Подавление экспрессии генов-супрессоров опухолевого роста при немелкоклеточном раке легкого тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Анедченко, Екатерина Анатольевна

• Анедченко, Екатерина Анатольевна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Анедченко, Екатерина Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОБОЗНАЧЕНИЯ ГЕНОВ

ВВЕДНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Классификация рака легкого

1.2. Молекулярные нарушения при раке легкого

1.3. Роль хромосомы 3 в возникновении и развитии рака легкого 28 1.3.1. Гены-супрессоры опухолевого роста (области АР20 и LUC А)

1.4. Методы оценки экспрессии генов

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Материа

2.1.1. Образцы тканей

2.1.2. Образцы кДНК

2.1.3. Праймеры и зонды

2.2. Методы

2.2.1. Выделение РНК

2.2.2. Выделение ДНК

2.2.3. Реакция обратной транскрипции

2.2.4. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ)

2.2.5. Анализ продуктов ПЦР-РВ

2.2.6. Статистический анализ данных

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Разработка методической базы для ПЦР-РВ

3.1.1. Выбор наборов реактивов для ПЦР-РВ

3.1.2. Выбор контрольных генов и образцов сравнения для ПЦР-РВ

3.1.3. Положительный контроль ПЦР-РВ

3.2. Количественная оценка уровня мРНК генов RBSP3/CTDSPL,

МРЯ12/в21, КАББРЫ, 1ТвА9, НУАЫ и НУАЬ2 при НМРЛ

3.2.1. Гены, кодирующие белки, участвующие в регуляции клеточного цикла {МЗРЗ/СТОБРЬ, №Я12Ю21, ДЛЯЯ/^Л)

3.2.2. Гены, кодирующие белки, участвующие в регуляции ангиогенеза и клеточной адгезии {1ТвА9, НУАЫ и НУАЬ2)

3.3. Сравнение уровней мРНК генов в одних и тех же опухолях легкого 70 3.3.1. Корреляции между изменением уровня мРНК исследуемых генов в разных группах больных

3.4. Ассоциация подавления экспрессии генов КВЗРЗ/СТВБРЬ, 1ТОА9 и НУАЬ2 при НМРЛ с делециями и метилированием их промоторных областей

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 78 ВЫВОДЫ 83 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 85 БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AK - аденокарцинома легкого а.о. — аминокислотные остатки

ГК - гиалуроновая кислота

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота кДНК - комплиментарная ДНК

MPJI — мелкоклеточный рак легкого мРНК - матричная (информационная) РНК

HMPJI - немелкоклеточный рак легкого

ОТ - реакция обратной транскрипции

ОТ-ПЦР — полимеразная цепная реакция, сопряженная с реакцией обратной транскрипции

ПААГ - полиакриламидный гель

ПКРЛ - плоскоклеточный рак легкого п. н. - пар нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

PJI - рак легкого

РМЖ - рак молочной железы

РП - рак почки

PLUM - рак шейки матки

РЯ - рак яичников

СПКР - светлоклеточная почечноклеточная карцинома почки т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов

АР-20 - район TSG на Зр, перекрываемый Alu-ПЦР-клоном

FD — частота снижения уровня мРНК гена (от англ. frequency of mRNA level decrease)

LUCA - район TSG на Зр (от англ. lung cancer TSG region)

LD — уровень снижения мРНК гена (от англ. level decrease of mRNA)

LOH - потеря гетерозиготности (от англ. loss of heterozygosity) микросателлитная нестабильность

MI - микросателлитная нестабильность (от англ. microsatellite instability) Зр — короткое плечо хромосомы 3 человека

SAGE - серийный анализ экспрессии генов (serial analysis of gene expression)

TSG — ген-супрессор опухолевого роста (tumor suppressor gene) ОБОЗНАЧЕНИЯ ГЕНОВ

RBSP3/CTDSPL - ген, кодирующий малую С-концевую сериновую фосфатазу, которая активирует RBI (RBI serine phosphatase from human chromosome 3).

RASSF1A — ген, кодирующий белок, содержащий домен гомологичный онкобелку семейства Ras 1 (Ras association domain family 1 ).

NPRL2/G21 - ген, кодирующий аналог 2 регулятора пермеазы азота (nitrogen permease regulator like-2).

HYALl, HYAL2 - гены, кодирующие белки семейства эндоглюкозаминидаз. ITGA9 - ген, кодирующий субъединицу мембранного белка, принадлежащего семейству интегринов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Подавление экспрессии генов-супрессоров опухолевого роста при немелкоклеточном раке легкого»

Рак легкого (РЛ) - одно из самых распространенных злокачественных новообразований в мире. В России РЛ занимает первое место среди онкологических заболеваний у мужчин (23,3%) и последнее место у женщин (4,2%) [1]. Смертность от РЛ превышает смертность от рака молочной железы, толстой кишки и простаты, вместе взятых и составляет 18 % [2]. Основная причина возникновения РЛ в 80 - 85 % случаев - курение. К причинам возникновения остальных 15-20 % случаев РЛ относят воздействие канцерогенных веществ, радиации, предшествующие изменения в бронхах и легочной паренхиме, а также химиотерапия цитостатиками при лечении рака других органов [1].

Согласно данным статистики, при первом обращении за врачебной помощью у 30-35 % больных имеются симптомы отдаленных метастазов, поскольку в начальном периоде развития опухоли клинические симптомы скудны или отсутствуют. Обычно данные анамнеза и первичного обследования не дают информации, необходимой для установления диагноза. Инструментальные методы диагностики РЛ (рентгенологическое и томографическое исследование, бронхоскопия) практически не позволяют обнаружить опухоль на ранней стадии, когда условия для ее лечения наиболее благоприятны. Между тем, при диагностике РЛ на 1-ой стадии развития заболевания выживаемость больных достигает 70 % [3]. Все это обуславливает необходимость разработки новых более надежных, быстрых и доступных широкому кругу пациентов методов ранней диагностики РЛ, послеоперационного мониторинга и раннего выявления метастазов.

Развитие злокачественных опухолей легкого - многофакторный и многостадийный процесс, в основе которого лежит накопление клетками различных геномных изменений, затрагивающих многие гены. К ранним событиям при развитии РЛ относят аллельные потери, геми- и гомозиготные делеции короткого плеча хромосомы 3 (Зр). Делеции Зр наблюдали в 100% случаев мелкоклеточного PJI (MPJI), 80-85% случаев немелкоклеточного PJI (HMPJI), а также в клетках из зон пренеопластических поражений легких - гиперплазии и дисплазии [4, 5, 6, 7, 8, 9]. Еще в 1997 г. показано, что введение субхромосомных фрагментов Зр в опухолевые клеточные линии приводит к подавлению их роста [10]. Это позволило предположить возможное присутствие генов-супрессоров опухолевого роста (TSG - Tumor Suppressor Genes) в этом районе генома. Долгое время на хромосоме 3 человека были известны лишь несколько TSG: FHIT, MLH1, VHL [10]. За последние несколько лет, благодаря использованию подхода, основанного на применении микросателлитных маркеров, и картированию гомозиготных делеций в первичных опухолях и клеточных линиях, идентифицировано около 50 новых генов потенциальных супрессоров опухолевого роста, значительную часть которых представляют гены, локализованные в районе Зр21 [9]. Известно, что белковые продукты генов из этой области выполняют в клетке разнообразные ключевые функции: регуляция клеточного цикла и адгезии, инициация апоптоза, репарация ДНК и др. Для некоторых из них доказана принадлежность к супрессорам опухолевого роста (например, CACNA2D2, DLCJ, BLU, FUS1, RBSP3/CTDSPL, NPRL2/G21, SEMA3B, RASSF1 (изоформы А и С)). Однако для большинства генов Зр до сих пор не ясна роль в канцерогенезе. На сегодняшний день внимание исследователей направлено, в основном, на изучение структурных изменений интересующих генов, а также функциональных изменений кодируемых ими белков в различных опухолях. Практически отсутствуют данные об экспрессии на уровне транскрипции большинства TSG и кандидатов в супрессоры в опухолях. Отсутствие и/или снижение количества мРНК гена в клетке с большой долей вероятности свидетельствует о снижении содержания или отсутствии соответствующего белка. Оценка содержания мРНК в опухолях - один из важных этапов в функциональных исследованиях TSG. Благодаря современным высокоэффективным технологиям с использованием кДНК-микропанелей стало возможным исследовать изменение экспрессии сотен и тысяч генов, однако данный метод не позволяет количественно оценивать содержание транскриптов интересующих генов, для этих целей широко используют метод ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ).

Представленная работа посвящена количественной оценке уровня мРНК генов RBSP3/CTDSPL, NPRL2/G21, RASSF1A, ITGA9, HYAL1 и HYAL2 из двух областей района Зр21 LUCA (3р21.31-р21.2) и АР20 (Зр22-р21.33) в двух основных гистологических типах немелкоклеточного рака легкого (HMPJI) - АК и ПКРЛ. Задачи исследования состояли в отработке методики количественных измерений уровня мРНК генов; оценке уровня мРНК выбранных генов при АК и ПКРЛ; сопоставлении полученных данных с клиническими характеристиками исследуемых опухолей; сравнительном анализе изменения уровня мРНК генов в одних и тех же образцах НМРЛ; обсуждении возможных причин, приводящих к подавлению экспрессии исследуемых генов в опухолях легкого. Стоит отметить, что эти гены не относятся к малоизученным, поскольку известны функции их белков, для 5-ти, кроме ITGA9 показана опухольподавляющая активность. Также изучали изменение экспрессии на уровне мРНК и/или белка, в основном, на клеточных линиях легкого и реже в единичных опухолях легкого, с использованием качественных и полуколичественных методов. В случае генов RASSF1A, NPRL2/G21, HYAL1 и HYAL2 исследовали роль метилирования в подавлении их транскрипции.

В работе впервые методом ПЦР-РВ выявлено значительное снижение уровня мРНК генов RBSP3/CTDSPL, NPRL2/G21, RASSF1A, ITGA9, HYAL1 и HYAL2 в большинстве опухолей легкого. Обнаружено, что частота и уровень снижений мРНК генов значительнее при ПКРЛ, чем при АК. В большинстве опухолей легкого происходит одновременное снижение содержания мРНК генов независимо от их расположения на 3р21.3 и функций белковых продуктов. Более того, впервые показано, что подавление транскрипции генов ЯВЗРЗ/СТВБРЬ и 1ТОА9 при НМРЛ связано с геномными и эпигеномными механизмами.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Анедченко, Екатерина Анатольевна

ВЫВОДЫ

1. В образцах немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) 1-Ш клинических стадий с высокой частотой снижается содержание мРНК генов - супрессоров опухолевого роста, расположенных в двух областях на хромосоме Зр человека, а именно: ЯВЗРЗ/СТПБРЬ, 1ЮА9 (АР20), КРКЫЮИ, МББПА, НУАЫ, НУАЬ2 (ШСА).

2. Профили экспрессии 6-ти генов при плоскоклеточном раке (ПКРЛ) и аденокарциноме (АК) легкого похожи, но не идентичны. При ПКРЛ заметное снижение уровня мРНК генов ЯВЗРЗ/СТОЗРЬ, ЫРЯЬ2/021, 1ЮА9, НУАЫ и НУАЬ2 происходит уже на 1-ой стадии. При АК на ранней стадии обнаружены случаи повышения уровня мРНК генов ИРЯЬ2/021, КАББРЫ и НУАЫ. Частота и степень подавления экспрессии генов КАББРЫ и 1ЮА9 достоверно ассоциирована с прогрессией АК.

3. Снижение уровня мРНК генов ЯВЗРЗ/СтЗРЬ, ЫРКЬ2/в21, ИАББРЫ, 1Т0А9, НУАЫ и НУАЫ происходит независимо от расположения в одной или разных областях района 3р21.3 и функций их белковых продуктов.

4. Уровни мРНК генов ITGA9 и HYAL2, HYAL1 и HYAL2, белки которых участвуют в регуляции клеточной адгезии и ангиогенезе, у каждого пациента близки, что указывает на одновременное и координованное подавление их экспрессии.

5. Для генов RBSP3/CTDSPL и ITGA9 (область АР20), имеющих Notl -узнающие участки в 5"- области, снижение уровня их мРНК вызвано преимущественно делециями и/или метилированием промоторной области.

6. Подавление экспрессии генов RBSP3/CTDSPL, NPRL2/G21, RASSF1A, ITGA9, HYAL1 и HYAL2 свидетельствует о функциональной важности кодируемых ими белков в предотвращении возникновения и/или развития опухолей легкого.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Анедченко, Екатерина Анатольевна, 2008 год

1. Татосян А.Г. Онкогены. Сборник обзорных статей «Канцерогенез». 2000. под ред. Д.Г. Заридзе, М: Научн. Мир, стр. 57-74.

2. Jemal A., Siegel R., Ward Е., Murray Т., Xu J., Smigal С., Thun M.J. Cancer statistics, 2006. CA Cancer J Clin. 2006. 56(2). P. 106-130.

3. Зборовская И.Б., Татосян А.Г. Молекулярные маркеры различных стадий развития немелкоклеточного рака легкого. Молекулярная биология. 2004. 38(2). С. 191-202.

4. Zabarovsky E.R., Lerman M.I., Minna J.D. Tumor suppressor genes on chromosome 3p involved in the pathogenesis of lung and other cancers. Oncogene. 2002. 21(45). P.6915-6935.

5. Massion P.P., Carbon D.P. The molecular basis of lung cancer: molecular abnormalities and therapeutic implications. Respir Res. 2003.4:12.

6. Zabarovsky et al. Lung cancer principles and practice, third edition, 2005. P. 118-133.

7. Angeloni D. Molecular analysis of deletions in human chromosome 3p21 and the role of resident cancer genes in disease. Brief Funct Genomic Proteomic. 2007. 6(1). P.19-39.

8. Ю.Кок К., Naylor S.L., Buys C.H. Deletions of the short arm of chromosome 3 in solid tumors and the search for suppressor genes. Adv Cancer Res. 1997. 71. P. 27-92.

9. Yokota J., Kohno T. Molecular footprints of human lung cancer progression. Cancer Sci. 2004. 95(3). P. 197-204.

10. TNM: Классификация злокачественных опухолей. 2003. 6-е изд. под ред. Н.Н. Блинова. СПб.: Эскулап. С. 192-196.

11. Hanahan D., Weinberg R.A. The hallmarks of cancer. Cell. 2000. 100(1). P. 57-70.

12. Hahn W.C., Weinberg R.A. Rules for making human tumor cells. N Engl J Med. 2002. 347(20). P. 1593-1603.

13. Knudson A.G. Hereditary cancer, oncogenes, and antioncogenes. Cancer Res. 1985. 45. P. 1437-1443.

14. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза. Биохимия. 2000. 65(1). С. 5-33.

15. Kohno T.,Yokota J. How many tumor suppressor genes are involved in human lung carcinogenesis? Carcinogenesis. 1999. (20)8. P. 1403-1410.

16. Kopper L., Timär J. Genomics of lung cancer may change diagnosis, prognosis and therapy. Pathol Oncol Res. 2005. 11(1). P. 5-10.

17. Dacic S. Molecular profiling of lung carcinoma: identifying clinically useful tumor markers for diagnosis and prognosis. Expert Rev. Mol. Diagn. 2007. 7(1). P. 77-86.

18. Hesson L.B., Cooper W.N., Latif F. Evaluation of the 3p21.3 tumour-suppressor gene cluster. Oncogene. 2007. 26. P. 7283-7301.

19. Zochbauer-Muller S., Gazdar A.F., Minna J.D. Molecular pathogenesis of lung cancer. Annu Rev Physiol. 2002. 64. P. 681-708.

20. Wieland I., Ammermüller T., Böhm M., Totzeck B., Rajewsky M.F. Microsatellite instability and loss of heterozygosity at the hMLHl locus on chromosome 3p21 occur in a subset of nonsmall cell lung carcinomas. Oncol Res. 1996. 8(1). P. 1-5.

21. Benachenhou N., Guiral S., Gorska-Flipot I., Labuda D., Sinnett D. High resolution deletion mapping reveals frequent allelic losses at the DNA mismatch repair loci hMLHl and hMSH3 in non-small cell lung cancer. Int J Cancer. 1998. 77(2). P. 173-180.

22. Miozzo M., Sozzi G., Musso K., Pilotti S., Incarbone M., Pastorino U., Pierotti M.A. Microsatellite alterations in bronchial and sputum specimens of lung cancer patients. Cancer Res. 1996. 56(10). P. 22852288.

23. Froudarakis M.E., Sourvinos G., Fournel P., Bouros D., Vergnon J.M., Spandidos D.A., Siafakas N.M. Microsatellite instability and loss of heterozygosity at chromosomes 9 and 17 in non-small cell lung cancer.Chest. 1998. 113(4). P. 1091-1094.

24. Wistuba I.I., Lam S., Behrens C., Virmani A.K., Fong K.M., LeRiche J., Samet J.M., Srivastava S., Minna J.D., Gazdar A.F. Molecular damage in the bronchial epithelium of current and former smokers. J Natl Cancer Inst. 1997. 89(18). P. 1366-1373.

25. Shiseki M., Kohno Т., Nishikawa R., Sameshima Y., Mizoguchi H., Yokota J. Frequent allelic losses on chromosomes 2q, 18q, and 22q in advanced non-small cell lung carcinoma. Cancer Res. 1994. 54(21). P. 5643-5648.

26. Shiseki M., Kohno Т., Adachi J., Okazaki Т., Otsuka Т., Mizoguchi H., Noguchi M., Hirohashi S., Yokota J. Comparative allelotype of early and advanced stage non-small cell lung carcinomas. Genes Chromosomes Cancer. 1996. 17(2). P. 71-77.

27. Чумаков П.М. Функция гена p53: выбор между жизнью и смертью. Биохимия. 2000. 65(1). С. 34-47.

28. Denissenko M.F., Pao A., Tang М., Pfeifer G.P. Preferential formation of benzoa.pyrene adducts at lung cancer mutational hotspots in P53. Science. 1996. 274(5286). P. 430-432.

29. Gao W., Keohavong P. Analysis of K-RAS and P53 mutations in sputum samples. Methods Mol Biol. 2005. 291. P. 217-233.

30. Uchida C., Miwa S., Kitagawa K., Hattori T., Isobe T., Otani S., Oda T., Sugimura H., Kamijo T., Ookawa K., Yasuda H., Kitagawa M. Enhanced Mdm2 activity inhibits pRB function via ubiquitin-dependent degradation. EMBO J. 2005. 24(1). P. 160-169.

31. Ko J.L., Cheng Y.W., Chang S.L., Su J.M., Chen C.Y., Lee H. MDM2 mRNA expression is a favorable prognostic factor in non-small-cell lung cancer. Int J Cancer. 2000. 89(3). P. 265-270.

32. Eymin B., Gazzeri S., Brambilla C., Brambilla E. Mdm2 overexpression and pl4(ARF) inactivation are two mutually exclusive events in primary human lung tumors. Oncogene. 2002. 21(17). P. 2750-2761.

33. Weinberg R.A. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 1995. 81. P. 323-330.

34. Virmani AK., Gazdar A.F. Tumor suppressor genes in Lung cancer. Methods Mol. Biol. 2003. 222. P. 97-115.

35. Eymin B., Gazzeri S., Brambilla C., Brambilla E. Distinct pattern of E2F1 expression in human lung tumours: E2F1 is upregulated in small cell lung carcinoma. Oncogene. 2001. 20(14). P. 1678-1687.

36. Zajac-Kaye M. Мус oncogene: a key component in cell cycle regulation and its implication for lung cancer. Lung Cancer. 2001. 34. P. S43-S46.

37. Bouchard C., Staller P., Eilers M. Control of cell proliferation by Мус. Trends Cell Biol. 1998. 8. P. 202-206.

38. Vita M., Henriksson M. The Мус oncoprotein as a therapeutic target for human cancer. Semin Cancer Biol. 2006. 16(4). P. 318-330.

39. Введение в молекулярную медицину, под ред. Пальцева М.А. М: «Медицина», 2004.

40. Kitamura Н., Kameda Y., Ito Т., Hayashi Н. Atypical adenomatous hyperplasia of the lung. Implications for the pathogenesis of peripheral lung adenocarcinoma. Am J Clin Pathol. 1999. 111(5). P. 610-622.

41. Ronai Z., Yabubovskaya M.S., Zhang E., Belitsky G.A. K-ras mutation in sputum of patients with or without lung cancer. J Cell Biochem Suppl. 1996. 25. P. 172-176.

42. Zhang L.F., Gao W.M., Gealy R., Weissfeld J., Elder E., Whiteside T.L., Keohavong P. Comparison of K-ras gene mutations in tumour and sputum DNA of patients with lung cancer. Biomarkers. 2003. 8(2). P. 156-161.

43. Mao L., Hruban R.H., Boyle J.O., Tockman M., Sidransky D. Detection of oncogene mutations in sputum precedes diagnosis of lung cancer. Cancer Res. 1994. 54(7). P. 1634-1637.

44. Schlessinger J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 2000. 103(2). P. 211-225.

45. Yarden Y., Sliwkowski M.X. Untangling the ErbB signalling network. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2001. 2. P. 127- 137.

46. Baillie R., Carlile J., Pendleton N., Schor A.M. Prognostic value of vascularity and vascular endothelial growth factor expression in non-small cell lung cancer. J Clin Pathol. 2001. 54(2). P. 116-120.

47. Meyerson M. Role of telomerase in normal and cancer cells. J Clin Oncol. 2000. 18(13). P. 2626-2634.

48. Autexier C., Lue N.F.: The Structure and Function of Telomerase Reverse Transcriptase. Annu Rev Biochem. 2006. 75. P. 493-517.

49. Wu K.J., Grandori C., Amacker M., Simon-Vermot N., Polack A., Lingner J., Dalla-Favera R. Direct activation of TERT transcription by c-MYC. Nat Genet. 1999. 21(2). P. 220-224.

50. Geng Z., Zhang D., Liu Y. Expression of telomerase hTERT in human non-small cell lung cancer and its correlation with c-myc gene. Chin Med J (Engl). 2003. 116(10). P. 1467-170.

51. Horikawa I., Barrett J.C: Transcriptional regulation of the telomerase hTERT gene as a target for cellular and viral oncogenic mechanisms. Carcinogenesis. 2003. 24. P. 1167-1176.

52. Wang J., Xie L.Y., Allan S., Beach D., Hannon G.J. Myc activates telomerase. Genes Dev. 1998. 12(12). P. 1769-1774.

53. Wang J., Liu X., Jiang W., Liang L. Telomerase activity and expression of the telomerase catalytic subunit gene in non-small cell lung cancer: correlation with decreased apoptosis and clinical prognosis. Chin Med J (Engl). 2000. 113(11). P. 985-990.

54. Wang L., Soria J.C., Kemp B.L., Liu D.D., Mao L., Khuri F.R. hTERT expression is a prognostic factor of survival in patients with stage I non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2002. 8(9). P. 2883-2889.

55. Fujita Y., Fujikane T., Fujiuchi S., Nishigaki Y., Yamazaki Y., Nagase

56. A., Shimizu T., Ohsaki Y., Kikuchi K. The diagnostic and prognostic relevance of human telomerase reverse transcriptase mRNA expression detected in situ in patients with nonsmall cell lung carcinoma. Cancer. 2003. 98(5). P. 1008-1013.

57. Hiyama K., Hiyama E., Ishioka S., Yamakido M., Inai K., Gazdar A.F., Piatyszek M.A., Shay J.W. Telomerase activity in small-cell and non-small-cell lung cancers. J. Natl. Cancer Inst. 1995. 87. P. 895-902.

58. Pasrija T., Srinivasan R., Behera D., Majumdar S. Telomerase activity in sputum and telomerase and its components in biopsies of advanced lung cancer. Eur J Cancer. 2007. 43(9). P. 1476-1482.

59. Lu C., Soria JC., Tang X., Xu X.C., Wang L., Mao L., Lotan R., Kemp

60. C., Sanchez-Pernaute A., Torres A., Diaz-Rubio E., Balibrea J.L., Benito

61. M. Relationship between 3p deletions and telomerase activity in non-small-cell lung cancer: prognostic implications. Br J Cancer. 2004. 90(10). P. 1983-1988.

62. Zhu C.Q., Cutz J.C., Liu N., Lau D., Shepherd F.A., Squire J.A., Tsao M.S. Amplification of telomerase (hTERT) gene is a poor prognostic marker in non-small-cell lung cancer. Br J Cancer. 2006. 94(10). P. 14521459.

63. Esteller M., Corn P.G., Baylin S.B., Herman J.G. A gene hypermethylation profile of human cancer. Cancer Res. 2001. 61(8). P. 3225-3229.

64. Belinsky S.A. Silencing of genes by promoter hypermethylation: key event in rodent and human lung cancer. Carcinogenesis. 2005. 26(9). P. 1481-1487.

65. Dammann R., Takahashi T., Pfeifer G.P. The CpG island of the novel tumor suppressor gene RASSF1A is intensely methylated in primary small cell lung carcinomas. Oncogene. 2001. 20(27).P. 3563-3567.

66. Pfeifer G.P., Dammann R. Methylation of the tumor suppressor gene RASSF1A in human tumors. Biochemistry (Mosc). 2005. 70(5). P. 576583.

67. Wistuba I.I., Mao L., Gazdar A.F. Smoking molecular damage in bronchial epithelium. Oncogene. 2002. 21(48). P. 7298-7306.

68. Esteller M., Sanchez-Cespedes M., Rosell R., Sidransky D., Baylin S.B., Herman J.G. Detection of aberrant promoter hypermethylation of tumor suppressor genes in serum DNA from non-small cell lung cancer patients. Cancer Res. 1999. 59(1). P. 67-70.

69. Palmisano W.A., Divine K.K., Saccomanno G., Gilliland F.D., Baylin S.B., Herman J.G., Belinsky S.A. Predicting lung cancer by detecting aberrant promoter methylation in sputum. Cancer Res. 2000. 60(21). P. 5954-5958.

70. Wistuba I.I., Gazdar A.F. Molecular pathology of lung cancer. Verh Dtsch Ges Pathol. 2000. 84. P. 96-105.

71. Киселев Л.Л., Сенченко B.H., Опарина Н.Ю., Брага Э.А., Забаровский Е.Р. Гены-супрессоры-опухолевого роста, локализованные на коротком плече хромосомы 3 человека. Молекулярная медицина 2005. 3. С. 17-28.

72. Riazimand S.H., Welkobrsky H.J., Bernawer H.S., Jacob R., Mamn W.J. Investigation for fine mapping of amplification in chromosome 3q26.3-28 frequently occurring in squamous cell carcinomas of the head and neck. Oncology. 2002. 63 (4). P. 385-392.

73. Брага Э.А., Киселев Л.Л., Забаровский Е.Р. От идентификации геномного полиморфизма к диагностическим и прогностическим маркерам эпителиальных опухолей. Молекулярная биология. 2004. 38. С. 145-154.

74. Tse C., Xiang R.H., Bracht T., Naylor S.L. Human Semaphorin 3B (SEMA3B) located at chromosome 3p21.3 suppresses tumor formation in an adenocarcinoma cell line. Cancer Res. 2002. 62(2). P. 542-546.

75. Xiang R., Davalos A.R., Hensel C.H., Zhou X.J., Tse C., Naylor S.L. Semaphorin 3F gene from human 3p21.3 suppresses tumor formation in nude mice. Cancer Res. 2002. 62(9). P. 2637-2643.

76. Shu J., Jelinek J., Chang H., Shen L., Qin T., Chung W., Oki Y., Issa J.P. Silencing of bidirectional promoters by DNA methylation in tumorigenesis. Cancer Res. 2006. 66(10). P. 5077-5084.

77. Albelda S.M. Endothelial and epithelial cell adhesion molecules. Am J Respir Cell Mol Biol. 1991. 3. P. 195-203.

78. Hibi K., Yamakawa K., Ueda R., Horio Y, Murata Y, Tamari M, Uchida K, Takahashi T, Nakamura Y, Takahashi T. Abberant upregolation of a novel integrin alpha subunit gene at 3p21.3 in small cell lung cancer. Oncogene. 1994. 9. P. 611-619.

79. Palmer E.L., Ruegg C., Ferrando R., Pytela R., Sheppard D. Sequence and tissue distribution of the integrin alpha-9 subunit, a novel partner ofbeta-1 that is widely distributed in epithelia and muscle. J. Cell Biol. 1993. 123. P. 1289-1297.

80. Shivakumar L., Minna J.D., Sakamaki Т., Pestell R.G., White M.A. The RASSF1A tumor suppressor blocks cell cycle progression and inhibits cyclin D1 accumulation. Mol. Cell. Biol. 2002. 22. P. 4309-4318.

81. Vos M.D., Ellis C.A., Bell A., Birrer M.J., Clark G.J. Ras uses the novel tumor suppressor RASSF1 as an effector to mediate apoptosis. J. Biol. Chem. 2000. 275. P. 35669-35672.

82. Ortiz-Vega S., Khokhlatchev A., Nedwidek M., Zhang X.F., Dammann R., Pfeifer G.P., Avruch J. The putative tumor suppressor RASSF1A homodimerizes and heterodimerizes with the Ras-GTP binding protein Norel. Oncogene. 2002. 21(9). P. 1381-1390.

83. Oh H.J., Lee K.K., Song S.J., Jin M.S., Song M.S., Lee J.H., Im C.R., Lee J.O., Yonehara S., Lim D.S. Role of the tumor suppressor RASSF1A in Mstl-mediated apoptosis. Cancer Res. 2006. 66(5). P. 2562-2569.

84. RASSF1A isoform of RASSF1 promotes microtubule stability and suppresses tumorigenesis. Mol Cell Biol. 2005. 25(18). P. 8356-8367.

85. Dammann R., Li C., Yoon J.H., Chin P.L., Bates S., Pfeifer G.P. Epigenetic inactivation of a RAS association domain family protein from the lung tumour suppressor locus 3p21.3. Nat Genet. 2000. 25(3). P. 315319.

86. Pan Z.G., Kashuba V.I., Liu W.Q., Shao J.Y., Zhang R.H., Jiang J.H., Guo C., Zabarovsky E., Ernberg I., Zeng Y.X. High frequency somatic mutations in RASSF1A in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Biol Ther. 2005.4. P. 1116-1122.

87. Agathanggelou A., Cooper W.N., Latif F. Role of the Ras-association domain family 1 tumor suppressor gene in human cancers. Cancer Res. 2005. 65(9). P. 3497-3508.

88. Малюкова А.В., Логинов В.И., Ходырев Д.С., Кадырова Е.Л., Пронина И.В., Иванова Т.А., Киселев Ф.Л., Забаровский Е.Р.,

89. Киселева Н.П., Брага Э.А. Метилирование предполагаемого гена-супрессора RASSF1A в опухолях шейки матки. Молекулярная биология. 2004. 38(6). С. 1005-1013.

90. Rosell R., Lord R.V., Taron M., Reguart N. DNA repair and cisplatin resistance in non-small-cell lung cancer. Lung Cancer. 2002. 38(3). P. 217-227.

91. Rosell R., Taron M., Barnadas A., Scagliotti G., Sarries C., Roig B. Nucleotide excision repair pathways involved in Cisplatin resistance in non-small-cell lung cancer. Cancer Control. 2003. 10(4). P. 297-305.

92. Siddik Z.H. Cisplatin: mode of cytotoxic action and molecular basis of resistance. Oncogene. 2003. 22(47). P. 7265-7279.

93. Toole BP. Hyaluronan: from extracellular glue to pericellular cue. Nat. Rev. Cancer. 2004. 4. P. 528-539.

94. Csoka A.B., Frost G.I., Stern R. The six hyaluronidase-like genes in the human and mouse genomes. Matrix Biol. 2001. 20(8). P. 499-508.

95. Zhang L., Underhill C.B., Chen L. Hyaluronan on the surface of tumor cells is correlated with metastatic behavior. Cancer Res. 1995. 55(2). P. 428-433.

96. Bertrand P., Courel M.N., Maingonnat C., Jardin F., Tilly H., Bastard C. Expression of HYAL2 mRNA, hyaluronan and hyaluronidase in B-cellnon-Hodgkin lymphoma: relationship with tumor aggressiveness. Int J Cancer. 2005. 113(2). P. 207-212.

97. Lepperdinger G., Strobl B., Kreil G. HYAL2, a human gene expressed in many cells, encodes a lysosomal hyaluronidase with a novel type of specificity. J Biol Chem. 1998. 273(35). P. 22466-22470

98. Lokeshwar V.B., Cerwinka W.H., Isoyama T., Lokeshwar B.L. HYAL1 hyaluronidase in prostate cancer: a tumor promoter and suppressor. Cancer Res. 2005. 65(17). P. 7782-7789.

99. Kovar J.L., Johnson M.A., Volcheck W.M., Chen J., Simpson M.A. Hyaluronidase expression induces prostate tumor metastasis in an orthotopic mouse model. Am J Pathol. 2006. 169(4). P. 1415-1426.

100. Jacobson A., Rahmanian M., Rubin K., Heldin P. Expression of hyaluronan synthase 2 or hyaluronidase 1 differentially affect the growth rate of transplantable colon carcinoma cell tumors. Int J Cancer. 2002. 102(3). P. 212-219.

101. Simpson M.A. Concurrent expression of hyaluronan biosynthetic and processing enzymes promotes growth and vascularization of prostate tumors in mice. Am J Pathol. 2006. 169(1). P. 247-257.

102. Madan A.K., Yu K., Dhurandhar N., Cullinane C., Pang Y., Beech D.J. Association of hyaluronidase and breast adenocarcinoma invasiveness. Oncol Rep. 1999. 6(3). P. 607-609.

103. Lokeshwar V.B., Obek C., Soloway M.S., Block N.L. Tumor-associated hyaluronic acid: a new sensitive and specific urine marker for bladder cancer. Cancer Res. 1998. 58(14). P. 3191.

104. Franzmann E.J , Schroeder G.L., Goodwin W.J., Weed D.T., Fisher P. Lokeshwar V.B. Expression of tumor markers hyaluronic acid and hyaluronidase (HYAL1) in head and neck tumors. Int J Cancer. 2003. 106(3). P. 438-445.

105. Lokeshwar V.B., Cerwinka W.H., Lokeshwar B.L. . HYAL1 hyaluronidase: a molecular determinant of bladder tumor growth and invasion. Cancer Res. 2005. 65(6). P. 2243-2250.

106. Li R., Todd N.W., Qiu Q., Fan T., Zhao R.Y., Rodgers W.H., Fang H.B., Katz R.L., Stass S.A., Jiang F. Genetic deletions in sputum asdiagnostic markers for early detection of stage I non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2007. 13(2). P. 482-487.

107. Лукьянов K.A., Гурская Н.Г., Богданова E.A., Лукьянов С.А. Селективная супрессия полимеразной цепной реакции. Биоорганическая химия. 1999. (25)3. С. 163-170.

108. Фролов А.Е., Годвин Э.К., Фаворова О.О. Анализ дифференциальной экспрессии генов на кДНК-микрочипах и его применение в молекулярной онкологии. Молекулярная биология. 2003. 37(4). С. 573-584.

109. Gibson U.E., Heid С.A., Williams P.M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 1996. 6(10). P. 995-1001.

110. Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P.M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 1996. 6(10). P. 986-994.170. http://qpcr2005.gene-quantification.info

111. Livak K.J., Flood S.J., Marmaro J., Giusti W., Deets K. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Appl. 1995. 4. P. 357-362.

112. Bustin S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol. 2000. 25(2). P. 169-193.

113. Bustin S.A. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol Endocrinol. 2002. 29(1). P. 23-39.

114. Bernard P.S., Wittwer C.T. Real-time PCR technology for cancer diagnostics. Clin Chem. 2002. 48(8). P. 1178-1185.

115. Zhu Y.Y., Machleder E.M., Chenchik A., Li R., Siebert P.D. Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 2001. 30. P. 892-897.

116. Dheda K., Huggett J.F., Bustin S.A., Johnson M.A., Rook G., Zumla A. Validation of housekeeping genes for normalizing RNA expression in real-time PCR. Biotechniques. 2004. 37(1). P. 112-114, 116, 118-119.

117. Wong M.L., Medrano J.F. Real-time PCR for mRNA quantification. BioTechniques. 2005. 39. P. 1-11.

118. Radonic A., Thulke S., Mackay I.M., Landt O., Siegert W., Nitsche A. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. 313. P. 856-862.

119. Liu D.W., Chen S.T., Liu H.P. Choice of endogenous control for gene expression in nonsmall cell lung cancer. Eur Respir J. 2005. 26(6). P. 1002-1008.

120. Hahn W.C. Role of telomeres and telomerase in the pathogenesis of human cancer. J Clin Oncol. 2003. 21(10). P. 2034-2043.

121. Wang J., Liu X., Jiang W., Liang L. Telomerase activity and expression of the telomerase catalytic subunit gene in non-small cell lung cancer: correlation with decreased apoptosis and clinical prognosis. Chin Med J (Engl). 2000. 113(11). P. 985-990.

122. Hung J., Kishimoto Y., Sugio K., Virmani A., Mclntire D.D., Minna J.D., Gazdar A.F. Allele-specific chromosome 3p deletions occure at an early stage in the pathogenesis of lung carcinoma. JAMA. 1995. 6. P. 963-968.

123. Wistuba I.I., Gazdar A.F., Minna J.D. Molecular genetics of small cell lung carcinoma. Semin Oncol. 2001. 28. P. 3-13.

124. GeneCards database, http://bioinformatics.weizmann. ac.il/cards/

125. Couzin J. MicroRNAs make big impression in disease after disease. Science. 2008. 319(5871). P. 1782-1784.

126. Petersen S., Heckert C., Rudolf J., Schluns K., Tchernitsa O.I., Schäfer R., Dietel M., Petersen I. Gene expression profiling of advanced lung cancer. Int J Cancer. 2000. 86(4). P. 512-517.

127. McDoniels-Silvers A.L., Stoner G.D., Lubet R.A., You M. Differential expression of critical cellular genes in human lung adenocarcinomas and squamous cell carcinomas in comparison to normal lung tissues. Neoplasia. 2002. 4(2). P. 141-150.