Эпигенетический статус генов опухолевой супрессии и количественные характеристики циркулирующих ДНК в крови при раке легкого тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат биологических наук Пономарева, Анастасия Алексеевна

• Пономарева, Анастасия Алексеевна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Пономарева, Анастасия Алексеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Роль эпигенетической регуляции в развитии злокачественных новообразований

1.1.1 Метилирование ДНК в нормальных клетках

1.1.2 Нарушения метилирования ДНК при раке

1.2 Заболеваемость раком легкого

1.3 Белковые маркеры при раке легкого

1.4 Генетические изменения при раке легкого

1.5 Эпигенетические изменения

1.6 Внеклеточные ДНК, циркулирующие в крови

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы

2.1.1 Характеристика материала исследования

2.1.2 Реактивы и препараты

2.1.3 Оборудование

2.2 Методы

2.2.1 Взятие образцов крови

2.2.2 Приготовление элюатов с поверхности форменных

элементов крови

2.2.3 Выделение циркулирующих ДНК из плазмы и элюатов

с клеточной поверхности

2.2.4 Бисульфитная модификация ДНК

2.2.5 Приготовление стандартов для количественной полимеразной

цепной реакции в режиме реального времени

2.2.6 Определение концентрации циркулирующих ДНК в крови

2.2.7 Получение геномной ДНК для приготовления положительного контроля в метил-специфичной полимеразной цепной реакции

2.2.8 Приготовление стандартов для количественной метил-специфичной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

2.2.9 Количественная метил-специфичная полимеразная цепная

реакция в режиме реального времени

2.2.10 Иммунохимический анализ маркеров РЭА, CYFRA 21-1

плазме крови

2.3 Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Количественный анализ фрагментов тошАСТВ и LINE-1 повторов цирДНК крови у больных хронической обструктивной болезнью и

раком легких

3.2 Исследование уровня метилирования гена RARB2 в цирДНК крови

у больных хронической обструктивной болезнью и раком легких

3.3 Определение индекса метилирования гена RARB2 в цирДНК крови

у больных хронической обструктивной болезнью и раком легких

3.4 Определение индекса метилирования гена RASSF1A в цирДНК крови

у больных хронической обструктивной болезнью и раком легких

3.5 Определение онкомаркеров РЭА, CYFRA 21-1 в крови у больных

раком легкого

3.6 Анализ ассоциации повышенного уровня метилированных аллелей генов RARB2 и RASSF1A и белковых онкомаркеров

(РЭА и CYFRA 21-1)

3.7 Исследование уровня эпигенетических (RARB2, RASSF1A) и белковых (РЭА) онкомаркеров в крови больных раком легкого на этапах динамического наблюдения

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АК - аденокарцинома

БАЛЖ - бронхоальвеолярная жидкость

ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения

ГТЦ - гуанидина тиоцианат

ИМ - индекс метилирования

МН - микросателлитная нестабильность

МС-ПЦР - полимеразная цепная реакция, специфичная к метилированию

HMPJI - немелкоклеточный рак легкого

ПГ - потеря гетерозиготности

ПКРЛ - плоскоклеточный рак легкого

ИТ TP - полимеразная цепная реакция

PJI - рак легкого

РЭА - раковый эмбриональный антиген

скп-цирДНК - циркулирующие ДНК, связанные с клеточной поверхностью

трис - трис-(гидроксиметил)аминометан

цирДНК - циркулирующие ДНК

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

CYFRA 21-1 - фрагмент цитокератина

п - количество человек

NaOAc - натрий уксуснокислый

NP-40 - Nonidet Р-40

р - уровень значимости

PBS - 0,01М натрий фосфатный буфер, 0Д5М NaCl, рН7,5

PMSF - фенилметансульфонилфторид

SDS - додецилсульфат натрия

ТАЕ - 40мМ трис ацетат, 2мМ ЭДТА, рН8,5

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Эпигенетический статус генов опухолевой супрессии и количественные характеристики циркулирующих ДНК в крови при раке легкого»

ВВЕДЕНИЕ

Рак легкого (PJI) - наиболее распространенная форма злокачественных новообразований (12,8 % в структуре онкологической заболеваемости населения мира), занимающая первое место по общей летальности от онкологических заболеваний у мужчин (1,2 млн. в год) (Мерабишвили, 2006; Чиссов, 2007). Диагностика PJI на ранних стадиях процесса является важной социальной задачей, поскольку существенно повышает вероятность успешного лечения. Показано, что 5-летняя выживаемость больных PJI I стадии после лечения составляет 70%, а III стадии - всего 15% (Харченко и др., 2005; Трахтенберг и др., 2007).

Известно, что злокачественная трансформация клеток и опухолевая прогрессия связаны с накоплением генетических и эпигенетических изменений. Основой эпигенетической модификации ДНК является присоединение метальной группы к цитозину в последовательностях цитозин-гуанин (CpG). Метилирование CpG в промоторных областях генов опухолевой супрессии при канцерогенезе связано с потерей генной экспрессии и прекращением образования белкового продукта, что приводит к утрате контроля дифференцировки и деления трансформированных клеток (Залетаев, 2008; Esteller, 2008; Duffy et al., 2009; Пузырев, 2011). При исследовании ДНК опухоли на различных стадиях развития патологического процесса было показано увеличение частоты выявления метилированных аллелей нескольких генов (CDKN2A, TIMP3, DAPK, MGMT, RARB2, RASSF1A, hTERT и др.) в ряду от атипической аденоматозной гиперплазии до аденокарциномы легких (Licchesi et al., 2008).

Рак легкого, как и большинство злокачественных новообразований, развивается на фоне предопухолевых изменений эпителия. У больных с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) и диспластическими изменениями эпителия существенно повышается риск развития рака легкого (Mannino, 2003). Недавно появились данные о том, что эпигенетические

факторы играют важную роль в регуляции экспрессии генов при хронической обструктивной болезни легких (Yang, Schwartz, 2011). Дальнейшие исследования молекулярно-генетических закономерностей прогрессии предопухолевых изменений будут способствовать выявлению механизмов их малигнизации и потенциальных мишеней для воздействия на ранних стадиях процесса с целью его реверсии или предотвращения.

Чрезвычайно актуальным представляется выявление маркеров прогноза развития предопухолевых изменений, ранней диагностики и прогнозирования клинического течения рака легкого, которые можно было бы детектировать в биологических жидкостях организма, для создания методов малоинвазивной диагностики. В связи с этим большое внимание уделяется изучению ДНК, циркулирующих в плазме или сыворотке крови (цирДНК), концентрация и состав которых существенно изменяются при развитии злокачественных новообразований (Laktionov et al., 2004; Van der Drift et al., 2010; Vlassov et al., 2010). В норме цирДНК присутствуют в крови в невысокой концентрации и в составе таких комплексов и частиц, которые препятствуют их распознаванию как «сигналов опасности» со стороны иммунной системы. Показано, что изменения ДНК, накапливающиеся в опухолевых клетках, также выявляются в составе цирДНК плазмы крови онкологических больных (Jahr et al., 2001; Fleischhaker, Schmidt, 2007; Vlassov et al., 2010). Интенсивно разрабатываются методы детекции подобных изменений с использованием современных молекулярно-генетических технологий, поскольку они представляются перспективным для ранней малоинвазивной диагностики опухолей.

Формирование пула цирДНК определяется сложными взаимодействиями в процессе их появления во внеклеточном пространстве, выхода в циркуляцию и элиминации в результате деградации и выведения. Согласно принятому мнению, источниками цирДНК являются как продукты разрушения клеток в результате апоптоза и некроза, так и секреция ДНК клетками в ходе их жизнедеятельности (Jahr et al., 2001; Anker et al., 2003).

Однако до сих пор неизвестен вклад каждого из этих процессов в формирование стабильного пула цирДНК в норме и, тем более, в образование измененного по составу и свойствам комплекса фрагментов цирДНК в крови при онкологических заболеваниях. Ряд исследований целевых генов-кандидатов и работы по полногеномному анализу циркулирующих ДНК, показали, что даже в крови здоровых людей относительная представленность разных последовательностей цирДНК отличается от таковой в ДНК генома родительских клеток (Anker, 2001; Beck et al., 2009, 2010). Изменение относительного содержания фрагментов генома, в норме соответствующих транскрипционно неактивным последовательностям (содержащим повторяющиеся элементы LINE-1), и фрагментов, соответствующих последовательностям конститутивно транскрибируемых генов, при развитии опухоли может быть связано с изменением активности этих участков генома и особенностями секреции ДНК опухолевыми клетками.

Накоплены данные о том, что эпигенетические изменения могут быть выявлены в крови пациентов с высокой частотой и отвечают требованиям, предъявляемым к диагностическим маркерам (Fleischhacker, Schmidt, 2007). Однако результаты исследований говорят о большей сложности эпигенетических характеристик цирДНК крови, чем предполагалось ранее. Сравнительное исследование метилирования отдельных CpG-сайтов цирДНК плазмы крови у больных раком молочной железы и здоровых доноров с помощью метода массового параллельного пиросеквенирования показало, что в составе таких ДНК можно обнаружить любой из возможных профилей метилирования исследуемой области гена (Korshunova et al., 2008). Эпигенетический статус фрагментов цирДНК может влиять на их взаимодействие с клетками крови, эндотелия сосудов. Связывание метилированных и неметилированных цирДНК с клетками может отличаться, также как их способность к депонированию (на поверхности клеток или в тканях) и повторной циркуляции в крови (Брызгунова и др., 2010).

Проведение сравнительного анализа состава ДНК, циркулирующих в крови здоровых людей, больных с предопухолевыми процессами и злокачественными новообразованиями необходимо для получения новых знаний о механизмах генерации циркулирующих нуклеиновых кислот в норме и при развитии онкологических заболеваний. Выявление изменений цирДНК крови имеет также очевидное практическое значение, поскольку может привести к разработке надежных диагностических и прогностических маркеров рака. Считается, что использование аберрантно метилированных ДНК в качестве маркеров онкологического заболевания имеет ряд преимуществ по сравнению с другими структурными изменениями ДНК. Во-первых, их появление является одним из наиболее распространенных и ранних событий при малигнизации (Esteller, 2005). Во-вторых, чувствительность детекции аберрантно метилированного аллеля в условиях избытка неметилированного аллеля выше, чем для мутантного аллеля (Herman et al., 1996). В-третьих, в онкотрансформированных клетках выявлен широкий спектр генов, инактивированных путем изменения статуса метилирования CpG-островков промоторных областей (Esteller, 2005; Herman, 1999).

Одним из признаков злокачественной трансформации является изменение уровня и профиля белковой экспрессии в клетках опухоли, которое сопровождается повышением уровня определенных белков в крови пациентов. Увеличение концентрации опухолеассоциированных белков в сыворотке крови и ткани опухоли является следствием целого комплекса изменений в геноме, приводящих к потере контроля синтеза потенциальных онкогенов. Некоторые из таких белковых онкомаркеров являются специфичными не только для опухолевого процесса, но и для ткани, в которой локализована опухоль, например, простат-специфический антиген (Fischer et al., 2005). Белковые онкомаркеры, применяемые в клинической практике у больных раком легких (РЭА, CYFRA 21-1 и др.), имеют высокую специфичность (до 97%), однако не обладают достаточной чувствительностью (не более 60%) (Holdenrieder et al.,

2008). Анализ белковых онкомаркеров в сопоставлении с эпигенетическими изменениями генов опухолевой супрессии представляется актуальным для выявления ассоциации процессов их появления в крови в ходе развития опухоли. Полученные данные позволят расширить знания о сопряженности различных генетических и эпигенетических изменений, связанных с трансформацией клеток и способствующих выживанию опухоли в организме. Применение независимых белковых и эпигенетических маркеров в комбинации может быть эффективным подходом для разработки специфичных и чувствительных методов диагностики РЛ на ранних и предклинических стадиях, а также послеоперационного мониторинга и прогноза клинического течения заболевания.

Цель исследования

Изучить особенности концентрации и эпигенетического статуса циркулирующих ДНК крови при злокачественных новообразованиях и хронической обструктивной болезни легких.

Задачи исследования

1. Провести количественный анализ фрагментов однокопийного теп&АСТВ и повторяющихся элементов ЬШЕ-1 циркулирующих ДНК плазмы и фракции, связанной с поверхностью клеток крови, у больных хронической обструктивной болезнью, раком легких и здоровых лиц.

2. Определить уровень метилирования гена опухолевой супрессии ЯАЯВ2 в циркулирующих ДНК крови у больных хронической обструктивной болезнью, раком легких и здоровых лиц.

3. Оценить индекс метилирования, отражающий соотношение метилированных и неметилированных аллелей генов опухолевой супрессии 1МЯВ2 и ЯАЗЗПА, в циркулирующих ДНК крови у больных хронической обструктивной болезнью, раком легких и здоровых лиц.

4. Провести анализ ассоциации концентрации фрагментов ДНК, уровня и индекса метилирования генов ЯАКВ2 и ЯАБЗПА в циркулирующих

ДНК крови с патогенетически значимыми признаками и исходом заболевания при раке легкого.

5. Изучить характер изменений индекса метилирования генов ЯАЯВ2 и КАБЗПА в циркулирующих ДНК у больных раком легкого после комбинированного лечения и на этапах мониторинга в сопоставлении с данными клинико-инструментального обследования.

6. Провести анализ ассоциации повышенного уровня метилированных аллелей генов ЯАКВ2 и ЯАЗБРЫ и белковых онкомаркеров (РЭА и СУРНА. 21-1) в крови больных раком легкого.

Научная новизна

Впервые проведен анализ эпигенетического статуса генов опухолевой супрессии КАКВ2, ЯАБЗПА, концентрации и характера распределения фрагментов однокопийного гена АСТВ, ЬШЕ-1 повторов, в циркулирующих ДНК крови у больных хронической обструктивной болезнью, раком легких и здоровых лиц. Показано статистически значимое снижение концентрации фрагментов гена АСТВ и ЬШЕ-1 элементов в циркулирующих ДНК плазмы и в циркулирующих ДНК, связанных с поверхностью клеток крови, у больных с патологиями легкого по сравнению со здоровыми донорами. Получены новые данные об увеличении уровня метилирования гена Я4ЯВ2 во фракциях цирДНК у больных хронической обструктивной болезнью и раком легких по сравнению со здоровыми донорами. Выявлена ассоциация повышенного уровня метилирования гена КАЯВ2 в циркулирующих ДНК плазмы крови с неблагоприятным исходом у больных раком легкого на основе анализа показателей общей выживаемости. Показано, что одновременная оценка индекса метилирования двух генов (ЯАЯВ2, ЯАЯЗРМ) как в циркулирующих ДНК плазмы, так и в циркулирующих ДНК, связанных с клеточной поверхностью, позволяет повысить чувствительность и специфичность дискриминирования рака легкого по сравнению с раздельным использованием указанных маркеров. Впервые выявлена ассоциация повышения концентрации

эпигенетических маркеров (ЯАЯВ2, ЯА53ПА, комбинации КАКВ2+КА88ПА) с уровнем белкового онкомаркера РЭА в крови больных раком легкого и отсутствие ассоциации с уровнем СУРКА 21-1. Показано, что анализ индекса метилирования генов ЯАЗБПА и ЯАЯВ2 одновременно с определением концентрации белкового маркера СУРЛА 21-1 позволяет отличить больных раком легкого от здоровых лиц с чувствительностью 94%, что превышает данный показатель при независимом определении эпигенетических (90%) и белковых (57%) маркеров.

Теоретическая и практическая значимость Сравнительный анализ эпигенетического статуса генов опухолевой супрессии ВАКВ2, КАББПА, концентрации и соотношения фрагментов гена АСТВ, ЬШЕ-1 повторяющихся элементов во фракциях циркулирующей ДНК (связанной с клеточной поверхностью и в плазме крови) у здоровых лиц и пациентов дает новые знания об особенностях генерации и циркуляции внеклеточных нуклеиновых кислот при развитии патологических процессов в легких. Определение изменений статуса метилирования гена КАКВ2 в цирДНК крови при хронической обструктивной болезни легких, при злокачественных опухолях легкого на различных стадиях заболевания позволяет оценить значимость эпигенетического статуса гена как маркера ранних этапов злокачественной трансформации клеток и опухолевой прогрессии. Данные о повышении индекса метилирования генов 11АКВ2, ЯАБЗПА при прогрессировании заболевания и его снижении после проведенного лечения свидетельствуют о потенциальной возможности их использования для оценки эффективности терапии, раннего выявления рецидивов и прогноза клинического течения рака легкого.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту 1. У больных хронической обструктивной болезнью и раком легких концентрация фрагментов однокопийного гена АСТВ и повторяющихся элементов ЬШЕ-1 в циркулирующих ДНК, связанных с клеточной поверхностью, статистически значимо снижается по сравнению со

здоровыми донорами.

2. Индекс метилирования генов ПАЯВ2 и ЯАЗБРЫ в циркулирующих ДНК крови у больных раком легкого значимо повышается по сравнению со здоровыми лицами. Для гена ЯАКВ2 характерно повышение уровня и индекса метилирования у больных хронической обструктивной болезнью легких по сравнению со здоровыми донорами.

3. Статус метилирования гена ЯАЯВ2 в циркулирующих ДНК крови коррелирует с распространенностью злокачественного процесса и неблагоприятным исходом у больных раком легкого. Индекс метилирования генов КЛЯВ2, КАЗЗПА в циркулирующих ДНК крови больных раком легкого снижается после проведенного лечения и вновь увеличивается у пациентов с клинически подтвержденным прогрессированием заболевания.

Апробация работы: Основные результаты диссертационной работы были представлены: на 1У-У1 региональных конференциях молодых ученых-онкологов имени академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2009-2011), Российско-Тайванском форуме «Опыт и перспективы развития сотрудничества между российскими и тайваньскими учеными в области изучения молекулярно-генетических механизмов развития злокачественных новообразований и использования результатов фундаментальных исследований в онкологии» (Томск, 2009), VI, VII международных конференциях «Циркулирующие нуклеиновые кислоты в плазме и сыворотке» (Гонг-Конг, Китай, 2009; Мадрид, Испания, 2011), международной конференции «Опухоль и организм: новые аспекты старой проблемы» (Киев, Украина, 2010), научной конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2010), научной конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения-2011» (Санкт-Петербург, 2011), всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Инноватика-2011» с элементами

научной школы для молодежи (Томск, 2011), II международной конференции «Физико-химическая биология» (Новосибирск, 2011), 21-ом ежегодном конгрессе Европейского Общества Респираторной Медицины (Амстердам, Нидерланды, 2011), научной конференции «Актуальные вопросы онкогенетики» (Москва, 2011), IX научной конференции Генетика человека и патология «Актуальные проблемы современной цитогенетики» (Томск, 2011).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 24 печатные работы, в том числе 4 статьи в журналах Перечня ведущих рецензируемых научных изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Структура и объем диссертации: Диссертационная работа изложена на 127 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Данные проиллюстрированы 16 таблицами, 9 рисунками. Библиографический список включает 164 источника, из них 18 работ отечественных авторов.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Пономарева, Анастасия Алексеевна

ВЫВОДЫ

1. Концентрация фрагментов однокопийного гена АСТВ и повторяющихся элементов LINE-1 в цирДНК крови, связанных с клеточной поверхностью, статистически значимо ниже у больных хронической обструктивной болезнью легких (140±42 нг/мл - АСТВ, 65±14 нг/мл -LINE-1) и больных раком легкого (163±20 нг/мл - АСТВ, 47±9 нг/мл -LINE-1), чем у здоровых доноров (294±56 нг/мл - АСТВ, 171±28 нг/мл -LINE-Г) (р<0,05).

2. У больных раком легкого выявлено существенное увеличение уровня метилирования гена RARB2 в цирДНК крови по сравнению со здоровыми донорами (р<0,05). В цирДНК, связанных с клеточной поверхностью, уровень метилирования гена RARB2 повышается в ряду здоровые доноры (1057±211 копий/мл) - больные хронической обструктивной болезнью легких (4853±606 копий/мл) - больные раком легкого (7524±939 копий/мл) (р<0,05).

3. Индекс метилирования генов RARB2 и RASSF1A в цирДНК крови существенно увеличивается у больных раком легкого по сравнению с больными хронической обструктивной болезнью легких и здоровыми донорами (р<0,05).

4. У больных раком легкого III стадии уровень и индекс метилирования гена RARB2 в цирДНК крови статистически значимо выше, чем у больных I-II стадий (р<0,05). Снижение концентрации повторяющихся элементов LINE-1 в цирДНК, связанных с клеточной поверхностью, происходит на более ранних стадиях рака легкого по сравнению с концентрацией фрагментов однокопийного гена АСТВ.

5. У больных раком легкого, имеющих уровень метилирования гена RARB2 в цирДНК плазмы крови ниже порогового значения (3614 копий/мл крови), показатели общей двухлетней выживаемости значимо выше по сравнению с больными, имеющими уровень метилирования более 3614 копий/мл крови (р=0,01).

6. Индекс метилирования генов ЯАКВ2 и ЯАЗБРЫ в цирДНК крови после удаления опухоли статистически значимо снижается по сравнению с показателями до лечения. У больных раком легкого повышение концентрации метилированных аллелей одного или двух генов (.КАЯВ2 и/или ЯАЗЗПА) в процессе мониторинга после лечения сопряжено с выявлением клинических признаков прогрессирования заболевания.

7. Повышение индекса метилирования одного гена (ЯАЯВ2 или ЯАББРМ) или одновременно двух генов (ЯАКВ2 и КАББРЫ) ассоциировано с увеличением концентрации белкового маркера РЭА в крови больных раком легкого (р<0,05), для СУПЗА 21-1 такой ассоциации не выявлено. Анализ индекса метилирования генов ВАББРЫ, ЯАЯВ2 одновременно с определением концентрации белкового маркера СУРКА 21-1 позволяет повысить чувствительность дискриминирования рака легкого с 57 до 94%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рак легкого (PJI) занимает лидирующие позиции по заболеваемости и в структуре общей летальности от онкологических заболеваний у мужчин, и диагностируется, как правило, на поздних стадиях процесса (Харченко и др., 2005; Трахтенберг и др., 2007). Известно, что злокачественная трансформация клеток и опухолевая прогрессия характеризуется приобретением и накоплением в клетке множества генетических и эпигенетических изменений. На сегодняшний день показано, что аберрантное метилирование ДНК является одним из наиболее распространенных и ранних событий, приводящих к злокачественной трансформации клетки при новообразованиях различной локализации, в том числе и при раке легкого (Esteller et al., 2005; Залетаев, 2008). С наибольшей частотой в опухолевой ткани при раке легкого выявляются метилированные аллели генов: RARB2, RASSF1A, CDKN2A, FHIT, АРС (Залетаев, 2008; Fujiwara et al., 2005; Schmiemann et al., 2005; Hsu et al., 2007).

В качестве состояний повышенного риска злокачественных новообразований легких в настоящее время рассматриваются различные дисрегенераторные изменения бронхолегочного эпителия на фоне хронических воспалительных заболеваний легких. Анализ экспрессии онкомаркеров, при различных дисрегенераторных изменениях легочного эпителия на фоне хронических воспалительных заболеваний легких позволяет говорить об их предполагаемом злокачественном потенциале. В качестве онкомаркеров выступают протонкогены, гены опухолевой супрессии и факторы роста (Коган, 2003). Недавно появились данные о том, что эпигенетические факторы играют важную роль в регуляции экспрессии ряда генов опухолевой супрессии при хронических воспалительных заболеваниях легких и могут быть использованы как онкомаркеры (Yang, Schwartz, 2011).

Наиболее перспективным представляется малоинвазивное выявление маркеров прогноза развития предопухолевых изменений, ранней диагностики и прогнозирования клинического течения рака легкого, в биологических жидкостях организма. В последние годы большое внимание уделяется изучению возможности использования внеклеточных ДНК для диагностики и прогноза у больных раком и роли ДНК, циркулирующих в плазме крови, в патогенезе злокачественных новообразований (Laktionov et al., 2004; Van der Drift et al., 2010; Vlassov et al., 2010). В литературе представлены сведения о том, что цирДНК в плазме крови онкологических больных обладают генетическими и эпигенетическими характеристиками, идентичными ДНК опухоли (Jahr et al., 2001; Ziegler et al., 2002; Fiegl et al., 2005 Fleischhacker, Schmidt, 2007). Ранее показано, что внеклеточные ДНК не только свободно циркулируют в плазме крови, но и могут быть адсорбированы на поверхности форменных элементов крови (Laktionov et al., 2004; Tamkovich et al., 2005; Vlassov et al., 2010; Skvortsova et al., 2011), при этом в составе скп-цирДНК выявлялись эпигенетические ДНК-онкомаркеры (Rykova et al., 2006; Kolesnikova et al., 2008; Skvortsova et al., 2008). Концентрация и состав цирДНК определяются сложными взаимодействиями в процессе их образования, циркуляции, элиминации (Korshunova et al., 2008), закономерности которых пока мало изучены.

Одним из признаков злокачественной трансформации является изменение уровня и профиля белковой экспрессии в клетках опухоли, которое сопровождается повышением уровня определенных белков в крови пациентов. Увеличение концентрации опухолевых белков в сыворотке крови и ткани опухоли является следствием накопленных изменений в геноме, приводящих к потере контроля синтеза потенциальных онкогенов. Анализ белковых онкомаркеров в сопоставлении с эпигенетическими изменениями генов опухолевой супрессии представляется актуальным для выявления ассоциации процессов их появления в крови при развитии опухоли.

Все вышесказанное обусловило изучение особенностей концентрации и характера распределения фрагментов цирДНК в крови у больных хронической обструктивной болезнью и раком легких. Проведено исследование эпигенетического статуса генов опухолевой супрессии в сопоставлении с уровнем белковых онкомаркеров, патогенетически значимыми признаками и исходом заболевания.

По данным ПЦР-анализа фрагментов однокопийного гена АСТВ и повторяющихся элементов LINE-1 концентрация цирДНК в плазме не различалась при сравнении больных HMPJI, ХОБЛ и здоровых доноров, что не противоречит результатам других исследований, которые использовали другие методы количественной оценки концентрации (Beau-Faller et al, 2003; Xie et al, 2004; Tamkovich et al, 2008). В то же время концентрация цирДНК, связанных с клеточной поверхностью (скп-цирДНК) значимо снижается при НМРЛ и при ХОБЛ по сравнению со здоровыми донорами.

Формирование пула цирДНК в крови определяется комплексом событий, таких как их генерация в результате клеточной смерти, активной секреции живыми клетками, захват фагоцитами, взаимодействие с клетками крови и эндотелия сосудов, метаболизм в печени и выведение через почки. При развитии опухолей различной локализации могут существенно изменяться различные параметры, участвующие в генерации цирДНК: активность протеаз и ДНК- гидролизующих ферментов крови и тканей, интенсивность процессов клеточной смерти и элиминации продуктов разрушения клеток, разнообразие формы и состава комплексов, в которые входят цирДНК. Проведенные ранее исследования показали, что состав цирДНК отличается от такового геномной ДНК. По данным Stroun с соавт. (2001) соотношение количества фрагментов Alu повторов к количеству фрагментов гена НВВ в цирДНК сыворотки существенно выше по сравнению с геномной ДНК лейкоцитов крови, как в норме, так и при онкологических заболеваниях.

В настоящей работе установлено, что соотношение количества цирДНК по анализу фрагментов гена АСТВ и LINE-1 элементов в плазме крови у здоровых лиц и больных НМРЛ больше 1, что говорит о различиях в относительной представленности этих фрагментов в цирДНК по сравнению с геномной ДНК. Эти данные согласуются с результатами Beck и соавт. (2009), которые методом полногеномного секвенирования показали достоверно более низкий уровень представленности LINE-1 повторов в ДНК сыворотки крови здоровых доноров по сравнению с ДНК генома клеток, в отличие от достоверно более высокого уровня представленности Alu повторов. Следует отметить тот факт, что в цирДНК избыточно представлены фрагменты генома, соответствующие транскрибируемым генам (содержащим Alu повторы), и недостаточно представлены районы молчащего в норме гетерохроматина (содержащие LINE-1 повторы) (Beck et al 2009).

Увеличение соотношения фрагментов АСТВ и LINE-1 в скп-цирДНК крови выявлено только у больных HMPJ1 и не обнаружено у больных ХОБЛ по сравнению со здоровыми донорами, следовательно, происходит только при развитии злокачественного процесса. Выявление изменений в соотношении фрагментов АСТВ к LINE-1 повторам в скп-цирДНК крови при раке легкого говорит об усилении процессов, приводящих к неравномерной селекции фрагментов генома, соответствующих районам активного эухроматина (ген АСТВ), и неактивным участкам конститутивного гетерохроматина {LINE-1 повторы). Можно предполагать, что такое распределение последовательностей однокопийных генов и повторяющихся элементов обусловлено действием различных факторов крови, например степенью выраженности нуклеазной активности в отношении кодирующих и некодирующих последовательностей ДНК (Черепанова и др., 2008; Брызгунова и др., 2010). Еще большее снижение относительного содержания фрагментов, соответствующих LINE-1 повторам, в норме транскрипционно неактивным, при развитии опухоли может быть связано с изменением активности этих участков генома и особенностями секреции ДНК опухолевыми клетками. Полученные результаты имеют практическое значение, поскольку говорят о возможности оптимизации подходов к селекции надежных критериев диагностики РЛ, которые по нашим данным могут быть выявлены не только в кодирующих, но и в некодирующих последовательностях геномной ДНК.

Таким образом, анализ концентрации разных фрагментов геномной ДНК в крови у больных HMPJI и больных ХОБЛ показал, что при развитии заболеваний легкого происходит значимое снижение их концентрации в цирДНК, связанных с клеточной поверхностью. Установлено, что снижение концентрации LINE-1 фрагментов в скп-цирДНК происходит на ранних стадиях НМРЛ (I-Пстадии), тогда как значимое снижение концентрации АСТВ происходит при распространении процесса (III стадия). Поэтому анализ концентрации LINE-1 является перспективным в качестве маркера детекции первичных опухолей, анализ АСТВ может быть применим для оценки стадии заболевания, тогда как анализ соотношения концентраций LINE-1 и АСТВ может служить дополнительным фактором дискриминации доброкачественного (ХОБЛ) и злокачественного процессов.

Можно предполагать, что изучение эпигенетических изменений, ассоциированных со злокачественной трансформацией, в цирДНК крови может обеспечить более высокую эффектвиность выявления маркеров рака легкого. Одним из механизмов, приводящих к злокачественной трансформации, является изменение экспрессии генов вследствие эпигенетических изменений ДНК в результате аберрантного метилирования цитозинов в составе CpG-динуклеотидов. В опухолевой ткани при раке легкого было ранее выявлено гиперметилирование различных генов опухолевой супрессии, среди которых метилирование генов RARB2, RASSF1A характеризовалась высокой частотой (Fujiwara et al., 2005; Kim et al., 2006; Hsu et al., 2007; De Jong et al., 2009). Ген RARB2, который кодирует ядерный рецептор ретиноевой кислоты, необходимой для нормального развития и дифференцировки клеток, был метилирован с частотой до 60% в клетках НМРЛ. В здоровой ткани легких этот показатель не превышал 9% (Hsu et al., 2007). Ген RASSF1A, который участвует в регуляции клеточной пролиферации и апоптоза, а также кодирует фактор, контролирующий клеточный цикл (Vos et al., 2000; Liu et al., 2003), был метилирован с частотой до 50% при HMPJ1 в биоптатах первичной опухоли. У здоровых доноров данный показатель достигал 10% (Hsu et al., 2007; Schmiemann et al., 2005).

Полученные ранее данные о частоте выявления метилированных аллелей генов опухолевой супрессии в плазме крови показывают, что чувствительность и специфичность анализов цирДНК плазмы ниже по сравнению с анализом ДНК тканей. Частота выявления аберрантно метилированных аллелей генов в плазме и сыворотке крови варьирует в зависимости от используемого метода детекции (37-54% - ген RARB2 и 12-39% - ген RASSF1A, соответственно) (Fleischhacker, Schmidt, 2007; Hsu et al., 2007). В связи с этим необходимы дальнейшие исследования эпигенетических изменений в цирДНК крови здоровых людей, больных с хроническими, предопухолевыми и опухолевыми заболеваниями с целью получения новых знаний об особенностях генерации циркулирующих нуклеиновых кислот в норме и их изменении при развитии патологических процессов.

В настоящей работе с целью повышения чувствительности детекции метилированных аллелей генов опухолевой супрессии RASSF1A и RARB2, при помощи количественной МС-ПЦР были определены концентрации метилированных и неметированных аллелей исследуемых генов как в цирДНК плазмы крови, так и в скп-цирДНК, при HMPJI, ХОБЛ и в норме. В исследование были включены образцы ХОБЛ для того, чтобы оценить количественные изменения уровня метилирования исследуемых генов на этапах развития патологического процесса в легких. Были определены концентрации метилированных и неметилированных аллелей генов и вычислен индекс метилирования по соотношению количества метилированных аллелей гена RARB2 к общему количеству аллелей (метилированных и неметилированных) в цирДНК плазмы и в скп-цирДНК.

Выявлено значимое повышение среднего значения концентрации метилированных аллелей гена ЯАЯВ2 в ряду здоровые доноры - больные ХОБЛ

- больные НМРЛ в цирДНК плазмы (1035-3015-3614 копий/мл) и в цирДНК, связанных с клеточной поверхностью (1057 - 4853 - 7524 копий/мл). Количественный анализ неметилированных аллелей гена КАКВ2 позволил выявить закономерности их накопления и распределения между плазмой и связанной с клетками фракцией цирДНК, отличающиеся от характера изменений концентрации метилированных аллелей. Концентрация неметилированных аллелей гена ВАКВ2 не изменяется в ряду здоровые доноры

- больные ХОБЛ - больные НМРЛ в цирДНК плазмы (5381 -3913 - 3496 копий/мл) и увеличивается в скп-цирДНК не так значительно, как концентрация метилированных аллелей (8856 - 15939 - 13812 копий/мл). Можно предполагать, что выявленные различия связаны с особенностями взаимодействия метилированных и неметилированных фрагментов цирДНК с клетками, их способностью к обратимым процессам депонирования на поверхности клеток крови или других тканей, и десорбции с выходом в кровоток (Брызгунова и др., 2010).

Были определены концентрации цирДНК в плазме и в скп-цирДНК в нг/мл исходя из данных об общем количестве аллелей (метилированных + неметилированных) гена КАЯВ2 в этих фракциях (см. пункт 2.2.9). Показано, что концентрация цирДНК по данным о количестве фрагментов 1{АКВ2 в плазме крови не изменяется в ряду здоровые доноры - больные ХОБЛ -больные НМРЛ (42 - 46 - 47 нг/мл), что согласуется с данными по анализу фрагментов АСТВ и ЬШЕ-1 в плазме крови. Напротив, изменения концентрации скп-цирДНК по данным для фрагментов ПАЯВ 2 являются противоположными изменениям, которые выявлены для фрагментов АСТВ и ЬШЕ-1, поскольку в ряду здоровые доноры - больные ХОБЛ - больные НМРЛ происходит увеличение, а не снижение количества исследуемых фрагментов (65 -137-141 нг/мл). Результаты настоящего исследования подтверждают полученные ранее данные о том, что различные участки геномной ДНК неравномерно представлены в пуле цирДНК крови в норме и при развитии злокачественных процессов эта неравномерность может усиливаться в связи с изменением функциональной активности генов и структуры соответствующих участков хроматина (Beck et al., 2009, 2010; Van der Vaart et al., 2009). Такие данные получены как при анализе цирДНК на полногеномном уровне, так и методом количественного ПЦР-анализа заранее выбранных мишеней (Stroun et al., 2001; Puszyk et al., 2009). В работе Puszyk с соавт. (2009) показано, что в плазме 6 здоровых доноров фрагменты, соответствующие 7 участкам геномной ДНК представлены в различной концентрации, причем выявленные изменения соотношения фрагментов были сходны для разных доноров.

Можно предполагать, что одним из существенных факторов, определяющих различия в представленности участков геномной ДНК в крови, является уровень метилирования цитозина в составе CpG-сайтов. Уровень метилирования фрагментов ДНК может влиять как на формирование и состав циркулирующих в крови комплексов ДНК с липопротеинами, так и на эффективность их гидролиза ферментами крови и взаимодействия с клетками крови и эндотелия сосудов (Skvortsova et al., 2008). Недавние исследования показали, что в плазме крови при введении in vivo неметилированные фрагменты ДНК менее устойчивы к действию нуклеаз крови по сравнению с метилированными (Брызгунова и др., 2010).

Проведенный в настоящей работе анализ позволил выявить значимые изменения статуса метилирования исследуемых генов не только в цирДНК плазмы, но и в скп-цирДНК. Определение индекса метилирования (ИМ) каждого из генов в пуле цирДНК (цирДНК плазмы и скп-цирДНК) приводит к улучшению характеристик анализа как для индивидуальных эпигенетических маркеров, так и для их комбинации при дискриминировании HMPJI, ХОБЛ и здоровых доноров. Чувствительность и специфичность дискриминирования больных НМРЛ от здоровых доноров при определении ИМ гена RARB2 в цирДНК плазмы и фракции, связанной с клеточной поверхностью, составила 77% и 72%), при определении ИМ гена RASSF1A составила 81% и 76%, соответственно. В случае дискриминирования больных HMPJI от больных ХОБЛ анализ ИМ генов RARB2 и RASSF1A в цирДНК крови характеризовался чувствительностью 75% и 79%, специфичностью - 70% и 74%, соответственно. Согласно полученным данным чувствительность выявления метилированных аллелей исследуемых генов в цирДНК крови (цирДНК плазмы и скп-цирДНК) сопоставима с чувствительностью детекции этих маркеров в ДНК образцов опухолевой ткани (Fujiwara et al, 2005; Kim et al, 2006; Hsu et al, 2007; De Jong et al, 2009). Одновременная оценка индекса метилирования обоих генов позволяет повысить как чувствительность, так и специфичность анализа. Действительно, превышение порогового значения индекса метилирования хотя бы одного из генов (RASSF1A или RARB2) в цирДНК плазмы и скп-цирДНК позволяет дискриминировать больных НМРЛ от здоровых лиц с чувствительностью 90%> и специфичностью 82%, от больных хронической обструктивной болезнью легких - с чувствительностью 88% и специфичностью 80%.

Установлено, что повышение уровня и индекса метилирования гена RARB2 ассоциировано со стадией заболевания. Средний показатель уровня и индекса метилирования гена как в цирДНК плазмы, так и в скп-цирДНК был значимо выше у больных с III стадией по сравнению с больными I-II стадии заболевания. Ассоциация повышенного индекса метилирования гена RARB2 в пуле цирДНК (цирДНК плазмы и скп-цирДНК) с прогрессией рака легкого может быть обусловлена ростом опухолевой массы, приводящим к увеличению как общего количества фрагментов цирДНК опухолевого происхождения, так и их относительного содержания в пуле цирДНК крови. При этом количественный подход позволяет выявить пороговые значения уровня метилирования гена RARB2 в зависимости от стадии заболевания в отличие от методов качественной МС-ПЦР. Ассоциации между индексом метилирования гена RASSF1A в цирДНК крови (скп-цирДНК и цирДНК плазмы) и распространенностью заболевания не выявлено, что согласуется с данными других исследователей, полученных для цирДНК плазмы крови (Fujiwara et al., 2005).

В исследованиях Schmiemann с соавт. (2005) показано, что индекс метилирования гена RARB2 в цирДНК бронхиальных аспиратов увеличивается у больных HMPJI по сравнению с больными с доброкачественными опухолями легких. Однако данные об изменениях статуса метилирования гена RARB2 в ттирДНК плазмы крови и скп-цирДНК у больных HMPJI в сопоставлении с больными ХОБЛ получены нами впервые. Выявлено повышение индекса метилирования гена RARB2 в скп-цирДНК в следующем ряду: здоровые доноры - больные ХОБЛ - больные НМРЛ. В цирДНК плазмы значимое увеличение выявлено у больных ХОБЛ и НМРЛ по сравнению со здоровыми донорами. Таким образом, увеличение концентрации метилированных аллелей генов RARB2 в скп-цирДНК крови может выступать потенциальным маркером развития опухоли на фоне хронических заболеваний легких. Для гена RASSF1A показано значимое повышение индекса метилирования в цирДНК крови (цирДНК плазмы и скп-цирДНК) только у больных НМРЛ по сравнению с больными ХОБЛ и здоровыми донорами. Таким образом, увеличение RASSF1A связано со злокачественным процессом.

Эпигенетические маркеры являются перспективными онкомаркерами для разработки методов диагностики и прогноза развития болезни для различных локализаций опухолей человека (Gargiulo, Minucci, 2009). Аберрантно метилированные последовательности геномной ДНК в тканях опухоли представляют собой потенциальные биомаркеры для диагностики, стадирования злокачественного процесса, прогноза течения заболевания и мониторинга после проведенного лечения (Lin et al., 2009). Ранее показано, что гиперметилирование гена RARB2 в опухолевой ткани при НМРЛ ассоциировано с низкими показателями 4-х летней выживаемости пациентов (Kim et al, 2004).

Нами впервые получены сведения об ассоциации уровня метилирования гена RARB2 в цирДНК плазмы крови с прогнозом заболевания при HMPJI. В настоящем исследовании показано, что уровень метилирования гена RARB2, превышающий пороговое значение в цирДНК плазмы крови, ассоциирован с неблагоприятным прогнозом у больных HMPJI. Для скп-цирДНК такая связь обнаружена на уровне тенденции. На основании результатов представляются перспективными пролонгированные исследования с целью выявления такой взаимосвязи для цирДНК крови (цирДНК плазмы и скп-цирДНК). Таким образом, увеличение концентрации метилированых аллелей гена опухолевой супрессии RARB2 в крови связано не только с ранними этапами развития злокачественного процесса, но и с прогрессией заболевания, что говорит о вкладе этих нарушений в патогенез HMPJI.

В настоящей работе показано, что после удаления опухоли у 90% пациентов с HMPJI уровень метилирования гена RARB2 и гена RASSF1A в цирДНК плазмы и скп-цирДНК снижался по сравнению с уровнем до лечения. Эти данные подтверждают предположение о том, что увеличение уровня метилированного гена RARB2 во фракциях цирДНК крови обусловлено присутствием в организме опухоли, удаление которой приводит к возвращению этого параметра к нормальному уровню. Время полувыведения циркулирующих ДНК из плазмы крови, по данным Diel с соавт. (2008), составляет не более 2-х часов, что согласуется с результатами других исследований (Goebel et al., 2005; Fleischhacker, Schmidt, 2007), в которых также было показано быстрое падение концентрации цирДНК, происходящей из опухолевых клеток, после оперативного вмешательства. На этапах послеоперационного мониторинга при оценке количественных изменений уровня метилирования исследуемых генов в сопоставлении с данными клинического обследования, показано, что у всех больных HMPJI, характеризующихся повышением концентрации метилированных аллелей одного или двух генов (RARB2 и/или RASSF1A) инструментальными и гистологическими методами было выявлено прогрессирование опухолевого процесса.

Таким образом, представленные нами результаты свидетельствуют о связи статуса метилирования генов опухолевой супрессии RARB2 и RASSF1A с признаками опухолевой прогрессии, что подтверждает значимость данного показателя для оценки эффективности проводимого комбинированного лечения и мониторинга пациентов с целью раннего выявления рецидивов при HMPJI.

Одной из задач настоящей работы являлось выявление ассоциации повышенного уровня эпигенетических (метилированных аллелей генов RARB2 и RASSF1A) и белковых онкомаркеров РЭА и CYFRA 21-1 в плазме крови больных раком легкого. Для этого определяли концентрацию белковых маркеров РЭА, CYFRA 21-1 при помощи стандартных коммерческих наборов в крови тех же больных раком легкого и здоровых лиц, у которых исследовали уровень метилирования генов. Следует отметить, что иммунохимический анализ онкомаркеров РЭА, CYFRA 21-1, используемый в практической медицине, имеет только вспомогательное значение для диагностики рака легкого, поскольку несмотря на относительно высокую специфичность (до 97%), белковые онкомаркеры не обладают достаточной чувствительностью (не более 60%) (Holdenrieder et al., 2008).

Результаты, полученные при определении белковых маркеров в плазме крови больных HMPJI, согласуются с данными других исследователей (Molina et al, 2005). Показано, что повышенный уровень РЭА наблюдался значительно чаще в группе больных с аденокарциномой по сравнению с группой больных с ПКРЛ. Была выявлена тенденция к повышению уровня CYFRA 21-1 в крови у больных НМРЛ III стадии заболевания по сравнению I-II стадией, что не противоречит уже имеющимся литературным данным (Vollmer et al., 2003; Molina et al., 2005; Holdenrieder et al., 2008). Иммунохимический анализ комбинации 2-х белковых онкомаркеров РЭА и CYFRA 21-1 характеризовался специфичностью 97%. Однако при этом чувствительность данного анализа не превышала 57%, тогда как чувствительность метода, основанного на анализе статуса метилирования промоторных областей генов 1(АКВ2, ЯАЗБЕМ в ттирДНК крови в образцах тех же больных раком легкого составляла 90%.

Проведено сопоставление изменений уровня анализ ассоциации между концентрациями эпигенетических и белковых маркеров в крови больных НМРЛ. Показано, что повышение индекса метилирования одного гена (ЯАКВ2 или ЯА88Е1А) или двух генов (ЯАЯВ2 и ЯА88Р1А) ассоциировано с увеличением концентрации белкового маркера РЭА. Статистически значимой ассоциации между индексом метилирования исследуемых генов и концентрацией белкового маркера СУЕИА 21-1 не выявлено. Отсутствие значимой ассоциации между индексом метилирования одного гена (ЯАЯВ2 или ЯА88Р1А) либо двух генов (ВАЯВ2 и ЯА88Р1А) и концентрацией белкового маркера СУРИА 21-1 позволяет предполагать, что эти показатели могут быть использованы в качестве независимых, дополняющих друг друга маркеров, отражающих разные стороны патогенеза рака легкого. В результате их использования в комбинации показано повышение чувствительности и специфичности дискриминации больных НМРЛ от здоровых лиц, что подтверждается увеличением показателя вероятности положительного результата диагностического исследования (ЬЯ +).

При исследовании динамики количественных изменений эпигенетических и белковых маркеров показано, что у больных НМРЛ с признаками опухолевой прогрессии (выявленными клинически через 9 месяцев после лечения) наблюдается повышение концентрации метилированных аллелей генов ЯАЯВ2 и ЯА88ПА в 100% (5/5) случаев, тогда как увеличение уровня белкового маркера РЭА наблюдалось только в 40% случаев (2/5). Полученные данные свидетельствуют о том, что анализ эпигенетических маркеров (метилированные аллели генов ЯАКВ2, ЯА88Р1А) может быть более информативным по сравнению с использованием белкового маркера РЭА для выявления ранних признаков прогрессирования.

Таким образом, полученные данные об изменении концентрации и распределения фрагментов генов АСТВ, 1МЯВ2 и ЬШЕ-1 повторов в цирДНК крови больных НМРЛ по сравнению со здоровыми лицами свидетельствуют о неоднородности представленности в цирДНК крови фрагментов, соответствующих различным участкам геномной ДНК, которая может усиливаться при развитии хронических заболеваний и опухолевых процессов в легких.

Выявлена ассоциация статуса метилирования генов ЯАКВ2 и ВАББЕМ в цирДНК крови (цирДНК плазмы и скп-цирДНК) с клинико-патологическими особенностями НМРЛ, что подтверждает патогенетическую значимость изучаемого показателя. Повышение чувствительности метода МС-ПЦР за счет анализа цирДНК крови открывает новые перспективы использования этого подхода в разработке надежного малоинвазивного диагностического теста. Сочетание эпигенетических и белковых маркеров приводит к повышению чувствительности и специфичности дискриминирования больных злокачественными опухолями легкого от здоровых людей. Представляется перспективным использование анализа изученных в работе эпигенетических маркеров в цирДНК крови с целью оценки эффективности проводимого лечения и на этапах динамического наблюдения для раннего выявления рецидива при НМРЛ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Пономарева, Анастасия Алексеевна, 2012 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Аксель Е.М. Заболеваемость и смертность от рака легкого в России // Новое в терапии рака легкого (терапия рака легкого начала XXI века) / ред. Н.И. Переводчикова. - М.: РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН, 2003. -С. 8-16.

2. Брызгунова O.E., Мак В.В., Власов В.В., Лактионов П.П. Исследование стабильности и циркуляции метилированных ДНК - потенциальных онкомаркеров in vivo и in vitro II Молекуляр. медицина. - 2010. - № 5. -С. 42-47.

3. Букурова Ю.А., Ханкин С.Л., Краснов Г.С. и др. Оценка эффективности идентификации белковых маркеров опухолей толстой кишки методами 2Б-анализа и биоинформатического поиска // Молекуляр. биология. -2010. - Т. 44, № 2. - С. 375-381.

4. Залетаев Д.В. Системы молекулярных маркеров в ДНК-диагностике онкозаболеваний // Молекуляр. медицина. - 2005. - № 1. - С. 10-17.

5. Залетаев Д.В., Немцова М.В., Стрельников В.В. Эпигенетическая регуляция экспрессии генов в процессах канцерогенеза // Молекуляр. Медицина. - 2008. - № 4. - С. 46-51.

6. Краснов Г.С., Ханкин С.Л., Букурова Ю.А. и др. Протеом злокачественных опухолей толстой кишки человека: идентификация растворимых белков с повышенным содержанием в опухоли // Молекуляр. биология. - 2009. - Т. 43, № 4. - С. 610-615.

7. Лебедев И.Н., Саженова Е.А. Эпимутации импринтированных генов в геноме человека: классификация, причины возникновения, связь с наследственной патологией // Генетика. - 2008. - Т. 44, № 10. - С. 13561373.

8. Лихтенштейн A.B., Киселева Н.П. Метилирование ДНК и канцерогенез // Биохимия. - 2001. - Т.66, вып. 3. - С. 293-317.

9. Лихтенштейн A.B., Потапова Г.И. Генетические дефекты как маркеры опухолевого роста // Молекуляр. биология. - 2003. - Т. 37, № 2. -С. 181-193.

10. Мерабишвили В.М. Выживаемость онкологических больных. - Спб.: ООО «Фирма КОСТА», 2006. - С. 440.

11. Морозкин Е.С., Сильников В.Н., Рыкова Е.Ю. и др. Внеклеточная ДНК в культуре первичных и трансформированных клеток, инфицированных и неинфицированных микоплазмой // Бюлл. экспер. мед. - 2009. - Т. 147. -С. 67-70.

12. Пальцев М.А., Залетаев Д.В. Системы генетических и эпигенетических маркеров в диагностике злокачественных заболеваний. - М.: ОАО Изд-во Медицина, 2009. - 384 с.

13. Пузырев В.П. Феномо-геномные отношения и патогенетика многофакторных заболеваний // Вестник Российской Академии медицинских наук. - 2011. - № 9. - С. 17-27.

14. Рыкова Е.Ю., Скворцова Т.Э., Хоффман А.Л. и др. Циркулирующие внеклеточные ДНК и РНК крови в диагностике опухолей молочной железы // Биомед. химия. - 2008. - Т. 54, №1. - С. 94-103.

15. Трахтенберг А.Х., Колбанов К.И., Вурсол Д.А. Расширенные и комбинированные операции при местно-распространенном немелкоклеточном раке легкого // Российский онкологический журнал: научно-практический журнал. - 2007. - № 2. - С. 9-13.

16. Тюляндин С.А. Перспективные подходы лекарственной терапии немелкоклеточного рака легкого // Новое в терапии рака легкого (терапия рака легкого начала XXI века) / ред. H.H. Переводчикова. - М.: РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН, 2003. - С. 118-128.

17. Харченко В.П., Чхиквадзе В.Д., Гваришвили A.A. Реконструктивные операции при немелкоклеточном раке легкого // Современные

технологии в онкологии: Материалы VI всероссийского съезда онкологов. - Т. 1-М, 2005. - С. 316.

18. Чиссов В.И. Организация онкологической службы в России: (методические рекомендации, пособия для врачей). - М.: Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П. А. Герцена, 2007. - 660 с.

19. Andriani F., Conte D., Mastrangeto Т. et al. Detecting lung cancer in plasma with the use of multiple genetic markers // Int. J. Cancer. - 2004. - Vol. 108, N1.-P. 91-96.

20. Angeloni D. Molecular analysis of deletions in human chromosome 3p21 and the role of resident cancer genes in disease // Brief Func. Genomics Proteomics. - 2007. - Vol. 6, N 1. - P. 19-39.

21. Anglim P.P., Alonzo T.A., Laird-Offringa I.A. DNA methylation-based biomarkers for early detection of non-small cell lung cancer: an update // Mol. Cancer. - 2008. - Vol. 81, N 7. - P. 1-13.

22. Anker P., Mulcahy H., Stroun M. Circulating nucleic acids in plasma and serum as a noninvasive investigation for cancer: time for large-scale clinical studies? // Int. J. Cancer. - 2003. - Vol. 103, N 2. - P. 149-152.

23. Baryshnikova E., Destro A., Infante M.V. et al. Molecular alterations in spontaneous sputum of cancer-free heavy smokers: results from a large screening program // Clin. Cancer Res. - 2008. - Vol. 14, N 6. - P. 1913— 1919.

24. Baylin S.B., Herman J.G., Graff J.R. et al. Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect of neoplasia // Adv. Cancer Res. - 1998. - Vol. 72. -P. 141-196.

25. Baylin S.B., Herman J.G. DNA hypermethylation in tumorigenesis epigenetics joins genetics // Trends Genet. - 2000. - Vol. 16, N 4. - P. 168174.

26. Beau-Faller M., Gaub M.P., Schneider A. et al. Plasma DNA microsatellite panel as sensitive and tumor-specific marker in lung cancer patients // Int. J. Cancer. - 2003. - Vol. 105, N 3. - P. 361-370.

27. Beck J., Urnovitz H.B., Riggert J. et al. Profile of the circulating DNA in apparently healthy individuals // Clin. Chem. - 2009. - Vol. 55, N 4. -P. 730-738.

28. Beck J., Urnovitz H.B., Mitchell W.M. et al. Next generation sequencing of serum circulating nucleic reveals differences to healthy and nonmalignant controls acids from patients with invasive ductal breast cancer // Mol. Cancer Res. - 2010. - Vol. 8, N 3. - P. 335-342.

29. Belinsky S.A., Klinge D.M., Dekker J.D. et al. Gene promoter methylation in plasma and sputum icreases with lung cancer risk // Clin. Cancer Res. - 2005. -Vol. 15, N 18. -P. 6505-6511.

30. Belinsky S.A., Liechty K.C., Gentry F.D. et al. Promoter hypermethylation of multiple genes in sputum precedes lung cancer incidence in a high-risk cohort // Cancer Res. - 2006. - Vol. 66, N 6. - P. 3338-3344.

31. Belinsky S.A., Grimes M.J., Casas E. et al. Predicting gene promoter methylation in non-small cell lung cancer by evaluating sputum and serum // Brit. J. Cancer. - 2007. - Vol. 96, N 8. - P. 1278-1283.

32. Bibikova M., Lin Z., Zhou L. et al. High-throughput DNA methylation profiling using universal bead arrays // Genome Res. - 2006. - Vol. 16, N 3. -P. 383-393.

33. Bird A. DNA methylation patterns and epigenetic memory // Genes Dev. -2002.-Vol. 16,N1.-P. 6-21.

34. Brena R.M., Morrison C., Liyanarachchi S. et al. Aberrant DNA methylation of OLIG1, a novel prognostic factor in non-small cell lung cancer // PloS Med. - 2007. - Vol. 4, N 3. - P. el08.

35. Brooks K.R., To K., Joshi B.M. et al. Measurement of chemoresistance markers in patients with stage III non-small cell lung cancer: a novel

approach for patient selection // Ann. Thorac. Surg. - 2003. - Vol. 76, N 1. -P. 187-193.

36. Buhrens R.I., Amelung J.T., Reymond M.A., Beshay M. Protein expression in human non-small cell lung cancer: a systematic database // Pathobiol. - 2009. -Vol. 76, N6.-P. 277-285.

37. Caiafa P., Zampieri M. DNA methylation and chromatin structure: the puzzling CpG islands // Cell Biochem. - 2005. - Vol. 94, N 2. - P. 257-265.

38. Chan K.C., Leung S.F., Yeung S.W. et al. Persistent aberrations in circulating DNA integrity after radiotherapy are associated with poor prognosis in nasopharyngeal carcinoma patients // Clin. Cancer Res. - 2008. - Vol. 14, N 13.-P. 4141-4145.

39. Chang Y.L., Wu C.T., Lin S.C. et al. Clonality and prognostic implications of TP53 and epidermal growth factor receptor somatic aberrations in multiple primary lung cancers // Clin. Cancer Res. - 2007. - Vol. 13, N 1. - P. 52-58.

40. Chen H., Suzuki M., Nakamura Y. et al. Aberrant methylation of RASGRF2 and RASSF1A in human non-small cell lung cancer // Oncol. Rep. - 2006. -Vol. 15, N5.-P. 1281-1285.

41. Chen R.Z., Pettersson U., Beard C. et al. DNA hypomethylation leads to elevated mutation rates // Nature. - 1998. - Vol. 395, N 6697. - P. 89-93.

42. Chen T., Tsujimoto N., Li E. The PWWP domain of Dnmt3a and Dnmt3b is required for directing DNA methylation to the major satellite repeats at pericentric heterochromatin // Mol. Cell Biol. - 2004. - Vol. 24, N 20. -P. 9048-9058.

43. Chen X., Ba Y., Ma L. et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases // Cell Res. - 2008. - Vol. 18, N 10.-P. 997-1006.

44. Cherepanova A.V., Tamkovich S.N., Bryzgunova O.E. et al. Deoxyribonuclease activity and circulating DNA concentration in blood

plasma of patients with prostate tumors // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2008. - Vol. 1137.-P. 218-221.

45. Cho W.C. Role of miRNAs in lung cancer // Expert Rev. Mol. Diagn. - 2009. - Vol. 9, N 8. - P. 773-776.

46. Christensen B.C., Marsit C.J., Houseman E.A. et al. Differentiation of lung adenocarcinoma, pleural mesothelioma, and nonmalignant pulmonary tissues using DNA methylation profiles // Cancer Res. - 2009. - Vol. 69, N 15. -P. 6315-6321.

47. De Jong W.K., Verpooten G.F., Kramer H. et al. Promoter methylation primarily occurs in tumor cells of patients with non-small cell lung cancer // Anticancer Res. - 2009. - Vol. 29, N 1. - P. 363-370.

48. Deeks J.J., Altman D.G. Diagnostic tests 4: likelihood ratios // BMJ. - 2004. -Vol. 329, N 7458. - P. 168-169.

49. Diehl F., Schmidt K., Choti M.A. et al.Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics // Nature Med. - 2008. - Vol. 14, N 9. - P. 985-990.

50. Duffy M.J., Napieralski R., Martens J.W. et al. Methylated genes as new cancer biomarkers // Eur. J. Cancer. - 2009. - Vol. 45, N 3. - P. 335-346.

51. Egger G., Liang G., Aparicio A., Jones P.A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy // Nature. - 2004. - Vol. 429, N 6990. -P. 457-463.

52. Esteller J.G. Aberrant DNA methylation as a cancer-inducing mechanism // Annu Rev. Pharmacol. Toxicol. - 2005. - Vol. 45. - P. 629-656.

53. Esteller M. Epigenetics in cancer // N. Engl. J. Med. - 2008. - Vol. 358, N11. -P. 1148-1159.

54. Fackler M.J., Veigh M., Mehrotra J. et al. Quantitative multiplex methylation-specific PCR assay for the detection of promoter hypermethylation in multiple genes in breast cancer // Cancer Res. - 2004. - Vol. 64, N 13. - P. 44424452.

55. Fawcett T. An introduction to ROC analysis // Pattern Recognition Letters 27. -2006.-P. 861-874.

56. Feng Q., Hawes S.E., Stern J.E. et al. DNA methylation in tumor and matched normal tissues from non-small cell lung cancer patients // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. - 2008. - Vol. 17, N 3. - P. 645-654.

57. Fiegl H., Millinger S., Mueller-Holzner E. et al. Circulating tumor-specific DNA: a marker for monitoring efficacy of adjuvant therapy in cancer patients //Cancer Res. -2005. -Vol. 65, N4.-P. 1141-1145.

58. Fischer K., Loertzer H., Fornara P. The use of comlexed PSA for the early of detection of prostate cancer // Anticancer Research. - 2005. - Vol. 25, N 3A. -P. 1591-1596.

59. Fleischhacker M., Schmidt B. Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer-a survey // Biochim. Biophys. Acta. - 2007. - Vol. 1775, N 1. - P. 181-232.

60. Fujiwara K., Fujimoto N., Tabata M. et al. Identification of epigenetic aberrant promoter methylation in serum DNA is useful for early detection of lung cancer // Clin. Cancer Res. - 2005. - Vol. 11, N 3. - P. 1219-1225.

61. Gargiulo G., Minucci S. Epigenomic profiling of cancer cells // Int. J. Biochem. Cell Biol. - 2009. - Vol. 41, N 1. - P. 127-135.

62. Ghoshal K., Datta J., Smith D.S. et al. Role of DNA methyltransferases in regulation of human ribosomal RNA gene transcription // J. Biol. Chem. 2006. - Vol. 281, N 31. - P. 22062-22072.

63. Goebel G., Zitt M., Zitt M., Muller H.M. Circulating nucleic acids in plasma or serum (CNAPS) as prognostic and predictive markers in patients with solid neoplasias // Dis. Markers. - 2005. - Vol. 21, N 3. - P. 105-120.

64. Granville C.A., Dennis P.A. An overview of lung cancer genomics and proteomics // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. - 2005. - Vol. 32, N 3. - P. 169176.

65. Greenman C., Stephens P., Smith R. et al. Patterns of somatic mutation in human cancer genomes // Nature. - 2007. - Vol. 446, N 7132. - P. 153-158.

66. Grote H.J, Schmiemann V, Geddert H. et al. Aberrant promoter methylation of CDKN2A, RARB2 and SEMA3B in bronchial aspirates from patients with suspected lung cancer // Int J Cancer. - 2005. - Vol. 116, N 5. - P. 720-725.

67. Grote H.J. Aberrant promoter methylation as biomarker for molecular cytological diagnosis of lung cancer // Verh. Dtsch. Ges. Pathol. - 2006. -Vol. 90.-P. 216-226.

68. Gu J, Berman D, Lu C. et al. Aberrant promoter methylation profile and association with survival in patients with non-small cell lung cancer // Clin Cancer Res. - 2006. - Vol. 12, N 24. - P. 7329-7338.

69. Hagiwara N, Mechanic L.E, Trivers G.E. et al. Quantitative detection of p53 mutations in plasma DNA from tobacco smokers // Cancer Res. - 2006. -Vol. 66, N 16.-P. 8309-8317.

70. Han S.W, Kim T.Y, Jeon Y.K. et al. Optimization of patient selection for gefitinib in non-small cell lung cancer by combined analysis of epidermal growth factor receptor mutation, K-RAS mutation, and Akt phosphorylation // Clin. Cancer Res. - 2006. - Vol. 12, N 8. - P. 2538-2544.

71. Haussmann, H.J. Smoking and lung cancer: future research directions // Int. J. Toxicol. - 2007. - Vol. 26, N 4. - P. 353-364.

72. Heller G, Zielinski C.C, Zochbauer-Muller S. Lung cancer: From singlegene methylation to methylome profiling // Cancer Metastasis Rev. - 2010. -Vol. 29, N 1. - P. 95-107.

73. Herman J.G, GraffJ.R, Myohanen S. et al. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1996. - Vol. 93, N 18. - P. 9821-9826.

74. Herman J.G. Hypermethylation of tumor suppressor genes in cancer // Semin. Cancer Biol. - 1999. - Vol. 9, N 5. - P. 359-367.

75. Herman J.G, Baylin S.B. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation // N. Engl. J. Med. - 2003. - Vol. 349, N 21. -P. 2042-2054.

76. Holdenrieder S., von Pawel J., Dankelmann E. et al. Nucleosomes, ProGRP, NSE, CYFRA 21-1, and CEA in monitoring first line chemotherapy of small cell lung cancer // Clin. Cancer Res. - 2008. - Vol. 14, N 23. - P. 7813-7821.

77. Holdenrieder S., von Pawel J., Dankelmann E. et al. Nucleosomes and CYFRA 21-1 indicate tumor response after one cycle of chemotherapy in recurrent non-small cell lung cancer // Lung Cancer. - 2009. - Vol. 63, N 1. -P. 128-135.

78. Hsu H.S., Wen C.K., Tang Y.A. et al. Promoter hypermethylation is the predominant mechanism in hMLHl and hMSH2 deregulation and is a poor prognostic factor in nonsmoking lung cancer // Clin. Cancer Res. - 2005. -Vol. 11,N 15.-P. 5410-5416.

79. Hsu H.S., Chen T.P., Hung C.H. et al. Characterization of a multiple epigenetic marker panel for lung cancer detection and risk assessment in plasma // Cancer. - 2007. - Vol. 110, N 9. - P. 2019-2026.

80. Jakupciak J.P., Maragh S., Markowitz M.E. et al. Performance of mitochondrial DNA mutations detecting early stage cancer // BMC Cancer. -2008.-Vol. 8.-P. 285.

81. Jahr S., Hentze H., Englisch S. et al. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells // Cancer Res. - 2001. - Vol. 61, N 4. - P. 1659-1665.

82. Jirtl R.L. Genomic imprinting and cancer // Exp. Cell Res. - 1999. - Vol. 248, N l.-P. 18-24.

83. Joseph B., Mamatha G., Raman G. et al. Methylation status of RBI promoter in Indian retinoblastoma patients // Cancer Biol. Ther. - 2004. - Vol. 3, N 2. -P. 184-187.

84. Kazazian H.H., Klein G., Moser H.W. et al. Methyl-CpG binding protein // Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine. - 2002. - Vol 3. - P. 20692071.

85. Keohavong P., Lan Q., Gao W.M. et al. Detection of TP 53 and K-RAS mutations in sputum of individuals exposed to smoky coal emissions in Xuan Wei County, China // Carcinogenesis. - 2005. - Vol. 26, N 2. - P. 303-308.

86. Kim J.S., Lee H., Kim H. Promoter methylation of RARB2 and the development of second primary lung cancers in non-small-cell lung cancer // J. Clin. Oncol. - 2004. - Vol. 22, N 17. - P. 3443-3450.

87. Kim J.S., Kim J.W., Han J. et al. Cohypermethylation of CDKN2A and FHIT promoters as a prognostic factor of recurrence in surgically resected stage I non-small cell lung cancer // Cancer Res. - 2006. - Vol. 66, N 8. - P. 40494054.

88. Kim S.H., Park J., Choi M.C. et al. Zinc-fingers and homeoboxes 1 (ZHX1) binds DNA methyltransferase (DNMT) 3B to enhance DNMT3B-mediated transcriptional repression // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2007. - Vol. 355,N2.-P. 318-323.

89. Klose R.J., Bird A.P. Genomic DNA methylation: the mark and its mediators // Trends Biochem. Sci. - 2006. - Vol. 31, N 2. - P. 89-97.

90. Kolesnikova E.V., Tamkovich S.N., Bryzgunova O.E. et al. Circulating DNA in the blood of gastric cancer patients // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2008. -Vol. 1137.-P. 226-231.

91. Korshunova Y., Maloney R.K., Lakey N. et al. Massively parallel bisulphite pyrosequencing reveals the molecular complexity of breast cancer-associated cytosine-methylation patterns obtained from tissue and serum DNA // Genome Res.-2008.-Vol. 18,N l.-P. 19-29.

92. Laktionov P.P., Tamkovich S.N., Rykova E.Y. et al. Cell-surface-bound nucleic acids: free and cell-surface-bound nucleic acids in blood of healthy donors and breast cancer patients // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2004. -Vol. 1022.-P. 221-227.

93. Li E., Beard C., Jaenisch R. Role for DNA methylation in genomic imprinting // Nature. - 1993. - Vol. 366, N 6453. - P. 362-365.

94. Licchesi J.D., Westra W.H., Hooker C.M., Herman J.G. Promoter hypermethylation of hallmark cancer genes in atypical adenomatous hyperplasia of the lung // Clin. Cancer Res. - 2008. - Vol. 14, N 9. - P. 25702578.

95. Lichtenstein A.V., Melkonyan H.S., Tomei L.D., Umansky S.R. Circulating nucleic acids and apoptosis // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2001. - Vol. 945. -P. 239-249.

96. Lin H.J., Zuo T., Chao J.R. et al. Seed in soil, with an epigenetic view // Biochim. Biophys. Acta. - 2009. - Vol. 1790, N 9. - P. 920-924.

97. Liu L., Tommasi S., Lee D.H. et al.Control of microtubule stability by the RASSF1A tumor suppressor // Oncogene. - 2003. - Vol. 22, N 50. - P. 81258136.

98. Liu E.T., Kuznetsov V.A., Miller L.D. In the pursuit of complexity: systems medicine in cancer biology // Cancer Cell. - 2006. - Vol. 9, N 4. - P. 245247.

99. Luczak M.W., Jagodzinski P.P. The role of DNA methylation in cancer development // Folia Histochem Cytobiol. - 2006. - Vol. 4, N 3. - P. 143154.

100. Maheswaran S., Sequist L.V., Nagrath S. et al. Detection of mutations in EGFR in circulating lung cancer cells // N. Engl. J. Med. - 2008. - Vol. 359, N4.-P. 366-377.

101.Mannino D.M. Chronic obstructive pulmonary disease: definition and epidemiology // Respir. Care. - 2003. - Vol. 48, N 12. - P. 1185-1191.

102. Meuwissen R., Berns A. Mouse models for human lung cancer // Genes Dev. - 2005. - Vol. 19, N 6. - P. 643-664.

103.Michor F. Chromosomal instability and human cancer // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. - 2005. - Vol. 360, N 1455. - P. 631-635.

104. Minna J.D., Roth J.A., Gazdar A.F. Focus on lung cancer // Cancer Cell. -2002.-Vol. 1,N 1. -P. 49-52.

105. Molina R., Auge J.M., Filella X. et al. Progastrin-releasing peptide (ProGRP) in patients with benign and malignant diseases: comparison with CEA, SCC, CYFRA 21-1 and NSE in patients with lung cancer // Anticancer Res. - 2005.

- Vol. 25, N 3A. - P. 1773-1778.

106. Morozkin E.S., Babochkina T.I., Vlassov V.V., Laktionov P.P. The effect of protein transport inhibitors on the production of extracellular DNA // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2008. - Vol. 1137. - P. 31-35.

107. Mutti A. Molecular diagnosis of lung cancer: an overview of recent developments // Acta Biomed. - 2008. - Vol. 79, Suppl. 1. - P. 11-23.

108. Nisman B., Biran H., Ramu N. et al. The diagnostic and prognostic value of ProGRP in lung cancer // Anticancer Res. - 2009. - Vol. 29, N 11. - P. 48274832.

109. Ocak S., Sos M.L., Thomas R.K., Massion P.P. High-throughput molecular analysis in lung cancer: insights into biology and potential clinical applications // Eur. Respir. J. - 2009. - Vol. 34, N 2. - P. 489-506.

110. Palmisano W.A., Crume K.P., Grimes M.J. et al. Aberrant promoter methylation of the transcription factor genes PAX5 alpha and beta in human cancers // Cancer Res. - 2003. - Vol. 63, N 15. - P. 4620-4625.

111. Pan H., Califano J., Ponte J.F. et al. Loss of heterozygosity patterns provide fingerprints for genetic heterogeneity in multistep cancer progression of tobacco smoke-induced non-small cell lung cancer // Cancer Res. - 2005. -Vol. 65,N5.-P. 1664-1669.

112. Park M.S., Ma C., Aziz M.U. et al. Genomic copy number alterations in non-small cell lung cancers identified using CBS and MSA // J. Clinic. Oncology.

- 2007. - Vol. 25, N 18. - P. 7695-7700.

113. Parkin D.M., Freddie B., Ferlay J., Pisani P. Global Cancer Statistics, 2002 // CA Cancer J. Clin. - 2005. - Vol. 55, N 2. - P. 74-108.

114. Pathak A.K., Bhutani M., Kumar S., Mohan A., Guleria R. Circulating cellfree DNA in plasma/serum of lung cancer patients as a potential screening and prognostic tool // Clin. Chem. - 2006. - Vol. 52, N 10. - P. 1833-1842.

115. Plass C. Cancer epigenomics // Human Molecular Genetics. - 2002. - Vol. 11, N. 20. - P. 2479-2488.

116. Puszyk W.M., Crea F., Old R.W. Unequal representation of different unique genomic DNA sequences in the cell-free DNA of individuals donors // Clin. Biochem. - 2009. - Vol. 42, N 7-8. - P. 736-738.

117. Rauch T.A., Zhong X., Wu X. et al. High-resolution mapping of DNA hypermethylation and hypomethylation in lung cancer // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.-2008.-Vol. 105, N l.-P. 252-257.

118. Richardson B. DNA methylation and autoimmune disease // Clin. Immunol. -2003. - Vol. 109, N 1. - P. 72-79.

119. Robertson K.D., Jones P.A. DNA methylation: past, present and future directions // Carcinogenesis. - Vol. 21, N 3. - P. 461-467.

120. Rom W.N., Hay J.G., Lee T.C., et al. Molecular and genetic aspects of lung cancer // Am J Respir Crit Care Med. - 2000. - Vol. 161, №4. _ p. 13551367.

121. Russo A.L., Thiagalingam A., Pan H. et al. Differential DNA hypermethylation of critical genes mediates the stage-specific tobacco smoke-induced neoplastic progression of lung cancer // Clin. Cancer Res. - 2005. -Vol. 11, N 7 - P. 2466-2470.

122. Ryan G., Steel-Perkins V., Morris J.F. et al. Repression of Pax-2 by WT1 during normal kidney development // Development. - 1995. - Vol. 21, N 3. -P. 867-875.

123. Salaun M., Sesboue R., Moreno-Swire S. et al. Molecular predictive factors for progression of high-grade preinvasive bronchial lesions // Am. J. Respir. Crit. Care Med.-2008.-Vol. 177, N8.-P. 880-886.

124. Sartori G, Cavazza A, Sgambato A. et al. EGFR and K-RAS mutations along the spectrum of pulmonary epithelial tumors of the lung and elaboration of a combined clinicopathologic and molecular scoring system to predict clinical responsiveness to EGFR inhibitors // Am. J. Clin. Pathol. - 2009. - Vol. 131, N4.-P. 478-489.

125. Schmiemann V, Bocking A, Kazimirek M. et al. Methylation assay for the diagnosis of lung cancer on bronchial aspirates: a cohort study // Clin. Cancer Res. - 2005. - Vol. 11, N 21. - P. 7728-7734.

126. Shames D.S, Gao M, Lewis C.M. et al. A genome-wide screen for promoter methylation in lung cancer identifies novel methylation markers for multiple malignancies // PloS. Med. - 2006. - Vol. 3, N 12. - P. e486.

127. Sinchaikul S, Hongsachart P, Sriyam S. et al. Current proteomic analysis and post-translational modifications of biomarkers in human lung cancer materials // Chang Gung Med. J. - 2008. - Vol. 31, N 5. - P. 417-430.

128. Skvortsova T.E, Rykova E.Y, Tamkovich S.N. et al. Cell-free and cell-bound circulating DNA in breast tumours: DNA quantification and analysis of tumour-related gene methylation // Br. J. Cancer. - 2006. - Vol. 94, N 10. -P. 1492-1495.

129. Skvortsova T.E, Vlassov V.V, Laktionov P.P. Binding and penetration of methylated DNA into primary and transformed human cells // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2008. - Vol. 1137. - P. 36^10.

130. Skvortsova T.E, Bryzgunova O.E, Lebedeva A.O. et al. Methylated cell-free DNA in vitro and in vivo II Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum / In: Gahan P.B, editor. - United Kindom: Springer, 2011. - P. 185-194.

131. Steiling K, Ryan J, Brody J.S, Spira A. The field of tissue injury in the lung and airway // Cancer Prev. Res. - 2008. - Vol. 1, N 6. - P. 396-403.

132. Stroun M, Lyautey J, Lederrey C. et al. Alu repeat sequences are present in increased proportions compared to a unique gene in plasma/serum DNA // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2001. - Vol. 945. - P. 258-264.

133. Stroun M., Anker P. Circulating DNA in higher organisms cancer detection brings back to life an ignored phenomenon // Cell Mol. Biol. - 2005. - Vol. 51,N8.-P. 767-774.

134. Suga Y., Miyajima K., Oikawa T. et al. Quantitative a CDKN2A and ESR1 methylation in the peripheral blood of patients with non-small cell lung cancer // Oncol. Rep. - 2008. - Vol. 20, N 5. - P. 1137-1142.

135. Sulewska A., Niklinska W., Kozlowski M.et al. DNA methylation in states of cell physiology and pathology // Cytobiol. - 2007. - Vol. 45, N 3. - P. 149158.

136. Sung H.J., Cho J.Y. Biomarkers for the lung cancer diagnosis and their advances in proteomics // BMB Rep. - 2008. - Vol. 41, N 9. - P. 615-625.

137. Tamkovich S.N., Bryzgunova O.E., Rykova E.Y. et al. Circulating nucleic acids in blood of healthy male and female donors // Clin. Chem. - 2005. -V. 51,N 7. -P. 1317-1319.

138. Tamkovich S.N., Litvjakov N.V., Bryzgunova O.E. et al. Cell-surface-bound circulating DNA as a prognostic factor in lung cancer // Ann. N.Y. Acad Sci. -2008.-Vol. 1137.-P. 214-218.

139. Tomita H., Ichikawa D., Sai S. et al. Quantification of circulating plasma DNA fragments as tumor markers in patients with esophageal and gastric cancer // Gan To Kagaku Ryoho. - 2007. - Vol. 34, N 12. - P. 1908-1910.

140. Travis W.D., Brambilla E., Muller-Hermelink H.K., Harris C. Pathology and genetics of tumors of the lung, pleura, thymus and heart // World Health Organization Classification of Tumors. - 2004. - P. 1-344.

141. Trombino S., Neri M., Puntoni R. et al. Mutations in K-RAS codon 12 detected in plasma DNA are not an indicator of disease in patients with non-small cell lung cancer // Clin. Chem. - 2005. - Vol. 51, N 7. - P. 1313-1314.

142. Tsou J.A., Galler J.S., Siegmund K.D. et al. Identification of a panel of sensitive and specific DNA methylation markers for lung adenocarcinoma // Mol. Cancer. - 2007. - Vol. 6. - P. 70-75.

143. Tzao C., Hsu H.S., Sun G.H. et al. Promoter methylation of the hMLHl gene and protein expression of human mutL homolog 1 and human mutS homolog 2 in resected esophageal squamous cell carcinoma // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. - 2005. - Vol. 130, N 5. - P. 1371-1376.

144. Van der Drift M.A., Hol B.E., Klaassen C.H. et al. Circulating DNA is a noninvasive prognostic factor for survival in non-small cell lung cancer // Lung Cancer. - 2010. - Vol. 68, N 2. - P. 283-287.

145. Van der Vaart M., Semenov D.V., Kuligina E.V. et al. Characterisation of circulating DNA by parallel tagged sequencing on the 454 platform // Clin. Chim. Acta. - 2009. - Vol. 409, N 1-2. - P. 21-27.

146. Verri C., Roz L., Conte D. et al. Fragile histidine triad gene inactivation in lung cancer the European Early Lung Cancer Project // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2009. - Vol. 179, N 5. - P. 396^101.

147. Vlassov V.V., Laktionov P.P., Rykova E.Y. Extracellular nucleic acids // BioEssays. - 2007. - Vol. 29, N 7. - P. 654-667.

148. Vlassov V.V., Laktionov P.P., Rykova E.Y. Circulating nucleic acids as a potential source for cancer biomarkers // Curr. Mol. Med. - 2010. - Vol. 10, N2.-P. 142-165.

149. Vollmer R.T., Herndon J.E, D'Cunha J. et al. Immunohistochemical detection of occult lymph node metastases in non-small cell lung cancer: anatomical pathology results from Cancer and Leukemia Group B Trial 976 // Clin. Cancer Res. - 2003. - Vol. 9, N 15. - P. 5630-5635.

150. Vos M.D., Ellis C.A., Bell A. et al. Ras uses the novel tumor suppressor RASSF1 as an effector to mediate apoptosis // J. boil Chem. - 2000. -Vol. 275, N 46. - P. 36569-36572.

151. Voss J.S., KippB.R., Hailing K.C. et al. Fluorescence in situ hybridization testing algorithm improves lung cancer detection in bronchial brushing specimens // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2010. - Vol. 181, N 5. -P. 478-485.

152. Weber K.S., Donermeyer D.L., Allen P.M., Kranz D.M. Class II-restricted T cell receptor engineered in vitro for higher affinity retains peptide specificity and function // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. - Vol. 102, N 52. -P. 19033-19038.

153. Wilson A.S., Power B.E., Molloy P.L. DNA hypomethylation and human diseases // Biochim. Biophys. Acta. - 2007. - Vol. 1775, N 1. - P. 138-162.

154. Wittner B.S., Sgroi D.C., Ryan P.D. et al. Analysis of the MammaPrint breast cancer assay in a predominantly postmenopausal cohort // Clin Cancer Res. -2008. - Vol. 14, N 10. - P. 2988-2993.

155. Woenckhaus M., Grepmeier U., Wild P.J. et al. Multitarget FISH and LOH analyses at chromosome 3p in non-small cell lung cancer and adjacent bronchial epithelium // Am. J. Clin. Pathol. - 2005. - Vol. 123, N 5. - P. 752761.

156. Xie G.S., Hou A.R., Li L.Y. et al. Quantification of plasma DNA as a screening tool for lung cancer // Chin. Med. J. - 2004. - Vol. 117, N 10. -P. 1485-1488.

157. Yang I.V., Schwartz D.A. Epigenetic control of gene expression in the lung // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2011. - Vol. 183, N 10. - P. 1295-301.

158. Ye Y., Wang D., Su C. et al. Combined detection of TP53, CDKN2A, RB, and EGFR mutations in lung cancer by suspension microarray // Genet. Mol. Res. -2009.-Vol. 8, N4.-P. 1509-1518.

159. Yu S.C., Lo D.Y., Ip C.B. et al. Does Percutaneous Liver Biopsy of Hepatocellular Carcinoma Cause Hematogenous Dissemination? An in vivo study with quantitative assay of circulating tumor DNA using methylation-specific real-time polymerase chain reaction // AJR Am. J. Roentgenol. -2004. - Vol. 183, N 2. - P. 383-385.

160. Yung T.K., Chan K.C., Mok T.S. et al. Single-molecule detection of epidermal growth factor receptor mutations in plasma by microfluidics digital

PCR in non-small cell lung cancer patients // Clin. Cancer Res. - 2009. - Vol. 15,N6.-P. 2076-2084.

161. Zhang L.X., Pan S.Y., Chen D. et al. Effect of adenomatous polyposis coli (APC) promoter methylation on gene transcription in lung cancer cell lines // Ai Zheng. - 2007. - Vol. 26, N 6. - P. 576-580.

162. Zhu C.Q., Shih W., Ling C.H., Tsao M.S. Immunohistochemical markers of prognosis in non-small cell lung cancer: a review and proposal for a multiphase approach to marker evaluation // J. Clin. Pathol. - 2006. - Vol. 59, N 8. - P. 790-800.

163. Ziegler A., Zangemeister-Wittke U., Stahel R.A. Circulating DNA: a new diagnostic gold mine? // Cancer Treat. Rev. - 2002. - Vol. 28, N 5. - P. 255271.

164. Zochbauer-Muller S., Fong M.K., Maitra A. et al. 5 CpG island methylation of the FHIT gene is correlated with loss of gene expression in lung and breast cancer // Cancer Res. - 2001. - Vol. 61, N 9. - P. 3581-3585.