Действие синтетических ауксинов на рост, цитоморфологию и синтез гинзенозидов в суспензионных культурах клеток двух видов рода Panax тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.12, кандидат биологических наук Смирнова, Юлия Николаевна

• Смирнова, Юлия Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Смирнова, Юлия Николаевна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Ареал распространения рода Panax, биология видов P. japonicus и

P. ginseng.

1.2 Ценность растений рода Panax для медицины.

1.3 Гинзенозиды: химическая принадлежность, структурные формулы.

1.4 Биологическая активность индивидуальных гинзенозидов.

1.5 Биосинтез гинзенозидов: ключевые ферменты, предшественники.

1.6 Накопление гинзенозидов в растениях видов P. japonicus и P. ginseng.

1.7 Накопление гинзенозидов в культуре клеток растений рода Panax.

1.8 Влияние условий культивирования на рост биомассы и синтез гинзенозидов в культурах клеток растений рода Panax.

1.9 Связь роста, дифференцировки и биосинтеза гинзенозидов в культурах клеток растений рода Panax.

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1 Объекты исследования.

2.2 Условия культивирования.

2.3 Определение ростовых и цитофизиологических параметров суспензионных культур клеток женьшеня.

2.4 Измерение количества ДНК.

2.5 Анализ количества и состава гинзенозидов методом ВЭЖХ.

2.6 Статистическая обработка материала.

Результаты исследований

Глава 3. Характеристика роста и биосинтеза гинзенозидов суспензионных культур клеток P. japonicus var. repens и P. ginseng, культивируемых на стандартных питательных средах

3.1 Ростовые и цитофизиологические параметры суспензионной культуры клеток P. japonicus var. repens.

3.2 Биосинтез гинзенозидов в суспензионной культуре клеток P. japonicus var. repens.

3.3 Ростовые и цитофизиологические параметры суспензионной культуры клеток P. ginseng.

3.4 Биосинтез гинзенозидов в суспензионной культуре клеток P. ginseng.

Глава 4. Цитофизиологические параметры и биосинтез гинзенозидов при длительном выращивании суспензионных культур клеток P. japonicus var. repens и P. ginseng на средах с различными сочетаниями регуляторов роста

4.1. Влияние сочетаний синтетических ауксинов и цитокининов на рост и цитофизиологические характеристики суспензионной культуры

P. japonicus var. repens.".

4.2. Влияние сочетаний ауксинов и цитокининов на биосинтез гинзенозидов в суспензионной культуре P. japonicus var. repens.

4.3. Влияние сочетаний синтетических ауксинов и цитокининов на рост и цитофизиологические характеристики суспензионной культуры

P. ginseng.

4.4. Влияние сочетаний ауксинов и цитокининов на биосинтез гинзенозидов в суспензионной культуре P. ginseng.

Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Действие синтетических ауксинов на рост, цитоморфологию и синтез гинзенозидов в суспензионных культурах клеток двух видов рода Panax»

Целебные свойства растений рода Panax известны около 6000 лет и обусловлены уникальной композицией биологически активных веществ, центральное место среди которых принадлежит тритерпеновым гликозидам даммаранового ряда - гинзенозидам. Гинзенозиды обладают иммуностимулирующей и антиоксидантной активностями, нормализуют кровяное давление, стимулируют синтез РНК и ДНК, обладают противодиабетическим действием. По структуре агликона тритерпеновые гликозиды даммаранового ряда делят на две группы: 20(8)-протопанаксадиол (Rb-группа - Rbi, Rb2, Rc, Rd гинзенозиды) и 20(8)-протопанаксатриол (Rg-группа - Rf, Rgb Re гинзенозиды). Биологическое действие соединений обеих групп различно, в частности, гликозиды Rb-группы подавляют активность ЦНС, понижают артериальное давление, а гликозиды Rg-группы увеличивают активность ЦНС и повышают артериальное давление. Поэтому, эффективность применения в лечебных целях препаратов женьшеня, в большей степени, зависит от композиции гинзенозидов, что подтверждается обоснованностью дифференцированного применения отдельных частей корня P. ginseng С.А. Meyer в традиционной китайской медицине.

В связи с тем, что количество растений рода Panax в природе крайне ограничено, широко исследуется возможность получения гинзенозидов биотехнологическим путем, используя культуру in vitro. Большинство из полученных линий клеток женьшеня отличаются от натуральных корней меньшим количеством и ограниченным составом гинзенозидов (Ходаковская и др., 1995; Langhansova et al., 2005). В настоящее время активно проводятся работы по получению высокопродуктивных штаммов представителей рода Panax, а таюке по исследованию их роста и биосинтеза гинзенозидов. При этом большое внимание уделяется оптимизации условий выращивания клеток, прежде всего составу питательных сред (Wu, Zhong, 1999). Хорошо известно, что регуляторы роста и их соотношение — важнейшие факторы, определяющие возможность существования популяций изолированных клеток. Они оказывают влияние, как на рост и дифференцировку клеток, так и на их метаболизм. Эффект определяется не только спецификой самого фитогормона, но также зависит от природы вторичных соединений, а подчас от вида растения и даже от штамма культивируемых клеток.

Изучение в сравнительном аспекте цитофизиологических характеристик суспензионных культур клеток P. japonicus var. repens С.А. Meyer и P. ginseng С.A. Meyer, а также их способности к синтезу вторичных метаболитов, дает возможность установить особенности их существования, как самостоятельных биологических систем. Кроме того, влияние регуляторов роста на биосинтез гинзенозидов у разных видов женьшеня в условиях in vitro до сих пор окончательно не выяснено.

Цель работы состояла в изучении влияния типа синтетического ауксина на процессы роста, цитофизиологические и цитогенетические характеристики, биосинтез гинзенозидов в культуре клеток растений двух видов рода Panax: P. japonicus var. repens С.А. Meyer и P. ginseng С.А. Meyer.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить ростовые, цитофизиологические и цитогенетические характеристики суспензионных культур клеток двух видов женьшеней. ;;

2. Определить накопление гинзенозидов в отдельных циклах субкультивирования суспензионных культур клеток P. japonicus var. repens и P. ginseng.

3. Изучить влияние типа синтетического ауксина на ростовые и цитофизиологические характеристики суспензионных культур клеток женьшеней.

4. Изучить влияние типа синтетического ауксина на накопление гинзенозидов в суспензионных культурах P. japonicus var. repens и P. ginseng.

5. Рассмотреть возможную связь между ростовыми, цитофизиологическими характеристиками и синтезом тритерпеновых гликозидов в суспензионных культурах клеток P. japonicus var. repens и P. ginseng.

Научная новизна работы. Проведено сравнительное изучение длительно культивируемых суспензионных культур клеток двух видов женьшеня.

Установлены различия ростовых, цитофизиологических и биосинтетических показателей суспензионных культур P. japonicus var. repens и P. ginseng.

Показано, что основное влияние на накопление биомассы, агрегированность, эндоредупликацию ядерной ДНК, содержание и качественный состав гинзенозидов исследуемых культур оказывает химическая природа синтетического ауксина. У обеих суспензионных культур женьшеня НУК вызывает цитодифференцировку, проявляющуюся в увеличении доли крупных многоклеточных агрегатов, увеличении объёма клеток, возрастании числа клеток с удвоенным количеством ядерной ДНК, а также приводит к повышению синтеза гинзенозидов.

Установлено, что между уровнем синтеза гинзенозидов и цитофизиологическими характеристиками суспензий клеток существует зависимость - повышение синтеза гинзенозидов связано с процессами цитодифференцировки.

Впервые экспериментально показано, что в случае активного биосинтеза соотношение индивидуальных гинзенозидов, - следовательно, и соотношение содержания гинзенозидов Rg и Rb групп - достаточно стабильно.

Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований, получены данные по гормональной регуляции роста и накопления тритерпеновых гликозидов даммаранового ряда в суспензиях клеток двух видов Panax. Охарактеризованы высокопродуктивные штаммы суспензионных культур P. japonicus var. repens и P. ginseng, которые могут быть рекомендованы для биотехнологического производства гинзенозидов. Результаты исследований дополняют данные о взаимосвязи цитодифференцировки клеток и уровня синтеза гинзенозидов в условиях in vitro.

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Смирнова, Юлия Николаевна

выводы

1. Установлены различия в росте и составе клеточной популяции суспензионных культур клеток P. japonicus var. repens и P. ginseng.

2. Показано, что обе суспензии отличаются по способности к синтезу гинзенозидов. В суспензии клеток P. japonicus var. repens высокий уровень синтеза всех семи гинзенозидов. В суспензии клеток P. ginseng синтез гинзенозидов не стабилен - определяются только следовые количества, а их состав представлен не полностью. У обеих культур доминируют соединения Rg-группы с преобладанием Яе-гинзенозида.

3. Установлено, что замена ауксина в среде культивирования уменьшает прирост биомассы обеих суспензий. Наибольшая интенсивность роста отмечается в вариантах, где химическая природа ауксина соответствует стандартной среде каждой культуры. Показано, что НУК вызывает укрупнение агрегатов в суспензиях P. japonicus var. repens и P. ginseng.

4. Показано, что вид ауксина не оказывает существенного влияния на изменение жизнеспособности суспензионных культур клеток P. japonicus var. repens и P. ginseng.

5. Установлено, что в суспензии клеток P. japonicus var. repens накопление гинзенозидов на всех сочетаниях фитогормонов сохраняет высокий уровень.

6. Показано, что в суспензионной культуре клеток P. ginseng НУК вызывает значительное увеличение синтеза гинзенозидов всех групп, в результате состав гинзенозидов представлен полностью.

7. Установлено, что при активном биосинтезе суспензионных культур клеток P. japonicus var. repens и P. ginseng состав гинзенозидов и отношение соединений Rg/Rb групп - одинаковы.

8. Показано, что повышение синтеза гинзенозидов в обеих культурах связано с процессами цитодифференцировки, вызванными НУК: увеличение доли крупных многоклеточных агрегатов, объёма клеток и возрастание числа клеток с удвоенным количеством ядерной ДНК.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Смирнова, Юлия Николаевна, 2008 год

1. Александрова И.В., Данилина А.Н., Груздев Л.Г., Стрелец Н.И., Пастушенко Т.М. (1979) Культура ткани женьшеня перспективное растительное сырье. Растительные ресурсы, 15(3), 361-367.

2. Белая Г.А. (1994) Флора сосудистых растений Еврейской автономной области. Аннотированный список. Владивосток: Дальнаука, 108 с.

3. Брехман И.И. (1957) Женьшень. JL: Медгиз, 181с.

4. Брехман И.И., Гриневич М.А. (1959) Метод биологической стандартизации препаратов корня женьшеня. Аптечное дело, 8(6), 34-40.

5. Брехман И.И., Дардымов И.В., Добряков Ю.И. (1966) К фармакологии индивидуальных гликозидов из корней женьшеня (Panax ginseng). Фармакология и токсикология, 2, 167-170.

6. Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н., Козыренко М.М., Бабкина Э. Н.,'г Уварова Н.И., Маханьков В.В. (1991) Содержание даммарановых гликозидов в различных каллусных линиях Panax ginseng С.А. Меу.,- ., Растительные ресурсы, 27(3), 94-100.

7. Булгаков В.П., Лауве Л.С., Чернодед Г.К., Ходаковская М.В., Журавлев,. Ю.Н. (2000) Хромосомная вариабельность клеток женьшеня, трансформированного растительным онкогеном rolC. Генетика, 36, 209-216.

8. Бутенко Р.Г. (1964) Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 162 с.

9. Бутенко Р.Г., Грушвицкий И.В., Слепян Л.И. (1968) Органогенез и соматический эмбриогенез в культуре ткани женьшеня и других представителей рода Панакс. Ботанический журнал, 53(7), 906-912.

10. Бутенко Р.Г. (1975) Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений. М.:Наука, 51с.

11. Бутенко Р.Г., Слепян Л.И., Хретонова Т.И., Михайлова Н.В., Высоцкая Р.И. (1979) Изучение некоторых штаммов культур тканей трех видов

12. Panax L. как возможных источников стимулирующих препаратов. Растительные ресурсы, 15(2), 265-270.

13. Государственная Фармакопея СССР (1987) 11-е изд., М.: Медицина, 400 с.

14. Грушвицкий И.В. (1961) Женьшень. Вопросы биологии. JL: Наука, 344 с.

15. Губарь С.И., Гулько Т.П., Кунах В.А. (1997) Рост и накопление гликозидов в каллусной культуре тканей женьшеня при длительном воздействии экзогенных фитогормонов. Физиология растений, 44(1), 97-103.

16. Долгих Ю.И. (1986) Генетическая изменчивость по признаку температурочувствительности в культуре клеток женьшеня: Автореф. канд.биол. наук, Москва, 42 с.

17. Журавлев Ю.Н., Коляда А.С. (1996) Araliaceae: женьшень и другие Владивосток: Дальнаука, 280 с.

18. Запрометов М.Н., Загоскина Н.В., Стрекова В.Ю., Морозова Г.А. (1979) Образование фенольных соединений и процесс дифференциации в каллусной культуре чайного растения. Физиология растений, 26 (3), 485-491.

19. Запрометов М.Н., Стрекова В.Ю., Субботина Г.А., Загоскина Н.В. (1986) Действие кинетина на дифференциацию и образование фенольных соединений в каллусной культуре чайного растения. Физиология растений, 33 (2), 356-364.

20. Бляков Г.Б., Стригина Л.И., Хорлин А.Я., Кочетков Н.К. (1962) Гликозиды из корня женьшеня (Panax ginseng С.А. Meyer). Изв. АН СССР. Отд. хим. наук, 2, 2054.

21. Еляков Г.Б., Стригина Л.И., Кочетков Н.К. (1965) Гликозиды из корней женьшеня. VI. Строение углеводной цепи панаксозида А. Химия природных соединений, Ъ, 149-152.

22. Еляков Г.Б., Дзизенко А.К., Шапкина Э.В. (1967) Структура продуктов кислотного гидролиза панаксозидов Д, Е, F. Химия природных соединений, 3, 165-169.

23. Еляков Г.Б., Оводов Ю.С. (1972) Гликозиды аралиевых. Химия природных соединений, 6, 697-709.

24. Еляков Г.Б., Уварова Н.И., Прокопенко Г.И., Маханьков В.В., Слабко М.Г., Фаустов B.C., Константинова Н.А., Новиков Е.В., Подгорбунская Н.В. (1989) Химическое исследование суспензионной культуры клеток женьшеня. Биотехнология, 5(4), 420-426.

25. Козыренко М.М., Артюкова Е.В., Реунова Г.Д., Чернодед Г.К., Ходаковская М.В., Журавлев Ю.Н. (1997) Геномный полиморфизм в культивируемых клетках Panax ginseng С.А. Меу. Биотехнология, 5, 10-14.

26. Козыренко М.М., Артюкова Е.В., Лауве Л.С., Журавлев Ю.Н., Реунова Г.Д. (2001) Генетическая изменчивость каллусных линий женьшеня Panax ginseng. Биотехнология, 1, 19—26.

27. Константинова Н.А., Зайцева Г.В., Фаустов B.C., Маханьков В.В., Уварова Н.И., Еляков Г.Б. (1989) Исследование ростовых и биосинтетических способностей длительно пассируемой суспензионной культуры клеток женьшеня. Биотехнология, 5(5), 517-575.

28. Константинова Н.А., Маханьков В.В., Уварова Н.И., Самошина Н.Ф., Сова В.В., Михайлова О.М. (1995) Исследование динамики биосинтезагинзенозидов в цикле роста каллусной культуры клеток женьшеня. Биотехнология, 9-10, 35-39.

29. Кунах В.А., Можилевская Л.П., Губарь С.И. (2001) Особенности получения и продуктивность суспензионных культур и клеточных клонов раувольфии змеиной Rauwolfia serpentina Benth. in vitro. Биотехнология, 4, 9-21.

30. Кунах В.А., Можилевская Л.П., Адонин В.И., Губарь С.И. (2003) Продуктивность и генетическая структура популяции клеток Panax ginseng С.А. Меу. при культивировании in vitro. Биотехнология, 3, 25-35.

31. Легостева А.Б., Грушвицкий И.В., Минина С.А. (1986) Возрастная и сезонная динамика содержания панаксозидов в листьях культивируемого Panax ginseng С.А. Меу. Растительные ресурсы, 22(4), 523-526.

32. Лобакова Е.С., Корженевская Т.Г., Гусев М.В., Бутенко Р.Г. (1984) Образование биологически активных веществ клетками женьшеня в ассоциации с цианобактерией Chlorogloea fritschii. Докл. АН СССР, 276(4), 1017-1018.

33. Малышев А.А. (1991) Женьшень. М.: Агропромиздат, 145 с.

34. Маханьков В.В., Самошина Н.Ф., Уварова Н.И., Еляков Г.Б. (1993) Анализ нейтральных гинзенозидов диких и плантационных корней Panax ginseng, произрастающих в Приморье. Химия природных соединений, 2, 237-242.

35. Маханьков В.В. (2001) Сравнительное исследование качественного состава и количественного содержания тритерпеновых гликозидов, продуцированных дикорастущим и плантационным женьшенем P. ginseng

36. C.M. Meyer и клеточной культурой на его основе. Дисс. канд. хим. наук, Владивосток, 187с.

37. Никитина И.В. (1982) Физиолого-биохимическая характеристика каллусных тканей некоторых видов рода Panax L. Растительные ресурсы, 18(2), 234-238.

38. Носов A.M. (1999) Культура высших растений уникальная система, модель, инструмент. Физиология растений, 46(6), 837-844.

39. Пасешниченко В. А. (1985) Регуляция биосинтеза терпеноидов и стероидов у растений и животных. Успехи биологической химии, 26, 246-268.

40. Пасешниченко В. А. (1987) Биосинтез и биологическая активность растительных терпеноидов и стероидов. Итоги науки и техники. Сер. Биолог, химия, 26. М.: ВИНИТИ, 196 с.

41. Писецкая Н.Ф. (1970) К вопросу о подборе питательной среды для культуры ткани женьшеня. Растительные ресурсы, 6(4), 517-520.

42. Репка Ф., Юрчак С. (1989) Опыт выращивания женьшеня в условиях ЧССР. Лекарственное растениеводство, 4, 22-23.

43. Решетняк О.В., Черняк Н.Д., Смоленская И.Н., Орешников А.В., Смирнова Ю.Н., Носов А.М. (2008) Сравнительный анализ гинзенозидов в разных частях корней и в культивируемых клетках женьшеня настоящего. Хим. фарм. журн., 42(1), 34-39.

44. Рокицкий П.Ф. (1964) Биологическая статистика. Минск: Высшая школа, 328 с.

45. Сапожникова Т.Г. (1994) Распространение и охрана редких видов сосудистых растений Хабаровского края и Еврейской автономной области. Владивосток; Хабаровск: Дальнаука, 126с.

46. Скуратова Е.В., Гольд В.М., Юшкова Е.В., (2004) Влияние фитогормонов на накопление и выделение берберина в каллусной культуре василистника малого. Биотехнология, 4, 24-30.

47. Стригина Л.И., Шапкина Э.В., Еляков Г.Б. (1962) О генинах гликозидов женьшеня. Симпозиум по элеутерококку и женьшеню, Владивосток, ДВО АН СССР, с. 74 75.

48. Тулупова Е.С., Остроженкова Е.Г., Слепян., Саканян Е.И. (2002) Влияние различных цитокининов на рост селективных штаммов Panax ginseng С.А.Меу и Panax quinquefolius L. с герматраном Lx 5 и содержание в них гликозидов. Биотехнология, 3, 30-36.

49. Уварова Н.И., Горшкова Р.П., Еляков Г.Б. (1962) Новый способ получения суммарного гликозидного препарата из женьшеня с применением сефадекса. Симпозиум по элеутерококку и женьшеню, Владивосток, ДВО АН СССР, с. 75 76.

50. Уварова Н.И., Горшкова Р.П., Стригина Л.И., Еляков Г.Б., Кочетков Н.К. (1965) Выделение новых гликозидов из женьшеня. Химия природных соединений, 2, 82-86.

51. Уварова Н.И., Маханьков В.В., Самошина Н.Ф. (2000) Химическая характеристика и биологическая активность тритерпеновых гликозидов приморской популяции Panax ginseng С.А. Meyer. Хим. фарм. экурн., 34(3), 19-25.

52. Федоров А.А. (1969) Хромосомные числа цветковых растений. JL: Наука, 914 с.

53. Филиппова И.Н., Зоринянц С.Э., Володина С.О., Смоленская И.Н. (2003) Культуры клеток экдистероидсодержащих растений Ajuga reptans и Serratula coronata. Физиология растений, 50, 501—508.

54. Ходаковская М.В., Булгаков В.П., Маханьков В.В. (1995) Влияние фитогормонов на накопление биомассы и содержание гинзенозидов в каллусных культурах Panax ginseng С.А.Меу. Биотехнология, 9-10, 40—45.

55. Чайко A.JL, Решетняк О.В., Куличенко И.Е. (1999) Культура клеток женьшеня японского Panax japonicus (var. repens): получение каллусной и суспензионной культуры, оптимизация роста и анализ панаксозидов Биотехнология, 6, 51-55.

56. Чой К.Т., Ан И.О., Парк Д.Ч. (1994а) Образование гинзенозидов в культуре тканей женьшеня (Panax ginseng С.А. Meyer). Физиология растений, 41(6), 891-895.

57. Цой К.Т., Ахн И.О., Парк Д.С. (19946) Продуцирование гинзенозидов культурой клеток женьшеня (Panax ginseng C.A.Meyer). Физиология растений, 41(6), 784 788.

58. Шлотгауэр С. Д. (1993) Антропогенная динамика растительности Хабаровского края. Вест. ДВО РАН, 6, 84-90.

59. Abe I., Rohmer М., Prestwich G.D. (1993) Enzymatic cyclization of squalene and oxidosqualene to sterols and triterpenes. Chem. Rev., 93, 2189-2206.

60. Akashi Т., Furuno Т., Takahashi Т., Ayabe S. (1994) Biosynthesis of triterpenoids in cultured cells and regenerated and wild plants organs of Taraxacum officinale. Phytochemistry, 36, 303-308.

61. Benishin C.G, Lee R, Wang L., Liu H.J. (1991) Effects of ginsenoside Rbl on central cholinergic metabolism. Pharmacology, 42, 223-229.

62. Benishin C.G. (1992) Actions of ginsenoside Rbl on choline uptake in central cholinergic nerve endings. Neurochem. Int., 21, 1-5.

63. Bonfill M., Cusido R.M., Palazon J., Pinol M., Morales C. (2002) Influence of auxins on organogenesis and ginsenosides production in Panax ginseng calluses. Plantcell, Tissue and organ culture, 68, 73-78.

64. Byun В. H., Shin I. Yoon Y.S., Kim S.I., Joe C.O. (1997). Modulation of protein kinase С activity in NIH 3T3 cells by plant glycosides from Panax ginseng. Planta Medica, 63(5), 389-392.

65. Campanoni P., Nick P. (2005) Auxin-Dependent cell division and cell elongation. 1-Naphthaleneacetic acid and 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid activate different pathways. Plant Physiol., 137, 939-948.

66. Chen F.D., Wu M.C., Wang H.E., Hwang J.J., Hong C.Y., Huang Y.T., Yen S.H., Ou Y.H. (2001) Sensitization of a tumor, but not normal tissue, to the cytotoxic effect of ionizing radiation using Panax notoginseng extract. Am J. Chin. Med., 29, 517-524.

67. Cho S.W., Cho E.H., Choi S.Y. (1995) Ginsenosides activate DNA polymerase from bovine placenta. Life Sci., 57, 1359-1365.

68. Choi K.T., Ют M.W., Shin H.S. (1982) Root and shoot formation from callus and leaflets of Ginseng {Panax ginseng C.A.Mey). Proc. 5th Int.Cong. Plant Tissue and Cell Culture, Tokyo, Japan, pp. 171.

69. Choi K.-T., Yang D.-C., Park J.-C. (1989) Characterization of cell line of ginseng (Panax ginseng C.A. Mayer) transformed by Agrobacterium tumefaciens. In: Lyama, S., Takeds, G. (Eds.), Proc. of the 6th Internatl. Congr. Of SABRAO, Tokyo, pp. 519-522.

70. Choi K.T., Lee C.H., Ahn I.O., Lee J.H., Park J.-C. (1994). Characteristics of the growth and ginsenosides in the suspension-cultured cells of Korean ginseng (Panax ginseng C.A. Mayer). In: Bailey, W.G., Whitehead, C., Proctor, J.T.A.,

71. Kyle, J.T. (Eds.), Proceedings of the International Ginseng Conference, Vancouver, pp. 259-268.

72. Choi Y.E. (2007) Ginseng. Biotechnology in Agriculture and Foresty, 61, 149-168.

73. Court W.A., Reynolds L.B, Hendel J.G (1996) Influence of root age on the concentration of ginsenosides of American ginseng (Panax quinquefolium). Canadian Journal of Plant Science, 76(4), 853-855.

74. Elyakov G.B., Strigina L.I., Uvarova N.I., Vaskovsky V.E., Dzizenko A.K., Kochetkov N.K. (1964) Glycosides from ginseng roots. Tetrahedron. Lett., 48, 3591-3597.

75. Filkuka J., Kleinwachter V. (1981) Basic staining of cell nuclei. Brno: Purkyne University, Medical Faculty. 158 p.

76. Flores-Sanchez I.J., Ortega-Lopez J., Montes-Horcasitas M.C., Ramos-Valdivia A.C. (2002) Biosynthesis of Sterols and Triterpenes in Cell Suspension Cultures of Uncaria tomentosa. Plant Cell Physiol., 43, 1502-1509.

77. Fujioka N., Kohda H., Yamasaki K., Kasai R., Tanaka O., Shoyama Y., Nishioka I. (1989) Dammarane and oleanane saponins from callus tissue of Panax japonicus. Phytochemistry, 28(7), 1855-1858.

78. Furuya Т., Kojima H., Syono K., Ishii T. Uotani K., Nishio M. (1983) Isolation of saponins and sapogenins from callus tissue of Panax ginseng. Chem Pharm Bull., 21, 98-101

79. Gao H., Wang F., Lien E.J., Trousdale M.D. (1996) Immunostimulating polysaccharides from Panax notoginseng. Pharm. Res. 13, 1196-1200.

80. Garve R., Luckner M., Vogel E., Tewes A., Nover L. (1980) Growth, morphogenesis and cardenolide formation in long-term cultures of Digitalis lanata. Planta Med., 40, 93-103.

81. Han J., Zhong J. J. (2002) High density cell culture of Panax notoginseng for production of ginsengsaponin and polysaccharide in an airlift bioreactor. Biotechnology Letters, 24, 1927-1930.

82. Han J.Y., Kwon Y.S., Yang D.C., Jung Y.R., Choi Y.E. (2006) Expression and RNA interference-induced silencing of the dammarenediol synthase gene in Panax ginseng. Plant Cell Physiol., 47, 1653-1662. v *

83. Haralampidis K., Trojanowska M., Osbourn A.E. (2001) Biosynthesis of triterpenoid saponin in plants. Adv. Biochem. Eng. Biothecnol., 75, 31-49.

84. Heijden R., Threlfall D.R., Verpoorte R., Whitehead I.M. (1989) Regulation and enzymology of pentacyclic triterpenoid phytoalexin biosynthesis in cell suspension cultures of Tabernaemontana divaricata. Phytochemistry, 28, 2981-2988.

85. Ни C., Kitts D.D. (2001) Free radical scavenging capacity as related to antioxidant activity and ginsenoside composition of Asian and North American ginseng extracts. J. of American oil chemists' Society, 78(3), 249-255.

86. Hu W.W., Yao H., Zhong J.J. (2001) Improvement of Panax notoginseng cell culture for production of ginseng saponin and polysaccharide by high densitycultivation in pneumatically agitated bioreactors. Biotechnology progressing, 17(5), 838-846.

87. Inomata, S., Yokoyama, M., Gozu, Y., Shimizu, Т., Yanagi, M. (1993) Growth pattern and ginsenoside production of Agrobacterium-transformed Panax ginseng roots. Plant Cell Rep., 12, 681-686.

88. Iturbe-Ormaetxe I., Haralampidis K., Papadopoulou K., Osbourn A.E. (2003) Molecular cloning and characterization of triterpene synthases from Medicago truncatula and Lotus japonicus. Plant Mo I. Biol., 51, 731-743.

89. Jung J.D., Park H.W., Halm Y., Hur C.G., In D.S., Chung H.J., Liu J.R., Choi D.W. (2003) Discovery of genes for ginsenoside biosynthesis by analysis of ginseng expressed sequence tags. Plant Cell Rep., 22, 224-230.

90. Kang K.S., Kim H.Y., Pyo J.S., Yokozawa T. (2006) Increase in the free radical scavenging activity of ginseng by heat-processing. Biol. Pharm. Bull., 29(4), 750-754.

91. Kawano N., Kawano Т., Lapeyrie F. (2003) Inhibition of the indole-3-acetic acid-induced epinastic curvature in tobacco leaf strips by 2,4— dichlorophenoxyacetic acid. Ann. Bot., 91, 465—471.

92. Ют JY, Germolec DR, Luster MI. (1990) Panax ginseng as a potentialimmunomodulator. Studies on in mice. Immunopharmacol Jmmunotoxicol., 12, 257-76.

93. Kim S., Kim D.S., Lee Y.H., Park J.D., Baek N. (1995) Isolation of novel dammarane-glycoside, ginsenoside Rh 44 0, from Korean red ginseng. Proc.of '95 Korean-Japan Symp. pp. 107-116.

94. Kim Y.K.,Guo Q., Packer L. (2002) Free radical scavenging activity of red ginseng aqueous extracts. Toxicology, 172(2), 149-56.

95. Kim Y.S., Hahn E.J., Murthy H.N., Paek K.Y. (2004) Adventitious root growth and ginsenoside accumulation in Panax ginseng cultures as affected by methyl jasmonate. Biotechnol Lett., 26, 1619-1622

96. Kenarova В., Neychev H., Hadjiivanova C., Petkov V.D. (1990) Immunomodulating activity of ginsenoside Rgl from Panax ginseng. Jpn. J. Pharmacol., 54, 447-54.

97. Keum Y.S., Park K.K., Lee J.M., Chun K.S., Park J.H., Lee S.K., Kwon H., Surh Y.J. (2000) Antioxidant and anti-tumor promoting activities of the methanol extract of heat-processed ginseng. Cancer Lett., 150(1), 41-48.

98. Ко K.S., Noguchi H., Ebizuka Y., Sankawa U. (1989) Oligoside production by hairy root cultures transformed by Ri plasmids. Chem. Pharm. Bull., 37, 245-248.

99. Konoshima Т., Takasaki M., Tokuda M. (1996) Anti-tumor-promoting activities of the roots of Panax-notoginseng. Natural Medicines, 50(2), 158-162.

100. Konoshima T. (1999) Cancer chemo preventive activities of Panax notoginseng ., and ginsenoside Rgi. Stud. Plant. Sci., 6, 36-42.

101. Kubo M., Tani Т., Katsuki Т., Ishizaki K., Arichi S. (1980) Histochemistry, ginsenosides in ginseng {Panax ginseng C.A.Mey) root. J. of Natural Prodacts, 43(2), 278-284.

102. Kushiro Т., Ohno Y., Shibuya Y., Ebizuka Y. (1997) In vitro conversion of 2,3-oxidosqualene into dammarenediol by Panax ginseng microsomes. Biol. Pharm. Bull., 20, 292-294.

103. Kushiro Т., Shibuya M., Ebizuka Y. (1998) p-Amyrin synthase: cloning of oxidosqualene cyclase that catalyzes the formation of the most popular triterpene among higher plants. Eur. J. Biochem., 256, 238-244.

104. Kutchan T.M., Ayabe S., Krueger R.J., Coscia E.M., Coscia C.J. (1983) Cytodifferentiation and alkaloid accumulation in cultured cells of Papaver bracteatum. Plant Cell Reports, 2, 281-284.

105. Kuzuyama Т. (2002) Mevalonate and nonmevalonate pathways for the biosynthesis of isoprene units. Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 1619-1627.

106. Langhansova L., Marsik P., Vanek T. (2005) Production of saponins from Panax ginseng suspension and adventitious root cultures. Biologia plantarum, 49(3), 463-465.

107. Li S.H., Chu Y. (1999) Anti-inflammatory effects of total saponins of Panax notoginseng. Acta Pharmacol. Sin., 20, 551-554.

108. Lim W., Mudge K.W., Vermeylen F. (2005) Effects of population, age, and cultivation methods on ginsenoside content of wild American Ginseng (Panax quinquefolium). Agric. Food Chem., 53 (22), 8498 -8505.

109. Liu S., Zhong J.J. (1997). Simultaneous production of ginseng saponin and polysaccharide by suspension cultures of Panax ginseng: Nitrogen effects. Enzyme and Microbial Technology, 21(7), 518-524.

110. Liu S., Zhong J.J. (1998) Phosphate effect on production of ginseng saponin and polysaccharide by cell suspension cultures of Panax ginseng and Panax quinquefolium. Process Biochem., 33, 69-74.

111. Liu K., Xu S.X., Che C.T. (2000) Antiproliferative effect of ginseng saponins on human prostate cancer cell line. Life Sci., 67, 1297-1306.

112. Liu K.Z., Li J.B., Lu H.L., Wen J.K., Han M. (2004) Effects of Astragalus and saponins of Panax notoginseng on MMP-9 in patients with type 2 diabetic macroangiopathy. Chin. J. Chin. Mater. Med., 29, 264-266.

113. Lee F. C. (1992) Facts about Ginseng. The elixir of life. Elizabeth, New Jersey: Hollyn International Corporation, 104. pp.

114. Lee M.H., Jeong J.H., Seo J.W., Shin C.G., Ют Y.S., In J.G., Yang D.C., Yi J.S., Choi Y.E. (2004) Enhanced triterpene and phytosterol biosynthesis in Panax ginseng overexpressing squalene synthase gene. Plant Cell Physiol., 45, 976-984.

115. Lu M.B., Wong H.L., Teng W.L. (2001) Effects of elicitation on the production of saponin in cell culture of P. ginseng. Plant cell report, 20, 674-677.

116. Mallol A., Cusidor R.M., Palazon J., Bonfill M., Morales C., Pino M.T. (2001) Ginsenoside production in different phenotypes of Panax ginseng transformed roots. Phytochemistry, 57, 365-371.

117. Mannonen L., Toivonen L., Kauppinen V. (1990). Effects of long-term preservation on growth and productivity of Panax ginseng and Catharanthus roseus cell cultures. Plant Cell Reports, 9(4), 173-177.

118. Mathur A., Shukla Y.N., Paul M., Ahuja P.S., Uniyal G.C. (1994). Saponin production in callus and cell suspension cultures of Panax quinquefolium. Phytochemistry Oxford, 35(5), 1221-1225.

119. Mazza G., Cottrell A.C., Gao L. (1996) Ginsenosides in roots and leaves of American ginseng. J. Agric. Food. Chem., 44, 717-720.

120. Melaragno J.E., Mehrotra В., Coleman A.W. (1993) Relationship between Endopolyploidy and Cell Size in Epidermal Tissue of Arabidopsis. Plant Cell., 5, 1661-1668.

121. Morita Т., Kasai R., Tanaka O., Yang T.R, Shou J. (1982) Saponins of Zu-Tziseng, rhizomes of Panax japonicus C.A. Meyer, var. major Burk, C.Y. Wu et K.M. Feng, collected in Yunnan, China. Chem. Pharm. Bull., 30(12), 4341-4346.

122. Morita Т., Tanaka О., Kohda H. (1985) Saponin composition of rhizomes of Panax japonicus collected in South Kyushu, Japan, and its significance in oriental traditional medicine. Chem. Pharm. Bull., 33(9), 3852-3858.

123. Muhlbach H.P. (1998) Use of plant cell cultures in biotechnology. Biothechnol. Annu. Rev., 4, 113-176.

124. Murashige Т., Skoog F.A. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 15, 473-497.

125. Nagai M., Tanaka O., Shibata S. (1971) Chemical studies on the oriental plant drugs XXVI.Saponins and sapogenins of Ginseng. The absolute configuration of cinenic acid and panaxadiol. Chem. Pharm. Bull., 19 (11), 2349-2353.

126. Odashima S., Ohta Т., Kohno H., Matsuda Т., Kitagawa I., Abe H., Arichi S. (1985) Control of phenotypic expression of cultured В16 melanoma cells by plant glycosides. Cancer Res., 45, 2781-2784.

127. Odnevall A., Bjork L., Berglund T. (1989) Rapid establishment of tissue cultures from seeds of Panax ginseng and Panax pseudoginseng. Biochem. Physiol. Pflazen, 185 (1/2), 131-134.

128. Odnevall A., Bjork L. (1989a) Effects of light on growth, morphogenesis and ginsenoside formation in tissue cultures of Panax ginseng. Biochem. Physiol. Pflanzen, 185 (3/4), 253-259.

129. Odnevall A., Bjork L. (1989b) Differentiated tissue cultures of Panax ginseng and their responses to various carbon sources. Biochem. Physiol. Pflansen, 185 (5/6), 403—413.

130. Pichersky E., Gang D.R. (2000) Genetics and biochemistry of secondary metabolism in plants: an evolutionary perspective. Trend plant scince, 5(10), 439-445.

131. Saito A., Lee Y., Takagi K., Shibata S., Shoji J., • Kondo N. (1977) Pharmacological studies of Panax japonicus rhizoma. Chem. Pharm. Bull., 25 (5), 1017- 1020.

132. Samukawa K., Yamashita H., Matsuda H., Kubo M. (1995) Simultaneous analysis of ginsenosides of varios ginseng radix by HPLC. Chem. Pharm. Bull., 43 (1), 137-141.

133. Schnedl W., Roscher U., van der Ploeg M., Dann O. (1977) Cytofluorometric analysis of nuclei and chromosomes by DIPI staining. Cytobiologie, 15, 357-362.

134. Shibata S., Tanaka O., Nagai M., Ishii T. (1962) The stereochemistry of Panaxadiol. Tetrahedron Lett., 26, 1239-1242.

135. Shibata S., Tanaka O., Sado M., Tsushima S. (1963a) On genuine sapogenin of ginseng. Tetrahedron Lett., 12, 795-800.

136. Shibata S., Fujita M., Itokawa H., Tanaka O., Ishii T. (1963b) Studies on the contituents of japanese and chiness crude drugs XI.Panaxadiol, a sapogenin of ginseng roots (1). Chem. Pharm. Bull., 11(6), 759-761.

137. Shibata S., Tanaka O., Soma K., Iida Y., Ando Т., Nakamura H. (1965) The structure ofpanaxatriol. Tetrahedron Lett., 3, 207-213.

138. Shibata S., Tanaka O., Ando Т., Sado M., Tsushima S., Ohosawa T. (1966) Protopanaxadiol, a genuine sapogenin of ginseng saponins. Chem. Pharm. Bull., 14(6), 595-600.

139. Shibata S. (2001) Chemistry and cancer preventing activities of ginseng saponins and somerelated triterpenoid compounds. J. Kor. Med. Sci., 16, 28-37.

140. Shibuya M., Hoshino M., Katsube Y., Hayashi H., Kushiro Т., Ebizuka Y. (2006) Identification of beta-amyrin and sophoradiol 24-hydroxylase by expressed sequence tag mining and functional expression assay. FEBS J., 273, 948-959.

141. Sivakumar G., Yu K.W., Hahn E.J., Paek K.Y. (2005) Optimization .of organic nutriens for ginseng hairy roots production in large — scale bioreactors. Current science, 89 (4), 641-649.

142. Smith R.G., Caswell D., Carriere A., Zielke B. (1996) Variation in the ginsenoside content of American ginseng, Panax quinquefolius L., roots. Can. J. Bot., 74(10), 1616-1620.

143. Soldati F., Sticher O. (1980) HPLC separation and quantitative determination of ginsenosides from Panax ginseng, Panax quinquefolium and from ginseng drug preparation. 1-nd commun. Planta medica, 38(3), 348-357.

144. Sollorz G. (1985) Qualitatsbeurteilung von Ginsengwurzeln. Dtsch. Apoth. Ztg., 125, 2052-2055.

145. Sonnenborn U., Proppert Y. Ginseng {Panax ginseng C.A. Meyer). (1991) Br. J. Phytother., 2, 3-14.

146. Sugimoto-Shirasu K., Roberts K. (2003) "Big It Up": Endoreduplication and Cell-Size Control in Plants. Curr. Opin. Plant Biol., 6, 544-553.

147. Tanaka О., Nagai M., Shibata S. (1966) Chemical studies on the oriental plant drugs. The steriochemistry of protopanaxadiol, a genuine sapogenin of ginseng. Chem. Pharm. Bull., 14(10), 1150-1156.

148. Tanaka O., Nagai M., Ohsawa Т., Tanaka N., Shibata S. (1967) Stereochemistry of protopanaxadiol: acid catalysed epimerization of C-20 -hydroxyl of betulafolientriol, protopanaxadiol and their derivatives. Tetrahedron Lett., 5, 391-396.

149. Tanaka O., Kasai R. (1984) Saponins of ginseng and related plants. In: Herz, W., Grisebach, H., Kirby, G.W., Tamm, Ch. (Eds.), Progress in the Chemistry of Organic Natural Products, 46, Springer-Verlag, Berlin, pp. 1-76.

150. Tanaka O. (1990) Recent studies on glycosides from plant drugs of Himalaya and f South-Western China chemogeographical correlation of Panax species. Pureand applied chemistry, 62 (7), 1281-1284.

151. Tansakul P., Shibuya M., Kushiro Т., Ebizuka Y. (2006) Dammarenediol-II synthase, the first dedicated enzyme for ginsenoside biosynthesis, in Panax ginseng. FEBS Letters, 580, 5143-5149.

152. Tohda C., Matsumoto N., Zou K., Meselhy M.R., Komatsu K. (2004). Ab (25-35)-induced memory impairment, axonal atrophy, and synaptic loss are ameliorated by Ml, A metabolite of protopanaxadiol-type saponins. Neuropsychopharmacology, 29, 860-868.

153. Wang Z., Zhong-jan J., Zhu Zi-ging, Yang Chong-ren, Zhou J., Kasai R., Tanaka O. (1985) The triterpenoid saponins of rhizomes of Panax japonicus C.A.Mey var.anqustifolius (Burk.). Acta Botanica sinica, 27(6), 618-624.

154. Wang W., Zhang Z.Y., Zhong J.J. (2005) Enhancement of ginsenoside biosynthesis in high-density cultivation of Panax notoginseng cells by various strategies of methyl jasmonate elicitation. Appl. Microbiol. BiotechnoL, 67, 752-758.

155. White C.M., Fan C., Song J., Tsikouris J.P., Chow M. (2001) An evaluation of the haemostatic effects of hydrophilic, alcohol, and lipophilic extracts of P. notoginseng. Pharmacotherapy, 21, 773-777.

156. Wen J., Zimmer E.A. (1996) Phylogeny and biogeography of Panax L. (the ginseng genus, Araliaceae): inferences from ITS sequences of nuclear ribosomal DNA. Mol. Phylogenet. Evol., 6, 167-177.

157. Wu J., Zhong J-J. (1999) Production of ginseng and its bioactive components in plant cell culture: Current technological and applied aspects. Journal of Biotechnology, 68, 89-99.

158. Xie J.T., Mehendale S., Yuan C.S. (2005) Ginseng and Diabetes. The-American Journal of Chinese Medicine, 33(3), 397 404.

159. Yahara S., Kasai R., Tanaka O. (1977) New dammarane type saponins of leaves of Panax japonicus C.A.Meyer (1), chikusetsusaponins -L 45 0,-L 49a 0 and -L 410 0. Chem. Pharm. Bull., 25(8), 2041-2047.

160. Yahara S., Tanaka O., Nishioka I. (1978) Dammarane type saponins of leaves of Panax japonicus C.A. Meyer. Saponins of the specimens collected in Tottori-ken, Kyoto-shi andNiigata-ken. Chem. Pharm. Bull., 26(10), 3010-3021.

161. Yamahara J., Kubomura Y., Miki K., Fujimura H. (1987) Anti-ulcer action of Panax japonicus rhizome. J. Ethnopharmacol., 19, 95-101.

162. Yamaguchi H., Matsuura H., Kasai R., Tanaka O., Satake M., Kohda H., Izumi H., Nuno M., Katsuki S., Isoda S., Shoji J., Goto K. (1988) Analysis of saponins of wild Panax ginseng. Chem. Pharm. Bull., 36(10), 4177-4181.

163. Yang D.-C., Choi K.T., Yang D.-C. (1991) Patterns of soluble proteiru reducing sugar and ginsenosides in transformed calli of ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer). Korean J. Ginseng Sci., 15, 124-130.

164. Yang D.C., Yang K.J. (2000) Pattern and contents of ginsenoside in normal root parts and hairy root lines of Panax ginseng C.A. Meyer. Kor. J. Plant Tis-^ue Cult., 27, 485-489.

165. Yokozawa Т., Yasui Т., Oura H. (2004) Stimulation of RNA polymerase activity by ginsenoside-Rb2 in diabetic rats. Phytotherapy Research, 7(3), 240 -243.

166. Yoshikawa Т., Furuya T. (1987) Saponin production by cultures of Panax ginseng transformed with Agrobacterium rhizogenes. Plant Cell Rep., 6, -449-453.

167. Yu K.W., Gao W., Hahn E.J., Paek K.Y. (2002) Jasmonic acid improves ginsenoside accumulation in adventitious root culture of Panax ginseng C.A. Meyer. Biochemical Engineering Journal, 11 (2-3), 211-215.

168. Yu K.W., Murthy H.N., Hahn E.-J., Paek K.-Y. (2005) Ginsenosides production by hairy root cultures of Panax ginseng: influence of temperature and light quality. Biochemical Engineering Journal, 23, 53-56.

169. Yun Т.К., Lee Y.S., Lee Y.H., Ют S.I., Yun H.Y. (2001) Anticarcinogenic effect of Panax ginseng C.A. Meyer and identification of active compounds. J. Korean Med. Sci., 16, 6-18.

170. Zhang Y.H., Zhong J.J., Yu J.T. (1996b) Effect of nitrogen source on cell growth and production of ginseng saponin and polysaccharide in suspension cultures Panax notoginseng. Biotechnol. Prog., 12, 567-571.

171. Zhang Y.H., Zhong J.J., Yu J.Y. (1996c) Enhancement of ginseng saponin production in suspension cultures of Panax notoginseng manipulation of medium sucrose. J. of Biotechnology, 51 (1), 49-56.

172. Zhang Y.H., Zhong J.J. (1997) Hyperproduction of ginseng saponin and polysaccharide by high density cultivation of Panax notoginseng cells. Enzyme Microb. Technol., 21, 59-63.

173. Zhong J.J., Zhu Q.X. (1995) Effect of initial phosphate concentration on cell growth and ginsenoside saponin production by suspended cultures of Panax notoginseng. Applied biochemistry and biotechnology, 55 (3), 241-247.

174. Zhong J. J., Bai Y., Wang S.J. (1996) Effects of plant growth regulators on cell-growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium. J. Biotechnol., 45, 227-234.

175. Zhong J.J., Wang D.J. (1996a). Improvement of cell growth and production of ginseng saponin and polysaccharide in suspension cultures of Panax notoginseng: Cu2+ effect. J. Biotechnol., 46, 69-72.

176. Zhong J.J., Wang S.J. (1996b) Effects of nitrogen source on the production of ginseng saponin and polysaccharide by cell cultures of Panax quinquefolium. Process Biochemistry, 33, 671-675.

177. Zhou J., Huang W.K., Wu M.Z., Yang C.R., Feng K.M., Wu Z.Y. (1975) Triterpenoids from Panax Linn, and their relationship with taxonomy and geographical distribution. Acta Phytotaxon Sin., 13,29-45.

178. Zhu S., Zou K., Fushimi H., Cai S., Komatsu K. (2004) Comparative study on triterpene saponins of ginseng drugs. Planta Med., 70,666-677.