Роль генетических и эпигенетических факторов в развитии рака молочной железы и немелкоклеточного рака лёгкого тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Бурденный, Алексей Михайлович

• Бурденный, Алексей Михайлович
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Бурденный, Алексей Михайлович

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общие закономерности канцерогенеза

1.1.1. Онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста

1.2. Современные подходы к поиску новых «онкозначимых» генов

1.2.1. Основные подходы к анализу генетического полиморфизма генов в

18

эпителиальных опухолях

1.2.2. Подходы к анализу метилирования промоторных районов генов в ^ эпителиальных опухолях

1.2.3 Комплексные подходы

1.3. Роль генных полиморфизмов в формировании онкологического риска

1.3.1. Полиморфные маркеры генов глутатион-8-трансфераз в патогенезе онкологических заболеваний

1.3.2. Ген ТР53 и его регулятор МБМ2 - связь с формированием и ^ развитием рака

1.4. Роль метилирования ДНК в канцерогенезе

1.5. Гены многоуровневой системы «клеточной защиты» организма, вовлечённые в патогенез немелкоклеточного рака легкого и рака молочной 40 железы

1.5.1. Гены биотрансформации ксенобиотиков - С5ТМ/, С5ТТ1 и ^ в8ТР1

1.5.2. Гены системы репарации, пролиферации, клеточного цикла и апоптоза

1.5.2.1. Ген ТР53 и функционально связанный с ним ген М£>М2

1.5.2.2. Ген МБЗПА

1.5.2.3. ГенМСЖГ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Реактивы, ферменты и буферные растворы

2.2. Материалы исследования

2.3. Выделение геномной ДНК из крови и ткани

2.4. ПЦР-ПДРФ

2.5. Бисульфитная конверсия ДНК

2.6. Метил-специфичная полимеразная цепная реакция (МС-ПЦР)

2.7. Статистическая обработка результатов

2.7.1. Сравнение выборок по частотам аллелей и генотипов. Точный ^ критерий Фишера. Поправка Бонферрони

2.7.2. Оценка относительного риска. Odds ratio. Доверительный интервал

2.7.3. Критерий согласия Пирсона х2

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Ассоциация полиморфных маркеров генов биотрансформации с риском развития немелкоклеточного рака лёгкого и рака молочной железы. 64 Связь с клинико-гистологическими параметрами опухоли

3.2. Ассоциация полиморфных маркеров генов пролиферации клеточного цикла и апоптоза с риском развития немелкоклеточного рака лёгкого и ^ рака молочной железы. Связь с клинико-гистологическими параметрами опухоли

3.3. Изменение профиля метилирования промоторных районов генов RASSF1A и MGMT при немелкоклеточном раке лёгкого и раке молочной 73 железы; связь с прогрессией рака

3.4. Сравнительный анализ исследованных генов и их комбинаций у

82

больных с немелкоклеточным раком легкого и раком молочной железы

3.5 Заключение и дальнейшие перспективы

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль генетических и эпигенетических факторов в развитии рака молочной железы и немелкоклеточного рака лёгкого»

ВВЕДЕНИЕ

В последние десятилетия частота онкологических заболеваний неуклонно растет. Ежегодно более 10 млн. человек во всем мире заболевают раком и 6 млн. человек умирают от рака ежегодно, что составляет 12% от умерших во всем мире.

Факт, что злокачественное новообразование возникает в результате генетических и эпигенетических повреждений в одной клетке уже не вызывает сомнений, а количество генов прямо или косвенно вовлеченных в канцерогенез неуклонно возрастает. Единичного повреждения, как правило, недостаточно для превращения клетки в опухолевую. Лишь накопление 5-10 таких повреждений в течение продолжительного времени, часто многих лет, приводит к злокачественному новообразованию. Генетические и эпигенетические нарушения способствуют либо активации протоонкогенов, стимулирующих пролиферацию клеток, либо подавлению генов - супрессоров опухолевого роста, тормозящих пролиферацию. Неправильная работа генов, контролирующих рост и деление клеток, вызывает неконтролируемую клеточную пролиферацию.

Только около 5-10% случаев рака являются наследственными, а остальные случаи рака являются результатом генетических и эпигенетических повреждений, возникающих в течение жизни в соматических клетках. Но даже при наследственной передаче предрасположенности к раку злокачественное новообразование возникает только в результате дополнительных соматических повреждений. Повреждения могут происходить либо вследствие воздействия внешних факторов (курение, химические вещества, радиация, инфекционные агенты, солнечное излучение, алкоголь), либо внутренних (гормоны, иммунная система, наследуемые мутации).

Ещё 100 лет назад рак легкого (PJI) считался уникально редким заболеванием, в частности, к 1898 г. в медицинской литературе было описано всего 140 случаев PJ1. Широкое распространение курения в начале XX века привело к тому, что PJI быстро занял позицию самого частого онкологического заболевания: ежегодно новообразования лёгкого диагностируются примерно у 1,2 миллиона человек, причём более 1 миллиона жителей планеты погибают от PJI. В структуре онкологической заболеваемости на PJI приходится 12,8%. Показатели 5-летней выживаемости при PJI выглядят весьма удручающе: даже в странах с самым высоким стандартом здравоохранения они составляют всего 15%, а при среднем уровне развития медицины эта цифра едва достигает 5-7% {Jemal et al., 2010). В разных географических регионах среди мужчин ежегодно регистрируется от 5,3 до 99,7 новых случаев PJI на 100000 человек в год, заболеваемость женщин в 6-10 раз ниже. В России ежегодно от PJ1 погибает свыше 60000 человек, что составляет более 20% всех умерших от злокачественных опухолей (Имянитов, 2006). Приблизительно 80% всех опухолей легкого приходится на немелкоклеточный рак (HMPJI), оставшиеся 20% представлены мелкоклеточным раком легкого.

В этиологии рака легкого определённую роль играют химические соединения, связанные с индустриальными процессами и неблагоприятными экологическими условиями. Однако, несмотря на большой перечень канцерогенных воздействий, влияющих на превращение нормальных клеток эпителия легкого в злокачественные, их вклад в развитие опухолей легкого не превышает 10-20%. Подавляющее большинство случаев PJI (80-90%) обусловлено курением. Популяризация «низкосмолистых» (lowtar) сигарет, «как менее канцерогенных», привела к возрастанию доли аденокарцином, среди опухолей легкого. Подобные изменения в эпидемиологии PJI связаны с тем, что в сигаретах с высоким содержанием смолы основная доля канцерогенов представлена полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ), тогда как в «низкосмолистых» преобладают нитрозамины (Имянитов, 2006).

Рак молочной железы (РМЖ) занимает лидирующие позиции среди злокачественных опухолей у женщин, каждая 10-я - имеет риск заболеть в течение жизни, смертность доходит до 40%. Последние годы наблюдается тенденция омоложения РМЖ. Так средний возраст женщин с диагнозом РМЖ составляет 53 года, тогда как 10 лет назад он составлял 65 лет (Мусаева и др., 2005; Asadzadeh et al., 2011). В отличие от рака легкого, ни один из канцерогенов окружающей среды не удалось убедительно связать с причиной возникновения рака молочной железы. Поэтому на первый план выходят факторы, участвующие в поддержании геномной стабильности. Во-первых, гены, задействованные в распознавании и/или репарации повреждений ДНК (Imyanitov et al., 2004). Во-вторых, гены ответственные за регуляцию клеточного цикла и алоптоза.

Согласно современным представлениям, важную роль в процессе канцерогенеза играют не только генетические факторы, в том числе и различные индивидуальные вариации ферментных систем (Ревазова и др., 2006), но и эпигенетические факторы — метилирование промоторных районов генов и ацетилирование гистонов {Логинов и др., 2004; Ходырев и др., 2011).

Гиперметилирование CpG-островков в промоторном районе найдено для ряда генов-супрессоров, таких как GSTP1, MGMT RASSF1A и др. (Ходырев и др., 2011). Метилирование регуляторных участков нарушает их взаимодействие с факторами транскрипции, блокируя эти участки с помощью белков, специфично связывающихся с метилированными CpG-парами (Methyl-CpG binding proteins), и более того, вносит изменения в окружающий хроматин, переводя его в стабильно репрессированное состояние {Springfield et al., 2012). Изменение статуса метилирования промоторных районов некоторых генов является характерной чертой опухолевых клеток, причем аномальное метилирование наблюдается уже на ранних этапах канцерогенеза. Изменения в уровне метилирования промоторных районов ряда генов показаны для рака молочной железы, простаты, легкого и рака других локализаций {Shenker et al., 2012; Lu et al., 2012).

Таким образом, генетические и эпигенетические факторы предрасположенности к развитию онкологических заболеваний связаны с несколькими уровнями системы клеточной защиты организма. Первый уровень - связан с генами биотрансформации, которые обеспечивают метаболизм чужеродных соединений. В этот процесс главным образом вовлечены гены глутатион 8 трансфераз Т1, М1, Р1 (ОБТП, С8ТМ1, ОБТР!) (Мартов и др., 2010; Корчагина и др., 2011). Следующий уровень клеточной защиты связан с механизмом репарации молекул ДНК при повреждении её структуры. На этом уровне важным геном является регулятор опухолевой супрессии ДНК метилтрансфераза 06-метилгуанина (МСМГ) (Степанов и др., 2010; Пономарева и др., 2011). Третий уровень - связан с генами контроля пролиферации, дифференцировки и роста клеток. Таковыми являются ген-супрессор КАББРЫ и транскрипционный фактор ТР53 со своим регуляторным геном МИМ2 {Желтухин и Чумаков, 2010).

В данном исследовании сделана попытка объединить две позиции в изучении проблемы повреждения генома человека - нарушение статуса метилирования генов ЯАББРЫ и МСМГ и генетический полиморфизм систем клеточного контроля и детоксикации ксенобиотиков, применительно к генам, кодирующим ключевые ферменты этих систем - СБТТ!, СБТМ!, С5ТР1, ТР53 и МБМ2. При этом чтобы подчеркнуть универсальность участия данных ферментов в онкологических процессах были выбраны две принципиально различные по механизмам развития онкопатологии -немелкоклеточный рак легкого и рак молочной железы.

Противоречивость данных литературы о вкладе полиморфных маркеров генов контроля клеточного цикла и ферментов системы биотрансформации ксенобиотиков в развитие НМРЛ и РМЖ, отсутствие информации о влиянии комбинаций их генотипов, а также связи полиморфных маркеров с метилированием ключевых генов с развитием этих форм рака делает целесообразным, на наш взгляд, проведение исследования по оценке вклада сочетаний этих генов в предрасположенность к НМРЛ и РМЖ. Не менее актуальным представляется установление взаимосвязи повреждения исследуемых генов с клинико-морфологическими особенностями онкозаболеваний, а так же проведение сравнительного анализа полиморфных маркеров генов ТР53, МйМ2, глутатион-8-трансфераз и их комбинаций при НМРЛ и РМЖ. Полученные данные послужат основой для определения дополнительных критериев прогноза клинического течения заболевания.

Целью данного исследования является изучение роли метилирования промоторных районов генов ЯАББРЫ и МСМТ, а так же полиморфных маркеров генов СБТР1, СБТП, ОБТМ!, ТР53 и МВМ2 в патогенезе немелкоклеточного рака легкого и рака молочной железы.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общие закономерности канцерогенеза.

Канцерогенез - это многоступенчатый процесс накопления изменений в геноме клеток, приводящий к появлению асоциальных клеток, характеризующихся морфологическим, функциональным, биохимическим атипизмом, автономным ростом, «ускользанием» клеток от гуморальных и нервных влияний (Hanahan and Weinberg, 2011). Накопление генетических повреждений в клетках сопровождается селекцией клона, способного к неконтролируемой пролиферации, и в дальнейшем к метастазированию. При этом в силу высокой генетической изменчивости и селекции в популяции клеток такого клона постоянно возникают и отбираются все более и более автономные и агрессивные субклоны, что описывается термином опухолевая прогрессия. В результате довольно длительной эволюции неопластического клона формируется опухоль.

В последнее десятилетие достигнут значительный прогресс, как в идентификации генов, нарушения функции которых ведут к развитию новообразований, так и в выяснении роли белковых продуктов таких генов в физиологии клетки. Все это позволило выделить ряд важнейших свойств, приобретение которых предопределяет способность клетки к образованию злокачественной опухоли (Рис. 1).

Во-первых, это - сниженная потребность во внешних сигналах для поддержания клеточной пролиферации, так называемая, самодостаточность в пролиферативных сигналах. Снижение зависимости от факторов роста достигается за счет изменений в системах внутриклеточной сигнализации, в результате возникает секреция необходимых факторов роста, либо резко увеличивается количество рецепторов для факторов роста, либо спонтанно запускается каскад событий, аналогичный тому, который в норме инициируется связыванием ростового фактора со своим рецептором {Cheng et al., 2008; Lemmon et al., 2010).

Во-вторых, отличительной особенностью опухолевых клеток являются приобретенные аномалии в морфологии и движении клеток. В основе морфологических изменений лежат взаимосвязанные между собой нарушения в цитоскелете и в адгезионных взаимодействиях клеток друг с другом и с внеклеточным матриксом. Они выражаются в нарушении формирования фокальных контактов и в ослаблении связи клеток с внеклеточным матриксом. Пониженная потребность неопластических клеток во внешних пролиферативных сигналах и нарушения адгезионных свойств выражаются в потере зависимости от субстрата (Hirohashi et al., 2003; Curto et al., 2007; Shaw, 2009).

Нечувствительность к рост-супрессирующим сигналам

Самодостаточность в пролиферативных сигналах

Генетическая нес табильность

Отсутствие р еплнк ативного старения

Ослабление индукции апоитоза

Стимуляция неоангиогенеза

Изменения Морфологии. Инвазия и мета с тарирование

Блокирование клеточной диффер енцир овки

Рисунок 1. Важнейшие свойства неопластической клетки, приобретаемые в ходе опухолевой прогрессии и обеспечивающие злокачественный рост (из Hanahan and Weinberg, 2011, с модификацией).

Третьей особенностью трансформированных клеток является их пониженная чувствительность к антипролиферативным сигналам. Опухолевые клетки значительно менее чувствительны к действию факторов подавляющих рост опухоли и факторов специфического и неспецифического противоопухолевого иммунитета. Они могут продолжать пролиферацию при повреждении ДНК и при прочих неблагоприятных условиях - недостатке нуклеотидов, гипоксии и т.д. (Алмазов и др., 2007; Ikushima et al., 2010).

Еще одним свойством опухолевых клеток является иммортализация, т.е. не ограниченное деление клеток. В зрелых клетках человека число делений ограничено в пределах 60-80 делений. Между тем, в опухолевых клетках наблюдается нарушение работы такого "счетно-ограничительного" механизма контроля репликации, и связано это с возобновлением работы теломеразы (Cong and Shay, 2008; Raynaud et al, 2010)

Еще одной отличительной особенностью опухолевых клеток по сравнению с нормальными клетками является способность уходить от апоптоза, что резко повышает жизнеспособность опухолевой клетки, делает ее нечувствительной к факторам противоопухолевого иммунитета и терапевтическим воздействиям (Adams et al., 2007).

Важным условием формирования первичной опухоли является неоангиогенез -формирование дополнительной капиллярной сети. Это необходимое условие для дальнейшего роста первичного опухолевого узла размером 1-2 мм. В ином случае, клетки в центре опухоли, не получая кислород и питательные вещества, погибают (Furuya et al., 2005; Raica et al., 2009).

Образование метастазов - это еще один признак онкогенеза и основная причина смерти онкологических больных. Этот процесс является многоступенчатым. Он начинается с местной инвазии (прорастания в расположенную рядом ткань), а затем происходит проникновение раковых клеток в близлежащие кровеносные и лимфатические сосуды. После осуществляется транзит раковых клеток по лимфатическим и кровеносным сосудам, с последующим выходом этих клеток из просвета сосудов в паренхиму отдаленной ткани с образование мелких узелков опухолевых клеток (микрометастазов), и, наконец, рост микрометастазов в полноценные вторичные опухоли (Talmadge and Fidler 2010; Hanahan and Weinberg, 2011).

Важным признаком неопластических клеток является их генетическая нестабильность (Negrini et al., 2010; Salk et al., 2010).

Генетическая нестабильность приводит к накоплению в одной клетке большого числа мутаций в онкогенах, генах-супрессорах опухолевого роста и других генах, придающих клетке совокупность необходимых для образования опухоли свойств. Генетическая нестабильность популяций опухолевых клеток складывается, главным образом, из четырех типов нарушений:

а) уменьшения точности воспроизведения генетической информации, а именно понижения точности репликации ДНК и сегрегации хромосом во время митоза;

б) нарушений в системах репарации повреждений ДНК или ошибок, возникших при ее репликации;

в) ослабления функции «точек проверки» клеточного цикла, активируемых в ответ на повреждения структуры ДНК или веретена деления в митотической клетке, в результате чего клетка (несмотря на разрывы ДНК или изменения числа хромосом) продолжает делиться и умножать число аномальных потомков;

д) ослабления индукции апоптоза, вследствие чего делящиеся клетки с генетическими нарушениями не погибают, а выживают.

В настоящее время уже известно, что новообразования могут возникнуть из органоспецифических или системоспецифических стволовых клеток, однако возможны и другие пути возникновения рака (Bjerkvig et al., 2005). Продолжительный период жизни и высокий митотический потенциал стволовых клеток значительно увеличивает их шансы

на приобретение мутаций. Эти мутации передаются потомкам, увеличивая число клеток, несущих небольшие генетические дефекты. Последовательная аккумуляция соматических мутаций безвозвратно обрекает клетку на злокачественную трансформацию (Salк et al., 2010).

Таким образом, возникновение и развитие новообразований является эволюционным процессом, в котором естественный отбор направлен на сохранение приобретенных признаков опухолевых клонов, предоставляя им селекционное преимущество. Совокупность перечисленных аномалий обеспечивает повышенную частоту возникновения различных генетических нарушений и их закрепление в ряду клеточных поколений (Hanahan and Weinberg, 2011).

1.1.1 Онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста.

В процессе эволюции были выработаны мощные механизмы, направленные на сохранение генетической стабильности и поддержание гомеостаза между действием двух систем регуляции деления клетки. К первой относятся гены, способные индуцировать деление клетки (протоонкогены), значительная часть которых была идентифицирована по гомологии с вирусными онкогенами. Ко второй, относятся гены, препятствующие делению клетки (гены-супрессоры опухолевого роста), иногда называемые также онкосупрессорами. Нарушение этого равновесия является причиной развития патологических процессов, сопровождающих злокачественный рост, в основе которого лежит каскадный процесс генетических повреждений, приводящих к нарушениям регуляции клеточного цикла, апоптоза, дифференцировки, морфогенетической патологии, а также, к неэффективному функционированию факторов специфического и неспецифического противоопухолевого иммунитета, затрагивающий не менее 10-15 генов (Zochbauer-Muller et al., 2002). Хотя общее число мутаций в опухолевых клетках может составлять тысячи, предполагается, что ключевую роль в возникновении опухоли играют нарушения функции генов-супрессоров опухолевого роста (TSG) и протоонкогенов.

Протоонкогены, регулирующие ответы на ростовые факторы, на гормоны и темп делений, находятся под тщательным и жестким контролем. Мутации выводят их из-под воздействия генов контроля, делая их автономными. Существует ряд механизмов, посредством которых протоонкогены приобретают способность трансформировать клетку. Например, хромосомные транслокации приводят к тому, что протоонкоген попадает под контроль действующего промотора и начинает работать непрерывно, не позволяя клетке выйти из цикла делений (туе), или направляя непрерывные сигналы от мембраны в ядро (ras), или стимулируя синтез ростовых факторов, посылающих той же

клетке сигналы к делению (аутокринная стимуляция) (Копнин, 2000). К белковым продуктам протоонкогенов относятся: факторы роста (например, PDHF/sis), рецепторные и нерецепторные тирозин-киназы, цитоплазматические сериновые киназы, ассоциированные с мембраной G-белки (активируемые связыванием ГТФ), факторы транскрипции и другие регуляторы (Татосян, 2000). Продукты многих протоонкогенов включены в разнообразные сигнальные пути и их пересечения внутри клетки ( Vogelstein et al., 2004). Таким образом, мутации в протоонкогенах позволяют за один шаг преодолеть несколько важных этапов опухолевой прогрессии и придать неопластической клетке сразу несколько необходимых свойств.

К настоящему времени открыто большое число генов, вовлеченных в канцерогенез и выполняющих функцию генов-супрессоров. Их участие проявляется в контроле клеточного цикла, регуляции пролифирации, индукции апоптоза, а также в подавлении нео-ангиогенеза, инвазии и метастазов {Hanahan and Weinberg, 2011). Кроме того, TSG могут контролировать трансдукцию сигналов и механизмы адгезии клеток {Vogelstein et al., 2004; Tischoff et al., 2008). Наиболее известные из них приведены в табл. 1.

Гены-супрессоры опухолевого роста (онкосупрессоры), можно разделить на две большие группы по их месту в системе функционирования эукариотической клетки. (Kinzler et al, 1997). Классические онкосупрессоры принимают непосредственное участие в процессе деления клеток, контролируя их вступление в ту или иную фазу клеточного цикла. Эти гены получили название "генов-хранителей клеточного цикла" ("gatekeepers"). Белковые продукты этих генов подавляют прогрессию опухолевого роста, ингибируя процессы, связанные с делением клетки, а так же индуцируют апоптоз на разных этапах малигнизации (Burkhart and Sage, 2008; Coles and Jones, 2009). Также важную роль в подавлении роста опухолей играют и гены, обеспечивающие межклеточные взаимодействия (Hirohashi étal., 2003, Hanahan and Weinberg, 2011).

Вторая группа генов - это "гены общего контроля" ("caretakers"), функция которых состоит в поддержании стабильности генома (Coles and Jones, 2009). К этой группе относят гены чьи белковые продукты участвуют (1) в выявлении повреждений ДНК и активации систем репации, (2) собственно восстановления целостности ДНК, (3) а так же гены ответственные за перехват или инактивацию мутагенных молекул, прежде чем они повредят ДНК (Hanahan and Weinberg, 2011). По отношению к процессу репликации различают несколько типов репарации ДНК. Дорепликативную, в которую входят: 1) общая эксцизионная репарация (например, гены MBD4 и OGG1), 2) прямая репарация (MGMT), 3) эксцизионную репарацию с вырезанием небольших фрагментов ДНК (ХРС и ERCC1) (Lahtz and Pfeifer, 2011; Meng et al., 2012).

Таблица 1. Примеры генов, вовлечённых в патогенез опухолей разной локализации.

Системы клеточной защиты Ген Локализация Функция белковых продуктов гена Типы опухолей

Биотрансформация ксенобиотиков

Фаза I CYP24A1 20ql3 Метаболизм лекарственных веществ, синтез жиров. Поддержание уровня витамина ЭЗ и кальция (Реппа-Магипег е/ а1, 2012) Опухоли щитовидной и молочной железы, аденокарцинома легкого (Chen et al„ 2011; Penna-Martinez et al., 2012)

Фаза II GSTP1 1 lql3 Защита от реактивных радикалов при оксидативном стрессе и выведение свободных радикалов (Хи ег а!., 2012) Опухоли различных эпителиальных локализаций (Jardim et al, 2012; Jankova et al., 2012)

Репарация

Общая эксцизионная репарация MBD4 3q21.3 Регуляция гликозилаз при эксцизионной репарации. (Moréra et al, 2012) Опухоли толстой кишки и яичников (Howard et al., 2009)

OGG1 Зр26.2 Инициация вырезания и удаления модифицированного 8-гидрокси-2-дезоксигуанина. (Хи et al., 2012) Опухоли различных эпителиальных локализаций (Хи et al., 2012)

Прямая репарация MGMT 10q26 Устранение повреждений ДНК, вызванных атакой алкильных радикалов (Ramakrishnan et al, 2011) Немелкоклеточный рак лёгкого, глиобластома и рак молочной железы (Ramakrishnan et al., 2011; Ekim et al, 2011; Neto et al, 2012)

Эксцизионная репарация с вырезанием небольших участков ДНК ХРС 3p25 Участвует в распознавании поврежденной ДНК {Wang et al, 2012) Опухоли мочевого пузыря (Yang et al, 2010)

ERCC1 19ql3.32 Распознавание и удаление одиночных ошибочно спаренных нуклеотидов, а также петель длиной в 1 -3 нуклеотида. (Снегова и др., 2011) Глиома (Chen et al, 2010)

* Жирным шрифтом с подчеркиванием, помечены гены с метилированием промоторных районов в опухолях.

Системы клеточной защиты Ген Локализация Функция белковых продуктов гена Типы опухолей

Репарация

Эксцизионная репарация неспаренных оснований/ошибочно спаренных оснований (Mismatch) MLH1* 2р22 МиН. гомолог. Репарация ошибок транскрипции. (ЯГоейгеГа/., 2012) Опухоли различных эпителиальных локализаций {Czerninski et al., 2009; Lo et al., 2011)

MSH2 Зр21 МШБ гомолог. Репарация ошибок транскрипции (ЪЮекг еГ а1, 2012)

Гомологичная рекомбинация BRCA1 17q21 Устранение двуцепочечных разрывов (?а^е1а1., 2011) Опухоли яичников и молочной железы, наследственный рак молочной железы {Ding et al, 2012)

BRCA2 13ql2

Защита от ионизирующего излучения ATM llq22.1 Индукция репарации, восстановление повреждений ДНК, вызванных воздействием ионизирующего излучения. (БетШвск е/ а1, 2011) Рак шейки матки, атаксия-телеангиэктазия {Mazumder Indra, 2011; Demuth et al., 2011)

Пролиферация и контроль клеточного цикла

CDH1 16q22.1 Регуляция клеточной адгезии и поддержание клеточной стабильности {Zheng et al., 2012). Рак молочной железы, легкого, наследственный рак желудка {Yamada et al., 2011; Tang et al., 2012; Zheng et al., 2012)

PTEN 10q23.3 Регуляция фосфорилирования в клетке, включая фосфорилирование киназ {Baig et al., 2011) Рак молочной железы {Baig et al., 2011)

VHL 3p25 Регуляция клеточного цикла {Cowey et al., 2009) Рак почки, Von-Hippel Lindau синдром {Cowey et al., 2009; Toy et al., 2012)

* Жирным шрифтом с подчеркиванием, помечены гены с метилированием промоторных районов в опухолях.

Системы клеточной защиты TSG Локализация Функция белковых продуктов гена Типы опухолей

Пролиферация и контроль клеточного цикла

RB1 13ql4 Контролирует вход в S-фазу, регулируя активность фактора транскрипции E2F {Wang et al., 2009). Опухоли различных эпителиальных локализаций, наследственная ретинобластома {Sarafzadeh et al, 2008; Wang et al., 2009; Ertel et al, 2010)

WT1 ІІрІЗ Транскрипционный фактор {Dohietal., 2010). Рак толстой кишки, опухоль Вильмса {Wagner et al, 2004; Bejrananda et al, 2010)

МАР2К4 17pll.2 Регуляция дифференцировки клеток, апоптоз {Ahnetal., 2011). Аденокарцинома лёгкого {Ahn etal, 2011)

RASSF1A 3р21.31 Регуляция клеточного цикла, индукция апоптоза {Thaler etal., 2012) Опухоли различных эпителиальных локализаций {Ходырев и др., 2011; Thaler et al, 2012)

АРС 5q21 Транскрипционная регуляция клеточного цикла и адгезии {Benchabane et al, 2009) Рак толстой и прямой кишки, молочной железы {Matuschek et al, 2010; Abdul Murad et al, 2012)

MDM2 12ql4.3 Регуляция ТР53 {Pei et al, 2012) Опухоли различных эпителиальных локализаций {Dong et al., 2011; Alshatwi et al., 2012)

ТР53 17р13 Транскрипционный фактор; «Дирижёр» {Желтухин и Чумаков, 2010) Эпителиальные опухоли различных локализаций, Li-Fraumeni синдром {Желтухин и Чумаков, 2010; Palmero et al, 2010)

* Жирным шрифтом с подчеркиванием, помечены гены с метилированием промоторных районов в опухолях.

16

Пострепликативную, осуществляемую с помощью механизмов, участвующих в процессах рекомбинации и репликации ДНК. Репарация ДНК может осуществляться, как с помощью специфичного набора ферментов, постоянно присутствующих внутри нормально функционирующих клеток (например, эксцизионная и пострепликативная), так и в ответ на повреждение ДНК или прекращение ее синтеза (путем активации групп генов, контролирующих различные клеточные функции, так называемая SOS-репарация) (Lahtz and Pfeifer, 2011).

Обычно скорость мутаций в клетке составляет 1x10"6 на ген, т.е. нужно не менее 6 специфичных мутаций для превращения нормальной клетки в опухолевую. При повреждении генов системы репарации скорость мутаций возрастает на три порядка. Все это, в конечном счете, приводит к инактивации генов-регуляторов клеточного роста и к активации протоонкогенов.

1.2. Современные подходы к поиску новых «онкозначимых» генов.

Основой всех молекулярно-генетических исследований являются манипуляции с ДНК, уникальной биополимерной молекулой, которая несет в себе информацию обо всех молекулах, которые будут синтезированы в клетке. Последовательности нуклеотидов в молекулах ДНК определяют последовательности аминокислот в молекулах белков. От первичной структуры белка зависят его структурные особенности, от которых, в свою очередь, зависят функции полипептидов.

Методики исследования ДНК до недавнего времени были сложными в исполнении, требовали много времени и кропотливой работы. Современные технологии позволяют значительно упростить протоколы исследований, получить результат за короткий промежуток времени и при этом иметь точность и специфичность ответа до 99,9%.

Количество идентифицированных онкогенов и генов-супрессоров опухолей в последнее время значительно возросло. Это связано с прогрессом в расшифровке генома человека, создании общедоступных баз данных и с разработкой новых стратегий для поиска "онкозначимых" генов. Открытие таких генов, помимо несомненного теоретического интереса, расширяет возможности создания новых маркеров для ранней диагностики и прогностики рака, а также создает основу для разработки подходов к генотерапии онкологических заболеваний.

В настоящее время для поиска и анализа, различных онкомаркеров используется целый спектр генетических, эпигенетических и комплексных методов исследования, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки.

1.2.1. Основные подходы к анализу генетического полиморфизма генов в эпителиальных опухолях.

Анализ потерь гетерозиготности.

Основным подходом к выявлению делеций остается анализ потери гетерозиготности полиморфных маркеров (LOH) при сравнении препаратов ДНК, выделенных из опухолевой и нормальной ткани. Впервые полиморфные пробы были использованы для такого анализа в 1983 году (Cavenee et al., 1983). Современный метод анализа LOH основан на использовании маркеров с известной геномной локализацией, созданных на основе последовательностей микросателлитов. Для проверки результатов LOH и поиска гомозиготных делеций применяют мультиплексную ПЦР (Senchenko et al., 2004) и метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Real-time PCR или ПЦР-РВ), позволяющий количественно определить изменения копийности участка хромосомы в опухоли (Bustin et al, 2009).

В отличие от обычной ПЦР, где продукты определяют на конечной стадии реакции, этот метод позволяет наблюдать накопление продуктов ПЦР в экспоненциальной фазе реакции. Линейный отрезок кривой можно использовать для определения начального числа копий исследуемого фрагмента ДНК. К преимуществам метода относятся быстрота, точность определения, воспроизводимость результатов, широкий диапазон концентраций и чувствительность, а также отсутствие дополнительных процедур после завершения реакции. Благодаря тщательно отработанному составу реакционной смеси и температурному режиму, значительно уменьшается риск появления побочных продуктов. Метод применим для полиморфных и неполиморфных STS (sequence tagged site) маркеров (Bustin et al, 2005, 2009).

TaqMan Real-time PCR состоит из двух основных стадий: 1) гибридизации исследуемой ДНК с TaqMan-пробой (коротким олигонуклеотидом, содержащим на 5'-конце флуоресцентный краситель) и 2) ПЦР, катализируемой ДНК-полимеразой Taq, которая, обладает 5'-экзонуклеазной активностью и одновременно расщепляет TaqMan-пробу (Рис. 2.). Это приводит к нарастанию флуоресцентного сигнала в результате нарушения взаимодействия репортерного красителя с "гасителем", находящимся на 3'-конце пробы. Измерение флуоресценции во время экспоненциальной фазы позволяет определить величину порогового цикла С/, обратно пропорциональную исходному числу копий анализируемой ДНК.

І

денптуряціш ДНК

отжиг ДНК-зондов

разрушение ДНК-зондов за счет 5' -экзончклеазной активности Тги^-ДНК-пол і ім-ераз ы

Рисунок 2. Принцип детекции ПЦР-продуктов с использованием зондов.

Таяшап. Ф - флюорофор. Г - гаситель

Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ)

Впервые ПДРФ был использован как генетический маркер в 1974 г. при идентификации термо-чувствительной мутации в геноме аденовируса (Grodzicker et al., 1975). Однако широкое применение вариантов полиморфизма ДНК в качестве генетических маркеров началось с 1980 г. после выхода основополагающей работы Ботштейна с соавт. (Botstein et al., 1980), в которой были изучены свойства ПДРФ как генетического маркера, дано теоретическое обоснование его использования и предложен метод оценки уровня информативности (PIC - polymorphism information content). Основной причиной, приводящей к возникновению полиморфизма ДНК, первоначально считались точковые мутации (а также микроделеции и инсерции), затрагивающие сайты узнавания тех или иных эндонуклеаз рестрикции. В дальнейшем спектр возможных причин был расширен, и в настоящее время основная роль отводится таким факторам, как крупные делеции и вставки, трансверсии, транслокации, транспозиции мобильных генетических элементов и т.п. Кроме того, некоторые рестриктазы не способны расщеплять ДНК, если сайт узнавания содержит один или несколько метилированных цитозиновых остатков. Такие ферменты также могут выявить полиморфизм, если имеются вариации в характере метилирования.

Метод ПЦР-ПДРФ относится к ферментативным методам анализа SNPs (Single nucleotide polymorphisms - полиморфизмы с однонуклеотидными заменами). Рестрикции (одной или несколькими рестриктазами) в этом случае подвергаются продукты амплификации, а не геномная ДНК. Благодаря простоте и надежности метод получил широкое распространение и до сих пор используется для анализа аллельного полиморфизма генов у самых разных объектов, в том числе и в злокачественных опухолях (Chuang et al., 2008). Ограничением метода является то, что с его помощью можно тестировать только известные мутации, затрагивающие сайты рестрикции.

На данный момент для детекции известных SNP чаще всего используются алель-специфичные праймеры совмесно с ПЦР-РВ. Основное преимущество заключается в том, что использование специальных флуоресцентных меток позволяет отказаться от стадии электрофореза, что ведет к резкому уменьшению вероятности контаминации исследуемых проб продуктами амплификации. Кроме того, флуоресцентная детекция продуктов ПЦР в пробирке в 2-3 раза чувствительнее электрофорезной детекции. Метод основан на использовании зондов с комплементарными концевыми последовательностями (Molecular Beacons) (Рис. 3) (Епринцев и др., 2008). Данная методика характеризуется тем, что концевые последовательности зонда представляют

собой взаимно комплементарные области из 5-6 оснований, вследствие чего они находятся в замкнутом состоянии и образуют «шпильки».

Внутренняя часть зондов содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную амплифицируемой области. «Шпилька» зонда в процессе ПЦР денатурирует, и концы зонда (флуоресцентная метка и гаситель) расходятся в разные стороны, и он специфически присоединяется к матрице. Затем под действием 5'-эндонуклеазной активности Тая-полимеразы, достраивающей новую цепь ДНК от праймера, зонд разрезается, флуорофор оказывается свободным от гасителя. В результате увеличивается интенсивность свечения. При отсутствии специфического отжига праймеров и зондов, не происходит присоединение их к ДНК-матрице и сохраняется тушение флуоресценции (ВияНп е1 а!., 2005). Следует, однако, помнить о том, что совершенность метода ведёт к увеличению его себестоимости. Кроме того, следует учитывать целесообразность исследования в зависимости от количества пациентов и задач. Подбор праймеров с учётом «правильных» флюорофоров и гасителей, также непрост. Наконец, высокая точность метода требует исключительной чистоты проб, так как в случае ошибки, невозможно понять, что случилось в отличие от обычного ПЦР-ПДРФ анализа.

Еще одним методом анализа БЫР, позволяющим отказаться от стадии электрофореза, стал метод построения «кривых плавления» (ЕгаИ е/ а1, 2008). Данный метод основан на том, что для конкретной ДНК-последовательности существует своя температура плавления. Если мы будем повышать температуру раствора ДНК, то на каком-то уровне средняя кинетическая энергия молекул окажется выше энергии водородных связей, которыми скреплены половинки двойной спирали. Отсюда следует, что по ширине интервала температур, в котором ДНК плавится, можно судить о ее составе.

«Кривые плавления» исследуют после окончания ПЦР, когда реакционную смесь нагревают, и молекула флюорофора отщепляется от ДНК, и ее флуоресценция резко снижается. Если в пробирке находятся ампликоны с разной температурой плавления, то на кривой будет видно несколько пиков, каждый из которых будет соответствовать своему ампликону (Рис. 4). Тем не менее, у данного метода существует ряд недостатков. Во-первых, требуется серьёзная подготовительяная работа, заключающаяся в калибровке прибора, с использованием большого числа контрольных проб, причем под каждый полиморфный маркер прибор приходится калибровать поновой. Контрольные пробы должны содержать АА (верхняя) и ВВ (нижняя) гомозиготы и АВ гетерозиготу, где А и В два аллеля с разными

Ii IIIIIIIIIMIIIIIIII III И денатурация ДНК"

о1' -( V

n.niiimiiiiiiii р

мін отжиг ДНК-зонда

Рисунок 3. Принцип детекции ПЦР-продуктов с использованием зондов

Molecular Beacons. Ф - флюорофор. Г - гаситель (Епринцев, и др., 2008)

Кривая Диссоциации

Температура (С)

Флюорофор = SYBR Green. Tm « 70 1 'С Проба(ы) А8.В8.С8.Н8

Заболевание/Геи/Полиморфный маркер PM>K/GSTP1/lte105Val

Рисунок 4. Исследование полученных ампликонов с помощью «кривых плавления». Tm 70,1 - начальная температура плавления контрольной пробы (без ДНК - соответсвует температуре отжига димеров праймеров). Красная линия соответствует плавлению аллеля Не с флюорофором. Зелёная линия - сочетанию аллелей Не + Val. Синяя линия - аллелю Val. Фиолетовая линия - контрольного образца (без ДНК).

температурами плавления. Во-вторых, требуется получение чистого ПЦР продукта, несодержащего неспецифических продуктов ПЦР. Не соблюдение данных правил приводит к смещению кривых плавления относительно контрольных проб, что значительно затрудняет анализ (ЕгаН еГ а1, 2008). Данный метод подходит для анализа значительных выборок образцов.

1.2.2. Подходы к анализу метилирования промоторных районов генов в эпителиальных опухолях.

Одним из старейших методов анализа метилирования является Саузерн-блот-гибридизация {1$$а е/ а1., 1994). Этому методу свойственны определенные ограничения: 1) требуется большое количество высокомолекулярной ДНК, что невозможно, например, при использовании парафинированных образцов; 2) недостаточная чувствительность при поиске метилирования в гетерогенных образцах, таких как биопсия, в которых кроме опухолевых клеток значительную долю составляют нормальные клетки; 3) метод дает информацию о метилировании только тех СрО-динуклеотидов, которые относятся к участкам узнавания соответствующих рестриктаз.

Анализ метилирования фрагментов ДНК с применением метилчувствительных рестриктаз (МЧРА).

Этот метод основан на комбинировании метилчувствительных рестриктаз и ПЦР {Логинов и др., 2004). Продукт ПЦР виден только в тех случаях, когда расщепление геномной ДНК рестриктазой было запрещено метилированием. Чувствительность метода выше, чем при гибридизации по Саузерну. Этот подход позволяет анализировать метилированные аллели в присутствии большого избытка аллелей дикого типа, но он не лишен ряда минусов: 1) исследуется метилирование только тех СрО-динуклеотидов, которые входят в состав участков узнавания метилчувствительных рестриктаз; 2) зависит от полноты расщепления рестриктазами геномной ДНК; 3) недостаточная очистка ДНК от белка может приводить к ложно-положительным результатам.

Метилспецифический фингерпринтинг (МСФ).

Этот метод направлен на выявление аномального метилирования новых генов, вовлеченных в канцерогенез, в различных формах опухолей или на разных стадиях злокачественного процесса {Залетаев и др., 2004). Сначала проводится гидролиз геномной ДНК с использованием двух ферментов рестрикции, один из которых

23

является метилчувствительным. В первом варианте метода олигонуклеотидные праймеры для ПЦР являются неспецифическими, содеожащими только цитозин и гуанин, что характерно для CpG-островков промоторных областей генов. Во втором варианте метода используются наборы специфических праймеров для CpG-островков определенных генов. В результате неспецифической амплификации наблюдается набор полос различной молекулярной массы. Сравнение картины амплификации, полученной на образцах ДНК из нормальных тканей и опухолевого материала, позволяют определить необычные фрагменты, которые могут свидетельствовать об аномальном метилировании какого-либо гена при заболевании.

Бисульфитный сиквенс.

Этот метод (Frommer et al, 1992) основан на модификации ДНК, в результате которой все цитозины переходят в урацил, в отличие от метилированных 5'-метилцитозинов. Модифицированные образцы должны быть амплифицированы и секвенированы. В некоторых случаях (гетерогенность материала) требуется предварительное клонирование ПЦР-продуктов. Основными проблемами данной методики является ее трудоемкость и непригодность к быстрому скринингу больших выборок образцов. Но в то же время она позволяет наиболее точно исследовать уровень метилирования гена в опухолях и оценить степень гетерогенности материала.

Метилспецифияная ПЦР (МС-ПЦР).

МС-ПЦР основана на бисульфитной конверсии метилированной или неметилированной нуклеотидной последовательности ДНК с последующей ПЦР (Herman et al, 1996).

Преимуществами МС-ПЦР являются: 1) отсутствие необходимости применения рестриктаз и как следствие отсутствие проблем с неполной рестрикцией; 2) возможность анализа метилирования CpG-динуклеотидов независимо от наличия участков рестрикции. 3) метод позволяет работать с архивными образцами.

Чувствительность метода МС-ПЦР для разных генов сильно различается и

5 2

колеблется от 10" до 10" (Herman et al, 1996). Высокая эффективность метода подтвердилась при исследовании пациентов с плоскоклеточным раком головы и шеи, было показано почти 100% метилирование промоторных районов генов RASSF1A и MGMT (Koutsimpelas et al, 2012).

Комбинированный бисульфит-рестриктазный анализ (КОБРА).

Метод основан на стандартной процедуре модификации ДНК бисульфитом с последующим расщеплением продуктов ПЦР рестриктазами и количественным

анализом (ВиЬпоу е( а1, 2012). Праймеры для ПЦР не содержат в своем составе СрО-динуклеотидов, для того чтобы не зависеть от статуса метилирования исследуемого образца. При анализе продуктов ПЦР из гетерогенной популяции, результат будет отражать процентное соотношение метилированных аллелей на данном участке ДНК.

Бисульфитная ПЦР^БСР (ШР8).

Разработан метод, основанный на бисульфитной обработке ДНК с последующим БЭСР анализом продуктов ПЦР (.Ыото/о е/ а1, 2002). Праймеры подобраны таким образом, чтобы они работали независимо от статуса метилирования исходной последовательности ДНК. В1РБ позволяет легко оценить уровень метилирования фрагмента ДНК и соотношение метилированных аллелей. Если все сайты в данном фрагменте в исследуемом образце метилированы, то на геле будет видна одна полоса. Однако иногда продукт виден в виде двух полос или смазан, что обусловлено неоднородностью метилирования и гетерогенностью исходного материала, и не подходит для количественного анализа.

Модификация ДНК бисульфитом в комбинации с полимеразной цепной реакцией в реальном времени (ПЦР-РВ).

На первом этапе проводится стандартная обработка геномной ДНК бисульфитом, на втором - гибридизация с пробой, содержащей на 5'- конце флуоресцентный краситель (БАМ) и на 3' - гаситель (ТАМЯА) (ОЪхЫта е/ а1, 2012). К преимуществам такой комбинации методов относятся, в первую очередь, повышение чувствительности и получение количественной характеристики степени метилирования гена в образце, например, возможность оценить долю клеток, в которых ген метилирован.

Метод мети л специфичных микропанелей.

На первом этапе проводится стандартная обработка геномной ДНК бисульфитом с последующей ПЦР. Праймеры для ПЦР не содержат в своем составе СрО-динуклеотидов. На следующем этапе проводится гибридизация ПЦР-продукта с олигонуклеотидными ДНК-мишенями, прикрепленными 5'-концом к подложке (например, предметному стеклу) и мечеными флюоресцентным красителем на 3'-конце (Су5 или СуЗ). Условия гибридизации подбираются так, чтобы не происходила одновременная гибридизация метилированного и неметилированного аллелей (НауазЫ е/ а1, 2007). Метод позволяет анализировать, как единичные СрО-динуклеотиды, так и несколько Срв, расположенных рядом в ОС-богатых генах, и проводить одновременный анализ метилирования промоторных районов нескольких генов.

1.2.3. Комплексные подходы.

Пиросеквенирование

На протяжении последних 30 лет метод Сэнгера был основным методом и «золотым» стандартом для секвенирования ДНК. На его основе был разработан метод пиросеквенирования. Он позволяет выявлять образованную de novo нуклеотидную последовательность, помещённую в виде раствора в специальную плашку. Метод основан на отщеплении пирофосфата, образующегося в результате взаимодействия с аденозин-5'-фосфосульфатом, с последующим образованием АТФ. В результате этого процесса усиливается люциферазная активность. Свет, полученный в результате этой активности, улавливается ПЗС камерой (прибор с зарядовой связью (от англ. CCD, «Charge-Coupled Device) взято из http://ru.wikipedia.org/wiki/n3C-MaTpHua). Высота каждого пика соответсвует своему световому сигналу и соответсвует своему нуклеотиду в исследуемой последовательности. АТФ и неспаренные нуклеотиды разрушаются под действием апираз. Как только свечение исчезает, добаляется следующий нуклеотид-три фосфат. В процессе формируется комплементарная цепь, а нуклеотиды перестают светить на пирограмме. На данный момент пиросеквенирование используется для количественной оценки в следующих направлениях: анализ мутаций, приводящих к развитию опухолей; полиплоидия обнаружение SNP в полиплоидном организме; гетероплазмия - анализ количества мутированных и диких типов митохондриальной ДНК; SNP, ассоциированные с риском развития мультифакторных заболеваний (Wang et al., 2007; Ronaghi et al., 2007).

Таким образом, пиросеквенирование позволяет решить ряд важных задач практической медицины, тем не менее, существует ряд недостатков, снижающих производительность анализа, но увеличивающих его цену: не различаются гомогенные повторы >5N; необходимы дНТФ высшей очистки; вместо дАТФ используется более дорогой дАТФаБ; термолабильность люциферазы; утечка PPi и АТФ из лунок проточной ячейки; низкая эффективность регистрации фотонов; высокая стоимость расходных реагентов; невозможность проводить мультиплексный анализ.

Полногеномные исследования

На рубеже прошедшего и нового десятилетий большую популярность получило т.н. полногеномные исследование полиморфных аллелей (genome-wide association studies, GWAS). Общее количество известных полиморфных маркеров приближается к 7 миллионам. К счастью, многие аллели характеризуются сцепленностью, поэтому

генотипирование «всего» нескольких сотен тысяч однонуклеотидных вариаций (single nuceotide polymorphisms, SNPs) позволяет с высокой долей достоверности предсказать полиморфный статус всего генома. Полногеномные исследования ассоциаций проводятся на огромных коллекциях ДНК, включающих десятки тысяч онкологических больных и здоровых контролей (Hartman et al., 2010). Так же все большую популярность получает полногеномное секвенирование (whole genome sequencing). Относительно доступной разновидностью этого метода является полноэкзомное секвенирование (whole exome sequencing), при котором анализ нуклеотидной последовательности ограничивается только кодирующими участками генома (Haimovich et al., 2011; Yu et al., 2012).

Применение этой группы методов позволяет получить исчерпывающую информацию о наборе мутаций и генных полиморфизмов в каждом индивидуальном образце ДНК. Полногеномное секвенирование применяется как для анализа соматических мутаций в опухолевой ткани, так и для идентификации генных нарушений при наследственных заболеваниях. Использование высокопроизводительного секвенирования нового поколения пока ограничивается единичными биологическими образцами - это связано как с высокой стоимостью соответствующих технологий, так и с некоторыми техническими ограничениями существующих методик. Тем не менее, именно полногеномное секвенирование имеет наилучшие шансы на скорейшее внедрение в повседневную клиническую практику -это связано как с безусловной ценностью информации, продуцируемой данным методом, так и с его стремительной адаптацией к требованиям учёных и врачей (Ross and Cronin, 2011).

Однако применение этих технологий для исследования клинического материала - опухолей - наталкивается на значительные затруднения. «Реальные» опухоли характеризуются огромной гетерогенностью, различаются между собой по содержанию и композиции стромальных элементов, возникают на фоне различных генетических, эпигенетических, метаболических и внешних факторов, и т.д. и т.п. Таким образом, задача сопоставления получаемых данных оказывается несравнимо сложнее, чем анализ различных состояний одних и тех же клеток. При формировании этого направления науки - 10-12 лет назад - практически все публикации обещали скорейший практический эффект от соответствующих разработок. Подобные заявления игнорировали тот факт, что истинная клиническая значимость теста предусматривает не только существенное изменение тактики лечения на основе

получаемых данных, но и заметное улучшение результатов проводимых лечебных мероприятий.

К сожалению, ни один из рекламируемых на сегодняшний день «микрочиповых» подходов пока не приблизился к уровню практической значимости, позволяющему поставить высокопроизводительный анализ биомолекул в один ряд с «устоявшимися» лабораторными методиками.

1.3. Роль генных полиморфизмов в формировании онкологического риска

Индивидуальная предрасположенность к возникновению опухолей может быть обусловлена и нормальными вариациями генома - генетическими полиморфизмами. Например, было показано, что риск возникновения карцином легкого, мочевого пузыря и толстой кишки увеличивается в случае носительства неблагоприятного сочетания полиморфных маркеров генов, вовлеченных в метаболизм табачных смол (García-Closas et al., 2005; Schwartz et al., 2007). Получено немало данных об аллельных вариантах генов стероидного метаболизма, принимающих участие в формировании риска опухолей репродуктивной системы (Gulyaeva et al., 2008). Возможная ассоциация между полиморфными маркерами генов репарации и онкологическим риском также активно изучалась в течение последних лет (Dufloth et al., 2008).

Также заслуживают пристального внимания гены, продукты которых принимают участие в апоптотическом ответе клетки на повреждение ДНК. В норме, когда изменения в химической структуре ДНК не могут быть устранены системой репарации, запускается программа клеточного суицида - апоптоза. Однако интенсивность этих процессов может колебаться в достаточно широком диапазоне, что во многом определяется генетической конституцией индивидуума. Таким образом, пониженная эффективность работы апоптотических каскадов может привести к накоплению в организме клеток, содержащих мутации в онкогенах или генах-супрессорах, что, безусловно, сопряжено с увеличением индивидуального онкологического риска. В пользу высказанного предположения свидетельствуют результаты некоторых фенотипических исследований, продемонстрировавших связь между сниженной способностью к апоптозу и повышенным онкологическим риском (Dentaria et al., 2010; Pérez-Losada et al., 2011). Появились отдельные работы, касающиеся встречаемости полиморфизмов генов апоптоза в группах больных раком

легкого и раком молочной железы (Нап et al., 2010; Alimirah et al., 2011; Lin et al., 2012)

1.3.1. Полиморфные маркеры генов глутагион-8-трансфера$ в патогенезе онкологических заболеваний.

Поступающие в организм чужеродные вещества (химические агенты, лекарственные средства, вирусы и др.) подвергаются метаболизму с участием ферментативной системы биотрансформации жирорастворимых эндогенных и экзогенных соединений в полярные водорастворимые производные. Как известно, процесс биотрансформации включает в себя две последовательные стадии. Ферменты первой фазы связывают ксенобиотики с образованием мутагенных промежуточных метаболитов (таких, как супероксид-анион-радикал и ароматические углеводороды), которые под действием ферментов второй фазы превращаются в нетоксичные для клетки водорастворимые продукты, легко выводимые из организма.

К ферментам второй фазы метаболизма ксенобиотиков относятся Глутатион-S-трансферазы (GSTs). У человека выделяют несколько классов глутатион-S-трансфераз: alpha (A), kappa (К), mu (M), omega (О), pi (Р), thêta (Т) и микросомальные (Frova, 2006). Эти ферменты катализируют реакцию конъюгации окисленного глутатиона через сульфгидрильную группу с электрофильными центрами большого разнообразия субстратов, тем самым вовлекаясь в процесс защиты организма против вредных экзогенных субстратов {Christiansen et al., 2006).

Гены, кодирующие mu (M) класс ферментов, организованы в генный кластер, расположенный в области короткого плеча первой хромосомы (1р13.3), который включает в себя 5 сцепленных генов: 5'-GSTM4-GSTM2-GSTM1-GSTM5-GSTM3-3' (Nebert and Vasiliou, 2004). Ген GSTM1 протяженностью в 6 т.п.н. состоит из 8 экзонов и 7 интронов (Timofeeva et al., 2009). Локус GSTM1 является полиморфным и представлен тремя аллельными вариантами: GSTM1 A, GSTM1 В, GSTM1 0. Аллельные варианты GSTM1 А и GSTM1 В являются функционально активными, отличаясь единственной заменой K127N, и кодируют белки, мало различающиеся по своей ферментативной активности. Наиболее значимым для генетических и биомедицинских исследований является «нулевой» вариант GSTM1 0, возникший в результате делеции вследствие неравного кроссинговера между гомологичными последовательностями, фланкирующими ген GSTM1 (Рис. 5а). В результате делеции соответствующий белковый продукт не синтезируется.

GSTM4 GSTM2

GSTM1

GSTM5 GSTM3

нормальный

аллель

нулевой

аллель

-О

НАЗ GSTT1 HAS GSTT2

50 т.п.н. 1

нормальный

аллель

нулевой

аллель

В

GSTP1

Ген 2,8 т.п.н.

мРНК Г-тг 0,75 т.п.н. Щ£

МЛ 1

и

I / \ / \

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Бурденный, Алексей Михайлович

выводы

1. Обнаружена высокодостоверная ассоциация полиморфных маркеров генов систем биотрансформации (б^ГМ/, 08ТТ1, СБТР!) и пролиферации клеточного цикла и апоптоза (ТР53 и МБМ2) с развитием НМРЛ и РМЖ и их гистологических подтипов.

2. Составлен профиль метилирования СрО-островков промоторных районов генов МСМТ и КАБЗПА. Впервые показано значимое повышение частоты метилирования гена МСМТ при раке молочной железы.

3. Показана ассоциация полиморфных маркеров изученных генов (Сг8ТМ1, ОБТП, С8ТР1, ТР53 и Ш)М2) и метилирования промоторных районов генов МСМТ и 11А88ПА с клинико-гистологическими и патофизиологическими параметрами опухолей.

4. Впервые выявлена статистически значимая ассоциация частоты метилирования гена МСМТ с прогрессией РМЖ, в том числе и у пациентов с трижды негативным раком молочной железы.

5. Обнаружены высоко достоверные ассоциации сочетанных генотипов исследованных в работе генов с риском развития НМРЛ и РМЖ. Выявлены как общие, так и специфичные предраспологающие сочетанные генотипы для НМРЛ и РМЖ.

6. Показано независимое влияние на риск развития НМРЛ генетических и эпигенетических факторов онкологического процесса.

7. Впервые показана связь полиморфных вариантов ферментов второй фазы биотрансформации ксенобиотиков и апаптоза с метилированием генов супрессоров опухолей с риском развития РМЖ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Бурденный, Алексей Михайлович, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алмазов В.П., Кочетков Д.В., Чумаков П.М. р53 - Инструмент для терапии злокачественных заболеваний человека. Молекулярная биология. 2007, 41(6), 947963

2. Баранов B.C. Генетический паспорт - основа индивидуальной и предиктивной медицины. Санкт-Петербург: H-JI. 2009, 527 с

3. Ванюшин Б.Ф. Метилирование ДНК и эпигенетика. Генетика. 2006, 42(9), 1186— 1199

4. ДНК-технология. Методическое пособие. Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР). Москва. 2012, 68-71

5. Епринцев А.Т., Попов В.Н., Федорин Д.Н. Идентификация и исследование экспрессии генов Учебно-методическое пособие для вузов Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета. 2008, 2831

6. Ермоленко H.A., Боярских У.А., Сушко А.Г., Воронина E.H., Селезнева И.А., Синкина Т.В., Лазарев А.Ф., Петрова В.Д., Филипенко М.Л. Исследование влияния однонуклеотидных замен в генах MnSOD, GPX1 и GSTP1 на риск развития семейного и спорадического рака молочной железы у жительниц Алтайского края Российской Федерации. Генетика. 2010, 46(12), 1685-1691

7. Желтухин А.О. и Чумаков П.М. Повседневные и индуцируемые функции гена р53. Успехи биоорганической химии. 2010, 50, 447-516

8. Залетаев Д.В., Немцова М.В., Стрельников В.В., Бабенко О.В., Васильев Е.В., Землякова В.В., Жевлова А.И., Дрозд О.В.. Диагностика эпигенетической патологии при наследственных и онкологических заболеваниях. Молекулярная биология. 2004, 38(2), 213-223

9. Землякова В. В., Жевлова А.И., Стрельников В.В., Любченко Л.Н., Вишневская Я.В., Третьякова В.А., Залетаев Д.В., Немцова М.В. Аномальное метилирование некоторых генов-супрессоров при спорадическом раке молочной железы. Молекулярная биология. 2003, 37(4), 696-703

10. Имянитов Е.Н Наследственный рак молочной железы Практическая онкология. 2010, 11(4), 258-266.

11. Имянитов E.H., Молекулярная патология рака лёгкого: клинические аспекты. Практическая онкология. 2006, 7(3), 131-137

12. Киселева Н.П., Киселев Ф.Л. Деметилирование ДНК и канцерогенез (обзор). Биохимия. 2005, 70, 900-912

13. Копнин Б.П. Опухолевые супрессоры и мутаторные гены. Сборник обзорных статей «Канцерогенез», под ред. Д.Г. Заридзе, М: Научн. Мир. 2000, 75-92

14. Копнин Б.П., Копнин П.Б., Хромова Н.В., Агапова Л.С.. Многоликий р53: разнообразие форм, функций, опухольсупрессирующих и онкогенных активностей. Клиническая онкогематология. 2008,1(1), 2-9

15. Корчагина Р.П., Осипова Л.П., Вавилова H.A., Ермоленко H.A., Воронина E.H., Филипенко М.Л. Полиморфизм генов биотрансформации ксенобиотиков GSTM1, GSTT1, CYP2D6, вероятных маркеров риска онкологических заболеваний, в популяциях коренных этносов и русских Северной Сибири. Вавиловский журнал генетики и селекции. 2011, 15(3), 448—461

16. Лихтенштейн A.B., Киселева Н.П. Биохимия. 2001, 66(3), 657-69

17. Логинов В.И., Малюкова A.B., Серегин Ю.А., Ходырев Д.С, Казубская Т.П., Ермилова В.Д., Гарькавцева Р.Ф., Киселев Л.Л, Забаровский Е.Р., Брага Э.А. Уровень метилирования гена RASSF1A в эпителиальных опухолях почки, молочной железы и яичников. Молекуляр. биология. 2004, 38, 654-667

18. Логинов В.И., Ходырев Д.С., Пронина И.В., Малюкова A.B., Казубская Т.П., Ермилова В.Д., Гарькавцева Р.Ф., Забаровский Е.Р., Брага Э.А. Два CpG-островка гена SEMA3B: метилирование при светлоклеточном раке почки. Молекуляр. Биология, 2009,43(3), 436-445

19. Мартов С.И., Севостьянова Н.В., Дмитриева А.И., Кошель А.П., Степовая Е.А., Клоков С.С., Ракитин C.B., Залесная Е.В., Карпович A.B., Маевский Е.И. Полиморфизм генов ферментов первой и второй фазы биотрансформации ксенобиотиков у больных раком желудка, Сибирский онкологический журнал. 2010, 4(40), 30-33

20. Мусаева Н.Э., Дыхно Ю.А.. Качество жизни больных при раке молочной железы, Сибирский Онкологический Журнал. 2005, 2(14), 50-55

21. Пономарева A.A., Е.Ю. Рыкова, H.B. Чердынцева, Чойнзонов E.JL, Лактионов П.П., Власов В.В. Молекулярно-генетические маркеры в диагностике рака легкого. Молекулярная биология. 2011, 45(2), 203-217

22. Пфайфер Г.П., Дамманн Р. Метилирование гена опухолевого супрессора RASSFIA в человеческих опухолях. Биохимия. 2005, 70, 699-708

23. Ревазова Ю.А., Хрипач Л.В., Сидорова И.Е., Юрченко В.В., Зыкова И.Е. Комплексный подход к оценке нестабильности генома человека. Вестник Российской АМН. 2006, 4, 36-41

24. Снегова A.B., Манзюк Л.В. Значение биомаркеров для определения тактики лечения и прогноза злокачественных опухолей. Практическая онкология. 2011, 12(4), 166-170

25. Степанов И.В., Завьялова М.В., Григорьева Е.С., Букурова Ю.А., Афанасьев С.Г., Чердынцева Н.В. Клинико-морфологические и молекулярно-генетические особенности интестинального и диффузного типов карцином желудка. Сибирский онкологический журнал. 2010, 4(40), 55-66

26. Татосян А.Г. 2000. Онкогены. Сборник обзорных статей «Канцерогенез», под ред. Д.Г. Заридзе, М: Научн. Мир, 57-74

27. Тюляндин С.А., Стенина М.Б., Фролова М.А. Тройной негативный рак молочной железы. Практическая онкология. 2010, 11(4), 247-252

28. Ходырев Д.С., Логинов В.И., Пронина И.В., Казубская Т.П., Забаровский Е.Р., Брага Э.А. Изменение метилирования генов из критичных районов хромосомы 3 в эпителиальных опухолях. Молекулярная медицина. 2011, 1, 3-10

29. Хрунин A.B., Хохрин Д.В., Лимборская С.А. Полиморфизм генов глутатион-S-трансфераз в популяциях русского населения европейской части России. Генетика. 2008, 44, 1429-1434

30. Чакова H.H., Михаленко Е.П., Полонецкая С.Н., Чеботарева Н.В., Демидчик Ю.Е., Жилко A.A., Квитко О.В., Крупнова Э.В. Полиморфизм GST-генов и цитогенетические изменения в ткани легкого больных раком легкого. Цитология и генетика. 2009, 43(1), 48-53

31. Чумаков П.М. Белок р53 и его универсальные функции в многоклеточном организме. Успехи биологической химии. 2007, 47, 3-52

32. Abbas A, Delvinquiere K, Lechevrel M, Lebailly P, Gauduchon P, Launoy G, Sichel F. GSTM1, GSTT1, GSTP1 and CYP1A1 genetic polymorphisms and susceptibility to esophageal cancer in a French population: different pattern of squamous cell carcinoma and adenocarcinoma. World J Gastroenterol. 2004, 10(23), 3389-3393

33. Abdul Murad NA, Othman Z, Khalid M, Abdul Razak Z, Hussain R, Nadesan S, Sagap I, Mohamed Rose I, Wan Ngah WZ, Jamal R. Missense mutations in MLH1, MSH2, KRAS, and APC genes in colorectal cancer patients in Malaysia. Dig Dis Sci. 2012, 57(11), 2863-2872

34. Adams J.M. and Cory S. The Bcl-2 apoptotic switch in cancer development and therapy. Oncogene. 2007, 26, 1324-1337

35. Ahmad ST, Arjumand W, Seth A, Kumar Saini A, Sultana S. Impact of glutathione transferase Ml, Tl, and PI gene polymorphisms in the genetic susceptibility of North Indian population to renal cell carcinoma. DNA Cell Biol. 2012, 31(4), 636-643

36. Ahn YH, Yang Y, Gibbons DL, Creighton CJ, Yang F, Wistuba II, Lin W, Thilaganathan N, Alvarez CA, Roybal J, Goldsmith EJ, Tournier C, Kurie JM. Map2k4 functions as a tumor suppressor in lung adenocarcinoma and inhibits tumor cell invasion by decreasing peroxisome proliferator-activated receptor y2 expression. Mol Cell Biol. 2011, 31(21), 4270-4285.

37. Alawadi S, Ghabreau L, Alsaleh M, Abdulaziz Z, Rafeek M, Akil N, Alkhalaf M. P53 gene polymorphisms and breast cancer risk in Arab women. Med Oncol. 2011, 28(3), 709-715

38. Alimirah F, Peng X, Murillo G, Mehta RG. Functional significance of vitamin D receptor Fokl polymorphism in human breast cancer cells. PLoS One. 2011, 6(1) el6024

39. Alshatwi AA, Hasan TN, Shafi G, Alsaif MA, Al-Hazzani AA, Alsaif AA. A single-nucleotide polymorphism in the TP53 and MDM-2 gene modifies breast cancer risk in an ethnic Arab population. Fundam Clin Pharmacol. 2012, 26(3), 438-43.

40. Amatu A, Sartore-Bianchi A, Moutinho C, Belotti A, Bencardino K, Chirico G, Cassingena A, Rusconi F, Esposito A, Nichelatti M, Esteller M, Siena S. Promoter CpG Island Hypermethylation of the DNA Repair Enzyme MGMT Predicts Clinical Response to Dacarbazine in a Phase II Study for Metastatic Colorectal Cancer. Clin Cancer Res. 2013, 19(8), 2265-2272

41. Antognelli C, Del Buono C, Ludovini V, Gori S, Talesa VN, Crin6 L, Barberini F, Rulli A. CYP17, GSTP1, PON1 and GLOl gene polymorphisms as risk factors for breast cancer: an Italian case-control study. BMC Cancer. 2009, 9, 115

42. Arnold CN, Sosnowski A, Schmitt-Graff A, Arnold R, Blum HE. Analysis of molecular pathways in sporadic neuroendocrine tumors of the gastro-entero-pancreatic system. Int J Cancer. 2007, 120(10), 2157-2164

43. Asadzadeh VF, Breeders MJ, Kiemeney LA, Verbeek AL. Opportunity for breast cancer screening in limited resource countries: a literature review and implications for Iran. Asian Pac J Cancer Prev. 2011,12(10), 2467-2475

44. Atinkaya C, Taspinar M, Sakiragaoglu O, Oz G, Yazici U, Oztuna D, Tastepe I, Sunguroglu A. The effect of CYP1A1, GSTT1 and GSTM1 polymorphisms on the risk of lung cancer: a case-control study. Hum Exp Toxicol. 2012, 31(10), 1074-1080.

45. Auerkari EI. Methylation of tumor suppressor genes pl6(INK4a), p27(Kipl) and E-cadherin in carcinogenesis. Oral Oncol. 2006, 42(1), 5-13

46. Baig RM, Mahjabeen I, Sabir M, Masood N, Hafeez S, Malik FA, Kayani MA. Genetic changes in the PTEN gene and their association with breast cancer in Pakistan. Asian Pac J Cancer Prev. 2011, 12(10), 2773-2778.

47. Bao LD, Niu JX, Song H, Wang Y, Ma RL, Ren XH, Wu XL. Association between the GSTP1 codon 105 polymorphism and gastric cancer risk: an updated meta-analysis. Asian Pac J Cancer Prev. 2012, 13(8), 3687-3693

48. Baylin S.B. Mechanisms underlying epigenetically mediated gene silencing in cancer. Semin Cancer Biol. 2002, 12, 331-337

49. Bejrananda T, Phukaoloun M, Boonpipattanapong T, Wanitsuwan W, Kanngern S, Sangthong R, Sangkhathat S. WT1 expression as an independent marker of poor prognosis in colorectal cancers. Cancer Biomark. 2010-2011, 8(1), 35-42.

50. Benchabane H, Ahmed Y. The adenomatous polyposis coli tumor suppressor and Wnt signaling in the regulation of apoptosis. Adv Exp Med Biol. 2009, 656, 75-84.

51. Bisof V, Salihovic MP, Narancic NS, Skaric-Juric T, Jakic-Razumovic J, Janicijevic B, Turek S, Rudan P. TP53 gene polymorphisms and breast cancer in Croatian women: a pilot study. Eur J Gynaecol Oncol. 2010, 31(5), 539-544

52. Bjerkvig R, Tysnes BB, Aboody KS, Najbauer J, Terzis AJ. Opinion: the origin of the cancer stem cell: current controversies and new insights. Nat Rev Cancer. 2005, 5(11), 899-904

53. Boldrini L, Gisfredi S, Ursino S, Lucchi M, Greco G, Mussi A, Donati V, Fontanini G. Effect of the p53 codon 72 and intron 3 polymorphisms on non-small cell lung cancer (NSCLC) prognosis. Cancer Invest. 2008, 26(2), 168-172

54. Bolt HM, Thier R. Relevance of the deletion polymorphisms of the glutathione S-transferases GSTT1 and GSTM1 in pharmacology and toxicology. Curr Drug Metab. 2006, 7(6), 613-628

55. Bond G.L., Hirshfield K.M., Kirchhoff T., Alexe G., Bond E.E., Robins H., Bartel F., Taubert H„ Wuerl P., Hait W., Toppmeyer D., Offit K., Levine A.J. MDM2 SNP309 accelerates tumor formation in a gender-specific and hormone-dependent manner. Cancer Res. 2006,66(10), 5104-5110

56. Bondurant AE, Huang Z, Whitaker RS, Simel LR, Berchuck A, Murphy SK. Quantitative detection of RASSF1A DNA promoter methylation in tumors and serum of patients with serous epithelial ovarian cancer. Gynecol Oncol. 2011, 123(3), 581-587

57. Botana-Rial M, De Chiara L, Valverde D, Leiro-Fernández V, Represas-Represas C, Del Campo-Pérez V, Fernández-Villar A. Prognostic value of aberrant hypermethylation in pleural effusion of lung adenocarcinoma. Cancer Biol Ther. 2012, 13(14), 1436-1442

58. Botstein D., White R.L., Skolnick M., Davis R.V. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms Amer. J. Hum. Genet. 1980, 32(3), 314-331

59. Bougeard, G., Baert-Desurmont, S., Tournier, I., Vasseur, S., Martin, C., Brugieres, L., Chompret, A., Bressac-de Paillerets, B., Stoppa-Lyonnet, D., Bonaiti-Pellie, C., Frebourg, T. Impact of the MDM2 SNP309 and p53 arg72-to-pro polymorphism on age of tumour onset in Li-Fraumeni syndrome. J. Med. Genet. 2006, 43, 531-533

60. Bourdon JC, Fernandes K, Murray-Zmijewski F, Liu G, Diot A, Xirodimas DP, Saville MK, Lane DP. p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity. Genes Dev. 2005, 19(18), 2122-2137

61. Broek AJ van den, Broeks A, Horlings HM, Canisius SV, Braaf LM, Langerad A, Van't Veer LJ, Schmidt MK. Association of the germline TP53 R72P and MDM2 SNP309

variants with breast cancer survival in specific breast tumor subgroups. Breast Cancer Res Treat. 2011,130(2), 599-608

62. Bubnov V, Moskalev E, Petrovskiy Y, Bauer A, Hoheisel J, Zaporozhan V. Hypermethylation of TUSC5 genes in breast cancer tissue. Exp Oncol. 2012, 34(4), 370372

63. Buchard A, Sanchez J J, Dalhoff K, Morling N. Multiplex PCR detection of GSTM1, GSTT1, and GSTP1 gene variants: simultaneously detecting GSTM1 and GSTT1 gene copy number and the allelic status of the GSTP1 Ilel05Val genetic variant. J Mol Diagn. 2007, 9(5), 612-617

64. Burkhart D.L. and Sage J. Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene. Nat. Rev. Cancer. 2008, 8, 671-682;

65. Bustin S.A. and Mueller R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 2005, 109, 365-379

66. Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009, 55(4), 611-622

67. Cabral RE, Caldeira-de-Araujo A, Cabral-Neto JB, Costa Carvalho Mda G. Analysis of GSTM1 and GSTT1 polymorphisms in circulating plasma DNA of lung cancer patients. Mol Cell Biochem. 2010, 338(1-2), 263-269

68. Cáceres DD, Quiñones LA, Schroeder JC, Gil LD, Irarrázabal CE. Association between p53 codon 72 genetic polymorphism and tobacco use and lung cancer risk. Lung. 2009, 187(2), 110-115

69. Carvalho AL, Henrique R, Jeronimo C, Nayak CS, Reddy AN, Hoque MO, Chang S, Brait M, Jiang WW, Kim MM, Claybourne Q, Goldenberg D, Khan Z, Khan T, Westra WH, Sidransky D, Koch W, Califano JA. Detection of promoter hypermethylation in salivary rinses as a biomarker for head and neck squamous cell carcinoma surveillance. Clin Cancer Res. 2011, 17(14), 4782-4789

70. Cavenee W.K., Dryja T.P., Philips R.A., Benedict W.F., Godbout R., Gallie B.L., Murphree A.L., Strong L.C. and White R. Expression of recessive alleles by chromosomal mechanisms in retinoblastoma. Nature, 1983, 305, 779-784

71. Cesinaro AM, Sartori G, Migaldi M, Schirosi L, Pellacani G, Collina G, Maiorana A. Prognostic significance of MGMT gene promoter methylation in differently treated metastatic melanomas. Pathology. 2012, 44(4), 313-317

72. Chan EC, Lam SY, Fu KH, Kwong YL. Polymorphisms of the GSTM1, GSTP1, MPO, XRCC1, and NQOl genes in Chinese patients with non-small cell lung cancers: relationship with aberrant promoter methylation of the CDKN2A and RARB genes. Cancer Genet Cytogenet. 2005, 162(1), 10-20

73. Chan QK, Khoo US, Ngan HY, Yang CQ, Xue WC, Chan KY, Chiu PM, Ip PP, Cheung AN. Single nucleotide polymorphism of pi-class glutathione s-transferase and susceptibility to endometrial carcinoma. Clin Cancer Res. 2005, 11(8), 2981-2985

74. Chang-Claude J, Ambrosone CB, Lilla C, Kropp S, Helmbold I, von Fournier D, Haase W, Sautter-Bihl ML, Wenz F, Schmezer P, Popanda O. Genetic polymorphisms in DNA repair and damage response genes and late normal tissue complications of radiotherapy for breast cancer. Br J Cancer. 2009, 100(10), 1680-1686

75. Chen G, Kim SH, King AN, Zhao L, Simpson RU, Christensen PJ, Wang Z, Thomas DG, Giordano TJ, Lin L, Brenner DE, Beer DG, Ramnath N. CYP24A1 is an independent prognostic marker of survival in patients with lung adenocarcinoma. Clin Cancer Res. 2011, 17(4), 817-826.

76. Chen HY, Shao CJ, Chen FR, Kwan AL, Chen ZP. Role of ERCC1 promoter hypermethylation in drug resistance to cisplatin in human gliomas. Int J Cancer. 2010, 126(8), 1944-1954.

77. Chen X, Liang L, Hu X, Chen Y. Glutathione S-transferase PI gene Ilel05Val polymorphism might be associated with lung cancer risk in the Chinese Han population. Tumour Biol. 2012, 33(6), 1973-1981

78. Chen XX, Zhao RP, Qiu LX, Yuan H, Mao C, Hu XC, Guo XM. Glutathione S-transferase T1 polymorphism is associated with breast cancer susceptibility. Cytokine. 2011,56(2), 477-480

79. Cheng N., Chytil A., Shyr Y., Joly A. and Moses H.L. Transforming growth factor-beta signaling-deficient fibroblasts enhance hepatocyte growth factor signaling in mammary carcinoma cells to promote scattering and invasion. Mol. Cancer Res. 2008, 6, 1521— 1533

80. Cherdyntseva NV, Denisov EV, Litviakov NV, Maksimov VN, Malinovskaya EA, Babyshkina NN, Slonimskaya EM, Voevoda MI, Choinzonov EL. Crosstalk between the FGFR2 and TP53 genes in breast cancer: data from an association study and epistatic interaction analysis. DNA Cell Biol. 2012, 31(3), 306-316

81. Cherdyntseva NV, Gervas PA, Litvyakov NV, Stakcheeva MN, Ponomaryeva AA, Dobrodeev AY, Denisov EV, Belyavskaya VA, Choinzonov EL. Age-related function of tumor suppressor gene TP53: contribution to cancer risk and progression. Exp Oncol. 2010, 32(3), 205-208

82. Choi N, Son DS, Song I, Lee HS, Lim YS, Song MS, Lim DS, Lee J, Kim H, Kim J. RASSF1A is not appropriate as an early detection marker or a prognostic marker for non-small cell lung cancer. Int. J. Cancer. 2005, 115, 575-581

83. Choo S., Lum S.S., Li H„ Soh L.Y., Sabapathy K„ Seow A. Effect of MDM2 SNP309 and P53 codon 72 polymorphisms on lung cancer risk and survival among non-smoking Chinese women in Singapore. BMC Cancer. 2010, 10(88), 1186-1193

84. Christians A, Hartmann C, Benner A, Meyer J, von Deimling A, Weller M, Wick W, Weiler M. Prognostic value of three different methods of MGMT promoter methylation analysis in a prospective trial on newly diagnosed glioblastoma. PLoS One. 2012, 7(3), e33449

85. Christiansen L., Brasch-Andersen C., Bathum L. et al. A longitudinal study of the effect of GSTT1 and GSTM1 gene copy number on survival. Mech. Ageing Dev. 2006, 127, 597-599

86. Christmann M, Verbeek B, Roos WP, Kaina B. 0(6)-Methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) in normal tissues and tumors: enzyme activity, promoter methylation and immunohistochemistry. Biochim Biophys Acta. 2011, 1816(2), 179-190

87. Chua HW, Ng D, Choo S, Lum SS, Li H, Soh LY, Sabapathy K, Seow A. Effect of MDM2 SNP309 and p53 codon 72 polymorphisms on lung cancer risk and survival among non-smoking Chinese women in Singapore. BMC Cancer. 2010, 10, 88

88. Chuang LY, Yang CH, Tsui KH. Restriction Enzyme Mining for SNPs in Genomes Anticancer Research. 2008, 28, 2001-2008

89. Coles AH, Jones SN. The ING gene family in the regulation of cell growth and tumorigenesis. J Cell Physiol. 2009, 218(1), 45-57

90. Cong, Y., and Shay, J.W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 2008,18, 725-732

91. Costa S, Pinto D, Pereira D, Rodrigues H, Cameselle-Teijeiro J, Medeiros R, Schmitt F. Importance of TP53 codon 72 and intron 3 duplication 16bp polymorphisms in prediction of susceptibility on breast cancer. BMC Cancer. 2008, 8, 32

92. Costello J.F., Plass C. Methylation matters. J. Med. Genet. 2001, 38, 285-303

93. Cote ML, Chen W, Smith DW, Benhamou S, Bouchardy C, Butkiewicz D, Fong KM, Gene M, Hirvonen A, Kiyohara C, Larsen JE, Lin P, Raaschou-Nielsen O, Povey AC, Reszka E, Risch A, Schneider J, Schwartz AG, Sorensen M, To-Figueras J, Tokudome S, Pu Y, Yang P, Wenzlaff AS, Wikman H, Taioli E. Meta- and pooled analysis of GSTP1 polymorphism and lung cancer: a HuGE-GSEC review. Am J Epidemiol. 2009, 169(7) 802-814

94. Cowey CL, Rathmell WK. VHL gene mutations in renal cell carcinoma: role as a biomarker of disease outcome and drug efficacy. Curr Oncol Rep. 2009, 11(2), 94-101.

95. Crabtree MD, Fletcher C, Churchman M, Hodgson SV, Neale K, Phillips RK, Tomlinson IP. Analysis of candidate modifier loci for the severity of colonic familial adenomatous polyposis, with evidence for the importance of the N-acetyl transferases. Gut. 2004, 53(2), 271-276

96. Curto M., Cole B.K., Lallemand D., Liu C.H. and McClatchey A.I. Contact-dependent inhibition of EGFR signaling by Nf2/Merlin. J. Cell Biol. 2007, 177, 893-903

97. Czerninski R, Krichevsky S, Ashhab Y, Gazit D, Patel V, Ben-Yehuda D. Promoter hypermethylation of mismatch repair genes, hMLHl and hMSH2 in oral squamous cell carcinoma. Oral Dis. 2009, 15(3), 206-213.

98. Damin AP, Frazzon AP, Damin DC, Roehe A, Hermes V, Zettler C, Alexandre CO. Evidence for an association of TP53 codon 72 polymorphism with breast cancer risk. Cancer Detect Prev. 2006, 30(6), 523-529

99. Daniel FI, Cherubini K, Yurgel LS, de Figueiredo MA, Salum FG. The role of epigenetic transcription repression and DNA methyltransferases in cancer. Cancer. 2011, 117(4), 677687

100.Daniunaite K, Berezniakovas A, Jankevicius F, Laurinavicius A, Lazutka JR, Jarmalaite S. Frequent methylation of RASSF1 and RARB in urine sediments from patients with early stage prostate cancer. Medicina (Kaunas). 2011, 47(3), 147-153

101.Demaria S, Pikarsky E, Karin M, Coussens LM, Chen YC, El-Omar EM, Trinchieri G, Dubinett SM, Mao JT, Szabo E, Krieg A, Weiner GJ, Fox BA, Coukos G, Wang E, Abraham RT, Carbone M, Lotze MT. Cancer and inflammation: promise for biologic therapy. JImmunother. 2010, 33(4), 335-351

102.Demuth I, Dutrannoy V, Marques W Jr, Neitzel H, Schindler D, Dimova PS, Chrzanowska KH, Bojinova V, Gregorek H, Graul-Neumann LM, von Moers A, Schulze I, Nicke M, Bora E, Cankaya T, Oläh E, Kiss C, Bessenyei B, Szakszon K, Gruber-Sedlmayr U, Kroisel PM, Sodia S, Goecke TO, Dörk T, Digweed M, Sperling K, de Sä J, Lourenco CM, Varon R. New mutations in the ATM gene and clinical data of 25 AT patients. Neurogenetics. 2011, 12(4), 273-282.

103.Denisov EV, Cherdyntseva NV, Litvyakov NV et al. TP53 mutations and Arg72Pro polymorphism in breast cancers. Cancer Genet Cytogenet. 2009, 192, 93-95

104.Denisov EV, Sukhanovskaya TV, Dultseva TS, Malinovskaya EA, Litviakov NV, Slonimskaya EM, Choinzonov EL, Cherdyntseva NV. Coordination of TP53 abnormalities in breast cancer: data from analysis of TP53 polymorphisms, loss of heterozygosity, methylation, and mutation. Genet Test Mol Biomarkers. 2011, 15(12), 901-907

105.Ding YC, McGuffog L, Healey S, Friedman E, Laitman Y, Paluch-Shimon S, Kaufman B; SWE-BRCA; EMBRACE; GEMO Study Collaborators; OCGN; Consortium of Investigators of Modifiers of BRCA1/2 (CIMBA). A nonsynonymous polymorphism in IRS1 modifies risk of developing breast and ovarian cancers in BRCA1 and ovarian cancer in BRCA2 mutation carriers. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2012, 21(8), 1362-1370.

106.Dohi S, Ohno S, Ohno Y, Kyo S, Soma G, Sugiyama H, Inoue M. WT1 expression correlates with angiogenesis in endometrial cancer tissue. Anticancer Res. 2010, 30(8), 3187-3192.

107.Dong J, Ren B, Hu Z, Chen J, Hu L, Dai J, Jin G, Xu L, Shen H. MDM2 SNP309 contributes to non-small cell lung cancer survival in Chinese. Mol Carcinog. 2011, 50(6), 433-438.

108.Donninger H, Vos MD, Clark GJ. The RASSF1A tumor suppressor. J Cell Sei. 2007, 120(18), 3163-3172

109.Dufloth RM, Arruda A, Heinrich JK, Schmitt F, Zeferino LC. The investigation of DNA repair polymorphisms with histopathological characteristics and hormone receptors in a group of Brazilian women with breast cancer. Genet Mol Res. 2008, 7(3), 574-582

110.Dzian A, Halasova E, Matakova T, Kavcova E, Smolar M, Dobrota D, Hamzik J, Mistuna D. Lung adenocarcinoma and squamous cell carcinoma in association with genetic polymorphisms of GSTs in Slovak population. Neoplasma. 2012, 59(2), 160-167

111 .Economopoulos K.P., Sergentanis T.N. GSTM1, GSTT1, GSTP1, GSTA1 and colorectal cancer risk: a comprehensive meta-analysis. Eur. J. Cancer. 2010, 46(9), 1617-1631

112.Economopoulos KP, Sergentanis TN. Differential effects of MDM2 SNP309 polymorphism on breast cancer risk along with race: a meta-analysis. Breast Cancer Res Treat. 2010, 120(1), 211-216

113.Ekim M., Caner V., Buyukpinarba§ih N., Tepeli E., Elmas L., Bagci G. Determination of 06-methylguanine DNA methyltransferase promoter methylation in non-small cell lung cancer. Genet Test Mol Biomarkers. 2011, 15(5), 357-360

114.Erali M, Palais R, Wittwer C. SNP genotyping by unlabeled probe melting analysis. Methods Mol Biol. 2008,429,199-206

115.Ertel A, Dean JL, Rui H, Liu C, Witkiewicz AK, Knudsen KE, Knudsen ES. RB-pathway disruption in breast cancer: differential association with disease subtypes, disease-specific prognosis and therapeutic response. Cell Cycle. 2010, 9(20), 4153-4163.

116.Esteller M, Risques RA, Toyota M, Capella G, Moreno V, Peinado MA, Baylin SB, Herman JG. Promoter hypermethylation of the DNA repair gene 0(6)-methylguanine-DNA methyltransferase is associated with the presence of G:C to A:T transition mutations in p53 in human colorectal tumorigenesis. Cancer Res. 2001, 61(12), 46894692

117.Feng W, Shen L, Wen S, Rosen DG, Jelinek J, Hu X, Huan S, Huang M, Liu J, Sahin AA, Hunt KK, Bast RC Jr, Shen Y, Issa JP, Yu Y. Correlation between CpG methylation profiles and hormone receptor status in breast cancers. Breast Cancer Res. 2007, 9(4), 57.

118.Feng X, Zheng BS, Shi JJ, Qian J, He W, Zhou HF. Association of glutathione S-transferase PI gene polymorphism with the susceptibility of lung cancer. Mol Biol Rep. 2012, 39(12), 10313-10323

119.Fernandes MS, Carneiro F, Oliveira C, Seruca R. Colorectal cancer and RASSF family-a special emphasis on RASSF1A. Int J Cancer. 2013, 132(2), 251-258

120.Fernández-Rubio A, López-Cima MF, González-Arriaga P, García-Castro L, Pascual T, Marrón MG, Tardón A. The TP53 Arg72Pro polymorphism and lung cancer risk in a population of Northern Spain. Lung Cancer. 2008, 61(3), 309-316

121.Frommer M., McDonald L.E., Millar D.S., Collies C.M., Watt F., Grigg G.W. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 1827-1831

122.Frova C. Glutathione transferases in the genomics era: New insights and perspectives. Biomol. Enginering. 2006, 23, 149-169

123.Fumagalli C, Pruneri G, Possanzini P, Manzotti M, Barile M, Feroce I, Colleoni M, Bonanni B, Maisonneuve P, Radice P, Viale G, Barberis M. Methylation of 06-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) promoter gene in triple-negative breast cancer patients. Breast Cancer Res Treat. 2012, 134(1), 131-137

124.Furuya M, Nishiyama M, Kasuya Y, Kimura S, Ishikura H. Pathophysiology of tumor neovascularization. Vase Health Risk Manag. 2005, 1(4), 277-290

125.García-Closas M, Malats N, Silverman D, Dosemeci M, Kogevinas M, Hein DW, Tardón A, Serra C, Carrato A, García-Closas R, Lloreta J, Castaño-Vinyals G, Yeager M, Welch R, Chanock S, Chatteijee N, Wacholder S, Samanic C, Tora M, Fernández F, Real FX, Rothman N. NAT2 slow acetylation, GSTM1 null genotype, and risk of bladder cancer: results from the Spanish Bladder Cancer Study and meta-analyses. Lancet. 2005, 366(9486), 649-659

126.Gemignani F, Moreno V, Landi S, Moullan N, Chabrier A, Gutiérrez-Enríquez S, Hall J, Guiño E, Peinado MA, Capella G, Canzian F. TP53 polymorphism is associated with increased risk of colorectal cancer and with reduced levels of TP53 mRNA. Oncogene. 2004, 23(10), 1954-1956

127.Gilliland FD, Harms HJ, Crowell RE, Li YF, Willink R, Belinsky SA. Glutathione S-transferase PI and NADPH quinone oxidoreductase polymorphisms are associated with aberrant promoter methylation of P16(INK4a) and 0(6)-methylguanine-DNA methyltransferase in sputum. Cancer Res. 2002, 62(8), 2248-2252

128.Gong M, Dong W, An R. Glutathione S-transferase T1 polymorphism contributes to bladder cancer risk: a meta-analysis involving 50 studies. DNA Cell Biol. 2012, 31(7), 1187-1197

129.Grodzicker T., Williams J., Sharp P., Sambrook J. Physical mapping of temperature-sensitive mutations of adenoviruses. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1975, 39, 1, 439-446

130.Gronbaek K, Hother C, Jones PA. Epigenetic changes in cancer. APMIS. 2007, 115(10), 1039-1059

131.Gulyaeva LF, Mikhailova ON, Pustylnyak VO, Kim IV 4th, Gerasimov AV, Krasilnikov SE, Filipenko ML, Pechkovsky EV. Comparative analysis of SNP in estrogen-metabolizing enzymes for ovarian, endometrial, and breast cancers in Novosibirsk, Russia. Adv Exp Med Biol. 2008; 617, 359-366.

132.Gupta R, Nagarajan A, Wajapeyee N. Advances in genome-wide DNA methylation analysis. Biotechniques. 2010, 49(4), iii-xi

133.Haimovich AD. Methods, challenges, and promise of next-generation sequencing in cancer biology. Yale J Biol Med. 2011, 84(4), 439-446

134.El Hallani. S., Ducray F., Idbaih A., Marie Y., Boisselier B., Colin C., Laigle-Donadey F., Rodero M., Chinot O., Thillet J., Hoang-Xuan K., Delattre J.-Y., Sanson M. TP53 codon 72 polymorphism is associated with age at onset of glioblastoma. Neurology 2009, 72,332-336

135.Hammel P, Hentic O, Neuzillet C, Faivre S, Raymond E, Ruszniewski P. New treatment options with cytotoxic agents in neuroendocrine tumours. Target Oncol. 2012, 7(3), 169172

136.Han J.Y., Lee G.K., Jang D.H., Lee S.Y., Lee J.S. Association of P53 codon 72 polymorphism and MDM2 SNP309 with clinical outcome of advanced nonsmall cell lung cancer. Cancer. 2008, 113(4), 799-807

137.Han W, Kang SY, Kang D, Park SK, Lee JY, Kim H, Park AK, Noh DY., Multiplex genotyping of 1107 SNPs from 232 candidate genes identified an association between ILIA polymorphism and breast cancer risk. Oncol Rep. 2010, 23(3), 763-769

138.Hanahan D and Weinberg RA., Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 2011, 144, 646-674

139.Hancox RJ, Poulton R, Welch D, Olova N, McLachlan CR, Greene JM, Sears MR, Caspi A, Moffitt TE, Robertson SP, Braithwaite AW. Accelerated decline in lung function in cigarette smokers is associated with TP53/MDM2 polymorphisms. Hum Genet. 2009, 126(4), 559-565

140.Hartman M., Loy E.Y., Ku C.S., Chia K.S. Molecular epidemiology and its current clinical use in cancer management. Lancet. Oncol. 2010,11, 383-390

141.Hassler MR, Klisaroska A, Kollmann K, Steiner I, Bilban M, Schiefer AI, Sexl V, Egger G. Antineoplastic activity of the DNA methyltransferase inhibitor 5-aza-2'-deoxycytidine in anaplastic large cell lymphoma. Biochimie. 2012, 94(11), 2297-2307

142.Hawes SE, Stern JE, Feng Q, Wiens LW, Rasey JS, Lu H, Kiviat NB, Vesselle H. DNA hypermethylation of tumors from non-small cell lung cancer (NSCLC) patients is associated with gender and histologic type. Lung Cancer. 2010, 69(2), 172-9.

143.Hayashi H, Nagae G, Tsutsumi S, Kaneshiro K, Kozaki T, Kaneda A, Sugisaki H, Aburatani H. High-resolution mapping of DNA methylation in human genome using oligonucleotide tiling array. Hum Genet. 2007, 120(5), 701-711

144.Heist R.S., Zhou W., Chirieac L.R., Cogan-Drew T., Liu G., Su L., Neuberg D., Lynch T.J., Wain J.C., Christiani D.C. MDM2 polymorphism, survival, and histology in early-stage non-small-cell lung cancer .J Clin. Oncol. 2007, 25(16), 2243-2247

145.Hel OL van der, Bueno-de-Mesquita HB, van Gils CH, Roest M, Slothouber B, Grobbee DE, Peeters PH. Cumulative genetic defects in carcinogen metabolism may increase breast cancer risk (The Netherlands). Cancer Causes Control. 2005, 16(6), 675-681

146.Herman J.G., Graff J.R., Myohanen S., Nelkin B.D., Baylin S.B. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc.Natl.Acad.Sci. 1996, 93,9821-9826

147.Herranz M, Esteller M. DNA methylation and histone modifications in patients with cancer: potential prognostic and therapeutic targets. Methods Mol Biol. 2007, 361, 25-62

148.Hesson LB, Cooper WN, Latif F. The role of RASSF1A methylation in cancer. Dis Markers. 2007, 23(1-2), 73-87

149.Hirohashi S., Kanai Y. Cell adhesion system and human cancer morphogenesis. Cancer Sci., 2003, 94, 575-581

150.Horn HF, Vousden KH. Coping with stress: multiple ways to activate p53. Oncogene. 2007, 26(9), 1306-1316

151. Ho ward JH, Frolov A, Tzeng CW, Stewart A, Midzak A, Majmundar A, Godwin A, Heslin M, Bellacosa A, Arnoletti JP. Epigenetic downregulation of the DNA repair gene MED1/MBD4 in colorectal and ovarian cancer. Cancer Biol Ther. 2009, 8(1), 94-100.

152.Hrstka R, Coates PJ, Vojtesek B. Polymorphisms in p53 and the p53 pathway: roles in cancer susceptibility and response to treatment. J Cell Mol Med. 2009,13(3), 440-453

153.Iarmarcovai G, Bonassi S, Botta A, Baan RA, Orsiere T. Mutat Res. Genetic polymorphisms and micronucleus formation: a review of the literature. Mutat Res. 2008, 658(3), 215-233

154.1hsan R, Chauhan PS, Mishra AK, Yadav DS, Kaushal M, Sharma JD, Zomawia E, Verma Y, Kapur S, Saxena S. Multiple analytical approaches reveal distinct geneenvironment interactions in smokers and non smokers in lung cancer. PLoS One. 2011, 6(12), e29431

155.1kushima H. and Miyazono K. TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression. Nat. Rev. Cancer, 2010, 10,415-424.

156.Iliopoulos D, Oikonomou P, Messinis I, Tsezou A. Correlation of promoter hypermethylation in hTERT, DAPK and MGMT genes with cervical oncogenesis progression. Oncol Rep. 2009, 22(1), 199-204

157.Imyanitov EN, Togo AV, Hanson KP Searching for cancer associated gene polymorphisms: promises and obstacles. Cancer Lett. 2004, 204, 3-14

158.1shikawa T, Zhang SS, Qin X, Takahashi Y, Oda H, Nakatsuru Y, Ide F. DNA repair and cancer: lessons from mutant mouse models. Cancer Sci. 2004, 95(2), 112-117

159.1ssa J.P., Ottaviano Y.L., Celano P., Hamilton S.R., Davidson N.E., Baylin S.B. Methylation of the oestrogen receptor CpG island links ageing and neoplasia in human colon. Nat. Genet. 1994, 7, 536-540

160.Jankova L, Robertson G, Chan C, Tan KL, Kohonen-Corish M, Fung CL, Clarke C, Lin BP, Molloy M, Chapuis PH, Bokey L, Dent OF, Clarke SJ. Glutathione S-transferase Pi expression predicts response to adjuvant chemotherapy for stage C colon cancer: a matched historical control study. BMC Cancer. 2012, 12, 196.

161.Jardim BV, Moschetta MG, Gelaleti GB, Leonel C, Regiani VR, de Santi Neto D, Bordin-Junior NA, Perea SA, Zuccari DA. Glutathione transferase pi (GSTpi) expression in breast cancer: an immunohistochemical and molecular study. Acta Histochem. 2012, 114(5), 510-517.

162.Jarmalaite S, Jankevicius F, Kurgonaite K, Suziedelis K, Mutanen P, Husgafvel-Pursiainen K. Promoter hypermethylation in tumour suppressor genes shows association with stage, grade and invasiveness of bladder cancer. Oncology. 2008, 75(3-4), 145-151

163.Jemal A., Center M.M., DeSantis C., Ward E.M. Global patterns of cancer incidence and mortality rate and trends. Cancer Epid. Biomar. Prev. 2010, 19(8), 1893-1907

164.Ji M, Tang J, Zhao J, Xu B, Qin J, Lu J. Polymorphisms in genes involved in drug detoxification and clinical outcomes of anthracycline-based neoadjuvant chemotherapy in Chinese Han breast cancer patients. Cancer Biol Ther. 2012, 13(5), 264-271

165.Jiang Y, Cui L, Chen WD, Shen SH, Ding LD. The prognostic role of RASSF1A promoter methylation in breast cancer: a meta-analysis of published data. PLoS One. 2012, 7(5), e36780

166.Jiang Z, Li C, Wang X Glutathione S-transferase Ml polymorphism and bladder cancer risk: a meta-analysis involving 33 studies. Exp Biol Med (Maywood). 2011, 236(6), 723728

167. Jin Y, Xu H, Zhang C, Kong Y, Hou Y, Xu Y, Xue S. Combined effects of cigarette smoking, gene polymorphisms and methylations of tumor suppressor genes on non small cell lung cancer: a hospital-based case-control study in China. BMC Cancer. 2010, 10, 422

168Juhlin CC, Kiss NB, Villablanca A, Haglund F, Nordenstrom J, Hoog A, Larsson C. Frequent promoter hypermethylation of the APC and RASSF1A tumour suppressors in parathyroid tumours. PLoS One. 2010, 5(3), e9472

169.Juillerat A, Juillerat-Jeanneret L. S-alkylthiolation of 06-methylguanine-DNA-methyltransferase (MGMT) to sensitize cancer cells to anticancer therapy. Expert Opin Ther Targets. 2007,11(3), 349-361

170.Kadouri L, Kote-Jarai Z, Hubert A, Baras M, Abeliovich D, Hamburger T, Peretz T, Eeles RA. Glutathione-S-transferase Ml, T1 and PI polymorphisms, and breast cancer risk, in BRCA 1/2 mutation carriers. Br J Cancer. 2008, 98(12), 2006-2010

171.Kaina B., Christmann M., Naumann S., Roos W. P. MGMT: key node in the battle against genotoxicity, carcinogenicity and apoptosis induced by alkylating agents. DNA Repair (Amst). 2007, 6(8), 1079-1099,

172.Karray-Chouayekh S., Trifa F., Khabir A., Boujelbane N., Sellami-Boudawara T., Daoud J., Frikha M., Jlidi R., Gargouri A., Mokdad-Gargouri R. Aberrant methylation of RASSF1A is associated with poor survival in Tunisian breast cancer patients. J Cancer Res Clin Oncol. 2010, 136(2), 203-210

173.Kim DH, Kim JS, Ji YI, Shim YM, Kim H, Han J, Park J. Hypermethylation of RASSF1A promoter is associated with the age at starting smoking and a poor prognosis in primary non-small cell lung cancer. Cancer Res. 2003, 63, 3743-3746

174.Kim YT, Park SJ, Lee SH, Kang HJ, Hahn S, Kang CH, Sung SW, Kim JH. Prognostic implication of aberrant promoter hypermethylation of CpG islands in adenocarcinoma of the lung. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2005,130(5), 1378.

175.Kinzler K.V., Vogelstein B. Cancer-susceptibility genes. Gatekeepers and caretakers (news, comment). Nature, 1997, 386, 761-763

176.Kioulafa M, Kaklamanis L, Mavroudis D, Georgoulias V, Lianidou ES. Prognostic significance of RASSF1A promoter methylation in operable breast cancer. Clin Biochem. 2009, 42(10-11), 970-975

177.Ko E, Lee BB, Kim Y, Lee EJ, Cho EY, Han J, Shim YM, Park J, Kim DH. Association of RASSF1A and p63 with Poor Recurrence-Free Survival in Node-Negative Stage I-II Non-Small Cell Lung Cancer. Clin Cancer Res. 2013, 19(5), 1204-1212.

178.Kostrykina NA, Pechkovskii EV, Mishukova OV, Khripko UI, Zarubina NA, Selezneva LA, Sinkina TV, Terekhova SA, Lazarev AF, Petrova VD, Filipenko ML. Studying the association of polymorphic variants of GSTM1 and GSTT1 genes with breast cancer in female residents of Altai Krai. Bull Exp Biol Med. 2009, 148(1), 89-93

179.Koukoura O, Sifakis S, Spandidos DA. DNA methylation in the human placenta and fetal growth (review). Mol Med Rep. 2012, 5(4), 883-889

180.Koutsimpelas D, Pongsapich W, Heinrich U, Mann S, Mann WJ, Brieger J. Promoter methylation of MGMT, MLH1 and RASSF1A tumor suppressor genes in head and neck squamous cell carcinoma: pharmacological genome demethylation reduces proliferation of head and neck squamous carcinoma cells. Oncol Rep. 2012, 27(4), 1135-1141

181.Kruger, S., Bier, A., Engel, C., Mangold, E., Pagenstecher, C., von Knebel Doeberitz, M., Holinski-Feder, E., Moeslein, G., Schulmann, K., Plaschke, J., Ruschoff, J., Schackert, H. K., German HNPCC Consortium. The p53 codon 72 variation is associated with the age of onset of hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC). J. Med. Genet. 2005, 42, 769-773

182.Kumar S., Walia V., Ray M., Elble R.C. p53 in breast cancer: mutation and countermeasures. Front. Biosci. 2007, 12,4168-4178

183.Lahtz C, Pfeifer GP.J Epigenetic changes of DNA repair genes in cancer. Mol Cell Biol. 2011, 3(1), 51-58

184.Lai JC, Cheng YW, Goan YG, Chang JT, Wu TC, Chen CY, Lee H. Promoter methylation of 0(6)-methylguanine-DNA-methyltransferase in lung cancer is regulated by p53. DNA Repair (Amst). 2008, 7(8), 1352-1363

185.Lam TK, Ruczinski I, Helzlsouer K, Shugart YY, Li KE, Clipp S, Strickland PT, Alberg AJ. Copy number variants of GSTM1 and GSTT1 in relation to lung cancer risk in a prospective cohort study. Ann Epidemiol. 2009, 19(8), 546-552

186.Lang A, Palmeback Wegman P, Wingren S. The significance of MDM2 SNP309 andp53 Arg72Pro in young women with breast cancer. Oncol Rep. 2009,22(3), 575-579

187.Langevin SM, loannidis JPA, Vineis P, Taioli E. Genetic Susceptibility to Environmental Carcinogens group (GSEC). Assessment of cumulative evidence for the association between glutathione S-transferase polymorphisms and lung cancer: application of the Venice interim guidelines. Pharmacogenet Genomics 2010, 20, 586-597

188.Lavin MF, Gueven N. The complexity of p53 stabilization and activation. Cell Death Differ. 2006,13(6), 941-950

189.Lebovic DJ, Mahmood T, Chiappori A. Lung cancer after 70: is it a different disease? Oncology (Williston Park). 2010, 24(12), 1106-11, 1114.

190.Lee KM, Kang D, Lee SJ, Park SK, Lee KH, Choi JY, Kim SU, Choi H, Choi SH, Kim YW, Hong YC, Cho SH. Interactive effect of genetic polymorphism of glutathione S-transferase Ml and smoking on squamous cell lung cancer risk in Korea. Oncol Rep. 2006,16(5), 1035-1039

191.Lees-Murdock DJ, Walsh CP. DNA methylation reprograxnming in the germ line. Epigenetics. 2008, 3(1), 5-13

192.Leeuwen FE, Van't Veer LJ, Pharoah PDP, Easton DF, Shah M, Humphreys M, Dork T, Reincke SA, Fagerholm R, Blomqvist C and Nevanlinna H. Combined effects of single nucleotide polymorphisms TP53 R72P and MDM2 T309G, and p53 expression on survival of breast cancer patients. Breast Cancer Res. 2009, 11(6), 89.

193.Lemmon M.A. and Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell 2010, 141, 1117-1134

194.Leu JD, Wang CY, Tsai HY, Lin IF, Chen RC, Lee YJ. Involvement of p53 R72P polymorphism in the association of MDM2-SNP309 with breast cancer. Oncol Rep. 2011, 25(6), 1755-1763

195.Li G., Zhai X., Zhang Z., Chamberlain R.M., Spitz M.R., Wei Q. MDM2 gene promoter polymorphisms and risk of lung cancer: a case-control analysis. Carcinogenesis. 2006, 27(10), 2028-2033

196.Li L, Choi JY, Lee KM, Sung H, Park SK, Oze I, Pan KF, You WC, Chen YX, Fang JY, Matsuo K, Kim WH, Yuasa Y, Kang D. DNA methylation in peripheral blood: a potential biomarker for cancer molecular epidemiology. J Epidemiol. 2012, 22(5), 384394

197.Li W, Yue W, Zhang L, Zhao X, Ma L, Yang X, Zhang C, Wang Y, Gu M. Polymorphisms in GSTM1, CYP1A1, CYP2E1, and CYP2D6 are associated with susceptibility and chemotherapy response in non-small-cell lung cancer patients. Lung. 2012,190(1), 91-98

198.Li Y, Qiu LX, Shen XK, Lv XJ, Qian XP, Song Y. A meta-analysis of TP53 codon 72 polymorphism and lung cancer risk: evidence from 15,857 subjects. Lung Cancer. J2009, 66(1), 15-21

199.Lin J, Lu C, Stewart DJ, Gu J, Huang M, Chang DW, Lippman SM, Wu X. Systematic evaluation of apoptotic pathway gene polymorphisms and lung cancer risk. Carcinogenesis. 2012, 33(9), 1699-1706

200.Liu L, Wu C, Wang Y, Zhong R, Duan S, Wei S, Lin S, Zhang X, Tan W, Yu D, Nie S, Miao X, Lin D. Combined effect of genetic polymorphisms in P53, P73, and MDM2 on non-small cell lung cancer survival. J Thorac Oncol. 2011, 6(11), 1793-1800

201.Lo H.W., Ali-Osman F. Genetic polymorphism and function of glutathione S-transferases in tumor drug resistance. Curr Opin Pharmacol. 2007, 7(4), 367-374;

202.Lo YL, Hsiao CF, Jou YS, Chang GC, Tsai YH, Su WC, Chen KY, Chen YM, Huang MS, Hsieh WS, Chen CJ, Hsiung CA. Polymorphisms of MLH1 and MSH2 genes and the risk of lung cancer among never smokers. Lung Cancer. 2011, 72(3), 280-286.

203.Lorente A., Mueller W., Urdangarin E., Lazcoz P., Lass U., von Deimling A., Castresana J.S. RASSF1A, BLU, NORE1A, PTEN and MGMT expression and promoter methylation in gliomas and glioma cell lines and evidence of deregulated expression of de novo DNMTs. Brain Pathol. 2009, 19(2), 279-292

204.Lu Q, Ma D, Zhao S. DNA methylation changes in cervical cancers. Methods Mol Biol. 2012, 863,155-176

205.Lu S, Wang Z, Cui D, Liu H, Hao X. Glutathione S-transferase PI Ilel05Val polymorphism and breast cancer risk: a meta-analysis involving 34,658 subjects. Breast Cancer Res Treat. 2011, 125(1), 253-259

206.Ma Y, Bian J, Cao H. MDM2 SNP309 rs2279744 Polymorphism and Gastric Cancer Risk: A Meta-Analysis. PLoS One. 2013, 8(2), e56918

207.Malpeli G, Amato E, Dandrea M, Fumagalli C, Debattisti V, Boninsegna L, Pelosi G, Falconi M, Scarpa A. Methylation-associated down-regulation of RASSF1A and up-regulation of RASSF1C in pancreatic endocrine tumors. BMC Cancer. 2011,11, 351

208.Margison G.P., Povey A.C., Kaina B., Santibanez Koref M.F. Variability and regulation of 06-alkylguanine-DNA alkyltransferase. Carcinogenesis. 2003, 24(4), 625-635

209.Marsit C, Christensen B. Blood-derived DNA methylation markers of cancer risk. Adv Exp Med Biol. 2013; 754, 233-252

210.Matakova T, Sivonova M, Halasova E, Mistuna D, Dzian A, Berzinec P, Letkova L, Dobrota D. Gene polymorphisms of biotransforming enzymes (GSTs) and their association with lung cancer in the Slovakian population. Eur J Med Res. 2009, 14(4), 275-279

211.Matuschek C, Bolke E, Lammering G, Gerber PA, Peiper M, Budach W, Taskin H, Prisack HB, Schieren G, Orth K, Bojar H. Methylated AFC and GSTP1 genes in serum DNA correlate with the presence of circulating blood tumor cells and are associated with a more aggressive and advanced breast cancer disease. Eur J Med Res. 2010, 15, 277286.

212.Mazumder Indra D, Mitra S, Roy A, Mondal RK, Basu PS, Roychoudhury S, Chakravarty R, Panda CK. Alterations of ATM and CADM1 in chromosomal llq22.3-23.2 region are associated with the development of invasive cervical carcinoma. Hum Genet. 2011, 130(6), 735-748.

213.Meng X, Zhong J, Liu S, Murray M, Gonzalez-Angulo AM. A new hypothesis for the cancer mechanism. Cancer Metastasis Rev. 2012, 31(1-2), 247-268

214.Minelli C, Granell R, Newson R, Rose-Zerilli MJ, Torrent M, Ring SM, Holloway JW, Shaheen SO, Henderson JA. Glutathione-S-transferase genes and asthma phenotypes: a

Human Genome Epidemiology (HuGE) systematic review and meta-analysis including unpublished data. Int J Epidemiol. 2010, 39(2), 539-562

215.Mokarram P, Zamani M, Kavousipour S, Naghibalhossaini F, Irajie C, Moradi Sarabi M, Hosseini SV. Different patterns of DNA methylation of the two distinct 06-methylguanine-DNA methyltransferase (0(6)-MGMT) promoter regions in colorectal cancer. Mol Biol Rep. 2013,40(5), 3851-3857

216.Moréra S, Grin I, Vigouroux A, Couvé S, Henriot V, Saparbaev M, Ishchenko AA. Biochemical and structural characterization of the glycosylase domain of MBD4 bound to thymine and 5-hydroxymethyuracil-containing DNA. Nucleic Acids Res. 2012, 40(19), 9917-9926.

217.Moura Gallo CV de, Azevedo E Silva Mendonça G, de Moraes E, Olivier M, Hainaut P. TP53 mutations as biomarkers for cancer epidemiology in Latin America: current knowledge and perspectives. Mutat Res. 2005, 589(3), 192-207

218.Muggerud AA, Rjanneberg JA, Warnberg F, Botling J, Busato F, Jovanovic J, Solvang H, Bukholm I, B0rresen-Dale AL, Kristensen VN, S0rlie T, Tost J. Frequent aberrant DNA methylation of ABCB1, FOXC1, PPP2R2B and PTEN in ductal carcinoma in situ and early invasive breast cancer. Breast Cancer Res. 2010,12(1), 3

219.Naushad SM, Reddy CA, Rupasree Y, Pavani A, Digumarti RR, Gottumukkala SR, Kuppusamy P, Kutala VK. Cross-talk between one-carbon metabolism and xenobiotic metabolism: implications on oxidative DNA damage and susceptibility to breast cancer. Cell Biochem Biophys. 2011, 61(3), 715-723;

220.Nebert DW, Vasiliou V. Analysis of the glutathione S-transferase (GST) gene family. Hum Genomics. 2004,1(6), 460-464

221.Negrini S., Gorgoulis V.G. and Halazonetis T.D. Genomic instability - an evolving hallmark of cancer. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010, 11, 220-228

222.Nehru GA, Pai R, Samuel P, Chacko AG, Chacko G. Status of 0(6) -methylguanine-DNA methyltransferase [MGMT] gene promoter methylation among patients with glioblastomas from India. Neurol India. 2012, 60(5), 481-486

223.Neto JC, Ikoma MM, Carvalho KC, Vassallo J, De Brot M, Gobbi H, Soares FA, Rocha RM. MGMT and PTEN as potential prognostic markers in breast cancer. Exp Mol Pathol. 2012, 92(1), 20-26.

224.Neves Filho EH, Cordeiro DE, Vieira AP, Rabenhorst SH. TP53 codon 72 and intron 3 polymorphisms and mutational status in gastric cancer: an association with tumor onset and prognosis. Pathobiology. 2012, 79(6), 323-328

225.Nii T, Marumoto T, Tani K. Roles of p53 in various biological aspects of hematopoietic stem cells. J Biomed Biotechnol. 2012,2012,903435

226.Nomoto K, Maekawa M, Sugano K, Ushiama M, Fukayama N, Fujita S, Kakizoe T. Methylation status and expression of human telomerase reverse transcriptase mRNA in relation to hypermethylation of the pi 6 gene in colorectal cancers as analyzed by bisulfite PCR-SSCP. JpnJClin Oncol. 2002, 32(1), 3-8

227.0hshima J, Haruta M, Fujiwara Y, Watanabe N, Arai Y, Ariga T, Okita H, Koshinaga T, Oue T, Hinotsu S, Nakadate H, Horie H, Fukuzawa M, Kaneko Y. Methylation of the RASSF1A promoter is predictive of poor outcome among patients with Wilms tumor. Pediatr Blood Cancer. 2012, 59(3), 499-505

228.0kishiro M, Kim SJ, Tsunashima R, Nakayama T, Shimazu K, Shimomura A, Maruyama N, Tamaki Y, Noguchi S. MDM2 SNP309 and TP53 R72P associated with severe and febrile neutropenia in breast cancer patients treated with 5-FU/epirubicin/cyclophosphamide. Breast Cancer Res Treat. 2012, 132(3), 947-953

229.01iveira AL, Rodrigues FF, Santos RE, Aoki T, Rocha MN, Longui CA, Melo MB. GSTT1, GSTM1, and GSTP1 polymorphisms and chemotherapy response in locally advanced breast cancer. Genet Mol Res. 2010, 9(2), 1045-1053

230.01iveira C, Louren^ GJ, Sagarra RA, Derchain SF, Segalla JG, Lima CS. Polymorphisms of glutathione S-transferase Mu 1 (GSTM1), Theta 1 (GSTT1), and Pi 1 (GSTP1) genes and epithelial ovarian cancer risk. Dis Markers. 2012, 33(3), 155-159

231.0nay H., Pehlivan S., Koyuncuoglu M., Kirkali Z., Ozkinay F. Multigene methylation analysis of conventional renal cell carcinoma. Urol Int. 2009, 83(1), 107-112

232.Palakurthy R. K., Wajapeyee N., Santra M. K., Gazin C., Lin L., Gobeil S., Green M. R. Epigenetic silencing of the RASSF1A tumor suppressor gene through HOXB3-mediated induction of DNMT3B expression. Molec. Cell. 2009, 36,219-230

233.Palmero EI, Achatz MI, Ashton-Prolla P, Olivier M, Hainaut P. Tumor protein 53 mutations and inherited cancer: beyond Li-Fraumeni syndrome. Curr Opin Oncol. 2010, 22(1), 64-69.

234.Park S.H., Choi J.E., Kim E.J., Jang J.S., Han H.S., Lee W.K., Kang Y.M., Park J.Y. MDM2 309T>G polymorphism and risk of lung cancer in a Korean population. Lung Cancer. 2006, 54(1), 19-24

235.Park SK, Yim DS, Yoon KS, Choi IM, Choi JY, Yoo KY, Noh DY, Choe KJ, Ahn SH, Hirvonen A, Kang D. Combined effect of GSTM1, GSTT1, and COMT genotypes in individual breast cancer risk. Breast Cancer Res Treat. 2004, 88(1), 55-62

236.Parl FF. Glutathione S-transferase genotypes and cancer risk. Cancer Letters. 2005, 221, 123-129

237.Paulin FE, O'Neill M, McGregor G, Cassidy A, Ashfield A, Ali CW, Munro AJ, Baker L, Purdie CA, Lane DP, Thompson AM. MDM2 SNP309 is associated with high grade node positive breast tumours and is in linkage disequilibrium with a novel MDM2 intron 1 polymorphism. BMC Cancer. 2008, 8, 281

238.Pavicic WH, Laguens M, Richard SM. Analysis association between mitochondrial genome instability and xenobiotic metabolizing genes in human breast cancer. Mol Med. 2009, 15(5-6), 160-165

239.Pei D, Zhang Y, Zheng J. Regulation of p53: a collaboration between MDM2 and Mdmx. Oncotarget. 2012, 3(3), 228-235

240.Peklak-Scott C, Smitherman PK, Townsend AJ, Morrow CS. Role of glutathione S-transferase Pl-1 in the cellular detoxification of cisplatin. Mol Cancer Ther. 2008, 7(10), 3247-3255

241.Penna-Martinez M, Ramos-Lopez E, Stern J, Kahles H, Hinsch N, Hansmann ML, Seikinski I, Grünwald F, Vorländer C, Bechstein WO, Zeuzem S, Holzer K, Badenhoop K. Impaired vitamin D activation and association with CYP24A1 haplotypes in differentiated thyroid carcinoma. Thyroid. 2012, 22(7), 709-716.

242.Pérez-Losada J, Castellanos-Martín A, Mao JH. Cancer evolution and individual susceptibility. Integr Biol (Camb). 2011, 3(4), 316-328

243.Petitjean A, Achatz M, Borresen-Dale A. TP53 mutations in human cancers: functional selection and impact on cancer prognosis and outcomes .Oncogene 2007, 26(15), 21572165

244.Pfeifer GP, Dammann R, Tommasi S. RASSF proteins. Curr Biol. 2010, 20(8), 344-345

245.Pietsch EC, Humbey O, Murphy ME. Polymorphisms in the p53 pathway. Oncogene. 2006, 25(11), 1602-1611

246.Proestling K, Hebar A, Pruckner N, Marton E, Vinatzer U, Schreiber M. The Pro allele of the p53 codon 72 polymorphism is associated with decreased intratumoral expression of BAX and p21, and increased breast cancer risk. PLoS One. 2012, 7(10), e47325

247.Qiu LX, Yuan H, Yu KD, Mao C, Chen B, Zhan P, Xue K, Zhang J, Hu XC. Glutathione S-transferase Ml polymorphism and breast cancer susceptibility: a meta-analysis involving 46,281 subjects. Breast Cancer Res Treat. 2010,121(3), 703-708

248.Raica M., Cimpean A.M. and Ribatti D. Angiogenesis in pre-malignant conditions. Eur. J. Cancer. 2009,45,1924-1934

249.Ramakrishnan V, Kushwaha D, Koay DC, Reddy H, Mao Y, Zhou L, Ng K, Zinn P, Carter B, Chen CC. Post-transcriptional regulation of 0(6)-methylguanine-DNA methyltransferase MGMT in glioblastomas. Cancer Biomark. 2011-2012, 10(3-4), 185193

250.Ramalhinho AC, Fonseca-Moutinho JA, Breitenfeld Granadeiro LA. Positive association of polymorphisms in estrogen biosynthesis gene, CYP19A1, and metabolism, GST, in breast cancer susceptibility. DNA Cell Biol. 2012, 31(6), 1100-1106

251.Ramalhinho AC, Fonseca-Moutinho JA, Breitenfeld L. Glutathione S-transferase Ml, Tl, and PI genotypes and breast cancer risk: a study in a Portuguese population. Mol Cell Biochem. 2011, 355(1-2), 265-271

252.Raynaud C.M., Hernandez J., Llorca F.P., Nuciforo P., Mathieu M.C., Commo F., Delaloge S., Sabatier L., Andre. F. and Soria J.C. DNA damage repair and telomere length in normal breast, preneoplastic lesions, and invasive cancer. Am. J. Clin. Oncol. 2010, 33, 341-345

253.Rodier F, Campisi J, Bhaumik D. Two faces of p53: aging and tumor suppression. Nucleic Acids Res. 2007, 35(22), 7475-7484

254.Ronaghi M, Shokralla S, Gharizadeh B. Pyrosequencing for discovery and analysis of DNA sequence variations. Pharmacogenomics. 2007, 8(10), 1437-1441

255.Ross J.S., Cronin M. Whole cancer genome sequencing by next-generation methods. Am. J. Clin. Pathol. 2011, 136, 527-539

256.Rotunno M, Lam TK, Vogt A, Bertazzi PA, Lubin JH, Caporaso NE, Landi MT. GSTM1 and GSTT1 copy numbers and mRNA expression in lung cancer. Mol Carcinog. 2012, 51(1), 142-150

257.Salk J.J., Fox E.J. and Loeb L.A.. Mutational heterogeneity in human cancers: origin and

consequences. Ann. Rev. Pathol. 2010, 5, 51-75 258.Sarafzadeh S, Corrêa ZM, Augsburger JJ. Familial retinoblastoma with unilateral and

unifocal involvement in 2 families. Arch Ophthalmol. 2008,126(9), 1308-1309 259.Saxena A, Dhillon VS, Raish M, Asim M, Rehman S, Shukla NK, Deo SV, Ara A, Husain SA. Detection and relevance of germline genetic polymorphisms in glutathione S-transferases (GSTs) in breast cancer patients from northern Indian population. Breast Cancer Res Treat. 2009, 115(3), 537-543 260.Schwartz A.G., Prysak G.M., Bock C.H., Cote M.L. The molecular epidemiology of lung

cancer. Carcinogenesis. 2007, 28, 507-518 261. Sebova K, Zmetakova I, Bella V, Kajo K, Stankovicova I, Kajabova V, Krivulcik T, Lasabova Z, Tomka M, Galbavy S, Fridrichova I. RASSF1A and CDH1 hypermethylation as potential epimarkers in breast cancer. Cancer Biomark. 2011-2012, 10(1), 13-26 262.Semlitsch M, Shackelford RE, Zirkl S, Sattler W, Malle E. ATM protects against oxidative stress induced by oxidized low-density lipoprotein. DNA Repair (Amst). 2011, 10(8), 848-860

263.Senchenko VN, Liu J, Loginov W, Bazov I, Angeloni D, Seryogin Y, Ermilova V, Kazubskaya T, Garkavtseva R, Zabarovska VI, Kashuba VI, Kisselev LL, Minna JD, Lerman MI, Klein G, Braga EA, Zabarovsky ER Discovery of frequent homozygous deletions in chromosome 3p21.3 LUC A and AP20 regions in renal, lung and breast cinomas. Oncogene. 2004, 23(34), 5719-5728 264.Sharma G, Mirza S, Parshad R, Srivastava A, Gupta SD, Pandya P, Ralhan R. Clinical significance of promoter hypermethylation of DNA repair genes in tumor and serum DNA in invasive ductal breast carcinoma patients. Life Sci. 2010, 87(3-4), 83-91 265.Shaw R.J.. Tumor suppression by LKB1: SIK-ness prevents metastasis. Sci. Signal. 2009, 2(86), 55

266.Shenker N, Flanagan JM, Intragenic DNA methylation: implications of this epigenetic

mechanism for cancer research. British Journal of Cancer. 2012, 106, 248-253 267.Shi X., Zhou S., Wang Z., Zhou I. CYP1A1 and GSTM1 Polymorphisms and lung cancer

risk in Chinese populations: a meta-analysis. Lung Cancer. 2008, 59(2), 155-163 268.Shiraishi K, Kohno T, Tanai C, Goto Y, Kuchiba A, Yamamoto S, Tsuta K, Nokihara H, Yamamoto N, Sekine I, Ohe Y, Tamura T, Yokota J, Kunitoh H. Association of DNA

repair gene polymorphisms with response to platinum-based doublet chemotherapy in patients with non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 2010,28(33), 4945-4952 269.Shivakumar L., Minna J., Sakamaki T., Pestell R., White M.A. The RASSF1A tumor suppressor blocks cell cycle progression and inhibits cyclin D1 accumulation. Mol Cell Biol. 2002,22,4309-4318 270. Singh M, Shah PP, Singh AP, Ruwali M, Mathur N, Pant MC, Parmar D. Association of genetic polymorphisms in glutathione S-transferases and susceptibility to head and neck cancer. MutatRes. 2008, 638(1-2), 184-194. 271.Sobin LH, Gospodarowicz MK, Wittekind Ch. UICC International Union Against Cancer: TNM Classification of malignant Tumor. Seven Edition. Wiley-Blackwell. A John Wiley and Sons, Ltd, Publication. 2009, 276 272.Sobti RC, Kaur P, Kaur S, Janmeja AK, Jindal SK, Kishan J, Raimondi S. Combined effect of GSTM1, GSTT1 and GSTP1 polymorphisms on histological subtypes of lung cancer. Biomarkers. 2008, 13(3), 282-295 273.Sorensen M, Autrup H, Tjonneland A, Overvad K, Raaschou-Nielsen O. Glutathione S-transferase T1 null-genotype is associated with an increased risk of lung cancer. Int J Cancer. 2004, 110(2), 219-224 274. Springfield S, Das R., Mohammed SI. Role of epigenetics in cancer health disparities. Methods Mol Biol. 2012; 863:395-410; Biran A, Meshorer E. Concise review: chromatin and genome organization in reprogramming. Stem Cells. 2012, 30(9), 1793-1799 275.Sreeja L, Syamala V, Hariharan S, Syamala VS, Raveendran PB, Sivanandan CD, Madhavan J, Ankathil R. Glutathione S-transferase Ml, T1 and PI polymorphisms: susceptibility and outcome in lung cancer patients. J Exp Ther Oncol. 2008, 7(1), 73-85 276.Stoehr C, Burger M, Stoehr R, Bertz S, Ruemmele P, Hofstaedter F, Denzinger S, Wieland WF, Hartmann A, Walter B. Mismatch repair proteins hMLHl and hMSH2 are differently expressed in the three main subtypes of sporadic renal cell carcinoma. Pathobiology. 2012, 79(3), 162-168. 277. Sun W, Zaboli D, Liu Y, Arnaoutakis D, Khan T, Wang H, Koch W, Khan Z, Califano JA. Comparison of promoter hypermethylation pattern in salivary rinses collected with and without an exfoliating brush from patients with HNSCC. PLoS One. 2012, 7(3), e33642

278.Sun YF, Leu JD, Chen SM, Lin IF, Lee YJ. Results based on 124 cases of breast cancer and 97 controls from Taiwan suggest that the single nucleotide polymorphism (SNP309) in the MDM2 gene promoter is associated with earlier onset and increased risk of breast cancer. BMC Cancer. 2009,9,13

279.Sunami E, Shinozaki M, Sim MS, Nguyen SL, Vu AT, Giuliano AE, Hoon DS. Estrogen receptor and HER2/neu status affect epigenetic differences of tumor-related genes in primary breast tumors. Breast Cancer Res. 2008,10(3), 46

280.Surekha D, Sailaja K, Rao DN, Padma T, Raghunadharao D, Vishnupriya S. Codon 72 and G13964C intron 6 polymorphisms of TP53 in relation to development and progression of breast cancer in India. Asian Pac J Cancer Prev. 2011; 12(8), 1893-1898

281.Szkandera J, Absenger G, Dandachi N, Regitnig P, Lax S, Stotz M, Samonigg H, Renner W, Gerger A. Analysis of functional germline polymorphisms for prediction of response to anthracycline-based neoadjuvant chemotherapy in breast cancer. Mol Genet Genomics. 2012,287(9), 755-764

282.Talmadge J.E. and Fidler IJ. AACR centennial series: the biology of cancer metastasis: historical perspective. Cancer Res. 2010, 70, 5649-5669;

283.Tamaki Y, Arai T, Sugimura H, Sasaki T, Honda M, Muroi Y, Matsubara Y, Kanno S, Ishikawa M, Hirasawa N, Hiratsuka M. Association between cancer risk and drug-metabolizing enzyme gene (CYP2A6, CYP2A13, CYP4B1, SULT1A1, GSTM1, and GSTT1) polymorphisms in cases of lung cancer in Japan. Drug Me tab Pharmacokinet. 2011,26(5), 516-522

284.Tamura G. Alterations of tumor suppressor and tumor-related genes in the development and progression of gastric cancer. World J Gastroenterol. 2006,12(2), 192-198

285.Tang D, Xu S, Zhang Q, Zhao W. The expression and clinical significance of the androgen receptor and E-cadherin in triple-negative breast cancer. Med Oncol. 2012, 29(2), 526-533.

286.Thaler S, Schmidt M, Schad A, Sleeman JP. RASSF1A inhibits estrogen receptor alpha expression and estrogen-independent signalling: implications for breast cancer development. Oncogene. 2012, 31(47), 4912-4922.

287.Tian J, Lee SO, Liang L, Luo J, Huang CK, Li L, Niu Y, Chang C. Targeting the unique methylation pattern of androgen receptor (AR) promoter in prostate stem/progenitor cells

with 5-aza-2'-deoxycytidine (5-AZA) leads to suppressed prostate tumorigenesis. J Biol Chem. 2012,287(47), 39954-39966

288.Tian Y, Hou Y, Zhou X, Cheng H, Zhou R. Tumor Suppressor RASSF1A Promoter: p53 Binding and Methylation. PLoS ONE. 2011, 6(2), el7017.

289.Tilak AR, Kumar S, Pant MC, Mathur N, Kumar A. Polymorphism Arg72Pro of p53 confers susceptibility to squamous cell carcinoma of lungs in a North Indian population. Cell Biol. 2013, 32(2), 66-72

290.Timofeeva M, Kropp S, Sauter W, Beckmann L, Rosenberger A, Iiiig T, Jäger B, Mittelstrass K, Dienemann H; LUCY-Consortium, Bartsch H, Bickeböller H, Chang-Claude J, Risch A, Wichmann HE, Wiesholzer M. Genetic polymorphisms of MPO, GSTT1, GSTM1, GSTP1, EPHX1 and NQOl as risk factors of early-onset lung cancer. Int J Cancer. 2010, 127(7), 1547-1561

291.Timofeeva M., Jager B., Rosenberg A. et al. A multiplex real-time PCR method for detection of GSTM1 and GSTT1 copy number. Clin. Biochem. 2009, 42, 500-509

292.Tischoff I, Tannapfe A. DNA methylation in hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 2008,14(11), 1741-1748.

293.Toffoli G, Biason P, Russo A, De Mattia E, Cecchin E, Hattinger CM, Pasello M, Alberghini M, Ferrari C, Scotlandi K, Picci P, Serra M. Effect of TP53 Arg72Pro and MDM2 SNP309 polymorphisms on the risk of high-grade osteosarcoma development and survival. Clin Cancer Res. 2009, 15(10), 3550-3556

294.Toledo F, Wahl GM. MDM2 and MDM4: p53 regulators as targets in anticancer therapy. Int J Biochem Cell Biol. 2007, 39(7-8), 1476-1482

295.Tommasi S., Dammann R., Zhang Z., Wang Y., Liu L., Tsark W.M., Wilczynski S.P., Li J., You M., Pfeifer G.P.. Tumor susceptibility of Rassfla knockout mice. Cancer Res. 2005,65, 92-98

296.Toy BC, Agrön E, Nigam D, Chew EY, Wong WT. Longitudinal analysis of retinal hemangioblastomatosis and visual function in ocular von Hippel-Lindau disease. Ophthalmology. 2012, 119(12), 2622-2630.

297.Tserga A, Michalopoulos NV, Levidou G, Korkolopoulou P, Zografos G, Patsouris E, Saetta AA. Association of aberrant DNA methylation with clinicopathological features in breast cancer. Oncol Rep. 2012, 27(5), 1630-1638

298.Verbeek B, Southgate TD, Gilham DE, Margison GP. 06-Methylguanine-DNA methyltransferase inactivation and chemotherapy. Br Med Bull. 2008, 85,17-33

299.Vlerken LE van, Hurt EM, Hollingsworth RE. The role of epigenetic regulation in stem cell and cancer biology. JMol Med (Berl). 2012,90(7), 791-801

300.Vogelstein B., Kinzler K. Cancer genes and the pathways they control. Nature Medicine, 2004,10, 789-799

301. Wagner KJ, Roberts SG. Transcriptional regulation by the Wilms' tumour suppressor protein WT1. Biochem Soc Trans. 2004, 32(6), 932-935.

302.Wang J, Wang B, Chen X, Bi J. The prognostic value of RASSF1A promoter hypermethylation in non-small cell lung carcinoma: a systematic review and metaanalysis. Carcinogenesis. 2011, 32(3), 411-416.

303. Wang L, Luhm R, Lei M. SNP and mutation analysis. Adv Exp Med Biol. 2007, 593,105116

304.Wang QE, Han C, Zhang B, Sabapathy K, Wani AA. Nucleotide excision repair factor XPC enhances DNA damage-induced apoptosis by downregulating the antiapoptotic short isoform of caspase-2. Cancer Res. 2012, 72(3), 666-675.

305.Wang X, Huang K, Xu L. Interaction among Rb/pl6, Rb/E2F1 and HDAC1 proteins in gallbladder carcinoma. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 2009, 29(6), 729-731.

306.Wang Y, Yang H, Li L, Wang H. Glutathione S-transferase T1 gene deletion polymorphism and lung cancer risk in Chinese population: a meta-analysis. Cancer Epidemiol. 2010, 34(5), 593-597

307.Wang Z, Xue L, Chong T, Li H, Chen H, Wang Z. Quantitative assessment of the association between glutathione S-transferase PI Ilel05Val polymorphism and bladder cancer risk. Tumour Biol. 2013, 34(3), 1651-1657.

308.Whibley C., Pharoah P.D., Hollstein M. p53 polymorphisms: cancer implications. Nat. Rev. Cancer. 2009, 9(2), 95-107.

309.Wilkening S., Bermejo J.L., Hemminki K. MDM2 SNP309 and cancer risk: a combined analysis. Carcinogenesis. 2007, 28(11), 2262-2267

310. Wolf P, Hu YC, Doffek K, Sidransky D, Ahrendt SA. 0(6)-Methylguanine-DNA methyltransferase promoter hypermethylation shifts the p53 mutational spectrum in non-small cell lung cancer. Cancer Res. 2001, 61(22), 8113-8117.

311 .Xu B, Tong N, Chen SQ, Yang Y, Zhang XW, Liu J, Hu XN, Sha GZ, Chen M. Contribution of HOGG1 Ser326Cys polymorphism to the development of prostate cancer in smokers: meta-analysis of 2779 cases and 3484 controls. PLoS One. 2012, 7(1), e30309.

312.Xu J, Shetty PB, Feng W, Chenault C, Bast RC Jr, Issa JP, Hilsenbeck SG, Yu Y. Methylation of HIN-1, RASSF1A, RIL and CDH13 in breast cancer is associated with clinical characteristics, but only RASSF1A methylation is associated with outcome. BMC Cancer. 2012, 12, 243

313.Xu Z, Zhu H, Luk JM, Wu D, Gu D, Gong W, Tan Y, Zhou J, Tang J, Zhang Z, Wang M, Chen J. Clinical significance of SOD2 and GSTP1 gene polymorphisms in Chinese patients with gastric cancer. Cancer. 2012,118(22), 5489-5496.

314.Yamada H, Shinmura K, Ito H, Kasami M, Sasaki N, Shima H, Ikeda M, Tao H, Goto M, Ozawa T, Tsuneyoshi T, Tanioka F, Sugimura H. Germline alterations in the CDH1 gene in familial gastric cancer in the Japanese population. Cancer Sci. 2011, 102(10), 17821788.

315.Yanagawa N, Tamura G, Oizumi H, Kanauchi N, Endoh M, Sadahiro M, Motoyama T. Promoter hypermethylation of RASSF1A and RUNX3 genes as an independent prognostic prediction marker in surgically resected non-small cell lung cancers. Lung Cancer. 2007, 58, 131-138

316.Yang D, Khan S, Sun Y, Hess K, Shmulevich I, Sood AK, Zhang W. Association of BRCA1 and BRCA2 mutations with survival, chemotherapy sensitivity, and gene mutator phenotype in patients with ovarian cancer. JAMA. 2011, 306(14), 1557-1565.

317. Yang J, Xu Z, Li J, Zhang R, Zhang G, Ji H, Song B, Chen Z. XPC epigenetic silence coupled with p53 alteration has a significant impact on bladder cancer outcome. J Urol. 2010, 184(1), 336-343.

318.Yin JY, Huang Q, Zhao YC, Zhou HH, Liu ZQ. Meta-analysis on pharmacogenetics of platinum-based chemotherapy in non small cell lung cancer (NSCLC) patients. PLoS One. 2012, 7(6), e38150

319.Yu Y, Wu BL, Wu J, Shen Y. Exome and whole-genome sequencing as clinical tests: a transformative practice in molecular diagnostics. Clin Chem. 2012, 58(11), 1507-1509

320.Zhang BL, Sun T, Zhang BN, Zheng S, Lu N, Xu BH, Wang X, Chen GJ, Yu DK, Lin DX. Polymorphisms of GSTP1 is associated with differences of chemotherapy response and toxicity in breast cancer. Chin Med J (Engl). 2011, 124(2), 199-204

321.Zhang Y, Liu C. The interaction between smoking and GSTM1 variant on lung cancer in the Chinese population. Tumour Biol. 2013, 34(1), 395-401

322.Zhang ZY, Jin XY, Wu R, Wu LN, Xing R, Yang SJ, Xie Y. Meta-analysis of the association between GSTM1 and GSTT1 gene polymorphisms and cervical cancer. Asian Pac J Cancer Prev. 2012, 13(3), 815-819

323.Zhao E, Cui D, Yuan L, Lu W. MDM2 SNP309 polymorphism and breast cancer risk: a meta-analysis. Mol Biol Rep. 2012,39(4), 3471-3477

324.Zheng SY, Hou JY, Zhao J, Jiang D, Ge JF, Chen S. Clinical outcomes of downregulation of E-cadherin gene expression in non-small cell lung cancer. Asian Pac J Cancer Prev. 2012, 13(4), 1557-1561.

325.Zochbauer-Muller S., Gazdar A.F. and Minna J.D. Molecular pathogenesis of lung cancer. Annu. Rev. Physiol. 2002, 64, 681-708