Нарушения эпигенетической регуляции экспрессии генов как новый класс молекулярной патологии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, доктор биологических наук Немцова, Марина Вячеславовна

• Немцова, Марина Вячеславовна
• доктор биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации доктор биологических наук Немцова, Марина Вячеславовна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ГЛАВА 1. Метилирование ДНК в норме и при патологии (Обзор литературы).

1.1. Феномен метилирования ДНК.

1.1.1. Количество и распределение динуклеотидов CpG в геноме.

1.1.2. Профили метилирования.

1.1.3. Ферменты метилирования.

1.1.4. Метилирование генома как динамический процесс.

1.1.5. Влияние метилирования ДНК на структуру хроматина.

1.1.6. Методы анализа метилирования ДНК.

1.2. Метилирование ДНК и наследственная патология.

1.2.1. Общие представления об импринтинге.

1.2.2. Механизмы геномного импринтинга.

1.3. Эпигенетическая регуляция экспрессии генов и канцерогенез.

1.3.1. Молекулярные механизмы канцерогенеза.

1.3.2. Гены-супрессоры опухолевого роста.

1.3.3. Взаимодействие генов, регулирующих клеточный цикл.

1.3.4. Двухударная модель канцерогенеза.

1.3.5. Метилирование генов, вовлеченных в канцерогенез.

ГЛАВА 2. Материалы и методы.

2.1. Характеристика пациентов.

2.2. Забор крови и операционного материала.

2.3. Выделение геномной ДНК.

2.4. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции и электрофорез при проведении блот-гибрид из ации.

2.5. Гибридизация с радиоактивно меченым зондом.

2.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.6.1. Микросателлитный анализ делеций и ОРД при СПВ и СА.

2.6.2. Микросателлитный анализ ОРД при СВБ и нефробластоме.

2.6.3. Микросателлитный анализ делеций и ПГ при ретинобластоме.

2.6.4. Полимеразная цепная реакция кодирующих районов tqh&RBI.

2.6.5. Метил-специфическая ПЦР при СПВ и С А.

2.6.6. Метил-чувствительная ПЦР CpG-островков генов IGF2 и LIT1 при СВБ.

2.6.7. Метил-чувствительная ПЦР фрагментов CpG-островков района X(q27.3-q28) при СМБ и НСУО.

2.6.8. Метод метил-чувствительной ПЦР промоторных районов генов-супрессоров.

2.7. Детекция точковых мутаций методом SSCP.

2.8. Анализ гетеродуплексов (НА).

2.9. Автоматическое секвенирование.

2.10. Программное обеспечение компьютерного анализа ДНК.

ГЛАВА 3. Синдромы Прадера-Вилли и Ангельмана как модель изучения патологии импринтинга.

3.1. Клиническая характеристика синдрома Прадера-Вилли.

3.2. Клиническая характеристика синдрома Ангельмана.

3.3. Молекулярная организация хромосомного района 15(ql 1 - ql3).

3.4. Формы молекулярной патологии, вызывающие СПВ и СА.

3.4.1. Делеции критического района 15(qll - ql3).

3.4.2. Однородительская дисомия.

3.4.3. Мутации центра импринтинга.

3.5. Гены-кандидаты и их возможное участие в формировании фенотипических проявлений СПВ и СА.

3.5.1. Гены-кандидаты для СПВ.

3.5.2. Гены-кандидаты для СА.

3.6. ДНК-диагностика СПВ и СА.

3.6.1. Анализ аллельного метилирования локусов хромосомного района 15(qll-ql3).

3.6.1.1. Блот-гибридизационный анализ с использованием метилчувствительных рестриктаз.

3.6.1.2. Бисульфитная модификация ДНК и метилспецифическая ПЦР.

3.6.2. Анализ микросателлитного полиморфизма локусов хромосомного района 15(qll-ql3).

ГЛАВА 4. Синдром Видемана-Беквита и нефробластома как модель потери импринтинга.

4.1. Клинико-генетическая характеристика синдрома Видеманна-Беквита.

4.2. Молекулярная организация импринтированного района хромосомы 11р15.5 и гены, вовлеченные в формирование фенотипических признаков СВБ.

4.3. Тонкая структурно-функциональная организация района, содержащего гены

1119 и 1GF2.

4.4. Молекулярная патология, приводящая к СВБ.

4.5. Молекулярная диагностика СВБ и нефробластомы.

ГЛАВА 5. Синдром Мартина-Белл, неспецифическая умственная отсталость FRAXE и метилирование районов экспансии тринуклеотидных повторов.

5.1. Клинико-генетическая характеристика и молекулярно-генетические основы синдрома Мартина-Белл.

5.1.1. Клиническая характеристика синдрома Мартина-Белл.

5.1.2. Цитогенетические основы СМБ.

5.1.3. Особенности наследования СМБ. Парадокс Шермана.

5.1.4. Молекулярно-генетические основы СМБ.

5.2. Клиническая характеристика, цитогенетические и молекулярногенетические основы УО FRAXE и FRAXF.

5.2.1. Клиническая характеристика и цитогенетические основы УО FRAXE и FRAXF.

5.2.2. Молекулярно-генетические основы УО FRAXE и FRAXF.

5.3. Роль импринтинга и эффекта положения в развитии СМБ и УО FRAXE.

5.4. Гиперметилирование амплифицированных CGG-повторов.

5.4.1. Механизмы гиперметилирования CGG-повторов.

5.4.2. Реализация эффектов метилирования CGG-повторов.

5.5. Методы ДНК-диагностики СМБ, УО FRAXE и FRAXF.

5.5.1. ДНК-диагностика СМБ.

5.5.2. ДНК-диагностика УО FRAXE и FRAXF.

5.5.3. Детекция экспансии тринуклеотидного повтора CGG методом блот-гибридизации.

5.5.4. Анализ метилирования CpG-островка reHaFMRl

5.5.4.1. Совместный анализ метилирования CpG-островка FMR1 и экспансии CGG-повтора.

5.5.4.2. Изолированный тест на метилирование с использованием блот-гибридизации.

5.5.4.3. Анализ метилирования с использованием ГТЦР.

5.5.5. Совместный анализ метилирования CpG-островков, прилежащих к ломким участкам FRAXA, FRAXE и FRAXF.

5.5.6. Сравнительный анализ подходов к ДНК-диагностике СМБ и УО FRAXE Современный протокол лабораторной диагностики СМБ.

ГЛАВА 6. Вклад эпигенетических нарушений в генез ретинобластомы.

6.1. Клинико-генетическая характеристика ретинобластомы.

6.2. Структура и функция гена RB1.

6.3. Роль RB1 в регуляции клеточного цикла.

6.4. Молекулярная патология в ретинобластомах.

6.4.1. Структурные мутации генаRB1 в спорадических ретинобластомах.

6.4.2. Потеря гетерозиготности.

6.4.3. Профиль метилирования генов-супрессоров в ретинобластомах.

6.5. Алгоритм проведения ДНК-диагностики при ретинобластоме.

ГЛАВА 7. Профиль метилирование генов-супрессоров в спорадических раках молочной железы и эпителиальных дисплазиях шейки матки.

7.1. Профиль метилирования генов-супрессоров в спорадических раках молочной железы.

7.2. Профиль метилирования генов-супрессоров в эпителиальных дисплазиях шейки матки.

7.3. Возможность и необходимость разработки протоколов для ранней ДНК-диагностики опухолеобразования.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Нарушения эпигенетической регуляции экспрессии генов как новый класс молекулярной патологии»

Актуальность исследования.

Молекулярные основы наследственной патологии сегодня являются наиболее изучаемой проблемой медицинской и молекулярной генетики. Регулярно картируются и клонируются новые гены наследственных заболеваний человека, описываются новые мутации в уже известных генах, разрабатываются новые методические подходы в ДНК-диагностике. Параллельно проводится тотальное секвенирование генома человека, изучаются особенности структуры и закономерности функционирования генов, структурно-функциональная организация хроматина в определенных хромосомных районах. Однако, развитие этой области науки в последние годы показало, что расшифровка нуклеотидной последовательности является только одним из первых шагов к пониманию закономерностей функционирования генома в целом. Изучение взаимодействия структурной организации ДНК, ее модификаций и функции "концерта генов" на разных стадиях онтогенеза, а так же в норме и при патологии, потребует не одного десятилетия.

Наши предыдущие исследования в области молекулярно-генетической патологии показали, что картирование определенного гена-кандидата заболевания в определенном хромосомном локусе, его клонирование и обнаружение специфических мутаций, даже при условии отсутствия генетической гетерогенности заболевания, во многих случаях не позволяет осуществлять эффективную, стопроцентную диагностику. Причиной этого являются достаточно распространенные, но недостаточно, пока, изученные у человека явления импринтинга, эффекта положения и структурно-функциональной организации хроматина в определенном хромосомном локусе, где локализуется ген, структурные и функциональные повреждения которого вызывают патологию. Выше указанные причины классифицируются как «эпигенетические» для обозначения наследственных и ненаследственных изменений в экспрессии конкретного гена без каких-либо соответствующих структурных изменений в его нуклеотидной последовательности. Механизмами такой патологии являются: аномалии метилирования промоторных и регуляторных областей гена; динамические (амплификация микросателлитных повторов) и точковые мутации в регуляторных областях генов; транспозиции повторяющихся элементов генома; инактивирующее влияние крупных блоков структурного гетерохроматина.

Метилирование ДНК вовлечено в широкий круг биологических процессов, которые включают регуляцию экспрессии тканеспецифичных генов, клеточную дифференциров-ку, геномный импринтинг, инактивацию Х-хромосомы, регуляцию структуры хроматина, репликацию ДНК, латентный период у вирусов, канцерогенез и старение. В последнее время, в качестве причин возникновения некоторых генетических и онкологических заболеваний, все большая роль отводится эпигенетической регуляции активности генов, основанной на аномальном метилировании CpG-островков в промоторных районах, что приводит к их полной инактивации. Таким образом, при отсутствии каких-либо структурных изменений нуклеотидной последовательности гена, он теряет свою активность, что может рассматриваться, как функциональная делеция.

Цель исследования.

Основной целью исследования является разработка нового направления в молекулярной диагностике наследственной и онкологической патологии, которое связано с аномальным метилированием промоторных районов генов, в результате чего происходит их функциональная инактивация без структурных нарушений ДНК.

Задачи исследования:

1. Изучить механизмы эпигенетической регуляции и пути ее нарушения в генезе синдромов Прадера-Вилли и Ангельмана, связанных с импринтингом, и разработать эффективные способы их ДНК-диагностики;

2. Изучить механизмы эпигенетической регуляции и пути ее нарушения в генезе синдрома Беквита-Видеманна и нефробластомы, связанных с потерей импринтинга, и разработать эффективные способы их ДНК-диагностики;

3. Изучить механизмы, приводящие к нарушению генной активности при синдроме Мартина-Белл и неспецифической умственной отсталости FRAXE и разработать подходы к ДНК-диагностике этих заболеваний;

4. Изучить вклад структурных и функциональных нарушений гена RB1, а также других генов-супрессоров в генез ретинобластомы, разработать эффективные способы ДНК-диагностики;

5. Охарактеризовать профиль метилирования ряда генов-супрессоров в спорадических формах рака молочной железы. Обосновать необходимость разработки протоколов для ранней диагностики и мониторинга течения онкологического заболевания.

Научная новизна исследования.

Разработано новое направление в молекулярной диагностике наследственной и онкологической патологии, связанное с аномальным метилированием промоторных районов генов, что приводит к их функциональной инактивации без структурных нарушений ДНК. Впервые на большой выборке больных с генетическими и онкологическими заболеваниями показана роль аномального метилирования промоторных и регуляторных районов ряда генов, как этиологического фактора патологии. Определен спектр молекулярной патологии приводящий к синдромам Прадера-Вилли, Ангельмана и Видеманна-Беквита, известных как болезни импринтинга. Определено, что причиной заболеваний связанных с импринтингом, является нарушение аллель специфической экспрессии генов импринти-рованных районов, что может быть выявлено в результате анализа их аномального метилирования. Выявлено, что потеря импринтинга (ПИ), приводящая к нарушению функционирования импринтированных районов локуса 11р15 является характерной особенностью некоторых опухолей, и особенно часто встречается в нефробластомах. Разработаны эффективные методы ДНК-диагностики заболеваний, связанных с нарушением импринтинга.

Впервые для обследования большой выборки больных с умственной отсталостью разработаны методы лабораторной диагностики Х-сцепленных форм УО, что позволило сделать выводы о характере структурных и функциональных изменений Х-хромосомы, приводящих к развитию фенотипов УО. Разработаны и апробированы методики анализа функционального состояния генов FMR1 и FMR2 на основе метил-чувствительной ПЦР. Впервые в России проведена успешная молекулярная диагностика УО FRAXE. Исследован характер метилирования CpG-динуклеотидов в промоторной области гена FMR2. Разработан метод анализа метилирования CpG-островков FRAXA, FRAXE и FRAXF в одной пробирке, предназначенный для выявления больных с СМБ, УО FRAXE, полных мутаций экспансии FRAXF.

Определен спектр молекулярной патологии в спорадических ретинобластомах Выявлены 34 мутации в различных экзонах и интронных областях гена RBJ, из них 24 мутации описаны впервые в мире. Описаны 3 новых полиморфизма в гене RB1. Потеря гетерози-готности определена в 68% опухолей. Обнаружено аномальное метилирование промотор-ной области гена RB1 в 25% исследованных случаев ретинобластомы. Впервые проведено исследование статуса метилирования промоторной области гена pi6/CDKN2A в образцах ретинобластомы - аномальное метилирование продемонстрировано в 48% случаев. Разработана мультиплексная метил-чувствительная ПЦР для совместной оценки статуса метилирования промоторных районов генов RB1 и pl6/CDKN2A.

Впервые проведено определение профиля метилирования других генов-супрессоров опухолевого роста в спорадических ретинобластомах. Установлено, что метилированию подвергаются: ген E-cad в 60%, ген MGMT - 1%. Гены р15, р14 , и N33 не показали аномального метилирования в исследованных нами образцах.

Впервые проведено определение профиля метилирования генов-супрессоров опухолевого роста в спорадических опухолях молочной железы. Установлено аномальное метилирование для следующих генов в 60 образцах РМЖ: RB1 - 14%, р1б - 47%, E-cad - 30%, MGMT - 9%, N33 - 11%, HIC - 84%. Гены pi5 и р14 не показали метилирования. Основываясь на полученных результатах, показан значительный вклад аномального метилирования регуляторных районов генов, вовлеченных в канцерогенез, в процессы опухолеобра-зования.

Впервые проведено определение профиля метилирования генов-супрессоров опухолевого роста в эпителиальной ткани при дисплазиях шейки матки, которые представляют собой самые начальные этапы опухолевого процесса. Показана большая роль инактивации основных генов-супрессоров, посредством метилирования их промоторных областей, в развитие диспластических процессов и их злокачественную трансформацию.

Установлено, что неизмененная морфологически ткань, взятая, как контрольный образец из района опухоли или дисплазии, на самом деле не может являться контролем, т.к. несет в себе аномалии метилирования генов-супрессоров, идентичные опухолевой. Это позволяет считать метилирование промоторных районов ключевых генов-супрессоров наиболее ранним событием канцерогенеза.

Практическая значимость исследования.

Решена важная для практического здравоохранения задача - охарактеризован новый класс молекулярной патологии, приводящий к нарушению функционирования генов, что является причиной ряда наследственных и онкологических заболеваний.

В результате обследования больных с клиническими диагнозами синдромов Прадера-Вилли (200 пациентов) и Ангельмана (110 пациентов) разработаны подходы к ДНК-диагностике этих заболеваний.

В результате обследования 12 больных с синдромом Видеманна-Беквита и 10 пациентов с нефробластомой разработаны подходы к ДНК-диагностике заболеваний, связанных с импринтингом и его потерей.

Проведена ДНК-диагностика у 470 больных с неспецифической УО и у 49 родственников. В 8 семьях с синдромом Мартина-Белл (СМБ) исследовано 9 образцов плодного материала; в 5 случаях выявлены изменения, характерные для синдрома. В результате выполненного исследования разработаны подходы для молекулярно-биологической диагностики СМБ, УО FRAXE и полных мутаций экспансии FRAXF у больных с умственной отсталостью.

В результате исследования 56 образцов спорадической ретинобластомы разработаны подходы к молекулярной диагностике и характеристике микроструктурной патологии, мутаций и функциональных нарушений в гене RB1, приводящих к развитию ретинобластомы.

При исследовании образцов спорадических ретинобластом (56 образцов) и рака молочной железы (60 образцов) показана необходимость исследования метилирования про-моторных и регуляторных районов генов-супрессоров опухолевого роста, как маркеров злокачественного роста.

При исследовании эпителиальных дисплазий шейки матки выявлено, что инактивация генов-супрессоров опухолевого роста посредством метилирования их регуляторных районов является наиболее ранним событием, приводящим к злокачественной трансформации. Это позволяет начать разработку протоколов для ранней диагностики опухолевого процесса различных органов и тканей.

Результаты исследования уже внедрены или находятся на стадии внедрения в практику работы МГНЦ РАМН, РОНЦ РАМН, Института педиатрии и детской хирургии МЗ РФ, МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца, НИИ акушерства и гинекологии им. Отта РАМН, Томского медико-генетического центра РАМН, межрегиональных МГЦ и региональных медико-генетических консультаций.

Социально-экономическая значимость результатов исследования связана с повышением эффективности лабораторной диагностики, пренатальной диагностикой, ранней диагностикой, скринингом и профилактикой наследственных и онкологических заболеваний.

Фрагменты исследования были удостоены первой премии Президиума РАМН за 2000 г. и премии Координационного Межведомственного Совета по приоритетному направлению "Науки о жизни и биотехнология" за 2001 г.

Апробация работы.

Материалы исследования докладывались на международных конференциях: на ежегодных конференциях Европейского общества генетиков в 1993-2002 гг., на ежегодных конференциях общества генетики человека Германии в 1999 - 2000 гг., на конференциях Европейского общества цитогенетиков в 1997 и 1999 г., на международных конференциях «Геном человека» в 1999-2002 гг., на конференциях ГНТП «Геном человека» в 1993-2001 гг., на научно-практической конференциях МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца в 1998 и 2001 гг., на 3 и 5-й международных конференциях по молекулярной биологии им. Энгельгардта в 1997 и 2001 гг., на Всероссийских научно-практических конференция по генетике человека и межлабораторных семинарах МГНЦ РАМН.

Положения, выносимые на защиту

1. Метилирование ДНК определенных генов и хромосомных районов в норме является основой моноаллельной экспрессии генов, подверженных импринтингу. Потеря неим-принтированного аллеля или потеря импринтинга приводят к синдромам МВПР и онкологическим заболеваниям (синдромы Прадера-Вилли, Ангельмана, Видеманна-Беквита и нефробластома);

2. Разработаны подходы к ДНК-диагностике синдромов МВПР (синдромы Прадера-Вилли, Ангельмана, Видеманна-Беквита), связанных с импринтингом и нефробластомы;

3. Проведён комплексный молекулярно-генетический анализ области расположения генов FMR1, FMR2 и ломкого хромосомного участка FRAXF в районе хромосомы X(q27-q28) в норме и у больных с СМБ и УО FRAXE. Разработан оригинальный скрининговый метод ДНК-диагностики синдрома Мартина-Белл и неспецифической умственной отсталости, основанный на анализе метилирования промоторных районов генов FMR1 и FMR2\

4. Аномальное метилирование промоторных участков генов RB1 и/или pl6/CDKN2A является одним из механизмов, приводящих к развитию ретинобластомы. Разработаны оптимальные подходы для лабораторной ДНК-диагностики ретинобластомы;

5. Охарактеризован профиль метилирования генов-супрессоров опухолевого роста в образцах спорадических ретинобластом и рака молочной железы. Исследование профиля метилирования является необходимым этапом в характеристике определенного типа опухоли;

6. Метилирование промоторных и регуляторных районов генов-супрессоров опухолевого роста является одним из наиболее ранних событий в канцерогенезе, что позволяет разрабатывать ДНК-диагностические протоколы для ранней диагностики онкологического процесса.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Немцова, Марина Вячеславовна

выводы

1. Проведен комплексный ДНК-анализ критического района хромосомы 15qll.2, структурная и функциональная патология которого связана с возникновением СПВ и СА. Метилирование генов, подверженных импринтингу, является основой их моноаллельной экспрессии в норме. Показано, что нарушение моноаллельной экспрессии в результате делеций или однородительской дисомии является основной причиной, приводящей к СПВ и СА. На основе анализа аллельного метилирования импринтированного района разработан эффективный метод ДНК-диагностики этих заболеваний посредством метил-специфической ПЦР, имеющей высокую чувствительность и специфичность.

2. Проведен анализ дифференциального метилирования критического района хромосомы 11р15.5, структурная и функциональная патология которого вызывает СВБ и нефроб-ластому. Установлено, что нарушение аллель специфического метилирования импринтированных генов IGF2 и ЫТ1, представленная потерей импринтинга этих генов, приводит к указанным заболеваниям. В результате исследования разработан оригинальный метод, основанный на метил-чувствительной ПЦР, позволяющий эффективно определять потерю импринтинга указанных генов.

3. Проведен комплексный ДНК-анализ критического района хромосомы X(q27.3-q28), структурная и функциональная патология которого вызывает синдром Мартина-Белл и неспецифическую умственную отсталость. Экспансия тринуклеотидного повтора CGG приводит к метилированию промоторных районов генов FMR1 и FMR2. Разработан и успешно апробирован метод одновременного анализа метилирования CpG-островков генов FMR1 и FMR2 и фолатчувствительного ломкого участка FRAXF. Это позволяет использовать метод для неонатального скрининга мальчиков и пациентов с неспецифической умственной отсталостью.

4. Определен спектр молекулярной патологии гена RB1 при исследовании операционного материала 56 случаев спорадической ретинобластомы. Структурные аномалии гена, представленные точковыми мутациями выявлены в 60%, 24 мутации описаны впервые. Потеря гетерозиготности хромосомного локуса 13ql4.1 определена в 68% случаев. Функциональные нарушения, представленные аномальным метилированием промоторной области гена RB1 выявлены в 25% случаев, причем гиперметилирование сочеталось и с мутациями в гене RB1, и с ПГ. Учитывая высокую частоту функциональных аномалий, анализ метилирования посредством метил-чувствительной ПЦР необходимо использовать в диагностическом протоколе.

5. Исследован статус метилирования генаpl6/CDKN2A в спорадических ретинобласто-мах, в качестве одной из возможных причин, приводящих к развитию опухоли. Аномальное метилирование CpG-островка р16 было выявлено в 48%; установлено, что метилирование р1б может быть выявлено совместно с метилированием промотора RB1, точковыми мутациями гена и ПГ по району хромосомы 13ql4.1, а в ряде случаев быть единственным событием в опухоли.

6. Охарактеризован профиль метилирования генов-супрессоров опухолевого роста в образцах спорадического рака молочной железы и ретинобластомы. Гены р15 и р14 не показали метилирования ни в одном из исследованных типов опухолей. В опухолях молочной железы установлено метилирование генов: RB1 - в 14%, р16 - 47%, CDH1 - 30%, MGMT - 9%>, N33 - 11%, HIC - 84%). В ретинобластомах профиль метилирования следующий: ген RB1 - 25%, р16 - 48%, CDH1 - 60%, HIC1 - 41%, MGMT - 1%, ген N33 метилирования не показал. Высокий уровень метилирования этих генов в опухоли, по сравнению с контролем, может быть использован как маркер злокачественной трансформации, а функциональную инактивацию генов-супрессоров можно считать значимым механизмом канцерогенеза.

7. Определён профиль метилирования генов pl6/CDKN2A, MLH1, HIC1, MGMT, N33, CDH1 в образцах дисплазии и морфологически неизменённой эпителиальной ткани шейки матки. Установлено, что при дисплазии ген р1б метилируется в 62%>, MLH1 - в 85%, HIC1- в 100%), MGMT- в 8%, N33 - в 39%, a CDH1 - не метилируется. В морфологически неизменённой ткани метилирование составило: 23% для генов р1б и MLH1, 69% - для HIC1, 8% - для N33 и не выявлено для генов MGMT и CDH1. Для генов Р16, MLH1, HIC1 выявлены высокие значения метилирования и в очаге дисплазии, и в морфологически неизменённой ткани, что позволяет считать эти гены вовлеченными в канцерогенез эпителиальной ткани, а их метилирование - наиболее ранним молекулярным маркёром опухоле-образования.

8. Разработано новое направление в молекулярной диагностике наследственной и онкологической патологии, связанное с аномальным метилированием промоторных районов генов, что приводит к их функциональной инактивации без структурных нарушений ДНК. На значительном клиническом материале (790 пациентов с генетическими заболеваниями и 146 образцов опухолевого материала) показана важная роль аномального метилирования промоторных и регуляторных районов ряда генов, как этиологического фактора патологии. Разработаны методические основы молекулярной диагностики ряда синдромов, связанных с аномалиями эпигенетической регуляции экспрессии генов. Показано, что аномальное метилирование генов-супрессоров опухолевого роста является наиболее ранним событием канцерогенеза, а его определение может и должно быть использовано в диагностических протоколах.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ. НАРУШЕНИЯ ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ КАК НОВЫЙ КЛАСС МОЛЕКУЛЯРНОЙ ПАТОЛОГИИ.

Молекулярные основы наследственной и онкологической патологии в настоящее время являются наиболее изучаемыми проблемами медицинской генетики. Сегодня уже можно говорить о значительных успехах в области изучения и расшифровки ДНК человека, постоянно картируются и клонируются новые гены, связанные с заболеваниями человека, описываются новые мутации в уже известных генах, разрабатываются новые подходы к ДНК-диагностике.

Современные подходы в диагностике наследственных и онкологических заболеваний предполагают использование полного комплекса молекулярно-биологических методов, которые позволяют найти ген, ответственный за заболевание, определить повреждения в нем, которые и являются причиной этого заболевания, от крупных хромосомных перестроек, до точковых мутаций. До недавнего времени определение структурных повреждений генов и целых хромосомных районов являлось конечным этапом ДНК-диагностики генетического заболевания. Однако, не всегда, даже в случае моногенных заболеваний, удавалось определить мутации, приводящие к развитию патологии, в результате чего невозможно было осуществить эффективную, стопроцентную диагностику (Залетаев, Немцова, 2001). С другой стороны, мутации, которые определяются в семейных случаях заболевания, не всегда можно выявить в спорадических случаях тех же заболеваний, даже применяя самые чувствительные методы их детекции. Оказалось, что развитие патологического процесса могут определять не только генетические, но и так называемые эпигенетические факторы - наследственные и ненаследственные изменения в экспрессии гена без изменения его нуклеотидной последовательности. На сегодняшний день известно два основных феномена, при которых происходит нарушение функции гена без повреждения его нуклеотидной последовательности - это импринтинг и эффект положения гена (Немцова, 2000; van Heyningen et al., 1998). Оба этих явления существуют в норме и необходимы для нормального функционирования некоторых генов, особенно в период интенсивного развития организма. Воздействие на экспрессию гена может осуществляться различными путями, основными из которых принято считать метилирование промоторных и регулятор-ных областей гена, мутации в регуляторных областях генов, расположенных на значительном расстоянии от самого гена, инактивирующее влияние крупных блоков гетерохро-матина. При этом ген инактивируется настолько, что возникает состояние аналогичное структурной делеции, которое получило название "функциональная делеция ".

Метилирование ДНК является наиболее изученным механизмом изменения генной активности, который используется в различных биологических процессах, таких как регуляция экспрессии тканеспецифичных генов, клеточная дифференцировка, инактивация X-хромосомы, регуляция структуры хроматина и др. Обнаружение зависимости между снижением/выключением активности гена и метилированием его промоторной области, послужило веским доводом в пользу того, что такая модификация может служить эпигенетическим механизмом, регулирующим генную активность. Это открытие явилось началом огромного количества исследований, в результате которых, эпигенетические изменения, наряду с молекулярно-генетическими (мутациями и хромосомными перестройками), стали рассматриваться как причина, приводящая к наследственной и онкологической патологии. Данная работа на примере наследственных синдромов и спорадических опухолей показывает значительный вклад эпигенетических изменений, как этиологического фактора, в генез наследственной и онкологической патологии. Настоящее исследование является разработкой нового направления в молекулярной диагностике наследственной и онкологической патологии, связанного с аномальным метилированием промоторных районов генов, что приводит к их функциональной инактивации без структурных нарушений ДНК. Важная роль аномального метилирования промоторных и регуляторных районов ряда генов, как этиологического фактора патологии, продемонстрирована на значительном клиническом материале (790 пациентов с генетическими заболеваниями и 146 образцов опухолевого материала).

Метилирование ДНК является основой моноаллельной экспрессии импринтированных генов. Примером этого может служить моноаллельная экспрессия ряда генов, расположенных в критических районах 15(qll-ql3) и 11р15.5, которые повреждаются при синдромах Прадера-Вилли, Ангельмана и Видеманна-Беквита (Немцова, 2000). Используя знания о законах функционирования импринтированных генов нам удалось разработать универсальный подход, который может быть использован для определения дефектов в нормальном метилировании промоторных районов генов, связанных с проявлением наследственных синдромов Прадера-Вилли, Ангельмана, Видеманна-Беквита, а также еще не изученных синдромов, связанных с импринтингом. Применение этого подхода позволяет выявить дефекты нормального аллель специфического метилирования критических импринтированных районов, которые могут возникать в результате таких малоизученных причин, как мутации ЦИ и ДМР, при синдроме ВБ, а также могут являться следствием структурных перестроек, затрагивающих район импринтированных генов, как при СПВ и СА. Предложенный подход предполагает сочетание анализа аллель специфического метилирования с другими молекулярно-биологическими методами исследования, что позволяет значительно повысить эффективность ДНК-диагностики и генетического консультирования больных с патологией импринтинга а также других наследственных заболеваний, причиной которых является нарушение нормального метилирования или аномальное метилирование регуляторных областей некоторых генов.

Этот подход успешно опробован в настоящей работе на большой выборке больных, и может быть использован в качестве скринингового метода в медицинской генетике. Применяя весь комплекс молекулярно-биологических методов, в сочетании с методами анализа аллельного метилирования импринтированных генов нам удалось предложить диагностический протокол для СПВ и СВБ, который позволяет провести эффективную диагностику почти в 95% случаев, а также осуществить диагностику 70% случаев СА (Залетаев, Немцова, 2001).

Метилирование, как механизм регуляции генной экспрессии, встречается не только в норме. При различных формах генетических заболеваний обнаруживается аномальное метилирование генов, которые в нормальных тканях экспрессируются биаллельно. Такое явление отмечается при СМБ, инактивация гена FMR1 происходит без структурных повреждений, а только в результате аномального метилирования, которое, сочетаясь с экспансией тринуклеотидного повтора, приводит к синдрому умственной отсталости (Стрельников и др., 1998). В результате применения предложенного нами подхода к исследованию аллельного метилирования, нам удалось разработать диагностический и скрининговый метод для анализа нескольких заболеваний, связанных с аномальным метилированием района X(q27-q28), исследовать характер метилирования CpG-островков FRAXA, FRAXE и FRAXF, причем осуществить диагностику методом мультилокусной ПЦР в одной пробирке. В результате разработанного нами универсального метода впервые в России успешно проведена молекулярная диагностика УО FRAXE.

В настоящее время большое внимание уделяется исследованию генетических повреждений при онкологических заболеваниях, потому что доказано, что рак - заболевание всего генома. Последние исследования в области онкологии показали, что в опухоли имеют место не только структурные повреждения генов, но и эпигенетические, т.е. большое количество генов изменяют свою экспрессию без каких-либо структурных нарушений в их нуклеотидной последовательности. Используя моногенную опухоль - ретинобластому, в качестве модели исследования, мы определили долю структурной и функциональной патологии, которая приводит к развитию опухоли. Оказалось, что аномальное метилирование промоторной области гена RB1 в 25% случаев, сочетаясь со структурными изменениями, приводит к полной инактивации гена-супрессора опухолевого роста RB1 и становится причиной развития опухоли (Бабенко и др., 2002). В результате анализа структурной и функциональной патологии гена RB1 нам удалось не только выявить 34 мутации из которых 24 описаны впервые, но и определить оба события (по Кнадсону), в результате которых происходит полная потеря супрессорной функции гена и развивается ретинобластома. Хотя ретинобластома моногенная опухоль нам не удалось для всех случаев определить полную инактивацию гена RB1, поэтому принимая во внимание взаимодействие генов в процессе регуляции клеточного цикла мы исследовали статус метилирования гена р1б, который является регулятором активности белка pRBl. Метилирование промоторной области р16 является самым распространенным путем его инактивации и показано в различных типах опухолей. Оказалось, что функциональная инактивация таких основных регуляторов клеточного цикла, как ген RB1 и ген р1б вносит значительный вклад в генез ретинобластомы. Недостаточная активность каждого из этих генов может привести к развитию опухоли, а их совместная инактивация в этом типе опухоли показана впервые (Немцова и др., 2002). Сделанная нами попытка определить причинно-следственные отношения между метилированием основных генов-супрессоров опухолевого роста и процессом опухолеобразования, не позволила дать однозначный ответ о том, является ли метилирование причиной канцерогенеза, или происходит вследствие его, но однозначно показала большую роль эпигенетической регуляции в развитие процесса озлокачествления.

Анализ функционирования различных генов в злокачественной опухоли показывает отсутствие экспрессии одних и гиперэкспрессию других. Оказалось, что аномальное метилирование CpG-островков генов-супрессоров в опухоли, является одним из наиболее значимых механизмов канцерогенеза, а метилирование, с последующей инактивацией генов-супрессоров, может выступать, и как первая, и как вторая, но функциональные мутации. В настоящее время для большого количества генов показано, что именно метилирование как одного, так и обоих аллелей является причиной развития опухоли. В связи с этим, определение профиля метилирования известных и вновь клонированных генов-кандидатов, одной из функций которых может быть регуляция клеточного цикла, в образцах различных опухолей, является необходимым моментом в характеристике гена и ДНК-диагностике при определенном заболевании. Исследования эпигенетических механизмов регуляции экспрессии генов уже позволили в ряде случаев установить причины инактивации определенных генов в опухолях. Аномальное метилирова-ние/деметилирование может служить диагностическим и прогностическим маркером, а так же позволяет дифференцировать определенные типы опухолей (Залетаев и др., 2002; Немцова и др., 2002). Характеристика профиля метилирования генов в различных тканях и типах опухолей вносит существенный вклад в понимание процессов дифференцировки тканей и канцерогенеза. Методические подходы, описанные выше, позволяют проводить такой экспресс-анализ и в операционном материале опухоли, и в лимфоцитах крови, что имеет большое значение для выбора тактики лечения конкретного больного. Кроме того, установление профиля метилирования генов, обладающих супрессорной активностью, для различных типов опухолей является фундаментальной задачей в области изучения молекулярных процессов, происходящих в раковой клетке, наряду с гиперэкспрессией онкогенов, потерей гетерозиготности по различным хромосомным районам, экспансией тринук-леотидных повторов и микросателлитной нестабильностью. В настоящей работе мы исследовали профиль метилирования генов-супрессоров опухолевого роста для спорадических ретинобластом и РМЖ и показали, что значительное количество основных генов-супрессоров, регулирующих клеточный цикл, подвергаются инактивации в исследуемых опухолях, в результате аномального метилирования их регуляторных промоторных областей. Метилирование, которое необходимо для нормального развития организма, становится патологическим механизмом, приводящим к изменению генной активности в опухолевой клетке.

В связи с тем, что частота онкопатологии постоянно растет, а возраст манифестации заболевания уменьшается, все большую актуальность приобретает проспективная диагностика онкопатологии (до явных проявлений) в рамках ежегодных диспансеризаций и в группах риска. Мониторинг молекулярных маркеров, которые обнаруживаются задолго до клинических признаков, позволяет вовремя начать более тщательную диагностику и превентивную терапию. Под молекулярными маркерами понимают любые фиксируемые изменения, происходящие в опухолевой клетке и отсутствующие в клетке нормальной, от гиперэкспрессии или, наоборот, потери активности некоторых генов до точковых мутаций и делеций целых хромосомных районов. Особое внимание, в связи с этим, уделяется исследованию эпигенетических изменений, происходящих в клетке, которая находится в пограничном состоянии между нормой и опухолевой трансформацией. В пользу того, что аномальное метилирование является одним из наиболее ранних событий в геноме трансформированной клетки, свидетельствуют обнаружение метилирования гена р16 в гипер-плазированном эпителии бронхолегочной системы, обнаружение метилирования гена MLH1 в аденомах толстого кишечника и др.

Исследуя пограничные состояния, предшествующие опухолевой трансформации, такие как гиперплазия и дисплазия в образцах сквамозного эпителия шейки матки нам удалось показать, что аномальное метилирование основных генов, регулирующих клеточных цикл уже присутствует на стадии диспластических, но еще не злокачественных процессов. Полученный результат демонстрирует, что аномальное метилирование промоторов некоторых генов является одним из самых ранних событий, происходящих в клетке, задолго до генетических изменений, приводящих к трансформации клетки в опухолевую.

Проводя сравнительный анализ статуса метилирования генов-супрессоров опухолевого роста на парных образцах тканей, взятых у одного пациента (образец дисплазии - образец морфологически нормальной ткани), нами впервые выявлена проблема нормального контроля при изучении профиля метилирования генов в опухолях и диспластических состояниях. Выяснилось, что в морфологически нормальной ткани, взятой в качестве контроля на границе с очагом трансформации, исследуемые гены тоже могут подвергаться аномальному метилированию. Наиболее реальным объяснением полученных результатов может быть участие метилирования генов в предопухолевой трансформации клетки, ещё не выявляемой морфологически. Другими словами, эпигенетические изменения в геноме клетки могут происходить задолго до проявления злокачественной трансформации и даже гиперпластических процессов, а молекулярные методы могут являться более строгим контролем наличия или отсутствия злокачественных изменений в тканях, чем цитологический. Проведение статистической обработки и выявление достоверных различий между метилированием генов р!б, HIC1 uMLHl в группе образцов сквамозного эпителия шейки матки с диспластическими изменениями и контрольной группе образцов морфологически нормальной ткани, подтверждает участие процесса метилирования данных генов в патогенезе цервикальных карцином уже на самых начальных стадиях канцерогенеза. Различный характер метилирования этих генов в исследуемой и контрольной ткани свидетельствует о возможности использования метилирования качестве раннего маркёра дис-пластических поражений цервикального эпителия и выявления, таким образом, пациентов с повышенным риском малигнизации.

Выявление достоверных различий в метилировании разных генов между опухолевыми и нормальными клетками позволяет использовать профиль метилирования генов-супрессоров в диагностических протоколах, где в сочетании с другими молекулярно-генетическими методами и маркерами, определение аномального метилирования может быть необходимым, как для ранней диагностики злокачественных процессов, так и для определения прогноза развития и поведения опухоли. Разработка стандартного набора ДНК-маркеров для наиболее часто встречающихся онкологических заболеваний, позволит эффективно проводить скрининг и бороться с онкопатологией на самых ранних этапах ее возникновения, проводить мониторинг заболевания в периоды ремиссий, определять микрометастазы в период лечения и определять тактику терапии в случае инактивации определенных генов-рецепторов.

Приведенные данные позволяют начать разработку проспективных диагностических протоколов, основанных на неинвазивных методах исследования ДНК из плазмы крови, мокроты, слюны, желудочного сока, мочи, кала и мазков из половых путей. Механизмы выхода ДНК в плазму крови еще до конца не изучены, но наличие там свободной ДНК является установленным фактом, позволяющим проводить неинвазивную диагностику. Наличие аномального метилирования генов RB1, р1б, MLH1, CDH1, микросателлитной нестабильности и потери гетерозиготности по определенным хромосомным районам, мутаций генов р53, K-ras и др. в плазме крови с высокой вероятностью свидетельствует о наличии в организме злокачественного процесса (Залетаев и др., 2002).

Анализ метилирования промоторных районов генов, вовлеченных в генез наследственных и онкологических заболеваний, посредством предложенных нами подходов, имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными молекулярно-генетическими методами: однозначность и легкость интерпретации результатов, возможность поставить диагноз в течение 2-3 дней, отсутствие радиоактивно меченых нуклеотидов, технологическая эффективность и низкая себестоимость, что делает возможным использование этого анализа в клинических лабораториях в практической медицине.

Исследование эпигенетической регуляции экспрессии генов в норме и при патологии является новым направлением в молекулярной генетике человека. Обилие экспериментальных данных о роли таких нарушений в этиологии онкологических и наследственных заболеваний свидетельствует, что установлен новый класс молекулярной патологии. Результаты дальнейших исследований позволят получить новую информацию о закономерностях функционирования генома человека. Это, в свою очередь, приведет к разработке новых эффективных диагностических подходов, новых лекарственных средств и методов терапии.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Немцова, Марина Вячеславовна, 2002 год

1. Баранова А.В., Янковский Н.К. // Гены-супрессоры опухолевого роста. // Мол. Биол.1998, т. 32, №2, с. 206-218.

2. Бабенко О.В., В.В.Землякова, С.В.Саакян, А.Ф.Бровкина, В.В.Стрельников,

3. М.В.Немцова, Д.В.Залетаев.// Функциональная патология генов RB1 и р16 в ретинобластомах. //Молекулярная биология. 2002, т.36, № 5, с.777-783.

4. Бабенко О.В., С.В.Саакян, АФ.Бровкина, В.М.Козлова, М.В.Немцова, Д.В.Залетаев.//

5. Спектр и частота структурной патологии гена RB1 при ретинобластоме.// Молекулярная биология. 2002, т.36, № 4, с.623-629.

6. Бровкина А.Ф. // Ретинобластома. // В кн. "Наследственные и врожденные заболеваниясетчатки и зрительного нерва" под ред. АМ.Шамшиновой. М. Медицина 2001, с. 360371.

7. Залетаев Д., Немцова М., Бочков Н.// Метилирование ДНК как этиологический факторканцерогенеза.// Вестник академии медицинских наук 2002, № 4, стр. 6-11.

8. Залетаев Д.В.//Эпигенетическая патология при наследственных и онкозаболеваниях.// Всб. научных трудов РАЕН «Проблемы биомедицины на рубеже XXI века». М., 2000, с. 303-309

9. Зборовская И.Б, Татосян А.Г.// Молекулярно-генетические маркёры при раке лёгкого:онкогены и гены-супрессоры.// В. кн.: Новое в терапии рака лёгкого, М, 1997, с.5-17.

10. Зборовская И.Б. // Молекулярно-биологические исследования онкогенов и геновсупрессоров опухолевого роста в клинической практике. // В кн. Канцерогенез. М. 2000, с. 361-380.

11. Зборовская И.Б., Ельчева И.А., Татосян А.Г. // Молекулярно-генетическиеисследования рака молочной железы: онкогены и гены-супрессоры.// В кн. «Новое в терапии рака молочной железы» под ред. Переводчиковой Н.И., М. 1998, с. 11 -18.

12. Киселева Н.П., Киселев Ф.Л. // Эпигенетические изменения и канцерогенез. // В кн. Канцерогенез. М. 2000, с. 93-105.

13. Козлова С.И., Демикова Н.С., Семанова Е., Блинникова О.Е. (1996) Наследственные синдромы и медико-генетическое консультирование. 1996 , Москва, изд. Практика: с. 304-305.

14. Копнин Б.П. // Опухолевые супрессоры и мутаторные гены. // В кн. Канцерогенез. М. 2000, с. 75-92.

15. Лихтейнштейн А.В., Киселева Н.П. // Метилирование ДНК и канцерогенез. // Биохимия 2001, т. 66, вып. 3, с. 293-317.

16. Мазин А.Л., Ванюшин Б.Ф. //Потеря CpG динуклеотидов из ДНК. П1. Метилирование и эволюция гистоновых генов.// Молекулярная Биология, 1987, т. 21, №3, с. 678-87.

17. Немцова М.В. // Геномный импринтинг и наследственная патология.// Молекулярная биология, 2000, т. 34, № 4, с. 554-560.

18. В.В.Стрельников, М.В.Немцова, О.Е.Блинникова, Г.Г.Чеснокова, Н.П.Кулешов, Д.В .Залетаев// Современные методы ДНК-диагностики синдрома Мартина-Белл.// Педиатрия, 2000, № 4, с. 21-25.

19. Трапезников Н.Н., Аксель Е.М. // Статистика рака молочной железы.// В кн. «Новое в терапии рака молочной железы» под ред. Переводчиковой Н.И., М. 1998, стр.6-10.

20. Яценко А.Н. // Молекулярно-генетическая характеристика района локализации гена, ответственного за множественную экзостозную хондродисплазию (ЕХТ1). // Авт. канд. дис. М., 1996.

21. Albrecht U, SutclifFe J.S., Cattanach B.M.,Beechey C.V.,Armstrong D. et al.// Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene Ube3a in hippocampi and Purkinje neurons. // Nature Genetics 1997, v. 17, p. 75-78.

22. Alonso J., Garcia-Miguel P., Adelairas J. et al. // Spectrum of germline RBI gene mutations in Spanish retinoblastoma patients: phenotypic and molecular epidemiological implications. //Hum. Mutat. 2001, v. 17, p. 412-422.

23. Angelman, H. // Puppet children': a report of three cases. // Dev. Med. Child Neurol. 1965, v. 7, p. 681-688.

24. Antequera F, Bird A. // CpG islands.//EXS. 1993, v.64, p. 169-185.

25. Archer SY, Hodin RA. // Histone acetylation and cancer.// Curr Opin Genet Dev. 1999, v. 9, p. 171-174.

26. Bandara L.R., Adamczewski J.P., Hunt Т., La Thangue N.B. // Cyclin A and the retinoblastoma gene product complex with a common transcription factor. // Nature 1991, v. 352, p. 249-251.

27. Barlow D.P. // Gametic imprinting in mammals.// Science 1995, v.8, 270, p.1610-1613.

28. Barr J.A. et al. // Ubiquitous expression and imprinting of Snrpn in the mouse. //Mammalian genome, 1995, p. 405-407.

29. Bartolomei M.S., Tilghman S.M. // Parental imprinting of mouse chromosome 7. // Semin. Dev. Biol. 1992, v. 3, p. 107-117.

30. Baylin SB, Herman JG, Graff JR, Vertino PM, Issa JP. // Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect of neoplasia. // Adv. Cancer. Res. 1998, v.72, p. 141-196.

31. Bell, A. C., Felsenfeld, G. // Stopped at the border: boundaries and insulators. // Curr. Opin. Genet. Dev. 1999, v. 9, p. 191-198.

32. Bestor Т.Н. // DNA methylation: evolution of a bacterial immune function into a regulator of gene expression and genome structure in higher eukaryotes.// Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci. 1990, v. 30;326, p. 179-187.

33. Bestor Т.Н., Vergine G.L. // DNA methyltransferases. // Curr Opin Cell Biol. 1994, v. 6, p.380-399.

34. Bhattacharya SK, Ramchandani S, Cervoni N, Szyf M. // A mammalian protein with specific demethylase activity for mCpGDNA. //Nature 1999, v. 397, p.579-583.

35. Bird A. // The essentials of DNA methylation.// Cell, 1992, v. 70, p. 5-8.

36. Bird A.P. // Gene number, noise reduction and biological complexity. //Trends Genet. 1995, v. 1, p. 94-100.

37. Bird AP. // CpG-rich islands and the function of DNA methylation.// Nature 1986, v.321, p.209-213.

38. Blagitko N, Schulz U., A.A.Schinzel A. A., et al. // gamma2-COP, a novel imprinted gene on chromosome 7q32, defines a new imprinting cluster in the human genome. // Hum. Mol. Genet. 1999, v. 8, p.23 87-296.

39. Blanquet V., Turlean C., Gross-Morand S., Senamaud-Beaufort C., Doz F., Besmond C. // Spectrum of germline metation in the RB 1 gene: study of 232 patiens with hereditary and non hereditary retinoblastoma. // Hum. Mol. Genet. 1995, v. 4, p. 383-388.

40. Boccaccio, I.; Glatt-Deeley, H.; Watrin, F.; Roeckel, N.; Lalande, M.; Muscatelli, F. II The human MAGEL2 gene and its mouse homologue are paternally expressed and mapped to the Prader-Willi region.// Hum. Molec. Genet. 1999, v. 8, p. 2497-2505.

41. Brandeis M., Kafri Т., Ariel M., Chaillet J.R., McCarrey J., Razin A, Cedar H. // The ontogeny of allele-specific methylation associated with imprinted genes in mouse.// EMBO J. 1993, v. 12, p. 3669-3677.

42. Bremner R., Du D.C., Connolly-Wilson M., Bridge P., Ahmad K., Mostachifi H., Rushlow D. and Gallie B. // Deletion of RB exons 24 and 25 causes low-penetrance retinoblastoma. // Hum. Genet. 1997, v. 61, p. 559-570.

43. Brown, K.W. et al. //Imprinting mutation in the Beckwith-Wiedemann syndrome leads to biallelic IGF2 expression through an HI 9 independent pathway.// Hum. Mol. Genet. 1996, v. 6, p. 2027-2032.

44. Buchkovich K., Duffy L. A. and Harlow E. // The retinoblastoma protein is phosphorylated during specific phases of the cell cycle. //Cell, 1989, v. 58, p. 1097-1105.

45. Buiting, K.; Barnicoat, A.; Lich, C.; Pembrey, M.; Malcolm, S.; Horsthemke, B. // Disruption of the bipartite imprinting center in a family with Angelman syndrome.// Am. J. Hum. Genet. 2001, v. 68, p. 1290-1294.

46. Burger J., Buiting K., Dittrich В., Grob S., Lich C. et al.// Different mechanisms and recurrence risks of imprinting defects in Angelman syndrome. // Am. J. Hum. Genet. 1997, v. 61, p. 88-93.

47. Buxton, J. L.; Chan, C. J.; Gilbert, H.; Clayton-Smith, J.; Burn, J.; Pembrey, M.; Malcolm, S. // Angelman syndrome associated with a maternal 15ql 1-13 deletion of less than 200 kb. //Hum. Molec. Genet. 1994, v.3, p. 1409-1413.

48. Chambers A.F., Matrisian L.M. // Changing views of the role of matrix metalloproteinases in metastasis.//J. Natl. Canser Inst. 1997. v. 89, p. 1260-1270.

49. Carlin M., Escobar L., Ward R., Wielgus T. //A reassessment of Beckwith-Wiedemann syndrome (BWS). (Abstract)// Am. J. Hum. Genet., 1990, v.47, p. A50.

50. Caron H., van Sluis P., van Hoeve M., et al. // Chromosome lp allelic loss in neuroblastoma: prognosis, genomic imprinting and 1;17 translocations.// Nature Genet. 1993, v. 4. p. 187-190.

51. Cassidy S.B. // Prader-Willi syndrome.// J. Med. Genet., 1997, v.4, p. 917-923.

52. Cassidy, S. В.; Lai, L.-W.; Erickson, R. P.; Magnuson, L.; Thomas, E.; Gendron, R.; Herrmann, J. // Trisomy 15 with loss of the paternal 15 as a cause of Prader-Willi syndrome due to maternal disomy. // Am. J. Hum. Genet. 1992, v. 51, p. 701-708.

53. Cavenee W. K., Dryja T.P., Phillips R.A., Benedict W.F., Godbout R, Gallie B.L., Murphree A.L., Strong L.C. and White R.L. // Expression of recessive alleles by chromosomal mechanisms in retinoblastoma. // Nature 1983, v. 305, p. 779-784.

54. Chakrabarti L, Bristulf J, Foss GS, Davies KE // Expression of the murine homologue of FMR2 in mouse brain and during development.// Hum. Mol. Genet . 1998, v. 7:3, p. 441448.

55. Chakrabarti L, Knight SJ, Flannery AV, Davies KE. //A candidate gene for mild mental handicap at the FRAXE fragile site.// Hum Mol Genet 1996, v. 5, p. 275-282.

56. Charrow, J.; Balkin, N.; Cohen, M. M. // Translocations in Prader-Willi syndrome. // Clin. Genet. 1983, v. 23, p. 304-307.

57. Chellappan S.P., Hiebert S., Mudryj M. et al. // The E2F transcription factor is a cellular target for theRB protein. // Cell 1991, v. 65, p. 1053-1061.

58. Chen P.L., Scully P., Shew J.Y., Wang J.Y. and Lee W.H. // Phosphorylation of the retinoblastoma gene product is modulated during the cell cycle and cellular differentiation. // Cell 1989, v. 58, p. 1193- 1198.

59. Cheng J.M., Hiemstra J.L., Schneider S.S., et al.// Preferential amplification of the paternal allele in neuroblastomas with N-myc amplification. // Nature, 1993, v. 4, p. 191-194.

60. Chiurazzi P, Pomponi MG, Pietrobono R, Bakker CE, Neri G, Oostra BA // Synergistic effect of histone hyperacetylation and DNA demethylation in the reactivation of the FMR1 gene. //Hum. Molec.Genet.1999, v. 8, p. 2317-2323.

61. Choi YC, Chae CB. // Demethylation of somatic and testis-specific histone H2A and H2B genes in F9 embryonal carcinoma cells. // Mol Cell Biol 1993, v. 13, p. 5538-5548.

62. Chu C.E„ Donaldson M.D.C., Kelnar C.J.H., et al.// Possible role of imprinting in the Turner phenotype. // J. Med. Genet. 1994, v.31, p.840-842.

63. Chuang LS, Ian Ш, Koh TW, Ng HH, Xu G, Li BF. //Human DNA-(cytosine-5) methyltransferase-PCNA complex as a target for p21WAFl.// Science 1997, v. 277, p. 19962000.

64. Clark SJ, Harrison J, Paul CL, Frommer M. // High sensitivity mapping of methylated cytosines.//Nucleic Acids Res. 1994, v. 11;22, p.2990-2997.

65. Clayton-Smith J., Pembrey ME. // Angelman syndrome.// J.Med.Genet.1992, v. 29, p.412-415.

66. Clayton-Smith J., Webb Т., Robb SA, Digkstra I., Willems P. et al. // Further evidence for dominant inheritance at the chromosome 15qll-ql3 locus in familial Angelman syndrome.// Am.J.Med.Genet.1992, v. 44, p. 256-260.

67. Coffee B, Zhang F, Warren ST, Reines D // Acetylated histones are associated with FMR1 in normal but not fragile X-syndrome cells. // Nat Genet 1999, v. 22, p. 98-101.

68. Comings D.E. // A general theory of carcinogenesis. // Proceeding of the National Academy of the Sciences of the USA 1973, v. 70, p. 3324-2228.

69. Conroy JM, Grebe ТА, Becker LA, Tsuchiya K, Nicholls RD, Buiting K, Horsthemke B, Cassidy SB, Schwartz S.//Balanced translocation 46,XY,t(2;15)(q37.2;qll.2) associated with atypical Prader-Willi syndrome. //Am. J. Hum. Genet., 1997, v.61, p.388-394.

70. Constancia M., Pickard В., Kelsey G., Reik W. // Imprinting mechanisms. // Genome Research 1998, v.8, p.881-900.

71. Costello J., Plass C. // Methylation matters.// J. Med. Genet., 2001, v.38, p.285-303.

72. Cowell J.K., Smith Т., Bia B. // Frequent constitutional С to T mutation in CGA-arginin codons in the RBI gene produce premature stop codons in patients with bilateral (hereditary) retinoblastoma. //Europ. J. Hum.Genet. 1994, v. 2, p. 281-290.

73. Creusot F, Acs G, Christman JK.// Inhibition of DNA methyltransferase and induction of Friend erythroleukemia cell differentiation by 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine.// J. Biol. Chem. 1982, v. 25;257, p.2041-2048.

74. Crouse HV, Brown A, Mumford ВС. //Chromosome inheritance and the porblem of chromosome "imprinting" in Sciara (Sciaridae, Diptera).// Chromosoma. 1971, v.34, p. 324398.

75. Dao D., Frank D., Qian N, et al. // IMPT1, an imprinted gene similar to polyspecific transporter and multi-drug genes.// Hum.Mol.Genet. 1998, v.7, p.597-608.

76. De Vries BBA, Fryns JP, Butler MJ, Canciani F, Wesbyvan Swaay E, van Hemel JO, Oostra В A, Halley DJJ, Niermeijer MF. // Clinical and molecular studies in fragile X patients with a Prader-Willi-like Phenotype. // J Med Genet 1993, v.30, p. 761-766.

77. DeCaprio J. A., Ludlow J.W., Lynch D., Furukawa Y., Griffin J. et al. // The product of the retinoblastoma susceptibility gene has properties of a cell cycle regulatory element. // Cell 1989, v. 58, p. 1085-1095.

78. Devys D Lutz Y Rouyer N Bellocq JP Mandel JL // The FMR-1 protein is cytoplasmic, most abundant in neurons and appears normal in carriers of a fragile X permutation. // Nature Genet. 1993, v. 4, p. 335-340.

79. Dhar V, Skoultchi Al, Schildkraut CL // Activation and repression of a beta-globin gene in cell hybrids is accompanied by a shift in its temporal replication.// Mol. Cell Biol 1989, v. 9, p. 3524-3532.

80. Dimri G.P., Itahana K., Acosta M., Campisi J. // Regulation of a senescence checkpoint response by the E2F1 transcription factor and pl4ARF tumor suppressor. // Mol. Cell. Biol.2000, v.20, p.273-285.

81. Doerfler W. // Patterns of de novo DNA methylation and promoter inhibition; studies on the adenovirus and the human genomes.//EXS. 1993, v. 64, 262-299.

82. Draper G.J., Sanders B.M., Kingston J.E. // Second prymary neoplasm in patient with retinoblastoma. // Br. J. Cancer. 1988, v. 53, p. 661-671.

83. Droufakou S., Deshmane V., Roylance R., et al. // Multiple ways of silencing E-cadherin gene expression in lobular carcinoma of the breast. //Int. J. Cancer. 2001, v.92, p.404-408.

84. Dunn J.M., Phillips R.A., Zhu X., Becker A. and Gallie B.L. // Mutations in the RBI gene and their effects on transcription. // Molec. Cell. Biol. 1989, v. 9, p. 4596-4604.

85. Dyson N., Balmain A. // Oncogenes and cell proliferation. // Curr.Op.Gen. Development 1999, v.9, p.11-14/

86. Dyson N., Buchkovich K, Whyte P. and Harlow E. // The cellular 107k protein that binds to adenovirus El A also associated with the large T antigen of SV40 and JC virus. // Cell. 1989, v. 58, p. 248-255.

87. Eapen V., O'Neill J., Gurling H.M.D., et al. // Sex of parent transmission effect in Tourette's syndrome: evidence for earlier age at onset in maternally transmitted cases suggests a genomic imprinting effect. //Neurology 1997, v.48, p.934-937.

88. Elliott M., Maher E. //Beckwith-Wiedemann syndrome.// J. Med. Genet., 1994, v. 31, p. 560-564.

89. Eng C., Abramson D.H., Ellsworth R.M., Wong F.L., Goldman M.B., Seddon J. et al. // Mortality from second tumors among long-term survivors of retinblastoma. // J. Nanl. Cancer. Inst. 1993, v. 85, p. 1121-1128.

90. Engemann S., Strodicke M., Paulsen M., Frank O., Reinhard R., et al.// Sequence and functional comparison in the Beckwith-Wiedemann region: implication for a novel imprinting centre and extended imprinting.// Hum Mol Genet. 2000, v.9, p.2691-2706.

91. Esteller M, Catasus L, Matias-Guiu X, Mutter GL, Prat J, Baylin SB, Herman JG.// hMlhl promoter hypermethylation is an early event in human endometrial tumorigenesis.// Am. J. Pathol. 1999, v. 155, p. 1767-1772.

92. Esteller M, Tortola S, Toyota M, Capella G, Peinado MA, Baylin SB, Herman JG. // Hypermethylation-associated inactivation of pl4 (AEP) is independent of pl6(INK4a) methylation and p53 mutational status.// Cancer. Res .2000, v.60, p. 129-133.

93. Esteller M., Corn P.G., Baylin S.B., Herman J.G.// A Gene hypermethylation profile of human cancer.// Cancer Research 2001, v.61, p.3225-3229.

94. Evans D.G., Huson, S.M., Donnai, D., et al. // A genetic study of type 2 neurofibromatosis in the United Kingdom. II. Guidelines for genetic counselling.// J. Med. Genet., 1992, v.29, p.847-852.

95. Feil R., Kesley G. // Genomic imprinting: A chromatin connection. // Amer. J. Hum.Gen. 1997, v. 61, p. 1213-1219.

96. Feinberg AP, Vogelstein B. // Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts.// Nature 1983, v.301, p.89-92.

97. Ferguson-Smith A.C., Surani M. A. // Imprinting and epigenetic assymetry between parental genomes. // Science 2001, v 293, p.1086-1089.

98. Field S.J., Tsai F.Y., Kuo F., Zubiaga A.M., Kaelin W.G., Livingston D.M., Orkin S.H., Greenberg M. E. // E2F-1 Functions in mice to promote apoptosis and supress proliferation. //Cell 1996, v. 85, p. 549-561.

99. Friend S., Bernards R., Rogelj S., Weinberg R., Rapaport J., Albert D., Dryja T. // A human DNA segment with properties of the gene that predisposes to retinoblastoma and osteosarcoma. //Nature 1986, v. 323, p. 643-646.

100. Fryns JP. // Personal Communication // Leuven, Belgium 5/28/1993.

101. Fu YH, Pizzuti A, Fenwick RG Jr, King J, Rajnarayan S, Dunne PW, Dubel J, Nasser GA, Ashizawa T, de Jong P, et al.//An unstable triplet repeat in a gene related to myotonic muscular dystrophy.// Science. 1992, v.255, p. 1256-1258.

102. Fujii H, Biel MA, Zhou WB, Weitzman SA, Baylin SB, Gabrielson E. // Methylation of the ШС-1 candidate tumor suppressor gene in human breast cancer.// Oncogene 1998, v. 16, p.2159-2164.

103. Fulmer-Smentek SB, Francke U.//Association of acetylated histones with paternally expressed genes in the Prader-Willi deletion region. //Hum Mol Genet. 2001, v.10, p.645-652.

104. Fulmer-Smentek, S. В.; Francke, U. // Association of acetylated histones with paternally expressed genes in the Prader-Willi deletion region.// Hum. Molec. Genet. 2001, v. 10, p. 645-652.

105. Gade J.R, Meyer C. and Wettern F.O. // The E7 proteins of the nononcogenic human papillomavirus type 6b (HPV-6b) and the oncogenic HPV-16 differ in retinoblastoma protein bilding and other propertis. // Journal of Virology 1990, v. 64, p. 723-730.

106. Gardie В., Cayuela J.M., Martini S., Sigaux F. // Genomic alteration of the pl9 ARF encoding exon in T-cell acute lymphoblastic leukemia.// Blood 1998, v.91, p.1016-1020.

107. Gardiner-Garden M, Frommer M. // CpG islands in vertebrate genomes.// J. Mol. Biol. 1987, v.196, p.261-282.

108. Gecz J, Gedeon AK, Sutherland GR, Mulley JC // Identification of the gene FMR2, associated with FRAXE mental retardation. //Nat Genet 1996, v. 13, p. 105-108.

109. Gedeon AK, Baker E, Robinson H, Partington MW, Gross B, Manca A, Korn B, Poustka A, Yu S, Sutherland GR, Mulley JC // Fragile X syndrome without CGG amplification has anFMR-1 deletion. //Nat Genet 1992, v.l, p. 341-344.

110. Giraud F, Ayme S, Mattei JF, Mattei MG //Constitutional chromosomal breakage. // Hum Genet 1976, v. 34, p. 125-136.

111. Glenn C.C., Saiton S., Jong M.T.C, Filbrandt M.M., Surti U., Driscoll D.J., Nicholls R.D. // Gene structure, DNA methylation, and imprinted expression of the human SNRPN gene. // Amer. J. Hum.Genet. 1996, v. 58, p. 335-346.

112. Glenn CC, Nicholls RD, Saitoh S. et al. // Modification of 15qll-ql3 DNA methylation imprints in unique Angelman and Prader-Willi patients. // Hum.Mol. Genet. 1993, v. 2, p. 1377-1382.

113. Goodrich D. W.; Wang N. P.; Qian Y.W.; Lee E. Y.H. P. and Lee W.H. // The retinoblastoma gene product regulates progression through the G1 phase of the cell cycle. // Cell 1991, v. 67, p. 293-302.

114. Graff JR, Herman JG, Lapidus RG, Chopra H, Xu R, Jarrard DF, Isaacs WB, Pitha PM, Davidson NE, Baylin SB.// E-cadherin expression is silenced by DNA hypermethylation in human breast and prostate carcinomas.// Cancer Res. 1995, v.55, p.5195-5199.

115. Gray T.A., Saiton S., Nicholls R.D. // An imprinted, mammalian bicistronic transcript encodes two independent proteins. // PNAS USA 1999, v. 96, p. 5616-5621.

116. Gray T.A., Smithwick M.J., Schaldach M.A., Martone D.L., Nicholls RD. et al. // Concerted regulation and molecular evolution of the duplicated SNRPB'/B and SNRPN loci.// NAR 1999, v. 27, p. 4577-4584.

117. Greger, V.; Woolf, E.; Lalande, M. // Cloning of the breakpoints of a submicroscopic deletion in an Angelman syndrome patient.// Hum. Molec. Genet. 1993, v. 2, p. 921-924.

118. Gu K, Mes-Masson AM, Gauthier J, Saad F. // Analysis of the pl6 tumor suppressor gene in early-stage prostate cancer.// Mol .Carcinog .1998, v.21, p.164-170.

119. Gu Y, Lugenbeel KA, Vockley JG, Grody WW, Nelson DL // A de novo deletion in FMR1 in a patient with developmental delay. // Hum Mol Genet 1994, v. 3, p. 1705-1706.

120. Guillemot F., Caspary Т., Tilghmann S.M., at al. // Genomic imprinting of Mash2, a mouse gene required for trophoblast development. // Nat. Genet. 1995, v.9, p.235-242.

121. Hagstrom S.A. and Dryja T.P. //Mitotic recombination map of 13cen-13ql4 derived from an investigation of loss of heterozygosity in retinoblastomas. // Proc. Nat. Acad, Sci. 1999, v. 96, p. 2952-2957.

122. Hall, J. G.//Genomic imprinting and its clinical implications. // New Eng. J. Med. 1992, v. 326, p. 827-829.

123. Hanada M., Delia D. // bcl-gene hypomethylation and high-level expression in B-cell chronic lymphocytic leukemia. //Blood 1993, v. 82, p. 1820.

124. Hansen RS, Canfield TK, Fjeld AD, Mumm S, Laird CD, Gartler SM // A variable domain of delayed replication in FRAXA fragile X chromosomes: X inactivation-like spread of late replication. // Proc Natl Acad Sci U S A 1997, v. 94, p. 4587-4592.

125. Hansen RS, Canfield TK, Lamb MM, Gartler SM, Laird CD // Association of fragile X syndrome with delayed replication of the FMR1 gene. Cell 1993, v. 73, p. 1403-1409.

126. Harbour J.W., Luo R.X., Dei Santi A., Postigo A.A., Dean D.C. // Cdk phosphorilation triggers sequental intramolecular interaction that progressively block Rb functions as cells move through GI. // Cell 1999, v. 98, p. 859-869.

127. Harvey J, Judge C, Wiener S // Familial X-linked mental retardation with an X chromosome abnormality. // J Med Genet 1977, v. 14, p. 46-50.

128. Hatada I., Mukai T.// Genomic imprinting of p57KIP2, a cycline-dependent kinase inhibitor in mouse.// Nat Genet. 1995, v. 11, p.204-206.

129. Hatada I., Nabetani A., Morisaki H. // New p57KIP2 mutations in Wiedemann-Beckwith syndrom. //Hum.Genet. 1997, v.100, p.681-683.

130. Hattori M, Fujiyama A, Taylor TD, Watanabe H K. // The DNA sequence of human chromosome 21. //Nature 2000, v. 18;405, p.311-319.

131. Heard E, Clerc P, Avner P // X-chromosome inactivation in mammals. // Annu Rev Genet 1997, v.31, p. 571-610.

132. Hecht F, Bixenman HA // Location of FRAXD in Xq27.2. Fragile sites on the X chromosome.// Cancer Genet Cytogenet 1990, v. 49, p. 137-138.

133. Henry I., Bonaiti-Pellie C., Chehensse V., at al.// Uniparental paternal disomyin a genetic cancer-predisposing syndrom.//Nature, 1991, v. 351, p.665-667.

134. Hensel C., Hsieh C.L., Lee W.H., Pam-Lee E., Gazdar A., Sakaguchi A.Y., Naylor S.L. // Allele loss and lack of expression of the RB-1 locus in small cell lung cancer. (Abstract). // Am. J. Hum. Genet. 1988, v. 43, A25.

135. Hergersberg M, Matsuo K, Gassman M, Schaffner W, Luscher B, Rulicke T, Aguzzi К // Tissue-specific expression of a FMR-l/beta galactosidase fusion gene in transgenic mice.// Hum Mol Genet 1995, v.4, p. 359-366.

136. Herman JG, Latif F, Weng Y, Lerman MI, Zbar B, Liu S, Samid D, Duan DS, Gnarra JR, Linehan WM.// Silencing of the VHL tumor-suppressor gene by DNA methylation in renal carcinoma. //Proc. Natl. Acad .Sci .USA 1994, v.91, p.9700-9704.

137. Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB.// Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.// Proc Natl Acad Sci USA. 1996, v. 3;93, p.9821-9826.

138. Herman JG, Jen J, Merlo A, Baylin SB. // Hypermethylation-associated inactivation indicates a tumor suppressor role for pl5INK4B. // Cancer Res. 1996, v.56, p.722-727.

139. Herman JG. // Hypermethylation of tumor suppressor genes in cancer.// Semin Cancer Biol. 1999, v.9, p.359-367.

140. Hirst M, Grewal P, Flannery A, Slatter R, Maher E, Barton D, Fryns JP, Davies К // Two new cases of FMR1 deletion associated with mental impairment.// Am. J. Hum. Genet. 1995, v. 56, p. 67-74.

141. Hirst MC, Barnicoat A, Flynn G, Wang Q, Daker M, Buckle VJ, Davies KE, Bobrow M // The identification of a third fragile site, FRAXF, in Xq27-q28 distal to both FRAXA and FRAXE. // Hum Mol Genet 1993, v.2, p. 197-200.

142. Holmquist GP // Role of replication time in the control of tissue-specific gene expression.// Am J Hum Genet 1987, v 40, p. 151-73.

143. Hoovers J.M., Kalikin L.M., JonsonL.A.,at al.// Multiple genetics loci within 1 lpl5 defined by Wiedemann-Beckwith syndrom rearrangement breakpoints and subchromosomal transferable fragments.//Proc.Natl. Acad.Sci.US A 1995, v.92, p. 12456-12460.

144. Hornstra IK, Nelson DL, Warren ST, Yang TP // High resolution methylation analysis of the FMR1 gene trinucleotide repeat region in fragile X syndrome. // Hum Mol Genet 1993, v. 2, p. 1659-1665.

145. Horsthemke В., Greger V., Barnert H.J., Hopping W. and Passarge E. // Detection of submicroscopic deletions and a DNA polymorphism at the retinoblastoma locus. // Hum. Genet. 1987, v. 76, p. 257-261.

146. Hsieh J.K., Chan F. S., O'Connor D.J., et al. // RB regulates the stability and the apoptotic function of p53 via MDM2. //Molec. Cell 1999, v. 3, p. 181-193.

147. Huang T. // Identification of DNA methylation markers for human breast carcinoma using the methylation-sensitive restriction fingerprinting technique. // Canser Res. 1997, v. 57, p. 1030-1034.

148. Iguchi-Ariga SM, Schaffner W.// CpG methylation of the cAMP-responsive enhancer/promoter sequence TGACGTCA abolishes specific factor binding as well as transcriptional activation.// Genes Dev. 1989, v.3, p.612-619

149. Issa JP, Ottaviano YL, Celano P, Hamilton SR, Davidson NE, Baylin SB. // Vethylation of the oestrogen receptor CpG island links ageing and neoplasia in human colon. // Nat Genet 1994, v.7, p.536-540.

150. Jiang, Lev-Lehman, Bressler, Tsai, Beaudet. // Genetics of Angelman syndrome. // Am. J. Hum. Genet. 1999, v. 65, p. 1-6.

151. John R.M., Surani M.A. // Imprinted genes and regulation of gene expression by epigenetic inheritance.//Curr.Opin.Cell Biol. 1996, v.8, p. 348-353.

152. Jones P., Takai D.// The role of DNA methylation in mammalian epigenetics.// Sciens 2001, v.293, p. 1069-1070.

153. Jones PA.// The DNA methylation paradox.// Trends Genet .1999, v. 15, p.34-37.

154. Jost J.P., Jost Y.C.// Mechanism of active DNA demethylation during embryonic development and cellular differentiation in vertebrates. // Gene 1995, v. 19, p. 265-266.

155. Joyce J.A., at al. // Imprinting IGF2 and H19: lack of reciprocity in sporadic Beckwith-Wiedemann syndrom.//Hum.Mol.Genet. 1997, v.6, p. 1543-1548.

156. Kaelin W.G., Pallas D.C., DeCaprio J.A., Kaye F.J., Livingston D. M. // Identification of cellular proteins that can interact specifically with the T/ElA-binding region of the retinoblastoma gene product. // Cell 1991, v. 64, p. 521-532.

157. Kaghad M., Bonnet H., Yang A., et al. // Monoallelically expressed gene related to p53 at lp36, a region frequently deleted in neuroblastoma and other human cancers. // Cell. 1997, v.22, p. 809-819.

158. Kamb A., Gruis N.A., Weaver-Feldhaus J. et al. // A cell regulatory potentially involved in genesis of many tumor types. // Science 1994, v. 264, p. 436-440.

159. Kashino, Т.; Lalande, M.; WagstafF, J. // UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome//Nature Genet. 1997, v. 15, p. 70-73.

160. Katri T. et al. // Developmental pattern of gene-specific DNA methylation in the mouse embryo and germ line. // Genes & Development, 1992, v. 6, p. 705-714.

161. Kennet S.B., Udvadia A.J., Horowitz J.M. // Sp3 encodes multiple proteins that differ in their capacity to stimulate or repress transcription. // Nucleic Acids Res. 1997, v. 26, p. 3110-3117.

162. Kennet S.B., Udvadia A.J., Horowitz J.M. // Sp3 encodes multiple proteins that differ in their capacity to stimulate or repress transcription. // Nucleic Acids Res. 1997, v. 26, p. 3110-3117.

163. Khandjian EW, Corbin F, Woerly S, Rousseau F // The fragile X mental retardation protein is associated with ribosomes. //Nature Genet. 1996, v. 12, p. 91-93.

164. Kiono Т., Foster S.A., Koop J.I, McDougall J.K., Galloway D.A., Klingelhutz A.J. // Both Rb/pl6INK4a inactivation avd telomerase activity are required to immortalize human epithelial cells. // Nature 1998, v. 396, p. 84-89.

165. KlimaDauskas S, Roberts RJ // M.Hhal binds tightly to substrates containing mismatches at the target base. // Nucleic Acids Res 1995, v. 23, p. 1388-1395.

166. Knudson AG. //Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1971, v.69, p.820-823.

167. Kolehmainen K, Karant Y // Modeling methylation and IQ scores in fragile X females and mosaic males.// Am J Med Genet 1994, v. 51, p. 328-338.

168. Kono Т., Obata Y., Yoshimzu T. et al. // Epigenetic modifications during oocyte growth correlates with extended parthenogenetic development in the mouse. // Nat.Genet. 1996, v. 13, p. 91-94.

169. Kosaki K., McGinniss M.J. et al. //Prader-Willi and Angelman Syndromes: Diagnosis With a Bisulfite-Treated Methylation-Specific PCR Method.// Am. J. Med. Genet. 1997, v. 73, p. 308-313.

170. Kotzot D., Schmitt S., Bernasconi F., et al. // Uniparental disomy 7 in Silver-Russell syndrome and primordial growth retardation. // Hum. Mol. Genet. 1995, v. 4, p.583-587.

171. Krawczak M.; Reiss J.; Cooper D.N. // The mutational spectrum of single base-pair substitution in mRNA splice junction of human genes: causes and consequences. // Hum. Genet. 1992, v. 90, p. 41-54.

172. Kruyer H, Mila M, Glover G, Carbonell P, Ballesta F, Estivill X // Fragile X syndrome and the (CGG)n mutation: two families with discordant MZ twins.// Am. J. Hum. Genet. 1994, v. 54, p. 437-442.

173. Kuslich C.D., Kobori J.A., Mohapatra G., Gregorio-King C., Donlon T.A. // Prader-Willi syndrome is caused by disruption of the SNRPN gene. // Am.J. Med. Genet. 1999, v. 64, p. 70-76.

174. Laayoun A, Smith S.S. // Methylation of slipped duplexes, snapbacks and cruciforms by human DNA (cytosine-5) methyltransferase.// Nucleic Acids Res 1995, v. 23, p. 1584-1589.

175. Laird CD // Possible erasure of the imprint on a fragile X chromosome when transmitted by a male. //Am. J. Med. Genet. 1991, v.38, p. 391-395.

176. Laird CD // Proposed mechanism of inheritance and expression of the human fragile X syndrome of mental retardation.// Genetics 1987, v. 117, p. 587-599.

177. Lam W.W., at al. // Analysis of germline CDKN1C mutations in familial and sporadic Beckwith-Wiedemann syndrom (BWS) provides a novel genotype-phenotype correlation. //.J.Med.Genet. 1999, v. 36, p.518-523.

178. Lapidus RG, Nass SJ, Davidson NE. //The loss of estrogen and progesterone receptor gene expression in human breast cancer.//J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1998, v.3, p.85-94.

179. Ledbetter SA, Ledbetter DH // A common fragile site at Xq27: theoretical and practical implications.// Am J Hum Genet 1988, v. 42, p. 694-702

180. Lee M.P., Hu R.J., Jonson L.A., at al. // Human KVLQTlgene shows tissue-specific imprinting and encompasses Wiedemann-Beckwith syndrom chromosomal rearrangement.// Natur.Genet. 1997, v.15, p.181-185.

181. Lee W. H., Lee E. Y. // The retinoblastoma gene: from its basic umderstanding as a signal mediator for growth find differentiation to its use in the treatment qf cancer. // Gan To Kagaku Ryoho 1997, v. 24, p. 1368-1380.

182. Lee, S.; Wevrick, R. // Identification of novel imprinted transcripts in the Prader-Willi syndrome and Angelman syndrome deletion region: further evidence for regional imprinting control.// Am. J. Hum. Genet. 2000, v. 66, p. 848-858.

183. Lewis JD, Meehan RR, Henzel WJ, Maurer-Fogy I, Jeppesen P, Klein F, Bird A.//Purification, sequence, and cellular localization of a novel chromosomal protein that binds to methylated DNA.// Cell, 1992, v. 69, p. 905-14.

184. Li E, Bestor TH, Jaenisch R.// Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality.// Cell, 1992, v. 69, p. 915-926.

185. Li E., Beard C., Jaenisch R. // Role for DNA methylation in genomic imprinting. // Nature 1993, v. 366, p. 362-365.

186. Li Q, Jedlicka A, Ahuja N, Gibbons MC, Baylin SB, Burger PC, Issa JP. //Concordant methylation of the ER and N33 genes in glioblastoma multiforme. //Oncogene 1998, v. 16, p.3197-3202.

187. Liang G., Carol E., Hung D. et al.// DNA methylation differences associated with tumor tissues identified by genome scanning analisis.// Genomics 1998, v.53, p. 260-268.

188. Loesch DZ, Huggins R, Hay DA, Gedeon AK, Mulley JC, Sutherland GR // Genotype-phenotype relationships in fragile X syndrome: a family study. // Am J Hum Genet 1993, v. 53, p. 1064-1073.

189. Lohmann D.; Horsthemke В.; Gillessen K.G.; Stefani F.H.; Hofler H. // Detection of small RBI gene deletions in retinoblastoma by multiplex per and high-resolution gel electroforesis. //Hum. Genet. 1992, v. 89, p. 49-53.

190. Lohmann D.R.; Brandt В.; Hopping W.; Passarge E.; Horsthemke B. // The spectrum of RBI germ-line mutation in hereditary retinoblastoma. // Hum. Genet. 1996, v. 58, p. 940949.

191. Lohmann D.R.; Brandt В.; Hopping W.; Passarge E.; Horsthemke B. // Distinct RBI gene mutation with low penetrance in hereditary retinoblastoma. // Hum. Genet. 1994, v. 94, p. 349-354.

192. Lohmann D.R.; Gerick M.; Brandt В.; Oelschlager U.; Lorenz В.; Passarge E.; Horsthemke B. // Constitutional RBI-gene mutation in patient with isolated unilateral retinoblastoma. // Am. J. Hum. Genet. 1997, v. 61, p. 282-294.

193. Lubs HA // A marker X chromosome. //Am J Hum Genet 1969, v.21, p. 231-244.

194. Ludlow J.W.; DeCaprio J.A.; Huang C.M.; Paycha E.and Livingston D M. // SV40 Large T antigen binds preferently to an underphosphorylated member of the retinoblastoma susceptibility gene family. // Cell 1989, v. 56, p. 57-65.

195. Lugenbeel KA, Peier AM, Carson NL, Chudley AE, Nelson DL. // Intragenic loss of function mutations demonstrate the primary role of FMR1 in fragile X syndrome.// Nature Genet. 1995, v. 10, p. 483-485.

196. Lukas J., Parry D., Aagard L., Mann D.J. et al. // Retinoblastoma-protein-depend cell-cycle inhibition by the tumour supressor pl6. //Nature 1995, v. 375, p. 503-506.

197. Luo D, Liu QF, Gove C, NaomovN, Su JJ, Williams R. //Analysis ofN-ras gene mutation and p53 gene expression in human hepatocellular carcinomas.// World J Gastroenterol. 1998, v. 4, p. 97-99.

198. Lyko F., Brenton JD., Surani MA, Paro R.// An imprinting element from the mouse H19 locus functions as a silencer inDrosophyla. //Nature Genetics 1997, v. 16, p. 171-173.

199. Lyko F., Buiting K. et al., Horsthemke В., Paro R. // Identification of a silencins element in the human 15qll-ql3 imprinting center using transgenic Drosophila. // PNAS USA 1998, v. 95, p. 1698-1702.

200. MacLeod AR, Rouleau J, Szyf M. // Regulation of DNA methylation by the Ras signaling pathway.//J Biol Chem. 1995, v. 12, p. 11327-11337.

201. Macleod K. // Tumor supressor genes. // Curr.Op.Gen. Development 2000, v. 10, p.81-93.

202. Maher E.R., Reik W. // Beckwith-Wiedemann syndrom: imprinting in clusters revised.// J.Clin.Invest. 2000, v. 105, p. 247-252.

203. Malter H. E., Iber J. C., Willemsen R., et al. // Characterization of the full fragile X syndrome mutation in fetal gametes. //Nat .Genet. 1997, v.15, p.165-169.

204. Mancini D., Singh S., Ainsworth P., Rodenhiser D. // Constitutively methylated CpG dinucleotides as mutation hot spots in the retinoblastoma gene (RBI). // Hum. Genet. 1997, v. 61, p. 80-87.

205. Matsunaga E. // Recurrence risks to relatives of patients with retinoblastma. // Jpn. J. Ophthal. 1978, v. 22, p. 313-319.

206. McFadden DE, Kalousek DK. //Two different phenotypes of fetuses with chromosomal triploidy: correlation with parental origin of the extra haploid set.// Am J Med Genet. 1991, v. 15, p.535-538.

207. McGee T.L.; Yandell D.W. and Druja T.P. // Structure and partial genomic sequence of the human retinoblastoma susceptibility gene. // Gene 1989, v. 80, p. 119-128.

208. McVean GT, Hurst LD. //Molecular evolution of imprinted genes: no evidence for antagonistic coevolution.//Proc R Soc bond В Biol Sci. 1997, v.22;264, p. 1382.

209. Meehan R., Cross S. // Transcriptional repression by methylation of CpG.// J. Cell Sci. Suppl. 1992, v.16, p. 9.

210. Meehan R.R., Lewis J.D., McKay S. et al.// Identification of a mammalian protein that binds specifically to DNA containing methylated CpGs.//

211. Melki JR, Vincent PC, Clark SJ. II Cancer-specific region of hypermethylation identified within the HICl putative tumour suppressor gene in acute myeloid leukaemia. // Leukemia 1999, v. 13, p.877-883.

212. Melwin M.J., McGURT M.E., Bort S.J. // Hypomethylation of the interferon-gamma gene correlates with its expression by primary T-lineage cells. //Eur J Immunol. 1995, v.25, p.426-430.

213. Mitsuya K., Meguro M, Lee M.P.,KatohM., at al.// LIT1, an imprinted antisense RNA in human KVLQT1 locus identified by screening for differentially expressed transcript using monochromosomal hybrids. //Hum.Mol.Genet. 1999, v.8, p. 1209-1217.

214. Mulley JC, Yu S, Loesch DZ, Hay DA, Donnelly A, Gedeon AK, Carbonell P, Lopez I, Glover G, Gabarron I // FRAXE and mental retardation. // J Med Genet 1995, v. 32, p. 162169.

215. Munger K.; Werness B.A.; DysonN, Harlow E. and Howley P.M. // Complex formation of human papillomavirus E7 protein with the retinoblastoma tumor supressor gene product. // EMBO Journal 1989, v. 8, p. 4099-4105.

216. Musarella M.A.; Gallie B.L. // A simplified scheme for genetic counseling in retinoblastoma. // J. Pediatr. Ophtalmol. Strabismus. 1987, v. 24, p. 124-125.

217. Newsham I.F., Hadjistilianou Т., Cavenee W.K. // Retinoblastoma. // in "The Genetic Basis of Human Cancer", ed. by B.Vogelstein and K.W.Kingler. // McCraw-Hill Companies 1998, p. 363-387.

218. Ng HH, Zhang Y, HendrichB, Johnson CA, Turner BM, Erdjument-Bromage H, Tempst P, Reinberg D, Bird A.// MBD2 is a transcriptional repressor belonging to the MeCPl histone deacetylase complex.// Nat Genet 1999, v.23, p. 58-61

219. Nicholls R.D., Saiton S., Horsthemke B. // Imprinting in Prader-Willi and Angelman syndromes. //Nat. Genet. 1995, v.9, p. 110-112.

220. Nicholls, R. D.; Knoll, J. H. M.; Butler, M. G.; Karam, S.; Lalande, M. // Genetic imprinting suggested by maternal heterodisomy in non-deletion Prader-Willi syndrome.// Nature 1989, v. 342, p. 281-285.

221. Noyer-Weidner M., Trautert.a.// Methylation of DNA in prokaryotes.//EXS. 1993, v.64, p.39-108.

222. Nussbaum RL, Ledbetter DH // The metabolic basis of inherited disease. // Eds. Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, ValleD, 1989, p.327-341.

223. Nystroom, A., Cheetham J.E., Engstrom W., at al. // Molecular analysis of patients with Wiedemann-Beckwith syndrome. II Parentally derived disomies of chromosome 11. // Eur.J.Paediatr. 1992, v.151, p.511-514.

224. Obata Y., Kaneko-Ishino Т., Koide T. et al. // Disruption of primary imprinting during oocyte growth leads to the modified expression of imprinted genes during development.// Development 1998, v. 125, p. 1553-1560.

225. Oberle I, Rousseau F, Heitz F, Kretz C, Davys D, Hanauer A, Boue J, Bertheas MF, Mandel JL // Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome. // Science 1991, v.252, p. 1097-1102.

226. O'Donovan M.C., Guy C., Craddock N., et al. // Expanded CAG repeats in schizophrenia and bipolar disorder. // Nat. Genet. 1995, v.10, p.380-381.

227. Ohara K., Xu H.D., Mori N., et al. // Anticipation and imprinting in schizophrenia. // Biol.Psychiatry. 1997, v. 42, p.760-766.

228. Okano M, Bell DW, Haber DA, Li E.// DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development.// Cell 1999, v.99, p.247-257.

229. Okano M., Xie S., Li E. // Cloning and characterization of a family of novel mammalian DNA (cytosine-5)-methyltransferases. //Nature Genetics 1998, v. 19, p. 219-220.

230. Okano M., Xie S.// Dnmt2 is not required for de novo and maintenance methylation of viral DNA in embryonic stem cells.//Nucleic Acids Res. 1998, v. 1;26, p.2536-2540.

231. Oostra BA, Jacky PB, Brown WT, Rousseau F // Guidelines for the diagnosis of fragile X syndrome. National Fragile X Foundation.// J. Med. Genet. 1993, v.30, v.5, p. 410-413.

232. Oostra BA, Willems PJ // A fragile gene. // Bioessays 1995, v. 17, p. 941-947.

233. Ottaviano YL, Issa JP, Pari FF, Smith HS, Baylin SB, Davidson NE.// Methylation of the estrogen receptor gene CpG island marks loss of estrogen receptor expression in human breast cancer cells.// Cancer Res 1994, v.54, p.2552-2555.

234. Ottman R., Annegers J.F., Hauser, W.A., et al. // Higher risk of seizures in offspring of mothers than of fathers with epilepsy. // Am. J. Hum. Genet. 1988, v.43, p.257-264.

235. Palmisano WA, Divine KK, Saccomanno G, Gilliland FD, Baylin SB, Herman JG, Belinsky SA.// Predicting lung cancer by detecting aberrant promoter methylation in sputum.// Cancer Res 2000, v.60, p.5954-5958.

236. Parrish JE, Oostra В A, Verkerk AJMH, Richards CS, Reynolds J, Spikes AS, Shaffer LG, Nelson DL // Isolation of a GCC repeat showing expansion in FRAXF, a fragile site distal to FRAXA and FRAXE. Nature Genet. 1994, v. 8, p. 229-235.

237. Paulsen M., El-Maarri О., Engemann S., at al. // Sequence conservation and variability of: imprinting in the Beckwith-Wiedemann syndrom gene cluster in human and mouse.// Hum.Mol.Genet. 2000, v.9, p. 1829-1841.

238. Pembrey ME, Winter RM, Davies KE // A permutation that generates a defect at crossing over explains the inheritance of fragile X mental retardation. //Am J Med Genet 1985, v.21, p. 709-717.

239. Pennisi E. // Behind the scenes of gene expression.// Sciens 2001, v.293, p. 1064-1067.

240. Perez Jurado L.A., Peoples R., Kaplan P., et al. // Molecular definition of the chromosome 7 deletion in Williams syndrome and parent-of-origin effects on growth.// Am. J. Hum. Genet. 1996, v.59, p.781-792.

241. Pilia G, Hughes-Benzie RM, MacKenzie A, Baybayan P, Chen EY, Huber R, Neri G, Cao A, Forabosco A, Schlessinger D.//Mutations in GPC3, a glypican gene, cause the Simpson-Golabi-Behmel overgrowth syndrome.//Nat Genet. 1996, v. 12, p,241-247.

242. Prowse AH, Webster AR, Richards FM, Richard S, Olschwang S, Resche F, Affara NA, Maher ER.//Somatic inactivation of the VHL gene in Von Hippel-Lindau disease tumors.//Am J Hum Genet. 1997, v.60, p.765-771.

243. Qian N., Frank D., О KeefeD.,et al. // The IPL gene on chromosome 1 lpl5.5 is imprinted in humans and mise and is similar to TDAG51, implicated in Fas expression and apoptosis.// Hum.Mol. Genet., 1997, v.6, p.2021-2029.

244. Quan F, Grompe M, Jakobs P, Popovich BW // Spontaneous deletion in the FMR1 gene in a patient with fragile X syndrome and cberubism.// Hum. Molec. Genet. 1995, v. 4, p. 16811684.

245. Rainier S., Dobry C.J., Feinberg A.P., et al. // Loss of imprinting in gepatoblastoma.// Cancer Res. 1995, v.55, p. 1836-1838.

246. Ranen N. G., Stine О. C., Abbott M. H., et al. // Anticipation and instability of IT-15 (CAG)n repeats in parent-offspring pairs with Huntington disease.// Am .J. Hum. Genet. 1995, v.57, p.593-602.

247. Razin A, Shemer R. // Epigenetic control of gene expression.//Results Probl Cell Differ. 1999, v.25, p. 189-204.

248. Razin A, Shemer R. //DNA methylation in early development.// Hum Mol Genet. 1995, v. 4, p. 1751-1755.

249. Reed, M. L.; Leff, S. E. // Maternal imprinting of human SNRPN, a gene deleted in Prader-Willi syndrome.//Nature Genet. 1994, v. 6, p. 163-167.

250. Reik W, Maher ER.//Imprinting in clusters: lessons from Beckwith-Wiedemann syndrome.// Trends Genet. 1997, v. 13, p.330-334.

251. Reik W, Walter J. //Imprinting mechanisms in mammals.//Curr Opin Genet Dev. 1998, v.8, p.154-164.

252. Reis A., Dittrich В., Gregor V., Buiting K. et al. // Imprinting mutations suggested by abnormal DNA methylation patterns in familial Angelman and Prader-Willi syndromes.// Am .J. Hum. Genet. 1994, v. 54, p. 741-747.

253. Reis, A.; Kunze, J.; Ladanyi, L.; Enders, H.; Klein-Vogler, U.; Niemann, G.// Exclusion of the GABA(A)-receptor beta-3 subunit gene as the Angelman's syndrome gene. (Letter) // Lancet, 1993, v.341, p. 122-123.

254. Riggs AD (1990)// DNA methylation and late replication probably aid cell memory, and type I DNA reeling could aid chromosome folding and enhancer function. // Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci 1990, v. 30 326, p. 285-297.

255. Riley D.J., Liu C.Y., Lee W.H. // Mutation of N-terminal regions render the retinoblastoma protein insufficient for functions in development and tumor suppression. // Mol. Cell Biol. 1997, v. 17, p. 7342-7352.

256. Robertson K.D., Jones P.A. // The human ARF cell cycle regulatory gene promotor is a CpG islend which can be silenced by DNA methylation and down-regulated by wild-tipe p53. //Mol. Cell. Biol. 1998, v. 18, p.6457-6473.

257. Robertson K.D., Wolffe A.P. // DNA methylation in health and disease.// Natur. Revies. 2000, v. 1, p. 11-19.

258. Robinson D.O., Gardner R.J., Temple I.K., et al. // Paternal uniparental disomy of chromosome 6 and transient neonatal diabetes mellitus. // Clin.Genet. 1998, v.54, p.522-525.

259. Rougeulle C., Cardosa C, Fontes M., Colleaux L., Lalande M. // An imprinted antisense RNA overlaps UBE3A and a second maternally expressed transcript.// Nat.Genet. 1998, v. 19, p. 15-16.

260. Rougier N, Bourc'his D, Gomes DM, Niveleau A, Plachot M, Paldi A, Viegas-Pequignot E. // Chromosome methylation patterns during mammalian preimplantation development.// Genes Dev. 1998, v,15;12, 2108-2113.

261. Sakai T, Toguchida J, Ohtani N, Yandell DW, Rapaport JM, Dryja TP.// Allele-specific hypermethylation of the retinoblastoma tumor-suppressor gene.// Am. J. Hum. Genet. 1991, v.48, p. 880-888.

262. Sasaki H, Allen ND, Surani MA. //DNA methylation and genomic imprinting in mammals.//EXS. 1993, v.64, p.469-86.

263. Schinzel AA, Robinson WP, Binkert F, Torresani T, Werder. //Exclusively paternal X chromosomes in a girl with short stature.//Hum Genet. 1993, v.2, p. 175-178.

264. Schinzel, A.; Robinson, W. P.; Bottani, A.; Yagang, X.; Prader, A. // Prader-Willi or Angelman syndrome in familial 15qll-ql3 deletion of maternal origin? //Hum. Genet. 1992, v. 88, p. 361-362.

265. Schmidt J.V., Levorse J.M., Tilghman S.M. // Enchancer competition between H19 and igf2 does not mediate their imprinting.// Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1997, v. 96, p. 97339738.

266. Schmidt M, Migeon BR. 11 Asynchronous replication of homologous loci on human active and inactive X chromosomes.//Proc Natl Acad Sci USA. 1990, v.87, p.3685-3689.

267. Schulze, A.; Hansen, C.; Skakkebaek, N. E.; Brondum-Nielsen, K.; Ledbetter, D. H.; Tommerup, N.// Exclusion of SNRPN as a major determinant of Prader-Willi syndrome by a translocation breakpoint.//Nature Genet. 1994, v. 12, p. 452-454.

268. Schumacher A., Buiting K., Korn В., Rickard S.et al. // Methylation analysis of the PWS/AS region does not support an enchancer-competition model. // Nature Genetics 1998, v. 19, p. 324-325.

269. Searle A.G., Beechey C.V. //Genome imprinting phenomena on mouse chromosome 7. // Genet Res. 1990, v.56, p.237-244.

270. Selig S, Okumura K, Ward DC, Cedar H // Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization.// EMBO J 1992, v. 11, p. 1217-1225.

271. Selker E.U.//Gene silencing: repeats that count.// Cell, 1999, v. 16, p. 157-160.

272. Selker EU, Fritz DY, Singer MS.I I Dense nonsymmetrical DNA methylation resulting from repeat-induced point mutation in Neurospora.// Science 1993, v. 10;262, p. 1724-1728.

273. Shaffer L.G., McCaskill C., Egli СЛ., et al. // Is there an abnormal phenotype associated with maternal isodisomy for chromosome 2 in the presence of two isochromosomes? // Am. J. Hum. Genet. 1997, v.61, p.461-462

274. Shemer R., Birger Y., Riggs AD., Razin A. // Structure of the imprinted mouse Snrpn gene and establishment of its parental-specific methylation pattern. // PNAS USA 1997, v. 94, p. 10267-10272.

275. Sherman SL, Jacobs PA, Morton NE // Further segregation analysis of the fragile X syndrome with special reference to transmitting males. // Hum Genet 1985, v.69, p. 289-299.

276. Simpson DJ, Hibberts NA, McNicol AM, Clayton RN, Farrell WE.// Loss of pRb expression in pituitary adenomas is associated with methylation of the RBI CpG island.// Cancer Res. 2000, v.60, p. 1211-1216.

277. Singal R, Ginder GD. //DNA methylation.// Blood, 1999, v.15, p.4059-4070.

278. Skuse D.H., James R.S., Bishop D.Y.M., et al.// Evidence from Turner's syndrome of an imprinted X-linked locus affecting cognitive function.//Nature, 1997, v.387, p.705-708.

279. Smilinich N.J. et al.// A maternally methylated CpG island in KvLQTl is associated with an antisense parental transcript and loss of imprinting in Beckwith-Wiedemann syndrom.// Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1999, v.96, p. 8064-8069.

280. Smith SS, Kan JL, Baker DJ, Kaplan BE, Dembek P // Recognition of unusual DNA structures by human DNA (cytosine-5) methyltransferase. //J Mol Biol 1991, v. 5 217, p. 39-51.

281. Sommer A., Cutler E., Cohen В., Harper D., Backes C. // Familial occurrence of the Wiedemann-Beckwith syndrome and persistent fontanel.// Am. J. Med. Genet., 1977, v. 1, p. 59-63.

282. Sotelo-Avila C., Gonzalez-Crussi F., Fowler J. // Complete and incomplete forms of Beckwith-Wiedemann syndrome: their oncogenic potential.// J. Pediat. 1980, v. 96, p.47-50.

283. Stoger R., Kubicka P. et al. // Maternal-specific methylation of the imprinted mouse Igf2r locus identifies the expressed locus as carrying the imprinting signal. // Cell 1993, v. 73, p. 61-71.

284. Strelnikov V.V., Nemtsova M.V., Chesnokova G.G., Kuleshov N.P., Zaletayev D.V. // A simple multiplex FRAXA, FRAXE and FRAXF PCR assay convenient for wide screening programs.// Human Mutation, 1999, N2 p. 166-169.

285. Subramanian PS, Nelson DL, Chinault AC. // Large domains of apparent delayed replication timing associated with triplet repeat expansion at FRAXA and FRAXE. // Am. J. Hum. Genet. 1996, v. 59, p. 407-416.

286. Sun, F.-L., Elgin, S. C. R. // Putting boundaries on silence.// Cell 1999, v. 99, p. 459-462.

287. Sun, F.-L.; Dean, W. L.; Kelsey, G.; Allen, N. D.; Reik, W. //Transactivation of IGF2 in a mouse model of Beckwith-Wiedemann syndrome.//Nature 1997, v.389, p. 809-815.

288. Surani M. // Imprinting and the initiation of gene silencind in the germ line. //Cell, 1998, v. 93, p.309-312.

289. Surti U., Hoffner L., Chakravarti A., et al. // Genetics and biology of human ovarian teratomas. I. Cytogenetic analysis and mechanism of origin.// Am. J. Hum. Genet. 1990, v.47, p.635-643.

290. Sutherland GR // Fragile sites on human chromosomes: demonstration of their dependence on the type of tissue culture medium. Science 1977, p. 265-266.

291. Sutherland GR, Baker E // Characterisation of a new rare fragile site easily confused with the fragile X. // Hum. Molec. Genet. 1992, v. 1, p. 111-113.

292. Szabo P.E., Mann JR. // Biallelic expression of imprinted genes in the mouse germ line: implications for erasure, establishment and mechanisms of genomic imprinting. // Genes & Development 1995, v. 9, p. 1857-1868.

293. Tajima S., Suetake I. // Regulation and Function od DNA Methylation in Vertebrates.// Journal of Biochemistry 1998, v. 123, p. 993-999.

294. Tarleton J, Richie R, Schwartz C, Rao K, Aylsworth AS, Lachiewicz A // An extensive de novo deletion removing FMR1 in a patient with mental retardation and the fragile X syndrome phenotype. //Hum. Molec. Genet. 1993, v.2, p. 1973-1974.

295. Tazi J, Bird A. //Alternative chromatin structure at CpG islands.// Cell, 1990, v. 60, p. 909920.

296. Temple J.K., James R.S., Crolla J.A., et al. // An imprinted gene(s) for diabetes? // Nature Genrt. 1995,v.9, p. 110-112

297. Toguchida J.; McGee T.L.; Paterson J.C.; Eagle J.R.; Tucker S.; Yandell D.W. and Dryja T.P. // Complete genomic sequence of the human retinoblastoma susceptibility gene. // Genomics 1993, v. 17, p. 535-543.

298. Torra R., Badeias C., Darnell A., et al.//Clinical, genetic and molecular studies on autosomal dominant polycystic kidney disease. // Med Clin (Bare). 1998, v. 18, p.481-487.

299. Toyota M, Ahuja N, Suzuki H, Itoh F, Ohe-Toyota M, Imai K, Baylin SB, Issa JPJ.// Aberrant methylation in gastric cancer associated with the CpG island methylator phenotype.// Cancer Res. 1999, v.59, p.5438-5442.

300. Toyota M, Ho C, Ahuja N, Jair KW, Li Q, Ohe-Toyota M, Baylin SB, Issa JPJ.// Identification of differentially methylated sequences in colorectal cancer by methylated CpG island amplification.// Cancer Res 1999, v.59, p.2307-2312

301. Toyota M, Issa JPJ. // CpG island methylator phenotypes in aging and cancer.// Semin. Cancer Biol. 1999, v.9, p.349-357.

302. Traupe H., van Gurp P.J.M., Happle R., et al. // Psoriasis vulgaris, fetal growth, and genomic imprinting. // Am. J.Med. Genet. 1992, v. 42, p. 649-654.

303. Trottier Y, Imbert G, Poustka A, Fryns JP, Mandel JL // Male with typical fragile X phenotype is deleted for part of the FMR1 gene and for about 100 kb of upstream region. // Am J Med Genet 1994, v. 51, p. 454-457.

304. Trouche D. // Control of cell proliferation by the retinoblastoma gene product (editorial). // Patol. Biol. 1997, v. 45, p. 5-8.

305. Turker M.S., Mummaneni P.,et al.// Region- and cell type-specific de novo DNA methylation in cultured mammalian cells.//Somat Cell Mol Genet. 1991, v.17, p.151-157.

306. Turker M.S.// The establishment and maintenance of DNA methylation patterns in mouse somatic cells. // Semin Cancer Biol. 1999, v.9, p.329-337.

307. Van den Ouweland, van der Est, E.W.van Swaay, et al.// DNA diagnosis of Prader-Willi and Angelmen syndromes with hte probe PW71 (D15S63).// Hum.Genet.1995, v.95, p.562-567.

308. Verkerk AJMH, Pieretti M, Sutcliffe GS (1991) Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell 65: 905-14.

309. Vincent JB, Gurling HMD. // Point mutation in intron 10 of FMR1 is unlikely to be a cause of fragile X syndrome (Letter)//Hum. Mutat. 1998, v. 12, p. 431.

310. Vogel F. // The genetics of retinoblastoma. // Hum. Genet. 1979, v. 52, p. 1-54.

311. Voss R, Ben-Simon E., Avital A, et al.// Isodisomy of chromosome 7 in a patient with cystic fibrosis: could uniparental disomy be common in humans? // Am. J. Hum Genet. 1989, v.45, p.373-380.

312. Vu, Т. H.; Hoffman, A. R. // Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain. // (Letter) Nature Genet 1997, v. 17, p. 12-13.

313. Walsh C.P., Bestoe Т.Н. // Cytosine methylation and mammalian development.// Genes Dev. 1999 , v.l;13, p.26-34.

314. Wang YC, Li SY. // Response to Vincent and Gurling // (Letter) Hum. Mutat. 1998, v. 12, p. 432.

315. Weichselbaum R.R, Beckett M, Diamond A. // Some retinoblastomas, osteosarcomas, and soft tissue sarcomas may share a common etiology. // Proc. Nat. Acad. Sci. 1988, v. 85, p. 2106-2109.

316. Weiss A, Keshet I, Razin A, Cedar H // DNA demethylation in vitro: involvement of RNA. //Cell 1996, v. 86, p. 709-718.

317. Weksberg R., Shuman C., Caluseriu O., Smith A.S., Fei Y.-L., Nishikawa J., Stockley Т., et al.// Discordant KCNQ10T1 imprinting in sets of monozygotic twins discordant for Beckwith-Wiedemann syndrome.//Hum Mol Genet 2002, v. 11, p. 1317-1325.

318. Weng E., Moeschler J., Graham J. // Longitudinal observations on 15 children with Wiedemann-Beckwith syndrome.// Am. J. Med. Genet., 1995, v. 56, p. 366-373.

319. Wevrick, R.; Francke, U. //Diagnostic test for the Prader-Willi syndrome by SNRPN expression in blood.//Lancet 1996, v. 348, p. 1068-1069.

320. White, L. M.; Rogan, P. K; Nicholls, R. D.; Wu, B.-L.; Korf, В.; Knoll, J. H. M.//Allele-specific replication of 15ql l-ql3 loci: a diagnostic test for detection of uniparental disomy.// Am. J. Hum. Genet. 1996, v. 59, p. 423-430.

321. Wiedemann H.R. // Tumors and hemihypertrophy assosiated with Wiedemann-Beckwith syndrome.//Eur.J.Paediatr. 1983, v.141, p.129.

322. Willems PJ, Van Roy B, De Boulle K, Vits L, Reyniers E, Beck O, Dumon JE, Verkerk A, Oostra В // Segregation of the fragile X mutation from an affected male to his normal daughter. //Hum Mol Genet 1992, v. 1, p. 511-515.

323. Xin, Z.; Allis, C. D.; Wagstaff, J. // Parent-specific complementary patterns of histone H3 lysine 9 and H3 lysine 4 methylation at the Prader-Willi syndrome imprinting center.// Am. J. Hum. Genet. 2001, v. 69, p. 1389-1394.

324. Xu GL, Bestor TH, Bourc'his D, Hsieh CL, Tommerup N, Bugge M, Hulten M, Qu X, Russo JJ, Viegas-Pequignot E.// Chromosome instability and immunodeficiency syndrome caused by mutations in a DNA methyltransferase gene.// Nature 1999, v.402, p. 187-191

325. Yanagisawa Y, Akiyama Y, Iida S, Ito E, Nomizu T, Sugihara K, Yuasa Y, Maruyama К.// Methylation of the hMLHl promoter in familial gastric cancer with microsatellite instability.// Int. J. Cancer 2000, v.85, p.50-53.

326. Yoder JA, Soman NS, Verdine GL, Bestor TH. //DNA (cytosine-5)-methyltransferases in mouse cells and tissues. Studies with a mechanism-based probe.// J Mol Biol. 1997, v.270, p. 385-395.

327. Yu S, Pritchard M, Kremer E, Lynch M, Nancarrow J, Baker E, Holman K, Mulley JC, Warren ST, Schlessinger D, Sutherland GR, Richards RI. // Fragile X genotype characterized by an unstable region of DNA. // Science 1991, v.252, p. 1179-1181.

328. Zajaczek S., Jakubowska A., Gorki, Kurzawski G., Krzystolik Z., Lubinski J. // Frequency and nature of germline RBI gene mutations in a series of patients with sporadic unilateral retinoblastoma. //Eur. J of Cancer, 1999, v.35, p. 1824-1827.

329. Zaslav AL, Brown WT // Simultaneous expression of the rare and common fragile sites on the X chromosome. // Clin Genet 1991, v. 40, p. 423-429.

330. Zhan SL, Shapiro DN, HelmanLJ. // Loss of imprinting of IGF2 in Ewing sarcoma. // Oncogene1995, v. 11, p.2503-2507.

331. Zhan SL, Shapiro DN, HelmanLJ.// Activation of an imprinted allele of IGF2 gene implicated in rhabdomyosarcoma.// J Clin Invest. 1994 v. 94, p. 445-448.

332. Zhang H.S., Postigo A.A., Dean D.C. // Active transcriptional repression by the Rb-E2F complex mediates G1 arrest triggered by pl6 (INK4a), TGF-beta, and contact inhibition. // Cell 1999, v. 97, p. 53-61.