Распределение аберрантно метилированных форм генов опухолевой супрессии и циркулирующих ДНК крови больных раком желудка тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат медицинских наук Елистратова, Елена Владимировна

• Елистратова, Елена Владимировна
• кандидат медицинских наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Елистратова, Елена Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Заболеваемость раком желудка, проблемы диагностики.

1.2 Белковые маркеры рака желудка.

1.3 Молекулярно-генетические маркеры рака желудка.

1.3.1 Генетические изменения.

1.3.2 Эпигенетические изменения.

1.4 Циркулирующие ДНК.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 МАТЕРИАЛЫ.

2.1.1 Клинические характеристики здоровых доноров и больных раком желудка.

2.1.2 Реактивы и препараты.

2.1.3 Оборудование.

2.2 МЕТОДЫ.

2.2.1 Взятие образцов крови.

2.2.2 Приготовление элюатов с поверхности форменных элементов крови.

2.2.3 Определение концентрации циркулирующих ДНК в крови.

2.2.3.1 Метод сорбции циркулирующих ДНК на модифицированном стекле.

2.2.3.2 Линии клеток и методы культивирования.

2.2.3.3 Приготовление раствора ДНК с целью построения калибровочной кривой.

2.2.3.4 Определение концентрации циркулирующих ДНК в плазме и элюатах, выделенных с клеточной поверхности форменных элементов клеток крови.

2.2.4 Определение статуса метилирования промоторных областей генов опухолевой супрессии МОМТ, р15 и 1гМЬШ в цирДНК.

2.2.4.1. Выделение циркулирующих ДНК из плазмы и элюатов с клеточной поверхности.

2.2.4.2 Бисульфитная модификация ДНК.

2.2.4.3. Получение геномной ДНК для положительного и отрицательного контроля в мет-ПЦР.

2.2.4.4. Полимеразная цепная реакция, специфичная к метилированию.

2.2.4.5. Визуализация продуктов мет-ПЦР.

2.2.5. Иммунохимический анализ маркеров РЭА, СА 19.9 и СА 72.4 в плазме крови больных раком желудка и здоровых людей.

2.3. Статистическая обработка данных.'.

ГЛАВА 3. СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Исследование концентраций циркулирующих ДНК.

3.1.1. Приготовление растворов ДНК для построения калибровочных кривых.

3.1.2 Концентрация цирДНК плазмы и связанных с поверхностью форменных элементов в крови здоровых доноров.

3.1.3 Особенности циркуляции внеклеточных ДНК в крови больных раком желудка.

3.2 Анализ статуса метилирования промоторных областей генов гшшп опухолевой супрессии р15, МОМТ, ЬМЫТ1 в циркулирующих ДНК плазмы и связанных с поверхностью форменных элементов в крови клинически здоровых людей и больных раком желудка.

3.2.1. Контроль на наличие ДНК в выделенных образцах ДНК плазмы и связанных с клеточной поверхностью.

3.2.2. Исследование профиля метилирования промоторной области гена р15.

3.2.3. Исследование профиля метилирования промоторной области гена ЬМЬН1.

3.2.4 Исследование профиля метилирования промоторной области гена МХЗМТ.

3.3. Сравнительное исследование чувствительности и специфичности анализов эпигенетических маркеров (р15, МОМТ, ЬМЬН1) в цирДНК и стандартных онкоспецифических белков (РЭА, СА 19.9, СА 72.4) при раке желудка.

3.3.1 Иммунохимический анализ онкомаркеров РЭА, СА 19.9, СА 72.4.

3.3.2. Сравнительный анализ методов основанных на определении белковых маркеров и статуса метилирования генов опухолевой супрессии.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Распределение аберрантно метилированных форм генов опухолевой супрессии и циркулирующих ДНК крови больных раком желудка»

Актуальность

Несмотря на тенденцию к снижению заболеваемости рак желудка (РЖ) является четвертой по частоте формой злокачественных новообразований (около 8,6 % от общего числа онкологических больных в мире) и занимает второе место в структуре общей летальности от злокачественных новообразований (700.000 смертей ежегодно) [106].

Самый высокий показатель 5-летней выживаемости больных раком желудка - 52% зафиксирован в Японии, где с 1960 г. в рамках общей программы медицинского обследования внедрен метод фотофлюрографии. Этот опыт не нашел широкого применения в других странах мира в связи с необходимостью больших затрат, чем объясняется более низкий показатель 5-летней выживаемости (27%) в странах Западной Европы [10].

В России по сравнению с 1990 годом за последнее десятилетие число вновь выявленных больных раком желудка снизилось на 16%, однако в общем числе умерших от злокачественных новообразований органов пищеварения на рак желудка приходится 38,5%. Среди 45 стран мира Россия стоит на 1-м месте по уровню смертности от данного заболевания [1]. Статистические данные объясняются поздним выявлением РЖ, когда хирургический метод (основной метод радикального лечения этого заболевания) лечения является малоэффективным. Показатель 5-летней выживаемости при радикальном лечении составляет: при I стадии - 80-100%; II - 40-65%; III - 15-35%; IV - 0%. Однако частота обнаружения ранних форм рака желудка не превышает 10-20%, а доля больных раком III стадии, поступающих в стационар, составляет 31,4 %, IV стадии - 42,6%, и у 83% больных при первично выявленном раке желудка уже существуют регионарные метастазы [12].

Причинами поздней диагностики РЖ при современной возможности эндоскопии, рентгенографии остается несовершенство этих методов для распознавания патологии в пределах слизистой оболочки желудка [15], что объясняется сложностью визуальной дифференциальной диагностики ранних форм рака и доброкачественных изменений, противоречивыми данными морфологических исследований, недостаточной квалификацией врачей, использованием несовершенной аппаратуры и экономические причины.

Не отвечают поставленной задаче и применяющиеся сегодня иммунохимические и биохимические методы, основанные на выявлении белковых онкомаркеров, концентрация которых повышается в крови пациентов при наличии сформировавшейся опухоли. При РЖ чаще всего используются следующие маркеры: альфа-фетопротеин (АФП), раковый антиген СА 72.4 (СА 72.4), раковый эмбриональный антиген (РЭА), углеводный антиген СА 19.9 (СА 19.9) [5]. Однако даже одновременное исследование всех опухолевых маркеров не приводит к существенному повышению чувствительности и специфичности первичной диагностики РЖ в силу того, что эти белковые маркеры характеризуются поздним появлением в крови и не все онкотрасформированные клетки экспрессируют повышенный уровень искомых маркеров. Основным применением данных маркеров является мониторинг течения заболевания, оценка эффективности лечения и отслеживание рецидива опухоли

Таким образом, существуют объективные причины, осложняющие выявление ранних форм рака желудка. Отсутствуют критерии формирования групп риска среди населения, есть сложности экономического характера, есть недостатки в техническом оснащении соответствующих служб и имеются проблемы, связанные с несовершенством клинико-инструментальной диагностики.

Совершенно очевидно, что для кардинального решения проблемы диагностики рака желудка необходимы надежные и простые методы детекции опухолевого процесса, которые позволяли бы выявлять небольшую по размерам опухоль на доклинических стадиях (рак in situ) и ранние стадии злокачественного перерождения клеток у пациентов с предраковыми заболеваниями.

Известно, что трансформация клеток в раковые и прогрессия онкологического процесса связаны с накоплением генетических и эпигенетических изменений в геноме, поэтому анализ подобных изменений с использованием современных молекулярногенетических методов представляется в настоящее время особенно перспективным для ранней онкодиагностики. Высокая частота обнаружения подобных изменений генов в ткани опухоли открывает большие возможности для разработки методов ранней диагностики рака желудка. Однако, анализ ткани опухоли - это инвазивный метод и проводится при измененной слизистой оболочке, что снижает ценность данного метода для выявления ранних стадий рака желудка. Наиболее перспективным для ранней диагностики рака желудка представляется выявление ДНК-онкомаркеров в крови. Это стало возможным в связи с обнаружением в цирДНК плазмы крови онкологических больных генетических и эпигенетических изменений, идентичных таковым в ДНК клеток опухоли [64].

Использование эпигенетических изменений, а именно анализ статуса метилирования промоторных областей генов опухолевой супрессии, в качестве маркеров онкологического заболевания имеет ряд преимуществ по сравнению с генетическими изменениями ДНК. Во-первых, на сегодняшний день известно, что аберрантное метилирование ДНК является одним из наиболее распространенных и ранних событий, приводящих к опухолевой трансформации клетки при раке желудка [62]. Во-вторых, чувствительность детекции аберрантно метилированного гена в условиях избытка неметилированного аллеля выше, чем мутантного аллеля [99]. В-третьих, описано большое число генов, инактивированных путем изменения статуса метилирования Срв-островков промоторных областей, характерных для онкотрансформированных клеток [62, 81].

Накоплен большой материал об эпигенетических изменениях, наблюдающихся в образцах опухолевой ткани при раке желудка. Однако исследователями отмечается, что частота выявления онкомаркеров в цирДНК плазмы крови больных раком желудка значительна ниже по сравнению частотой их выявления в опухолевой ткани [108].

Как было показано в недавних исследованиях, внеклеточные ДНК не только свободно циркулируют в плазме крови, но также могут быть связаны с поверхностью форменных элементов крови [34]. Эти данные позволяют надеяться, что проблема более низкой частоты детекции гиперметилированных генов опухолевой супрессии в крови по сравнению с исследованием опухолевой ткани при раке желудка может быть успешна преодолена. Все сказанное определяет актуальность исследования распределения аберрантного метилирования генов опухолевой супрессии в циркулирующих ДНК крови больных раком желудка.

Цель исследования

Изучение особенностей циркуляции внеклеточных ДНК и распределения онкоспецифических последовательностей в крови больных раком желудка с разными клинико-морфологическими параметрами течения заболевания

Задачи исследования

1. Определить концентрацию цирДНК и изучить распределение между фракциями плазмы и связанных с клеточной поверхностью форменных элементов крови у больных раком желудка на разных стадиях заболевания.

2. Проанализировать частоту выявления аберрантно метилированных форм генов опухолевой супрессии р15, МОМТ, 1гМЬН1 в цирДНК плазмы и фракции связанной с поверхностью клеток крови у больных раком желудка на разных стадиях заболевания.

3. Провести сравнительное исследование чувствительности и специфичности анализов эпигенетических маркеров (р15, МОМТ, 1гМЬН1) в цирДНК и стандартных онкоспецифических белков (РЭА, СА 19.9, СА 72.4) при раке желудка.

Научная новизна работы

Впервые показано, что по мере распространенности рака желудка происходит достоверное увеличение концентрации цирДНК плазмы, тогда как концентрация цирДНК, связанных с клеточной поверхностью, достоверно не изменяется.

Получены новые данные о возможности выявления у больных раком желудка онкоспецифических последовательностей в цирДНК, связанных с клеточной поверхностью, что значительно повышает частоту выявления эпигенетических маркеров по сравнению с использованием только цирДНК плазмы. Показано, что аберрантное метилирование является характерным изменением для всех исследуемых стадий рака желудка.

Между детекцией эпигенетических маркеров и повышенным уровнем опухолеспецифических белков (РЭА, СА 19.9 и СА 72.4) отсутствует корреляционная зависимость, таким образом, данные изменения имеют независимое значение при развитии рака желудка и отражают разные стороны патогенеза.

Теоретическая и практическая значимость.

Достоверное увеличение концентрации цирДНК плазмы у больных раком желудка по мере распространения опухолевого процесса свидетельствуют о том, что анализ концентрации цирДНК плазмы является эффективным показателем при дифференцировке больных раком желудка и может быть использован для оценки стадии заболевания.

Суммарная цирДНК, а именно ДНК плазмы и связанная с клеточной поверхностью, повышает чувствительность детекции метилированных аллелей генов опухолевой супрессии (МОМТ, р15, ИМЬШ) по сравнению с использованием только цирДНК плазмы у больных раком желудка.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. У больных раком желудка по мере распространенности заболевания статистически значимо возрастает уровень цирДНК плазмы. В то время как уровень цирДНК, связанных с клеточной поверхностью, не изменяется.

2. При раке желудка использование суммарных цирДНК крови позволяет детектировать опухолевые изменения (метилирование аллелей генов р15 и ЬМЬН1) с чувствительностью 63% и специфичностью 63%. Метилированные формы генов выявляются в суммарных цирДНК при раке желудка с одинаковой частотой на разных стадиях заболевания.

3. При раке желудка частота выявления ДНК-маркеров (метилированных аллелей генов MGMT, р15 и hMLHl) существенно выше по сравнению с выявлением повышенного уровня белковых маркеров РЭА, С А 19.9 и СА 72.4. Показано отсутствие достоверной корреляции между детекцией эпигенетических и белковых маркеров опухолевого процесса.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 17 тезисов. Результаты работы были представлены на конференциях «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии» (Россия, 2004), «Biotechnology and oncology» и «Новые технологии в онкологической практике» (Россия, 2005), «Петровские чтения-2006» и «Актуальные вопросы экспериментальный и клинической онкологии» (Россия, 2006), «Фундаментальные науки-медицине», XI Российский Онкологический конгресс и II Молодежный Медицинский Конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения» (Россия, 2007).

Заключение диссертации по теме «Онкология», Елистратова, Елена Владимировна

ВЫВОДЫ

1. У больных раком желудка концентрация цирДНК плазмы крови мужчин и женщин достоверно выше, чем у здоровых доноров и составляет 116 нг/мл и 77 нг/мл против 10 нг/мл соответственно (р=0,001). У больных раком желудка мужчин уровень цирДНК, связанных с поверхностью клеток крови, достоверно ниже по сравнению со здоровыми донорами (442 нг/мл и 703 нг/мл соответственно, р=0,04).

2. При III6-IV стадии выявлено достоверное увеличение концентрации цирДНК плазмы по сравнению с больными I-IIIa стадии заболевания (146 нг/мл и 72 нг/мл соответственно, р=0,04). У больных с отдаленными метастазами концентрация цирДНК плазмы в группе была достоверно выше по сравнению с группой больных без отдаленных метастазов (155 нг/мл и 79 нг/мл соответственно, р=0,049).

3. В крови больных раком желудка при суммарном анализе цирДНК плазмы и связанных с клеточной поверхностью, аберрантно метилированная форма гена р15 детектируется в 50%, MGMT в 67% и hMLHl в 27% случаев, что значительно превышает частоту их выявления в цирДНК плазмы (20%, 37% и 13% соответственно). У больных раком желудка метилированные аллели одного из двух генов р15 и hMLHl в цирДНК крови выявляются со специфичностью и чувствительностью 63% и 63%. При раке желудка метилированные формы генов выявляются в суммарных цирДНК с одинаковой частотой на разных стадиях заболевания.

4. У больных раком желудка частота выявления метилированных форм генов р15 и hMLHl в суммарных цирДНК выше по сравнению с определением стандартных белковых маркеров РЭА, СА 19.9, СА 72.4 (63% и 30% соответственно). Не выявлено статистически значимой корреляции между эпигенетическими и белковыми маркерами.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. На основании поведенных исследований выявлены изменения концентрации и распределения цирДНК при раке желудка по сравнению со здоровыми людьми, что свидетельствует о перспективности дальнейших исследований в группах риска больных раком желудка и пролеченных больных с целью разработки методов ранней диагностики рака желудка и мониторинга заболевания.

2. Показано, что использование суммарных цирДНК (плазмы и связанных с клеточной поверхностью) для анализа онкоспецифических последовательностей, а именно аберрантного метилирования генов опухолевой супрессии р15, ЬМТЛП и МОМТ позволяет повысить чувствительность метода, по сравнению только с исследованием цирДНК плазмы. Суммарные цирДНК могут быть использованы для разработки высокоспецифичных и чувствительных методов диагностики рака желудка.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Елистратова, Елена Владимировна, 2008 год

1. Аксель, Е.М. Злокачественные новообразования в России и странах СНГ в 2000 г. / Е.М. Аксель, М.И. Давыдов // Злокачественные новообразования в России и странах СНГ в2000. М.: РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН, 2002.- С. 85-106.

2. Активность дезоксирибонуклеаз в биологических жидкостях здоровых доноров и онкологических больных / С.Н. Тамкович, A.B. Черепанова, O.E. Брызгунова и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2008. Т. 145, № 7. - С. 97-100.

3. Активность дезоксирибонуклеаз крови в норме и при патологии / A.B. Черепанова, С.Н. Тамкович, В.В. Власов et al. // Биомедицинская химия. 2007. - Т. 53, № 5. - 488-496.

4. Барановский, А.Г. Дезоксирибонуклеазы человека / А.Г. Барановский, В.Н. Бунева, Г.А. Невинский // Биохимия. 2004. - 69. - С. 587-601.

5. Белохвостов, A.C. Онкомаркеры. Молекулярно-генетические, иммунохимические, биохимические анализы (пособие для врачей) / A.C. Белохвостов, А.Г. Румянцев. — М.: МАКС Пресс, 2003.

6. Брызгунова, O.E. Современные методы диагностики рака предстательной железы / O.E. Брызгунова, В.В. Власов, П.П. Лактионов // Биомедицинская химия. 2007. - Т. 53, № 2.-С. 128-139.

7. Клишко, Е.В. Матриксные металлопротсиназы в онкогенезе / Е.В. Клишко, И.В. Кондакова, Е.Л. Чойнозов // Сибирский онкологический журнал. 2003. - № 2. - С. 63-70.

8. Копнин, Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза / Б.П. Копнин // Биохимия. 2000. — Т. 65 — С. 5-33.

9. Лихтенштейн, A.B. Метилирование ДНК и канцерогенез / A.B. Лихтенштнейн, Н.П. Киселева // Биохимия. 2001. -Т. 66, № 3. - С. 293-317.

10. Мерабишвили, В.М. Рак желудка: эпидемиология, профилактика, оценка эффективности лечения на популяционном уровне / В.М. Мерабишвили // Практическая Онкология. 2001.- Т. 7, № 3. - С. 3-8.

11. Патент на изобретение № 2232768 Россия, Способ выделения дезоксирибонуклеиновых кислот / П. Лактионов, СН. Тамкович, ПА. Симонов, ЕЮ. Рыкова, ВВ. Власов. Приоритет от 02.10.2002. (2004).

12. Проблемы диагностики и рационального лечения раннего рака желудка (TisNOMO и T1N0M0) / H.H. Симонов, Л.М. Мяукина, A.B. Филин и др. // Практическая Онкология.2001. Т. 7, № 3. - С. 25-30. (14)

13. Рубцов, Н.Б. Методы работы с хромосомами млекоииающих / Н.Б. Рубцов. -Новосибирск: Редакционно-издательский центр НГУ, 2006. (13)

14. Уровень внеклеточных нуклеиновых кислот в плазме крови здоровых доноров и больных с опухолями молочной железы / С.Н. Тамкович, П.П. Лактионов, Е.Ю. Рыкова и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2005. — Т. 139, № 4. - С. 462-464.(15)

15. Чиссов, В.И Избранные лекции по клинической онкологии / В.И. Чиссов, С.Л. Дарьялова. М., 2000.

16. A systematic profile of DNA methylation in human cancer cell lines / M.F. Paz, M.F. Fraga, S. Avila et al. // Cancer Research. 2003. - Vol. 63, № 5. - P. 1114-1121.

17. Aberrant CpG island hypermethylation of chronic gastritis, in relation to aging, gender, intestinal metaplasia, and chronic inflammation / G.H. Kang, H.J. Lee, K.S. Hwang et al. // American Journal of Pathology. -2003. -№ 163.-P. 1551-1556.

18. Aberrant CpG island methylation in early-onset sporadic gastric carcinoma / H.C. Kim, J.C. Kim, S.A. Roh et al. // Cancer Res. Clin. Oncol. -2005. № 131. - P. 733-740.

19. Aberrant methylation and histone deacetylation of cyclooxygenase-2 in gastric cancer / T. Kikuchi, F. Itoh, M. Toyota et al. // Int. J. Cancer. 2002. - № 97. - P. 272-277.

20. Accumulation of DNA methylation is associated with tumor stage in gastric cancer / N. Oue, Y. Mitani, J. Motoshita et al. // Cancer. 2006. - № 106. - P. 1250-1259.

21. Activation of c-K-ras mutation in human gastrointestinal tumors / N. Arber, I. Shapira, J. Ratan et al. // Gastrienterology. 2000. - № 118. - P. 1045-1050.

22. Age-related methylation of tumor suppressor and tumor-related genes: an analysis of autopsy samples / T. Waki, G. Tamura, M. Sato et al. // Oncogene. 2003. - № 22. - P. 4128-4133.

23. Alteration of APC, c-met, and p53 genes in tumor tissue and serum of patients with gastric cancer / J-Y. Wang, J-S. Hsieh, C-C. Chen et al. // Journal of Surgical Research. 2004. - № 120. -P. 242-248.

24. Altered expression and mutation of b-catenin gene in gastric carcinomas and cell lines / D.K. Woo, H.S. Kim, H.S. Lee et al. // Int. J. Cancer (Pred. Oncol.). 2001. - № 95. - P. 108-113

25. Analysis of comparative genomic hybridization and loss of heterozygosity in 43 primary gastric carcinomas / W. Qi, W. Baiqiu, G. Xinyuan et al. // Chinese Medical Journal. — 2003. -Vol. 116, №4.-P. 517-523.

26. Analysis of p53 gene mutations in helicobacter pylori-associated gastritis mucosa in endoscopic biopsy specimens, Scandinavian Journal of Gastroenterology / K. Murakami, T.

27. Fujioka, T. Okimoto et al. // Scandinavian Journal of Gastroenterology. — 1999. Vol. 34, № 5. -P. 474 - 477.

28. Anker, P. Circulating nucleic acids in plasma and serum as a noninvasive investigation for cancer: time for large-scale clinical studies? / P. Anker, H. Mulcahy, M. Stroun // Int. J. Cancer.2003.-№ 103.-P. 149-152.

29. BRAF/ K-ras mutation, microsatellile instability, and promoter hypermethylation of hMLHl/MGMT in human gastric cancer / M. Wu, S. Semba, N. Oue et al. // Gastric Cancer.2004.-№ 7.-P. 246-253.

30. BRAF and KRAS mutations in stomach cancer / S.H. Lee, J.W. Lee, Y.H. Soung et al. // Oncogene. 2003. - № 22. - P. 6942-6945.

31. CA 72-4 measurement of tumor-associated glycoprotein 72 (TAG-72) as a serum marker in the management of gastric cancer / F. Guadagni, M. Roselli, T. Amato et al. // Cancer Research. -1992,- №52,- P. 1222-1227.

32. Cell-free and cell-bound circulating DNA in breast tumours: DNA quantification and analysis of tumour-related gene methylation / T.E. Skvortsova, E.Y. Rykova, S.N. Tamkovich et al. // British Journal of Cancer. 2006. - Vol. 94, № 10. - P. 1492-1495.

33. Cell-surface-bound circulating DNA as a prognostic factor in lung cancer / S.N. Tamkovich, N.V. Litviakov, O.E. Bryzgunova et al. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2008. - Vol. 1137. - P. 214-217.

34. Choi, I-S. Epigenetic alterations in gastric carcinogenesis / I-S. Choi, T-T. Wu // Cell Research.-2005.-Vol. 15, №4.-P. 247-254.

35. Circulating nucleic acids in blood of healthy male and female donors / S.N. Tamkovich, O.E. Bryzgunova, E.Y. Rykova et al. // Clin.Chem. 2005. - Vol. 51. - P. 1317-1319.

36. Clinical significance and prognostic value of CA72-4 compared with CEA and CA19-9 in patients with gastric cancer / M. Ychou, J. Duffour, A. Kramar et al. // Disease Markers. -2000. -Vol. 16, №3-4.-P. 105-110.

37. Clinical utility of CEA, CA 19-9, and CA 72-4 in the follow-up of patients with respectable gastric cancer / D. Marrelli, E. Pinto, A. De Stefano et al. // The American Journal of Surgery. -2001.-№ 181.-P. 16-19.

38. Clinicopathologic and genetic characteristics of gastric cancer in young male and female patients / S. Sasao, T. Hiyama, S. Tanaka et al. // Oncology Reports. 2006. - № 16. - P. 11-15.

39. Clincopathologic features of gastric cancers producing alpha-fetoprotein / K. Kono, H. Amemiya, T. Sekikawa et al. // Dig. Surg. 2002. - № 19. - P. 359-365.

40. Concurrent hypermethylation of gene promoters is associated with a MSI-H phenotype and diploidy in gastric carcinomas / B. Carvalho, M. Pinto, L. Cirnes et al. // European Journal of Cancer.-2003.-№39.-P. 1222-1227.

41. Concurrent hypermethyalation of multiple tumor-related genes in gastric carcinoma and adjacent normal tissues / W.K. Leung, J. Yu, E.K.W. Ng et al. // Cancer. 2001. - № 91. - P. 2294-2301.

42. Correlation between serum and tissue deoxyribonuclease levels in breast cancer patients / G. Ramandanis, N. Agnantis, J. Garas et al. // Anticancer Res. 1982. - № 2. - P. 213-218.

43. Correlation of hMLHl and HPP1 hypennethylaton in gastric, but not in esophageal and cardiac adenocarcinoma / H. Geddert, S. Kiel, E. Iskander et al. // Int. J. Cancer. 2004. - № 110. -P. 208-211.

44. CpG island methylation in premalignant stages of gastric carcinoma / G.H. Kang, Y-H. Shim, H-Y. Jung et al. // Cancer Research. 2001. - № 61. - P. 2847-2851.

45. Definition and refinement of chromosome 8p regions of loss of heterozygosity in gastric cnacer / R. Baffa, R. Santoro, F. Bullrich et al. // Clinical Cancer Research. 2000. - № 6. -P. 1372-1377.

46. Deoxyribonuclease activity and circulating DNA concentration in blood plasma of patients with prostate tumors / A.V. Cherepanova, S.N. Tamkovich, O.E. Bryzgunova et al. // Ann. N.Y. Acad. Sci.-2008.-Vol. 1137.-P. 218-221.

47. Destabilization of tracts of simple repetitive DNA in yeast by mutations affecting DNA mismatch repair / M. Strand, T.A. Prolla, R.M. Liskay et al. // Nature. 1993. - № 365. - P. 274276.

48. Detection of gene promoter hypermethylation in the tumor and serum of patients with gastric carcinoma / T-L. Lee, W.K. Leung, M.W.Y. Chan et al. // Clinical Cancer Research. -2002,-№8.-P. 1761-1766.

49. Detection of pl6 promoter hypermethylation in serum of gastric cancer patients / Y. Kanyama, K. Hibi, H. Nakayama et al. // Cancer Sci. 2003. - Vol. 94, № 5. - P. 418-420.

50. Determination of circulating DNA levels in patients benign or malignant gastrointestinal disease / B. Shapiro, M. Chakrabarty, E. M. Cohn et al. // Cancer. 1983. - Vol. 51. - P. 21162120.

51. Distinct clinical features and outcomes of gastric cancers with microsatellite instability / H.S. Lee, S.I. Choi, H.K. Lee et al. // Mod. Pathol. 2002. - Vol. 15, № 6. - P. 632-640.

52. Distinct methylation pattern and microsatellite instability in sporadic gastric cancer / H. Suzuki, F. Itoh, M. Toyota et al. // Int. J. Cancer. 1999. - № 83. - P. 309-313.

53. DNA copy number aberrations in intestinal-type gastric cancer revealed by array-based comparative genomic hybridization / H. Vauhkoncn, M. Vauhkonen, A. Sajantila et al. // Cancer Genetics and Cytogenetics. 2006. - № 167. - P. 150-154.

54. DNA hypermethylation of tumor-related genes in gastric carcinoma / S. H. Hong, H.G. Kim, W.B. Chung, E.Y. Kim et al. / J. Korean Med. Sci. 2005. - № 20. - P. 236-241.

55. DNA methylation of multiple genes in gastric carcinoma: association with histological type and CpG island methylator phenotype / N. Oue, Y. Oshimo, H. Nakayama et al. // Cancer Sci. -2003. Vol. 94, № 10. - P. 901-905.

56. Donninger, H. The RASSF1A tumor suppressor / II. Donninger, M.D. Vos, G.J. Clark // Journal of Cell Science. 2007. - Vol. 120, № 18. - P. 3163-3172.

57. Duraker, N. The prognostic significance of gastric juice CA 19-9 and CEA levels in gastric carcinoma patients / N. Duraker, A. N. Celik, N. Gender // EJSO. 2002. - № 28. P. 844-849.

58. El-Rifai, W. Molecular biology of gastic cancer / W. El-Rifai, S.M. Powell // Seminars in Radiation Oncology. 2002. - Vol. 12, № 2. - P. 128-140.

59. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy / G. Egger, G. Liang, A. Aparicio et al. // Nature. 2004. - № 429. - P. 457-463.

60. Esteller, M. Aberrant DNA methylation as a cancer-inducing mechanism / M. Esteller // Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2005. - № 45. - P. 629-656.

61. Esteller, M. CpG island hypermethylation and tumor suppressor genes: a booming present, a brighter future / M Esteller // Oncogene. 2002. - № 21. - P. 5427-5440.

62. Fleischhacker, M. Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer- A survey / M. Fleischhacker, B. Schmidt//BiochimicaetBiophysica Acta. -2007. -№1775. -P. 181-232.

63. Free and cell surface bound nucleic acids in blood of healthy donors and breast cancer patients / P.P. Laktionov, S.N. Tamkovich, E.Y. Rykova et al. // Ann. N. Y. Acad Sci. 2004. -Vol. 1022.-P. 221-227.

64. Frequent CpG island methylation in precursor lesions and early gastric adenocarcinomas / JH. Lee, S-J. Park, S.C Abraham et al. // Oncogene. 2004. - № 23. - P. 4646-4654.

65. Frequent loss of heterozygosity at 8p22 chromosomal region in diffuse type of gastric cancer / H.A. Hosseini, A. Ahani, H. Galehdari et al. // World J. Gastroenterology. 2007. - Vol. 13,№24.-P. 3354-3358.

66. Frequent somatic mutations of the B-Catenin gene in intestinal-type gastric cancer / W.S. Park, R.R. Oh, J.Y. Park et al. // Cancer Research. 1999. - № 59. - P. 4257-4260.

67. Gastric adenocarcinoma: pathomorphology and molecular pathology / M. Werner, K.F. Becker, G. Keller et al. // J Cancer Res. Clin. Oncol. 2001. - № 127. - P. 207-216.

68. Gastric cancer in young and elderly patients show different genomic profiles / T.E. Buffart, B. Carvalho, E. Hopmans et al. // J. Pathol. 2007. - № 211. - P. 54-51.

69. Genetic alterations in 102 primary gastric cancer by comparative genomic hybridization: gain of 20q and loss of 18q are associated with tumor progression / Y. Kimura, T. Noguchi, K. Kawahara et al. // Modern Pathology. 2004. - № 17. - P. 1328-1337.

70. Genetic alterations in primary gastric carcinomas correlated with clinicopathological variables by array comparative genomic hybridization / J.U. Kang, J.J. Kang, K.C. Kwon et al. // J. Korean Med. Sci. 2006. - № 21. - P. 656-665.

71. Genetic and epigenetic analysis of the EPHB2 gene in gastric cancer / J.H. Song, C.J. Kim, Y.G. Cho et al. // APMIS. 2007. - № 115. - P. 802-808.

72. Genetic, epigenetic, and clinicopathologic features of gastric carcinomas with the CpG island methylator phenotype and an association with Epstein-Barr virus / M. Kusano, M. Toyota, H. Suzuki et al. // Cancer. 2006. - № 106. - P. 1467-1479.

73. Genomic alterations in primary gastric adenocarcinomas correlate with clinicopathological characteristics and survival / M.M. Weiss, E.J. Kuipers, C. Postma et al. // Cellular Oncology. — 2004. № 26. - P. 307-317.

74. Goonetilleke, K.S. Systematic review of carbohydrate antigen (CA 19-9) as a biochemical marker in the diagnosis of pancreatic cancer / K.S. Goonetilleke, A.K. Siriwardena // EJSO. -2007. -№33.-P. 266-270.

75. Hamilton, J.P. A review of the genomics of gastric cancer / J.P. Hamilton, S.J. Meltzer // Clinical Gastroenterology and Hepatology. 2006. - № 4. - P. 416-425.

76. Hepatoid adenocarcinoma of the stomach / S. Inagawa, J. Shimazaki, M. Hori et al. // Gastric Cancer. 2001. - № 4. - P. 43-52.

77. Herman, J.G. Hypermethylation of tumor suppressor genes in cancer / J.G. Herman // Seminars in Cancer Biology. 1999. - № 9. - P. 359-367.

78. Herman, J.G. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation / J.G. Herman, S.B. Baylin // The New England Journal of Medicine. 2003 - № 349. - P. 2042-2054.

79. Iiou, P. Detection of pi6 hyoermethylation in gastric cancinomas using a seminested methylation-specific PCR / P. Hou, M-J. Ji, J-Y. Shen et al. // Biochemical Generics. 2005. - № 43.-P. 1-9.

80. Huang Z.H. Quantitative analysis of plasma circulating DNA at diagnosis and during follow-up of breast cancer patients / Z.H. Huang, L.H. Li, D.Hua // Cancer Letters. 2006. - Vol. 243, 1,№ 8.-P. 64-70.

81. Hypermethylation of tumor suppressor genes (pl6INK4A, pl4ARF and APC) in adenocarcinomas of the upper gastrointestinal tract / M. Sarbia, H. Geddert, B. Klump et al. // Int. J. Cancer. 2004. - Vol. 111, № 2. - P. 224-228.

82. Immunohistochemical analysis of phosphor-BAD protein and mutational analysis of BAD gene in gastric carcinomas / E.G. Jeong, S.H. Lee, S.S. Kim et al. // APMIS. 2007. - № 115. - P. 976-981.

83. Inverse relationship between APC gene mutation in gastric adenomas and development of adenocarcinoma / J-H. Lee, S.C. Abraham, H-S. Kim et al. // American Journal of Pathology. -2002.-№ 161.-P. 611-618.

84. Investigation of tumor-derived extracellular DNA in blood of cancer patients by methylation-specific PCR / E.Y. Rykova, T.E. Skvotsova, P.P. Laktionov et al. // Nucleosides, nucleotides & Nucleic acids. 2004. - Vol. 23, № 6, 7. - P. 855-859.

85. Knudson, A. G. Two genetic hits (more or less) to cancer / A. G. Knudson // Nature Reviews.-2001.-№ l.-P. 157-162.

86. K-RAS mutation in Helicobacter pylory-associated chronic gastritis in patients with and without gastric cancer / T. Hiyama, K. Haruma, Y. Kitadai et al. // Int. J. Cancer. 2002. - № 97. -P. 562-566.

87. Labarca, C. A simple, rapid, and sensitive DNA assay procedure / C. Labarca, K. Paigen // Anal Biochem. 1980. - № 102. - P. 344-352.

88. Lengauer, C. Genetic instabiltities in human cancer / C. Lengauer, K.W. Kinzler, B. Volgelstien // Nature. 1998. - № 396. P. 643-649.

89. Levels of circulating cell-free serum DNA in benign and malignant breast lesions / R.A. Zanetti-Dallenbach, S. Schmid, E. Wight et al. // Int J Biol Markers. 2007. - Vol. 22, № 2. - P. 95-99.

90. Matrisian, L.M. Extracellular proteolysis and cancer: meeting summary and future directions / L.M. Matrisian, G.W. Sledge, Jr. Mohla, // Cancer Res. 2003. - № 63. - P. 61056109.

91. McCawley. L.J. Matrix metalloproteinases: multifunctional contributors to tumor progression / L.J. McCawley, L.M. Matrisian // Molecular Medicine Today. 2000. - № 60. - P. 149-156.

92. Measurement of serum CA 19-9 may be more valuable than CEA in prediction of recurrence in patients with gastric cancer / F. Tas, N.F. Aykan., A. Aydiner et al. // Am. J. Clin. Oncol. -2001.-Vol. 24, №2.-P. 148-149.

93. Methylation-specific PCR: A novel PCR assay for methylation status of CpG island / J.G. Herman, J.R. Graff, S. Myoehaenen et al. // Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 1996. - № 93. - P. 98219826.

94. Molecular- basis of gastric cancer development and progression. Review article / L. Zheng, L. Wang, J. Ajani et al. // Gastric Cancer. 2004. - № 7. - P. 61-77.

95. Molecular diagnosis of gastric cancer: present and future. Review article / W. Yasui, N. Oue, H. Kuniyasu et al. // Gastric Cancer. 2001. - № 4. - P. 113-121.

96. Mutation analysis of BRAF and K-ras in gastric cancers: absence of BRAF mutations in gastric cancer / I-J. Kim, J-H. Park, H. C. Kang et al. // Hum. Genet. 2003. - № 114. - P. 118120.

97. No duplicate KRAS mutation is identified on the same allele in gastric or colorectal cancer cells with multiple KRAS mutation / K. Kimura, T. Nagasaka, N. Hoshizima et al. // The Journal of International Medical Research. 2007. - № 35. - P. 450-457.

98. P53 alteration in gastric precancerous lesions / Y. H. Shiao, M. Rugge, P. Correa et al. //Am JPatliol.-1994.-Vol. 144,№3.-P. 511-517.

99. Parkin, M. Global Cancer Statistics, 2002 / M. Parkin, F. Bray, J. Ferlay, P. Pisani // CA Cancer J. Clin. 2005. - Vol. 55, № 2. - P. 74-108.

100. Patterns of somatic mutation in human cancer genomes / C Greenman, P. Stephens, R. Smith et al. // Nature. 2007. - № 446. - P. 153-158.

101. Potential diagnostic and prognostic values of detecting promoter hypermethylation in the serum of patients with gastric cancer / W.K. Leung, K-F. To, E.S.H. Chu et al. // British Journal of Cancer. 2005. - № 92. - P. 2190-2194.

102. Prediction of breast tumor progression by integrity of free circulating DNA in serum / N. Umetani, A.E. Giuliano, S.H. Hiramatsu et al. // J Clin Oncol. 2006. - Vol. 24, № 26. - P. 42704276.

103. Preoperative serum levels of CA 72-4, CEA, CA 19-9, and alpha-fetoprotein in patients with gastric cancer / R. Mattar, C.R. Alves e Andrade, G.M. DiFavero et al. // Rev Hosp. Clin. Fac. Med. Sao Paulo. 2002. - Vol. 57, № 3. - P. 89-92.

104. Profile of aberrant CpG island methylation along the multistep pathway of gastric carcinogenesis / G. H. Kang, S. Lee, J-S. Kim et al. // Laboratory Invastigation. 2003. - № 83. — P. 635-641.

105. Prognostic analysis of E-cadherin gene promoter hypermethylation in patients with surgically resected, node-positive, diffuse gastric cancer / F. Graziano, F. Arduini, A. Ruzzo et al. // Clinical Cancer Research. 2004. - № 10. - P. 2784-2789.

106. Prognostic significance of CEA, CA 19-9 and CA 72-4 preoperative serum levels in gastric carcinoma / D. Marrelli, F. Roviello, A. De Stefano et al. // Oncology. 1999. - № 5. - P. 55-62.

107. Prognostic significance of CpG island methylation phenotupe and microsatellite instability in gastric carcinoma / C. An, I-S. Choi, J.C. Yao et al. // Clinical Cancer Research. — 2005. № 11.-P. 656-663.

108. Prognostic value of carcinoembryonic antigen, CA 19-9 and CA 72-4 in gastric carcinoma / M.J. Gaspar, I. Arribas, M.C. Coca et al. // Tumor Biol. 2001. - № 22. - P. 318-322.

109. Promoter hypermethylation of Death-associated protein-kinase gene associated with advance stage gastric cancer / A.W.H. Chan, M.W.Y. Chan, T-L. Lee et al. // Oncology Reports. -2005.-№ 13.-P. 937-941.

110. Promoter hypermethylation of MGMT is associated with protein loss in gastric carcinoma / N. Oue, H. Shigeishi, H. Kuniyasu et al. // Int. J. Cancer. 2001. - № 93. - P. 805-809.

111. Promoter hypermethylation of tumor-related genes in gastric intestinal metaplasia of patients with and without gastric cancer / K-F. To, W.K. Leung, T-L. Lee et al. // Int. J. Cancer. 2002. -№ 102.-P. 623-628.

112. Promoter methylation and silencing of the retinoic acid receptor-beta gene in lung carcinomas / A.K. Virmani, A. Rathi, S. Zöchbauer-Müller et al. // J. Natl. Cancer Inst. 2000. -Vol. 92,№ 16.-P. 1303-1307.

113. Promoter methylation status of DAP-kinase and RUNX3 gene in neoplastic and non-neoplastik gastric epithelia / T. Waki, G. Tamura, M. Sato et al. // Cancer Sei. 2003. - № 94. - P. 360-364.

114. Promoter methylation status of E-cadherin, hMLHl and pl6 genes in nonneoplastic gastric epithelia / T. Waki, G. Tamura, T. Tsuchiya et al. // American Journal of Pathology. 2002. - № 161.-P. 399-403.

115. Promoter methylation status of the DNA repair genes hMLHl and MGMT in gastric carcinoma and metaplastic mucosa / N. Oue, K. Sentani, H. Yokozaki et al. // Pathobiology. -2001. -№69.-P. 143-149.

116. Raveh, T. DAP kinase- a proapoptotic gene that functions as a tumor suppressor / T. Raveh, A. Kimichi // Experimental Cell Research. 2001. - № 264. - P. 185-192.

117. Regulation of tumor angiogenesis by thrombospondin-1 / B. Ren, K.O. Yee, J. Lawler et al. //Biochim. Biophys. Acta. 2006. - Vol. 1765, №2. -P. 178-188.

118. Role of serum tumor markers in monitoring for recurrence of gastric cancer following radical gastrectomy / S.R. Choi, J.S. Jang, J.H. Lee et al. // Dig. Dis. Sei. 2006. - № 51. - P. -2081-2086.

119. Sato, F. CpG island hypermethylation in progression of esophageal and gastric cancer / F. Sato, S.J. Meitzer // Cancer. 2006. - № 106. - P. 483-493.

120. Serum a-fetoprotein in patients with neoplasms of the gastrointestinal tract / K.R. Mclntire., T.A. Waldmann, C.G. Moertel et al. // Cancer Research. 1975. - № 35. - P. 991-996.

121. Serum carcinoembryonic antigen as a prognostic factor in respectable gastric cancer / M. Tachibana, Y. Takemoto, Y. Nakashima, Kinugasa et al. // J. Am. Coll. Surg. 1998. - № 187. -P. 64-68.

122. Significance of genetic abnormalities of p53 protein in Slovenian patients with gastric carcinoma / R. Juvan, P. Hudler, B. Gazvoda, et al. // Croat Med. J. 2007. - № 48. - P. 207-217.

123. Somatic mutation analysis of p53 and ST7 tumor suppressor genes in gastric carcinoma by DHPLC / C. Lu, H-M. Xu, Q. Ren // World J. Gastroenterol. 2003. - Vol. 9, № 12. - P. 26622665.

124. The consensus coding sequences of human breast and colorectal cancers / T. Sjoblom, S. Jones, L.D. Wood et al. // Science. 2006. - № 314. - P. 268-274.

125. The role of serum and gastric juice levels of carcinoembryonic antigen, CA 19.9 and CA 72.4 in patients with gastric cancer / A. Tocchi, G. Costa, L. Lepre et al. // J Cancer Res Clin. Oncol. 1998. - № 124. - P. 450-455.

126. The usefulness of CEA and/or CA 19-9 in monitoring for recurrence in gastric cancer patients: a prospective clinical study / Y. Takahashi, T. Takeuchi, J. Sakamoto et al. // Gastric Cancer. 2003. - № 6. P. 142-145.

127. TP53 and gastric carcinoma: a review / C.M. Fenoglio-Preiser, J. Wang, G.N. Stemmermann et al. // Human Mutation. 2003. - № 21. - P. 258-270.

128. Transcriptional inactivation of the tissue inhibitor of metalloproteinase-3 gene by DNA hypermethylation of the 5'- CpG island in human gastric cancer cell lines / S.H. Kang, H.H. Choi, S.G. Kim et al. // Int. J. Cancer. 2000. - № 86. - P. 632-635.

129. Transcriptional silencing of cyclooxygenase-2 by hypermethylation of 5' CpG island in human gastric carcinoma cells / S.H. Song, H-S. Jong, H.H. Choi et al. // Cancer Research. -2001.-№61.-P. 4628-4635.

130. Tumor-associated glyeoprotein-72 serum levels complement carcinoembryonic antigen levels in monitoring patients with gastrointestinal carcinoma / F. Guadagni, M. Roselli, T. Amato et al. // Cancer. 1991. - № 68. - P. 2443-2450.

131. Vauhkonen, M. Pathology and molecular biology of gastric cancer / M. Vauhkonen, H. Vauhlconen, P. Sipponen // Best. Practice and Research Clinical Gastoenterology. 2006. -Vol. 20, № 4. - P. 651-674.