Аномальные изменения картины метилирования геномной ДНК при хроническом В-клеточном лимфолейкозе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Москалёв, Евгений Александрович

• Москалёв, Евгений Александрович
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Москалёв, Евгений Александрович

Список сокращений и обозначений.g

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.,

1.1. ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ОНКОГЕНЕЗА.

1.1.1. Картина метилирования геномной ДНК (метилом) как эпигенетическая программа клеток.

1.1.1.1. Неполнота генетической информации и концепция эпигенома.

1.1.1.2. Природа эпигенетических модификаций.

1.1.1.2.1. Нормальная картина метилирования геномной ДНК.¡

1.1.1.2.2. Роль ДНК-метилтрансфераз в формировании метилома.

1.1.1.2.3. Ковалентные модификации гистонов. Гипотеза гистонового кода. j

1.1.1.3. Механизм репликации и взаимосвязь разных типов эпигенетических модификаций в клетке.

1.1.1.4. Реализация эпигенетической информации.

1.1.2. Аномальные изменения метилома и их роль в этиологии и патогенезе опухолей, jg

1.1.2.1. Ограниченность генетической (мутационной) модели онкогенеза.\ g

1.1.2.2. Локальное гиперметилирование CpG-островков de novo как эпигенетический механизм инактивации генов-супрессоров.

1.1.2.3. Общее деметилирование ДНК - фактор нестабильности генома.

1.1.2.4. Системы передачи онкогенных сигналов в клетке.

1.1.2.4.1. Роль протоонкогенов и генов-супрессоров в системе передачи сигналов в клетке.

1.1.2.4.2. Направленный характер эпигенетической инактивации генов-супрессоров

1.1.2.4.3. Сигнальный путь Wnt: митогенные и антиапоптотические сигналы.

1.1.2.4.4. Сигнальный путь Jak/STAT: регуляция цитокинами.

1.1.2.4.5. Сигнальный путь Ras: контроль апоптоза.

1.1.3. Анализ картины метилирования ДНК для ранней диагностики и прогноза онкологических заболеваний.

1.1.3.1. Онкомаркеры в молекулярной клинической диагностике опухолей.

1.1.3.1.1. Критерии идеального онкомаркера.

1.1.3.1.2. Чувствительность, специфичность и прогностические показатели маркеров опухоли.

1.1.3.1.3. Маркеры метилирования ДНК в биологических жидкостях для диагностики и прогноза онкозаболеваний.

1.1.3.1.4. Эпигенетическая классификация опухолей.

1.1.4. Эпигенетическая терапия опухолей: деметилирующие агенты как противоопухолевые химиотерапевтические средства.

1.1.5. Основные подходы к экспериментальному анализу картины метилирования ДНК.

1.1.5.1. Общие принципы дискриминации цитозина и 5-метилцитозина.

1.1.5.2. Методы локального эпигенетического анализа.

1.1.5.3. Методы крупномасштабного эпигенетического анализа.

1.2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПАТОГЕНЕЗА ХРОНИЧЕСКОГО

В-КЛЕТОЧНОГО ЛИМФОЛЕЙКОЗА (В-ХЛЛ).

1.2.1. В-ХЛЛ - нозологическая форма зрелоклеточных опухолей из В-лимфоцитов.

1.2Л. 1. Механизмы нормальной дифференцировки и активации В-клеток.

1.2.1.2. Стадии В-ХЛЛ.

1.2.1.3. Роль цитогенетических изменений в патогенезе В-ХЛЛ.

1.2.1.4. Основные молекулярные нарушения и новые прогностические факторы В-ХЛЛ.

1.2.1.5. Роль В-клеточного рецептора и сигналов от микроокружения в прогрессии В-ХЛЛ.

1.2.1.6. Гипотетическая модель происхождения и эволюции клона В-ХЛЛ.

1.2.2. Крупномасштабный профиль экспрессии генов в клетках В-ХЛЛ.5]

1.2.3. Эпигенетические изменения при В-ХЛЛ.

1.2.3.1. Различия общего уровня метилирования ДНК в формах В-ХЛЛ с разным мутационным статусом генов иммуноглобулинов.

1.2.3.2. Гиперметилирование промоторных Срв-островков некоторых генов.

1.2.3.3. Крупномасштабный анализ метилома в клоне В-ХЛЛ.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Цель и задачи исследования.

2.2. Объекты и методы исследования.

2.2.1. Объекты исследования.

2.2.2. Методы исследования.

2.2.2.1. Забор периферической крови.

2.2.2.2. Селекция В-лимфоцитов.

2.2.2.3. Выделение геномной ДНК.

2.2.2.4. Модификация ДНК бисульфитом натрия.

2.2.2.5. Разработка олигонуклеотидных праймеров для ПЦР-амплификации ДНК, метилспецифичной ПЦР и бисульфитного секвенирования.

2.2.2.6. Условия ПЦР-амплификации.

2.2.2.7. Определение концентрации ПЦР-продуктов денситографически.

2.2.2.8. Очистка ПЦР-продуктов.

2.2.2.9. Метилирование ДНК in vitro.

2.2.2.10. Мечение ДНК биотином.

2.2.2.11. Проектирование олигонуклеотидного состава ДНК-чипов.

2.2.2.12. Синтез олигонуклеотидных ДНК-чипов in situ.

2.2.2.13. Гибридизация, отмывание и детекция флуоресцентных сигналов.

2.2.2.14. Анализ флуоресцентных сигналов.

2.2.2.15. Бисульфитное секвенирование ДНК.

2.2.3. Статистическая обработка экспериментальных данных.

2.3. Полученные результаты и их обсуждение.

2.3.1. Разработка высокопроизводительного метода определения картины метилирования ДНК посредством гибридизации на олигонуклеотидных ДНК-чипах.

2.3.1.1. Гены-кандидаты для анализа метилирования при B-XJIJI.

2.3.1.2. Схема типичного эксперимента по гибридизации на ДНК-чипе.

2.3.1.3. Получение ДНК разной степени метилирования.

2.3.1.4. Способность олигонуклеотидных зондов дискриминировать ДНК разной степени метилирования.

2.3.1.5. Высокая воспроизводимость результатов.

2.3.1.6. Отбор эффективно дискриминирующих олигонуклеотидных зондов.

2.3.1.7. Прямое сравнение индексов метилирования ДНК в контрольной и клинической пробах.

2.3.2. Гибридизационный анализ картины метилирования ДНК в опухолевых клетках при В-ХЛЛ.

2.3.2.1. Олигонуклеотидные чипы для анализа метилирования ДНК.

2.3.2.2. Разработка олигонуклеотидных праймеров для ПЦР-амплификации модифицированной бисульфитом ДНК и оптимизация условий проведения ПЦР

2.3.2.3. Подготовка пробы ДНК больных для гибридизации на чипах.

2.3.2.4. Аберрантное гиперметилирование промоторно-экзонных CpG-островков

18 генов при B-XJIJI.

2.3.2.5. Шесть аномально метилированных генов в клетках B-XJIJI кодируют белковые компоненты онкогенного сигнального пути Wnt.

2.3.3. Анализ метилирования генов негативных регуляторов сигнальных путей Wnt, Jak/STAT и Ras с использованием бисульфитного секвенирования и метилспецифичной ПЦР.

2.3.3.1. Высокая частота аномального метилирования генов ингибиторов пути

Wnt DKK1, SFRP1,WIF1.

2.3.3.2. Гены компонентов белкового комплекса деградации р-катенина АРС и GSK3B неметилированы при В-ХЛЛ.

2.3.3.3. Гены негативных регуляторов систем передачи сигналов Jak/STAT и Ras полностью неметилированы при В-ХЛЛ.

2.3.3.4. Анализ связи характера метилирования генов DKK1, PYGOl, SFRP1 и WIF1 с факторами прогноза В-ХЛЛ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Аномальные изменения картины метилирования геномной ДНК при хроническом В-клеточном лимфолейкозе»

Актуальность проблемы. Опухолевый фенотип клетки является результатом аномального функционирования систем передачи сигналов в клетке [9]. Онкогенные сигнальные пути (Ras, Wnt, Jak/STAT, Akt, Hedgehog, Notch и другие) проводят митогенные и антиапоптотические сигналы в ядро от рецепторов на клеточной мембране [282]. Достигшие ядра сигналы активируют гены-мишени, запуская генетические программы клеточного роста, пролиферации клеток и избегания апоптоза [153]. В отличие от дифференцированных клеток онкогенные сигнальные пути в опухолях активны конститутивно вне зависимости от наличия реального сигнала (например, фактора роста).

В основе аберрантного функционирования сигнальных путей в опухолях лежат описанные ранее генетические нарушения. Точечные и хромосомные мутации, амплификации генов, образующиеся химерные гены приводят к потере экспрессии генов ингибиторов сигнальных путей (потенциальных генов-супрессоров), активации генов, продукты которых участвуют в цепи передачи сигнала, или к изменению структуры их белковых продуктов (протоонкогены). Традиционная модель онкогенеза [185] предполагает прогрессивное накопление генетических нарушений в клетке, необходимых для её трансформации. Следствием данной модели является случайность мутаций и их необратимость. Подобный взгляд на онкогенез определяет используемые подходы к терапии опухолей.

В настоящее время происходит существенный пересмотр представлений об этиологии опухолей в связи с обнаружением значительных эпигенетических нарушений во всех изученных типах новообразований. К эпигенетическим модификациям клетки относят картину метилирования геномной ДНК и паттерн модификаций хроматина. Эпигенетические модификации определяют митотически наследуемые изменения функции генов, происходящие без изменения их нуклеотидных последовательностей [240]. Показано, что аберрантное гиперметилирование 5'-областей генов связано с их инактивацией [50, 113, 119, 197], а общее деметилирование ДНК сопряжено с возрастанием нестабильности генома [10]. Таким образом, эпигенетические нарушения функционально не менее важны, чем онкогенные мутации. Судьба клетки, приобретшей онкогенную мутацию, по-видимому, сильно зависит от имеющихся в ней эпигенетических нарушений [134]. Изменения нормального метилирования ДНК появляются на самых ранних этапах трансформации, когда клетка еще не приобрела свойства опухолевой [161, 188, 200, 220, 292], и поэтому представляют исключительный интерес для ранней диагностики и прогноза онкозаболеваний. Аномальное метилирование генов онкогенного сигнального пути может предрасполагать к накоплению мутаций в генах того же пути (неслучайность мутаций) [63], и именно эпигенетические нарушения могут инициировать трансформацию клеток по меньшей мере в ряде случаев.

Механизмы столь значительных изменений картины метилирования ДНК в опухолях только начинают исследовать. К сегодняшнему дню детально описана картина метилирования не более 0,1% генома [243]. Знание эпигенетических нарушений в опухолевых клетках иключительно важно с точки зрения понимания этиологии новообразований, а также - учитывая обратимость эпигенетических изменений - для разработки новых эпигенетических подходов к терапии опухолей. Все это выводит на первый план методические аспекты исследования картины метилирования ДНК. Большинство используемых в настоящее время методов обладают низкой информативностью и позволяют анализировать характер метилирования только одного или нескольких нуклеотидов за один эксперимент. Особую актуальность поэтому приобретает разработка новых методов крупномасштабного и высокопроизводительного анализа метилирования ДНК, с помощью которых можно одновременно анализировать характер метилирования множества (сотни, тысячи) нуклеотидов (генов) в нескольких биологических образцах в ходе одного эксперимента.

Лимфопролиферативное заболевание хронический В-клеточный лимфолейкоз (В-ХЛЛ) имеет относительно благоприятный прогноз, но крайне гетерогенное течение [16]. Клинические, морфологические и цитогенетические исследования позволяют считать В-ХЛЛ неоднородным заболеванием, имеющим несколько форм с различной клинической картиной [20]. Цитогенетические нарушения в опухолевом клоне редко обнаруживаются на ранних стадиях заболевания [75], что позволяет предположить важный вклад эпигенетических изменений в патогенез В-ХЛЛ. Однако характер метилирования геномной ДНК в опухолевых клетках при В-ХЛЛ мало изучен. Имеющиеся данные описывают общее содержание 5-метилцитозина, картины метилирования нескольких генов, а также аномальное метилирование отдельных Св-динуклеотидов в масштабе генома. Функциональное значение изменений картины метилирования ДНК при В-ХЛЛ в целом остаётся неясным.

В связи с этим важным является исследование характера метилирования потенциально важных в патогенезе В-ХЛЛ генов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было сравнительное исследование картины метилирования 5'-регионов (промотор, первый экзон) потенциально важных для онкогенеза генов в опухолевых клетках при хроническом В-клеточном лимфолейкозе и в В-лимфоцитах здоровых доноров.

Для выполнения цели были поставлены следующие задачи:

1. разработать метод анализа картины метилирования ДНК с помощью гибридизации на in situ синтезированных олигонуклеотидных ДНК-чипах;

2. выбрать гены-кандидаты для изучения метилирования их 5'-областей (по данным литературы);

3. выделить геномную ДНК из клеток периферической крови больных B-XJIJ1 и В-лимфоцитов здоровых доноров и модифицировать её бисульфитом натрия;

4. разработать олигонуклеотидные праймеры и провести ПЦР-амплификацию исследуемых участков промоторных областей генов на нативной и модифицированной бисульфитом геномной ДНК (пробоподготовка);

5. спроектировать олигонуклеотидный состав ДНК-чипов для изучения характера метилирования искомых генов и синтезировать ДНК-чипы;

6. провести гибридизационный анализ проб ДНК из опухолевых клеток больных В-ХЛЛ и периферической крови здоровых доноров на ДНК-чипах;

7. проверить полученные результаты с помощью широко используемых альтернативных методов - метилспецифичной ПЦР и бисульфитного секвенирования ДНК;

8. сопоставить характер метилирования ДНК с известными прогностическими факторами В-ХЛЛ: мутационным статусом генов иммуноглобулинов IgVH, уровнем лимфоцитов исходно, временем удвоения лимфоцитов и полом.

9. предложить гипотетический механизм аномальной эпигенетической активации сигнального пути Wnt в клоне В-ХЛЛ.

Научная новизна. Разработанный метод масштабного анализа картины метилирования ДНК с помощью гибридизации на олигонуклеотидных чипах не имеет аналогов в отечественной литературе и позволяет дискриминировать пробы ДНК разной степени метилирования. В ходе одного эксперимента возможен одновременный анализ метилирования 500-1000 индивидуальных CG-динуклеотидов в каждой из восьми биологических проб. Показана возможность количественного анализа степени метилирования CG-динуклеотидов с помощью гибридизации с зондами чипа, селектированных по способности дискриминировать пробы ДНК известной степени метилирования. Впервые в опухолевых клетках В-ХЛЛ выявлено аберрантное метилирование генов сигнального пути Wnt: DKK1 (50%, 23/46 образцов), PYG01 (86%, 19/22), WIF1 (65%, 30/46), DACT1 (6%, 3/46), PTPN6 (2%, 1/46), DKK2 (3/7), DKK3 (2/7); проапоптотических генов APAF1 (4/10), ВАХ (3/10) и RAD9A (3/10); гена, контролирующего клеточный цикл, UBE2C (4/6), а также генов BCL6 (6/6) и FSCN1 (2/6).

Гиперметилирование промоторных CpG-островков генов, кодирующих негативные регуляторы сигнального пути Wnt, по-видимому, представляет эпигенетический механизм его аномальной активации при B-XJIJI. Установлено отсутствие метилирования генов, кодирующих негативные регуляторы путей Jak/STAT и Ras.

Практическая значимость. Метод масштабного анализа картины метилирования ДНК с помощью гибридизации на олигонуклеотидных чипах, разработанный в данной работе, может быть использован для эпигенетического анализа (в т.ч. количественного) любого типа опухоли, поиска новых локусов, подверженных метилированию в новообразованиях. После дополнительных испытаний возможно использование метода в диагностических целях по ранее описанным маркерам метилирования ДНК в биоптатах опухолей или биологических жидкостях организма (например, ДНК плазмы или сыворотки крови). Установленное гиперметилирование генов SFRP1, WIF1, PYG01 и ряда других при B-XJIJ1 создаёт основу для разработки клинического теста для диагностики В-XJIJT, а также испытаний деметилирующих агентов (например, децитабина) в качестве новых химиотерапевтических средств. Обнаруженное метилирование генов негативных регуляторов сигнального пути Wnt важно для разработки новых средств направленной терапии B-XJIJI.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по биохимии, в спецкурсах «Молекулярная биология», «Генетическая инженерия», «Молекулярная диагностика», а также при проведении автором практиктических и семинарских занятий по биохимии в Воронежской государственной медицинской академии.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Основные положения работы были представлены на XIX зимней молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2007); ежегодной международной конференции по методам анализа с помощью биочипов «Chiptechnologien» (Франкфурт, 2006); 2-ой конференции Германского центра изучения рака (Gemían Cancer Research Center) (Хайдельберг, 2006); 10-й Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006); межрегиональных конференциях, посвященных памяти проф. А. А. Землянухина (Воронеж, 2006, 2007); ежегодной научной сессии отчётной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета (2006); ежегодной конференции «Философские проблемы биологии и медицины» (Воронеж, 2004). По итогам 2-ой конференции Германского центра изучения рака сообщение было признано победителем конкурса.

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 12 публикациях - 6 статьях, 5 тезисах и 1 учебно-методическом пособии.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 204 страницах машинописного текста (151 стр. основного текста и 53 стр. приложений) и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (297 источников). Иллюстрационный материал включает 41 рисунок и 8 таблиц. Материал, не вошедший в основной текст работы, изложен в пяти приложениях.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Москалёв, Евгений Александрович

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод масштабного анализа картины метилирования ДНК посредством гибридизации модифицированной бисульфитом ДНК с /и si tu синтезированными олигонуклеотидными зондами ДНК-чипа. Характер метилирования каждого CG-динуклеотида оценивается с помощью пары 17-21-членных олигонуклеотидных зондов, комплементарных метилированной и неметилированной ДНК-мишеням. Возможно одновременное исследование метилирования порядка 1000 CG-динуклеотидов в нескольких биологических пробах.

2.0лигонуклеотидные зонды ДНК-чипа способны статистически достоверно дискриминировать пробы ДНК разной степени метилирования: 91% пар зондов - 0 и 100% метилированную ДНК, 74% пар - 0, 50 и 100% метилированную ДНК, 62% пар -образцы ДНК 0, 25, 50 и 100% степени метилирования.

3.Показана принципиальная возможность количественного анализа степени метилирования ДНК в биологических образцах с помощью олигонуклеотидных зондов чипа, селектированных по способности дискриминировать 0, 50 и 100% метилированные пробы и характеризующихся линейной зависимостью вычисленных индексов метилирования от известной степени метилирования гибридизуемой ДНК. Обнаружено 12% пар зондов, полностью удовлетворяющих данному критерию.

4.Предложены две стратегии эпигенетического анализа на ДНК-чипах. Для поиска новых аномально метилированных локусов целесообразно качественное сравнительное исследование картины метилирования ДНК опухолевых и нормальных клеток без предварительной селекции зондов. Для ранее описанных метилированных генов (например, в диагностических целях) возможно изучить степень их метилирования в опухоли, используя олигонуклеотидные зонды, способные к количественному анализу.

5.Впервые установлено аберрантное метилирование потенциально важных в патогенезе хронического лимфолейкоза генов посредством гибризизации на олигонуклеотидных чипах: проапоптотические гены APAF1 (4 из 10 проб крови больных), ВАХ (3/10), RAD9A (3/10), негативный регулятор клеточного цикла UBE2C (4/6), транскрипционный регулятор BCL6 (6/6), гомолог фасцина FSCN1 (2/6), ген негативных регуляторов сигнального пути Wnt DKK2 (3/7), DKK3 (2/7), FRZB (3/7), SFRP2 (2/7), ген ядерного компонента сигнального пути Wnt PYGOl (6/6). Подтверждено гиперметилирование генов кальцитонина CALCA (4/10), Е-кадхерина CDH1 (8/10), ингибитора циклин-зависимой киназы CDKN2B (5/10), проапоптотической протеинкиназы DAPK1 (3/10), рецептора глутамата GRM7 (5/5) и антагониста р53 TWIST2 (8/10).

6.Впервые показана высокая частота аномального метилирования генов негативных регуляторов сигнального пути Wnt WIF1 (65%, 30/46), DKK1 (50%, 23/46) и PYG01 (86%, 19/22). Ген SFRP1 дифференциально метилирован при В-ХЛЛ (91%, 20/22). Не выявлено метилирование генов, кодирующих негативные регуляторы сигнальных путей Jak/STAT и Ras: CISH, PTPN6, SOCS1/3, RASSF1,4,5.

7.Исходный уровень лимфоцитов в крови достоверно выше у больных с гиперметилированными генами SFRP1 и PYG01. Не обнаружено корреляции гиперметилирования с другими прогностическим факторами при B-XJTJT: мутационным статусом генов иммуноглобулинов IgVn, временем удвоения лимфоцитов, характером поражения костного мозга и полом.

8.Аберрантное метилирование генов DKK1, PYGOl, SFRP1 и WIF1 обнаружено на всех (в т.ч. ранних стадиях) В-ХЛЛ, что является основой для использования характера метилирования данных генов в дальнейшем как эпигенетических маркеров для ранней диагностики заболевания.

Э.Установленное гиперметилирование 5'-областей генов, по-видимому, носит неслучайный характер и представляет эпигенетический механизм дерегуляции клеточного цикла и апоптоза, вносящих важный вклад в патогенез В-ХЛЛ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные данные свидетельствуют о том, что хронический В-клеточный лимфолейкоз имеет не только генетическую природу и развивается в результате онкогенных мутаций, но в значительной степени обусловлен эпигенетически. Обнаружены неизвестные ранее при В-ХЛЛ существенные изменения картины метилирования важных для онкогенеза генов, которые вместе с описанными ранее хромосомными аберрациями могут вносить важный вклад в патогенез данного лимфопролиферативного заболевания и предрасполагать к его прогрессии.

Комплексное исследование картины метилирования ДНК в клетках В-ХЛЛ во многом стало возможным благодаря разработанному нами методу гибридизации модифицированной бисульфитом ДНК на ДНК-чипах с in situ синтезированными олигонуклеотидными зондами. Так, при гибридизации проб ДНК из крови больных В-ХЛЛ и здоровых доноров на трёх ДНК-чипах стало возможным одновременное сравнительное изучение метилирования 1544 CG-динуклеотидов 33 генов в норме и при патологии. Данный метод даёт воспроизводимые результаты, позволяет дискриминировать пробы ДНК разной степени метилирования и обладает очевидным преимуществом перед рутинно используемыми методами исследования метилирования ДНК, которые позволяют изучить метилирование только нескольких CG-динуклеотидов за один эксперимент. Проверка результатов гибридизационного анализа на ДНК-чипах с помощью альтернативных способов - бисульфитного секвенирования и метилспецифичной ПЦР, выявила полное соответствие результатов, полученных разными методами.

Аномально метилированные при В-ХЛЛ гены, обнаруженные в данной работе, кодируют компоненты сигнальных систем, контролирующих клеточный цикл и апоптоз и поэтому важных для онкогенеза. Возможные последствия метилирования отражены в предлагаемой нами гипотетической схеме дерегуляции клеточного цикла и апоптоза (рис. 41). Предлагаемая модель основана на предположении о потере экпрессии гиперметилированных генов в опухолевых клетках. В пользу справедливости этого допущения свидетельствует большое множество литературных данных по реактивации метилированных генов в культуре опухолевых клеток или первичных опухолях после деметилирования ДНК с помощью ингибиторов ДНК-метилтрансфераз.

Установленная в работе высокая частота аномального метилирования генов компонентов сигнального пути Wnt предполагает особую важность данной системы

Внеклеточное ^пространство я

Цитозоль

Ядро

Нарушение контроля клеточного цикла

Пролиферация, избегание апоптоза

ЦП мембрана

Рис. 41. Гипотетическая схема эпигенетической дерегуляции клеточного цикла и апоптоза в клетках хронического В-клеточного лимфолейкоза. прямая активация опосредованная активация прямое ингибирование опосредованное ингибирование потеря активности Выделение серым - метилирование гена +Р - фосфорилирование +и - убиквитинирование передачи сигнала в патогенезе хронического B-клеточного лимфолейкоза. Девять аномально метилированных генов негативно регулируют сигнальный путь Wnt (рис. 41). Таковы гены WIF1, SFRP1.2, FRZB (SFRP3), DKK1-3, белковые продукты которых препятствуют узнаванию сигнальных молекул Wnt рецептором Fz на клеточной поверхности. А также ген DACT1, ингибирующий цитозольный участок цепи передачи сигнала, и ген Е-кадхерина CDH1, цитоплазматический домен которого способен связывать белок ß-катенин - ключевой компонент сигнального пути, уменьшая его концентрацию в цитоплазме. В результате ß-катенин может накапливаться в цитоплазме и транслоцироваться в ядро, где функционирует как транскрипционный фактор, активируя антиапоптотические гены (например, survivin) и гены, регулирующие клеточный цикл (МУС, циклин D и др). Результатом гиперметилирования данных генов в клетках B-XJLJ1 может быть активирование пути Wnt, которое действительно имеет место и отчасти обусловливает устойчивость к апоптозу in vitro.

Установлено аберрантное метилирование гена UBE2C, продукт которого является убиквитин-конъюгирующим ферментом, необходимым для деградации митотических циклинов, а также гена CDKN2B, кодирующего ингибитор циклин-зависимой киназы 4. Согласованая эпигенетическая инактивация данных генов (потеря экспрессии UBE2C при B-XJ1JI продемонстрирована Klein et al., 2006), по-видимому, приводит к нарушению нормальной регуляции клеточного цикла и пролиферации клеток B-XJLJ1.

Метилирование гена RAD9A (инактивирован при В-ХЛЛ), продукт которого активируется при повреждении ДНК и через онкосупрессорный белок р53 приводит к остановке клеточного цикла в G1/S чекпойнте и апоптозу, может отчасти объяснять феномен генетической нестабильности клеток В-ХЛЛ. Метилирование генов DAPK1 (протеинкиназа, ассоциированная с рецептором смерти), В АХ и АР AFI (проапоптотические компоненты внешнего пути апоптоза), по-видимому, вносят вклад в известный феномен устойчивости клеток В-ХЛЛ к апоптозу in vivo.

В данной работе впервые продемонстрирована высокая частота de novo метилирования гена PYG01, продукт которого функционирует в ядре клетки как коактиватор транскрипции генов-мишеней пути Wnt. Функциональное значение метилирования гена PYG01 при В-ХЛЛ не совсем понятно. Однако его гиперметилирорвание может отражать потерю равновесия между экспансией метилирования (от метилированной в норме части промотора) (рис. 29) и защиты от него в клетках В-ХЛЛ.

Мы не утверждаем, что метилирование каждого гена имеет важную биологическую роль и располагает к прогрессии заболевания. Но эпигенетическая потеря функции, по меньшей мере, некоторых из них (рис. 41), по-видимому, вносит важный вклад в патогенез хронического лимфолейкоза.

Высокая частота метилирования исследованных генов при В-ХЛЛ (например, SFRP1 - 91%, WIF1 - 65%, DKK1 - 50%) и их важная для онкогенеза роль подтверждает предположение о неслучайном, направленном механизме de novo метилирования генов в неоплазиях, выдвинутое рядом исследователей по результатам эпигенетического анализа солидных опухолей.

Другой важный для онкогенеза путь Jak/STAT передаёт сигнал от рецепторов цитокинов на клеточной мембране в ядро. Активный путь Jak/STAT приводит к клеточному росту и избеганию апоптоза за счёт усиления транскрипции генов-мишеней [166, 171]. Для настоящего исследования путь Jak/STAT был выбран ввиду ранее обнаруженной потери экспрессии гена его негативного регулятора SOCS1 в клетках В-ХЛЛ по сравнению с нормальными В-лимфоцитами (в 18,5 раз) [147]. Гиперметилирование данного гена является частым событием в разных типах опухолей (Приложение 1). Инактивация данного гена может вносить вклад в аномальную передачу сигнала через путь Jak/STAT при В-ХЛЛ. Ген другого негативного регулятора PTPN6(SHP1) инактивирован метилированием в В-клеточных лимфомах [45]. Для исследования предположения об эпигенетическом механизме потери экспрессии генов был исследован характер метилирования промоторно-экзонных CpG-островков генов SOCS1/3, PTPN6 и CISH (Рис. 34-37). По результатам метилспецифичной ПЦР и бисульфитного секвенирования метилирование гена PTPN6 обнаружено только в 1 из 46 проб крови больных (2%). Метилирование генов SOCS1/3 и CISH не выявлено ни в одном случае. Данные результаты позволяют предположить существование другого неэпигенетического механизма активации данного сигнального пути.

Метилирование генов RASSF1, RASSF4 и RASSF5, кодирующих эффекторы протоонкобелка Ras и контролирующих апоптоз, также не выявлено. Данные результаты свидетельствуют о том, что сигнальный путь Ras, по-видимому, не вовлечён в патогенез В-ХЛЛ (несмотря на высокую частоту метилирования данных генов в других типах опухолей (Приложение 1)), т.к. уровень экспрессии данных генов не отличается в опухолевы В-клетках от нормальных В-лимфоцитов [147].

Результаты гибридизационного анализа генов RAD9A, CDKN2B, UBE2C, APAF1, ВАХ, DAPK1, GRM7, TWIST2 полностью воспроизводят ранее обнаруженное при В-ХЛЛ метилирование данных генов, что свидетельствует о надёжности разработанного метода. Кроме того, метилирование генов 8РЯР1, СВН1 и РУ001 было подтверждено с помощью широко используемых методов бисульфитного секвенирования и метилспецифичной ПЦР (рис. 28, 29).

Таким образом, нами предложен возможный эпигенетичекий механизм развития хронического В-клеточного лимфолейкоза, который значительно дополняет описанную ранее генетическую картину данного заболевания. Нарушения нормальной картины метилирования ряда важных для онкогенеза генов свидетельствуют о целесообразности дальнейших поисков в области эпигенетики В-ХЛЛ для более полного понимания событий, инициирующих опухолевую трансформацию В-клеток, истинного механизма данного заболевания и разработки новой эффективной терапии, а также эпигенетических маркеров для ранней диагностики и прогноза.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Москалёв, Евгений Александрович, 2007 год

1. Аномальное метилирование генов-супрессоров опухолевого роста имикросателлситная нестабильность в предраковых состояниях шейки матки / Т. В. Кекеева и др.. // Молекуляр. биология. 2006. - Т. 40, № 2. - С. 224-230.

2. Аномальное метилирование некоторых генов-супрессоров при спорадическом ракемолочной железы / В. В. Землякова и др.. // Молекуляр. биология. 2003. -Т. 37, № 4. - С. 696-703.

3. Биологические микрочипы, содержащие иммобилизованные в гидрогеленуклеиновые кислоты, белки и другие соединения: свойства и приложения в геномике / В. Барский и др.. // Молекуляр. биология. 2002. - V. 36, № 4. -Р. 563-584.

4. Ванюшин Б. Ф. Энзиматическое метилирование ДНК эпигенетический контроль загенетическими функциями клетки / Б. Ф. Ванюшин // Биохимия. 2005. - Т. 70, №5.-С. 598-611.

5. Глик Б. Молекулярная биотехнология: принципы и применение / Б. Глик, Дж.

6. Пастернак. М.: Мир, 2002. - 589 с.

7. Диагностика эпигенетической патологии при наследственных и онкологическихзаболеваниях / Д. В. Залетаев и др.. // Молекуляр. биология. 2004. - Т. 38, № 2. -С. 213-223.

8. Москалёв Е. А. Методы определения картины метилирования геномной ДНК приканцерогенезе: от отдельных нуклеотидов к метилому / Е. А. Москалёв, А. Т. Епринцев, J. D. Hoheisel // Молекуляр. биология. 2007. - Т. 41, №. 5. - С. 793-807.

9. Изменение метилирования ДНК лимфоцитов крупного рогатого скота прихроническом лимфолейкозе / Н. Н. Бурцева и др.. // Биохимия. 1977. - Т. 42. -С. 1690-1696.

10. Канцерогенез: Руководство / Под ред. Д. Г. Заридзе. М.: Медицина, 2004. - С. 191-203.

11. Киселёва Н. П. 2005. Деметилирование ДНК и канцерогенез / Н. П. Киселева,

12. Ф. Л. Киселев // Биохимия. Т. 70, № 7. - С. 900-911.

13. Кольман Я. Наглядная биохимия / Я. Кольман, К.-Г. Рём. М.: Мир, 2000. - 469 с.

14. Лакин Г. Ф. Биометрия / Г. Ф. Лакин. 4-е издание. - М.: Высш. школа, 1990. - 352 с.

15. Маршалл В. Дж. Клиническая биохимия / В. Дж. Маршалл. М. - СПб.:

16. Издательство БИНОМ»-«Невский Диалект», 1999. 368 с.

17. Метилирование предполагаемого гена-супрессора RASSF1 в опухолях шейки матки / А.

18. В. Малюкова и др.. // Молекуляр. биология. 2004. - Т. 38, № 6. - С. 1005-1013.

19. Молекулярная клиническая диагностика. Методы / Под ред. С. Херрингтона,

20. Дж. Макги. М: Мир, 1999. - 560 с.

21. Никитин Е. А. Прогностическое значение мутаций вариабельного регионаиммуноглобулинов при хроническом лимфолейкозе: Автореф. дис. на соискание учен. степ. канд. мед. наук / Е. А. Никитин. Москва, 2001. - 24 с.

22. Онкомаркеры, их характеристика и некоторые аспекты клинико-диагностическогоиспользования / М. JI. Алексеева // Проблемы репродукции. 2005. - №3. - 65-79.

23. Ройт А. Иммунология / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл. М.: Мир, 2000. - 592 с.

24. Руководство по гематологии / Под ред. А. И. Воробьёва. М.: Ньюдиамед, 2003.1. Т. 2. 280 с.

25. Сингер М. Гены и геномы / М. Сингер, П. Берг. М.: Мир, 1998. - Т. 1. - 373 с.

26. Уровень метилирования промоторной области гена RASSF1A в первичныхэпителиальных опухолях / В. И. Логинов и др.. // Молекуляр. биология. 2004. - Т. 38, № 4. - С. 654-667.

27. Функциональная патология генов RB1 и pió в ретинобластомах / О. В. Бабенко идр.. // Молекуляр. биология. 2002. - Т. 36, № 5. - С. 777-783.

28. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells /

29. B. E. Bernstein et al.. // Cell. 2006. - V. 125, № 20. - P. 315-326.

30. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residuesin individual DNA strands / M. Frommer et al.. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. -V. 89, №5.-P. 1827-1831.

31. A mammalian protein with specific demethylase activity for mCpG DNA /

32. S. K. Bhattacharya et al.. // Nature. 1999. - V. 397, № 6720. - P. 579-583.

33. A new prognostic classification of chronic lymphocytic leukemia derived from amultivariate survival analysis / J. L. Binet et al.. // Cancer. 1981. - V. 48, № 1. - P. 198-206.

34. A quantitative Hpall-PCR assay to measure methylation of DNA from a small number ofcells / J. Singer-Sam et al.. // Nucleic Acids Res. 1980. - V. 18, № 3. - P. 687.

35. A stem cell-like chromatin pattern may predispose tumor suppressor genes to DNAhypermethylation and heritable silencing / J. E Ohm et al.. // Nat. Genet. 2007. -V. 39, № 2. - P. 237-242.

36. A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication inmammalian nuclei / H. Leonhardt et al.. // Cell. 1992. - V. 71, № 5. - P. 865-873.

37. Aberrant CpG island hypermethylation of chronic gastritis, in relation to aging, gender,intestinal metaplasia, and chronic inflammation / G. H. Kang et al.. // Am. J. Pathol. -2003. V. 163, № 4. - P. 1551-1556.

38. Aberrant methylation of RASGRF2 and RASSF1A in human non-small cell lung cancer /

39. H. Chen et al.. //Oncol. Rep. 2006. - V. 15, № 5. - P. 1281-1285.

40. Aberrant methylation of RASSF4/AD037 in nasopharyngeal carcinoma / L. S. Chow //

41. Oncol. Rep. 2004. - V. 12, № 4. - P.781-787.

42. Aberrant methylation of suppressor of cytokine signalling-1 (SOCS-1) gene in pancreaticductal neoplasms / N. Fukushima et al.. // Br. J. Cancer. 2003. - V. 89, № 2. - P. 338-343.

43. Aberrant methylation of the negative regulators RASSFIA, SHP-1 and SOCS-1 inmyelodysplastic syndromes and acute myeloid leukaemia / M. F. Johan et al.. // Br J Haematol. 2005. - V. 129, № 1. - P. 60-65.

44. Aberrant methylation of the Wnt antagonist SFRP1 in breast cancer is associated withunfavourable prognosis / J. Veeck et al.. // Oncogene. 2006. - V. 25, № 24, 34793488.

45. Aberrant promoter hypermethylation and silencing of the critical 3p21 tumour suppressorgene, RASSF1A, in Chinese oesophageal squamous cell carcinoma / M. L. Wong et al.. // Int. J. Oncol. 2006. - V. 28, № 3. - P. 767-773.

46. Aberrant promoter hypermethylation of multiple genes in gallbladder carcinoma andchronic cholecystitis / T. Takahashi et al.. // Clin. Cancer. Res. 2004. - V. 10, № 18 Pt 1. - P. 6126-6133.

47. Aberrant promoter methylation profiles of tumor suppressor genes in hepatocellularcarcinoma / B. Yang et al.. // Am. J. Pathol. 2003. - V. 163, № 3. - P. 1101-1107.

48. Abnormalities of the APC/beta-catenin pathway in endometrial cancer / G. Moreno-Buenoet al.. // Oncogene. 2002. - V. 21, № 52. - P. 7981-7990.

49. Abundant hypermethylation of SOCS-1 in clinically silent pituitary adenomas / R. Busleiet al.. // Acta Neuropathol. (Berl). 2006. - V. 111, № 3. - P. 264-271.

50. Activated proliferation of B-cell lymphomas/leukemias with the SHP1 gene silencing byaberrant CpG methylation / M. Koyama et al.. // Lab. Invest. 2003. - V. 83, № 12 . -P. 1849-1858.

51. Activated proliferation of B-cell lymphomas/leukemias with the SHP1 gene silencing byaberrant CpG methylation / M. Koyama et al.. // Laboratory Investigation. 2003. -V. 83, №12.-P. 1849-1858.

52. Activation of the Wnt signaling pathway in chronic lymphocytic leukemia / D. Lu, Y.

53. Zhao, R. Tawatao et al.. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - V. 101, № 9. -P. 3118-3123.

54. Activity of the suppressor of cytokine signaling-3 promoter in human non-small-cell lungcancer / B. He et al.. // Clin. Lung. Cancer. 2004. - V. 5, № 6. - P. 366-370.

55. Agathanggelou A. Role of the Ras-Association domain family 1 in tumor /

56. A. Agathanggelou, W. N. Cooper, F. Latif // Cancer Res. 2005. - V. 65, № 9. - P. 3497-3508.

57. Allele-specific hypermethylation of the retinoblastoma tumor-suppressor gene / T. Sakaiet al.. // Am. J. Hum. Genet. 1991. - V. 48, № 5. - P. 880-888.

58. Allelic silencing at the tumor-suppressor locus 13ql4.3 suggests an epigenetic tumorsuppressor mechanism / D. Mertens et al.. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006. -V. 103,№20.-P. 7741-7746.

59. Alterations of the Wnt signaling pathway during the neoplastic progression of Barrett'sesophagus / G. Clément et al.. // Oncogene. 2006. V. 25, № 21. - P. 3084-3092.

60. An autocrine mechanism for constitutive Wnt pathway activation in human cancer cells /

61. A. Bafico et al.. // Cancer Cell. 2004. - V. 6, № 5. - P. 497-506.

62. Analysis of adenomatous polyposis coli promoter hypermethylation in human cancer /

63. M. Esteller et al.. // Cancer Res. 2000. - V. 60, № 16. - P. 4366-4371.

64. Antequera F. Structure, function and evolution of CpG island promoters / F. Antequera //

65. Cell. Mol. Life Sci. 2003. - V. 60, № 8. - P. 1647-1658.

66. Antisense suppression of Pygopus 2 results in growth arrest of epithelial ovarian cancer / C.

67. M. Popadiuk et al.. // Clin. Cancer Res. 2006. - V 12, № 7 Pt. 1. - P. 2216-2223.

68. APC, beta-catenin, and E-cadherin and the development of recurrent endometrialcarcinoma / J.M. Pijnenborg et al.. // Int. J. Gynecol. Cancer. 2004. - V. 14, № 5. -P. 947-956.

69. Apoptosis and cancer therapy / Eds. K. M. Debatin, S. Fulda. Weinheim: Wiley-VHC,2006. P. 60-85.

70. Array-based analysis of genomic DNA methylation patterns of the tumor suppressor genepl6INK4A promoter in colon carcinoma cell lines / C. Mund et al.. I I Nucleic Acids Res.-2005.-V. 33, №8.-P. e73.

71. Arrayed primer extension: solid phase four-color DNA resequencing and mutationdetection technology / A. Kurg et al.. // Genetic testing. 2000. - V. 4, № 1. - P. 1-7.

72. Association of promoter hypermethylation of the RASSF1A gene with prognosticparameters in endometrial cancer / H. Jo et al.. // Oncol. Res. 2006. - V. 16, № 4. -P. 205-209.

73. Baylin S. B. DNA hypermethylation in tumorigenesis: epigenetics joints genetics /

74. S. B. Baylin, J. G. Herman // Trends Genet. 2000. - V. 16, № 4. - P. 168-174.

75. Baylin S. B. Epigenetic gene silencing in cancer a mechanism for early oncogenicpathway addiction? / S. B. Baylin, J. E. Ohm // Nature Rev. 2006. - V.6, № 2. -P. 107-116.

76. B-cell chronic lymphocytic leukemia cells express a surface membrane phenotype ofactivated, antigen-experienced B lymphocytes / R. N. Damle et al.. // Blood. 2002. -V. 99,№ 11.-P. 4087-4093.

77. Bernstein B. E. The mammalian epigenome / B. E. Bernstein, A. Meissner, E. S. Lander //

78. Cell. 2007. - V.128, № 4. - P. 669-681.

79. Bioinformatics methods and protocols: methods in molecular biology / S. Krawetz,

80. S. Misener (Eds.). Totowa: Humana Press, 2000. - pp. 365-386.

81. Biology and treatment of chronic lymphocytic leukemia / M. J. Keating et al.. //

82. Hematology (Am. Soc. Hematol. Educ. Program). 2003. - P. 153-175.

83. Bird A. DNA methylation patterns and epigenetic memory / A. Bird // Genes Dev. 2002.-V. 16, № l.-P. 6-21.

84. Bird A. P. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: I. Themethylation pattern in ribosomal DNA from Xenopus laevis / A. P. Bird, E. M. Southern //J. Mol. Biol. 1978. - P. 118, № 1. - P. 27-47.

85. Bird A. Perceptions of epigenetics / A. Bird // Nature. 2007. - V. 447, № 7143. - P. 396-398.

86. Boes M. Role of natural and immune IgM antibodies in immune responses / M. Boes //

87. Mol. Immunol. 2000. - V. 37, № 18. - P. 1141-1149.

88. Brero A. Replication and translation of epigenetic information / A. Brero, H. Leonhardt,

89. M. C. Cardoso // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2006. - № 301. - P. 21-44.

90. Cadigan K. M. Wnt signaling: a common theme in animal development / K. M. Cadigan,

91. R. Nusse // Genes Dev. 1997. - V. 11, № 24. - P. 3286-3305.

92. Chim C. S. Epigenetic dysregulation of the Jak/STAT pathway by frequent aberrantmethylation of SHP1 but not SOCS1 in acute leukaemias / C. S. Chim, A. S. Wong, Y. L. Kwong // Ann. Hematol. 2004. V. 83, № 8. - P. 527-532.

93. Chiorazzi N. Chronic lymphocytic leukemia / N. Chiorazzi, K. R. Rai, M. Ferrarini //

94. N. Engl. J. Med. 2005. - V. 352, № 8. - P. 804-815.

95. Chronic lymphoid leukemias / Ed. B. D. Cheson. 2nd ed. - New York: Marcel Dekker,2001.-P. 127-160.

96. Clinical staging of chronic lymphocytic leukemia / K. R. Rai et al.. // Blood. 1975.1. V. 46, № 2. 219-234.

97. Clonal inheritance of the pattern of DNA methylation in mouse cells / R. Stein et al.. //

98. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. - V. 79, № 1. - P. 61-65.

99. Combination analysis of hypermethylated Wnt-antagonist family genes as a novelepigenetic biomarker panel for bladder cancer detection / S. Urakami et al.. // Clin. Cancer Res. 2006. - V. 12, № 7 . - P. 2109-2116.

100. Composition and histone substrates of polycomb repressive group complexes changeduring cellular differentiation / A. Kuzmichev et al.. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2005.-V. 102, №6. -P. 1859-1864.

101. Concurrent DNA hypermethylation of multiple genes in acute myeloid leukemia /

102. J. R. Melki et al.. // Cancer Res. 1999. - V. 59, № 15. - P. 3730-3740.

103. Constitutional activation of IL-6-mediated JAK/STAT pathway through hypermethylationof SOCS-1 in human gastric cancer cell line / K.F. To et al.. // Br. J. Cancer. 2004. -V. 91, № 7. - P. 1335-1341.

104. Control of microtubule stability by the RASSF1A tumor suppressor / L. Liu et al.. //

105. Oncogene. 2003. - V. 22, № 50. - P. 8125-8136.

106. Cox A. D. The dark side of Ras: regulation of apoptosis / A. D. Cox, C. J. Der // Oncogene.- 2003. V. 22, № 56. - P. 8999-9006.

107. CpG island methylation and expression of the secreted frizzled-related protein gene familyin chronic lymphocytic leukemia / T. Liu et al.. // Cancer Res. 2006. - V. 66, № 2. -P. 653-658.

108. CpG island methylation of DNA damage response genes in advanced ovarian cancer /

109. J. M. Teodoridis et al.. // Cancer Res. 2005. - V. 65, № 19. - P. 8961-8967.

110. CpG island promoter hypermethylation of the Ras-effector gene NORE1A occurs in thecontext of a wild-type K-ras in lung cancer / M. Irimia et al.. // Oncogene. 2004. -V. 23, № 53 . - P. 8695-8699.

111. Cremer T. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammaliancells / T. Cremer, C. Cremer // Nat. Rev. Genet. 2001. - V. 2, № 4. - P. 292-301.

112. Dalerba P. Cancer stem cells: model and concepts / P. Dalerba, R. W. Cho, M. F. Clarke //

113. Annu Rev Med. 2007. - № 58. - P. 267-284

114. Dammann R. Hypermethylation of the CpG island of Ras association domain family 1A

115. RASSF1A), a putative tumor suppressor gene from the 3p21.3 locus, occurs in a large percentage of human breast cancers / R. Dammann , G. Yang, G. P. Pfeifer // Cancer Res. 2001. - V. 61, № 7. - P. 3105-3109.

116. Datta S. R. Cellular survival: a play in three Akts / S. R. Datta, A. Brunet, M. E. Greenberg

117. Genes Dev. 1999. - V. 13, № 22. - P. 2905-2927.

118. Demethylation of the zygotic paternal genome / W. Mayer et al.. // Nature. 2000.

119. V. 403, № 6769. P. 501-502.

120. Detection and measurement of PCR bias in quantitative methylation analysis of bisulphitetreated DNA / P. Warnecke et al.. // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25, № 21. -P. 4422-4426.

121. Diagnostic and prognostic information in prostate cancer with the help of a small set ofhypermethylated gene loci / P. J. Bastian et al.. // Clin. Cancer Res. 2005. - V. 11, № 11.-P. 4097-4106.

122. Differential DNA methylation of gene promoters in small B-cell lymphomas / J. Guo //

123. Am. J. Clin. Pathol. 2005. - V. 124, № 3. - P. 430-439.

124. Differential hypermethylation of SOCS genes in ovarian and breast carcinomas /

125. K.D. Sutherland et al.. // Oncogene. 2004. - V. 23, № 46. - P. 7726-7733.

126. Distinct epigenetic changes in the stromal cells of breast cancers / M. Hu et al.. // Nat.

127. Genet. 2005. - V. 37, № 8. - P. 899-905.

128. Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation inthe human genome / M. Weber et al.. // Nat. Genet. 2007. - V. 39, № 4. - P. 457-466.

129. DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy / S. A. Leon et al.. //

130. Cancer Res. 1977. - V. 37, № 3. - P. 646-650.

131. DNA methylation changes in multiple myeloma / O. Galm et al.. // Leukemia. 2004.

132. V. 18, № 10.-P. 1687-1692.

133. DNA methylation patterns of the calcitonin gene in human lung cancers and lymphomas /

134. S. B. Baylin et al.. // Cancer Res. 1986. - V. 46, № 6. - P. 2917-2922.

135. DNA Methylation: Basic Mechanisms / Ed. W. Doerfler, P. Bohm. Berlin Heidelberg.:

136. Springer-Verlag, 2006. 321 p.

137. DNA methyltransferase Dnmtl associates with histone deacetylase activity / F. Fuks et al..

138. Nat. Genet. 2000. - V. 24, № 1. - P. 88-91.

139. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation andmammalian development / M. Okano et al.. // Cell. 1999. - V. 99, № 3. - P. 247-257.

140. DNMT1 forms a complex with Rb, E2F1 and HDAC1 and represses transcription from

141. E2F-responsive promoters / K. D. Robertson et al.. // Nat. Genet. 2000. - V. 25, № 3. - P. 338-342.

142. Doerfler W. DNA methylation and gene activity / W. Doerfler // Annu. Rev. Biochem.1983.-№.52.-P. 93-124.

143. Dormant tumor cells develop cross-resistance to apoptosis induced by CTLs or imatinibmesylate via methylation of suppressor of cytokine signaling 1 / A. Saudemont et al.. // Cancer Res. 2007. - V. 67, № 9. - P. 4491-4498.

144. Epigenetic alterations complement mutation of JAK2 tyrosine kinase in patients with

145. BCR/ABL-negative myeloproliferative disorders / E. Jost et al.. // Leukemia. 2007. - V. 21, № 3. - P. 505-510.

146. Epigenetic alterations in RASSF1A in human aberrant crypt foci / E. J. Greenspan et al..

147. Carcinogenesis. 2006. - V. 27, № 7. - P. 1316-1322.

148. Epigenetic alterations of the Wnt/p-catenin pathway in human disease / O. Aguilera et al..

149. Endocrine, Metabolic and Immune Disorders Drug Targets. - 2007. V.7 № 1. -P. 13-21.

150. Epigenetic changes may contribute to the formation and spontaneous regression ofretinoblastoma / V. Greger et al.. // Hum. Genet. 1989. - V. 83, № 2. - P. 155-158.

151. Epigenetic defects of hepatocellular carcinoma are already found in non-neoplastic livercells from patients with hereditary haemochromatosis / U. Lehmann et al.. // Hum. Mol. Genet.-2007.-V. 16, №11.-P. 1335-1342.

152. Epigenetic inactivation of a RAS association domain family protein from the lung tumoursuppressor locus 3p21.3 / R. Dammann et al.. // Nat. Genet. 2000. - V. 25, № 3. -P.315-319.

153. Epigenetic inactivation of RASSFla in uveal melanoma / W. Maat et al.. // Invest.

154. Ophthalmol. Vis. Sci. 2007. - V. 48, № 2. - P. 486-490.

155. Epigenetic inactivation of SOCS-1 by CpG island hypermethylation in human gastriccarcinoma / Y. Oshimo et al.. // Int. J. Cancer. 2004. - V. 112, № 6. - P. 1003-1009.

156. Epigenetic inactivation of the RASSF1A tumour suppressor gene in ependymoma /

157. D. W. Hamilton et al.. // Cancer Lett. 2005. - V. 227, № 1. - P. 75-81.

158. Epigenetic inactivation of the Wnt antagonist DICKKOPF-1 (DKK-1) gene in human colorectalcancer/ O. Aguilera et al.. // Oncogene. 2006. - V. 25, № 29. - P. 4116-4121.

159. Epigenetic inactivation of tumor suppressor genes in serum of patients with cutaneousmelanoma / A. Marini et al.. //J. Invest. Dermatol. 2006. - V. 126, № 2. - P. 422-431.

160. Epigenetic Inactivation of Wnt Inhibitory Factor-1 Plays an Important Role in Bladder

161. Cancer through Aberrant Canonical Wnt/ p-Catenin Signaling Pathway / S. Urakami et al.. // Clin. Cancer Res. 2006. - V. 12, № 2. - P. 383-391.

162. Epigenetic profiling in chronic lymphocytic leukemia reveals novel methylation targets /

163. J. Rush et al.. // Cancer Res. 2004. - V. 64, № 7. - P. 2424-2433.

164. Epigenetic regulation of Wnt-signaling pathway in acute lymphoblastic leukemia /

165. J. Roman-Gomez et al.. // Blood. 2007. - V. 109, № 8. - P. 3462-3469.

166. Epigenetic stem cell signature in cancer / M. Widschwendter et al.. // Nat. Genet. 2007.-V. 39,№2.-P. 157-158.

167. Espada J. Epigenetic control of nuclear architecture / J. Espada, M. Esteller // Cell. Mol.1.fe Sci. 2007. - V. 64, № 4. - P. 449-457.

168. Esteller M. Aberrant DNA methylation as a cancer-inducing mechanism / M. Esteller //

169. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2005. - №. 45. - P. 629-656.

170. Evaluating the arrayed primer extension resequencing assay of TP53 tumor suppressorgene / N. Tonisson et al.. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - V. 99, № 8. -P. 5503-5508.

171. Evidence that chronic lymphocytic leukemia B lymphocytes are frequently committed toproduction of natural autoantibodies / L. Borche et al.. // Blood. 1990. - V. 76, № 3. -P. 562-569.

172. Expression level of lipoprotein lipase and dystrophin genes predict survival in B-cellchronic lymphocytic leukemia / E. A. Nikitin et al.. // Leukemia and Lymphoma. -2007.-V. 48, №5,- P. 912-922.

173. Expression of the secreted frizzled-related protein gene family is downregulated in humanmesothelioma / A.Y. Lee et al.. // Oncogene. 2004. - V. 23, № 39. - P. 6672-6676.

174. Feinberg A. P. DNA methylation and genomic imprinting: insights from cancer intoepigenetic mechanisms / A. P. Feinberg, H. Cui, R. Ohlsson // Semin. Cancer Biol. -2002. -V. 12, №5.-P.389-398.

175. Feinberg A. P. Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from theirnormal counterparts / A. P. Feinberg, B. Vogelstein // Nature. 1983. - V. 301, № 5895. - P. 89-92.

176. Feinberg A. P. The history of cancer epigenetics / A. P. Feinberg, B. Tycko // Nat. Rev.

177. Cancer. 2004. - V. 4, № 2. - P. 143-153.

178. Felsenfeld G. Controlling the double helix / G. Felsenfeld, M. Groudine // Nature. 2003.-V. 421,№6921-P. 448-453.

179. Fisher A. G. Gene silencing, cell fate and nuclear organization / A. G. Fisher,

180. M. Merkenschlager // Curr. Opin. Genet. Dev. 2002. - V. 12, № 2. - P. 193-197.

181. Frequent epigenetic inactivation of RASSF1A and BLU genes located within the critical3p21.3 region in gliomas / L. Hesson et al.. // Oncogene. 2004. - V. 23, № 13. -P. 2408-2419.

182. Frequent epigenetic inactivation of RASSF1A in human bladder carcinoma / M. G. Lee et al..

183. Cancer Res. 2001. - V. 61, № 18. - P. 6688-6692.

184. Frequent epigenetic inactivation of SFRP genes and constitutive activation of Wntsignaling in gastric cancer / M. Nojima et al.. // Oncogene. 2007. V. 26, № 32. -P. 4699-4713.

185. Frequent epigenetic inactivation of Wnt inhibitory factor-1 in human gastrointestinalcancers / H. Taniguchi et al.. // Oncogene. 2005. V. 24, № 53. P. 7946-7952.

186. Frequent hypermethylation of 5' flanking region of TIMP-2 gene in cervical cancer /

187. T. Ivanova et al.. // Int. J. Cancer. 2004. - V. 108, № 6. - C. 882-886.

188. Frequent hypermethylation of the RASSF1A gene in prostate cancer / L. Liu et al.. //

189. Oncogene. 2002. - V. 21, № 44. - P. 6835-6840.

190. Frequent loss of SFRP1 expression in multiple human solid tumours: association withaberrant promoter methylation in renal cell carcinoma / E. Dahl et al.. // Oncogene. -2007. V. 26, № 38. - P. 5680-5691.

191. Frequent promoter hypermethylation of RASSF1A and CASP8 in neuroblastoma /

192. P. Lazcoz et al.. // BMC Cancer. 2006. - № 6. - P.254.

193. Fukui T. Transcriptional silencing of secreted frizzled related protein 1 (SFRP1) bypromoter hypermethylation in non-small-cell lung cancer / T. Fukui, M. Kondo, G. Ito // Oncogene. 2005. - V. 24, № 41. - P. 6323-6327.

194. Functional variants within the secreted frizzled-related protein 3 gene are associated withhiposteoarthritis in females / J. Loughlin et al.. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V.101, № 26. - P. 9757-9762.

195. Gene expression profiling of B cell chronic lymphocytic leukemia reveals a homogeneousphenotype related to memory B cells / U. Klein et al.. // J. Exp. Med. 2001. -V. 194, № 11.- P. 1625-1638.

196. Gene silencing of the tyrosine phosphatase SHP1 gene by aberrant methylation inleukemias/lymphomas / T. Oka et al.. // Cancer Res. 2002. - V. 62, № 22. -P. 6390-6394.

197. Genetic and epigenetic alterations of the APC gene in malignant melanoma / J. Worm et al..

198. Oncogene. 2004. - V. 23, № 30. - P. 5215-5226.

199. Glantz S. A. Primer of biostatistics / S. A. Glantz. 5th ed. - McGraw-Hill Medical, 2002.- 489 p.

200. Gonzalgo M. L. Quantitative methylation analysis using methylation-sensitive singlenucleotide primer extension (Ms-SNuPE) / M. L. Gonzalgo, P. A. Jones // Methods. -2002.-V. 27, №2.-P. 128-133.

201. Hall T.A. BioEdit: A user-friendly biological sequence alignment editor and analysisprogram for Windows 95/98/NT / T. A. Hall // Nucl. Acids Symp. 1999. - Ser. 41. -P. 95-98.

202. Hanahan D. The hallmarks of cancer / D. Hanahan, R. A. Weinberg // Cell. 2000.1. V. 100, №1,-P. 57-70.

203. HDPR1, a novel inhibitor of the WNT/b-catenin signaling, is frequently downregulated inhepatocellular carcinoma: involvement of methylation mediated gene silencing / T. Yau et al.. // Oncogene. 2005. - V. 24, № 9. - P.1607-1614.

204. Hendrich B. Identification and characterization of a family of mammalian methyl-CpGbinding proteins / B. Hendrich, A. Bird // Mol. Cell. Biol. 1998. - V. 18, № 11. -P. 6538-6547.

205. High bone density due to a mutation in LDL-receptor-related protein 5 / L. M. Boyden et al. //

206. N. Engl. J. Med. 2002. V.346, № 20. - P. 1513-1521.

207. High frequency of promoter hypermethylation of RASSF1A and pl6 and its relationship toaflatoxin Bl-DNA adduct levels in human hepatocellular carcinoma / Y. J. Zhang et al.. // Mol. Carcinog. 2002. - V. 35, № 2. - P. 85-92.

208. High frequency of promoter hypermethylation of RASSF1A in nasopharyngeal carcinoma /

209. K.-W. Lo et al.. // Cancer Res. 2001. - V. 61, № 10. - P. 3877-3881.

210. High frequency of promoter hypermethylation of RASSF1A in tumorous and nontumourous tissue of breast cancer / W. Yeo et al.. // Pathology. 2005. - V. 37, № 2. -P. 125-130.

211. Hillmen P. Chronic lymphocytic leukemia aiming at a moving target! / P. Hillmen //

212. Haematologica/The hematology Journal. 2005. - V. 90, № 11. - P. 1451-1452.

213. Histologically normal human mammary epithelia with silenced pl6(INK4a) overexpress

214. COX-2, promoting a premalignant program / Y. G. Crawford et al.. // Cancer Cell. -2004. V. 5, № 3. - P. 263-273.

215. Hoheisel J. D. Microarray technology: beyond transcript profiling and genotype analysis /

216. J. D, Hoheisel // Nat. Rev. Genet. 2006. - V. 7, № 3. - P. 200-210.

217. Holland-frei cancer medicine / D. W. Kufe et al.. 6nd ed. - Amsterdam: Elsevier, 2003.- 2400 p.

218. Homozygous WNT3 mutation causes tetra-amelia in a large consanguineous family /

219. S. Niemann et al.. // Am. J. Hum. Genet. 2004. - V.74, № 3,- P. 558-563.

220. Hotchkiss R. D. The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paperchromatography / R. D. Hotchkiss//J. Biol. Chem. 1948. - V. 168. - P. 315-332.

221. Hypermethylation associated with inactivation of the SOCS-1 gene, a JAK/STAT inhibitor,in human hepatoblastomas / H. Nagai et al.. // J. Hum. Genet. 2003. V. 48, № 2. -P. 65-69.

222. Hypermethylation of E-cadherin in leukemia / J. R. Melki et al.. // Blood . 2000.1. V. 95, №10.-P. 3208-3213.

223. Hypermethylation of the APC promoter but lack of APC mutations in myxoid/round-cellliposarcoma / S. Sievers et al.. // Int. J. Cancer. 2006. V. 119, № 10. - P. 2347-2352.

224. Hypermethylation of the death-associated protein (DAP) kinase promoter andaggressiveness in stage I non-small-cell lung cancer / X. Tang et al.. // J. Natl. Cancer Inst. 2000. - V. 92, № 18. - P. 1511-1516.

225. Hypermethylation of the suppressor of cytokine signalling-1 (SOCS-1) in myelodysplasticsyndrome / K. Brakensiek et al.. // Br. J. Haematol. 2005. - V. 130, № 2. - P. 209-217.

226. Hypermethylation-associated inactivation of the SOCS-1 gene, a JAK/STAT inhibitor, inhuman pancreatic cancers / T. Komazaki et al.. // Jpn. J. Clin. Oncol. 2004. - V. 34, № 4. - P.191-194.

227. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing / P. M. Warnecke et al.. //

228. Methods. 2002. - V. 27, № 2. - P. 101-107.

229. Identification of pancreatic cancer stem cells / C. Li et al.. // Cancer Res. 2007. - V. 67,3. P.1030-1037.

230. Inactivation of the DNA-repair gene MGMT and the clinical response of gliomas toalkylating agents / M. Esteller et al.. // N. Engl. J. Med. 2000. - V. 343, № 23. -P. 1350-1354.

231. Inactivation of Wnt inhibitory factor-1 (WIF1) expression by epigenetic silencing is acommon event in breast cancer / L. Ai et al.. // Carcinogenesis. 2006. - V.27, № 7. -P. 1341-1348.

232. Increased DNA methyltransferase expression in leukemia / J. R. Melki et al.. // Leukemia.- 1998. V. 12, №3.-P. 311-316.

233. Initial sequencing and analysis of the human genome / E. S. Lander et al.. // Nature.2001. V. 409, № 6822. - P. 860-921.

234. Issa J.-P. Decitabine in chronic leukemias / J. P. Issa, J. C. Byrd // Semin. Hematol. 2005.- V. 42, № 3 Suppl. 2. P. S43-49.

235. Issa J.-P. CpG island methylator phenotype in cancer / J.-P. Issa // Nat. Rev. Cancer.2004.-V. 4, № 12. -P. 988-993.

236. Issa J.-P. Decitabine / J.-P. Issa // Curr. Opin. Oncol. 2003. - V. 15, № 6. - P. 446-451.

237. Katzenellenbogen R. A. Hypermethylation of the DAP-kinase CpG island is a commonalteration in B-cell malignancies / R. A. Katzenellenbogen, S. B. Baylin, J. G. Herman // Blood. 1999. - V. 93, № 12. - 4347-4353.

238. Jenuwein T. Translating the histone code / T. Jenuwein, C. D. Allis // Science. 2001.

239. V. 293, № 5532. P. 1074-1080.

240. Jones P. A. The epigenomics of cancer / P. A. Jones, S. B. Baylin // Cell. 2007. - V. 128,4, 683-692.

241. Khan N. I. Role of WNT signaling in normal and malignant hematopoiesis / N. I. Khan,

242. J. Bendall // Histol. Histopathol. 2006. - V.21, № 7. - 761-774.

243. Knudson A. G. Two genetic hits (more or less) to cancer / A. G. Knudson // Nat. Rev.

244. Cancer. 2001. - V. 1, № 2. - P. 157-162.

245. Kouzarides T. Chromatin modifications and their function / T. Kouzarides // Cell. -2007.1. V. 128,№4.-P. 693-705.

246. Kriaucionis S. DNA methylation and Rett syndrome / S. Kriaucionis, A. Bird // Hum. Mol.

247. Genet. 2003. - V. 12, Spec. № 2. - P. R221-R227.

248. Laird P. W. Early detection: the power and the promise of DNA methylation markers /

249. P. W. Laird // Nat. Rev. Cancer. 2003. - V. 3, № 4. p. 253-266.

250. LDL receptor-related protein 5 (LRP5) affects bone accrual and eye development /

251. Y. Gong et al.. II Cell. 2001. V.107, № 4. P. 513-523.

252. Li L. C. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs / L. C. Li., R. Dahiya //

253. Bioinformatics. 2002. - V. 18, № 11. - P. 1427-1431.

254. Liu S. Mammary stem cells, self-renewal pathways, and carcinogenesis / S. Liu, G. Dontu,

255. M. S. Wicha // Breast Cancer Res. 2005. - V. 7, № 3. - P. 86-95.

256. Lu H. Inflammation, a key event in cancer development / H. Lu, W. Ouyang, C. Huang //

257. Mol. Cancer Res. 2006. - V.4, № 4. - P.221-233.

258. Luo L. Leukemia Stem Cells / L. Luo, Zh. Ch. Han // Int. J. Hematol. 2006. V. 84, №2.1. P.123-127.

259. Lustig B. The Wnt signaling pathway and its role in tumor development / B. Lustig,

260. J. Behrens // J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 2003. - V. 129, № 4. - P. 199-221.

261. MBD2 is a transcriptional repressor belonging to the MeCPl histone deacetylase complex /

262. H. H. Ng et al.. // Nat. Genet. 1999. - V. 23, № 1. - P. 58-61.

263. Methylated DNA and MeCP2 recruit histone deacetylase to repress transcription /

264. P. L. Jones et al.. // Nat Genet. 1998. - V. 19, № 2. - P. 187-191.

265. Methylation and silencing of the retinoic acid receptor-beta 2 gene in cervical cancer /

266. T. Ivanova et al.. // BMC Cancer. 2002. - №. 2. - P. 4.

267. Methylation of apoptosis related genes in the pathogenesis and prognosis of prostate cancer

268. M. Suzuki et al.. // Cancer Lett. 2006. - V. 242, № 2. - P. 222-230.

269. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins / M. Lachner et al..

270. Nature. 2001. - V. 410, № 6824. - P. 116-120.

271. Methylation of pl6(INK4a) promoters occurs in vivo in histologically normal humanmammary epithelia / C. R. Hoist et al.. // Cancer Res. 2003. - V. 63, № 7. - P. 1596-1601.

272. Methylation of RAS association domain family protein 1A as a biomarker of lung cancer /

273. H. J. Grote et al.. // Cancer. 2006. - V. 108, № 2. - P. 129-134.

274. Methylation of Socs-3 and Socs-1 in the carcinogenesis of Barrett's adenocarcinoma /

275. Tischoff et al.. // Gut. 2007. - V. 56, № 8. - P. 1047-1053.

276. Methylation silencing of SOCS-3 promotes cell growth and migration by enhancing

277. JAK/STAT and FAK signalings in human hepatocellular carcinoma / Y. Niwa et al.. // Oncogene. 2005. - V. 24, № 42. - P. 6406-6417.

278. Methylation status of suppressor of cytokine signaling-1 gene in hepatocellular carcinoma /

279. H. Miyoshi et al.. //J. Gastroenterol. 2004. - V. 39, № 6. - P. 563-569.

280. Methylation status of the SOCS3 gene in human malignant melanomas / T. Tokita et al..

281. Int. J. Oncol. 2007. - V. 30, № 3. - P. 689-694.

282. Methylation-associated silencing of the Wnt antagonist SFRP1 gene in human ovariancancers / T. Takada et al.. // Cancer Sci. 2004. - V. 95, № 9. - P. 741-744.

283. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands /

284. J. G. Herman et al.. // Proc. Nad. Acad. Sci. USA. 1996. - V. 93, № 18. - P. 9821-9826.

285. Multiple distinct sets of stereotyped antigen receptors indicate a key role for antigen inpromoting chronic lymphocytic leukemia / B. T. Messmer et al.. // J. Exp. Med. -2004.-V. 200, №4.-P.519-525.

286. Norel inhibits tumor cell growth independent of Ras or the MST1/2 kinases / Y. Aoyamaet al.. // Oncogene. 2004. - V.23, № 19. - P. 3426-3433.

287. NORE1A, a homologue of RASSF1A tumour suppressor gene is inactivated in humancancers / L. Hesson et al.. // Oncogene. 2003. - V. 22, № 6. - P. 947-954.

288. Novel method for high throughput DNA methylation marker evaluation using PNA-probelibrary hybridization and MALDI-TOF detection / P. Schatz et al.. // Nucleic Acids Res. 2006. - V. 34, № 8. - P. 59.

289. Ohm J. E. Stem cell chromatin patterns: an instructive mechanism for DNAhypermethylation? / J. E. Ohm, S. B. Baylin // Cell Cycle. 2007. - V. 6, № :9. -P. 1040-1043.

290. Oligonucleotide-based microarray for DNA methylation analysis: principles andapplications / H. Shi et al.. // J. Cell. Biochem. 2003. - V. 88, № 1. - P. 138-143.

291. On mammary stem cells / W. A. Woodward et al.. //J. Cell Sci. 2005. - V. 118, Pt. 16.- P. 3585-3594.

292. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53and pl6INK4a / M. Serrano et al.. // Cell. 1997. - V. 88, № 5. - P. 593-602.

293. Oncogenic Ras-mediated cell growth arrest and apoptosis are associated with increasedubiquitin-dependent cyclin D1 degradation / J. Shao et al.. // J. Biol. Chem. 2000. -V. 275, № 30. - P. 22916-22924.

294. Parallel genotyping of over 10,000 SNPs using a one-primer assay on a high-densityoligonucleotide array / H. Matsuzaki et al.. // Genome Res. 2004. - V. 14, №3. -P. 414-425.

295. Perantoni A. O. Renal development: perspectives on a Wnt-dependent process /

296. A. O. Perantoni // Semin. Cell Dev. Biol. 2003. - V. 14, № 4. - P. 201208.

297. Perwez H. S. Inflammation and cancer: an ancient link with novel potentials /

298. H. S. Perwez, C. C. Harris // Int. J. Cancer. 2007. - V. 121, № 11. - P. 2373-2380.

299. Phases of biomarker development for early detection of cancer / M. S. Pepe et al.. //

300. J. Natl. Cancer Inst. 2001. - V. 93, № 14. - P. 1054-1061.

301. Polycomb-mediated methylation on Lys27 of histone H3 pre-marks genes for de novomethylation in cancer / Y. Schlesinger et al.. // Nat. Genet. 2007. - V. 39, № 2. -P. 232-236.

302. Preferential methylation of Wnt inhibitory factor-1 in acute promyelocytic leukemia: anindependent poor prognostic factor / C. S. Chim et al.. // Leukemia. 2006. - V. 20, №5. -P. 907-909.

303. Promoter CpG methylation of tumor suppressor genes in colorectal cancer and itsrelationship to clinical features / S.-Y. Lin et al.. // Oncol.Rep. 2004. - V. 11, № 2. -P. 341-348.

304. Promoter hypermethylation profile of ovarian epithelial neoplasms / P. B. Makarla et al..

305. Clin. Cancer Res. 2005. - V. 11, № 15. - P. 5365-5369.

306. Promoter methylation inhibits APC gene expression by causing changes in chromatinconformation and interfering with the binding of transcription factor CCAAT-binding factor / G. Deng et al.. // Cancer Res. 2004. - V. 64, № 8. - P. 2692-2698.

307. Promoter methylation of RASSF1A, RARbeta and DAPK predict poor prognosis ofpatients with malignant mesothelioma / J. R. Fischer et al.. // Lung Cancer. 2006. -V. 54, №1.-P. 109-116.

308. Promoter methylation of the secreted frizzled-related protein 1 gene SFRP1 is frequent inhepatocellular carcinoma / Y. L. Shih et al.. // Cancer. 2006. - V.107, № 3. -P. 579-590.

309. Purification and molecular cloning of a secreted, frizzled-related antagonist of Wnt action / P.

310. W. Finch et al.. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1997. V. 94, № 13. - P. 6770-6775.

311. Quantitative analysis of DNA methylation in chronic lymphocytic leukemia patients /

312. F. Lyko et al.. // Electrophoresis. 2004. - V. 25, № 10-11. - P. 1530-1535.

313. Rare bases in animal DNA / B. F. Vanyushin et al.. // Nature. 1970. - V. 225, № 5236.- P. 948-949.

314. RASSF2, a potential tumour suppressor, is silenced by CpG island hypermethylation in gastriccancer / M. Endoh et al.. // Br. J. Cancer. 2005. - V. 93, № 12. - P. 1395-1399.

315. RASSF3 and NORE1: identification and cloning of two human homologues of the putativetumor suppressor gene RASSF1 / S. Tommasi et al.. // Oncogene. 2002. - V. 21, № 17.-P. 2713-2720.

316. Reciprocal regulation of SOCS 1 and SOCS3 enhances resistance to ionizing radiation inglioblastoma multiforme / H. Zhou et al.. // Clin. Cancer Res. 2007. - V. 13, № 8. -P. 2344-2353.

317. Reconstitution of Syk function by the ZAP-70 protein tyrosine kinase / G. H. Kong et al..

318. Immunity. 1995. - V. 2, № 5. - P. 485-492.

319. Relation of gene expression phenotype to immunoglobulin mutation genotype in B cellchronic lymphocytic leukemia / A. Rosenwald et al.. // J. Exp. Med. 2001. - V. 194, № 11. -P.1639-1647.

320. Relationship of the aberrant DNA hypermethylation of cancer-related genes withcarcinogenesis of endometrial cancer / K. Banno et al.. // Oncol. Rep. 2006. V. 16, №6.-P. 1189-1196.

321. Remarkably similar antigen receptors among a subset of patients with chronic lymphocyticleukemia / F. Ghiotto et al.. // J. Clin. Invest. 2004. - V. 113, № 7. - P. 1008-1016.

322. Ringrose L. Epigenetic regulation of cellular memory by the Polycomb and Trithorax groupproteins / L. Ringrose, R. Paro // Annu. Rev. Genet. 2004. - № 38. - P. 413-443.

323. Ronaghi M. A sequencing method based on real-time pyrophosphate / M. Ronaghi,

324. M. Uhlen, P. Nyren // Science. 1998. - V. 281, № 5375. - P. 363-365.

325. Russo V. E. A. Epigenetic mechanisms of gene regulation / V. E. A. Russo,

326. R. A. Martienssen, A. D. Riggs. New York: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1996. - 692 p.

327. Sanger F. DNA-sequencing with chain-terminator inhibitors / F. Sanger, S. Nicklein,

328. A. R. Coulson // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - V. 74, № 12. - P. 5463-5467.

329. Santoro R. Many players, one goal: how chromatin states are inherited during cell division

330. R. Santoro, F. De Lucia // Biochem. Cell Biol. 2005. - V. 83, №3. - P. 332-343.

331. Schumacher A. Microarray-based DNA methylation profiling: technology and applications

332. A. Schumacher, P. Kapranov, Z. Kaminsky. Nucleic Acids Res. - 2006. - V. 34, № 2. - P. 528-542.

333. Secreted frizzled-related protein 4 is silenced by hypermethylation and induces apoptosis inbeta-catenin-deflcient human mesothelioma cells / B. He et al.. // Cancer Res. 2005. -V. 65, №3.-P. 743-748.

334. Selker K. Histone acetylation and transcriptional regulatory mechanisms / K. Struhl //

335. Genes Dev. 1998. - V. 12, № 5. - P. 599-606.

336. SFRP1 suppressed hepatoma cells growth through Wnt canonical signaling pathway /

337. Y. L. Shih et al.. // Int. J. Cancer. 2007. V. 121, № 5. - P. 1028-1035.

338. Signalling through the JAK/STAT pathway, recent advances and future challenges /

339. T. Kisseleva et al.. // Gene. 2002. - V. 285, № 1-2. - 1-24.

340. SOCS1 and SHP1 hypermethylation in mantle cell lymphoma and follicular lymphoma:implications for epigenetic activation of the Jak/STAT pathway / C. S. Chim et al.. // Leukemia. 2004. - V. 18, № 2. - P. 356-358.

341. SOCS1 and SHP1 hypermethylation in multiple myeloma: implications for epigeneticactivation of the Jak/STAT pathway / C. S. Chim et al.. // Blood. 2004. - V. 103, №12.-P. 4630-4635

342. SOCS-1, a negative regulator of cytokine signaling, is frequently silenced by methylation inmultiple myeloma / O. Galm et al.. // Blood. 2003. - V. 101, № 7. - P. 2784-2788.

343. SOCS-3 is frequently methylated in head and neck squamous cell carcinoma and itsprecursor lesions and causes growth inhibition / A. Weber et al.. // Oncogene. 2005. - V. 24, № 44. - P. 6699-6708.

344. SOCS-3 is frequently silenced by hypermethylation and suppresses cell growth in humanlung cancer / B. He et al.. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - V. 100, № 24. -P. 14133-14138.

345. Sokol S. Y. Wnt signaling and dorso-ventral axis specification in vertebrates / S. Y. Sokol

346. Curr. Opin. Genet. Dev. 1999. - V. 9, № 4. - P. 405-410.

347. STAT3- and DNA methyltransferase 1-mediated epigenetic silencing of SHP-1 tyrosinephosphatase tumor suppressor gene in malignant T lymphocytes / Q. Zhang et al.. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - V. 102, № 19. - P. 6948-6953.

348. Strathdee G. Aberrant DNA methylation in cancer: potential clinical interventions /

349. G. Strathdee, R. Brown // Exp. Rev. Mol. Med. 2002. - V. 4, № 4. - P. 1-17.

350. Suppressor of cytokine signalling-1 gene silencing in acute myeloid leukaemia and humanhaematopoietic cell lines / D. Watanabe et al.. // Br. J. Haematol. 2004. - V. 126, № 5. - P. 726-735.

351. Sustained IL-6/STAT-3 signaling in cholangiocarcinoma cells due to SOCS-3 epigeneticsilencing / H. Isomoto et al.. // Gastroenterology. 2007. - V. 132, № 1. - P. 384-396.

352. Suv39h-mediated histone H3 lysine 9methylation directs DNA methylation to majorsatellite repeats at pericentric heterochromatin / B. Lehnertz et al.. // Curr. Biol. -2003.-V. 13,№14. -P. 1192-1200.

353. The content of 5-methylcytosine in animal DNA: the species and tissue specificity /

354. B. F. Vanyushin et al.. // Biochim. Biophys. Acta. 1973. - V. 299, № 3. - P. 397-403.

355. The DNA (cytosine-5) methyltransferases / S. Kumar et al.. // Nucleic Acids Res. 1994.1. V. 22, №1,- P. 1-10.

356. The human frizzled-3 (FZD3) gene on chromosome 8p21, a receptor gene for Wntligands.is associated with the susceptibility to schizophrenia / T. Katsu et al.. // Neurosci. Lett. 2003. V.353, № 1. - P. 53-56.

357. The Polycomb group protein EZH2 directly controls DNA methylation / E. Vire et al.. //

358. Nature. 2006. - V. 439, № 7078. - P. 871-874.

359. The putative tumor suppressor RASSF1A homodimerizes and heterodimerizes with the

360. Ras-GTP binding protein Norel / S. Ortiz-Vega et al.. // Oncogene. 2002. - V. 21, №9.-P. 1381-1390.

361. The Wnt antagonist sFRPl in colorectal tumorigenesis / G. M. Caldwell et al.. // Cancer

362. Res. 2004. - V. 64, № 3. - P. 883-888.

363. The Wnt antagonist sFRPl is downregulated in premalignant large bowel adenomas /

364. G. M. Caldwell et al.. // Br. J. Cancer. 2006. - V. 94, № 6. - P. 922-927.

365. Tônisson N. Mutation detection by primer extension on oligonucleotide microarray

366. Dissertation for commencement of the degree of Doctor of Philosophy in Molecular Diagnostics) / N. Tônisson. Tartu: Tartu University Press, 2002. - 124 p.

367. Tost J. Analysis and quantification of multiple methylation variable positions in CpGislands by Pyrosequencing / J. Tost, J. Dunker, I. G. Gut // BioTechniques. 2003. -V. 35, №1.-P. 152-156.

368. Transcriptional repression by the methyl-CpG-binding protein MeCP2 involves a histonedeacetylase complex / X. Nan et al.. // Nature. 1998. - V. 393, № 6683. - P. 386-389.

369. Transcriptional silencing of the Dickkopfs-3 (Dkk-3) gene by CpG hypermethylation inacute lymphoblastic leukaemia / J. Roman-Gomez et al.. // Br. J. Cancer. 2004. -V. 91, №4. - P. 707-713.

370. Trinh B. N. DNA methylation analysis by Methylight technology / B. N. Trinh, T. I. Long,

371. P. W. Laird / Methods. 2001. - V. 25, № 4. - P. 456-462.

372. Tumor-specific methylation in saliva: a promising biomarker for early detection of headand neck cancer recurrence / C. A. Righini et al.. // Clin. Cancer Res. 2007. - V. 13, №4.-P. 1179-1185.

373. Tumour class prediction and discovery by microarray-based DNA methylation analysis /

374. P. Adorjan et al.. // Nucleic Acids Res. 2002. - V. 30, № 5. - P. e21.

375. TWIST2 demonstrates differential methylation in immunoglobulin variable heavy chainmutated and unmutated chronic lymphocytic leukemia / A. Raval et al.. // J. Clin. Oncol. 2005. - V. 23, № 17. - P. 3877-3885.

376. Ubiquitous activation of Ras and Jak/Stat pathways in human HCC / D. F. Calvisi et al.. //

377. Gastroenterology. 2006. - V. 130, № 4. - P. 1117-1128.

378. Unmutated Ig V(H) genes are associated with a more aggressive form of chroniclymphocytic leukemia / T. J. Hamblin et al.. // Blood. 1999. - V. 94, № 6. -P. 1848-1854.

379. Vairapandi M. Characterization of DNA demethylation in normal and cancerous cell linesand the regulatory role of cell cycle proteins in human DNA demethylase activity / M. Vairapandi //J. Cell. Biochem. 2004. - V. 91, № 3. - P. 572-583.

380. Valentino L. JAK/STAT signal transduction: regulators and implication in hematologicalmalignancies / L. Valentino, J. Pierre // Biochem. Pharmacol. 2006. - V.71, № 6. -P. 713-721.

381. Validation of a novel, fully integrated and fexible microarray benchtop facility for geneexpression profiling / M. Baum et al.. // Nucleic Acids Res. 2003. - V. 31, № 23. -P. el51.

382. Waalwijk C. DNA methylation at a CCGG sequence in the large intron of the rabbit betaglobin gene: tissue-specific variations / C. Waalwijk, R. A. Flavell // Nucleic Acids Res. 1978. - V. 5, № 12. - P. 4631-4634.

383. Walsh C. P. Transcription of IAP endogenous retroviruses is constrained by cytosinemethylation / C. P. Walsh, J. R. Chaillet, T. H. Bestor // Nat. Genet. 1998. - V. 20, №2.-P. 116-117.

384. Watson J. D. / Molecular structure of nucleic acids; a structure for deoxyribose nucleic acid

385. J. D. Watson, F. H. Crick // Nature. 1953. - V. 171, № 4356. - P. 737-738.

386. Weinberg R. A. The biology of cancer / R. A. Weinberg. New York: Garland Science,2007. 850 p.

387. Wigler M. The somatic replication of DNA methylation / M. Wigler, D. Levy, M. Perucho

388. Cell. 1981. - V. 24, № 1. V. 33-40.

389. Wnt and P-catenin signalling: diseases and therapies / R. T. Moon et al.. // Nat. Rev.

390. Genet. 2004. - V. 5, № 9. - P. 689-699.

391. Wnt inhibitory factor-1 is silenced by promoter hypermethylation in human lung cancer /

392. J. Mazieres et al.. // Cancer Res. 2004. - V. 64, № 14. - P. 4717-4720.

393. Wnt inhibitory factor-1 is silenced by promoter hypermethylation in human lung cancer /

394. J. Mazieres et alj. // Cancer Res. 2004. - V. 64, № 14. - P. 4717-4720.

395. Wnt inhibitory factor-1, a Wnt antagonist, is silenced by promoter hypermethylation inmalignant pleural mesothelioma / S. Batra et al.. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. - V. 342, № 4. - P. 1228-1232.

396. Wnt4 overexpression disrupts normal testicular vasculature and inhibits testosteronesynthesis by repressing steroidogenic factor 1/p-catenin synergy / B. K. Jordan et al.. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - V.100, № 19. - P.10866-10871.

397. Wyatt G. R. Recognition and estimation of 5-methylcytosine in nucleic acids / G. R. Wyatt

398. J. Biochem. (Tokyo). 1951. - V. 48, № 5. - P. 581-584.

399. Xiong Zh. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay / Zh. Xiong,

400. P. W. Laird // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25, № 12. - P. 2532-2534.

401. Yoder J. A. Cytosine methylation and the ecology of intragenomic parasites / J. A. Yoder,

402. T. H. Bestor // Trends Genet. 1997. - V. 13, № 8. - P. 335-340.

403. Yoo C. Epigenetic therapy of cancer: past, present and future / C. Yoo, P. A. Jones // Nat.

404. Rev. Drug Discov. 2006. - V. 5, № 1, 37-50.

405. ZAP-70 expression as a surrogate for immunoglobulin-variable-region mutations inchronic lymphocytic leukemia / M. Crespo et al.. // N. Engl. J. Med. 2003. - P. 348, № 18.-P. 1764-1775.

406. ZAP-70 methylation status is associated with ZAP-70 expression status in chroniclymphocytic leukemia / M. Corcoran et al.. // Haematologica. 2005. - V. 90, № 8. -P. 1078-1088.

407. ZAP-70: a 70 kd protein-tyrosine kinase that associates with the TCR zeta chain /

408. A. C. Chan et al.. // Cell. 1992. - V. 71, № 4. - P. 649-662.

409. Zent C. S. Advances in the understanding of biology and prognosis in chronic lymphocyticleukemia / C. S. Zent, N. E. Kay // Curr. Oncol. Rep. 2004. - V.6, № 5. - P. 348-354.

410. Zhao C.H. Hypermethylation and aberrant expression of Wnt antagonist secreted frizzledrelated protein 1 in gastric cancer / C. H. Zhao, X. M. Bu, N. Zhang // World J. Gastroenterol. 2007. - V. 13, № 15. - P. 2214-2217.

411. Настоящая работа стала возможной благодаря поддержке окружавших меня людей, которые способствовали развитию моих научных интересов и которым я обязан за всё, чему научился до сих пор.

412. Огромное спасибо Станиславе Владимировне Золотарёвой, Татьяне Ивановне Дедовой и Лидии Константиновне Воиновой за развитие моего интереса к биологии и химии в школе, высочайший профессионализм и педагогический талант.

413. Бесконечно благодарю мою семью и особенно маму за безоговорочную поддержку, терпение и искреннее желание успеха на пути научных исследований.