Изменение метилирования промоторных областей семи генов хромосомы 3 человека в эпителиальных опухолях тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Ходырев, Дмитрий Сергеевич

• Ходырев, Дмитрий Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ходырев, Дмитрий Сергеевич

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста.

1.2. Современные подходы к поиску новых «онкозначимых» генов.j |

1.2.1. Анализ аллельных делеций.^

1.2.2. Участки хромосомы, подавляющие рост опухоли.

1.2.3. «Вычитающая» гибридизация как способ отбора онкогенов и генов-супрессоров опухолевого роста.

1.2.4. Применение микропанелей для поиска "онкозначимых" генов.

1.3 Эпигенетическая регуляция экспрессии генов в опухоли.

1.3.1 Метилирование ДНК.

1.3.2. CpG-островки в геноме человека.

1.3.3. Гипометилирование генома опухолей.

1.3.4. Гиперметилирование CpG-островков в геноме опухолей.

1.3.5. Эпигенетические механизмы инактивации генов.

1.3.6. МикроРНК человека и канцерогенез.

1.4. Подходы к анализу метилирования промоторных районов генов в эпителиальных опухолях.

1.5. Гены на коротком плече хромосомы 3, предположительно связанные с онкогенезом.

1.5.1. Ген RASSF1A (3р21.3).

1.5.2. Ген SEMA3B (3р21.3).

1.5.3. Ген RAR-beta 2 (3р23-р22.3).

1.5.4. Ген RHOAIARHA (3р21.31).

1.5.5. Геи USP4 (3р21.31).

1.5.6. Ген GPX1 (3р.21.31).

1.5.7. Ген NKIRAS1 (Зр24.2).

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Сбор материала.

2.2. Выделение геномной ДНК из ткани.

2.3. Анализ метилирования ДНК с применением метилчувствительных рестриктаз (МЧРА).

2.4. Бисульфитная конверсия ДНК.

2.5. Бисульфитное секвенирование.

2.6. Метил-специфичная полимеразная цепная реакция (МС-ПЦР).

2.7. Статистическая обработка результатов.5g

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Гиперметилирование промоторного района гена RASSF1A в опухолях разных локализаций, связь с прогрессией рака.

3.2 Два CpG-островка гена SEMA3B: метилирование в опухолях разных локализаций и связь с прогрессией рака.

3.3. Метилирование промоторного района гена RAR-beta2 в опухолях разных локализаций, связь с прогрессией рака.

3.4. Анализ метилирования промоторного района гена RHOA/ARHA в опухолях разных локализаций, связь с прогрессией рака.

3.5. Анализ метилирования промоторного района гена USP4 в опухолях разных локализаций, связь с прогрессией рака.

3.6. Анализ метилирования промоторного района гена GPX1 в опухолях разных локализаций, связь с прогрессией рака. Ю

3.7. Изменение метилирования 3-х участков протяженного CpG-островка в промоторном районе гена NKIRAS1 в опухолях разных локализаций, связь с прогрессией рака. Ю

3.8. Предпосылки для разработки новых диагностических и прогностических онкомаркеров.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изменение метилирования промоторных областей семи генов хромосомы 3 человека в эпителиальных опухолях»

Исследование молекулярно-биологических причин возникновения рака представляют собой одну из наиболее актуальных проблем здравоохранения. Онкологические заболевания занимают второе место в мире по причине смертности после сердечно-сосудистых заболеваний и в последнее десятилетие их частота неуклонно растет. Согласно современным представлениям, важную роль в процессе канцерогенеза играют как генетические, так и эпигенетические факторы.

Значительный прогресс в понимании механизмов канцерогенеза связан с открытием сначала онкогенов (и протонкогенов), или факторов позитивного контроля деления клеток, а затем - антионкогенов или генов-супрессоров опухолевого роста (TSG), осуществляющих негативный контроль клеточного роста. Онкогены активируются в опухолях по доминантному механизму и стимулируют развитие опухоли. Напротив, TSG инактивируются в опухолях по рецессивному типу с повреждением обоих родительских аллелей.

В случае сохранности некоторых критичных TSG (например, гена р53) в клетке, подверженной неопластическим изменениям, эти TSG могут вызвать остановку клеточного цикла или ее программируемую смерть (апоптоз), и таким образом, остановить или замедлить опухолевый рост (Чумаков, 1998, 2000). TSG могут также участвовать в подавлении нео-ангиогенеза, инвазии и метастазирования, в регуляции теломеразной системы. Некоторые TSG прямо или опосредованно участвуют в репарации мутаций, например, р53 задерживает клеточный цикл до исправления нарушений с помощью белков системы репарации.

С целью поиска генов, связанных с развитием опухолей, в первую очередь проводят картирование областей ДНК, часто делетируемых в раковых клетках, и исследуют подавление роста опухоли под действием фрагментов ДНК из этих районов. Количество картированных и клонированных генов, вовлеченных в канцерогенез, постоянно увеличивается. При выявлении новых генов-кандидатов сравнивают уровень их экспрессии (синтез м-РНК) в опухоли по сравнению с аналогичным паттерном в гистологически нормальных тканях. В регуляции экспрессии генов, связанных с развитием злокачественных опухолей, все большая роль отводится метилированию CpG-островков в их промоторных районах (Attwood et al., 2002; Jain et al., 2003; Hu et al., 2008; Lorente et al., 2009).

В последнее десятилетие число опубликованных работ, связанных с процессами эпигенетической модификации генов, превысило 14 тысяч, и число обзорных статей к 2000 г. достигло 200, а к 2009 г. более 1500. С одной стороны, вызывает интерес сложнейший механизм эпигенетической модификации, протекающей с участием многокомпонентных систем и разнообразных факторов, а с другой стороны, появилась принципиально новая платформа для отбора онкомаркеров. Сочетание этих специфических молекулярных маркеров позволяет определить прогноз развития заболевания, подобрать оптимальную тактику лечения и разработать современные методики, позволяющие проводить комплексный анализ определенного типа опухоли и ДНК-диагностику для конкретного пациента.

Целью данной работы являлось изучение метилирования промоторных областей семи генов хромосомы 3: RASSF1A, SEMA3B, RAR-beta2, RHOA/ARHA, USP4, GPX1, NKIRAS1, с целью поиска молекулярных маркеров, а также подбора информативных систем маркеров, необходимых для ранней диагностики и мониторинга рака легкого, молочной железы и почки.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Ходырев, Дмитрий Сергеевич

выводы

1. Впервые обнаружено метилирование не исследованного ранее дистального промоторного CpG-островка гена SEMA3B в опухолях почки, легкого и молочной железы. Показано, что частота метилирования промоторного CpG-островка в 1,5 раза выше, чем интронного в опухолях разных локализаций. Выявлены корреляции частоты метилирования промоторного CpG-островка гена SEMA3B с прогрессией 3-х видов опухолей, а интронного с прогрессией РМЖ и НМКРЛ.

2. Впервые показана высокая частота метилирования промоторного района гена RAR-beta2 при ПКР (59%), а также установлена достоверная корреляция частоты метилирования этого гена с прогрессией ПКР и РМЖ.

3. Выявлена корреляция частоты метилирования промоторного района гена RASSF1A с клинической стадией и степенью анаплазии опухоли молочной железы.

4. Впервые исследование метилирование промоторных районов генов RHOA, USP4, GPX1, NK1RAS1 в опухолях разных локализаций. Обнаружено частое деметилирование гена RHOA при НМКРЛ и гена NKIRAS1 при РМЖ и НМКРЛ. Показан опухоль-специфичный характер изменения профиля метилирования промоторной области гена USP4. Выявлены корреляции уровня метилирования промоторных CpG-островков генов RHOA и USP4 с клинической стадией и степенью анаплазии немелкоклеточного рака легкого. Установлена корреляция уровня метилирования CpG-островка гена NKIRAS1 с прогрессией немелкоклеточного рака легкого: с клинической стадией, степенью анаплазии и размером опухоли, а также с метастазированием в регионарные лимфатические узлы.

5. Составлены панели информативных маркеров, позволяющие с высокой чувствительностью выявлять опухоль молочной железы (в 80% случаев), опухоль почки (в 68% случаев) и немелкоклеточный рак легкого (в 89% случаев).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ходырев, Дмитрий Сергеевич, 2009 год

1. Абелев Г. И., Эрайзер Т. JI. На пути к пониманию природы рака. Обзор. Биохимия, 2008, 73(5),605-618.

2. Ванюшин Б.Ф. Метилирование ДНК и эпигенетика. Генетика, 2006, 42(9), 1186— 1199.

3. Д.В.Залетаев, М.В.Немцова, В.В.Стрельников, О.В.Бабенко, Е.В.Васильев, В.В.Землякова, А.И.Жевлова, О.В.Дрозд Диагностика эпигенетической патологии при наследственных и онкологических заболеваниях. Молекулярная биология, 2004, 38(2), 213-223

4. Забаровский Е.Р. Новые стратегии клонирования идентичных и различающихся фрагментов ДНК из сложных геномов. Молекуляр. биология, 2000, 34, 612-625.

5. Киселев JI.JL, Сенченко В.Н., Опарина Н.Ю., Брага Э.А., Забаровский Е.Р. Гены-супрессоры опухолевого роста, локализованные на коротком плече хромосомы 3 человека. Молекулярная медицина, 2005,3, 17-28.

6. Киселев Ф.Л. Гены стабилизации ДНК и канцерогенез. Молекуляр. биология, 1998, 32, 197205.

7. Киселева Н.П., Киселев Ф.Л. Деметилирование ДНК и канцерогенез (обзор) Биохимия, 2005, 70, 900-912

8. Кленов М.С., Гвоздев В.А. Биохимия, 2005, 70, 1445-1458.

9. Копнин Б.П. 2000.0пухолевые супрессоры и мутаторные гены. Сборник обзорных статей «Канцерогенез», под ред. Д.Г. Заридзе, М: Научи, мир, стр. 75-92.

10. Логинов В.И., Ходырев Д.С., Пронина И.В., Малюкова А.В., Казубская Т.П., Ермилова В.Д., Гарькавцева Р.Ф., Забаровский Е.Р., Брага Э.А. 2009. Два CpG-островка гена SEMA3B: метилирование при светлоклеточном раке почки. Молекуляр. Биология, 43

11. Пронина И.В., Логинов В.И., Прасолов B.C. и др. 2009. Изменение уровней экспрессии гена SEMA3B в эпителиальных опухолях. Молекуляр. Биология, 43(3), 439-445.

12. Пфайфер Г.П., Дамманн Р. Метилирование гена опухолевого супрессора RASSFIA в человеческих опухолях. 2005, Биохимия, 70, 699-708.

13. Ровенский Ю.А. и Васильев Ю.М. Морфогенетические реакции клеток и их нарушения при опухолевой трансформации. 2000. Сборник обзорных статей «Канцерогенез», под ред. Д.Г. Заридзе, М: Научн. Мир, стр. 260-283.

14. Рогаев Е.И., Боринская С.А., Исламгулов Д.В., Григоренко А.П. МикроРНК человека в норме и патологии. 2008, Молекулярная биология, 42(5), 751-764.

15. Рязанский С.С., Гвоздев В.А. Короткие РНК и канцерогенез. 2008, Биохимия, 73(5), 640-655.

16. Саложин С.В., Прохорчук Е.Б., Георгиев Г.П. Метилирование ДНК как один из основных эпигенетических маркеров. Биохимия, 2005, 70, 641-651

17. Татосян А.Г. 2000. Онкогены. Сборник обзорных статей «Канцерогенез», под ред. Д.Г. Заридзе, М: Научн. Мир, стр. 57-74.

18. Чумаков П.М. Роль р53 в программируемой клеточной смерти. Изв. Акад. Наук, сер. Биология, 1998,2, 151-156.19.22.