Поиск и характеристика онко-ассоциированных генов на хромосоме 3 человека с помощью сравнительной геномной гибридизации на NotI-микрочипах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Павлова, Татьяна Владимировна

• Павлова, Татьяна Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Павлова, Татьяна Владимировна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гены - супрессоры опухолевого роста

1.2. Эпигеномные изменения при канцерогенезе

1.2.1. Эпигеномные процессы

1.2.2. CpG островки и метилирование ДНК

1.2.3. Метилтрансферазы

1.2.4. Метилирование опухолевого генома 23 1.3. Локализация ряда TSG на хромосоме 3 человека

1.3.1. Нарушения на хромосоме 3 в карциномах различных органов

1.3.2. Анализ 3p21.3C - LUCA-региона

1.3.3. Анализ 3p21.3T- АР20-региона 32 1.4. Сравнительная геномная гибридизация (Comparative genome hibridization, CGH)

1.4.1. Современные методы CGH на микрочипах

1.4.2. Notl-микрочипы

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.1.1. Генетические конструкции для трансфекции клеток

RBSP3 и RASSF1A

2.1.2. Фрагменты геномной ДНК и кДНК генов

2.1.3. Клеточные линии

2.1.4. Образцы биопсий опухоли и нормальной ткани

2.2. Методы

2.2.1. Изготовление Notl-микрочипов

2.2.2. Блокировка микрочипов

2.2.3. Методика получения Notl-обогащенных ДНК-проб для

2.2. Методы

2.2.1. Изготовление Notl-микрочипов

2.2.2. Блокировка микрочипов

2.2.3. Методика получения Notl-обогащенных ДНК-проб для гибридизации

2.2.4. Гибридизация Notl-обогащенных проб

2.2.5. Анализ результатов гибридизации

2.2.6. Трансфекция и селекция позитивных клонов

2.2.7. Тест на эффективность формирования колоний

2.2.8. Тест на эффективность формирования колоний в жидком агаре

2.2.9. Формирование опухоли в иммунодефицитных мышах

2.2.10. Стандартные биологические процедуры 49 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Модификация технологии сравнительной геномной гибридизации с Notl-микрочипами

3.1.1. Nqtl-микрочипы

3.1.2. Модифицированная технология подготовки Notl-обогащенных проб ДНК для гибридизации с Notl-микрочипами

3.1.3. Обработка результатов гибридизации

3.1.4. Особенности биоинформатической обработки результатов гибридизации

3.1.5. Преимущества метода гибридизации на Notl-микрочипах

3.2. Эпигеномные и структурные изменения хромосомы 3, выявленные гибридизацией на Notl-микрочипах в разных типах опухоли

3.3. Анализ метилирования геномных Notl-локусов, показавших изменения в результате гибридизации на Notl-микрочипах, с помощью независимых методов

3.3.1. Бисульфитное секвенирование Notl-локусов

3.3.2. Метил-специфичная амплификация Notl-локусов

3.4. Анализ метилирования TSG RASSF1A из хромосомы 3 человека и RASSF2 из хромосомы 20 в опухолях и раковых клеточных линиях

3.4.1. Семейство генов RAS

3.4.2. Эпигеномная регуляция гена RASSF

3.4.3. Анализ метилирования RASSF2 в раковых клеточных линиях молочной железы

3.4.4. Анализ метилирования промоторов генов RASSF2 и RASSF1A в опухоли молочной железы, HMPJI и яичника

3.5. Проверка опухоль-подавляющей способности гена RASSF in vitro и in vivo

3.5.1. Тест на формирование колоний

3.5.2. Тест на формирование колоний в жидком агаре

3.5.3. Формирование опухоли в иммуннодефицитных мышах с RASSF

3.6. Анализ мутационных изменений TSGRASSF1 иRBSP3 из хромосомы Зр человека в образцах опухолей и раковых клеточных линиях

3.6.1. Частота мутаций в гене RASSF1A

3.6.2. Поиск первичных мутаций в гене RASSF1A в клонах из единичной клетки

3.6.3. Частота мутаций RBSP

3.6.4. Сравнение частоты мутаций в генах RASSF1A и RBSP3 с мутациями в других генах

3.6.5. Влияние мутаций в генах RASSF1A и RBSP3 на их опухоль-подавляющую способность

3.6.6. Поиск мотивов - мишеней в генах RASSF1A и RBSP3 88 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

MPJT - мелкоклеточный рак легкого

МСП - метил-специфичная полимеразная цепная реакция

HMPJI - немелкоклеточный рак легкого

ПЦР (PCR) - полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ - ПЦР в реальном времени

ФБС - фетальная бычья сыворотка

5-aza-2dC - 5-аза-2'деоксицитидин

CoBRA - combined bisulphite restriction analysis, комбинированного бисульфитного рестрикционного анализа

GIT - gene inactivation test, тест на инактивацию гена

LOH (Lost of heterozygosity) - потеря гетерозиготности

LUCA (Lung cancer) - рак лёгкого

NMA (Notl-microarray) - Notl-микрочип

RNAP II - РНК-полимераза II

SCID - тяжёлая комбинированная иммунная недостаточность

SCP - семейство малых CTD-фосфатаз

SDS - (Sodium Dodecyl Sulfat) додецил сульфат натрия

SSC - (Saline-Sodium Citrate buffer) цитрат натрия

SSCP - анализ полиморфизма одиночной нуклеотидной цепочки

TSG - tumor supressor gene, ген-супрессор опухолевого роста

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Поиск и характеристика онко-ассоциированных генов на хромосоме 3 человека с помощью сравнительной геномной гибридизации на NotI-микрочипах»

Актуальность проблемы

Разработка и совершенствование методик диагностики и терапии раковых заболеваний является актуальной задачей современной науки и медицины. Метилирование генов-супрессоров опухолевого роста (tumor supressor gene, TSG) является одним из ранних событий канцерогенеза, которое может быть диагностировано значительно раньше других изменений в организме. В связи с этим поиск новых TSG как опухолевых маркеров представляет большой интерес.

Показано, что короткое плечо хромосомы 3 (Зр) человека содержит факторы, обладающие способностью подавлять опухолевый рост и подвержено частым аберрациям при многих видах рака; поэтому высказано мнение, что Зр - вероятный участок локализации целого ряда генов-супрессоров опухоли (Killary et al., 1992; Kok et al., 1997; Zabarovsky et al., 2002; Braga et al., 2002; Angeloni, 2007), однако, в настоящее время в этом большом (100 млн.п.н.) районе удалось выделить и охарактеризовать всего несколько TSG. Широко охарактеризованы только некоторые из них: ген VHL (Зр25), подавляющий активность РНК-полимеразы II на стадии элонгации, ген системы репарации MLH1 (Зр22) и ген RASSF1A (Зр21), вовлеченный в регуляцию клеточного цикла. Не вызывает сомнений необходимость более детального анализа этого участка генома для выявления новых TSG.

Одновременное использование комбинаций нескольких маркеров повышает эффективность диагностики опухолей. В этой связи важной задачей является разработка методик мультиплексного скрининга маркеров канцерогенеза и все большее значение приобретает технология микрочипов, которая позволяет одновременно анализировать десятки тысяч генов. (Gray and Collins, 2000; Trevino et al., 2007). Бурно развивающаяся технология микрочипов позволяет изучать дифференциальную экспрессию генов и является эффективным методом в поиске новых генов, вовлеченных в различные заболевания. (Su et al., 2001; Macgregor et al., 2003).

Создание новых ДНК-микрочипов имеет принципиальное значение для получения информации, не доступной на уровне мРНК (кДНК): гетерозиготные делеции, метилирование ДНК, ацетилирование гистонов. Метилирование и другие эпигеномные факторы, как известно, являются одними из ключевых механизмов регуляции экспрессии генов и играют важную роль в канцерогенезе. Эпигеномные изменения могут быть определены на ранних стадиях заболевания и использованы для ранней диагностики опухолей и прогноза раковых заболеваний.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы является поиск и характеристика новых генов-супрессоров опухолевого роста на хромосоме 3 человека с помощью технологии гибридизации на Notl-микрочипах.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Модифицирование методики сравнительной геномной гибридизации на Notl-микрочипах для скринирования хромосомы 3 человека.

2. Анализ геномных и эпигеномных изменений хромосомы 3 человека в образцах опухолей с использованием разработанных Notl-микрочипов и поиск новых кандидатов в TSG.

3. Исследование изменений геномных локусов, выявленных гибридизацией на Notl-микрочипах, с помощью независимых методов: метил-специфичной ПЦР (МСП) и бисульфитного секвенирования.

4. Проверка взаимосвязи метилирования генов - кандидатов в TSG с их экспрессией в образцах эпителиальных опухолей.

5. Сравнение данных по метилированию и опухоль-подавляющей способности TSG RASSF1A и TSG-кандидата RASSF2 в клеточных линиях и образцах опухолей различной локализации.

6. Оценка способности TSG-кандидата RASSF2 к подавлению опухолевого роста в культуре клеток и у иммунодефицитных мышей.

7. Определение частоты возникновения мутаций в TSG RASSF1A и RBSP3 хромосомы Зр человека в раковых клеточных линиях и образцах эпителиальных опухолей.

Научная новизна работы

В работе модифицирована технология сравнительной геномной гибридизации на Notl-микрочипах, созданных с использованием Notl-связующих клонов (Zabarovsky et al., 1990; Li et al., 2002, международный патент W002/086163). Нами использованы Notl-микрочипы для скрининга хромосомы 3 человека, позволяющие одновременно анализировать 181 Notl-ассоциированный сайт хромосомы 3. Внесен ряд изменений в процесс подготовки проб ДНК-зондов для гибридизации на Notl-микрочипах:

-использование рестриктазы Sau3AI в комбинации с NotI, дающее возможность получать короткие фрагменты геномной ДНК, эффективно гибридизующиеся на микрочипах;

-использование биотинилированного Notl-линкера и стрептавидиновых магнитных шариков, позволяющее избавляться от метилированных фрагментов ДНК и от повторов геномной ДНК, которые существенно занижают силу сигнала при гибридизации.

Отработаны условия машинной гибридизации ДНК-проб на Notl-микрочипах.

Модифицирована математическая обработка результатов гибридизации на микрочипах.

С помощью модифицированной технологии сравнительной геномной гибридизации на Notl-микрочипах проанализированы геномные и эпигеномные изменения хромосомы 3 человека в 250 образцах эпителиальных опухолей и лейкемии. Показано, что причиной инактивации TSG, локализованных в хромосоме 3, могут быть не только мутации и делеции, но и метилирование их промоторных областей. На основании результатов гибридизации на Notl-микрочипах и бисульфитного секвенирования метилирование NotI -локусов в генах RARbetal, ITGA9, MINT24, ZIC4, VHL, RBSP3, BHLHB2, GATA2, UBE2E2, LRRC3B выявлено более чем в 30% образцов опухолей различной локализации. Метилирование генов BHLHB2, ITGA9, ZIC4, GATA2 при канцерогенезе показано впервые.

Обнаружена взаимосвязь между снижением экспрессии гена RASSF2 и метилированием его промоторной области в клетках рака молочной железы, образцах немелкоклеточного рака легкого (HMPJI) и рака молочной железы. Экспериментально установлено, что обработка с 5-aza-2dC способна восстановить экспрессию RASSF2 в тех раковых клеточных линиях молочной железы, в которых прежде наблюдалось метилирование. В данной работе впервые показана способность гена RASSF2A подавлять рост клеток рака молочной железы in vitro и в иммунодефицитных мышах. Обнаружено, что в образцах опухоли почки и HMPJI, где метилированы промоторные области генов HYAL2, RBSP3, RASSF1A, ITGA9, снижен уровень мРНК этих генов.

Впервые выявлена повышенная частота мутаций в генах-супрессорах опухолевого роста RASSF1A и RBSP3 и показано, что мутации могут снижать опухоль-подавляющую способность этих генов.

Практическая значимость работы

Практическая ценность работы заключается в модификации методики гибридизации на Notl-микрочипах, позволяющей одновременно определять наличие геномных и эпигеномных изменений в геноме опухолевых клеток.

Модифицированная методика позволяет достаточно быстро выявлять новые онко-ассоциированные гены. Идентифицированные в данной работе новые 10 генов-кандидатов в TSG на хромосоме 3 человека могут быть использованы в качестве маркеров для ранней диагностики и мониторинга эффективности лечения онкозаболеваний, а также представляют потенциальный интерес для генной терапии.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гены — супрессоры опухолевого роста

В основе образования злокачественных клеток и опухолей лежат наследственные или случайные дефекты генома. Большинство раковых заболеваний возникает из-за мутаций ДНК, приводящих к изменению функционирования генов, которые регулируют нормальное деление, рост, дифференцировку и старение клеток. В результате происходит образование постоянно пролиферирующих раковых клеток, которые, разрастаясь, могут привести к гибели целый организм.

На сегодняшний день признано, что рак возникает в результате комплексного процесса. Для 17 наиболее часто встречаемых типов рака была обнаружена логарифмическая зависимость частоты заболеваний от возраста (Armitage et al., 1954), которая указывает на то, что этому процессу предшествует множество событий. На основании этих данных был сделан вывод о том, что карциногенез — это сложный процесс, включающий в себя, по крайней мере, 6 или 7 стадий. В настоящее время разработана модель многостадийной прогрессии рака кишечника от аденомы до карциномы, в которой указано, что развитие спорадических форм данного клинического вида рака происходит в шесть стадий с участием различных классов генов: генов — супрессоров раковой опухоли, онкогенов и генов, вызывающих мутации (Sharrard et al., 1992).

Гены - супрессоры раковой опухоли принимают непосредственное участие в контроле клеточного цикла, обеспечивают клеточные контакты, поддерживают стабильность генома. Потеря или инактивация таких генов является онкогенной. Мутации генов — супрессоров раковой опухоли в зародышевых клетках (первичных клетках) являются предпосылкой развития рака. При спорадических формах рака обнаружены мутации этих же генов в соматических клетках (Tomlinson et al., 1996).

Открытие новых qTSG расширяет возможности создания маркеров для ранней диагностики и прогностики рака, а также создает основу для разработки подходов к генотерапии онкологических заболеваний. Локализация, идентификация и понимание функций генов — супрессоров опухолевого роста составляют одно из главных направлений в исследовании рака.

Изучение гибридов соматических клеток, полученных в результате слияния нормальных и опухолевых клеток, показало утрачивание злокачественных свойств гибридными клетками, т.е. подавление злокачественного фенотипа. Гибриды клеток проявляли себя как нормальные клетки при введении в организм иммуно-компромиссного хозяина, что указывало на их первоначальную неонкогенность. Однако, было установлено, что гибриды восстанавливали способность образовывать опухоль в случае утраты хромосом или участков хромосом, несущих гены-супрессоры раковой опухоли (Harris et al., 1986; Harris et al., 1988). Доказательством существования генов-супрессоров раковой опухоли в геноме человека является подавление роста разных типов опухолей, наблюдаемое при слиянии опухолевых клеток с микроклетками человека, содержащими отдельные хромосомы человека (Sager et al., 1985, 1986) .

В большинстве случаев для подавления роста опухоли in vitro или in vivo достаточным является введение единственной копии нормальной хромосомы (Sager et al., 1985, 1986; Shimizu et al., 1990; Tanaka et al., 1991; Dowdy et al., 1991; Banerjee et al., 1992).

Изучение наследственных онкологических заболеваний предоставило новые доказательства существования генов-супрессоров раковой опухоли. Кнудсон выдвинул гипотезу двух ударов (two-hits hypothesis), основанную на статистическом анализе частоты возникновения ретинобластомы в зависимости от возраста для наследственной и спорадической формы болезни. Согласно этой гипотезе возникновение ретинобластомы является результатом двух последовательных мутационных событий на двух аллелях одного и того же гена. Гипотеза Кнудсона в значительной степени способствовала открытию гена ретинобластомы (RB) в 1986 (Knudson, 1985; Klein, 1987). С тех пор было идентифицировано около 30 генов-супрессоров раковой опухоли, которые участвуют в контроле клеточного цикла, регулируют рост и транскрипцию, передачу сигналов, ангиогенезис и развитие, что указывает на широкий спектр функций этих генов. Предполагается, что гены-супрессоры раковой опухоли могут найти широкое применение в антиопухолевой терапии.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Павлова, Татьяна Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Модифицирована технология сравнительной геномной гибридизации на Notl-микрочипах, разработанных в Каролинском институте Швеции. В результате ряда модификаций в протоколе подготовки проб ДНК-зондов, повышена эффективность гибридизации и интенсивность флуоресцентного сигнала. Усовершенствована система обработки результатов гибридизации.

2. Проанализированы изменения хромосомы 3 в 250 образцов рака почки, шейки матки, молочной железы, яичника, легкого, простаты, кишечника, лейкемии с помощью модифицированной методики гибридизации на Notl-микрочипах. Более чем в 30% образцов опухолей выявлены метилирование/гетерозиготные делеции Notl-ассоциированных локусов 10 генов хромосомы 3 человека: RARbetal, ITGA9, MINT24, ZIC4, VHL, RBSP3, BHLHB2, GATA2, UBE2E2, LRRC3B.

3. Метилирование геномных Notl-локусов в биопсиях опухолей подтверждено с помощью независимых методов: МСП и бисульфитным секвенированием для большинства образцов опухоли.

4. Обнаружено, что в биопсиях опухолей с метилированными/делетированными промоторами генов HYAL2, ITGA9, RBSP3, NPRL2, RASSF1A и RASSF2 экспрессия этих генов снижена от двух до ста раз, что позволяет рассматривать эти гены как потенциальные маркеры для ранней диагностики эпителиальных опухолей.

5. Выявлено метилирование промоторов генов RASSF1A и RASSF2 в образцах опухоли молочной железы и HMPJL В образцах опухоли яичника промотор гена RASSF1A метилирован, промотор RASSF2 — нет. Не обнаружено корреляции между статусами метилирования RASSF1A и RASSF2, что свидетельствует о независимости процессов метилирования этих двух локусов и о том, что они не являются частью генерализованно метилированного фенотипа.

6. Впервые показана способность гена RASSF2 подавлять рост опухолевых клеток молочной железы в культуре и в иммунодефицитных мышах, что подтверждает его свойства как гена-супрессора опухолевого роста и может служить для разработки новых терапевтических методов.

7. Обнаружена исключительно высокая частота спонтанного возникновения мутаций в генах RASSF 1А (0.23 на 100 п.н.) и RBSP3 (0.10 на 100 п.н.) хромосомы 3. Это первые гены в негематопоэтических клетках, для которых показан такой высокий уровень мутаций. Продемонстрировано, что мутации могут снижать способность RASSF1A и RBSP3 к подавлению опухолевого роста.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе впервые представлена модифицированная технология сравнительной геномной гибридизации на Notl-микрочипах, перспективная для масштабного скринирования структурных (делении и амплификации) и эпигеномных (метилирование) изменений в геномах опухолевых клеток. Информация об этих изменениях может служить предварительной базой для выявления потенциальных генов-супрессоров опухолевого роста и наиболее перспективных опухолевых маркеров. Описанная модифицированная технология приготовления NotI-npo6 из геномной /ТНК" для сравнительной геномной гибридизации имеет три основных преимущества. Первое: использование чувствительной к метилированию рестриктазы NotI, благодаря чему не только в случае делеции, но и в случае гомо- или гемизиготного метилирования Notl-сайта в меченой пробе этот локус отсутствует полностью или частично. Второе: использование рестриктазы Sau3AI в паре с NotI, позволяющее получать короткие фрагменты меченой ДНК размером от 100 до 500 п.н. Третье: биотинилированный Notl-линкер дает возможность избавиться от фрагментов ДНК, не содержащих Notl-сайта и потому не связавшихся с магнитными шариками. В результате, гибридизационная проба, в основном, обогащена короткими ДНК-последовательностями, гомологичными Notl-связующим клонам. При этом в пробе остается и метится флуоресцентными красителями только 0.1-0.5% ДНК полного генома.

Метод Notl-микрочипов может быть применен для сканирования всего генома человека либо для определенной его части.

В данной работе проведен пилотный эксперимент, в котором с помощью Notl-микрочипов к хромосоме 3 нами проанализированы изменения на этой хромосоме в 250 образцах опухолей: 40 образцах рака легкого, 43 образцах рака шейки матки, 39 - рака почки, 47 - рака молочной железы, 20 - рака яичника, 8 - рака простаты, 24 - рака кишечника, 20 образцов лейкемии.

Метилирование Notl-локусов генов RARbetal, ITGA9, MINT24, ZIC4, VHL, RBSP3, BHLHB2, GATA2, RPL15, THRB выявлено на Notl-микрочипах и подтверждено с помощью МСП и бисульфитного секвенирования в 30-60% образцов. Участие некоторых из этих генов в развитии опухолевых заболеваний той или иной локализации было ранее описано в литературе: RBSP3 (Kashuba et al., 2004), MINT24 (Toyota et al., 1999), VHL (Kuroki et al., 2003).

Метилирование промоторов генов BHLHB2, ITGA9, ZIC4, GATA2 при канцерогенезе ранее не описано в литературе. Для геномных локусов hmm210782, hmm57278, hmml44092, NBEAL2, FLJ32332, продемонстрировавших изменения больше чем в 30% образцов опухоли, не найдено литературных данных об их связи с онкозаболеваниями либо отсутствует информация об их функциях. Представляется интересным дальнейшее изучение роли этих генов в канцерогенезе.

Для генов HYAL2, ITGA9, RBSP3, NPRL2, RASSF1A и RASSF2 показана корреляция снижения уровня мРНК с метилированием промоторов генов в образцах опухоли.

Нами показано метилирование промоторов генов семейства RAS: RASSF1A (Зр21) - 56% и RASSF2 (20р13) - 38%, в образцах опухоли молочной железы.

В образцах опухоли яичника обнаружено метилирование только RASSF1A (59%), но не RASSF2 (0/17).

Метилирование RASSF2 выявлено в 44% образцов HMPJI. В литературе сообщалось о метилировании гена RASSF1A в 34% тех же образцов (Agathanggelou et al., 2001).

Не выявлено корреляции между статусами метилирования RASSF1A и RASSF2 в проанализированных образцах, что свидетельствует о независимости процессов метилирования этих двух локусов и о том, что они не являются частью генерализованно метилированного фенотипа.

Показано метилирование промотора RASSF2 в 13 из 20 (65%) клеточных линий рака молочной железы, где экспрессия гена снижена или отсутствовала. В результате обработки клеточных линий с «молчащим» из-за метилирования промотора RASSF2 с помощью 5-aza-2dC (5-аза-2'деоксицитидином) экспрессию гена реактивировали. Отсюда следует предварительное заключение, что утрата экспрессии RASSF2 коррелирует с метилированием промотора гена в раковых клеточных линиях молочной железы.

Все полученные нами и описанные ранее данные предполагают, что метилирование промоторов TSGs RASSF 1А и RASSF2 - ранние, частые и специфичные для опухоли события для ряда эпителиальных опухолей (включая HMPJI, молочную железу, кишечник). RASSF1A и RASSF2 можно рассматривать как потенциальные маркеры для ранней диагностики раковых заболеваний. Впервые показано, что экспрессия RASSF2 значительно подавляет рост опухолевых клеток молочной железы MCF7 в культуре (20% колоний от числа колоний контрольных клеток) и в иммунодефицитных мышах. Эндогенная экспрессия гена в клетках MCF7 отсутствует вследствие метилирования промоторной области. Предполагается возможность разработки новых терапевтических методов с использованием RASSF2, учитывая показанную им сильную опухоль-подавляющую способность.

Подводя итоги, можно сказать, что метилирование промоторов ряда генов из хромосомы 3 человека — раннее и частое событие в различных эпителиальных опухолях, вызывающее полное или частичное подавление экспрессии. Возможность открытия метилирования TSG на ранних стадиях канцерогенеза может стать революционным в диагностике рака, так как позволит существенно раньше выявлять и прогнозировать возникновение онкологических заболеваний.

Впервые обнаружена исключительно высокая частота спонтанного возникновения единичных мутаций в генах-супрессорах опухолевого роста RASSF1A (0.23 на 100 п.н.) и RBSP3 (0.10 на 100 п.н.) из хромосомы Зр, in vitro и in vivo. В нашей работе впервые показан такой высокий уровень мутаций. Частота мутаций RASSF1A и RBSP3 сходна с таковой для онкогенов Rho/TTF (0.17), МУС (0.12) и BCL6 (0.69) в крупноклеточных лимфомах (Pasqualucci et al., 2001). Продемонстрировано, что мутации могут снижать опухоль-подавляющую способность генов.

Следует отметить, что продукты генов RASSF1A (TSG из региона LUCA) и RBSP3 (TSG из региона АР20) могут вместе участвовать в индуцировании остановки клеточного цикла: первый ингибирует циклин D1, а второй активирует pRB белок.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Павлова, Татьяна Владимировна, 2009 год

1. Ванюшин Б. Ф. Метилирование ДНК и эпигенетика. Генетика. 2006. 9, 1186-1189.

2. Корочкин JI. И. Что такое эпигенетика. Генетика. 2006. 9, 1156-1164.

3. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. М.: Наука, 2000. 527 с.

4. Allen NP, Donninger H, Vos MD, Eckfeld K, Hesson L, Gordon L, Birrer MJ, Latif F, Clark GJ. RASSF6 is a novel member of the RASSF family of tumor suppressors. Oncogene. 2007.26, 6203-6211.

5. Allikmets R, Kashuba VI, Huebner K, LaForgia S, Kisselev LL, Klein G, Dean M, Zabarovsky ER. Mapping of 22 Notl linking clones on human chromosome 3 by polymerase chain reaction and somatic cell hybrid panels. Chromosome Res. 1996. 1,33-37.

6. Allikmets RL, Kashuba VI, Pettersson B, Gizatullin R, Lebedeva T, Kholodnyuk ID, Bannikov VM, Petrov N, Zakharyev VM, Winberg G. Notl linking clones as a tool for joining physical and genetic maps of the human genome. Genomics. 1994. 19, 303-309.

7. Alves G, Tatro A, Fanning T. Differential methylation of human LINE-1 retrotransposons in malignant cells. Gene. 1996. 176, 39-44.

8. Angeloni D, Duh FM, Wei MF, Johnson BE, Lerman MI. A G-to-A single nucleotide polymorphism in intron 2 of the human CACNA2D2 gene that maps at 3p21.3. Mol Cell Probes. 2001. 15, 125-127.

9. Angeloni D. Molecular analysis of deletions in human chromosome 3p21 and the role of resident cancer genes in disease. Brief Funct Genomic Proteomic. 2007. 6, 19-39. Review.

10. Antequera F., Bird A. Number of CpG islands and genes in human and mouse. Proc Natl Acad Sci USA. 1993. 90, 11995-11999.

11. Arenstorf HP, Kandpal RP, Baskaran N, Parimoo S, Tanaka Y, Kitajima S, Yasukochi Y, Weissman SM. Construction and characterization of a Notl-BsuE linking library from the human X chromosome. Genomics. 1991 11, 115-123.

12. Armitage P., Doll R. The age distribution of cancer and a multi-stage theory of carcinogenesis. Br J Cancer. 1954. 8, 1-12.

13. Batova A, Diccianni MB, Yu JC, Nobori T, Link MP, Pullen J, Yu AL. Frequent and selective methylation of pi 5 and deletion of both pi 5 and pl6 in T-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Res. 1997. 57, 832-836.

14. Baylin SB, Hoppener JW, de Bustros A, Steenbergh PH, Lips CJ, Nelkin BD. DNA methylation patterns of the calcitonin gene in human lung cancers and lymphomas. Cancer Res. 1986. 46, 2917-2922.

15. Baylin SB, Herman JG, Graff JR, Vertino PM, Issa JP. Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect of neoplasia. Adv Cancer Res. 1998. 72, 141-196.

16. Baylin and Herman, DNA hypermethylation in tumorigenesis: epigenetics joins genetics.Trends Genet. 2000. 16, 168-174. Review.

17. Belinsky SA. Role of the cytosine DNA-methyltransferase and pl6INK4a genes in the development of mouse lung tumors. Exp Lung Res. 1998. 24, 463-479.

18. Bhattacharya SK, Ramchandani S, Cervoni N, Szyf M. A mammalian protein with specific demethylase activity for mCpG DNA. Nature. 1999. 397, 579-583.

19. Beale RC, Petersen-Mahrt SK, Watt IN, Harris RS, Rada C, Neuberger MS. Comparison of the differential context-dependence of DNA deamination by APOBEC enzymes: correlation with mutation spectra in vivo. J Mol Biol. 2004. 337, 585-596.

20. Bird A.P. The relationship of DNA methylation to cancer. Cancer Surv. 1996. 28, 87-101. Review.

21. Bird A, Taggart M, Frommer M, Miller OJ, Macleod D. A fraction of the mouse genome that is derived from islands of nonmethylated, CpG-rich DNA. Cell. 1985. 40, 91-99.

22. Brena R.M., Huang Т.Н., Plass C. Quantitative assessment of DNA methylation: Potential applications for disease diagnosis, classification, and prognosis in clinical settings. J. Mol. Med. 2006. 84, 365-377.

23. Bouchard J, Momparler RL. Incorporation of 5-Aza-2'-deoxycytidine-5'-triphosphate into DNA. Interactions with mammalian DNA polymerase alpha and DNA methylase. Mol Pharmacol. 1983. 24, 109-114.

24. Brandeis M, Frank D, Keshet I, Siegfried Z, Mendelsohn M, Nemes A, Temper V, Razin A, Cedar H. Spl elements protect a CpG island from de novo methylation. Nature. 1994. 371, 435-438.

25. Cheng Y, Poulos NE, Lung ML, Hampton G, Ou B, Lerman MI, Stanbridge EJ. Functional evidence for a nasopharyngeal carcinoma tumor suppressor gene that maps at chromosome 3p21.3. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998. 95, 3042-3047.

26. Chuang LS, Ian HI, Koh TW, Ng HH, Xu G, Li BF. Human DNA-(cytosine-5) methyltransferase-PCNA complex as a target for p21WAFl. Science. 1997. 277, 1996-2000.

27. Clark SJ, Harrison J, Paul CL, Frommer M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 1994. 22, 2990-2997.

28. Conticello SG, Thomas CJ, Petersen-Mahrt S, Neuberger MS. Evolution of the AID/APOBEC family of polynucleotide (deoxy)cytidine deaminases. Mol Biol Evol. 2005. 22, 367-377.

29. Cooper DN, Taggart MH, Bird AP. Unmethylated domains in vertebrate DNA. Nucleic Acids Res. 1983. 11, 647-658.

30. Cooper DN, Youssoufian H.The CpG dinucleotide and human genetic disease. Hum Genet. 1988. 78, 151-155.

31. Costello JF, PI ass C. Methylation matters. J Med Genet. 2001. 38, 285303.

32. Costello JF, Smiraglia DJ, Plass C. Restriction landmark genome scanning. Methods 2002;27:144-149

33. Cross SH, Charlton JA, Nan X, Bird AP. Purification of CpG islands using a methylated DNA binding column. Nat Genet. 1994. 6, 236-244.

34. Cross SH, Lee M, Clark VH, Craig JM, Bird AP, Bickmore WA. The chromosomal distribution of CpG islands in the mouse: evidence for genome scrambling in the rodent lineage. Genomics. 1997. 40, 454-461.

35. Csoka AB, Frost GI, Stern R. The six hyaluronidase-like genes in the human and mouse genomes. Matrix Biol. 2001. 20, 499-508.

36. Curley SA, Lott ST, Luca JW, Frazier ML, Killary AM. Surgical decisionmaking affected by clinical and genetic screening of a novel kindred with von Hippel-Lindau disease and pancreatic islet cell tumors.Ann Surg. 1998. 227, 229-235.

37. Del Senno L, Maestri I, Piva R, Hanau S, Reggiani A, Romano A, Russo G. Differential hypomethylation of the c-myc protooncogene in bladder cancers at different stages and grades. J Urol. 1989. 142, 146-149.

38. Denissenko MF, Chen JX, Tang MS, Pfeifer GP. Cytosine methylation determines hot spots of DNA damage in the human P53 gene. Proc Natl Acad Sci USA. 1997. 94, 3893-3898.

39. Doerfler W. DNA methylation and gene activity. Annu Rev Biochem. 1983. 52, 93-124.

40. Dowdy SF, Fasching CL, Araujo D, Lai KM, Livanos E, Weissman BE, Stanbridge EJ. Suppression of tumorigenicity in Wilms tumor by the pi 5.5-pl4 region of chromosome 11. Science. 1991. 254, 293-295.

41. Esteller M, Herman JG. Cancer as an epigenetic disease: DNA methylation and chromatin alterations in human tumours. J Pathol. 2002. 196, 1-7.

42. Feinberg AP. Imprinting of a genomic domain of llpl5 and loss of imprinting in cancer: an introduction. Cancer Res. 1999. 59, 1743-1746.

43. Feinberg AP, Vogelstein B. Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts. Nature. 1983. 301, 89-92.

44. Feng Q, Balasubramanian A, Hawes SE, Toure P, Sow PS, Dem A, Dembele B, Critchlow CW, Xi L, Lu H, Mcintosh MW, Young AM, Kiviat NB. Detection of hypermethylated genes in women with and without cervical neoplasia. J. Natl. Cancer. 2005. 97, 273-278.

45. Gama-Sosa MA, Slagel VA, Trewyn RW, Oxenhandler R, Kuo КС, Gehrke CW, Ehrlich M. The 5-methylcytosine content of DNA from human tumors. Nucleic cids Res. 1983. 11, 6883-6894.

46. Gama-Sosa MA, Wang RY, Kuo КС, Gehrke CW, Ehrlich M. The 5-methylcytosine content of highly repeated sequences in human DNA. Nucleic Acids Res. 1983. 11, 3087-3095.

47. Gardiner-Garden M, Frommer M. CpG islands in vertebrate genomes. J Mol Biol. 1987. 196, 261-282.

48. Gearhart PJ, Wood RD. Emerging links between hypermutation of antibody genes and DNA polymerases. Nat Rev Immunol. 2001. 1, 187— 192.

49. Gray JW, Collins C. Genome changes and gene expression in human solid tumors. Carcinogenesis. 2000. 21, 443-452.

50. Goldberg M, Rummelt C, Laerm A, Helmbold P, Holbach LM, Ballhausen WG. Epigenetic silencing contributes to frequent loss of the fragile histidine triad tumour suppressor in basal cell carcinomas. Br J Dermatol. 2006. 155, 1154-1158.

51. Greenblatt MS, Bennett WP, Hollstein M, Harris CC. Mutations in the p53 tumor suppressor gene: clues to cancer etiology and molecular pathogenesis. Cancer Res. 1994. 54, 4855-4878.

52. Harris N. The analysis of malignancy by cell fusion: the position in 1988. Cancer Res. 1988. 48, 3302-3306.

53. Harris N. The genetic analysis of malignancy. Cell Sci Suppl. 1986. 4, 431-444.

54. Hattori M, Toyoda A, Ichikawa H, Ito T, Ohgusu H, Oishi N, Капо T, Kuhara S, Ohki M, Sakaki Y. Sequence-tagged Notl sites of human chromosome 21: sequence analysis and mapping. Genomics. 1993. 17, 3944.

55. Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin S.B. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. 93, 9821-9826.

56. Hesson L, Dallol A, Minna JD, Maher ER, Latif F. NORE1A, a homologue of RASSF 1A tumour suppressor gene is inactivated in human cancers. Oncogene. 2003. 22, 947-954.

57. Hesson L, Bieche I, Krex D, Criniere E, Hoang-Xuan K,Maher ER, Latif F. Frequent epigenetic inactivation of RASSF 1A and BLU genes located within the critical 3p21.3 region in gliomas. Oncogene. 2004. 23, 24082419.

58. Hesson L, Dallol A, Minna JD, Maher ER, Latif F. NORE1A, a homologue of RASSF 1A tumour suppressor gene is inactivated in human cancers. Oncogene. 2004. 22, 947-954.

59. Hesson LB, Cooper WN, Latif F. The role of RASSF1A methylation in cancer. Dis Markers. 2007. 23, 73-87. Review.

60. Hibi K, Yamakawa K, Ueda R, Horio Y, Murata Y, Tamari M, Uchida K, Takahashi T, Nakamura Y, Takahashi T. Aberrant upregulation of a novel integrin alpha subunit gene at 3p21.3 in small cell lung cancer. Oncogene. 1994. 9, 611-619.

61. Holliday R, Pugh JE. DNA modification mechanisms and gene activity during development. Science. 1975. 187, 226-232.

62. Holschneider CH, Baldwin RL, Tumber K, Aoyama C, Karlan BY. The fragile histidine triad gene: a molecular link between cigarette smoking and cervical cancer. Clin Cancer Res. 2005. 11, 5756-5763.

63. Imreh S, Klein G, Zabarovsky ER. Search for unknown tumour-antagonizing genes. Genes Chromosomes Cancer. 2003. 38, 307-321.

64. Irimia M, Fraga MF, Sanchez-Cespedes M, Esteller M. CpG island promoter hypermethylation of the Ras-effector gene NORE1A occurs in the context of a wild-type K-ras in lung cancer. Oncogene. 2004. 23, 86958699.

65. Issa JP. CpG-island methylation in aging and cancer. Curr Top Microbiol Immunol. 2000. 249, 101-118.

66. Ito T, Sakaki Y. A novel procedure for selective cloning of NotI linking fragments from mammalian genomes. Nucleic Acids Res. 1988. 16, 91779184.

67. Jahner D, Stuhlmann H, Stewart CL, Harbers K, Lohler J, Simon I, Jaenisch R. De novo methylation and expression of retroviral genomes during mouse embryogenesis. Nature. 1982. 298, 623-628.

68. Janisch R, Bird A. Epigenetic regulation of gene expression. Nature Genetics. 2003. 33, 245-254.

69. Jones PA, Laird PW. Cancer epigenetics comes of age. Nat Genet. 1999. 21, 163-167.

70. Jones PA. The DNA methylation paradox. Trends Genet. 1999. 15, 34-37.

71. Kafri T, Ariel M, Brandeis M, Shemer R, Urven L, McCarrey J, Cedar H, Razin A. Developmental pattern of gene-specific DNA methylation in the mouse embryo and germ line. Genes Dev. 1992. 6, 705-714.

72. Kashuba VI, Li J, Wang F, Senchenko VN, Protopopov A, Malyukova A, Kutsenko AS, Kadyrova E, Zabarovska VI, Muravenko OV, Zelenin AV,

73. Kisselev LL, Kuzmin I, Minna JD, Winberg G, Ernberg I, Braga E, Lerman MI, Klein G, Zabarovsky ER. RBSP3 (HYA22) is a tumour suppressor gene implicated in major epithelial malignancies. Proc Natl Acad Sci USA. 2004. 101,4906-4911.

74. Killary AM, Wolf ME, Giambernardi ТА, Naylor SL. Definition of a tumor suppressor locus within human chromosome 3p21-p22. Proc Natl Acad Sci USA. 1992. 89, 10877-10881.

75. Kim YI, Giuliano A, Hatch KD, Schneider A, Nour MA, Dallal GE, Selhub J, Mason JBXjlobal DNA hypomethylation increases progressively in cervical dysplasia and carcinoma. Cancer. 1994. 74, 893-899.

76. Kim YI. Folate and cancer prevention: a new medical application of folate beyond hyperhomocysteinemia and neural tube defects. Nutr Rev. 1999. 57, 314-321.

77. Klein G. The approaching era of the tumor suppressor genes. Science. 1987. 238, 1539-1545.

78. Knudson AG Jr. Genetics of human cancer. Annu Rev Genet. 1986. 20, 231-251.

79. Knudson AG Jr. Hereditary cancer, oncogenes, and antioncogenes. Cancer Res. 1985. 45, 1437-1443.

80. Kovacs G, Erlandsson R, Boldog F, Ingvarsson S, Miiller-Brechlin R, Klein G, Stimegi J. Consistent chromosome 3p deletion and loss of heterozygosity in renal cell carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA. 1988. 85,1571-1575.

81. Lapeyre JN, Becker FF. 5-Methylcytosine content of nuclear DNA during chemical hepatocarcinogenesis and in carcinomas which result. Biochem Biophys Res Commun. 1979. 87, 698-705.

82. Leonhardt H, Page AW, Weier HU, Bestor TH. A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei. Cell. 1992. 71, 865-873.

83. Lerman MI. The RASSF 1A tumor suppressor gene is inactivated in prostate tumors and suppresses growth of prostate carcinoma cells. Cancer Res. 2002. 62, 3498-3502.

84. Li J, Protopopov Al, Gizatullin RZ, Kiss C, Kashuba VI, Winberg G, Klein G, Zabarovsky ER. Identification of new tumour suppressor genes based on in vivo functional inactivation of a candidate gene. FEBS Lett. 1999. 451,289-294.

85. Li J, Wang F, Protopopov A, Malyukova A, Kashuba V, Minna JD, Lerman MI, Klein G, Zabarovsky E. Inactivation of RASSF1C during in vivo tumor growth identifies it as a tumor suppressor gene. Oncogene. 2004. 23, 5941-5949.

86. Li J.L., Fei Q., Yu J., Zhang H.Y., Wang P., Zhu J.D. Correlation between methylation profile of promoter cpg islands of seven metastasis-associated genes and their expression states in six cell lines of liver origin. Ai Zheng. 2004. 23,985-991.

87. Liu Z, Wang L, Wang LE, Sturgis EE, Wei Q. Polymorphisms of the DNMT3B gene and risk of squamous cell carcinoma of the head and neck: A case-control study. Cancer Lett. 2008. 268, 158-165.

88. Lutecij LJ, Randerath E, Randerath K. DNA hypomethylation in Morris hepatomas. Cancer Lett. 1983. 19, 231-239.

89. Macgregor P.F. Gene expression in cancer: the application of microarrays. Expert. Rev. Mol. Diagn. 2003. 3, 185-200.

90. McQueen HA, Fantes J, Cross SH, Clark VH, Archibald AL, Bird AP. CpG islands of chicken are concentrated on microchromosomes. Nat Genet. 1996. 12, 321-324.

91. Maliukova AV, Loginov VI, Khodyrev DS, Kadyrova EL, Pronina IV, Ivanova ТА, Kiselev FL, Zabarovskii NP, Braga EA. Methylation of the putative tumor suppressor gene, RASSF1A, in primary cervical tumors. Mol Biol (Mosk). 2004. 38, 1005-1013.

92. Monk М, Boubelik М, Lehnert S. Temporal and regional changes in DNA methylation in the embryonic, extraembryonic and germ cell lineages during mouse embryo development. Development. 1987. 99, 371-382.

93. Nancarrow DJ, Handoko HY, Smithers BM, Gotley DC, Drew PA, Watson DI, Clouston AD, Hayward NK, Whiteman DC. Genome-wide analysis of DNA copy-number changes using cDNA microarrays. Nat Genet. 1999. 23, 41-46.

94. Narayan A, Ji W, Zhang XY, Marrogi A, Graff JR, Baylin SB, Ehrlich M. Hypomethylation of pericentromeric DNA in breast adenocarcinomas. Int J Cancer. 1998. 77, 833-838.

95. Pan ZG, Kashuba VI, Liu XQ, Shao JY, Zhang RH, Jiang JH, Guo C, Zabarovsky E, Ernberg I, Zeng YX. High frequency somatic mutations in RASSF1A in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Biol Ther. 2005. 4, 11161122.

96. Park HW, Kang HC, Kim IJ, Jang SG, Kim K, Yoon HJ, Jeong SY, Park JG. Correlation between hypermethylation of the RASSF2A promoter and

97. K-ras/BRAF mutations in microsatellite-stable colorectal cancers. Int J Cancer. 2007. 120, 7-12.

98. Pasqualucci L, Neumeister P, Goossens T, Nanjangud G, Chaganti RS, Kiippers R, Dalla-Favera R. Hypermutation of multiple proto-oncogenes in B-cell diffuse large-cell lymphomas. Nature. 2001. 412, 341

99. Pfeifer GP, Dammann R. Methylation of the tumor suppressor gene RASSF1A in human tumors. Biochemistry (Mosc). 2005. 70, 576-583. Review.

100. Pollack J.R., Perou C.M., Alizadeh A.A., Eisen M.B., Pergamenschikov A., Williams C.F., Jeffrey S.S., Botstein D., Brown P.O. Genome-wide analysis of DNA copy-number changes using cDNA microarrays. Nat. Genet. 1999. 23, 41-46.

101. Protopopov A, Kashuba V, Zabarovska VI, Muravenko OV, Lerman MI, Klein G, Zabarovsky ER. An Integrated Physical and Gene Map of the 3.5Mb Chromosome 3p21.3 (AP20) Region Implicated in Major Human Epithelial Malignancies. Cancer Res. 2003. 63, 404-412.

102. Qu GZ, Grundy PE, Narayan A, Ehrlich M. Frequent hypomethylation in Wilms tumors of pericentromeric DNA in chromosomes 1 and 16. Cancer Genet Cytogenet. 1999. 109, 34-39.

103. Ramsahoye BH, Biniszkiewicz D, Lyko F, Clark V, Bird AP, Jaenisch R. Non-CpG methylation is prevalent in embryonic stem cells and may be mediated by DNA methyltransferase 3 a. Proc Natl Acad Sci USA. 2000. 97, 5237-5242.

104. Rideout WM, Coetzee GA, Olumi AF, Jones PA. 5-Methylcytosine as an endogenous mutagen in the human LDL receptor and p53 genes. Science. 1990. 249, 1288-1290.

105. Riggs AD, Jones PA. 5-methylcytosine, gene regulation, and cancer. Adv Cancer Res. 1983. 40, 1-30.

106. Robertson KD, Wolffe AP. DNA methylation in health and disease. Nat Rev Genet. 2000. 1, 11-19.

107. Rogozin IB, Pavlov YI, Bebenek K, Matsuda T, Kunkel ТА. Somatic mutation hotspots correlate with DNA polymerase eta error spectrum. Nat Immunol. 2001. 2, 530-536.

108. Roll JD, Rivenbark AG, Jones WD, Coleman WB. DNMT3b overexpression contributes to a hypermethylator phenotype in human breast cancer cell lines.Mol Cancer. 2008. 25, 7-15.

109. Roth S.Y., Allis C. D. Chromatin condensation: does histone HI dephosphorylation play a role? Trends Biochem Sci. 1992. 17, 93-98.

110. Rountree MR, Bachman KE, Baylin SB. DNMT1 binds HDAC2 and a new co-repressor, DMAP1, to form a complex at replication foci. Nat Genet. 2000. 25, 269-277.

111. Sadikovic В., Andrews J., Rodenhiser D.I. DNA methylation analysis using CpG microarrays is impaired in benzopyrene exposed cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2007. 225, 300-309.

112. Sadikovic В., Andrews J., Carter D., Robinson J., Rodenhiser D.I. Genome-wide H3K9 histone acetylation profiles are altered in benzopyrene treated MCF7 breast cancer cells. J. Biol. Chem. 2007. 283, 4051-4060.

113. Sager R. Genetic suppression of tumor formation. Adv Cancer Res. 1985. 44, 43-68.

114. Sager R. Genetic suppression of tumor formation: a new frontier in cancer research. Cancer Res. 1986. 46, 1573-1580.

115. Saito A, Abad JP, Wang DN, Ohki M, Cantor CR, Smith CL. Construction and characterization of a NotI linking library of human chromosome 21. Genomics. 1991. 10, 618-630.

116. Sanchez Y, el-Naggar A, Pathak S, Killary AM. A tumor suppressor locus within 3pl4-pl2 mediates rapid cell death of renal cell carcinoma in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 1994. 91, 3383-3387.

117. Schmutte C, Jones PA. Involvement of DNA methylation in human carcinogenesis. Biol Chem. 1998. 379, 377-388.

118. Sharif J, Muto M, Takebayashi S, Suetake I, Iwamatsu A, Endo ТА, Shinga J, Mizutani-Koseki Y, Toyoda T, Okamura K, Tajima S, Mitsuya K,

119. Okano M, Koseki H. The SRA protein Np95 mediates epigenetic inheritance by recruiting Dnmtl to methylated DNA. Nature. 2007. 450, 908-912.

120. Sharrard RM, Royds JA, Rogers S, Shorthouse AJ. Patterns of methylation of the c-myc gene in human colorectal cancer progression. Br J Cancer. 1992. 65, 667-672.

121. Shen JC, Rideout WM, Jones PA. The rate of hydrolytic deamination of 5-methylcytosine in double-stranded DNA. Nucleic Acids Res. 1994. 22, 972976.

122. Shimizu M, Yokota J, Mori N, Shuin T, Shinoda M, Terada M, Oshimura M. Oncogene. 1990. 5, 185-194.

123. Silva AJ, White R. Inheritance of allelic blueprints for methylation patterns. Cell. 1988. 54, 145-152.

124. Sims III R.G., Nishioka K., Reinberg D. Histone lysine methylation: a signature for chromatin function. Trends Genet. 2003. 19, 629-639

125. Sperling J., Sperling R. Photochemical cross-linking of histones to DNA nucleosomes. Nucl. Acids Res. 1978. 5, 2755-2773.

126. Stallcup M.R. Role of protein methylation in chromatin remodeling and transcriptional regulation. Oncogene. 2001. 20, 3014-3020.

127. Sugimura T, Ushijima T. Genetic and epigenetic alterations in carcinogenesis. Mutat Res. 2000. 462, 235-246. Review.

128. Tanaka K, Oshimura M, Kikuchi R, Seki M, Hayashi T, Miyaki M. Suppression of tumorigenicity in human colon carcinoma cells by introduction of normal chromosome 5 or 18. Nature. 1991. 349, 340-342.

129. Thayer RE, Singer MF, Fanning TG. Undermethylation of specific LINE-1 sequences in human cells producing a LINE-1-encoded protein. Gene. 1993. 133, 273-277.

130. Thoma F., Koller Т.Н. Klug A. Involvement of histone HI in the organization of the nucleosome and of the salt-dependent superstructures of chromatin. J. Cell Biol. 1979. 83, 403-427.

131. Tian XQ, Zhang Y, Sun D, Zhao S, Xiong H, Fang J. Epigenetic silencing of LRRC3B in colorectal cancer. Scand J Gastroenterol. 2009. 44, 79-84.

132. Tommasi S, Dammann R, Jin SG, Zhang XF, Avruch J, Pfeifer GP. RASSF3 and NORE1: identification and cloning of two human homologues of the putative tumor suppressor gene RASSF1. Oncogene. 2002. 21, 2713— 2720.

133. Tomlinson IP, Bodmer WF. Chromosome llq in sporadic colorectal carcinoma: patterns of allele loss and their significance for tumorigenesis. J Clin Pathol. 1996. 49, 386-390.

134. Toyota M., Ho C., Ahuja N., Jair K.W., Li Q., Ohe-Toyota M., Baylin S.B., Issa J.P. Identification of differentially methylated sequences in colorectal cancer by methylated CpG island amplification. Cancer Res. 1999. 59, 2307-2312.

135. Trevino V., Falciani F., Barrera-Saldana H.A. DNA microarrays: a powerful genomic tool for biomedical and clinical research. Mol. Med. 2007. 13, 527-541.

136. Туско В. Epigenetic gene silencing in cancer. J Clin Invest. 2000. 105, 401-407.

137. Vachtenheim J, Horakova I, Novotna H.Hypomethylation of CCGG sites in the 3' region of H-ras protooncogene is frequent and is associated with H-ras allele loss in non-small cell lung cancer. Cancer Res. 1994. 54, 11451148.

138. Vos MD, Ellis CA, Elam C, Ulku AS, Taylor BJ, Clark GJ. RASSF2 is a novel K-Ras-specific effector and potential tumor suppressor. J Biol Chem. 2003 Jul 25;278(30):28045-51. Epub 2003 May 5.

139. Wallace MR, Fountain JW, Brereton AM, Collins FS. Direct construction of a chromosome-specific NotI linking library from flow-sorted chromosomes. Nucleic Acids Res. 1989. 17, 1665-1677.

140. Wang Q., Yang C., Zhou J., Wang X., Wu M., Liu Z. Cloning and characterization of full-length human ribosomal protein LI5 cDNA which was overexpressed in esophageal cancer. Gene. 2001. 263, 205-209.

141. Warnecke P.M., Stirzaker C., Song J., Grunau C., Melki J.R. and Clark S.J. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods. 2002. 27, 101-107.

142. Woodcock DM, Lawler CB, Linsenmeyer ME, Doherty JP, Warren WD. Asymmetric methylation in the hypermethylated CpG promoter region of the human LI retrotransposon.J Biol Chem. 1997. 272, 7810-7816.

143. Xie S, Wang Z, Okano M, Nogami M, Li Y, He WW, Okumura K, Li E. Cloning, expression and chromosome locations of the human DNMT3 gene family. Gene. 1999. 236, 87-95.

144. Yan PS, Chen CM, Shi H, Rahmatpanah F, Wei SH, Caldwell CW, Huang TH. Dissecting complex epigenetic alterations in breast cancer using CpG island microarrays.Cancer Res. 2001. 61, 8375-8380.

145. Yan PS, Wei SH, Huang TH. Differential methylation hybridization using CpG island arrays. Methods Mol Biol. 2002. 200, 87-100.

146. Yeo M, Lin PS, Dahmus ME, Gill GN. A novel RNA polymerase II C-terminal domain phosphatase that preferentially dephosphorylates serine 5. J Biol Chem. 2003. 278, 26078-26085.

147. Yoder JA, Walsh CP, Bestor TH. Cytosine methylation and the ecology of intragenomic parasites. Trends Genet. 1997. 13, 335-340.

148. Yoon D.Y., Buchler P., Saarikoski S.T., Hines O.J., Reber H.A., Hankinson O. Identification of genes differentially induced by hypoxia in pancreatic cancer cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. 288, 882— 886.

149. Zabarovsky E.R., Lerman M.I., Minna J.D. Tumor suppressor genes on chromosome 3p involved in the pathogenesis of lung and other cancers. Oncogene. 2002. 21, 6915-6935.

150. Zabarovsky ER, Kashuba VI, Pettersson B, Petrov N, Zakharyev V, Gizatullin R, Lebedeva T, Bannikov V, Pokrovskaya ES, Zabarovska VI, et al. Shot-gun sequencing strategy for long-range genome mapping: a pilot study. Genomics. 1994. 21, 495-500.

151. Zardo G, Caiafa P. The unmethylated state of CpG islands in mouse fibroblasts depends on the poly(ADP-ribosyl)ation process. J Biol Chem. 1998.273, 16517-16520.

152. Zeng X, Winter DB, Kasmer C, Kraemer KH, Lehmann AR, Gearhart PJ. DNA polymerase eta is an A-T mutator in somatic hypermutation of immunoglobulin variable genes. Nat Immunol. 2001. 2, 537-541.

153. Zhang Y., Reinberg D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 2001. 15. 2343-2360.

154. Zhang Z, Sun D, Van do N, Tang A, Hu L, Huang G. Inactivation of RASSF2A by promoter methylation correlates with lymph node metastasis in nasopharyngeal carcinoma. Int. J. Cancer. 2007. 120, 32—38.

155. Zhou D., Qiao W., Yang L., Lu Z. Bisulfite-modified target DNA array for aberrant methylation analysis. Anal. Biochem. 2006. 351, 26-35.

156. Zochbauer-Muller S., Fong K.M., Virmani A.K., Geradts J., Gazdar A.F., Minna J.D. Aberrant promoter methylation of multiple genes in non-small cell lung cancers. Cancer Res. 2001. 61, 249 -255.

157. Zochbauer-Muller S, Minna JD, Gazdar AF. Aberrant DNA methylation in lung cancer: biological andclinical implications. Oncologist. 2002. 7, 451457. Review.§ Благодарности

158. Огромная благодарность моей маме за неустанную заботу и поддержку. Искреннюю признательность выражаю Инне Носовой и Елизавете Стародубовой за дружеское отношение и помощь в решении организационных вопросов при оформлении диссертации.

159. Я искренне признательна всем, кто оказал мне помощь в работе и дружескую поддержку.