.S., Miller J.P., Koff A. Rho activity can alter the translation of p27 mRNA and is important for RasV12-induced transformation in a manner dependent on p27 status. J. Biol. Chem., 2002, 277, 16433-16440.

197. Virmani AK, Muller C, Rathi A, Zoechbauer-Muleller S, Mathis M, Gazdar AF: Aberrant methylation during cervical carcinogenesis. Clin Cancer Res., 2001, 7, 584-589

198. Vogelstein В., Kinzler K. Cancer genes and the pathways they control. Nature Medicine, 2004,10, 789-799.

199. Vos M.D., Ellis C.A., Bell A., Birrer M.J. and Clark G.J. Ras uses the novel tumor suppressor RASSF1 as an effector to mediate apoptosis. J. Biol. Chem., 2000, 275, 35669-35672.

200. Waki T, Tamura G, Sato M, Motoyama T. Age-related methylation of tumor suppressor and tumor-related genes: an analysis of autopsy samples. Oncogene, 2003, 22, 41284133.

201. Wang F, Grigorieva EV, Li J, Senchenko VN, Pavlova TV, Anedchenko EA, Kudryavtseva AV, Tsimanis A, Angeloni D, Lerman MI, Kashuba VI, Klein G, Zabarovsky ER. HYAL1 and HYAL2 inhibit tumour growth in vivo but not in vitro. PLoS One., 2008, 3(8), e3031.

202. Widschwendter M., Berger J., Muller H.M. et al. Epigenetic downregulation of the retinoic acid receptor-(32 gene in breast cancer. J. Mam. Gl. Biol and Neop., 2001, 6. 193-201.

203. Wilkinson M.F. A new function for nonsense-mediated mRNA-decay factors. Trends Genet., 2005, 21, 143-148.

204. Wilkinson M.F., Shyu A.B. RNA surveillance by nuclear scanning? Nat. Cell Biol., 2002, 4, E144-E147.

205. Wilusz C.J., Wormington M., Peltz S.W. The cap-to-tail guide to mRNA turnover. Nat. Rev. Mol Cell Biol., 2001, 2, 237-246.

206. Wistuba II, Berry J, Behrens C, Maitra A, Shivapurkar N, Milchgrub S, Mackay B, Minna JD, Gazdar AF. Molecular changes in the bronchial epithelium of patients with small cell lung cancer. Clin Cancer Res., 2000a, 6, 2604-2610.

207. Xu P., Guo M., Hay B.A. MicroRNAs and the regulation of cell death. Trends Genet., 2004, 20, 617-624.

208. Yan J, Zhu J, Zhong H, Lu Q, Huang C, Ye Q. BRCA1 interacts with FHL2 and enhances FHL2 transactivation function. FEBSLett., 2003, 553, 183-189

209. Yanaihara N., Caplen N., Bowman E., Seike M., Kumamoto K., Yi M., Stephens R.M., Okamoto A., Yokota J., Tanaka Т., Calin G.A., Liu C.G., Croce C.M., and Harris C.C. Cancer Cell, 2006, 9, 189-198.

210. Yang H, Jeffrey PD, Miller J, Kinnucan E, Sun Y, Thoma NH, Zheng N, Chen PL, Lee WH, Pavletich NP. BRCA2 function in DNA binding and recombination from a BRCA2-DSSl-ssDNA structure. Science, 2002, 297, 1837-1848.

211. Yekta S., Shih I.H., Bartel D.P. MicroRNA-directed cleavage of HOXB8 mRNA. Science, 2004, 304, 594-596.

212. Yoder JA, Walsh CP, Bestor TH: Cytosine methylation and the ecology of intragenomic parasites. Trends Genet., 1997, 13, 335-340.

213. Yu X, Chini CC, He M, Mer G, Chen J. The BRCT domain is a phospho-protein binding domain. Science, 2003, 302, 639-642.

214. Zabarovsky E.R., Lerman M.I., Minna J.D. Tumor suppressor genes on chromosome 3p involved in the pathogenesis of lung and other cancers. Oncogene, 2002, 21(45), 69156935.

215. Zeng Y. Oncogene, 2006, 25, 6156-6162

216. Zochbauer-Muller S, Gazdar AF and Minna JD. Molecular pathogenesis of lung cancer. Annu. Rev. Physiol., 2002, 64, 681-708.