Исследование онтогенетической и тканеспецифической экспрессии гена Grp, геномного гомолога гена gag ретротранспозона gypsy, у Drosophila melanogaster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.05, кандидат биологических наук Кузьмин, Илья Владимирович

• Кузьмин, Илья Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кузьмин, Илья Владимирович

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ 7 1. МОБИЛЬНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ И ИММУНИТЕТ У ДРОЗОФИЛЫ (обзор литературы)

1.1 Мобильные генетические элементы

1.1.1 Классификация мобильных генетических элементов

1.1.2 Строение и жизненный цикл ретровирусов

1.1.3 Особенности ДКП-ретротранспозонов и их сходство с

17

ретровирусами

1.1.4 Взаимодействие ретротранспозонов и ретровирусов

1.1.5 Потенциальные эффекты транспозиции мобильных

22

элементов

1.1.6 Онтогенетическая регуляция экспрессии мобильных элементов и участие мобильных элементов в эмбриональном 24 развитии

1.2 Иммунитет у дрозофилы

1.2.1 Врожденный иммунитет у дрозофилы

1.2.2 Участие РНК-интерференции в противовирусной защите

1.2.3 Контроль перемещения ретроэлементов как способ

31

противовирусной защиты

1.2.4 Другие механизмы противовирусной защиты

1.3 Молекулярная доместикация последовательностей мобильных

35

элементов

1.3.1 Что такое молекулярная доместикация

1.3.2 Различные случаи молекулярной доместикации 3

1.3.3 Доместикация гена gag ДКП-ретротранспозонов

1.3.4 Grp - геномный гомолог гена gag у дрозофилы

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Материалы

2.1.1 Объект исследования

2.1.2 Штаммы Escherichia coli

2.1.3 Праймеры для ПЦР

2.2 Методы

2.2.1 Условия культивирования D. melanogaster

2.2.2 Получение личинок третьего возраста и эмбрионов

2.2.3 Выделение органов и тканей дрозофилы

2.2.4 Выделение геномной ДНК из взрослых особей

2.2.5 Выделение тотальной РНК из биоматериала от дрозофилы

2.2.6 Обратная транскрипция

2.2.7 Полимеразная цепная реакция

2.2.8 ПЦР в реальном времени

2.2.9 Культивирование Е. coli

2.2.10 Приготовление компетентных клеток Е. coli и их трансформация

2.2.11 Выделение плазмидной ДНК из E.coli

2.2.12 Разделение фрагментов ДНК методом электрофореза в

52

агарозном геле

2.2.13 Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля

2.2.14 Клонирование фрагментов гена Grp в экспрессионный вектор рЕТЗО

2.2.15 Секвенирование

2.2.16 Экспрессия конструкций, кодирующих рекомбинантные белки, в клетках E.coli

2.2.17 Выделение рекомбинантных белков из клеток Е. coli и очистка методом аффинной хроматографии

2.2.18 Диализ растворов белков

51

54

54

60

2.2.19 Измерение концентрации белка

2.2.20 Электрофорез белков в полиакриламидном геле в

56

денатурирующих условиях

2.2.21 Электрофорез в неденатурирующих условиях

2.2.22 Окраска полиакриламидных гелей красителем Соотазз1е

57

в-250

2.2.23 Измерение спектра кругового дихроизма

2.2.24 Иммунизация крыс рекомбинантными белками

2.2.25 Взятие крови у крыс и получение сывороток

2.2.26 Титрование сывороток с помощью ИФА

2.2.27 Выделение тотального белка для вестерн-блот гибридизации

2.2.28 Вестерн-блот гибридизация

2.2.29 Биоинформатические методы 61 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей гена Огр у разных видов семейства ИгозорЫШае

3.2 Исследование экспрессии гена Огр на уровне транскрипции на разных стадиях развития и.те1сжо%а81ег

3.3 Сравнение экспрессии гена Огр на уровне транскрипции в разных органах D.melanogaster

3.4 Сравнение экспрессии гена Огр на уровне транскрипции в разных линиях D.melanogaster

3.5 Биоинформатический анализ структуры продукта гена Сгр

3.6 Клонирование гена Огр в составе экспрессионного вектора рЕТЗО

3.7 Исследование вторичной структуры рекомбинантного белка Огр с помощью измерения спектра кругового дихроизма

3.8 Иммунизация крыс рекомбинантными белками Огр и ОгрИ и

62

64

65

68

73

76

получение препарата антител

3.9 Вестерн-блот гибридизация с экстрактами имаго

79

И. melanogaster

3.10 Вестерн-блот гибридизация с экстрактами, выделенными из

различных органов и тканей D.melanogaster на разных стадиях 81 развития

3.11 Возможная функция гена (Згр

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

5. ВЫВОДЫ

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 91 Благодарности

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ALV - avian leukosis virus

DCV - Drosophila С virus

DEPC - diethylpyrocarbonate

DTT - dithiothreitol

DXV - Drosophila x virus

FeLV - feline leukemia virus

FHV - Flock house virus

GNBP - Gram-negative-binding protein

Grp - gag-related protein SDS sodium dodecyl sulfate

Ha-MSV - Harvey murine sarcoma virus

LB - Luria-Bertani

LINE - long interspersed nuclear elements MMTV - mouse mammary tumor vims Mo-MLV - Moloney murine leukemia virus Mo-MSV - Moloney murine sarcoma virus PBS - phosphate buffered saline PGRP - peptidoglycan recognition protein PMSF - phenylmethylsulfonyl fluoride SINE - short interspersed nuclear elements SSV - simian sarcoma virus ДКП - длинные концевые повторы кДа -кило дальтоны

МГЭ - мобильные генетические элементы млн - миллион

ОРС - открытая рамка считывания пн - пары нуклеотидов

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование онтогенетической и тканеспецифической экспрессии гена Grp, геномного гомолога гена gag ретротранспозона gypsy, у Drosophila melanogaster»

ВВЕДЕНИЕ

Мобильные генетические элементы широко представлены в геномах эукариотических организмов. Среди них особое место занимают ретротранспозоны с длинными концевыми повторами, которые в значительной степени сходны с ретровирусами позвоночных: имеют сходную структуру и жизненный цикл. У дрозофилы наибольший интерес вызывают ретротранспозоны, относящиеся к группе gypsy (Bowen, McDonald, 2001). Они могут содержать все три открытые рамки считывания — gag, pol, env, характерные для ретровирусов, однако рамка env может и отсутствовать. Известно, что gypsy является инфекционным ретровирусом у дрозофилы, первым ретровирусом, обнаруженным у беспозвоночных (Kim et al., 1994). Показано, что у ретротранспозонов gypsy и ZAM рамка считывания env функциональна. Эти ретротранспозоны образуют вирусные частицы, подобные вирионам ретровирусов, что позволяет считать gypsy и ZAM настоящими ретровирусами (Song et al., 1994, Teysset et al., 1998, Leblanc et al., 2000). С другой стороны, ретровирус может стать мобильным генетическим элементом при интеграции в геном клеток зародышевой линии хозяина. Также существуют ретровирусы (SSV, Ha-MSV, Mo-MSV), которые потеряли часть генов и, подобно многим ретротранспозонам, неспособны формировать вирусные частицы и даже самостоятельно реплицироваться. Такие вирусы распространяются при совместной инфекции с близкородственными ретровирусами (Coffin et al., 1997). Таким образом, между ДКП-ретротранспозонами и ретровирусами четкой границы не существует.

Изучение ретротранспозонов и ретровирусов является важным направлением в современной науке. Ретровирусы вызывают ряд заболеваний у человека и животных, наиболее известным из которых

является СПИД. Большой интерес представляет участие ретроэлементов в канцерогенезе (Romanish et al., 2010), развитии аутоиммунных заболеваний и заболеваний нервной системы (Christensen, 2010). Большую помощь в борьбе с этими заболеваниями может дать изучение механизмов противовирусной защиты и контроля перемещения ретроэлементов. Еще одно важное направление это изучение участия ретротранспозонов и ретровирусов в эволюционном процессе.

Копии ретроэлементов (ретротранспозонов и ретровирусов), интегрированные в геном, со временем деградируют, однако отдельные гены или их фрагменты могут быть адаптированы на пользу организма-хозяина, то есть подвергаться процессу молекулярной доместикации. У млекопитающих в результате молекулярной доместикации гена env появился ген syncytin, участвующий в формировании плаценты. В результате нескольких случаев доместикации гена gag появились гены, принадлежащие семействам Fv и Mart {Mar), участвующие в ограничении ретровирусной инфекции (Stoye, 1998, Brandt et al, 2005). У дрозофилы также обнаружены гены, гомологичные генам ретротранспозонов: Iris -гомолог гена env (Malik, Henikoff, 2005) и Grp, идентифицированный в нашей лаборатории, - гомолог гена gag (Нефёдова, Ким, 2009).

Ген Grp присутствует во всех секвенированных геномах семейства Drosophilidae. Это означает, что его доместикация произошла до наступления видовой радиации в семействе, то есть 40-50 млн лет назад. Ранее в нашей лаборатории было показано, что Grp в значительной степени консервативен, это говорит о том, что он поддерживается стабилизирующим отбором и выполняет определенные функции в организме D. melanogaster (Нефёдова, Ким, 2009).

Доместицированные гены выполняют широкий спектр функций в организме хозяина, и их изучение представляет значительный интерес. Многие из них тесно связаны с процессами эмбрионального развития и выполняют разнообразные функции, начиная с участия в сигнальных

путях и регуляции родительского геномного импритинга и заканчивая участием в формировании синцития в трофобласте (Volff, 2006, Volff, 2009).

Целью данной работы было изучение структуры и возможных функций гена Grp, исследование структуры его белкового продукта и тканеспецифичности экспрессии этого гена на уровне транскрипции и трансляции в онтогенезе у D.melanogaster. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать транскрипцию гена Grp на разных стадиях индивидуального развития D. melanogaster.

2. Исследовать экспрессию гена Grp на уровне транскрипции в разных органах и тканях D. melanogaster.

3. Клонировать ген Grp, экспрессировать его в условиях in vitro и выделить рекомбинантный белок.

4. Провести исследование структуры белка Grp физико-химическими и биоинформатическими методами.

5. Получить препараты антител (антисыворотки) к рекомбинантному белку Grp.

6. Изучить экспрессию гена Grp на уровне трансляции в разных органах и тканях D. melanogaster.

7. Исследовать распределение продукта гена Grp на разных стадиях онтогенеза у D. melanogaster.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые осуществлено клонирование и исследование экспрессии гена Grp, гомолога гена gag ретротранспозонов. Показано, что ген Grp у D. melanogaster экспрессируется исключительно на стадии имаго, причем его экспрессия имеет тканеспецифичный характер.

Впервые получен рекомбинантный белок, соответствующий белковому продукту гена Grp, получены данные о его вторичной структуре, совпавшие с предсказанием вторичной структуры, полученным с помощью биоинформатических методов.

Впервые белковый продукт гена Grp был обнаружен в условиях ш vivo, исследована его экспрессия на разных стадиях развития и в разных тканях у D. melanogaster.

Полученные данные могут быть использованы в дальнейшем для исследования вопросов, связанных с молекулярной доместикацией и ролью ретроэлементов в эволюции, а также для изучения функций доместицированного гена Grp и связи их с онтогенезом D.melanogaster. Представляет интерес возможное участие гена Grp в защите от ретровирусов. Изучение этих вопросов может принести пользу в борьбе с ретровирусными инфекциями человека и животных.

Личное участие автора. Работа выполнена непосредственно автором. Поставленные задачи решены с применением современных методов генетики, эмбриологии, иммунологии. Выводы сделаны на основании собственных оригинальных данных.

Апробация работы. Работа прошла апробацию на Всероссийской конференции «Инновационные и молекулярно-генетические исследования живых систем»., посвященной 10-летию кафедры генетики БГПУ им. М. Акмуллы (Уфа, 2009), Международной конференции «Спорт: медицина, генетика, физиология, биохимия, педагогика, психология» (Уфа, 2011), XVII и XVIII Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010» и «Ломоносов-2011» (Москва), семинарах лаборатории генетики животных и заседаниях кафедры генетики биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК - 2, тезисов докладов и материалов конференций - 4.

1. МОБИЛЬНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ И ИММУНИТЕТ У ДРОЗОФИЛЫ (обзор литературы)

1.1 Мобильные генетические элементы

1.1.1 Классификация мобильных генетических элементов

К мобильным генетическим элементам относят последовательности ДНК, способные к перемещению внутри генома и увеличению числа копий, либо когда-то имевшие такую способность. Мобильные элементы принято классифицировать по механизму их перемещения и структуре, а также по тому, происходит это перемещение самостоятельно (автономные мобильные элементы) или при посредстве других мобильных элементов (неавтономные мобильные элементы) (рис. 1).

Рассмотрим автономные мобильные элементы. По механизму перемещения выделяются две группы - ДНК-транспозоны и ретроэлементы. Механизм перемещения ДНК-транспозонов связан с вырезанием последовательности транспозона с последующим встраиванием в другой участок генома, увеличение их копийности происходит за счет процессов связанных с репликацией ДНК и рекомбинацией. ДНК-ретротранспозоны кодируют фермент транспозазу, отвечающий за вырезание и встраивание мобильного элемента, и содержат на концах короткие инвертированные повторы, которые распознает транспозаза. Совсем другой механизм перемещения у ретроэлементов: они обычно не подвергаются вырезанию и увеличивают свою копийность путем обратной транскрипции РНК, считываемой с мобильного элемента с последующей интеграцией в геном полученной ДНК-копии.

Ретроэлементы, в свою очередь подразделяются на LINE-ретротранспозоны (Long Interspersed Nuclear Elements) и ДКП-ретротранспозоны. LINE-элементы имеют внутренний промотор РНК-

полимеразы II, которая осуществляет транскрипцию генов ретроэлемента и обычно содержат две открытые рамки считывания (ОРС). ОРС1 кодирует белок, связывающийся с РНК ретротранспозона, он способен функционировать в качестве шаперона для нуклеиновых кислот (ускоряет процессы плавления и отжига двуцепочечных нуклеиновых кислот) и необходим на этапе интеграции ретротранспозона в геном. ОРС2 кодирует обратную транскриптазу, создающую ДНК-копию ретротранспозона на матрице РНК. Эти мобильные элементы не содержат на концах каких-либо специфических последовательностей, таких как прямые или инвертированные повторы (Martin, 2010).

Мобильные генетические элементы -45% генома человека

ДНК-транспозоны

Ретроэлементы

LINE-ретротранспозоны

автономные и неавтономные

16,1%

ДКП-ретротранспозоны и эндогенные ретровирусы автономные и неавтономные

8.3%

Рис. 1. Классификация мобильных генетических элементов (по Bannert, Kurth, 2004, с изменениями).

ДКП-ретротранспозоны получили свое название из-за длинных концевых повторов на концах. Типичные ДКП-ретротранспозоны имеют две открытые рамки считывания, гомологичные генам gag и pol ретровирусов, некоторые имеют третью рамку считывания, гомологичную ретровирусному гену env. Наличие у ДКП-ретротранспозонов длинных концевых повторов и генов, гомологичных генам ретровирусов, придает им большое структурное сходство с копиями ретровирусов, встроенными в геном. Поэтому ДКП-ретротранспозоны, имеющие три рамки считывания (gag, pol, env) принято выделять в группу эндогенных ретровирусов(Ваппей, Kurth, 2004).

В каждой из рассмотренных групп мобильных элементов присутствуют также неавтономные мобильные элементы. Неавтономными мобильными элементами часто становятся фрагменты или дефектные копии автономных элементов, например утратившие транспозазу или обратную транскриптазу. Внутри ретроэлементов выделяют большой класс исключительно неавтономных мобильных элементов SINE, в него, в частности входят Alu-элементы - продукт обратной транскрипции РНК сигнал-распознающей частицы, эти элементы присутствуют в большом количестве в геномах приматов (Cordaux, Batzer, 2009). Часто в качестве неавтономных ретроэлементов рассматривают процессированные псевдогены - встроенные в геном продукты обратной транскрипции клеточных РНК. Обычно они являются результатом активности LINE-ретротранспозонов (Pavlicek et al., 2005). Однако они не являются мобильными элементами в строгом смысле этого слова, так как обычно образуются в результате единичных событий и обычно имеют одну или несколько копий на геном (некоторые до 50 копий (Ohshima et al., 2003)), к тому же дальнейшее их перемещение маловероятно. Приведенный выше способ классификации объединяет в одну группу мобильные элементы, имеющие близкое происхождение.

Мобильные элементы составляют значительную часть генома многих эукариотических организмов. Так, например, около 45% последовательностей генома человека представлены мобильными элементами, в том числе ДНК-транспозоны - 2,8%, LINE-ретротранспозоны - 20,1%, SINE-элементы -13,1%, ДКП-ретротранспозоны и эндогенные ретровирусы - 8,3%.(Bannert, Kurth, 2004). Особый интерес представляют ДКП-ретротранспозоны из-за своего сходства с ретровирусами.

1.1.2 Строение и жизненный цикл ретровирусов

К ретровирусам относят вирусы с +РНК геномом (смысловая геномная РНК), имеющие в цикле репликации стадию в виде ДНК, интегрированной в геном хозяина. Типичные представители ретровирусов содержат в геноме три гена: gag, pol и env. Эти вирусы имеют замкнутый капсид с одной осью симметрии (в отличие от икосаэдрических капсидов многих вирусов), напоминающий своей формой еловую шишку. Снаружи капсид окружен мембраной, захваченной у хозяйской клетки. Ретровирусы не имеют РНК-зависимой РНК-полимеразы, как большинство РНК-содержащих вирусов. РНК их генома вместо копирования подвергается обратной транскрипции: происходит синтез ДНК на матрице геномной РНК вируса. В образовавшемся дуплексе РНК-ДНК цепь РНК расщепляется РНКазой Н, после чего обратная транскриптаза достраивает вторую цепь ДНК. Полученная ДНК-копия вирусного генома встраивается в геном хозяйской клетки с помощью интегразы. За обратную транскрипцию и интеграцию в геном отвечают ферменты, кодируемые ОРС2 (pol). Единый белковый продукт этого гена имеет протеазный домен и подвергается автокаталитическому расщеплению на собственно протеазу, обратную транскриптазу, интегразу и РНКазу Н. Ген gag кодирует белки капсида, ген env кодирует белки, встроенные в мембрану

вируса и служащие для связывания вируса с клеткой и слияния вирусной и клеточной мембран (Coffin et al., 1997).

Интегрированная в геном хозяина копия ретровируса (провирус) содержит два длинных (-500 п.н.) неинвертированных концевых повтора, идентичных у неповрежденного провируса. В обоих повторах находятся промоторы, с одного из них происходит транскрипция вирусной РНК (ДКП, содержащий этот промотор принято называть «левым»). Промотор «правого» ДКП для транскрипции интегрированного вируса не нужен, это резервная копия для восстановления «левого» ДКП, который попадает в транскрипт не целиком. С промотора «правого» ДКП может транскрибироваться геномная ДНК с одной стороны от места интеграции вируса. Изначально эта РНК содержит все три гена вируса и для нормальной трансляции белков вирусная РНК подвергается альтернативному сплайсингу: есть несколько вариантов сплайсинга геномной РНК, каждый приводит к трансляции определенного гена. Несплайсированная геномная РНК подвергается упаковке в капсид (Coffin et al., 1997). Интересно, что у многих ретровирусов нет отдельного варианта сплайсинга для трансляции продукта pol: в результате сплайсинга образуется РНК, содержащая в начале ген gag, a pol находится после гена gag в другой рамке считывания (сдвинутой на один нуклеотид в сторону начала трансляции по отношению к рамке gag). В большинстве случаев происходит трансляция рамки считывания гена gag с последующей терминацией трансляции. Однако на «стыке» рамок gag и pol имеется специальный сигнал, в некоторых случаях приводящий к «проскальзыванию» рибосомы на шаг назад (фреймшифт) и продолжению трансляции уже в рамке pol с образованием слитого белка Gag-pol, который процессируется протеазой вируса с образованием Gag и продуктов рамки pol. Такой необычный способ трансляции обеспечивает вирусу необходимое соотношение количества белка Gag и белков, кодируемых рамкой pol (Goff, 2004). Кроме генов gag, pol и env,

ретровирусы могут иметь дополнительные гены, продукты которых увеличивают эффективность инфекции за счет увеличения уровня транскрипции вируса, стимуляции пролиферации зараженных клеток и

гр

подавления клеточных систем противовируснои защиты. Гак, например вирус ВИЧ-1 (HIV-1) дополнительно имеет шесть генов с различными функциями (Coffin et al., 1997). Некоторые вирусы заимствуют для этого клеточные гены, например, вирус саркомы Рауса несет в своем геноме ген src, участвующий в регуляции клеточного цикла. Неконтролируемая экспрессия этого гена в зараженных клетках приводит к их пролиферации и образованию опухолей (Stelelin et al., 1976; Schwartzberg, 1998).

1.1.3 Особенности ДКП-ретротранспозонов и их сходство с ретровирусами

Как уже было сказано, ДКП-ретротранспозоны обладают значительным структурным сходством с интегрированными в геном копиями ретровирусов (рис. 3). Как и ретровирусы, ДКП-ретротранспозоны имеют неинвертированные ДКП, содержащие промоторы. Гены gag и pol ДКП-ретротранспозонов гомологичны соответствующим генам ретровирусов. Основным отличием ДКП-ретротранспозонов от ретровирусов является отсутствие функционального гена env, что не позволяет ДКП-ретротранспозонам формировать капсид и покидать клетку. Поэтому цикл репликации ДКП-ретротранспозонов (рис. 2) протекает в пределах одной клетки и одного генома (Havecker et al., 2004).

Рис. 2. Сравнение жизненного цикла ретротранспозонов и ретровирусов. При сходном механизме репликации, ретротранспозоны в отличие от ретровирусов не способны формировать вирусные частицы и покидать клетку (по Jern, Coffin, 2008).

Следует отметить, что ретровирусы также могут увеличивать свою копийность в зараженной клетке, то есть вести себя подобно ДКП-ретротранспозонам, в том числе и при проникновении в клетки зародышевой линии (MMTV, FeLV) (Coffin et al., 1997). О возможности такого превращения ретровируса в мобильный элемент известно достаточно давно, например, из экспериментов с вирусами Mo-MLV (Jaenisch, 1976; Jaenisch et al., 1981) и ALV (Crittenden et al., 1989). Напротив, для gypsy и ZAM, изначально считавшихся ДКП-ретротранспозонами дрозофилы, показаны инфекционные свойства и

формирование вирусных частиц (Kim et al., 1994; Song et аЦ 1994; Teysset et al., 1998; Leblanc et al., 2000). Следовательно, это полноценные ретровирусы, проникшие в генеративные клетки дрозофилы, которые были открыты и описаны в качестве ДКП-ретротранспозонов. Границу между ретровирусами и ретротранспозонами еще больше стирает тот факт, что существует ряд ретровирусов (SSV, Ha-MSV, Mo-MSV), не имеющих собственных генов env и даже ро! (взамен этого они несут онкогены) - для их инфекции необходимо присутствие полноценных ретровирусов (Coffin et al., 1997). ДКП-ретротранспозоны потенциально могут оказаться такими же вирусами-саттелитами и обнаружить инфекционные способности в присутствии полноценного ретро вируса. Ретротранспозоны группы gypsy были признаны настоящими ретровирусами и выделены в отдельное семейство Metaviridae и род Errant ivirus (Gypsy Database 2,0, http://gydb.org/index.php/Ty3/Gypsy; http://ictvonline.org/virusTaxonomy.asp)

gag

ретровирусы

src|

SRV

MLV

ДКП-ретротранспочоны

JKgag

Gypsy

Copia

Рис. 3. Структурное сходство ретротранспозонов и ретровирусов (по Coffin et al., 1997; Нефедова, Ким, 2007).

Следует заключить, что между ДКП-ретротранспозонами и ретровирусами нет принципиальных различий: ретровирусы могут вести себя как мобильные генетические элементы, а ДКП-ретротранспозоны могут проявлять свойства, характерные для вирусов.

1.1.4 Взаимодействие ретротранспозонов и ретровирусов

При совместной инфекции клетки двумя штаммами или двумя близкородственными видами многих вирусов возможен обмен генами между ними. Самый известный пример - это образование новых серотипов вируса гриппа. Разные штаммы вируса гриппа могут нести разные гены. Гены вируса гриппа находятся на разных РНК. При совместной инфекции двумя штаммами вируса (часто имеющими специфичность к разным видам хозяев) их геномы подвергаются реассортации (некоторый аналог перераспределения материнских и отцовских хромосом в мейозе): в один капсид могут упаковаться РНК, исходно принадлежавшие двум разным штаммам. Такая вирусная частица может дать начало новому серотипу вируса. Именно этот механизм привел к появлению широко известного «вируса свиного гриппа» (LaRussa, 2011).

В случае ретровирусов, обмен генами между двумя видами вирусов может происходить в результате рекомбинации между ДНК интегрированных в геном провирусов. В частности, возможен обмен генами env, что приводит к изменению специфичности вируса в отношении инфицирования определенных тканей и определенных видов хозяев (рис. 4).

В качестве примера моделирования смены вирусом хозяина можно привести работу JI. Тейссе и др. (Teysset et al., 1998), в которой вектор, созданный на основе вируса лейкемии мышей, был упакован с помощью белка env ретротранспозона gypsy. Полученные вирусные частицы оказались способными переносить РНК вектора в клетки дрозофилы, т.е.

белок env, принадлежащий gypsy, позволил вектору попасть в клетки нетипичного хозяина.

gagl poll

envi

gag2 pol2 env2

gagl poil j envi

X

gag2 po!2 | env2

gagl poll

env2

gag2 pol2

envi

gagl poll envi

gag2 po!2

envi

Рис. 4. Рекомбинация между генами ретровирусов и ретротранспозонов (по Jem, Coffin, 2008).

ДНК-копия ретровируса может рекомбинировать также с копиями ДКП-ретротранспозонов, имеющимися в геноме. При этом возможно как изменение свойств вируса, который получил часть последовательности ретротранспозона, так и появление инфекционной способности у ДКП-ретротранспозонов, то есть превращение его в ретровирус, например, за

счет приобретения ДКП-ретротранспозоном отсутствовавшего у него гена env (рис. 4). Также возможна упаковка РНК ДКП-ретротранспозонов в капсид вируса и превращение ретротранспозона в вирус-саттелит, распространяющийся за счет полноценных ретровирусов (Evans et al., 2009).

1.1.5 Потенциальные эффекты транспозиции мобильных элементов

Активное перемещение мобильных элементов обычно имеет негативные последствия для отдельно взятой клетки или организма. Напротив, важные этапы эволюции многих видов, по-видимому, связаны с эпизодами ретровирусной инфекции и массовой активации мобильных элементов.

На уровне клетки или организма активность мобильных элементов приводит к мутациям, например, к повреждению генов в результате инсерции мобильного элемента или гиперэкспрессии генов, оказавшихся рядом с его промотором. Среднестатистически, большая часть этих мутаций приносит вред и приводит к снижению жизнеспособности организма. Многие организмы выработали специальные механизмы для ограничения перемещения мобильных элементов. Перемещения мобильных элементов связывают с развитием многих заболеваний, в первую очередь онкологических (Romanish et al., 2010). Также обнаружена связь активности мобильных элементов с такими заболеваниями как рассеянный склероз, шизофрения, ревматоидный артрит, псориаз (Christensen, 2010). Однако тот же процесс становится полезным на уровне популяции, так как приводит к увеличению разнообразия. При этом вредные мутации элиминируются естественным отбором, а немногие полезные мутации отбором поддерживаются. Таким образом, активность мобильных элементов может приводить к ускорению процесса эволюции.

Появление в клетке активно транскрибирующейся копии автономного ретроэлемента (ретротранспозона или ретровируса) приводит к активации перемещения неавтономных ретроэлементов за счет обратной транскриптазы, продуцируемой автономным ретроэлементом (Evans et al., 2009). Один из основных эффектов перемещения мобильных элементов -это включение их последовательностей в гены организма-хозяина или регуляторные последовательности хозяйских генов. Активность мобильных элементов приводит также к увеличению частоты рекомбинации в геноме хозяина из-за разрывов, вносимых в хромосомную ДНК при инсерции мобильных генетических элементов. Множество копий мобильных генетических элементов приводит к появлению сайтов, по которым возможна гомологичная рекомбинация, приводящая к делециям, инверсиям и дупликациям участков генома (Jern, Coffin, 2008). Повышенная частота рекомбинации может быть причиной дупликации генов с последующей их дивергенцией и приобретением одной из копий новых функций - это один из важнейших механизмов эволюции. Ретровирусная инфекция может приводить к горизонтальному переносу ретротранспозонов и клеточных генов за счет упаковки клеточных РНК в вирусную частицу с последующей обратной транскрипцией и встраиванием в геном другой клетки (Jern, Coffin, 2008). Горизонтальному переносу может способствовать и включение клеточных генов в вирусный геном (как в случае вируса саркомы Рауса). Полезные стороны мобильных элементов и ретровирусов связаны с включением их последовательностей в функционирование и регуляцию генов хозяина (раздел 1.3.2). Таким образом, мобильные элементы и ретровирусы предоставляют широкое поле для деятельности естественного отбора и могут помогать процессу эволюции в быстром преодолении ряда барьеров за счет повышения частоты мутаций, маловероятных в отсутствии мобильных элементов, в частности за счет дупликации генов, ведущей к их дивергенции, а также горизонтального переноса генетической информации.

1.1.6 Онтогенетическая регуляция экспрессии мобильных элементов и участие мобильных элементов в эмбриональном развитии

Неконтролируемое перемещение мобильных генетических элементов особенно опасно в половых клетках и клетках эмбрионов на ранних стадиях развития, так как мутации в этих клетках могут привести к значительным нарушениям у взрослого организма. В контроль экспрессии мобильных элементов вовлечены многие механизмы. Последовательности ДНК мобильных элементов подвергаются специфическому метилированию на ранних стадиях эмбрионального развития. Разные классы мобильных элементов подвергаются метилированию с помощью разных метилтрансфераз, но этот процесс изучен недостаточно хорошо. Экспрессия мобильных элементов также ограничивается с помощью модификации гистонов (метилирование и деацетилирование) и Piwi-зависимых механизмов РНК-интерференции (Rowe, Trono, 2011)

В то же время показано, что репликация некоторых LINE-ретротранспозонов играет важную роль в эмбриональном развитии. Подавление экспрессии этих ретротранспозонов приводит к остановке деления зиготы на стадии двух бластомеров. Интересно, что эти ретротранспозоны подвергаются активной обратной транскрипции, при этом накапливается значительное количество их ДНК-копий, но не происходит их массовой интеграции, способной повредить геном (Vitullo et al., 2011). В данном случае, мобильные элементы оказались включены в один из регуляторных механизмов эмбрионального развития. Также известно о связи повышенной экспрессии некоторых эндогенных ретровирусов мыши с поддержанием плюрипотентного состояния эмбриональных стволовых клеток (Rowe, Trono, 2011).

Кроме того, важную роль в эмбриональном развитии могут играть гены и регуляторные последовательности ДНК, заимствованные у мобильных элементов и подвергшиеся изменениям в процессе эволюции.

Так, например, несколько генов, относящихся к семейству БупсШп, экспрессируются в клетках трофобласта плацентарных млекопитающих и необходимы для формирования плаценты (смотреть раздел 1.3.2). Таким образом, мобильные генетические элементы могут быть адаптированы на пользу организма-хозяина и могут участвовать в процессах эмбрионального развития.

1.2 Иммунитет у дрозофилы

1.2.1 Врожденный иммунитет у дрозофилы

В отличие от млекопитающих, в защите дрозофилы от патогенов основную роль играют системы врожденного иммунитета. Системы врожденного иммунитета есть практически у всех животных, эти механизмы имеют очень древнее происхождение и в высокой степени консервативны. Врожденный иммунитет дрозофилы достаточно надежен, чтобы эффективно защищать ее организм на протяжении всего жизненного цикла. «Первой линией» врожденного иммунитета являются первичные эпителиальные барьеры, отделяющие организм от внешней среды. На этом этапе обычными механизмами защиты являются создание механического барьера, не допускающего проникновения патогенов в более глубокие клеточные слои, и секреция антимикробных белков. У дрозофилы, первичными барьерами на пути инфекции являются, в первую очередь, пищеварительная система (кишечник) и трахеи.

Проникновение патогена через эпителиальный барьер, вызывает гуморальные и клеточные иммунные реакции в гемолимфе. Гуморальный ответ у дрозофилы заключается в активации фосфофенолоксидазного каскада, приводящей к отложению меланина на поверхности патогенных микроорганизмов и поврежденных участках тканей и каскадов, приводящих к секреции антимикробных пептидов жировым телом.

Клеточный иммунный ответ у дрозофилы включает в себя активацию фагоцитов и запуск процесса аутофагии у клеток, в которые проник патоген, (рис. 5).

cd

СЭ ,

СЭ CD

CD

it A it

секреция антимикробных пептидов

t >

cz>

Заключение диссертации по теме «Биология развития, эмбриология», Кузьмин, Илья Владимирович

5. ВЫВОДЫ

1. Исследование транскрипции на разных стадиях развития D. melanogaster показало, что ген Grp экспрессируется на имагинальной стадии онтогенеза, тогда как у эмбрионов и личинок РНК Grp не обнаружена. По-видимому, функция гена Grp необходима для обеспечения процессов, осуществляющихся на взрослой стадии онтогенеза.

2. Исследование экспрессии гена Grp на уровне транскрипции в разных органах и тканях D. melanogaster показало, что РНК Grp выявляется в соматических тканях (головы, кишечника, корпуса), а в гонадах -лишь в следовых количествах (~ в 500 раз меньше). Вероятно, тканеспецифичность экспрессии гена Grp свидетельствует о том, что он функционирует в тканях, контактирующих с окружающей средой.

3. Ген Grp клонирован, получен рекомбинантный белок Grp и его N-концевой фрагмент, которые были использованы для получения препаратов антител.

4. Обнаружена экспрессия гена Grp на уровне трансляции, причем профили распределения белка и РНК на разных стадиях онтогенеза и в различных органах и тканях совпадают. По-видимому, экспрессия гена Grp на этапе трансляции не репрессируется и не имеет специфического механизма регуляции.

5. Биоинформатический анализ аминокислотной последовательности белка Grp и исследование спектра кругового дихроизма показало, что белок имеет трансмембранный домен и альфа-спиральные участки, чередующиеся с неупорядоченными петлями. Предположительно белок Grp имеет глобулярную структуру, напоминающую структуру белка Gag ретровирусов.

6. На основании аномальной электрофоретической подвижности можно предполагать, что белок вгр подвергается посттрансляционной модификации. По-видимому, белок вгр может локализоваться в мембране соматических клеток имаго дрозофилы и может выполнять сигнальную и/или рецепторную функцию

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе проведено комплексное исследование гена Grp, структурного гомолога гена gag ретротранспозонов/ретровирусов группы gypsy в геноме D. melanogaster. Было установлено, что ген Grp активно экспрессируется в клетках, однако экспрессия гена Grp на уровне транскрипции наблюдается только на имагинальной стадии развития D. melanogaster и выявляется только в соматических тканях, демонстрируя тканеспецифичный характер. В клетках имаго был обнаружен и белковый продукт гена Grp. По-видимому, он имеет глобулярную структуру с включением участков альфа-спиралей и обладает трансмембранным доменом. Так же, как и на стадии транскрипции, он экспрессируется в соматических тканях. Таким образом, установлено, что Grp, локализованный в хозяйском геноме дрозофилы, - это реально функционирующий ген. По-видимому, он появился в геноме D. melanogaster в результате доместикации гена gag ретротранспозона, принадлежащего к группе gypsy.

Можно предполагать, что ген Grp является одним из компонентов иммунитета дрозофилы. Об этом свидетельствуют факты о повышении экспрессии гена Grp в ответ на липополисахариды грамотрицательных бактерий (Silverman et al., 2003). Возможно его участие и в защите от вирусной инфекции. Известны случаи доместикации гена gag ретротранспозонов млекопитающих, когда доместицированные гены стали участвовать в противовирусной защите. Такой иммунитет, вероятно, осуществляется только в соматических тканях дрозофилы, происходящих из клеток имагинальных дисков, а не эмбриональных и личиночных. Можно предполагать, что защита генеративных клеток, а также эмбриональных и личиночных клеток вовлекает иной механизм.

Возможная модификация белка Огр и наличие в его структуре трансмембранного домена позволяют предполагать, что белок Огр, локализован в мембране клеток имаго дрозофилы и выполняет сигнальную и/или рецепторную функцию.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кузьмин, Илья Владимирович, 2012 год

6. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ким А.И., Беляева Е.С. Транспозиции МДГ4 на фоне неизменной локализации других мобильных элементов в мутаторной линии Drosophila melanogaster, характеризующейся генетической нестабильностью // Доклады Академии Наук СССР. - 1986. - Т.289. -№5.-С. 1248- 1252.

2. Ким А.И., Беляева Е.С., Ларкина З.Г., Асланян М.М. Генетическая нестабильность и транспозиции мобильного элемента МДГ4 в мутаторной линии Drosophila melanogaster // Генетика. - 1989. - Т.25. -№10.-С. 1747- 1756.

3. Медведев Н.Н. Практическая генетика // М., Наука. - 1968. - С. 294.

4. Нефёдова Л.Н., Ким А.И. Молекулярная эволюция мобильных элементов группы gypsy: гомолог гена gag у Drosophila // Генетика. -2009.-Т.45.-№1.-С. 30-37.

5. Нефедова Л.Н., Ким А.И. Эволюция от ретротранспозонов к ретровирусам: источник происхождения гена env II Журнал общей биологии. - 2007. - Т.68. - №6. - С. 457 - 467.

6. Aravind L. The BED finger, a novel DNA-binding domain in chromatin boundary element-binding proteins and transposases // Trends Biochem. Sci. - 2000. - Y.25. - P. 421-423.

7. Bannert N., Kurth R. Retroelements and the human genome: new perspectives on an old relation // Proc Natl Acad Sci USA. - 2004. - V.101; №2.-P. 14572- 14579.

8. Berry В., Deddouche S., Kirschner D., Imler J.L., Antoniewski C. Viral suppressors of RNA silencing hinder exogenous and endogenous small RNA pathways in Drosophila // PLoS One. - 2009. - V.4; №6. - P. e5866.

9. Bowen N.J., McDonald J.F. Drosophila euchromatic LTR retrotransposons are much younger than the host species in which they reside // Genome Res. - 2001. - V.l 1; №9. - P. 1527 - 1540.

1 O.Brandt J., Veith A.M., Volff J.N. A family of neofunctionalized Ty3/gypsy retrotransposon genes in mammalian genomes // Cytogenet Genome Res. -2005. - V.l 10; №1-4. - P. 307 - 317.

11.Brennecke J., Aravin A.A., Stark A., Dus M., Kellis M., Sachidanandam R., Hannon GJ. Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity in Drosophila // Cell. - 2007. - V.l28; №6. - P. 1089 -1103.

12.Butler P.J. Self-assembly of tobacco mosaic virus: the role of an intermediate aggregate in generating both specificity and speed // Philos Trans R Soc bond В Biol Sci. - 1999. - V.354; №1383. - P. 537 - 550.

13.Campillos M., Doerks Т., Shah P.K., Bork P. Computational characterization of multiple Gag-like human proteins // Trends Genet. - 2006. - V.22; №11.-P. 585 - 589.

14.Campos-01ivas R., Newman J.L., Summers M.F. Solution structure and dynamics of the Rous sarcoma virus capsid protein and comparison with capsid proteins of other retroviruses // J Mol Biol. - 2000. - V.296; №2. - P. 633 - 649.

15.Christensen T. HERVs in neuropathogenesis // J Neuroimmune Pharmacol. -2010. - V.5; №3. - P. 326 - 335.

ló.Clark M.B., Janicke M., Gottesbühren U., Kleffmann Т., Legge M., Poole E.S., Tate W.P. Mammalian gene PEG10 expresses two reading frames by high efficiency -1 frameshifting in embryonic-associated tissues // J Biol Chem. - 2007. - V.282; №52. - P. 37359 - 37369.

17.Coffin J.M., Hughes S.H., Varmus H.E. Retroviruses // Cold Spring Harbor Laboratory Press. - 1997. - 843 p.

18.Cordaux R., Batzer M.A. The impact of retrotransposons on human genome evolution // Nat Rev Genet. - 2009. - V. 10; №10. - P. 691 - 703.

19.Crittenden L.B., Fadly A.M., Smith E.J. Segregation, viral phenotype, and proviral structure of 23 avian leukosis virus inserts in the germ line of chickens // Theor. Appl. Genet. - 1989. V.77. - P. 505 - 515.

20.Desset S., Meignin C., Dastugue B., Vaury C. COM, a heterochromatic locus governing the control of independent endogenous retroviruses from Drosophila melanogaster // Genetics. - 2003. - V.164; №2. - P. 501 - 509.

21.Ding S.W., Voinnet O. Antiviral immunity directed by small RNAs // Cell. -2007. - V. 130; №3. - P. 413 - 426.

22.Dostert C., Jouanguy E., Irving P., Troxler L., Galiana-Arnoux D., Hetru C., Hoffmann J.A., Imler J.L. The Jak-STAT signaling pathway is required but not sufficient for the antiviral response of drosophila // Nat Immunol. - 2005. -V.6;№9.-P. 946-953.

23.Dupressoir A., Marceau G., Vernochet C., Bénit L., Kanellopoulos C., Sapin V., Heidmann T. Syncytin-A and syncytin-B, two fusogenic placenta-specific murine envelope genes of retroviral origin conserved in Muridae // Proc Natl Acad Sci USA. - 2005. - V.102; №3. - P. 725 - 730.

24.Dupuis S., Jouanguy E., Al-Hajjar S., Fieschi C., Al-Mohsen I.Z., Al-Jumaah S., Yang K., Chapgier A., Eidenschenk C., Eid P. Impaired response to interferon-alpha/beta and lethal viral disease in human STAT1 deficiency // Nat Genet. - 2003. - V.33. - P. 388 - 391.

25.Evans L.H., Alamgir A.S., Owens N., Weber N., Virtaneva K., Barbian K., Babar A., Malik F., Rosenke K. Mobilization of endogenous retroviruses in mice after infection with an exogenous retrovirus // J Virol. - 2009. - V.83; №6.-P. 2429-2435.

26.Goff S.P. Genetic reprogramming by retroviruses: enhanced suppression of translational termination // Cell Cycle. - 2004. - V.3; №2. - P. 123 - 125.

27.Gunawardane L.S., Saito K., Nishida K.M., Miyoshi K., Kawamura Y., Nagami T., Siomi H., Siomi M.C. A slicer-mediated mechanism for repeat-associated siRNA 5' end formation in Drosophila // Science. - 2007. - V.315; №5818.-P. 1587- 1590.

28.Havecker E.R., Gao X., Voytas D.F. The diversity of LTR retrotransposons // Genome Biol. - 2004. - V.5; №6. - P. 225.

29.Ho L.J., Hung L.F., Weng C.Y., Wu W.L., Chou P., Lin Y.L., Chang D.M., Tai T.Y., Lai J.H. Dengue virus type 2 antagonizes IFN-alpha but not IFN-gamma antiviral effect via down-regulating Tyk2-STAT signaling in the human dendritic cell // J Immunol. - 2005. - V. 174. - P. 8163 - 8172.

30.Huszar T., Imler J.L. Drosophila viruses and the study of antiviral host-defense // Adv Vims Res. - 2008. - V.72. - P. 227 - 265.

31.Ivanov D., Stone J.R., Maki J.L., Collins T., Wagner G. Mammalian SCAN domain dimer is a domain-swapped homolog of the HIV capsid C-terminal domain//Mol Cell.-2005. - V.17; №1.-P. 137- 143.

32.Jaenisch R. Germ line integration and Mendelian transmission of the exogenous Moloney leukemia virus. // Proc Natl Acad Sci USA. - 1976. -V.73; №4. - P. 1260- 1264.

33.Jaenisch R., Jahner D., Nobis P., Simon I., Lohler J., Harbers K., Grotkopp D. Chromosomal position and activation of retroviral genomes inserted into the germ line of mice // Cell. - 1981. - V.24; №2. - P. 519 - 529.

34.Jern P., Coffin J.M. Effects of retroviruses on host genome function // Annu Rev Genet. - 2008. - V.42. - P. 709 - 732.

35.Karst S.M., Wobus C.E., Lay M., Davidson J. Virgin H.W.4th. STAT1-dependent innate immunity to a Norwalk-like virus // Science . - 2003. - V. 299.-P. 1575- 1578.

36.Kim A., Terzian C., Santamaria P., Pelisson A., Prud'homm N., Bucheton A. Retroviruses in vertebrates: the gypsy retrotransposon is apparently an

infectious retrovirus of Drosophila melanogaster // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1994. - V.91. - P. 1285 - 1289.

37.Kozak C.A. Analysis of wild-derived mice for Fv-1 and Fv-2 murine leukemia virus restriction loci: a novel wild mouse Fv-1 allele responsible for lack of host range restriction // J Virol. - 1985. - V.55; №2. - P. 281 - 285.

38.Kurata S. Extracellular and intracellular pathogen recognition by Drosophila PGRP-LE and PGRP-LC // Int Immunol. - 2010. - V.22; №3. - P. 143 -148.

39.Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. - 1970. - V.227; №5259. - P. 680 - 685.

40.Lander E.S., Linton L.M., Birren B., Nusbaum C., Zody M.C., Baldwin J., Devon K., Dewar K., Doyle M., FitzHugh W., Funke R., Gage D., Harris K. Initial sequencing and analysis of the human genome // Nature. - 2001. -V.409; №6822. - P. 860 - 921.

41.LaRussa P. Pandemic novel 2009 H1N1 influenza: what have we learned? // Semin Respir Crit Care Med. - 2011. - V.32; №4. - P. 393 - 399.

42.Leblanc P., Desset S., Giorgi F., Taddei A.R., Fausto A.M., Mazzini M., Dastugue B., Vaury C. Life cycle of an endogenous retrovirus, ZAM, in Drosophila melanogaster // J Virol. - 2000. - V.74; №22. - P. 10658 -10669.

43.Lyford G.L., Yamagata K., Kaufmann W.E., Barnes C.A., Sanders L.K., Copeland N.G., Gilbert D.J., Jenkins N.A., Lanahan A.A., Worley P.F. Arc, a growth factor and activity-regulated gene, encodes a novel cytoskeleton-associated protein that is enriched in neuronal dendrites // Neuron. - 1995. -V.14; №2. - P. 433 -445.

44.Malik H.S., Henikoff S. Positive selection of Iris, a retroviral envelope-derived host gene in Drosophila melanogaster // PLoS Genet. - 2005. - V.l; №4. - P. e44.

45.Manktelow E., Shigemoto K., Brierley I. Characterization of the frameshift signal of Edr, a mammalian example of programmed -1 ribosomal frameshifting // Nucleic Acids Res. - 2005. - V.33; №5. - P. 1553 - 1563.

46.Marques J.T., Carthew R.W. A call to arms: coevolution of animal viruses and host innate immune responses // Trends Genet. - 2007. - V.23; №7. - P. 359-364.

47.Martin S.L. Nucleic acid chaperone properties of ORFlp from the non-LTR retrotransposon, LINE-1 // RNA Biol. - 2010. - V.7; №6. - P. 706 - 711.

48.Matsui T., Kinoshita-Ida Y., Hayashi-Kisumi F., Hata M., Matsubara K., Chiba M., Katahira-Tayama S., Morita K., Miyachi Y., Tsukita S. Mouse homologue of skin-specific retroviral-like aspartic protease involved in wrinkle formation // J Biol Chem. - 2006. - V.281; №37. - P. 27512 -27525.

49.Mevel-Ninio M., Pelisson A., Kinder J., Campos A.R., Bucheton A. The flamenco locus controls the gypsy and ZAM retroviruses and is required for Drosophila oogenesis // Genetics. - 2007. - V.175; №4. - P. 1615 - 1624.

50.Mi S., Lee X., Li X., Veldman G.M., Finnerty H., Racie L., LaVallie E., Tang X.Y., Edouard P., Howes S., Keith J.C Jr., McCoy J.M. Syncytin is a captive retroviral envelope protein involved in human placental morphogenesis // Nature. - 2000. - V.403; №6771. - P. 785 - 789.

51 .Ohshima K., Hattori M., Yada T., Gojobori T., Sakaki Y., Okada N. Whole-genome screening indicates a possible burst of formation of processed pseudogenes and Alu repeats by particular LI subfamilies in ancestral primates // Genome Biol. - 2003. - V.4; №11. - P. R74.

52.0no R., Nakamura K., Inoue K., Naruse M., Usami T., Wakisaka-Saito N., Hino T., Suzuki-Migishima R., Ogonuki N., Miki H., Kohda T., Ogura A., Yokoyama M., Kaneko-Ishino T., Ishino F. Deletion of PeglO, an imprinted

gene acquired from a retrotransposon, causes early embryonic lethality // Nat Genet. - 2006.-V.38;№1.-P. 101-106.

53.Pardue M.L., DeBaryshe P.G. Retrotransposons provide an evolutionarily robust non-telomerase mechanism to maintain telomeres // Annu Rev Genet. -2003.-V.37.-P. 485 -511.

54.Pattanayek R., Stubbs G. Structure of the U2 strain of tobacco mosaic virus refined at 3.5 A resolution using X-ray fiber diffraction // J Mol Biol. - 1992. - V.228; №2. - P. 516-528.

55.Pavlicek A., Gentles A.J., Paces J., Paces V., Jurka J. Retroposition of processed pseudogenes: the impact of RNA stability and translational control // Trends Genet. - 2006. - V.22; №2. - P. 69 - 73.

56.Pelisson A., Sarot E., Payen-Groschene G., Bucheton A. A novel repeat-associated small interfering RNA-mediated silencing pathway downregulates complementary sense gypsy transcripts in somatic cells of the Drosophila ovary//J Virol.-2007.-V. 81; №4.-P. 1951 - 1960.

57.Ponicsan S.L., Kugel J.F., Goodrich J.A. Genomic gems: SINE RNAs regulate mRNA production // Curr Opin Genet Dev. - 2010. - V.20; №2. -P. 149- 155.

58.Prud'homme N, Gans M, Masson M, Terzian C, Bucheton A. Flamenco, a gene controlling the gypsy retrovirus of Drosophila melanogaster. Genetics. 1995. V. 139. N2. P. 697-711.

59.Robert V., Prud'homme N., Kim A., Bucheton A., Pelisson A. Characterization of the flamenco region of the Drosophila melanogaster Genome // Genetics. 2001. V. 158. P. 701-713.

60.Romanish M.T., Cohen C.J., Mager D.L. Potential mechanisms of endogenous retroviral-mediated genomic instability in human cancer // Semin Cancer Biol. - 2010. - V.20; №4. - P. 246 - 253.

61.Sabin L.R., Hanna S.L., Cherry S. Innate antiviral immunity in Drosophila // Curr Opin Immunol. - 2010. - V.22; №1. - P. 4 - 9.

62.Sambrook J., MacCallum P., Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition) // Cold Spring Harbor Laboratory Press. - 2011. -2344 p.

63.Schwartzberg P.L. The many faces of Src: multiple functions of a prototypical tyrosine kinase // Oncogene. - 1998. - V.17; №11. - P. 1463 -1468.

64.Seitz H., Youngson N., Lin S.P., Dalbert S., Paulsen M., Bachellerie J.P., Ferguson-Smith A.C., Cavaille J. Imprinted microRNA genes transcribed antisense to a reciprocally imprinted retrotransposon-like gene // Nat Genet. - 2003. - V.34; №3. - P. 261 - 262.

65.Silverman N., Zhou R., Erlich R.L., Hunter M., Bernstein E., Schneider D., Maniatis T. Immune activation of NF-kappaB and JNK requires Drosophila TAK1 // J Biol Chem. - 2003. - V.278; №49. - P. 48928 - 48934.

66.Song S.U., Gerasimova T., Kurkulos M., Boeke J.D., Corces V.G. An env-like protein encoded by a Drosophila retroelement: evidence that gypsy is an infectious retrovirus // Genes Dev. - 1994. - V.8; №17. - P. 2046 - 2057.

67.Stehelin D., Varmus H.E., Bishop J.M., Vogt P.K. DNA related to the transforming gene(s) of avian sarcoma viruses is present in normal avian DNA//Nature.- 1976.-V.260; №5547.-P. 170- 173.

68.Stoye J.P. Fvl, the mouse retrovirus resistance gene // Rev Sci Tech. - 1998. -V.17; №1.-P. 269-277.

69.Stoye J.P., Coffin J.M. A provirus put to work // Nature. - 2000. - V.403; №6771.-P. 715-717.

70.Tan K.O., Tan K.M., Chan S.L., Yee K.S., Bevort M., Ang K.C., Yu V.C. MAP-1, a novel proapoptotic protein containing a BH3-like motif that associates with Bax through its Bcl-2 homology domains // J Biol Chem. -2001. - V.276; №4. - P. 2802 - 2807.

71.Teysset L., Burns J.C., Shike H., Sullivan B.L., Bucheton A., Terzian C. A Moloney murine leukemia virus-based retroviral vector pseudotyped by the insect retroviral gypsy envelope can infect Drosophila cells // J Virol. - 1998.

- V.72; №1. - P. 853 - 856.

72.Valanne S., Wang J.H., Ramet M. The Drosophila Toll signaling pathway // J Immunol. - 2011. - V. 186; №2. - P. 649 - 656.

73.Vitullo P., Sciamanna I., Baiocchi M., Sinibaldi-Vallebona P., Spadafora C. LINE-1 retrotransposon copies are amplified during murine early embryo development // Mol Reprod Dev. - 2012. - V.79; №2. - P. 118 - 127.

74.Volff J.N. Cellular genes derived from Gypsy/Ty3 retrotransposons in mammalian genomes // Ann N Y Acad Sci. - 2009. V.l 178. - P. 233 - 243.

75.Volff J.N. Turning junk into gold: domestication of transposable elements and the creation of new genes in eukaryotes // Bioessays. - 2006. - V.28; №9.-P. 913 -922.

76.Wills N.M., Moore B., Hammer A., Gesteland R.F., Atkins J.F. A functional -1 ribosomal frameshift signal in the human paraneoplastic Ma3 gene // J Biol Chem. - 2006. - V.281; №11. - p. 7082 - 7088.

77.Xu G., Solaiman F., Zink M.A., Hodgson C.P. Fusogenic effects of murine retroviruses and cationic enhancers of transduction // Cancer Gene Ther. -2000. - V.7; №1. - P. 53 -58.

78.Yan Y., Buckler-White A., Wollenberg K., Kozak C.A. Origin, antiviral function and evidence for positive selection of the gammaretrovirus restriction gene Fvl in the genus Mus // Proc Natl Acad Sci USA. - 2009. -V.l06; №9. - P. 3259-3263.

79.Zambon R.A., Nandakumar M., Vakharia V.N., Wu L.P. The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila // Proc Natl Acad Sci USA.

- 2005. - V.l02; №20. - P. 7257 - 7262.

80.Buchon N., Broderick N.A., Poidevin M., Pradervand S., Lemaitre B. Drosophila intestinal response to bacterial infection: activation of host defense and stem cell proliferation // Cell Host Microbe. - 2009. - V.5; №2. -P. 200-211.

81.Charroux B., Royet J. Drosophila immune response: From systemic antimicrobial peptide production in fat body cells to local defense in the intestinal tract // Fly (Austin). - 2010. - V.4; №1. - P. 40 - 47.

82.Miller W.J., McDonald J.F., Pinsker W. Molecular domestication of mobile elements // Genetica. - 1997. - V. 100; №1 - 3. - P. 261 - 270.

83.Rowe H.M., Trono D. Dynamic control of endogenous retroviruses during development // Virology. - 2011. - V.411; №2. - P. 273 - 287.

Благодарности

Выражаю искреннюю благодарность научному руководителю профессору Александру Иннокентьевичу Киму, доценту Лидии Николаевне Нефедовой, доценту Наталии Ивановне Романовой, старшему научному сотруднику Андрею Александровичу Мартьянову, ведущему научному сотруднику Елене Николаевне Богачёвой, аспиранту Феликсу Анатольевичу Урусову.