Исследование тканеспецифичности транскрипции генов KLRB1 и PROM1 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Плешкан, Виктор Викторович

• Плешкан, Виктор Викторович
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Плешкан, Виктор Викторович

Список сокращений:.

ВВЕДЕНИЕ.

Цели и задачи работы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Метилирование и другие эпигенетические факторы, влияющие на экспрессию генов.

1.1.1 Гистоны и метилирование ДНК.

1.1.2 Петли хроматина и метилирование ДНК.

1.1.3 Метилирование при импринтинге.

1.1.4 Регуляторные белки CTCF и Kaiso.

1.1.5 Тканеспецифичность транскрипции генов обусловленная метилированием.

1.2 Изменения уровня метилирования при различных патологиях.

1.2.1 Гипометилирование ДНК.

1.2.1.1 Активация онкогенов.

1.2.1.2 Метилирование мобильных элементов.

1.2.1.3 Хромосомная нестабильность.

1.2.3 Метилирование ДНК и горячие точки мутаций.

1.3 Особенности транскрипции генов с промоторов не содержащих канонических ТАТА-последовательностей.

1.3.1 Основные свойства инициаторного элемента (Inr).

1.3.2 DPE элемент промотора (Downstream Promotor Element).

1.3.3 Проксимальный (PSE) и дистальный (DSE) промоторые элементы.

1.3.4 МТЕ элемент (Motif Ten Element).

1.3.5 DCE элемент (Downstream Core Element).

1.3.6 Элементы, специфические для he содержащих ТАТА-последовательность промоторов.

1.3.7 CpG островки.

1.3.8 Частные случаи регуляции генов не содержащих ТАТА-последовательность.39 1.3.8.1 Регуляция транскрипции генов NKR-P1 семейства.

1.3.8.1.1 Структура промотора гена Ly49 и тканеспецифичность экспрессии.

1.3.8.1.2 Особенности гена KLRB1.

1.3.8.2 Регуляция транскрипции гена PROM1.

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1 Определение тканеспецифичности транскрипции генов KLRB1 и PROM1.

2.1.1 Транскрипция в клеточных линиях.

2.1.2 Транскрипция в эмбриональном легком человека.

2.1.3 Транскрипция в опухолевых и нормальных тканях легкого и пищевода.

2.1.4 Исследование тканеспецифичности транскрипции в 5'-областях генов PROM1 и KLRB1.

2.1.4.1 5'-RACE гена KLRB 1.

2.1.4.2 Транскрипция изоформ гена PROM1, отличающихся по содержанию экзона 4.

2.1.4.3 Тканеспецифичность экспрессии транскриптов, инициированных с промоторов Р1 и Р2.

2.2 Определение статуса метилирования участков генов PROM1 и KLRB1.

2.2.1 Использование деметилирующего агента 5-Аза.

2.2.2 Бисульфитное секвенирование промоторов Р1 и Р2 гена PROM1.

2.2.2.1 Метилирование промотора Р1.

2.2.2.2 Метилирование промотора Р2.

2.4.2.3 Характер метилирования промоторов Р1 и Р2.

2.2.3 Анализ метилирования промотора Р2 метил-специфическим ПЦР.

2.2.4 Метилирование и транскрипция.

2.2.5 Определение метилирования в протяженных участках генов KLRB1 и PROM1.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1 Материалы.

3.1.1 Ферменты и реактивы.

3.1.2 Оборудование.

3.1.3 Расходные материалы.

3.1.4 Буферные и другие растворы.

3.1.5 Микробиологические среды.

3.1.6 Клеточные линии.

3.1.7 Праймеры, последовательность нуклеотидов.

3.2 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.2.1 Выделение РНК и геномной ДНК.

3.2.1.1 Выделение РНК.

3.2.1.2 Определение концентрации РНК.

3.2.1.3 Анализ выделенной РНК методом гель электрофореза.

3.2.1.4 Выделение геномной ДНК.

3.2.1.5 Высаживание.

3.2.2 Обработка ДНКазой.

3.2.3 Синтез первой цепи кДНК.

3.2.3.1 Построение первых цепей кДНК для ОТ-ПЦР.

3.2.3.2 Контроль на наличие примесей ДНК, "-ОТ" контроль.

3.2.3.3 Построение первых цепей кДНК для 5-RACE.

3.2.4 ПЦР.

3.2.4.1 ОТ-ПЦР.

3.2.4.2 Геномная ПЦР.

3.2.4.3 Электрофорез.

3.2.5 Определение первичной структуры клонированных фрагментов ДНК и ПЦР фрагментов.

3.2.6 Нуклеотидные последовательности и их анализ.

3.2.7 Бисульфитное секвенирование.

3.2.7.1 Секвенирование CG-богатых областей генов PROM1 и KLRB1.

3.2.7.2 Секвенирование промоторного участка гена PROM1.

3.2.8 Молекулярное клонирование.

3.2.8.1 Лигирование.

3.2.8.2 Клонирование.

3.2.8.3 Трансформация.

3.2.8.4 Выращивание ночной культуры клеток.

ВЫВОДЫ:.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование тканеспецифичности транскрипции генов KLRB1 и PROM1»

Онкологические заболевания являются второй по частоте причиной смертности в развитых странах. При неоплазиях нарушаются механизмы контроля процессов дифференцировки и пролиферации клеток, связанные с нарушением генетического аппарата клеток. Одним из принципиальных моментов в борьбе с опухолью является ранняя диагностика. Для повышения эффективности диагностирования рака на ранних стадиях и выбора путей лечения необходимо выявление общих для большинства опухолей данного типа генов, изменение экспрессии которых сопровождает появление и развитие опухоли. Такие гены называют маркерными. Не всегда эти маркерные гены играют существенную роль в процессах образования и развития опухоли, и ни один из множества исследованных молекулярных маркеров в отдельности не обладает значительной клинической ценностью при анализе гетерогенных опухолей. Однако использование группы характерных генов-маркеров может значительно повысить надежность ранней диагностики заболевания.

С другой стороны, изучение основ регуляции генов, и, в особенности, маркерных, может иметь важное значение для терапии опухоли.

Одной из характеристик определяющих функциональный статус гена является метилирование. Метилирование ДНК вносит свой вклад в механизмы контроля экспрессии генов и играет важнейшую роль в клеточной физиологии. Всё больше данных говорит в пользу того, что определённый характер метилирования генома важен для нормального функционирования клеток и целых органов. Определенный характер метилирования ДНК устанавливается во время эмбрионального развития организма, и его изменения могут привести в дальнейшем к нарушениям развития, преждевременному старению, прогрессии опухолевых заболеваний, подавлению экспрессии онкосупрессоров (гены, подавляющие развитие опухолей). На данный момент накоплено много данных об аберрантном метилировании в различных опухолях, о его корреляции с уровнем экспрессии, стадией развития и происхождением опухоли. Подобное влияние метилирования вероятно проистекает из того, что при его помощи происходит регуляция транскрипции генов. Считается, что метилирование регуляторных элементов генов, таких как промотор, энхансер и инсулятор обычно приводит к супрессии функции гена. Метилирование района интрона - наоборот, может обеспечить активность гена, поскольку в этом случае, метилирование интрона может препятствовать взаимодействию с белками-репрессорами. Неактивное состояние гена так же может быть обусловлено особой компактной структурой хроматина (гетерохроматина), которая образуется в результате взаимодействия ДНК со специфическими хромосомными белками. В некоторых случаях образование такой структуры хроматина объясняют метилированием ДНК и, напротив, деметилирование ДНК может сопровождаться активацией гена.

Обычно уровень метилирования генов сохраняется в процессе развития организма. Однако в зависимости от множества факторов, он может меняться при его взрослении. Подобные изменения могут являться, как нормальным ответом клетки на действующие на нее внешние стимулы, так и происходить в результате неправильной работы каких-либо клеточных систем.

Исследование принципов регуляции маркерных генов, анализ дифференциальной транскрипции генов в нормальных и опухолевых тканях человека, имеет как диагностическое, так и фундаментальное значение. Механизмы, вовлеченные в регуляцию экспрессии генов, вполне могут быть вовлечены в процессы опухолевой прогрессии, и на современном уровне очень важен комплексный подход к изучаемой проблеме, который позволит не только выявить общие принципы регуляции генов, но и предложить эффективные механизмы воздействия па структуры, способствующие развитию опухоли. По этой причине, экспрессируемые на поверхности клеток рецепторные белки, которые могут узнаваться цитотоксическими Т-лимфоцитами и/или моноклональными антителами, являются перспективным объектом для диагностики и для специфически направленной иммунотерапии и иммуномодуляции опухолевых заболеваний.

Рецептор CD161, кодируемый геном KLRB1, экспрессируется NK и NKT-клетками. Оба типа клеток обладают цитотоксической активностью и способны узнавать и уничтожать различные виды клеток, в том числе опухолевые, вирус-инфицированные клетки и чужеродные трансплантанты. Биологическая функция рецептора CD 161 человека до сих пор остается неясной, предполагается, что он может участвовать как в регуляции цитотоксических функций клеток, так и в регуляции продукции цитокинов. Механизмы регуляции экспрессии KLRB1 гена до сих пор не изучены.

Основным конечным продуктом гена PROM1 является трансмембранный гликопротеин CD 133. Он является специфическим маркером гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и, с недавнего времени, используется при скрининге ГСК. Отобранные по маркеру CD 133 клетки обладают большим пролиферативным потенциалом, нежели при ранее использованных маркерах ГСК. Известно, что метастазы, являющиеся во многом причиной смертности от рака, зачастую обладают фенотипом стволовых клеток, и, в частности, несут на своей поверхности характерные маркеры. Иногда такие клетки называют "раковыми стволовыми клетками", благодаря неограниченной способности к делению, устойчивости к апоптозу и лекарствам. Идентификация таких клеток очень важна при прогнозировании и лечении онкозаболеваний. С другой стороны, многими исследователями было показано, что при возникновении рака изменяется экспрессия некоторых генов, участвующих в эмбриональном развитии. Выявление и изучение таких генов дает возможность выяснить причины болезни, пути ее диагностики и лечения.

Ген PROM1 имеет сложную систему регуляции транскрипции. Известно, что транскрипция reuaPROMl инициируется как минимум с пяти альтернативных промоторов, однако, как правило, транскрипция идет с двух основных промоторов: Р1 и Р2. Поскольку все промоторы гена PROM1 входят в состав одного CpG-островка, предполагается, что одним из основных механизмов регуляции промоторов является метилирование.

По современным представлениям, многие молекулярные системы, участвующие в контроле развития организма, могут быть также вовлечены в процесс онкогенеза. Схожесть молекулярных характеристик стволовых и раковых клеток в определенной степени способствует подтверждению этой гипотезы. Тщательный анализ данных по изучению экспрессии генов в клеточных линиях, являющихся производными раковых клеток, параллельно с определением экспрессии в эмбриональных и раковых тканях может иметь большое значение, как для клинической практики, так и для фундаментальной науки. Нами был проведен анализ уровня транскрипции генов в эмбриональных, нормальных взрослых и раковых тканях, поскольку многими исследователями было показано, что при возникновении рака изменяется экспрессия некоторых генов, участвующих в эмбриональном развитии.

Известно, что при неоплазиях зачастую наблюдаются изменения в метилировании генов. На клеточных линиях, как модельном объекте, мы попытались определить существуют ли корреляции между уровнем метилирования потенциально регуляторных участков и экспрессией генов KLRB1 и PROM1.

Цели и задачи работы.

Целью данной работы было исследовать тканеспецифичность транскрипции генов KLRB1 и PROM1 и определить факторы, влияющие на транскрипцию исследуемых генов in vivo.

Были поставлены следующие экспериментальные задачи: определить тканеспецифичность транскрипции исследуемых генов на панели клеточных линий, в эмбриональных и опухолевых тканях человека, определить могут ли гены являться маркерными при раке пищевода и легкого человека. определить влияний метилирования, как одного из эпигенетических факторов регуляции уровня экспрессии генов, на транскрипцию генов KLRB1 и PROM1.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Плешкан, Виктор Викторович

ВЫВОДЫ:

1. Показано, что уровень транскрипции гена KLRB1 понижен в неопластических тканях легкого (68% пациентов) и пищевода (57% пациентов) по сравнению с соответствующими нормальными тканями. Следовательно, ген KLRB1 может использоваться как высокоинформативный маркер при диагностике указанных видов рака.

2. Установлено, что для транскрипции гена PROM1 важно метилирование промоторной области гена, в то время как метилирование других областей гена остается практически неизменным в разных типах клеток и не влияет на транскрипцию.

3. Исследованы эпигенетические изменения двух основных промоторов Р1 и Р2 гена PROM1. Показано, что метилирование промотора Р2 является тканеспецифичным и понижение степени метилирования необходимо для эффективной транскрипции гена. В то же время метилирование промотора Р1 конститутивно и, вероятно, не играет существенной роли в регуляции транскрипции гена.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Тканеспецифичность метилирования геномной ДНК является важным механизмом в регуляции экспрессии генов и играет важную роль в комплексе генетических и эпигенетических факторов, обеспечивающих нормальную жизнедеятельность клеток и всего организма в целом. Метилирование ДНК и модификации гистонов, определяющие компактизацию хроматина, рассматриваются как два основных механизма эпигенетической регуляции экспрессии генов. Накоплены различные свидетельства изменения уровней транскрипции генов и метилирования при различных патологиях и в различных тканях, однако до сих пор нет четкой картины механизмов лежащих в основе этих процессов. Очевидно, что для поддержания нормального функционирования клеток и систем органов важно взаимодействие всех клеточных систем. Исследование принципов регуляции маркерных генов, анализ тканеспецифичности транскрипции генов в нормальных и опухолевых тканях человека, имеет как диагностическое, так и фундаментальное значение. По последним представлениям, многие молекулярные системы, участвующие в контроле развития организма, могут быть также вовлечены в процесс онкогенеза. Подтверждению этой гипотезы в определенной степени способствует схожесть молекулярных характеристик стволовых и раковых клеток. На современном уровне очень важен комплексный подход к изучаемой проблеме, который позволит не только выявить общие принципы регуляции тканеспецифичной экспрессии генов, но и предложить эффективные механизмы воздействия на структуры, способствующие развитию опухоли.

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1 Определение тканеспецифичности транскрипции генов KLRB1 и PROM1.

Для определения тканеспецифичности транскрипции генов KLRB1 и PROM1 использовали метод ОТ-ПЦР. Используя статистические гексануклеотиды в качестве затравки и высокопроцессивную обратную транскриптазу PowerScript ("GibcoBRL", США), на матрицах РНК, выделенных из исследуемых тканей, синтезировали кДНК. На полученных смесях кДНК определяли уровень транскрипции генов KLRB1 и PROM1. Праймеры, специфичные для ПЦР амплификации данных генов, были подобраны так, чтобы продукты амплификации кДНК и геномной ДНК имели разную длину. В качестве контролей проводили ПЦР с праймерами к генам GAPDH и актина, имеющим примерно постоянный уровень экспрессии в различных тканях (т.н. "housekeeping genes"). Каждую ОТ-ПЦР проводили не менее трех раз, отбирая реакционную смесь, начиная с 21-ого цикла ПЦР через 3 цикла вплоть до 39-ого. Это позволило при анализе продуктов ПЦР с помощью агарозного электрофореза достаточно точно детектировать появление продуктов амплификации. Данные считали достоверными при р<0,05, где р - показатель статистической значимости (достоверности) данных.

2.1.1 Транскрипция в клеточных линиях.

Результаты ОТ-ПЦР на кДНК разных клеточных линий показали сильную межклеточную вариабельность уровня транскрипции генов KLRB1 и PROM1. Полученные данные приведены в таблице 1.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Плешкан, Виктор Викторович, 2009 год

1. Shames, D.S., J.D. Minna, and A.F. Gazdar, DNA methylation in health, disease, and cancer. Curr Mol Med, 2007. 7(1): p. 85-102.

2. Costello, J.F. and C. Plass, Methylation matters. J Med Genet, 2001. 38(5): p. 285-303.

3. Bestor, Т.Н., The DNA methyltransferases of mammals. Hum Mol Genet, 2000. 9(16): p. 2395-402.

4. Jaenisch, R. and A. Bird, Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet, 2003. 33 Suppl: p. 245-54.

5. Li, E., Т.Н. Bestor, and R. Jaenisch, Targeted mutation of the DNA meihyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell, 1992. 69(6): p. 915-26.

6. Bird, A.P., CpG-rich islands and the function of DNA methylation. Nature, 1986. 321(6067): p. 209-13.

7. Gardiner-Garden, M. and M. Frommer, CpG islands in vertebrate genomes. J Mol Biol, 1987.196(2): p. 261-82.

8. Versteeg, R., et al., The human transcriptome map reveals extremes in gene density, intron length, GC content, and repeat pattern for domains of highly and weakly expressed genes. Genome Res, 2003. 13(9): p. 1998-2004.

9. Marahrens, Y., X-inactivation by chromosomal pairing events. Genes Dev, 1999.13(20): p. 2624-32.

10. Jain, P.K., Epigenetics: the role of methylation in the mechanism of action of tumor suppressor genes. Ann N Y Acad Sci, 2003. 983: p. 71-83.

11. Bestor, Т.Н., The host defence function of genomic methylation patterns. Novartis Found Symp, 1998. 214: p. 187-95; discussion 195-9, 228-32.

12. Iguchi-Ariga, S.M. and W. Schaffner, CpG methylation of the cAMP-responsive enhancer/promoter sequence TGACGTCA abolishes specific factor binding as well as transcriptional activation. Genes Dev, 1989. 3(5): p. 612-9.

13. Tate, P.H. and A.P. Bird, Effects of DNA methylation on DNA-binding proteins and gene expression. Curr Opin Genet Dev, 1993. 3(2): p. 226-31.

14. Ng, H.H., et al., MBD2 is a transcriptional repressor belonging to the MeCPl histone deacetylase complex. Nat Genet, 1999. 23(1): p. 58-61.

15. Nan, X., S. Cross, and A. Bird, Gene silencing by methyl-CpG-bindingproteins. Novartis Found Symp, 1998. 214: p. 6-16; discussion 16-21, 46-50.

16. Bird, A.P. and A.P. Wolffe, Methylation-induced repression—belts, braces, and chromatin. Cell, 1999. 99(5): p. 451-4.17.