Комплексное исследование метилотипов злокачественных новообразований: фундаментальные и прикладные аспекты тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, доктор биологических наук Стрельников, Владимир Викторович

• Стрельников, Владимир Викторович
• доктор биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации доктор биологических наук Стрельников, Владимир Викторович

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Основные направления молекулярно-генетическнх исследований в онкологии.

1.1.2. Хронология изучения соматических мутаций геномов злокачественных новообразований: технологии и достижения.

1.1.2. Каталоги соматических мутаций геномов злокачественных новообразований.

1.1.3. Часы молекулярной эволюции опухолей.

1.1.4. Молекулярно-генетические изменения в тканях, окружающих опухоль. Теория полей канцеризации и её клинические приложения.

1.1.5. Низкоинвазивная пресимптоматическая молекулярная диагностика рака на материале периферической крови и других биологических жидкостей.

1.1.6. Роль биологических микрочипов в изучении и диагностике злокачественных новообразований.

1.2. Аномальное метилирование ДНК и другие эпигенетические маркеры канцерогенеза.

1.2.1. Аномальное метилирование генов, вовлеченных в канцерогенез.

1.2.2. Методы изучения эпигенетической патологии при канцерогенезе.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Клинический материал.

2.2. Забор крови, операционного и биопсийного материала.

2.3. Выделение геномной ДНК.

IМЧФП. ндонуклеазами рестрикции. гаьная полимеразная цепная реакция (МЧ-ПЦР югатых праймеров. ашивание нитратом серебра. рагментов СрО-островков и определение стельности. гаьная ПЦР со специфическими праймерами. гское секвенирование.

IАИМС. геномов.У о

3.1.1. Метилчувствительный фингерпринтинг (МЧФП).

3.1.2. Современный алгоритм непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов. Технология AFLOAT.

3.2. Локус-специфический анализ дифференциального метилирования геномов.

3.2.1. Методы, основанные на применении метилчувствительных рестриктаз.

3.2.2. Характеристика частот метилирования отдельных локусов генома, выявленных методами непредвзятого скрининга.

3.2.3. Методология анализа бисульфит-конвертированной ДНК.

3.2.4. Детальные карты дифференциально метилированных участков генома человека.

3.3. Предвзятый подход к выявлению новых маркеров канцерогенеза, основанных на аномальном метилировании ДНК.

3.3.1. Отбор кандидатных локусов для поиска дифференциального метилирования ДНК на основе функций известных генов.

3.3.2. Поиск кандидатных локусов для анализа дифференциального метилирования в областях потери гетерозиготности, характерных для отдельных типов опухолей.

3.4. Отбор кандидатных локусов для поиска дифференциального метилирования ДНК на основе локальных характеристик хроматина. Синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов.

3.5. Изучение эпигенетической патологии семейства генов ламининов на основе синтетического подхода к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Комплексное исследование метилотипов злокачественных новообразований: фундаментальные и прикладные аспекты»

Актуальность проблемы.

Значительная часть современных представлений о злокачественных новообразованиях основывается на предположении о том, что они развиваются в результате выхода клеток из-под контроля механизмов регуляции роста, деления и дифференцировки вследствие накопления соматических мутаций (Hanahan D., Weinberg R.A., 2000; Stratton M.R. et al., 2009). Наличие соматических мутаций, в число которых входят как структурные повреждения (нуклеотидные замены, небольшие инсерции и делеции, хромосомные перестройки, численные аномалии), так и эпигенетические нарушения, - неотъемлемое свойство геномов всех клеток злокачественных новообразований (Pleasance E.D. et al., 2010).

Новейшие технологии полногеномного анализа ДНК позволяют определять практически все классы структурных соматических изменений на всем протяжении генома (Mardis E.R. et al., 2009; Beroukhim R. et al., 2010). Полногеномный анализ структурных изменений, основанный на методах секвенирования нового поколения, обеспечивает получение результатов с точностью до одного нуклеотида. Фактически дальнейшее развитие этой области исследования соматических мутаций в ближайшее время будет сводиться к совершенствованию существующих технологий (Ding L. et al., 2010; Lee W. et al., 2010).

К полногеномному анализу метилирования ДНК методы секвенирования нового поколения на сегодняшний день применимы в очень незначительной степени, что объясняется в первую очередь сниженной информативностью последовательностей бисульфит-модифицированной ДНК, используемой в качестве матрицы для секвенирования (Stratton M.R. et al., 2009). Неметилированные участки ДНК после бисульфитной конверсии представляют собой последовательности из трех нуклеотидов, что значительно осложняет выравнивание фрагментов при формировании контигов; кроме того, прямые и обратные прочтения конвертированной ДНК не являются обратно комплементарными (Tost J., Gut I.G., 2007; Xi Y., Li W., 2009; Huss M. 2010). Таким образом, достоверная информация о характере метилирования ДНК с однонуклеотидным разрешением на сегодняшний день может быть получена только с использованием традиционных методов локус-специфического анализа, осуществление которого требует формирования принципов отбора кандидатных геномных локусов.

При разработке стратегии отбора кандидатных локусов для детальной характеристики метилирования следует принять во внимание все существующие возможности скрининга характеристик эпигеномов. Подходы к таким исследованиям не универсальны. Одни из них обеспечивают анализ с полногеномным покрытием, но низким разрешением; другие, при высоком разрешении, позволяют анализировать ограниченные выборки участков генома.

К первой группе относятся методы, основанные либо на аффинном обогащении фрагментированной ДНК фракциями с определенными эпигенетическими характеристиками, либо на обработке препаратов ДНК различными типами нуклеаз. Таким образом можно проанализировать не только метилирование ДНК (Weber M. et al., 2005), но и химические модификации хроматина - гистоновые метки НЗК4Ме1, НЗК27Ас, НЗК4МеЗ (Heintzman N. D. et al., 2009), области доступного хроматина (Crawford G.E. et al., 2006; Boyle A.P. et al., 2008), плотность нуклеосомной упаковки (Dennis J.H. et al., 2007). Надежно определяя эпигенетические изменения на полногеномном уровне, указанные методы страдают низкой прецизионностью: исследуемые параметры характеризуются с разрешением около 100-200 нуклеотидных пар (Huebert D.J. et al., 2006; Crawford G.E. et al., 2006; Johnson D.S. et al., 2008; Serre D. et al., 2009).

Вторая группа подходов подразумевает скрининг дифференциального метилирования ограниченных выборок геномных локусов. В этой группе наиболее известны методы метилчувствителыюго рестрикционно-ориентированного геномного сканирования (Rush L.J. et al., 2001; Costello J.F. et al., 2009), метилчувствителыюго репрезентативно-дифференциального анализа (Ushijima T. et al., 1997), метилчувствительного фингерпринтинга (Gonzalgo M.L. et al., 1997), амплификации интерметилированных сайтов (Frigola J. et al., 2002). Огромным преимуществом перечисленных методов является непредвзятость скрининга, под которой понимается определение дифференциального метилирования заранее неизвестных локусов генома с последующей идентификацией их нуклеотидных последовательностей (Fraga M.F., Esteller M., 2002). Непредвзятый скрининг расширяет фундаментальные представления о роли метилирования ДНК в норме и при патологии, и способствует диверсификации основ разработки эпигенетических диагностических маркеров. Непредвзятость скрининга -краеугольный камень объективной оценки состояния изучаемых метиломов (Schumacher A. et al., 2006, Gebhard et al., 2006). В то же время оптимального метода непредвзятого скрининга дифференциального метилирования на сегодняшний день не существует (Воск, С., 2009). Указанные методы, разработанные более 10 лет назад, так и не нашли широкого применения. Требуется формирование принципиально новой концепции, учитывающей современный уровень генетических знаний и использующей преимущества завершения проекта по секвенированию генома человека.

Сопоставление результатов исследования полногеномного и локального метилирования ДНК и ряда характеристик хроматина в пределах хромосомных участков должно привести к формированию синтетического подхода к изучению метиломов злокачественных новообразований, который будет полезен как с точки зрения изучения фундаментальных основ эпигенетической регуляции при канцерогенезе, так и с точки зрения разработки молекулярно-генетических клинических диагностических маркеров. Применительно к фундаментальным и прикладным аспектам онкогеномики требуется разработка методологии анализа эпигеномов злокачественных новообразований на основе синтеза современных методов молекулярной генетики, медицинской биотехнологии, математического моделирования и биоинформатики.

Цель исследования. Разработать оригинальную методологию скрининга дифференциального метилирования геномов и применить её к изучению фундаментальных характеристик метиломов злокачественных новообразований.

Задачи исследования:

1. Разработать оригинальную методологию непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов на основе синтеза современных методов молекулярной генетики, математического моделирования и биоинформатики.

2. Охарактеризовать состав репрезентаций генома, генерируемых разработанными методами скрининга районов дифференциального метилирования геномов.

3. Идентифицировать новые гены и локусы, вовлеченные в канцерогенез и подверженные аномальной эпигенетической регуляции при раке.

4. Провести анализ молекулярной патологии наиболее перспективного гена-кандидата на роль супрессора опухолевого роста из набора новых генов, выявленных в процессе исследования.

5. Идентифицировать константно метилированные участки генома человека, которые могут служить основой для обоснованного дизайна контролей эффективности метилчувствительной ПЦР.

6. Охарактеризовать локальные параметры хроматина, определяющие состояние метилирования участков ДНК в норме и при канцерогенезе.

7. Сформировать синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов, вовлеченных в канцерогенез, на основе локальных характеристик генома в норме и при злокачественной трансформации.

8. Используя разработанный способ предсказания статуса метилирования участков генов, вовлеченных в канцерогенез, провести исследование эпигенетической патологии всех генов, кодирующих семейство белков, непосредственно вовлеченных в процессы канцерогенеза (12 генов субъединиц ламининов).

Научная новизна.

Разработана оригинальная методология непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов AFLOAT (анализ, ориентированный на длину амплифицируемых фрагментов). Предложены принципиальные модификации методов поиска дифференциального метилирования - метилчувствительного фингерпринтинга и амплификации интерметилированных сайтов (АИМС). Охарактеризован состав репрезентаций генома, генерируемых методами метилчувствительного фингерпринтинга и АИМС. Выявлено 26 новых локусов, дифференциально метилированных в опухолях, условно нормальных тканях молочной железы, пограничных с опухолью, и аутопсийном материале молочной железы. Из них 22 принадлежат генам LAMBI, RAI1, KCNH8, DOCK6, GPC2, SH3KBP1, PPP2R5C, PHF1, ATMIN, C2CD2, KIAA1324L, IQSEC2, АХ746725/АК127124, ТМЕМ176А/ТМЕМ176В, FOXM1/HKMT1188, LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BINl, KCNH2, CACNG4 и PSMF1. Четыре дифференциально метилированных района расположены в межгенных областях на хромосомах 1рЗЗ, 5р15.33, 12ql3.13 и 13q32.1.

Проведена оценка частот аномального метилирования указанных локусов. Особенности метилирования выявленных областей охарактеризованы впервые.

Анализ молекулярной патологии гена SEMA6B, аномальное метилирование которого при раке молочной железы впервые показано в настоящем исследовании, продемонстрировал наличие повреждений гена (метилирование, потеря гетерозиготности) в 75% образцов рака молочной железы (РМЖ). Впервые выявлена терминальная мутация SEMA6B у пациентки с РМЖ. Полученные результаты свидетельствуют о том, что SEMA6B - один из наиболее реальных генов-кандидатов на роль супрессора опухолевого роста в области 19р13.3.

Скрининг метилирования ДНК из образцов рака молочной железы, светлоклеточного рака почки, рака мочевого пузыря, прилежащих условно нормальных тканей, аутопсийного материала молочной железы, лимфоцитов периферической крови и буккального эпителия здоровых доноров впервые выявил константно метилированные участки генома человека, принадлежащие CpG-островку гена CUX1 в составе альтернативного 3'-концевого экзона, первым экзонам генов LAMA3A, LAMB3, LAMC3, интронным областям генов MAD1L1, TAF4 и З'-CpG-островку гена ZBTB4.

Впервые проведено исследование эпигенетической патологии всех генов, кодирующих семейство белков, непосредственно вовлеченных в процессы канцерогенеза (12 генов цепей ламининов). Шесть из них демонстрируют неметилированное состояние в нормальных тканях и аномальное метилирование при РМЖ, с частотами, составившими для генов LAMA1 - 36%, LAMA2 - 38%, LAMA3B - 6%, LAMA4 - 2%, LAMBI -16%, LAMC3 - 8%. Промотор гена LAMC2 показал дифференциальное метилирование в зависимости от тканевого происхождения образцов: в буккальном эпителии и лимфоцитах периферической крови метилирование отсутствует, в то время как образцы ДНК из нормальных и опухолевых тканей молочной железы метилированы в 100% случаев. Константное метилирование предсказано и подтверждено для промоторных областей двух генов субъединиц ламининов - LAMA3A и LAMB3.

Впервые проведенный прицельный анализ состояния метилирования участков ДНК в норме и при канцерогенезе в зависимости от локальных характеристик хроматина показал совместное расположение константно метилированных участков с плотной упаковкой нуклеосом при закрытом хроматине, константно неметилированных участков - с низкой плотностью упаковки нуклеосом при закрытом хроматине, и дифференциально метилированных участков - с областями открытого хроматина при любой плотности нуклеосомной упаковки. *

Практическая значимость.

Разработанные системы скрининга дифференциального метилирования геномов высоко воспроизводимы, подробно охарактеризованы и могут быть использованы в дальнейшем в работах по характеристике эпигенетических нарушений, ассоциированных с социально значимыми заболеваниями. Решена основная проблема непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов -определение геномной принадлежности дифференциально метилированных локусов. Благодаря созданию новой технологии анализа, ориентированного на длину амплифицируемых фрагментов, AFLOAT, из процедуры определения геномной принадлежности локусов полностью исключается многоэтапный блок лабораторного анализа - выделение фрагментов ДНК из гелей, их реамплификация, клонирование, экстракция плазмидной ДНК и секвенирование. Предложенные методы скрининга обеспечивают высокую воспроизводимость результатов, снижение токсичности, себестоимости и трудоемкости исследований, расширение возможностей визуального контроля на каждом этапе эксперимента. По результатам характеристики состава репрезентаций генома, генерируемых методами метилчувствительного фингерпринтинга и АИМС, предложены схемы экспериментов, обеспечивающие высокое содержание Срв-островков в составе репрезентаций дифференциально метилированных участков, что обеспечивает базу для эффективного выявления новых генов и локусов, вовлеченных в канцерогенез и подверженных аномальной эпигенетической регуляции при раке. Выявленные константно метилированные участки генома человека обеспечивают проведение обоснованного дизайна контролей эффективности метилчувствительной ПЦР. Результаты проведенного анализа геномных локусов и сформированный синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов с учетом локальных характеристик хроматина представляют собой базу для разработки диагностических систем эпигенетических маркеров. Разработанные алгоритмы, методы и компьютерные программы оформлены в виде рекламно-технических описаний и описания новой медицинской ДНК-технологии, прошедших государственную регистрацию. Зарегистрирована заявка на патент «Способ формирования панелей маркеров метилирования ДНК».

Апробация работы.

Материалы исследования были доложены на конференции ГНТП "Геном человека" в 2000 г., ежегодных конференциях Европейского общества генетики человека в 2002, 2004, 2005, 2006 (диплом и премия), 2007, 2008 и 2009 гг., научно-практическом симпозиуме "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении" в 2002 г., 97-й ежегодной конференции Американского общества изучения рака (Вашингтон, 2006; премия), V и VI Международных конференциях «Молекулярная медицина и биобезопасность» (г. Москва) в 2008 и 2009 гг., V и VI съездах Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2009 и Ростов-на-Дону, 2010), V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (г. Москва) в 2008 г., V и VI Московских международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» в 2009 и 2011 гг., 6-м симпозиуме "Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний" (г. Москва) в 2009 г., конференции молодых ученых, посвященной 40-летию МГНЦ РАМН (г. Москва) в 2009 г., Всемирном эпигенетическом конгрессе (г. Берлин) в 2009 г., 11-й и 12-й Европейских конференциях по цитогенетике и молекулярной генетике солидных опухолей (г. Бильбао, 2008 и г. Неймеген, 2010).

Разработанные алгоритмы, новые медицинские технологии и компьютерные программы были использованы при выполнении научно-исследовательских работ по гранту РФФИ № 08-04-01685 «Общие закономерности структурно-функциональной организации эпигеномов клеток рака молочной железы», по государственному контракту № 8/3-655н-08 от 31 декабря 2009 «Поиск и характеристика новых молекулярных маркеров для ранней диагностики, прогноза течения, мониторинга эффективности лечения рака мочевого пузыря», по государственному контракту № 8/3-657н-08 от 31 декабря 2009 «Поиск и характеристика новых молекулярных маркеров для ранней диагностики, прогноза течения, мониторинга эффективности лечения рака почки», по государственному контракту № 02.740.11.0089 от 15 июня 2009 в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы по теме «Разработка новых диагностических технологий на основе механизмов эпигенетической регуляции», по гранту Earlier Breast Cancer Test Foundation "Development and validation of a differential methylation screening technology applicable for the identification of early breast cancer diagnostic markers" (2007-2010 гг.).

Положения, выносимые на защиту.

1. Разработаны алгоритмы, протоколы и компьютерные программы для проведения метилчувствительного фингерпринтинга и анализа, ориентированного на длину амплифицируемых фрагментов (AFLOAT), обеспечивающие повышение воспроизводимости результатов, снижение себестоимости и трудоемкости исследований, расширение возможностей визуального контроля на каждом этапе эксперимента.

2. Разработаны оригинальные подходы к картированию дифференциально метилированных локусов, решающие основную проблему непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов - определение геномной принадлежности выявляемых фрагментов ДНК.

3. Охарактеризован состав репрезентаций генома, генерируемых методами метилчувствительного фингерпринтинга и AFLOAT. Предложены схемы экспериментов, обеспечивающие высокое содержание CpG-островков в составе репрезентаций дифференциально метилированных участков.

4. Оригинальные методы непредвзятого скрининга позволяют идентифицировать дифференциально метилированные локусы геномов независимо от их расположения относительно кодирующих областей, промоторов и сайтов инициации транскрипции, что подтверждает непредвзятый характер скрининга.

5. Анализ молекулярной патологии гена SEMA6B, аномальное метилирование которого при раке молочной железы впервые показано в настоящем исследовании, свидетельствует о том, что это один из наиболее реальных генов-кандидатов на роль супрессора опухолевого роста в области хромосомы 19р13.3.

6. Выявлены константно метилированные участки генома человека, предоставляющие базу для обоснованного дизайна контролей эффективности метилчувствительной ПЦР.

7. Предложена гипотеза, связывающая локальные характеристики хроматина и состояние метилирования участков ДНК в норме и при канцерогенезе. На её основе разработан синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов, вовлеченных в канцерогенез.

8. Показан высокий предиктивный потенциал разработанной системы отбора для анализа метилирования кандидатных участков генов, на примере исследования эпигенетической патологии семейства генов ламининов.

Личный вклад автора.

Автором разработаны план исследования и основы методологии анализа метилирования ДНК, изложенные в работе, предложены ключевые модификации методов и протоколов скрининга метилирования ДНК (90%). Постановка и апробация всех новых методов проведены автором лично. Осуществлен дизайн 100 из 112 олигонуклеотидных праймеров для проведения ПЦР (90%). Выделение образцов ДНК и практическое исследование метилотипов различных типов злокачественных новообразований проведено совместно с коллегами из лаборатории эпигенетики ФГБУ «МГНЦ» РАМН. Проведен анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК, полученных в результате скрининга дифференциального метилирования, с использованием компьютерных программ и доступных баз данных метилирования ДНК, сформированы детальные карты метилирования соответствующих геномных локусов (100%). Охарактеризованы локальные параметры хроматина, определяющие состояние метилирования участков ДНК в норме и при канцерогенезе (100%). Сформирован синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов, вовлеченных в канцерогенез, на основе локальных характеристик генома в норме и при злокачественной трансформации.

Публикации.

По теме диссертационного исследования опубликовано 66 печатных работ, в том числе 21 статья в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук, 8 глав в учебниках, 3 статьи в сборниках и коллективных монографиях, 28 тезисов, зарегистрированы 2 новые медицинские ДНК-технологии, 3 рекламно-технических описания компьютерных программ, 1 заявка на получение патента.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Стрельников, Владимир Викторович

выводы.

1. Разработанные в настоящем исследовании алгоритмы, протоколы и компьютерные программы для проведения метилчувствительного фингерпринтинга и анализа, ориентированного на длину амплифицируемых фрагментов (AFLOAT), эффективно решают основную проблему непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов - определение геномной принадлежности дифференциально метилированных локусов. Предложенные методы скрининга обеспечивают высокую воспроизводимость результатов, снижение себестоимости и трудоемкости исследований, расширение возможностей визуального контроля на каждом этапе эксперимента.

2. Методами анализа in vitro и in silico охарактеризован состав репрезентаций генома, генерируемых методами метилчувствительного фингерпринтинга и AFLOAT. Предложенные схемы экспериментов обеспечивают высокое содержание CpG-островков в составе репрезентаций дифференциально метилированных участков, что создает базу для эффективного выявления новых генов и локусов, вовлеченных в канцерогенез и подверженных аномальной эпигенетической регуляции при раке.

3. Разработанные методы непредвзятого скрининга позволяют идентифицировать дифференциально метилированные локусы геномов независимо от их расположения относительно кодирующих областей, промоторов и сайтов инициации транскрипции. Среди выявленных в работе 26 новых локусов, аномально метилированных при раке молочной железы, 15% являются межгенными (области хромосом 1рЗЗ, 5р15.33, 12ql3.13 и 13q32.1), 19% - интронными (гены BIN1, RAI1, GPC2, PPP2R5C, PHF1), 8% расположены в первых экзонах (гены ATMIN, IQSEC2). Лишь около половины, (56%, гены LAMBI, KCNH8, DOCK6, SH3KBP1, C2CD2, KIAA1324L, АХ746725/АК127124, ТМЕМ176А/ТМЕМ176В, FOXM1/HKMT1188, LAMC3, SEMA6B, VCIP135,

КСЫН2, САСЫС4 и РБМП) полученных фрагментов имеют локализацию, каноническую для дифференциального метилирования при канцерогенезе, что подтверждает непредвзятый характер скрининга.

4. Анализ молекулярной патологии гена БЕМА6В, аномальное метилирование которого при раке молочной железы впервые показано в настоящем исследовании, продемонстрировал наличие повреждений гена (метилирование, потеря гетерозиготности) в 75% образцов РМЖ. Впервые выявлена терминальная мутация БЕМАбВ у пациентки с РМЖ. Полученные результаты свидетельствуют о том, что БЕМА6В - один из наиболее реальных генов-кандидатов на роль супрессора опухолевого роста в области хромосомы 19р13.3.

5. Скрининг метилирования ДНК из образцов рака молочной железы, светлоклеточного рака почки, рака мочевого пузыря, прилежащих условно нормальных тканей, аутопсийного материала молочной железы, лимфоцитов периферической крови и буккального эпителия здоровых доноров выявил константно метилированные участки генома человека, принадлежащие Срв-островку гена С11Х1 в составе альтернативного 3'-концевого экзона, первым экзонам генов ЬАМАЗА, ЬАМВЗ, ЬАМСЗ, интронным областям генов МАЭ1Ы, ПИ А и З'-СрО-островку гена 2ВТВ4. Полученные результаты впервые предоставили базу для обоснованного дизайна контролей эффективности метилчувствительной ПЦР.

6. Анализ состояния метилирования участков ДНК в норме и при канцерогенезе в зависимости от локальных характеристик хроматина показал совместное расположение константно метилированных участков с плотной упаковкой нуклеосом при закрытом хроматине, константно неметилированных участков - с низкой плотностью упаковки нуклеосом при закрытом хроматине, и дифференциально метилированных участков -с областями открытого хроматина при любой плотности нуклеосомной упаковки. Это позволило разработать синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов, вовлеченных в канцерогенез.

7. Использование разработанной в ходе исследования методологии локус-специфического анализа метилирования для изучения эпигенетической патологии семейства генов ламининов подтвердило предсказанное дифференциальное метилирование 70% промоторных областей этих генов при РМЖ. Шесть промоторных областей демонстрируют неметилированное состояние в нормальных тканях и аномальное метилирование при РМЖ, с частотами, составившими для генов LAMA1 - 36%, LAMA2 - 38%, LAMA3B - 6%, LAMA4 - 2%, LAMBI -16%, LAMC3 - 8%>. Промотор гена LAMC2 показал дифференциальное метилирование в зависимости от тканевого происхождения образцов: в буккальном эпителии и лимфоцитах периферической крови метилирование отсутствует, в то время образцы ДНК из нормальных и опухолевых тканей молочной железы метилированы в 100% случаев. Константное метилирование предсказано и подтверждено для промоторных областей генов субъединиц ламининов LAMA3A и LAMB3. Полученные результаты говорят о высоком предиктивном потенциале разработанного синтетического подхода к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов, вовлеченных в канцерогенез.

8. Разработана новая универсальная стратегия и оригинальная методическая база анализа эпигеномов в норме и при патологии для поиска и характеристики функциональных нарушений (аномальное метилирование генов и геномных локусов), вызывающих различные заболевания у человека. На значительном экспериментальном материале (более 1000 образцов операционного материала рака молочной железы, рака мочевого пузыря, светлоклеточного рака почки и прилежащих тканей, немелкоклеточного рака легких, острого лимфобластного лейкоза, аутопсийного материала молочной железы, буккального эпителия и лимфоцитов периферической крови здоровых доноров) показана эффективность разработанных подходов, охарактеризованы новые гены и районы, вовлеченные в процесс канцерогенеза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Значительная часть современных представлений о злокачественных новообразованиях вращается вокруг центрального принципа, согласно которому рак развивается в результате выхода клеток из-под контроля механизмов регуляции роста, деления и дифференцировки вследствие накопления соматических мутаций. Наличие соматических мутаций, в число которых входят нуклеотидные замены, небольшие инсерции и делеции, хромосомные перестройки, численные аномалии, эпигенетические нарушения, - неотъемлемое свойство геномов всех клеток злокачественных новообразований.

Новейшие технологии полногеномного анализа ДНК позволяют определять практически все классы структурных соматических изменений (нуклеотидные замены, инсерции/делеции, хромосомные перестройки, нарушения копийности ДНК) на всем протяжении генома (экзоны, интроны, межгенные области). Результаты полногеномного анализа структурных изменений, основанного на секвенировании ДНК, характеризуются разрешением, близким однонуклеотидному. Фактически дальнейшее развитие этой области исследования соматических мутаций в ближайшее время будет сводиться к совершенствованию существующих технологий.

К полногеномному анализу метилирования ДНК методы секвенирования нового поколения на сегодняшний день применимы в очень незначительной степени, что в объясняется в первую очередь сниженной информативностью последовательностей бисульфит-модифицированной ДНК, используемой в качестве матрицы для секвенирования. Неметилированные участки ДНК после бисульфитной конверсии представляют собой последовательности из трех нуклеотидов, что значительно осложняет выравнивание фрагментов при формировании контигов.

Оценка интенсивности метилирования ДНК в масштабах генома с использованием иммунопреципитации характеризуется разрешением в 100 нуклеотидных пар, вследствие чего может использоваться лишь как метод первичного скрининга дифференциального метилирования, предваряющий детальные локус-ориентированные исследования. К эпигенетическим изменениям, которые также достаточно надежно, но с низкой прецизионностью диагностируются на полногеномном уровне, относятся химические модификации хроматина (гистоновые метки) -НЗК4Ме1, НЗК27Ас, НЗК4МеЗ; области доступного хроматина, определяемые ДНКазным тестом; открытые сайты связывания транскрипционных факторов по результатам хроматин-иммунопреципитации (СЫР); плотность нуклеосомной упаковки по результатам обработки нуклеазой микрококков. Перечисленные параметры хроматина определяются с разрешением около 200 нуклеотидных пар.

Информация, полезная как с точки зрения изучения фундаментальных основ эпигенетической регуляции при канцерогенезе, так и с точки зрения разработки молекулярно-генетических клинических диагностических маркеров, может быть получена при сопоставлении результатов исследования полногеномного и локального метилирования ДНК и ряда характеристик хроматина в пределах хромосомных участков. Применительно к фундаментальным и прикладным аспектам онкогеномики такой подход требует разработки методологии анализа эпигеномов злокачественных новообразований на основе синтеза современных методов медицинской биотехнологии, математического моделирования и биоинформатики.

Метилирование ДНК, не нарушая структуры генов, предоставляет информацию о том, где и когда должны экспрессироваться конкретные гены. Присоединение метальной группы к молекуле цитозина катализируется ферментами семейства ДНК-метилтрансфераз и происходит только на пострепликативной стадии, поскольку молекулы 5-метилцитозина в свободном виде в клетке отсутствуют. За редким исключением метилированию подвергаются только молекулы цитозина в составе Срв-динуклеотидов. Рассеянные СрО-динуклеотиды в норме метилированы, в то время как в Срв-обогащенных участках, часто в промоторных областях генов, метилирование, как правило, отсутствует. Метилирование таких областей (Срв-островков) коррелирует со снижением транскрипционной активности генов.

Исследования профилей метилирования Срв-островков показали, что не все они неметилированы в нормальных клетках. Такое дифференциальное метилирование объясняют, в частности, вовлечением метилирования в тканеспецифическую регуляцию экспрессии генов. Обширные исследования дифференциального метилирования и патологических последствий аномального метилирования ДНК проводятся в рамках онкогеномики. В отличие от нормальных, опухолевые клетки часто демонстрируют общее гипометилирование генома, сопровождающееся гиперметилированием Срв-островков генов-супрессоров опухолевого роста и потерей геномного импринтинга. Свойство паттернов метилирования ДНК сохраняться (наследоваться) в ряду клеточных делений потенцирует формирование опухолеспецифичных метилотипов, и создает предпосылки для разработки надежных средств молекулярной диагностики рака.

Аномальное метилирование Срв-островков генов-супрессоров опухолевого роста, приводящее к их инактивации, является одним из наиболее значимых механизмов канцерогенеза и может выступать как одно из событий в двухударной модели Кнадсена. В то же время, любые изменения метилирования, ассоциированные с онкологическим процессом, представляют диагностическую ценность, независимо от их влияния на экспрессию генов, поэтому при разработке новых эпигенетических онкомаркеров должны рассматриваться все варианты метилирования Срв-островков генов, вовлеченных в канцерогенез. Например, было показано, что только метилирование небольшой области промоторного Срв-островка СОКЫ2А приводит к подавлению экспрессии гена. Метилирование же других участков этого СрС-островка, который захватывает весь первый экзон гена, не влияет на эффективность транскрипции. В то же время, именно метилирование первого экзона СОКЫ2А наблюдается при раке молочной железы значительно чаще, чем метилирование промотора и, вероятно, может служить более информативным диагностическим маркером. Метилирование Срв-островков непромоторной локализации также может быть ассоциировано с опухолевой трансформацией. Например, метилирование непромоторных З'-нетранслируемых и внутригенных Срв-островков ассоциировано с гиперэкспрессией или эктопической экспрессией генов РАХ6 и СОКША.

Всплеск интереса к изучению эпигенетической регуляции функционирования геномов стимулировал разработку десятков методов, позволяющих оценивать метилирование как тотальной ДНК, так и отдельных её участков. Эти методы можно разделить на группы на основании характера получаемой информации: первая группа включает методы определения уровней метилирования геномов в целом (соотношение метилированных и неметилированных Срв-динуклеотидов), вторая - методы исследования статуса метилирования специфических последовательностей, третья позволяет идентифицировать новые «горячие точки метилирования», т.е. области ДНК, аномально метилированные в патологически измененной ткани, четвертая предполагает полногеномный скрининг метилирования Срв-динуклеотидов. Первые две группы относятся в основном к диагностическим; третья и четвертая группы - в большей степени к поисковым. В онкогенетике методы второй группы подразумевают исследование статуса метилирования уже известных генов, вовлеченных в канцерогенез, на основе информации о структуре их промоторных областей и CpG-островков. Подобные исследования абсолютно необходимы для характеристики эпигенетического портрета того или иного типа опухолей и обычно охватывают ограниченный круг хорошо охарактеризованных генов, вовлеченных в канцерогенез (pl6/CDKN2A, pl4/ARF, pl5/CDKN2B, RBI, HIC, CDH1 и ряд других), что позволяет унифицировать результаты исследований метилотипов опухолей. Такой стандартизированный подход имеет определенные преимущества, поскольку позволяет сравнивать результаты десятков исследований, что значительно повышает их статистическую достоверность и практическую диагностическую ценность. В то же время, ограниченность круга генов, включенных в такие панели метилирования, не позволяет решить одну из главных задач онкогенетики по созданию наборов молекулярных, в том числе эпигенетических, диагностических маркеров, способных эффективно дифференцировать различные типы злокачественных новообразований, в том числе, в зависимости от их тканевого происхождения. Решение этой задачи сопряжено с идентификацией новых генов, вовлеченных в канцерогенез, путем выявления аномалий их эпигенетического статуса в опухолях, точнее, скрининга дифференциального метилирования геномов нормальных и опухолевых клеток.

Существует два принципиально различных подхода к скринингу дифференциального метилирования ДНК. Первый подразумевает предварительный отбор локусов для исследования, осуществляемый на основании некоторой гипотезы, предсказывающей наиболее вероятное выявление дифференциального метилирования именно этих локусов. Задача методов, осуществляющих такую стратегию, - проверка исходной гипотезы о наличии дифференциального метилирования заранее отобранных последовательностей ДНК. Второй подход подразумевает непредвзятый скрининг, в ходе которого сначала определяется дифференциальное метилирование заранее неизвестных локусов генома, а затем проводится идентификация их нуклеотидных последовательностей. Непредвзятый скрининг эффективно выявляет дифференциальное метилирование геномных участков, которые, в силу недостаточной изученности эпигеномов, не подпадают ни под одну из современных гипотез и не включаются в анализ методами первой группы. Непредвзятый скрининг не только расширяет фундаментальные представления о роли метилирования ДНК в норме и при патологии, но и способствует диверсификации основ разработки эпигенетических диагностических маркеров. Именно непредвзятость исследования является краеугольным камнем объективной оценки состояния изучаемого эпигенома в целом. С этим согласны все исследователи, работающие в области эпигеномики; в то же время оптимального метода непредвзятого скрининга дифференциального метилирования на сегодняшний день не существует. В качестве основы для разработки современных алгоритмов анализа дифференциального метилирования геномов мы приняли два ранее разработанных метода, метилчувствительный фингерпринтинг (МЧФП) и амплификацию интерметилированных сайтов (АИМС). Обеспечивая полную непредвзятость скрининга, эти методы характеризуются наибольшей простотой, экономичностью, высокой производительностью (возможность сравнения в рамках одного эксперимента десятков геномов по значительному количеству локусов). Главные их недостатки прослеживаются в области скорости и простоты идентификации геномной принадлежности детектируемых фрагментов ДНК. Нами предложены и апробированы принципиальные модификации обоих подходов.

Модификации МЧФП затронули этапы разделения и визуализации продуктов реакции, а также их геномного картирования.

Проведенные нами эксперименты показали возможность четкого разделения продуктов МЧФП в неденатурирующем полиакриламидном геле. Примененный способ окраски фрагментов ДНК в геле нитратом серебра позволил проводить непосредственный визуальный контроль за изоляцией интересующих фрагментов, а также обеспечил значительное сокращение промежутка времени от анализа геля и выявления интересующих фрагментов до их реамплификации, что способствовало сохранению их целостности. Традиционная процедура клонирования фрагментов ДНК, извлеченных из геля, заменена непосредственным прямым секвенированием с праймеров, использующихся при постановке МЧФП.

В составе репрезентаций генома, генерируемых модифицированным методом метилчувствительного фингерпринтинга, 58% были метилированы и 26% неметилированы во всех опухолевых образцах. Для 16% фрагментов было показано дифференциальное метилирование в образцах РМЖ. Эффективность выявления дифференциально метилированных фрагментов ДНК с помощью разработанной нами модификации метода сопоставима с результатами, полученными другими авторами. Результаты прямого секвенирования выявленных дифференциально метилированных фрагментов позволили провести компьютерный анализ их последовательности, на основании которого они были идентифицированы как участки CpG-островков генов LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1. Аномальное метилирование указанных CpG-островков при РМЖ продемонстрировано впервые. Из перечисленных генов лишь для одного, супрессора опухолевого роста BIN1, доказано участие в канцерогенезе, в то время как целенаправленного изучения роли молекулярной патологии других генов при раке не проводилось.

Полученные результаты показывают, что оптимизированный метод МЧФП позволяет эффективно выявлять новые гены, подвергающиеся аномальному метилированию при канцерогенезе. В то же время, в самой природе МЧФП заложен ряд принципиально неустранимых недостатков. На фоне общей репрезентации МЧФП доля дифференциально метилированных фрагментов не превышает единичных процентов, таким образом, область разделения элементов репрезентации МЧФП занята в основном неинформативными элементами. Второй системный недостаток МЧФП - использование статистических праймеров, не допускающее ни малейшей стандартизации метода.

К началу 2000-х гг. назрела необходимость разработки подхода к скринингу дифференциального метилирования геномов, не уступающего по эффективности МЧФП и лишенного присущих ему недостатков. В 2002 году испанскими исследователями была опубликована такая технология, основанная на адаптер-опосредованной амплификации интерметилированных сайтов (АИМС).

Нами проведен критический анализ метода АИМС, результатом которого фактически стало создание не просто модифицированного метода, а принципиально новой технологии анализа длин амплифицируемых фрагментов - AFLOAT (Amplified Fragment Length Oriented Analysis Technique), которая может использоваться как для изучения дифференциального метилирования ДНК, так и в более широких геномных приложениях. Технология AFLOAT соединила в себе преимущества АИМС, капиллярного электрофореза и математического анализа с современными возможностями биоинформатики. Адекватный дизайн экспериментов обеспечивается путем предварительного моделирования ожидаемых результатов in silico. Такая возможность предоставляется разработанной нами программой компьютерной симуляции AIMS in silico. Алгоритм моделирования результатов экспериментов программой AIMS in silico практически воспроизводит протокол осуществления АИМС in vitro.

Для предоставления исследователям возможности обоснованного выбора удлинителей праймеров, используемых для амплификации продуктов АИМС, мы, пользуясь программой AIMS in silico, сформировали представление количественной иерархии продуктов АИМС генома человека. Полученная гистограмма ясно показывает, что для подавляющего числа семейств удлинителей достаточно трех нуклеотидов, чтобы снизить сложность картины АИМС таким образом, чтобы продукты ПЦР можно было четко дифференцировать после разделения в полиакриламидном геле. Экспериментальное определение этих параметров потребовало бы невероятных затрат труда, времени и материалов, а неопределение наверняка привело бы к ложной интерпретации опытных данных.

Традиционный дизайн АИМС предполагает клонирование и секвенирование интересующих фрагментов ДНК для определения их геномной принадлежности. Пользуясь тем, что определение нуклеотидной последовательности генома человека уже практически полностью завершено и, соответственно, последовательности возможных продуктов АИМС также известны, мы заменили этапы клонирования и секвенирования последовательными этапами рестриктазного картирования in silico и in vitro. Для моделирования рестриктазного картирования был введен дополнительный модуль в программу AIMS in silico.

Для визуализации, анализа и дифференциации капиллярных электрофореграмм продуктов АИМС, полученных на автоматических генетических анализаторах и представленных в файлах *.fsa формата ABIF, разработана компьютерная программа PeakPick. Важнейшей функцией программы PeakPick является осуществление дифференциального анализа электрофореграмм репрезентаций различных геномов (нормального/опухолевого геномов, геномов организмов разных штаммов/сортов/видов и т.п.) для определения степени генетического сходства/различия исследуемых образцов биологического материала. Эта опция делает программу незаменимой при проведении сравнительного анализа геномных фингерпринтов.

В качестве модели для демонстрации возможностей технологии AFLOAT нами выбраны клеточные линии РМЖ: ZR-75-1, HBL-100, HS578T, ВТ-474, T-47D и MCF7. Анализ дифференциального метилирования их геномов выявил 6 геномных локусов, которые ранее не изучались с этой точки зрения. Среди них - участки CpG-островков, расположенных в первых интронах генов ANK3 и MAFK, в промоторной области гена C2CD2, в межгенных областях на хромосомах 12ql3.13 и 13q32.1, а также участок первого экзона гена PURB, не являющийся CpG-островком. Выявление дифференциального метилирования неканонической локализации подтверждает непредвзятость разработанного алгоритма скрининга.

Для подтверждения результатов анализа метилирования, полученных методом AFLOAT, проведено метилспецифическое секвенирование исследуемых локусов. Сравнение результатов, полученных методами AFLOAT и метилспецифического секвенирования, показало совпадение оценок статуса метилирования в 92% (33/36) случаев. В 3 случаях из 36 метилспецифическое секвенирование не подтвердило наличия метилирования, выявленного AFLOAT. Мы предположили, что данные метилспецифического секвенирования в некоторых случаях не подтверждают метилированного статуса по причине недостаточной чувствительности собственно метода секвенирования. Опубликованные в литературе оценки различных методов выявления мутаций в отношении их способности определять мозаичные мутации показало следующие значения чувствительности (детектируемая доля молекул ДНК с мутацей в пуле ДНК дикого типа): секвенирование по Сэнгеру - 15-50%, анализ полиморфизма конформации однонитевых фрагментов / анализ гетеродуплексов - 5203

25%, белковый тест РТТ - 10-100%, денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография - 5-25% и параллельное секвенирование - 1%. Использования только секвенирования по Сэнгеру недостаточно для выявления мозаичных мутаций низкого уровня. Параллельное секвенирование при достаточном количестве прочтений (глубине покрытия) позволяет достичь наилучших результатов, однако возможности его использования на сегодняшний день ограничены сложностью, высокой стоимостью анализа и доступностью оборудования.

В нашем исследовании в качестве дополнительного метода подтверждения результатов AFLOAT применен метилспецифический анализ конформации однонитевых фрагментов, показавший их аномальную электрофоретическую подвижность, говорящую о наличии метилированных клонов, в спорных образцах. Проведенное исследование говорит о высокой чувствительности разработанного метода анализа дифференциального метилирования геномов.

Применение технологии AFLOAT к выборке операционных образцов РМЖ и нормальных тканей позволило нам идентифицировать 19 новых локусов генома, аномально метилированных при РМЖ. Совокупно с результатами применения МЧФП, в работе выявлено 26 таких локусов. Среди них 15% являются межгенными (области хромосом 1рЗЗ, 5р15.33, 12ql3.13 и 13q32.1), 19% - интронными (гены В INI, RAH, GPC2, PPP2R5C, PHF1), 8% расположены в первых экзонах (гены ATMIN, IQSEC2). Лишь около половины, (56%, гены LAMBI, KCNH8, DOCK6, SH3KBPI, C2CD2, KIAA1324L, АХ746725/АК127124, ТМЕМ17 6А/ТМЕМ176В, FOXM1/HKMT1188, LAMC3, SEMA6B, VCIP135, KCNH2, CACNG4 и PSMF1) полученных фрагментов имеют локализацию, каноническую для дифференциального метилирования при канцерогенезе. Таким образом, разработанные методы непредвзятого скрининга позволяют идентифицировать дифференциально метилированные локусы геномов независимо от их расположения относительно кодирующих областей, промоторов и сайтов инициации транскрипции.

Один из новых генов, вовлеченных в канцерогенез, выявленных в настоящем исследовании, - БЕМАбВ - расположен в дистальном сегменте короткого плеча 19-й хромосомы, 19р13.3. Эта область, в которой часто наблюдаются потери гетерозиготности при злокачественных новообразованиях, представляет собой С,С-богатый участок ДНК, содержащий большое количество генов. Высокие частоты потерь гетерозиготности по ряду микросателлитных маркеров в локусе 19р13.3 и недавно продемонстрированная ассоциация частоты этих потерь со степенью злокачественности опухолей молочной железы заставляют предположить наличие в этой области одного или нескольких генов-супрессоров опухолевого роста. Анализ молекулярной патологии гена БЕМАбВ, аномальное метилирование которого при раке молочной железы впервые показано в настоящем исследовании, продемонстрировал наличие повреждений гена (метилирование, потеря гетерозиготности) в 75% образцов РМЖ. Впервые выявлена терминальная мутация БЕМАбВ у пациентки с РМЖ. Полученные результаты свидетельствуют о том, что БЕМАбВ - один из наиболее реальных генов-кандидатов на роль супрессора опухолевого роста в области хромосомы 19р13.3.

Скрининг метилирования ДНК из образцов рака молочной железы, светлоклеточного рака почки, рака мочевого пузыря, прилежащих условно нормальных тканей, аутопсийного материала молочной железы, лимфоцитов периферической крови и буккального эпителия здоровых доноров выявил не только дифференциально метилированные локусы, но и ряд константно метилированных участков генома человека. Это Срв-островок гена СШ7 в составе альтернативного З'-концевого экзона, первые экзоны генов ЬАМАЗА, ЬАМВЗ, ЬАМСЗ, интронные области генов MAD1L1, FLNA и З'-CpG-ocipoBOK гена ZBTB4. Полученные результаты впервые предоставили базу для обоснованного дизайна контролей эффективности метилчувствительной ПЦР.

Анализ состояния метилирования участков ДНК в норме и при канцерогенезе в зависимости от локальных характеристик хроматина показал совместное расположение константно метилированных участков с плотной упаковкой нуклеосом при закрытом хроматине, константно неметилированных участков - с низкой плотностью упаковки нуклеосом при закрытом хроматине, и дифференциально метилированных участков

- с областями открытого хроматина при любой плотности нуклеосомной упаковки. Это позволило разработать синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов, вовлеченных в канцерогенез.

Использование разработанной в ходе исследования методологии локус-специфического анализа метилирования для изучения эпигенетической патологии семейства генов ламининов подтвердило предсказанное на основании анализа локальных свойств хроматина дифференциальное метилирование 70% промоторных областей этих генов при РМЖ. Шесть промоторных областей демонстрируют неметилированное состояние в нормальных тканях и аномальное метилирование при РМЖ, с частотами, составившими для генов LAMA1

- 36%, LAMA2 - 38%, LAMA3B - 6%, LAMA4 - 2%, LAMBI - 16%, LAMC3 - 8%. Промотор гена LAMC2 показал дифференциальное метилирование в зависимости от тканевого происхождения образцов: в буккальном эпителии и лимфоцитах периферической крови метилирование отсутствует, в то время образцы ДНК из нормальных и опухолевых тканей молочной железы метилированы в 100% случаев. Константное метилирование предсказано и подтверждено для промоторных областей генов субъединиц ламининов LAMA3A и LAMB3. Полученные результаты говорят о высоком предиктивном потенциале разработанного синтетического подхода к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов, вовлеченных в канцерогенез.

Таким образом, в ходе исследования разработана новая универсальная стратегия и оригинальная методическая база анализа эпигеномов в норме и при патологии для поиска и характеристики функциональных нарушений (аномальное метилирование генов и геномных локусов), вызывающих различные заболевания у человека. На значительном экспериментальном материале (более 1000 образцов операционного материала рака молочной железы, рака мочевого пузыря, светлоклеточного рака почки и прилежащих тканей, немелкоклеточного рака легких, острого лимфобластного лейкоза, аутопсийного материала молочной железы, буккального эпителия и лимфоцитов периферической крови здоровых доноров) показана эффективность разработанных подходов, охарактеризованы новые гены и районы, вовлеченные в процесс канцерогенеза.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Стрельников, Владимир Викторович, 2012 год

1. Залетаев Д.В. ДНК-диагностика в онкологии // Молекулярная биология. 2000. - Т. 34. - С. 578-589.

2. Залетаев Д.В., Немцова М.В., Бочков Н.П. Метилирование ДНК как этиологический фактор канцерогенеза // Вестник РАМН. 2002. - № 4. - С. 6-11.

3. Залетаев Д.В., Немцова М.В., Стрельников В.В. и др. Диагностика эпигенетической патологии при наследственных и онкологических заболеваниях // Молекулярная биология. 2004. Т. 38(2), С. 213-223.

4. Залетаев Д.В., Горбунова В.Н., Бабенко О.В. Онкогеномика и молекулярная диагностика в онкологии // 2005. Геномика медицине. Научное издание / Под ред. академика РАМН В.И. Иванова и академика РАН JI.JL Киселева. -М.: ИКЦ «Академкнига» - 392 е.: ил.

5. Кузнецова Е.Б., Стрельников В.В. Методы анализа метилирования ДНК // 2006. Медицинская генетика, 5(11), 3 11.

6. Немцова М.В., Землякова В.В., Жевлова А.И. и др. Профиль метилирования генов-супрессоров опухолевого роста при различных формах рака // Вестник Института молекулярной медицины ММА им. И.М. Сеченова. 2002. - № 2. - С. 65-84.

7. Abrams E.S., Stanton V.P. Jr. Use of denaturing gradient gel electrophoresis to study conformational transitions in nucleic acids // Methods. Enzymol. 1992. - Vol. 212. - P. 71-104.

8. Aaroe J., Lindahl T, Dumeaux V. et al. Gene expression profiling of peripheral blood cells for early detection of breast cancer // Breast Cancer Res. -2010.-Vol. 12(1).-P. R7.

9. Anglim P.P., Galler J.S., Koss M.N. Identification of a panel of sensitive and specific DNA methylation markers for squamous cell lung cancer // Mol. Cancer. 2008. - Vol. 7. - P. 62.

10. Beroukhim R., Mermel C.H., Porter D. et al. The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers // Nature. 2010. - Vol. 463. - P. 899-905.

11. Bhusari S., Yang В., Kueck J., Huang W., Jarrard D.F. Insulin-like Growth Factor-2 (IGF2) Loss of Imprinting Marks a Field Defect Within Human Prostates Containing Cancer // The Prostate. 2011. - Vol. 71. - P. 1621-1630.

12. Bianco T., Hussey D., Dobrovic A. Methylation-sensitive, single-strand conformation analysis (MS-SSCA): A rapid method to screen for and analyze methylation // Hum. Mutat. 1999. - Vol. 14(4). - P. 289-293.

13. Bock C. Epigenetic biomarker development // 2009. Epigenomics, 1(1), 99-110.

14. Boyle A.P., Davis S., Shulha H.P. et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome // Cell. 2008. - Vol. 132(2).-P. 311-322.

15. Bozic I., Antal T., Ohtsuki H. et al. Accumulation of driver and passenger mutations during tumor progression // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. -Vol. 107.-P. 18545-18550.

16. Brock G.J.R., Huang T. H., Chen C., Johnson K.J. A novel technique for the identification of CpG islands exhibiting altered methylation patterns (ICEAMP) //2001. Nucleic Acids Res., 29, el23.

17. Buyse M., Loi S., van't Veer L. et al. Validation and Clinical Utility of a 70-Gene Prognostic Signature for Women With Node-Negative Breast Cancer // J. Natl. Cancer Inst. 2006. - V. 98. - P. 1183 - 1192.

18. Costello J.F., Hong C., Plass C., Smiraglia D.J. Restriction landmark genomic scanning: analysis of CpG islands in genomes by 2D gel electrophoresis//Methods Mol. Biol. -2009. Vol. 507. - P. 131-148.

19. Crawford G.E., Davis S., Scacheri P.C. et al. DNase-chip: a highresolution method to identify DNase I hypersensitive sites using tiled microarrays // Nat. Methods. 2006. - Vol. 3(7). - P. 503-509.

20. Dakubo G.D., Jakupciak J.P., Birch-Machin M.A., Parr R.L. . Clinical implications and utility of field cancerization // Cancer Cell Int. 2007. - Vol. 7. - P. 2.

21. Dalgliesh G.L., Furge K., Greenman C. et al. Systematic sequencing of renal carcinoma reveals inactivation of histone modifying genes // Nature. -2010. Vol. 463(7279). - P. 360-363.

22. Davies H., Bignell G.R., Cox C. et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer // Nature. 2002. - Vol. 417(6892). - P. 949-954.

23. Dennis J.H., Fan H.-Y., Reynolds S.M. et al. Independent and complementary methods for large-scale structural analysis of mammalian chromatin // Genome Res. 2007. - Vol. 17. - P. 928 - 939.

24. Deng D., Deng G., Smith M.F., et al. Simultaneous detection of CpG methylation and single nucleotide polymorphism by denaturing high performance liquid chromatography // Nucleic Acids Res. 2002. - Vol. 30: el3.

25. Ding L., Ellis M.J., Li S. et al. Genome remodelling in a basal-like breast cancer metastasis and xenograft // Nature. 2010. - Vol. 464(7291). - P. 9991005.

26. Durinck S., Ho C., Wang N.J. et al. Temporal Dissection of Tumorigenesis in Primary Cancers // Cancer Discovery. 2011. - Vol. 1. - P. 137-143.

27. Eads C.A., Danenberg K.D., Kawakami K., et al. MethyLight: a high-throughput assay to measure DNA methylation // Nucleic Acids Res. 2000. Vol. 28: e32 - e.

28. El-Maarri O, Herbiniaux U, Walter J., Oldenburg J. A rapid, quantitative, non-radioactive bisulfite-SNuPE- IP RP HPLC assay for methylation analysis at specific CpG sites // Nucleic Acids Res. 2002. - Vol. 30: e25.

29. Esteller M., Corn P., Baylin S., Herman J. A gene hypermethylation profile of human cancer // Cancer Res. 2001. - Vol. 61. - P. 3225-3229.

30. Esteller M. DNA Methylation: Approaches, Methods and Applications // 2005. CRC Press, FL, USA, (2005).

31. Euhus D.M., Cler L., Shivapurkar N. et al. Loss of heterozygosity in benign breast epithelium in relation to breast cancer risk // J. Natl. Cancer Inst. -2002. Vol. 94(11). - P. 858-860.

32. Fraga M.F., Esteller M. DNA methylation: a profile of methods and applications // BioTechniques. 2002. - Vol. 33. - P. 632-649.

33. Frigola J., Ribas M., Risques R., Peinado M.A. Methylome profiling of cancer cells by amplification of inter-methylated sites (AIMS) // Nucleic Acids Research. 2002. - Vol. 30(7). - e28.

34. Futreal P.A., Coin L., Marshall M. et al. A census of human cancer genes // Nat. Rev. Cancer. 2004. - Vol. 4(3). - P. 177-183.

35. Ge K., Duhadaway J., Sakamuro D., Wechsler-Reya R., Reynolds C., Prendergast G.C. Losses of the tumor suppressor BIN1 in breast carcinoma are frequent and reflect deficits in programmed cell death capacity. // 2000. Int. J. Cancer. 85(3), 376-383.

36. Gebhard C., Schwarzfischer L., Pham T.-H., Schilling E., Klug M., Andreesen R., Rehli M. Genome-Wide Profiling of CpG Methylation Identifies Novel Targets of Aberrant Hypermethylation in Myeloid Leukemia // 2006. Cancer Res., 66, 6118 6128.

37. Gitan R.S., Shi H., Chen C.-M., et al. Methylation-Specific Oligonucleotide Microarray: A New Potential for High-Throughput Methylation Analysis // Genome Res. 2002. - Vol 12. - P. 158- 164.

38. Glas A.M., Floore A., Delahaye L.J. et al. Converting a breast cancer microarray signature into a high-throughput diagnostic test // BMC Genomics. -2006 V. 7. P. 278.

39. Gonzalgo M.L., Jones P.A. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE) // Nucleic Acids Res. 1997. - Vol. 25. - P. 2529 - 2531.

40. Greenman C., Stephens P., Smith R. et al. Patterns of somatic mutation in human cancer genomes // Nature. 2007. - Vol. 446(7132). - P. 153-158.

41. Gruvberger S., Ringner M., Chen Y. et al. Estrogen Receptor Status in Breast Cancer Is Associated with Remarkably Distinct Gene Expression Patterns //Cancer Res.-2001.-V. 61.-P. 5979-5984.

42. Ha P.K., Tong B.C., Westra W.H. et al. Mitochondrial C-tract alteration in premalignant lesions of the head and neck: a marker for progression and clonal proliferation // Clin. Cancer Res. 2002. - Vol. 8. - P. 2260-2265.

43. Hackenberg M., Barturen G., Oliver J.L. NGSmethDB: a database for next-generation sequencing single-cytosine-resolution DNA methylation data // Nucleic Acids Res. 2011. - Vol. 39. - D. 75-79.

44. Han M., Liew C.T., Zhang H.W. et al. Novel blood-based, fivegene biomarker set for the detection of colorectal cancer // Clin. Cancer Res. 2008. - Vol. 14. -P. 455-460.

45. Hanahan D., Weinberg R.A. The hallmarks of cancer // Cell. 2000. -Vol. 100(1).-P. 57-70.

46. Harbour J.W., Onken M.D., Roberson E.D.O. et al. Frequent Mutation of BAP1 in Metastasizing Uveal Melanomas // Science. 2010. - Vol. 330. - P. 1410-1413.

47. Heaphy C.M., Bisoffi M., Fordyce C.A. et al. Telomere DNA content and allelic imbalance demonstrate field cancerization in histologically normal tissue adjacent to breast tumors // Int. J. Cancer. 2006. - Vol. 119. - P. 108-116.

48. Heintzman N.D., Hon G.C., Hawkins R.D. et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression // Nature. -2009. Vol. 459(7243). - P. 108-112.

49. Herman J.G., Graff J.R., Sanna M, et al. Methylation-specific PCR: A novel PCR assay for methylation status of CpG islands // PNAS. 1996. - Vol. 93. P. 9821-9826.

50. Hodges E., Smith A.D., Kendall J., et al. High definition profiling of mammalian DNA methylation by array capture and single molecule bisulfite sequencing // Genome Res. 2009. - Vol. 19. - P. 1593 - 1605.

51. Hong K.M., Yang S.H., Guo M., Herman J.G., Jen J. Semiautomatic detection of DNA methylation at CpG islands // Biotechniques. 2005. -Vol.38(3).-P. 354-358.

52. Hu Z., Fan C., Oh D.S. et al. The molecular portraits of breast tumors are conserved across microarray platforms // BMC Genomics. 2006. - V. 7. - P. 96.

53. Huebert D.J., Kamal M., O'Donovan A., Bernstein B.E. Genome-wide analysis of histone modifications by ChlP-on-chip // Methods. 2006. - Vol. 40(4).-P. 365-369.

54. Huss M. Introduction into the analysis of high-throughput-sequencing based epigenome data // Brief Bioinform. 2010. -Vol. 11. - P. 512 - 523.

55. Jacinto F.V., Ballestar E., Esteller M. Methyl-DNA immunoprecipitation (MeDIP): hunting down the DNA methylome // 2008. BioTechniques, 44(1), 35 -39.

56. James S.J., Pogribny I.P., Pogribna M., Miller B.J., Jernigan S., Melnyk S. Mechanisms of DNA Damage, DNA Hypomethylation, and Tumor Progression in the Folate/Methyl-Deficient Rat Model of Hepatocarcinogenesis // 2003. J. Nutr., 133,3740-3747.

57. Jelinic P., Shaw P. Loss of imprinting and cancer // J. Pathol. 2007. -Vol. 211.-P. 261-268.

58. Jiao Y., Shi C., Edil B.H. et al. DAXX/ATRX, MEN1, and mTOR Pathway Genes Are Frequently Altered in Pancreatic Neuroendocrine Tumors // Science. 2011.-Vol. 331.-P. 1199-1203.

59. Johnson D.S., Li W., Gordon D. B. et al. Systematic evaluation of variability in ChlP-chip experiments using predefined DNA targets // Genome Res. 2008.-Vol. 18.-P. 393 -403.

60. Jones P.A., Baylin S.B. The epigenomics of cancer // Cell. 2007. - Vol. 128(4).-P. 683-692.

61. Kanel T., Gerber D., Schaller A., Baumer A., Wey E., Jackson C.B., Gisler F.M., Heinimann K., Gallati S. Quantitative 1-Step DNA Methylation Analysis with Native Genomic DNA as Template // 2010. Clin. Chem., 56, 1098 1106.

62. Kantlehner M., Kirchner R., Hartmann P., Eilwart J.W., Alunni-Fabbroni M., Schumacher A. A high-throughput DNA methylation analysis of a single cell // 2011. Nucleic Acids Res., 10, 1093/nar/gkql357.

63. Kaneda A., Kaminishi M., Yanagihara K. et al. Identification of silencing of nine genes in human gastric cancers // Cancer Res. 2002. - Vol. 62. - P. 6645-6650.

64. Kerangueven F., Noguchi T., Coulier F., et al. Genome-wide search for loss of heterozygosity shows extensive genetic diversity of human breast carcinomas. // 1997. Cancer Res. 57, 5469-5474.

65. Kuppuswamy M.N., Hoffman J.W., Kasper C.K., et al. Single Nucleotide Primer Extension to Detect Genetic Diseases: Experimental Application to Hemophilia B (Factor IX) and Cystic Fibrosis Genes // PNAS. 1991. - Vol. 88.-P. 1143-1147.

66. Lee W., Jiang Z., Liu J. et al. The mutation spectrum revealed by paired genome sequences from a lung cancer patient // Nature. 2010. - Vol. 465(7297). - P. 473-477.

67. Leemans C.R., Braakhuis B.J.M., Brakenhoff R.H. The molecular biology of head and neck cancer // Nat. Rev. Cancer. 2011. - Vol. 11. - P. 9-22.

68. Ley T.J., Mardis E.R., Ding L. et al. DNA sequencing of a cytogenetically normal acute myeloid leukaemia genome // Nature. 2008. - Vol. 456(7218). -P. 66-72.

69. Li L., Carroll P., Dahiya R. Epigenetic changes in prostate cancer: implication for diagnosis and treatment // J. Natl. Cancer Inst. 2005. Vol. 97. -P. 103-115.

70. Liang G., Carol E., Hung D. et al. DNA methylation differences associated with tumor tissues identified by genome scanning analisis. // 1998. Genomics. 53, 260-268.

71. Lister R., Pelizzola M., Dowen R.H. et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences // Nature. 2009. -Vol. 462(7271).-P. 315-322.

72. Liu R., Wang X., Chen G.Y., et al. The prognostic role of a gene signature from tumorigenic breast-cancer cells // N Engl J Med. 2007. - Vol. 356(3). -P. 217-226.

73. Luo Z.G., Tang H., Li B., Zhu Z., Ni C.R., Zhu M.H. Genetic alterations of tumor suppressor ING1 in human non-small cell lung cancer // Oncol. Rep. -2011. Vol. 25(4). - P. 1073-1081.

74. Lydiatt W.M., Anderson P.E., Bazzana T. et al. Molecular support for field cancerization in the head and neck // Cancer. 1998. - Vol. 82(7). - P. 1376-1380.

75. Mardis E.R., Ding L., Dooling D.J. et al. Recurring mutations found by sequencing an acute myeloid leukemia genome // N. Engl. J. Med. 2009. -Vol. 361(11).-P. 1058-1066.

76. Maxwell A., McCudden C.R., Wians F., Willis M.S. Recent Advances in the Detection of Prostate Cancer Using Epigenetic Markers in Commonly Collected Laboratory Samples // LabMedicine. 2009. - Vol. 40. - P. 171-178.

77. Meissner A., Mikkelsen T.S., Gu H. et al. Genome-scale DNA methylation maps of pluripotent and differentiated cells // Nature. 2008. - Vol. 454(7205).-P. 766-770.

78. Mitelman F., Johansson B., Mertens F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation // Nat. Rev. Cancer. 2007. - Vol. 7(4). - P. 233-245.

79. Miyamoto K., Asada K., Fukutomi T. et al. Methylation-associated silencing of heparan sulfate D-glucosaminyl 3-0-sulfotransferase-2 (3-OST-2) in human breast, colon, lung and pancreatic cancers // Oncogene. 2003. - Vol. 22.-P. 274-280.

80. Nemtsova M., Zemlyakova V., Kusnetsova E., Strelnikov V., Lyubchenko L., Zaletayev D. Methylation profiling of carcinogenesis-associated genes in sporadic breast cancer // 2005. Breast Cancer Research, 7(Suppl 2), P4.17.

81. O'Shaughnessy J.A., Kelloff G.J., Gordon G.B. et al. Treatment and prevention of intraepithelial neoplasia: an important target for accelerated new agent development // Clin. Cancer Res. 2002. - Vol. 8(2). - P. 314-346.

82. Paulin R., Grigg G.W., Davey M.W., Piper A.A. Urea improves efficiency of bisulphite-mediated sequencing of 5'- methylcytosine in genomic DNA // Nucleic Acids Res. 1998. - Vol. 26. - P. 5009 - 5010.

83. Perou C.M., Sorlie T., Eisen M.B. et al. Molecular portraits of human breast tumours // Nature. 2000. - Vol. 406(6797). - P. 747-752.

84. Pleasance E.D., Cheetham R.K., Stephens P.J. et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome // Nature. 2010. - Vol. 463(7278). - P. 191-196.

85. Quackenbush J. Microarray analysis and tumor classification // N Engl J Med. 2006. - Vol. 354(23). - P. 2463-2472.

86. Raizis A.M., Schmitt F., Jost J.P. A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation // Anal. Biochem. 1995. - Vol. 226(1).-P. 161-166.

87. Rush L.J., Dai Z., Smiraglia D.J., et al. Novel methylation targets in de novo acute myeloid leukemia with prevalence of chromosome 11 loci // Blood. -2001.- Vol. 97.-P. 3226-3233.

88. Santarius T., Shipley J., Brewer D., Stratton M.R., Cooper C.S. A census of amplified and overexpressed human cancer genes // Nat. Rev. Cancer. 2010. - Vol. 10(1). - P. 59-64.

89. Seelan R.S., Pisano M.M., Greene R.M., Casanova M.F., Parthasarathy R.N. Differential methylation of the gene encoding myo-inositol 3-phosphate synthase (Isynal) in rat tissues // 2011. Epigenomics, 3(1), 111 -124.

90. Serre D., Lee B.H., Ting A.H. MBD-isolated Genome Sequencing provides a high-throughput and comprehensive survey of DNA methylation in the human genome // Nucleic Acids Res. 2010. - Vol. 38. - P. 391 - 399.

91. Shen L., Kondo Y., Rosner G.L. et al. MGMT promoter methylation and field defect in sporadic colorectal cancer // J. Natl. Cancer Inst. 2005. - Vol. 97.-P. 1330-1338.

92. Shin S.H., Kim B.H., Jang J.J., Suh K.S., Kang G.H. Identification of novel methylation markers in hepatocellular carcinoma using a methylation array // 2010. J. Korean Med. Sci., 25(8), 1152 1159.

93. Singer-Sam J., Robinson M.O., Bellve A.R., Simon M.I., Riggs A.D. Measurement by quantitative PCR of changes in HPRT, PGK-1, PGK-2, APRT, MTase, and Zfy gene transcripts during mouse spermatogenesis // Nucleic Acids Res.-1990b.-Vol. 18.-P. 1255- 1259.

94. Slaughter D.P., Southwick H.W., Smejkal W. "Field cancerization" in oral stratified squamous epithelium // Cancer. 1953. - Vol. 6. - P. 963-968.

95. Stratton M.R. Exploring the Genomes of Cancer Cells: Progress and Promise// Science.-2011.-Vol. 331.-P 1553-1558.

96. Stratton M.R., Campbell P.J., Futreal P.A. The cancer genome // Nature. -2009. Vol. 458. - P. 719-724.

97. Sui G., Zhou S., Wang J. et al. Mitochondrial DNA mutations in preneoplastic lesions of the gastrointestinal tract: A biomarker for the early detection of cancer // Mol. Cancer. 2006. - Vol. 5. - P. 73.

98. Suijkerbuijk K. P. M., van Diest P. J., van der Wall E. Improving early breast cancer detection: focus on methylation // 2011. Ann. One., 22, 24 29.

99. Tabor M.P., Brakenhoff R.H., Ruijter-Schippers H.J. et al. Multiple head and neck tumors frequently originate from a single preneoplastic lesion //Am. J. Pathol.-2002.-Vol. 161(3).-P. 1051-1060.

100. Tanas A.S., Shkarupo V.V., Kuznetsova E.B., Zaletayev D.V., Strelnikov V.V. Novel tools for unbiased DNA differential methylation screening // Epigenomics. 2010. - Vol. 2. - No. 2. - P. 325-333.

101. Tost J., Gut I.G. Analysis of gene-specific DNA methylation patterns by pyrosequencing technology // Methods Mol Biol. 2007. - Vol. 373. - P. 89102.

102. Ushijima T., Morimura K., Hosoya Y., et al. Establishment of methylation-sensitive-representational difference analysis and isolation of hypo-and hypermethylated genomic fragments in mouse liver tumors // PNAS. 1997. -Vol. 94.-P. 2284-2289.

103. Wang W., Srivastava S. Strategic Approach to Validating Methylated Genes as Biomarkers for Breast Cancer // 2010. Cancer Prevention Research, 3, 16-24.

104. Wang Z., Sturgis E.M., Zhang F. Genetic variants of p27 and p21 as predictors for risk of second primary malignancy in patients with index squamous cell carcinoma of head and neck // Molecular Cancer. 2012. - Vol. 11.-P. 17.

105. Weber M., Davies J.J., Wittig D. et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells // Nat. Genet. 2005. - Vol. 37(8). - P. 853-862.

106. West M., Blanchette C., Dressman H. et al. Predicting the clinical status of human breast cancer by using gene expression profiles // PNAS. 2001. -Vol. 98.-P. 11462- 11467.

107. Wojdacz T.K. Current methylation screening methods // 2009. Epigenomics, 1(2), 223 226.

108. Worm J., Aggerholm A., Guldberg P. In-Tube DNA Methylation Profiling by Fluorescence Melting Curve Analysis // Clin. Chem. 2001. - Vol. 47.-P. 1183 - 1189.

109. Xi Y., Li W. BSMAP: whole genome bisulfite sequence MAPping program // BMC Bioinformatics. 2009. -Vol. 10. - P. 232.

110. Xiao W., Oefner P.J. Denaturing high-performance liquid chromatography: A review // Hum. Mutat. 2001. - Vol. 17(6). - P. 439-474.

111. Xiong Z., Laird P.W. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay // Nucleic Acids Res. 1997. - Vol. 25. P. 2532 - 2534.

112. Zerilli F., Bonanno C., Shehi E., Amicarelli G., Adlerstein D., Makrigiorgos G. M. Methylation-Specific Loop-Mediated Isothermal Amplification for Detecting Hypermethylated DNA in Simplex and Multiplex Formats // 2010. Clin. Chem., 56, 1287 1296.