Особенности роста ткани, синтеза и выделения берберина в культуре in vitro Thalictrum minus L. (василистника малого) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.12, кандидат биологических наук Скуратова, Елена Валерьевна

• Скуратова, Елена Валерьевна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Скуратова, Елена Валерьевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение

Глава 1. Культура клеток и тканей растений как источник биологически активных веществ

1.1 Культуры клеток и тканей растений в решении задач физиологии растений и биотехнологии

1.2 Получение изолированных культур клеток in vitro

1.3 Питание клеток in vitro

1.3.1. Минеральное питание

1.3.2. Углеводное питание

1.3.3. Витамины

1.3.4. Регуляторы роста

1.4 Способы культивирования

1.4.1. Поверхностное культивирование

1.4.2. Глубинное культивирование

1.4.3. Иммобилизованные клетки

1.5 Получение вторичных метаболитов в культуре in vitro

1.5.1 Особенности и функциональное значение вторичного метаболизма in vivo и in vitro

1.5.2 Проблема регуляции вторичного синтеза в культуре in vitro

1.6 Образование и метаболизм берберина и протобербериновых алкалоидов

1.7 Перспективные методы культивирования клеток растений для получения берберина и протобербериновых адкалоидов

Глава 2. Объект и методы исследования

2.1 Объект исследования

2.2 Методы исследования

2.2.1. Получение исходного материала для каллусогенеза

2.2.2. Получение и субкультивирование каллусной культуры

2.2.3. Получение суспензионной культуры

ределение показателей роста культуры

ределение жизнеспособности культуры

ределение берберина в процессе культивирования

леток Thalictrum minus L. как перспективный источг

ультуру in vitro Thalictrum minus L

2 влияния разных концентраций регуляторов роста

теза берберина в каллусной ткани Thalictrum minus L

уляторы роста и накопление биомассы

Список литературы Приложение

121 123

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Особенности роста ткани, синтеза и выделения берберина в культуре in vitro Thalictrum minus L. (василистника малого)»

Введение

Растительная клетка - уникальный источник ценных биологически активных веществ разной химической природы, которые обладают не только широким спектром лечебного действия, но и применяются в парфюмерии, пищевой промышленности, сельском хозяйстве. Химические аналоги данных веществ, как правило, содержат сопутствующие примеси, проявляющие негативное действие на организм человека и животных. Кроме того, многие специфические биологически активные вещества, такие как алкалоиды, являются продуктами отдаленного синтеза у растений и их искусственное получение затруднено в связи с многостадийностью процесса, низким выходом основного продукта и его дороговизной [1,11].

В настоящее время актуальным является поиск альтернативных источников и разработка методов получения биологически активных веществ растительного происхождения, по эффективности сопоставимых или превосходящих использование традиционного сырья. Одним из таких методов является культура клеток и тканей растений in vitro. Культивируемые клетки высших растений способны синтезировать традиционно используемые продукты растительного происхождения, создавать принципиально новые вещества, биотрансфор-мировать дешевые предшественники в ценный продукт. Преимуществами данного метода является возможность получения продукта независимо от внешних климатических, почвенных условий, круглогодично и сохраняя при этом естественные ареалы ценных лекарственных растений [5,6,13].

Основной проблемой метода культуры тканей и клеток высших растений в аспекте получения ценных вторичных метаболитов является низкий конечный выход продукта. Это обусловлено тем, что в условиях in vitro клетки выходят из-под организменного контроля, присущего целому растению, и образуют специфическую биологическую систему с иной, чем в целом организме "сверхзадачей". Актуальным при использовании культур тканей и клеток выс-

ших растений с целью получения ценных вторичных веществ является поиск условий, при которых обеспечивался бы оптимальный рост и оптимальное содержание вторичных веществ в биомассе. Основными факторами, регулирующими эти процессы в культуре in vitro, являются искусственные регуляторы роста и способы культивирования тканей и клеток.

Роль искусственных регуляторов роста в процессах деления клеток in vitro изучена достаточно глубоко. Однако, существенное влияние на выбор вида регулятора, его концентрации оказывает видовая принадлежность, генотип, а также эпигенетические факторы [19]. Поэтому подход к каждой конкретной культуре остается эмпирическим. Данные по влиянию регуляторов роста на процессы вторичного синтеза в разных культурах весьма противоречивы. Этот вопрос требует дальнейшего серьезного изучения [32].

Применение того или иного способа культивирования существенным образом определяет как скорость роста биомассы так и интенсивность биосинтетических процессов. Традиционные методы культивирования (поверхностное и глубинное) имеют ряд существенных недостатков. В связи с этим актуальным является разработка высокоэффективного способа получения вторичных метаболитов. Иммобилизация клеток на инертный носитель и создание клеточных линий, выделяющих экзометаболиты является перспективным подходом для биотехнологического использования культур высших растений. Экзометабо-лизм - достаточно редкое явление в условиях in vitro. В большинстве случаев требуется специальная химическая обработка клеток для индукции освобождения продукта. Проблема экзометаболизма (выделение клетками продуктов метаболизма во внешнюю среду) остается мало изученной как с точки зрения физиологии и экологии растений, так и с точки зрения возможности регуляции процесса экзометаболизма с целью повышения эффективности биотехнологических производств.

В связи с этим большой интерес представляет Thalictrum minus L. (василистник малый), так как клетки этого растения в культуре in vitro способ-

ны выделять продукт вторичного метаболизма, алкалоид берберин в среду культивирования. Берберин представляет интерес как источник новых противоопухолевых препаратов, созданных на основе его химической модификации. Культура Thalictrum minus L. как перспективный объект биотехнологии привлекает внимание как российских, так и зарубежных исследователей [66,115]. Однако актуальным остается дальнейшая разработка таких направлений как регуляция биосинтеза берберина, регуляция и изучение механизмов выделения этого алкалоида в среду, а также получение высокопродуктивных и стабильных клеточных культур и оптимизация условий их культивирования.

Теоретическим основанием работы явились положения об определяющей роли эпигенетических факторов в регулировании вторичных процессов в растительной клетке, разработанные A.M. Носовым [52], Н.И. Запрометовым [32], Г.Б. Бузук [4], В.В. Рощиной [59], а также современные представления о методах культивирования растительных клеток in vitro.

Целью данного исследования являлось - выделение перспективной культуры клеток и тканей растения, способной к экзометаболизму биологически активных веществ, изучение особенностей роста культуры, синтеза и выделения экзометаболитов в зависимости от регуляторов роста и способов культивирования.

В задачи настоящего исследования входило:

1. Получить высокопродуктивную каллу сную культуру Thalictrum minus L. Исследовать влияние регуляторов роста на процессы накопления биомассы, синтеза и выделения берберина в каллусной ткани.

2. Провести сравнительный анализ способов культивирования (поверхностного и глубинного) на процессы накопления биомассы, синтеза и выделения берберина. Исследовать особенности процесса иммобилизации клеток Thalictrum minus L на кубики пенополиуретана.

3. Исследовать возможность двустадийного культивирования со сменой "ростовой" и "продукционной" сред при суспензионном культивировании и с иммобилизацией клеток на кубики пенополиуретана.

4. Исследовать влияние параметров иммобилизации (масса кубиков, плотность инокуляции) на процессы выделения берберина в условиях "продукционной" среды.

Научная новизна исследования:

Культура Thalictrum minus L. является интересным объектом для исследователей в силу способности выделять алкалоид берберин во внешнюю среду. Впервые изучено влияние разных соотношений искусственных регуляторов роста и способов культивирования на процессы перераспределения берберина между клетками и средой, а также на процессы накопления берберина в тканях и клеточный рост в культуре Thalictrum minus L. Выдвинута гипотеза о физиологической и экологической обусловленности процесса экзометаболизма в культурах тканей клеток высших растений на примере культуры Thalictrum minus L.

Впервые изучен процесс иммобилизации клеток Thalictrum minus L. на

кубики пенополиуретана с точки зрения кинетики роста иммобилизованных

#

клеток, изучены особенности роста клеток и выделения берберина при культивировании иммобилизованных клеток в две стадии со сменой сред, исследовано влияние параметров иммобилизации (масса частиц, плотность инокуляции) на процессы выделения берберина в условиях "продукционной" среды.

Научно-практическая значимость исследования:

Полученные результаты имеют как теоретическое значение, расширяя наши представления о регуляции процессов вторичного метаболизма и особенно экзометаболизма в культурах тканей и клеток высших растений, так и огромное практическое значение с точки зрения биотехнологического производства берберина. Из дикорастущего растения была получена каллусная культура Thalictrum minus L., способная синтезировать берберин и выделять его в среду

культивирования. Разработан процесс иммобилизации клеток суспензионной культуры на кубики пенополиуретана и культивирования иммобилизованных клеток со сменой сред. Применение полученных результатов в биотехнологии позволит существенно повысить конечный выход берберина за счет его выделения в среду и многократного использования биомассы.

Положения выносимые на защиту:

Определяющим условием как для роста каллусной ткани Thalictrum minus L., так и для синтеза берберина является присутствие в среде регуляторов роста ауксинового типа - 2,4-Д и НУК. Применение 2,4-Д эффективно для роста ткани, НУК - для активизации синтеза берберина. Кроме того, НУК оказывает влияние на перераспределение последнего между тканью и средой.

Культивирование клеток Thalictrum minus L. в суспензионной культуре является основным условием, обеспечивающим перераспределение берберина между клетками и средой преимущественно в сторону экзометаболизма алкалоида.

Иммобилизация клеток Thalictrum minus L. на кубики пенополиуретана позволяет повысить выход берберина и создает предпосылки для многократного использования биомассы.

Разделение процессов роста и синтеза при культивировании Thalictrum minus L. в две стадии позволяет более эффективно получать берберин за счет большой скорости роста культуры на "ростовой" стадии и стимуляции биосинтеза алкалоида - на "продукционной".

ГЛАВА 1. КУЛЬТУРА КЛЕТОК И ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ КАК ИСТОЧНИК БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

1.1 Культуры клеток и тканей растений в решении задач физиологии растений и биотехнологии

Культуры изолированных тканей и клеток растений - относительно молодая и активно развивающаяся сфера исследований, существующая на стыке нескольких областей знаний: физиологии растений, микробиологии и биотехнологии. Клеточные культуры растений могут рассматриваться как микрообъекты, что позволяет применять аппаратуру, методы поддержания стерильности и логику экспериментов, принятых для микроорганизмов. Но в то же время клеточные культуры высших растений сохраняют генетический потенциал и обладают тотипотентностью, что делает их удобной моделью для физиологии и биохимии растений, генетики и молекулярной биологии [9].

Культуры клеток растений широко применяются в физиологии растений как модели для изучения процессов, происходящих в организме растения. Их преимуществами являются: возможность строгого контроля за условиями выращивания, исключение влияния на изучаемые процессы микроорганизмов, доступность экспериментального материала круглый год, возможность использования меченых органических соединений для изучения их метаболизации тканями и клетками [10]. В качестве примеров такого использования культур клеток растений можно привести изучение углеводного метаболизма, изучение устойчивости растений к неблагоприятных факторам, к патогенам, изучение механизма действия фитогормонов, моделирование процессов морфогенеза [9,10].

Культуры клеток и тканей высших растений имеют также большое практическое значение. Поскольку растительная клетка обладает тотипотентностью, то есть способностью реализовать свой генетический потенциал разви-

тия, из одной клетки можно регенерировать целое растение. Это означает расширение возможности для селекции и размножения растений. Еще одним направлением биотехнологии на основе культур растительных клеток является их использование с целью получения биологически активных веществ [21,96].

Традиционно БАВ растений получают на основе использования природного сырья. Из сотен тысяч лекарственных средств, применяемых в мировой медицинской практике, лечебные препараты из растений составляют свыше 30 % [46]. Препараты из растений по сравнению с синтетическими лекарствами имеют ряд преимуществ. Будучи сложными по составу, они содержат много ингредиентов, которые придают им ценные свойства и обеспечивают многостороннее действие на организм, более сильное, чем действие каждого в отдельности. Кроме того, препараты растительного происхождения, обладающие стойким терапевтическим эффектом, как правило малотоксичны и редко оказывают побочное действие [97]. В связи с этим актуальным является поиск альтернативных источников растительного сырья, поскольку природные запасы сырья катастрофически сокращаются, исчезают виды редких лекарственных растений. При этом следует принять во внимание сложность перевода дикорастущих растений на полевое выращивание.

Основанием для использования культивируемых клеток высших растений в биотехнологии является их способность а) синтезировать традиционно используемые продукты растительного происхождения; б) создавать принципиально новые продукты, превосходящие традиционные или открывающие новые области применения; в) биотрансформировать дешевые предшественники в конечный ценный продукт [1,11,12]. Преимуществами клеточных культур по сравнению с традиционным растительным сырьем (дикорастущие или выращиваемые на плантациях растения) являются: 1) возможность получения продукта независимо от климата (привлечение клеток тропических растений), сезона, погоды, почвенных условий; 2) оптимизация и стандартизация условий выращивания; 3) перспективы полной автоматизации и компьютеризации про-

цессов. 4) Культивирование изолированных протопластов растений открывает возможности для генной и клеточной инженерии, направленных на создание новых растительных организмов с заданными свойствами. Возможны ассоциации растительных клеток с микроорганизмами [14,20].

1.2. Получение изолированных культур клеток in vitro

Каллусообразование — это результат дедифференциации клеток, их последующего активного деления и неорганизованного роста, возникающее в природе при ранениях. Каллусы могут образовывать не только активно растущие меристематические клетки, но также и клетки паренхимы листьев, стеблей, флоэмы корнеплода, лепестков и трихом цветка, эндосперма и пыльцы. Способность к каллусообразованию у многих видов растений, прежде всего двудольных, это реакция на травму, которая направлена на восстановление повреждений организма [12,39].

Введение в культуру in vitro предполагает дедифференциацию клеток исходного экспланта и их дальнейшее размножение. При этом происходит выход клеток из-под интегрирующих систем организма, меняются их функции, метаболизм [52]. Существенное влияние здесь оказывает видовая принадлежность, генотип, уровень плоидности растения. В то же время имеется множество данных, что для индукции каллусобразования многих видов растений необходимо наличие в питательной среде регуляторов роста, иногда в больших дозах. Следовательно, каллусообразование, прежде всего, гормонозависимое явление. В настоящее время накоплено большое количество данных, свидетельствующих о том, что способность к каллусообразованию, темп и тип роста изолированных тканей, их способность к различным типам морфогенеза зависят не только от генетической составляющей и состава питательной среды, но и от физиологического состояния растений-доноров, сезона, от стадии развития исходного

органа, условий вычленения экспланта, его тканевой принадлежности, а также размера и ориентации на питательной среде [15, 26, 39].

Таким образом, определяющими в индукции каллусообразования являются как внутренние так и внешние факторы, то есть видовые особенности исходных растений и условия их введения в культуру in vitro определяют взаимодействие генотип — среда, основанное на том, что состав питательной среды, большей частью регуляторы роста, а также условия вычленения экспланта существенно влияют на экспрессию генов, ответственных за каллусообразование.

В целом процесс получения клеточных культур in vitro можно условно разделить на два этапа. Первый этап — индукция каллусообразования, т.е. процессов дедифференциации и дальнейших делений дедифференцированных клеток. Для индукции используется воздействие стрессовыми факторами, в первую очередь, высокими дозами экзогенных, как правило синтетических стимуляторов роста. Здесь, по-видимому, существенную роль играет наличие компетентных клеток к гормонам, стимулирующих пролиферацию, или возникновение такой компетентности после стрессовых воздействий [79].

Второй этап — отбор клеток, способных к длительному росту в изолированной культуре. Чаще всего в среде снижают или изменяют содержание регуляторов роста и органических компонентов, вносят коррективы в условия выращивания.

Получение изолированных клеточных культур — сложный и многоэтапный процесс. Он предполагает формирование новой биологической системы, клетки в которой, выполняют иную чем в целом организме «сверхзадачу». Это требует глобальной перестройки как метаболизма клеток, так и структуры клеточной популяции.

1.3. Питание клеток in vitro.

Первым этапом культивирования клеток с целью получения БАВ, является разработка питательной среды и физико-химических условий, обеспечивающих интенсивный рост культуры.

Все среды состоят из следующих групп веществ: минеральные соли (макро- и микроэлементы ); сахара; стимуляторы роста; витамины [5,26,36].

1.3.1 Минеральное питание

Каллусные ткани, растущие в изолированной культуре, автотрофны в отношении азотного питания. Используя неорганические источники азота, ткани синтезируют на их основе все необходимые для жизнедеятельности органические азотистые соединения. Лучшей формой азотного питания являются нитраты. Источником - аммонийные соли [5,58,68,140,152].

Потребность ткани в элементах минерального питания зависит от ее физиологических особенностей. Интенсивно растущие пассируемые культуры требуют увеличения доз фосфора (среды Нича и Хеллера) [5,36,111]. Для быстро растущих молодых тканей необходимо присутствие в среде больших доз калия, старые, наоборот, требовательны к присутствию кальция [68]. При отсутствии в среде калия наблюдается изменение роста и некрозы [12].

Некоторые авторы [7,36] считают, что интенсивная пролиферация тканей сопровождается усилением белкового синтеза, и ткань не успевает восстанавливать нитраты, чтобы полностью обеспечить этот бурный синтез белка. И поэтому добавления в этих условиях к питательной среде, помимо аммонийных солей гидролизата белка (казеина) создает наиболее благоприятные условия для роста ткани.

Как отмечает Р.Г.Бутенко [5], ссылаясь на работы Хеллера отсутствие микроэлементов уменьшает интенсивность роста на 40% в первом пассаже и приводит к гибели культуры в течение двух последующих. Железо обычно используют хлорное. При выращивании эксплантов используют FeCl3 • 6Н20 в

концентрации lxlO"5. Для того, чтобы железо было доступно экспланту при достаточно высокой рН- среды, применяют хелат железа или цитрат его или тартрат [5,36].

1.3.2. Углеводное питание

Рост практически всех изолированных культур обеспечивается за счет углеводов среды. Это происходит потому, что экспланты растительных клеток, даже зеленеющие на свету, не автотрофны в отношении углеродного питания, и не способны обеспечить себя полностью углеводами за счет фотосинтеза.

Практические пособия по стандартным средам [5] рекомендуют использовать сахарозу в концентрации от 2 до 34%. Именно в этих пределах лежит оптимальная для накопления биомассы концентрация сахарозы. Среди культур, дающих наивысший выход биомассы на среде с 2 % сахарозы, находятся представители самых разных групп растений: голосеменные, некоторые семейства однодольных и двудольных. На хорошо сбалансированных средах выход биомассы оказывается пропорциональным концентрации сахарозы в среде, однако при наиболее высоких концентрациях (20% и более) эта закономерность нарушается. Оптимальная концентрация сахарозы в среде во многом зависит от видовой принадлежности объекта [5,26,36].

1.3.3. Витамины

Большинство тканей культивируемых in vitro способно к синтезу всех нужных для жизнедеятельности витаминов. Для улучшения роста культур изолированных тканей обычно добавляют к среде питательную смесь из витаминов группы В (тиамин, пиридоксин), никотиновой кислоты и мезоинозита. Тиамин разрушается при нагревании на пиримидин и тиазол. Ткань на среде с витамином В-1 становится более плотной, компактной. Производное тиамина тиаминпирофосфат служит коферментом при окислительном декарбоксилиро-вании а-кетокислот [5,36].

Производное пиридоксина, пиридоксальфосфат, играет роль кофактора во многих реакциях обмена аминокислот (в трансаминировании, декарбокси-лировании с образованием аминов), а также в процессе дыхания [22].

Ниацин (амид никотиновой кислоты) входит в состав никотинамидаде-ниндинуклеатида (НАД и НАДФ), которые служат коферментами многих де-гидрогеназ и играют роль акцепторов и доноров водорода [22,24].

Мезоинозит необходим для роста изолированных тканей и органов, устойчив к свету, термостоек. Наблюдали стимуляцию роста ткани вяза, стимуляцию образования почек камбия (адвентивный эмбриогенез) при внесении этого витамина в среду [5,36,58].

1.3.4. Регуляторы роста

Каллусные ткани, которые в отличие от опухолевых называют нормальными, для поддержания непрерывного роста в культуре нуждаются в стимуляторах роста как ауксинового так и цитокининового типа [5,26,36,19].

Из регуляторов роста группы ауксинов наиболее часто используются при культивировании клеток и тканей растений следующие соединения: индолил-3-уксусная кислота (ИУК), 3-индолилмасляная кислота (ИМК), а-нафтилуксусная кислота (аНУК), (3-нафтоксиуксусная кислота (НОУК), 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д). ИУК имеет самую низкую активность. Это обусловлено, по-видимому, тем, что она легко разрушается ИУК-оксидазой, и происходит образование конъюгатов. Наиболее активна 2,4Д, но ей присуще токсическое действие. НУ К и 2,4Д не подвержены ИУК-оксидазному разрушению. Конъюгирование 2,4Д идет медленнее, чем НУК. Соотношение между активностью ИУК, НУК и 2,4Д зависит также от продолжительности их действия [7,19,36].

Ауксин является одним из факторов органогенеза, он вызывает ризоге-нез. В цепи процессов, определяющих ход ризогенеза индукторная роль ауксина остается пока непонятной. ИУК изучена относительно больше других ауксинов, она образуется в растениях из аминокислоты триптофана через трипта-

мин, индолилпировиноградную кислоту и индолилацетальдегид или через ин-долилпропионовую кислоту, индолилэтиламин, индолилацетонитрил и идо-лилацетоамид. Разрушение ауксинов и, благодаря этому регулирование их уровня осуществляется путем окисления при участии комплексного фермента ауксиноксидазы или ИУК-оксидазы [19,24].

Между концентрацией ауксина и конечной массой ткани в культуре существует определенное соответствие, и могут быть выделены области субоптимальных, оптимальных и сверхоптимальных концентраций. Из-за того, что в средах для культур тканей содержится такое количество ауксина, которого должно хватить на весь длительный период выращивания, клетки в начальный момент культивирования подвергаются воздействию избытка ауксина. Это приводит к тому, что при концентрациях, оптимальных для получения наибольшего конечного эффекта, начальный рост культуры тормозится. Отсюда следует, что действие ауксинов в культурах тканей зависит от чувствительности клеток к их избытку. Для каждого вида подбор осуществляется обычно эмпирически. Видовые различия связаны с разным строением ауксиновых рецепторов, различиями в способности окислять и конъюгировать ауксины [19].

Из группы цитокининов чаще используются следующие соединения: 6-бензиламинопурин (6-БАП), 6-фурфуриламинопурин (кинетин), № изопентиламинопурин, зеатин [5,7]. Цитокинины активируют клеточное деление. В ряде работ показана необходимость присутствия цитокинина для прохождения С2-периода митотического цикла [19,37]. Встает вопрос о характере взаимодействия ауксинов и цитокининов. Помимо культур, нуждающихся в обоих стимуляторах, существуют такие, которым достаточно ауксина. Отсутствие потребности в цитокинине наиболее отчетливо проявляется у культур злаков. Без ауксина эти культуры расти не могут. При опухолевой трансформации с помощью агробакторий клетки кроме ауксин-, приобретают и цитокинин-независимость.

Есть сведения о некоторой взаимозаменяемости ауксинов и цитокининов. Наблюдался одинаковый рост при разных соотношениях ауксина и цитокинина в среде. Уменьшение концентрации ауксина в 10 раз компенсировалось десятикратным повышением концентрации цитокинина. Можно предположить, что цитокинин усиливет синтез эндогенной ИУК в клетках, а также, что под влиянием цитокинина усиливается поглошение ауксина из среды и ослабляется его инактивация [19].

1.4. Способы культивирования

1.4.1. Поверхностное культивирование

Каллусные культуры выращиваются на поверхности полутвердых сред с добавлением агар-агара, других желирующих полимеров, либо на мостиках из фильтровальной бумаги или дисках из пенополиуретана, погруженных в жидкую питательную среду [5,23,36].

Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток ,не имеющую строго определенной анатомической структуры. Цвет массы может быть белым, желтым, зеленым, красным — пигментированным антоцианом полностью или зонально

В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусные ткани бывают: 1) рыхлыми, сильно оводненными, легко распадающимися на отдельные клетки; 2) средней плотности, с хорошо выраженными меристема-тическими очагами; 3) плотными с зонами редуцированного камбия и сосудов (в основном трахеоподобных элементов). Как правило, в длительной пересадочной культуре, на средах, включающих ауксины, особенно 2,4Д каллусные ткани теряют пигментацию и становятся более рыхлыми [5].

В цикле выращивания каллусные ткани после ряда делений проходят обычный для клетки растения онтогенез, они приступают к росту растяжением,

затем дифференцируются как зрелые каллусные клетки и наконец деградируют. Выращивание тканей проводят в термостате. Их можно выращивать как в темноте, так и на свету. Хорошо растущая ткань обычно за 30 — 40 дней увеличивается в весе примерно в 100 раз. Остановка в росте на 30-е сутки может происходить из-за истощения питательной среды, так и из-за старения самой ткани. Чтобы продолжить рост, необходимо перенести каллусную ткань на свежую питательную среду. Сразу же после переноса перед возобновлением роста культура входит в « лаг-фазу», а после периода роста она может перейти в стационарную фазу, что вызвано лимитирующим содержанием одного либо более питательных веществ. Как в «лаг-фазе», так и в стационарной фазе культура может перейти в стрессовое состояние, а это, в свою очередь, приводит к потере жизнеспособности клеток [36].

1.4.2. Глубинное культивирование

Культуры клеток растений, выращиваемые в жидкой питательной среде, обычно называют суспензионными культурами. Отдельные клетки, небольшие группы или достаточно крупные агрегаты (более 50 клеток) выращивают во взвешенном состоянии в жидкой среде. Применяют разные аппараты и способы поддержания их в таком состоянии. Клетки, которые по ряду причин способны к перестройке метаболизма и размножению с высоким коэффициентом в данных условиях суспензионного культивирования, образуют «хорошие линии». Важными характеристиками таких линий является высокая степень дезагрегации (5 — 10 клеток в группе), морфологическая выравненность клеток (небольшие размеры, сферическая или слегка овальная форма, плотная цитоплазма), отсутствие трахеоподобных элементов [8].

Характерной особенностью суспензионных культур клеток растений является их морфологическая и биохимическая гетерогенность. Клеточная популяция обычно содержит клетки, которые сильно варьируют по форме и размеру. Даже тонкодиспергированная суспензия клеток состоит из отдельных клеток ( 50 —60%), клеточных групп (2 — 10 клеток) и неоднородных много-

клеточных агрегатов (100 — 1000 клеток). Уровень агрегированности неодинаков у разных культур [8,36].

Агрегаты могут образовываться в результате неполного расхождения делящихся клеток ( на ранних этапах фазы логарифмического роста ) и в культурах, клетки которых выделяют во внешнюю среду полисахариды. Снизить аг-регированность можно внося низкие концентрации пекто-целлюлазных ферментов.

Выращивание клеточных суспензий в жидкой питательной среде имеет ряд преимуществ перед выращиванием каллусных тканей поверхностным способом. Здесь легче и более воспроизводимо влиять на метаболизм и рост клеточных популяций экзогенными факторами, они удобнее для биохимических и молекулярно-биологических экспериментов, изучения индукции ферментов и связи их с событиями клеточного цикла, экспрессии и репресии генов, изолирования и характеристик мутантов [8,30,95].

Клеточные суспензии получают, помещая каллусную ткань в колбу с жидной питательной средой. Эта суспензия перемешивается на качалке. Для инициации необходимо 2 — 3 г каллуса на 60 — 100 мл среды. Суспензионную культуру можно получить непосредственно из фрагмента органа растения. Однако этот путь более трудоемкий. Рыхлые, оводненные каллусы более пригодны для получения суспензионных культур, чем структурированные. Первичную суспензию перед субкультивированием фильтруют через марлю, нейлоновые или металлические сита [8,38,102].

Одной из особенностей суспензионных культур является зависимость их размножения от одновременного или предшествующего присутствия в среде активно делящихся клеток. Одиночная клетка, помещенная в среду как правило погибает. Индуцировать ее деление можно, помещая одиночные клетки в контакте с растущей каллусной тканью (ткань-«нянька»), или культивируя в среде, где раньше росла суспензия. Активно делящиеся клетки кондиционируют среду, выделяя продукты собственной биосинтетической активности [18,38,145].

Для ростового цикла суспензий характерны три фазы: 1) лаг-фаза — клетки не размножаются и не увеличиваются в размерах; 2) фаза экспоненциального роста — происходит логарифмическое увеличение числа клеток и сухого вещества; 3) стационарная фаза — происходит остановка роста, истощение среды. Для субкультивирования используется суспензия в поздней экспоненциальной или ранней стационарной фазе. Суспензионные культуры требуют регулярного и более частого пассирования, чем каллусные. Перенос иноку-лята осуществляется в стерильных условиях с помощью а) пипеток; б) шприцев; в) просто перенос части культуры в новый объем с градуировкой до метки. Суспензионные культуры сохраняют в процессе пассирования ростовые способности, однако накопление биомассы характеризуется значительными колебаниями от пассажа к пассажу. Для оценки роста суспензионных культур используют следующие критерии: 1) объем осажденных клеток; 2) число клеток; 3) сырая и сухая масса; 4) содержание белка и ДНК; 5) проводимость среды; 6) жизнеспособность клеток [26].

Для глубинного культивирования клеток растений используют способы, разработанные в микробиологии. Наиболее часто применяется периодическая система. Клеточный инокулюм помещается в определенный объем среды и система остается закрытой по всем параметрам кроме газов. В закрытой непрерывной системе периодически подается свежая среда, а старая культура удаляется в том же объеме. Клетки остаются в системе. В открытые проточные культуры периодически или непрерывно поступает свежая питательная среда, однако отбирается не только старая среда, но и часть клеток. Регуляция осуществляется по принципу турбидио- или хемостата. (Принцип турбидиостата заключается в том, что заданная плотность культуры регистрируется реле, связанным с оптической системой. Принцип хемостата — скорость потока задается, для этого питательная среда лимитируется по важным для роста факторам. С помощью фиксированной скорости разбавления поддерживается константная скорость деления клеток). В Японии использовали ферментер объемом

20000 литров для непрерывного культивирования в течение 3-х месяцев клеток табака по принципу хемостата. Продуктивность была очень высокой — 5,58 г/л в сутки сухой массы клеток [43,80,104,109].

Однако наиболее распространенным остается периодическое выращивание. Для аэрации и перемешивания используют : роллеры, качалки, ферментеры с механическими мешалками или барботажного типа, где аэрация и перемешивание осуществляется воздушным потоком [143].

1.4.3. Иммобилизованные клетки

Перспективным подходом к культивированию клеток растений является использование клеток, иммобилизованных на инертном субстрате. При этом исключаются трудности, связанные с физическими свойствами суспензионных культур, их чувствительностью к интенсивному перемешиванию [3].

Для синтеза продуктов вторичного метаболизма гораздо эффективнее применять иммобилизованные клетки растений, а не суспензионные культуры в больших объемах по следующим причинам:

а) можно многократно использовать биомассу (получение которой — дорогостоящая процедура) путем сохранения клеток в ферментере и выделения продуктов из среды;

б) при работе с культурами клеток, продуцирующих экзометаболиты, можно физически отделять клетки от среды и, следовательно, от продуктов вторичного метаболизма;

в) возможности эффективного использования дорогих ферментеров: культивирование большого количества биомассы в сосудах небольшого объема;

г) возможности использования процесса продолжительного культивирования [3,16,23].

Иммобилизация клеток обеспечивает условия, приводящие к дифференциации и способствующие, таким образом, высокому выходу вторичных метаболитов. Иммобилизованные на инертный субстрат клетки, как предполагают, образуют биомассу с меньшей скоростью, чем растущие в жидких суспензионных культурах. Клетки растут в тесной близости друг с другом, между ними устанавливаются определенные контакты. К. Lindsey и М. Yeoman [128] заключили, что структурная организация клеток и скорость их роста являются факторами, определяющими активность вторичного метаболизма этих клеток: агрегированные или структурно организованные клетки обычно накапливали большие количества алкалоидов, и к концу цикла роста культуры синтез вторичных метаболитов превышал синтез первичных продуктов, таких как белки. Авторы объясняют этот эффект отвлечением общих предшественников от первичных путей на вторичные реакции, например синтез фенолов [112,113].

В другой работе этих авторов клетки Capsicum frutescens, иммобилизованные на частицах пенополиуретана продуцировали на 2 — 3 порядка больше экстраклеточного капсаицина, чем свободно суспендированные клетки. F. Majerus и A. Parellex [130] также наблюдали, что иммобилизация в Са-альгинатные подложки стабилизирует клетки Coffea arabica, что приводит к увеличению продуктов индольных алкалоидов. Иммобилизация в Са-альгинатовом геле клеток Cataranthus roseus приводила к такому же эффекту — образование алкалоидов возрастало в 13 раз по сравнению с контролем [72]. Такое действие иммобилизации объясняется улучшением межклеточных контактов, частичной дифференциацией клеток и удлинением стационарной фазы роста, характеризующейся, как правило, максимальной активностью синтеза вторичных метаболитов [45,49,63].

Таким образом, иммобилизация изменяет поведение растительных клеток, имитируя некоторые характеристики ткани в интактном растении.

Растительные клетки достаточно чувствительны к изменениям окружающей среды, и, следовательно, для иммобилизации могут быть использованы

только наиболее мягкие методы. Клетки растений были успешно иммобилизованы в целый ряд различных носителей путем обволакивания полимерной пленкой или врастания в готовые структуры [81]. Известны примеры иммобилизации растительных клеток методом адсорбции и ковалентной сшивки, а также иммобилизации на мембраны различной конфигурации. Растительные клетки наносят на наружную поверхность полой трубки и через нее с относительно высокой скоростью прокачивают обогащенную кислородом среду. При изучении модельной системы было показано, что в полом трубчатом реакторе иммобилизованные клетки Hicine max L. продуцируют фенольные соединения с константной скоростью в течение 700 часов. Следует отметить, что метаболизм клеток в большой степени зависит от размера пор используемой мембраны [143].

Метод ковалентного связывания клеток с твердым носителем применяют достаточно редко. Известен только один пример ковалентной сшивки клеток Solanum aniculare с нерастворимой матрицей из полифенилоксидазы. Носитель активирован глутаровым альдегидом, и после удаления его избытка в гель добавляли суспензию растительных клеток. Иммобилизованные клетки использовали в колончатом реакторе для получения стероидных гликозидов [143].

Для крупных, чувствительных клеток из широко используемых методов применяют включение в гель. Иммобилизацию проводят в стерильных условиях поскольку клетки растут относительно медленно и очень чувствительны к быстро растущим клеткам микроорганизмов. В связи с этим используемый для иммобилизации материал должен выдерживать автоклавирование. Для иммобилизации этим способом известен ряд методик, использующих альгинат, кар-рагинан, ксантан, агар и агарозу. Преимуществами геля агарозы является то, что он стабилен в отсутствии противоионов. Однако механическая стабильность агарозного геля ниже, чем альгинатного или каррагината при одинаковой температуре [81,113].

Другой подход состоит во внедрении клеток в пространства заранее подготовленной заранее I юдготовленной трехмерной структуры (из нейлона, пенополиуретана, металла). Для иммобилизации клеток мака в качестве носителя использовали частицы пенополиуретана в форме кубиков массой 20 — 40 мг. Клетки после перемешивания с частицами носителя быстро проникают в сетчатую структуру, затем прорастают внутрь кубиков и на их поверхности. Вследствие увеличевшегося размера и связывания с матриксом клетки застревают в полостях кубиков. Пенополиуретан является химически нейтральным, хорошо переносит автоклавирование и после тщательной промывки может быть использован неоднократно. Применение пенополиуретана может быть оправдано и для получения продуктов клеточного метаболизма, усиления и регулирования секреторной деятельности ткани: так, в продуктах секреции ткани ели на пенополиуретане увеличивается содержание Сахаров, аминокислот, характерных для фотосинтезирующей культуры [127,128].

При выборе методов иммобилизации растительных клеток следует иметь ввиду их чрезвычайную чувствительность к факторам окружающей среды. Наиболее приемлемыми являются два способа иммобилизации растительных клеток — включение в полисахаридные гели типа альгината и адсорбция на полимерных матриксах, таких как нейлон и полиуретан. Кроме этого необходимо учитывать, что способность клеток растений к образованию вторичных соединений связана со степенью агрегированности культуры. Для достижения хороших межклеточных контактов и формирования градиентов, которые способствуют полной экспрессии генов, ответственных за вторичный метаболизм, необходимо, чтобы клетки в иммобилизованном состоянии могли расти [127,128].

Метод иммобилизации облегчает управление химическим составом среды. Применение сред, лишенных различных питательных компонентов (безфосфатной, безнитратной и др.) на стационарной фазе, способствует повышенному образованию определенных метаболитов. Работы З.Б. Шаминой,

Н.В.Архангельской и др. [2,63] показали, что при максимальном связывании клеток мака с частицами пенополиуретана, их дальнейшее культивирование на полной среде приводит к снижению метаболической активности, а затем и к гибели клеток. Наибольшая продуктивность клеток мака наблюдалась при переносе их в среду, лишенную регуляторов роста и витаминов. Жизнеспособность при этом оставалась на уровне 50 — 60% живых клеток [2].

Также облегчается сбор выделяемых продуктов путем обработки клеток химическими веществами. Можно предположить, что это необходимое условие для увеличения выхода продукта, поскольку снимаются механизмы инги-бирования по типу обратной связи, способные ограничивать синтез веществ вследствие накопления их внутри клетки.

Очевидно, что иммобилизованные клетки имеют преимущества перед каллусными и суспензионными культурами. Но, вместе с тем, иммобилизация создает определенные трудности и ограничения. Разделение субстратов, газов, ионов, ингибиторов и продуктов между иммобилизованной и водной фазами значительно влияет на свойства клеток. Наличие диффузных ограничений снижает эффективность системы и может менять свойства клеток путем создания микроусловий внутри иммобилизационного матрикса, отличающихся от условий в основном растворе. Снизить диффузные ограничения и микроусловия можно уменьшением размера частиц и оптимизацией их формы, повышением концентрации субстрата, увеличением пористости, оптимизацией распределения биомассы внутри частиц и увеличения перемешивания, однако последний фактор существенно замедляет деление клеток [84,88].

Для культивирования иммобилизованных клеток растений можно использовать ферментеры глубинного культивирования типа сосудов с перемешиванием или барботажных колонн [137,138]. В настоящее время конструкции реакторов с носителем, состоящим из множества мелких частиц, представляют собой разнообразные варианты существующих аппаратов, используемых для непрерывно культивируемых суспензионных культур клеток растений. Те из

них, которые представляют собой сосуды большого объема с мешалкой, разновидности аэрируемых башен, перевернутых конических колб и модифицированных аэрлифтных ферментеров для иммобилизованных клеток часто неэффективны. Во всех этих системах на частицы в течение короткого промежутка времени действуют меняющиеся условия перемешивания и аэрации, вызываемые бурлением пузырьков воздуха фактором, который также существенно снижает загрузку сосуда для культивирования биомассой [90,93]. Недостатком этих систем является нерациональное использование объема ферментера, а также повреждение частиц вследствие их механического трения.

Поэтому наиболее приемлемым для крупномасштабного культивирования являются реакторы с прокачиванием или рециркуляцией среды, реакторы, в которых частицы упакованы в колонку, реакторы, в которых частицы упакованы в виде спирали. Эти типы реакторов могут работать при более высоких загрузках биомассы, однако здесь могут встретиться серьезные проблемы, связанные с переносом больших масс питательной среды при низких скоростях протока в этих системах [117,120].

Наряду с питанием клеток важным фактором, определяющим скорость роста и биосинтетическую активность, является аэрация. В существующих типах реакторов аэрация и контакт клеток с питательной средой осуществляется двумя методами: циркуляцией частиц в жидкой среде за счет механического перемешивания, либо постоянным прокачиванием аэрированной среды через колонну с иммобилизованными клетками. При этом важен состав газовой фазы, поскольку с одной стороны чрезмерная аэрация снижает рост культуры, с другой - достаточно высокая содержание растворенного кислорода ( примерно 8%) необходимо для обеспечения высокой скорости биосинтетических процессов [96]. Следовательно требуются специальные устройства, обеспечивающие постоянное поддержание необходимой концентрации кислорода в среде [145]

Поскольку иммобилизованные клетки существуют в гетерогенной двухфазной системе им присущи свои особенности. Первая проблема касается

транспорта субстратов. Он ограничивается извне, так как вещества передвигаются через слой воды, и изнутри, относительно диффузии внутрь частицы. Следовательно меняются свойства клеток. Эти ограничения сводятся к минимуму уменьшением размера частиц и оптимизацией их формы, повышением концентрации субстратов, увеличением скорости перемешивания (для повышения скорости переноса ), а также увеличением пористости частиц.

Вторая существенная проблема касается отрыва клеток от носителя. Обычно биомассу получают до иммобилизации. Но можно использовать системы выращивания биомассы в заранее приготовленном матриксе. В этом случае необходимо ограничивать рост клеток [148].

Существует проблема измерения параметров клеток после иммобилизации, так как после погружения в нерастворимую подложку клетки невозможно прямо отобрать для анализа. Жизнеспособность клеток определяют на тонких срезах иммобилизационного материала. Рост оценивают после растворения матрикса, проводимого для подсчета клеток. Изучение среды внутри частиц носителя также представляет из себя существенную трудность.

Важной проблемой при использовании систем иммобилизованных клеток является выделение продукта. Необходимым условием становится выделение продукта в среду. Однако естественное выделение метаболитов клетками растительных культур встречается крайне редко. Главным образом продукты накапливаются в вакуоли [4,59]. Используют двухстадийные методы культивирования, состоящие в повторных накоплении и извлечении продукта. Однако, если необходимо вновь использовать биомассу, то при обработке следует сохранять целостность мембран растительных клеток [123,126].

1.5. Получение вторичных метаболитов в культуре in vitro

1.5.1 Особенности и функциональное значение вторичного метаболизма in vivo и in vitro

Растения - уникальные источники практически ценных веществ вторичного происхождения, относящихся к следующим основным классам: терпены, флавоноиды, амины, алкалоиды, гликозиды и др. Число идентифицированных соединений вторичного метаболизма составляет на менее 30 ООО. Интерес к данным соединениям обусловлен главным образом их практической значимостью для медицины, парфюмерии, сельского хозяйства, пищевой промышленности [33,34].

В то же время принципиально важным и до сих пор не до конца решенным остается вопрос о физиологических функциях вторичных метаболитов. С одной стороны культура клеток и тканей является удобной моделью для выяснения роли вторичных веществ на уровне организма, с другой - исследование природы и обусловленности синтеза вторичных веществ может открыть возможности регуляции этого процесса в условиях in vitro, что открывает перспективы использования клеточных культур для направленного синтеза ценных продуктов.

A.M. Носов [54] выделяет следующие основные гипотезы, касающиеся функционального значения вторичных метаболитов в растении:

1. Вторичные метаболиты - конечные, тупиковые продукты, "отбросы" первичного метаболизма. Основой этой концепции явились факты накопления веществ специализированного обмена клетки в вакуолях, откуда они практически не востребуются, а также факты выведения их из организма.

2. Вторичные метаболиты - соединения, синтез которых сопряжен с функционированием альтернативных путей первичного метаболизма растения. Эта гипотеза базируется на факте наличия в растении значительного количества альтернативных путей метаболизма (например, альтернативных

путей дыхания), следствием неадекватности которых является возникновение вторичных метаболитов. Таким образом, вторичный метаболизм представляет собой своеобразную "расплату" за устойчивость растения, связанную с дублированием функций первичного метаболизма.

3. Вторичный метаболизм - процесс детоксикации продуктов первичного метаболизма, например, посредством превращения аминокислот, в свободном виде обладающих значительной токсичностью для организма, в алкалоиды.

4. Вторичные метаболиты являются формой запасания и/или транспорта веществ, причем как молекул, так и элементов. Например, алкалоиды -форма запасания азота, гликозиды - Сахаров и т.д.

5. Вторичные метаболиты играют роль в защите растения от абиотических и биотических стрессовых факторов [54].

Наиболее аргументированной, на наш взгляд, является последняя из перечисленных выше гипотез. Однако для нее достаточно сложно найти строгие доказательства, так как в данном случае играют роль надорганиз-менные взаимосвязи. Функции защиты растения от биотических или абиотических стрессовых факторов внешней среды отмечены практически для всех классов вторичных соединений [59]. Наиболее полно это доказано для ин-дуцибельных защитных соединений вторичного метаболизма - фитоалекси-нов. Четко установлено, что синтез фитоалексинов в клетке осуществляется через активацию генов, определяющих синтез ферментов метаболизма этих соединений. Этот процесс запускается элиситорами [71,83,91].

Однако вторичные соединения способны выполнять (и скорее всего выполняют) роль конституционных и полуиндуцибельных защитных соединений. В качестве одного из аргументов в пользу этих функций можно отметить особенность, присущую практически всем классам веществ вторичного метаболизма: наличие механизмов модификации молекулы, которая приводит к значительным изменениям свойств соединения. К таким меха-

низмам относятся: метилирование - деметилирование, гидроксилирование-дегидроксилирование и др. [54]. Посредством этих реакций может осуществляться переход неактивной формы соединения в активную.

Защитные функции свойственны многим, но далеко не всем соединениям вторичного метаболизма. Видимо, в более общем виде можно сказать, что вторичный метаболизм имеет экологические функции в широком понимании слова, т.е. он необходим для существования растения в реальной экологической ситуации. Это логично вытекает из прикрепленного образа жизни интактного растения: все экологические проблемы (защита от стрессовых факторов, привлечение насекомых- опылителей и др.) должны быть решены на биохимическом уровне.

Существует концепция о мультифункциональности вторичного метаболизма. Согласно этой концепции, в процессе эволюции значительно выше вероятность сохранения структур, выполняющих две функции и более [54].

Таким образом, можно постулировать совмещение экологических функций вторичных метаболитов, которые являются главными для этих соединений, с их определенной ролью на уровне организма. Например, алкалоиды во многих случаях являются защитными соединениями (в частности, фитоалексинами), но одновременно они могут участвовать в процессах транспорта и запасания азота.

Изучение вторичного метаболизма в культуре in vitro позволило установить ряд закономерностей:

1 .Практически все классы соединений вторичного метаболизма ( алкалоиды, терпеноиды и терпены, гликозиды, полисахариды, белки, бензохино-ны, эфирные масла, пигменты, витамины, гормоны, инсектициды, воска, пряности) могут быть синтезированы культивируемыми клетками растений.

2. Первичные культуры клеток часто содержат лишь незначительные количества вторичных соединений или не содержат их совсем. Однако со-

держание можно повысить в результате определенных манипуляций с клетками.

3. Не удается получить в культивируемых клетках синтез конкретных соединений (димерных алкалоидов, карденолидов). При этом можно отметить тенденцию: чем сложнее вещества и чем больше специфических этапов его синтеза (после ответвления от первичного метаболизма), тем менее вероятен синтез этого соединения в клеточной культуре [52,54].

4. Достаточно часто синтез вторичных метаболитов улучшается при замедлении или остановке роста культуры. Как частный случай этого положения можно отметить накопления веществ вторичного синтеза в стационарной фазе ростовой кривой [94,144].

5. В ряде случаев синтез вторичных метаболитов начинается только при появлении в клеточной культуре дифференцированных ( морфогенных ) структур [31].

6. Стабильность синтеза вторичных соединений неодинакова для разных классов веществ и для разных клеточных культур. Например, синтез стероидных гликозидов, как правило стабилен, тогда как синтез алкалоидов — нет. Так Morris Р. с соавторами [134] в течение трех лет наблюдали за содержанием алкалоидов ( серпентина и аймалицина ) в трех обычных линиях клеточных культур C.roseus. За два года были отмечены значительные колебания в содержании алкалоидов у 20-дневной культуры каждого пассажа. При продолжительном культивировании увеличивается скорость роста клеток, но это приводило к снижению продуктивности. У одной линии после 5-летнего культивирования образование алкалоидов прекратилось. Однако при отборе у этой линии небольших агрегатов с флуоресценцией удалось восстановить способность к высокому синтезу алкалоидов [92,134].

7. Часто для культивируемых клеток растений характерно увеличение спектра синтезируемых соединений специализированного обмена по сравнению с интактным растением. При этом в ряде случаев отмечается синтез веществ, не характерных для интактного растения (эдулин у Ruta graveolens, ароморин у Stephania cepharanatha) [70].

8. Для метаболизма вторичных соединений в культуре клеток растений можно отметить своеобразный «спуск» по филогенетической, либо онтогенетической «лестнице». Другими словами, специализированный обмен в культуре носит черты филогенетически архаичных групп растений или ювенильной стадии интактного растения. Например, в культуре живокости найдены стерины, не присутствующие в интактном растении, но характерные для филогенетически ранних групп растений. В культуре Papaver bracteatum присутствует сангвинарин и отсутствует тебаин, характерный для взрослого растения. В свою очередь сангвинарин обнаруживается в листьях только в первый год жизни [52,54].

Таким образом, можно заключить, что, во-первых, закономерности синтеза вторичных соединений в клетках in vitro отличаются от таковых в интактных растениях и, во-вторых, установленные закономерности этого процесса в культуре клеток противоречивы.

Принципиально важными особенностями культур клеток растений как искусственно созданной биологической системы являются следующие:

1. Освобождение клеток от регуляторных систем организма, т.е. выход из-под организменного контроля развития.

2. Наличие большого количества фенотипически нереализованной генетической информации, перешедшей "по наследству" от исходного растения. Этим в большой степени определяется пластичность популяции культивируемых клеток.

3. Возникновение популяционных механизмов контроля развития, которые определяют вектор отбора клеток в сторону интенсивной и/или устойчивой пролиферации [52,54].

На основании изложенного можно сделать некоторые заключения о закономерностях вторичного метаболизма в клетках in vitro.

Если принять, что главная функция вторичного метаболизма для ин-тактного растения - экологическая, т.е. значима на надорганизменном уровне, вторичный метаболизм должен исчезнуть в культуре клеток.

Интенсификация вторичного метаболизма в культуре клеток возможна путем направленной селекции и под действием сигналов, запускающих вторичные процессы в растениях (элиситоры, стресс) [52,54].

Однако, если принять во внимание принцип мультифункциональности вторичного метаболизма, вполне вероятно, что одна из его второстепенных функций в случае культивирования клеток in vitro может оказаться главной, т.е. полезной для интенсивной или устойчивой пролиферации клеток. В этом случае синтез вторичных метаболитов должен быть достаточно интенсивным и стабильным при пассировании клеток [54].

1.5.2. Проблема регуляции вторичного синтеза в культуре in vitro

Многочисленные литературные данные свидетельствуют о том, что вторичный метаболизм в культуре тканей не только определяется генотипом растения, но и в большой степени зависит от внешних условий. Это значит, что варьируя химическими и физическими факторами можно реально добиться такого же уровня вторичного синтеза, как и в интактном растении и даже превысить этот уровень [132,146,151].

Вопрос контроля вторичного метаболизма в культуре in vitro клеток и тканей растений долгое время оставался открытым. Это связано в первую очередь со сложностью живой клетки и определенными ограничениями в ис-

следовании изменений, возникающих в процессе воздействий на клеточные структуры. И хотя культура клеток и тканей во многом облегчает задачи физиологов, далеко не все процессы удается отследить, особенно при многофакторном воздействии на клеточные процессы. А.М.Носов [52] выделил основные этапы возможной стратегии контроля специализированного обмена в клетках in vitro

Первым этапом является выбор вида растения и выбор конкретного растения-донора. Правильный выбор конкретного растения-донора во многом облегчает и упрощает задачу максимального получения необходимых веществ. Поэтому на первом этапе работы важно определить какие именно виды растений являются продуцентами и суперпродуцентами искомых веществ [52].

Установлено, что высокопродуктивные по содержанию алкалоидов донорные растения барвинка розового дают каллусы с высоким содержанием аймалицина и серпентина; в каллусах, полученных из этих растений, содержание алкалоидов оказалось в среднем в 45 раз выше, чем в каллусах, полученных из низкопродуктивных растений. Однако вариации в содержании алкалоидов в обоих случаях велики (до 100-150 % от среднего) [75].

В других случаях корреляция между содержанием алкалоидов в ин-тактных растениях и полученными из них каллусами не обнаружены. В частности не было корреляции в содержании берберина у донорных растений и в соответствующих культурах клеток василисника [115]. Каллусы были получены из 17 растений, в надземной части которых содержалось берберина от 0 до 0,6 %. Содержание алкалоида в каллусах находилось в пределах 1,3% и не коррелировало с его количеством в донорном растении, но было достаточно стабильно в течение 10 пассажей. Количество берберина при переводе культуры в суспензию изменялось, но коррелировало с его исходным содержанием в исходном каллусе [66,115].

Возможно, эти противоречивые результаты объясняются тем, что оценка исходного генотипа определялась только по фенотипу. Таким образом, результаты по корреляции между содержанием вторичных метаболитов в растении-доноре и соответствующей клеточной культуре неоднозначны.

Вторым этапом стратегии контроля вторичного синтеза является выбор органа растения для введения в культуру. Изучая вопросы синтеза БАВ в растительной клетке необходимо выяснить, как и где синтезируется максимальное количество искомого вещества, важно определить место синтеза и время синтеза вещества, а также его компартмент [52].

В литературе достаточно широко представлен материал о влиянии эпи-генетческих характеристик экспланта на качественный и количественный состав вторичных соединений в культуре клеток [13,17,27,29]. В ряде случаев клеточные культуры синтезируют вещества, характерные для ткани экспланта. Например, культура клеток, полученная из корня подофилла, содержала подофилотоксин, тогда как в культуре стеблевого происхождения он отсутствовал; содержание диосгенина в культуре клеток диоскореи (Dioscorea floribunda), полученной из клубня, было на порядок выше, чем в клеточной культуре, полученной из побега. Однако значительно чаще наблюдается тотипотентность клеточных культур в отношении синтеза вторичных соединений. По данным, полученным в отделе биологии клетки и биотехнологии ИФР А.С.Воробьевым с соавт. [13], клеточная культура диоскореи дельтовтдной штамм ИФРДМ0,5 содержит два фуростаноловых гли-козида протодиосцин, характерный для листа, и дельтозид, содержащийся в корневище интактного растения. По данным Р.Г.Бутенко и А.Г.Волосовича [17], культура клеток раувольфии змеиной стеблевого происхождения содержит как основной алкалоид стебля серпентин, так и аймалицин, находящийся в корне интактного растения.

После практической реализации двух первых этапов, получения и исследования ростовых и биохимических характеристик каллусной ткани вы-

бранного объекта возникает необходимость селективного отбора быстрорастущих тканевых клонов, являющихся продуцентами веществ вторичной природы. В процессе изучения развития тканей выделяются клоны, так или иначе подвергшиеся воздействию мутагенов (таких как регуляторы роста, жесткое УФ-излучение, температурные воздействия и т.д.) [52].

Культуры клеток растений характеризуются большой степенью генетической гетерогенности клеток в популяции [39]. При этом гетерогенность на разных уровнях организации генома на уровне точковых мутаций, хромосомных перестроек, наборов хромосом, и наконец, цитоплазматических генов. В качестве основных причин гетерогенности выдвигаются: а) гетерогенность исходных эксплантов; б) мутационный эффект компонентов среды культивирования; в) эффект отсутствия организменного контроля [52].

Эта гетерогенность клеточной популяции позволяет с помощью клонирования отбирать линии клеток с сильно измененными свойствами, в частности с повышенным синтезом вторичных метаболитов. Таким способом, были отобраны штаммы продуценты шиконина, аймалицина, серпентина, берберина [12,20]. Однако судьба отобранных клонов при длительном культивировании различна: в одних случаях синтез вторичных соединений в клонах не стабилен и возвращается на уровень исходной культуры (например, синтез резерпина в раувольфии змеиной, алкалоидов в барвинке розовом), в других случаях клон достаточно стабилен (линии табака, продуцирующие витамины В-6, убихинон (}10, никотиновую кислоту) [17,37]. Причины такого различия в поведении клонов не ясны, о чем будет сказано ниже. Наконец, максимальные изменения генома культивируемых клеток могут быть получены в результате индуцированного мутагенеза. В полученных мутантных штаммах возможны резкие качественные и количественные изменения синтезов вторичных соединений [52].

В работах с культурой клеток диоскореи дельтовидной [13,142] было показано, что штаммы, полученные в результате химического индуцирова-

ного мутагенеза, существенно отличаются по синтезу стероидных сапонинов. Исходный штамм ИФРД1 содержит стероидные сапонины с двумя агли-конами диосгенином и его 8 изомером по 25-му атому углерода ямогени-ном. При этом сапонины находятся в двух формах фуростаноловой (дельтозид и протодиосцин) и спиростаноловой (дельтонин и диосцин спи-ростаноловые аналоги дельтозида и протодиосцина). Содержание диосгени-на и ямогенина достаточно низкое 0,3-0,5% к сухой биомассе клеток. Соотношение разных сапонинов в цикле выращивания колеблется достаточно сильно.

В мутантных штаммах ИФРДМ-8ак и ИФРДМ-1 наблюдается в целом такая же картина, но преобладающим является один из агликонов: в первом штамме диосгенин, во втором ямогенин. Отмечены изменения в соотно-шенши фитостеринов. Штамм ИФРДМ0,5 отличается от исходного наиболее радикально. Во-первых, содержание диосгенина в этом штамме на порядок выше (6% к сухой массе), во-вторых, в этом штамме полностью отсутствует ямогенин, и, наконец, уникальной особенностью штамма является полное отсутствие споростаноловых гликозидов [13,53]. Как уже отмечалось, штамм содержит только протодиосцин и дельтозид, при этом соотношение этих сапонинов весьма постоянно при различных условиях культивирования. По всей видимости, в штамме отсутствует активность эндогенной Ь-глюкозидазы.

Следующим важным этапом является оптимизация условий роста и синтеза вторичных соединений. Поскольку регуляция синтеза алкалоидов и других вторичных метаболитов может находиться под эпигенетическим контролем, любые изменения в цитоплазме могут привести к количественным или качественным изменениям в образовании вторичных метаболитов. Ци-топлазматическое окружение генома — динамическая система, которая сама находится под влиянием окружающей среды [2,52].

Из внешних условий на метаболизм влияют два важных фактора окружающей среды: уровень освещения и температура.

Свет включает образование антоцианов в культивируемых клетках Haplopappus gracilis, при этом эффективным является синий свет. Синтез ка-техинов и проантоцианидов в каллусе и суспензии Craetaegus sp., Ginkgo biloba происходит только на свету [32]. Свет увеличивает содержание эпика-техинов и проантоцианидов в культуре клеток чая, серпентина в барвинке, витамина В-6 и суммы алкалоидов в дурмане и руте. Красный свет увеличивает синтез подофиллотоксина в культивируемых клетках подофилла. В то же время свет часто выключает или снижает синтез вторичных соединений. Синтез гиосциамина и скополамина в культуре дурмана происходит только в темноте, освещение снижает содержание алкалоидов в клетках хинного дерева, шиконина в культуре клеток воробейника. В последнем случае показано, что свет разрушает ФМН, необходимый для синтеза шиконина [32,89,142].

Освещение стимулировало синтез алкалоидов в стеблевом каллусе. В освещенной стеблевой каллусной культуре были обнаружены виндолил и ка-тарантин, которые являются предшественниками синтеза димерных алкалоидов винкристина и винбластина [78,142].

Влияние температуры на синтез вторичных соединений изучалось лишь в нескольких работах. Показано, например, что оптимум синтеза никотина в клетках табака находится при 27° С, уклонение на 5 в любую сторону приводит к снижению синтеза более чем в 3 раза [33].

Факторы, связанные с самой культурой, то есть состав питательной среды, жизнеспособность, газовое окружение составляют сложную многокомпонентную систему, подход к изучению которой остается эмпирическим. Наиболее важными из внутренних факторов культивирования являются: факторы среды (регуляторы роста, минеральное питание, источники углеро-

да), наличие предшественников синтеза вторичных метаболитов, фактор элиситации, газовый состав и уровень аэрации, рН среды [52].

Использование ауксинов как непременных компонентов питательных сред, необходимых для успешного роста культур тканей, и как средства управления их морфогенезом обусловило необходимость оценки его влияния на биосинтез и содержание вторичных веществ в них. Так как биосинтез вторичных веществ в растении приурочен к определенным органам и тканям, а часто и к отдельным специально дифференцированным клеткам, роль ауксина в регуляции их содержания может быть двоякой. В одних случаях его действие может быть непосредственным, то есть вызывать прямые изменения в активности ферментов, синтезирующих и метаболизирующих вторичные вещества, в других — ауксин влияет на синтез вторичных веществ постольку, поскольку изменяет характер роста и морфогенеза культур тканей, вызывая или подавляя образование специализированных клеток, тканей, органов, продуцирующих вторичные вещества. При этом он очевидно, оказывает лишь косвенное влияние на накопление вторичных веществ [19,107].

В большинстве случаев синтез алкалоидов уменьшался под влиянием ауксинов. Особенно отчетливо это показано в культурах тканей и клеток табака, где содержание никотина резко уменьшалось при использовании повышенных концентраций ауксина в среде [19]. Следует отметить, что особенно отчетливое подавляющее действие ауксины оказывали на каллусы корневого происхождения, тогда как в культуре листового каллуса эффект отсутствовал. Интересно также, что при очень низкой концентрации НУК (0,01 мг/л ) содержание никотина было меньше, в 5 раз, чем при 0,1 мг/л [19]. Можно предположить, что для синтеза никотина ауксин необходим, но в значительно более низких концентрациях, чем для стимуляции размножения клеток. Увеличение концентрации НУК от 1 до 11,5 мкМ приводило к уменьшению содержания путресцина, который является предшественником

никотина и возникает из орнитина под влиянием орнитин-декарбоксилазы [48].

Моррисом с соавторами проведено сравнение различных питательных сред, предложенных как продукционные среды для активации синтеза алкалоидов в культуре клеток Catharantus roseus [50]. Сравнивалось действие различных регуляторов роста на рост клеток и синтез в них алкалоидов. Установлено, что 2,4Д является фактором, лимитирующим содержание в клетках алкалоидов. Во всех случаях увеличение концентрации 2,4Д в питательных средах вызывало снижение содержания алкалоидов в клетках [48].

Ауксины стимулировали синтез антоцианов в культуре моркови и тополя, антрахинонов в Cassia fistula, сапогенинов в тригонелле; уменьшали и исключали синтез антрахинонов и шиконина в воробейнике, скополамина в гиосциамусе, хлорогеновой кислоты в табаке. Достаточно часто влияние ауксинов на синтез вторичных соединений зависит от их природы. Так, синтез никотина в табаке стимулируется НУК и ИУК, но тормозится 2,4Д; синтез антоциана и нафтохинонов в клетках культуры Plumbago zeylanica, наоборот стимулируется повышенными концентрациями 2,4Д и тормозится ИУК и НУК. В целом 2,4Д чаще, чем ИУК и НУК, отрицательно влияет на вторичный метаболизм [19,32].

М.Сакута и А.Коммане [144] определили два типа взаимоотношений между ростом культур и синтезом вторичных веществ: 1) рост и синтез вторичных соединений антагонистичны; 2) условия, способствующие росту, усиливают синтез вторичных веществ. В соответствии с этим, ауксин, как фактор, необходимый для роста культур тканей и клеток, по разному влияет на синтез вторичных соединений. Характер этого влияния зависит от типа синтезируемых веществ, от вида культур тканей и происходящих в них мор-фогенетических процессов.

Результатов по влиянию цитокининов на синтез вторичных метаболитов существенно меньше, что не позволяет уловить какие-либо закономерно-

сти. БАП в концентрации 10-8 М стимулировал синтез стероидных сапоге-нинов в паслене, кинетин (5—10 М) также стимулировал синтез алкалоидов в скополии, но полностью ингибировал синтез никотина в табаке [48,106].

Стимуляция аккумуляции индольных алкалоидов в присутствии цито-кининов изучалась в суспензионной культуре Catharantus roseus французскими исследователями. В работе была описана стимуляция цитокининами образования аймалицина и серпентина в двух опухолевых и одной нормальной клеточных линиях. Добавление цитокининов в культуральную среду стимулирует накопление ацмалицина и серпентина в тканях C.roseus. Интенсивность аккумуляции алкалоидов зависела также от концентрации цитокининов, типа клеточной линии, фазы роста клеточной линии в момент обработки [47,48].

Минеральный состав сред оказывает большое влияние на синтез вторичных соединений, при этом наиболее важно содержание фосфора, калия и различных форм азота [111,119,140,142]. Высокие концентрации фосфора в большинстве случаев приводят к улучшению роста культуры и ухудшению синтеза вторичных метаболитов. Их синтез начинается обычно после исчерпания фосфора из среды. Высокие концентрации фосфора в среде снижают синтез никотина в культуре клеток табака, антоцианов в культивируемых клетках моркови, фенолов в клетках чая. В то же время имеются сообщения о повышении содержания вторичных соединений при повышенных концентрациях фосфора — алкалоидов в культуре барвинка розового, антрахинонов в клетках Galium sp.

Показано, что как для роста, так и для синтеза вторичных соединений необходимы минеральные формы азота. Органические формы — пептон, дрожжевой экстракт и другие — тормозят и рост и синтез. Очень важно соотношение аммонийного и нитратного азота. Можно проследить определенную тенденцию — повышение доли нитратного азота способствует увеличе-

нию синтеза вторичных веществ, в частности диосгенина в культуре клеток диоскореи [58,119,140].

Как показано в многочисленных работах, культуры могут расти на различных углеводах (испытано более 30 различных соединений). Как правило, лучший рост отмечается на двух сахарах глюкозе и сахарозе. В то же время высокий уровень синтеза свойственен культурам на сахарозе. Использование исходно повышенных концентраций сахарозы обычно приводит к увеличению выхода вторичных метаболитов в культурах [36]. Другие углеводы проигрывают по сравнению с сахарозой. Глюкоза способствует быстрому росту и ингибирует катаболизм, а следовательно заметно тормозит вторичный метаболизм.

По влиянию рН среды на синтез вторичных соединений данных очень немного. Их отсутствие определяется, видимо, в определенной степени сложностью постановки эксперимента. Однако по имеющимся данным, рН среды существенно влияет на этот процесс. Например, при изучении синтеза индола в культуре клеток ипомеи в условиях рНстата оказалось, что синтез индола максимален и в 2 раза превышает уровень синтеза без рН-статирования. В рН-стате при рН 4,8 синтез полностью прекращается [32,105].

Большое число работ посвящено влиянию предшествеников синтеза на выход вторичных метаболитов [125,134,149]. В большинстве случаев влияние предшественников не приводит к существенному увеличению синтеза. Так, добавление в среду культивирования диоскореи холестерина в концентрации 100 мг/л вызывало в лучшем случае включение в диосгенин менее 1% внесенного стерина, добавление в культуру барвинка розового триптамина также привело лишь к незначительному увеличению синтеза вторичных соединений в культуре. По всей видимости, для синтеза вторичных соединений в культуре определяющим фактором концентрация предшественников не является.

Особую группу стимулирующих факторов представляют собой элиси-торы. Это вещества, выделенные из микроорганизмов, грибов и ответственные за стимуляцию определенной стадии вторичного метаболизма. Они способствуют индукции образования фитоалексинов (веществ, принадлежащих к различным группам соединений типа изофлаваноидов, терпеноидов, полиацетиленов, дигидрофенантренов) — частичного механизма защиты от патогенов. Механизм — активация фенилаланин-аммиак лиазы и следовательно стимуляция вторичного синтеза [71,83,91,103,124].

Еще одним очень важным фактором является аэрация. Важно как значение расхода кислорода, так и соотношение С02 /02 [121,122]. Высокое отношение 02 /С02 может ингибировать и рост и синтез вторичных продуктов. С одной стороны, чрезмерная аэрация замедляет рост культуры, с другой — достаточно высокое содержание растворенного кислорода ( около 8% ) необходимо для обеспечения высокой скорости вторичных биосинтезов. Проблема аэрации тесно связана с перемешиванием. При выращивании в конических колбах на качалках большое значение имеет объем культуры и скорость перемешивания (влияет на коэффициент массопередачи кислорода ). В работах Константиновой, Строгова и др. [38] исследовано влияние интенсификации газового массообмена на выход шиконина в культурах воробейника и макротомии. При увеличении коэффициента массопередачи от 10 до 30 ч"1 путем изменения объема заполнения колб и частоты вращения качалки наблюдали повышение выхода шиконина в 4 раза благодаря существенному повышению его содержания в биомассе, тогда как выход биомассы в общем снижался. При малых объемах возрастал синтез никотина в культуре табака. При использовании ферментеров, большое значение имеет способ перемешивания и подачи воздуха [25,30]

Следующий подход к возможности повышения выхода вторичных продуктов в культуре in vitro — изучение путей биосинтеза полезных метаболитов с целью регуляции активности ключевых ферментных систем [52].

Пути биосинтеза различных соединений в культуре клеток известны достаточно хорошо. Нет серьезных оснований считать их отличными от путей биосинтеза данных соединений в интактном растении. В ряде случаев схемы биосинтеза были установлены именно в культуре клеток растений, а затем трансформированы на интактные растения [54].

Ферментные системы, осуществляющие реакции синтеза вторичных метаболитов изучены хуже. Известен ряд ключевых ферментов синтеза основных классов веществ специализированного обмена ( например, ферменты «ответвления» от первичного метаболизма; фенилаланинаммиаклиаза — синтез фенолов; триптофандекарбоксилаза, лизиндекарбоксилаза — синтез алкалоидов и др.) [4,24,86,87]. Для немногих случаев установлены ферменты всей цепочки биосинтеза. Например, для культуры клеток Coptis japónica охарактеризованы семь ферментов, осуществляющих синтез берберина [98,99,101].

Наиболее сложный и наименее изученный вопрос — регуляция активности этих ферментов. Установлено, что исключение из среды культивирования 2,4Д при выращивании культуры клеток моркови приводит к синтезу de novo м РНК ферментов халконсинтазы и ФАЛ-лиазы, синтезу этих ферментов, в конечном счете к синтезу и накоплению антоцианов в клетках [33,34,35]. Добавление 2,4Д к антоциансинтезирующим клеткам приводит к быстрому снижению мРНК и соответствующих ферментов. Установлено, что разные факторы (УФ облучение, свет, 2,4Д и др.) приводят к координированному увеличению активности ферментов фенилпропаноидного метаболизма : ФАЛ-лиазы, n-гидролазы транскоричной кислоты в культуре клеток петрушки [52].

Таким образом, контроль синтеза вторичных метаболитов в культуре клеток растений in vitro включает в себя следующие этапы:

1) Выбор вида растения, конкретного растения-донора (генетика экс-планта); 2) выбор органа растения для введения в культуру (эпигенетика экс-

планта); 3) селективный отбор быстрорастущих клонов — продуцентов веществ вторичной природы (генетика популяции клеток); 4) оптимизация условий роста и синтеза вторичных соединений (физиология популяции клеток); 5) регуляция активности ферментных систем, осуществляющих синтез целевых продуктов (биохимия синтеза). Однако эффективно использовать представленную стратегию на данном этапе развития биотехнологии не представляется возможным ввиду наличия многих значимых факторов и неизученности отдельных этапов.

1.6. Образование и метаболизм берберина и протобербериновых алкалоидов

Алкалоиды протоберберинового ряда входят в большую группу бензи-лизохинолиновых алкалоидов [115,116]. В основе строения протобербериновых алкалоидов лежит тетрациклическая структура, включающая изохино-линовое звено и восстановленный) систему хинолизина. У берберина хино-лизиновое кольцо конденсировано с двумя бензольными ядрами, причем центральный атом азота считается кватернизированным. Данные алкалоиды выделяются из растений, как правило, в виде четвертичных аммонийных солей.

Для всего ряда алкалоидов характерен общий путь биосинтеза через окислительную конденсацию бензилизохинолиновых фрагментов, главным этапом которой является образование (8)-ретикулина. Это соединение является ключевым в схеме образования многих родственных структур, лежащих в основе морфиновых, протопиновых, бисбензилизохинолиновых и др. алкалоидов, включая и протобербериновые [118,135].

Использование каллусных культур в изучении образования этих алкалоидов немало способствовало выяснению механизмов биосинтеза, с одной стороны, благодаря простоте введения меченых веществ, а с другой — вследствие высокого содержания ферментов, ответственных за это направ-

ление метаболизма. Рисунок 1. показывает последовательность образования (8)-ретикулина из Ь-тирозина.

ХГ-

но

«н, и

XXX

соон

НО

У

Тирании

I,-Тирозин

НО

хпг

соон

^ - Гадроксасренилпируёат 1дроксшренил -

Г ' ащетальоегио

Н3С0

БАМ 5АН

НО

{$)-Норка клаурин

НО

(б) ~ Коклаурим

Г\ ЗАМ вАН

н3со

и-сн,

НО" но *

(Б ) - Ы - Метилкоклаурин (5) ~ 3Гидрокси - N - Штилкоклаурин

и-сн,

ЗАМ ЭАН

(5) - Ретикулин

Рис.1 Последовательность образования (8)-ретикулина из Ь-

тирозина [67]

Ферменты, участвующие в реакциях: 1 — Ь-тирозин-декарбоксилаза; 2 — фенола-за; 3 — Ь-тирозин-трансаминаза; 4 — р-гидроксифенилпируватдекарбоксилаза; 5 — (Б)-норкоклауринсинтетаза; 6 — норкоклаурин-6-О-метилтрансфераза (6-ОМТ); 7 — тетра-гидробензилизохинолин-Ы-метилтрансфераза( коклаурин-Ы-метилтрансфераза); 8 — фе-нолаза; 9 — (8)-3-гидрокси-К-метилкоклаурин-4-0-метилтрансфераза (4-ОМТ).

Рис.2, представляет схему биосинтеза основных алкалоидов протобер-бериновбго ряда — берберина, ятрорризина и пальматина.

ОСН,

(S) ~ Ретикулин

Колумбами»

е С S) ~ Тетрагидроколумбамин

0СН3 0СН3

Н3С0

Н3С0

Берберин

Пальматин

Н3С0

Ятрорриьин

Рис.2 Этапы биосинтеза протобербериновых алкалоидов [67] Ферменты, участвующие в реакциях: 1 — фермент ВВЕ (berberin bridge enzime); 2 8-аденозил-Ь-метионин: (8)-скоулерин-9-0-метилтрансфераза; 3 — (S)-

тетрагидропротоберберин оксидаза (8ТОХ); 4 — берберин-синтетаза; 5 — метилтрансфераза.

Приведенные в схемах этапы биосинтеза протобербериновых соединений прослеживаются у многих растений, принадлежащих к разным семействам — ВегЬепёасеае, Рарауегасеае, Мешзрегшасеае. По-видимому, этот путь

— основной для образования протобербериновых алкалоидов в растительном царстве [129,135].

Знание метаболической последовательности и ключевых ферментов биосинтеза протобербериновых алкалоидов предоставляет широкие возможности для управления отдельными этапами этого процесса. Так, при изучении действия цитокининов на активность семи ферментов, участвующих в ранних этапах и одном из последних шагов биосинтеза берберина, оказалось, что добавление БАП в наибольшей степени активизирует норкоклаурин-О-метилтрансферазу и содержание берберина возрастает пропорционально активности НКМТ или концентрации БАП [73,67].

Кроме того, широкое применение за последние десять лет получили элиситоры — олигосахариды из экстракта дрожжей или патогенных грибов

— как соединения, вызывающие повышение биосинтетической активности в культуре растительных клеток. Как выяснилось, для культуры клеток Т11аНс-1тит п^овит увеличение содержание берберина после обработки элисито-рами обусловлено активизацией тирозиндекарбоксилазы, которой отводится роль ключевого фермента между первичным и вторичным метаболизмом в биосинтезе берберина [108].

В культивируемых клетках, а также в дифференцированных тканях растений четырех родственных семейств: ВегЬепс1асеае, Капипси1асеае, Ме-шзрегтасеае, Аппоасеае — обнаружены специфические структуры, представляющие собой везикулы из гладких мембран диаметром 0,1—1,0 мкм и плотностью 1,14 г/мл. В опытах с клетками коптиса показано, что такиих структур особенно много в высокопродуктивных линиях, а в линиях, не про-

дуцирующих берберин, они отсутствуют. Выделенные везикулы имеют характерную желтую окраску и содержат протобербериновые алкалоиды в тех же соотношениях, как и культивируемые клетки. В большинстве культур содержащие алкалоиды везикулы могут сливаться друг с другом и с центральной вакуолью, транспортируя таким образом алкалоиды в центральную вакуоль. Дальнейший синтез алкалоидов в вакуоли, по-видимому, маловероятен в силу высокого содержания в ней ионов водорода. У большинства культур превращение алкалоидов на этом заканчиваются, но у некоторых, например у клеток Thalictrum minus, возможно выделение алкалоидов в среду. В том и в другом случае, вероятно, имеют место защитные механизмы, обеспечивающие жизнедеятельность клеток в присутствии токсических концентраций алкалоидов, которые способны ингибировать рост клеток [4,74].

Транспорт берберина в клетках василистника является, по-видимому, высокоспецифичным процессом, так как выделение берберина в среду со-провождаеися эндогенным накоплением магнофлорина. Транспорт зависит от температуры и подавляется ингибиторами плазменно-мембранной АТФ-азы: ванадатом натрия и диэтилстильбэстролом, что может указывать на участие в выделении берберина активного транспорта [67,76].

Близкие закономерности были установлены также и для процессов поглощения из среды экзогенного берберина, что может указывать на родство этих двух противоположно направленных процессов. Возможно, они осуществляются одним и тем же обратимым механизмом. Из двух исследованных видов василистника клетки T.flavum синтезировали берберин, но накапливали его в вакуолях. Клетки Т. dipterocarpum выделяли берберин в среду только во время экспоненциальной фазы роста, а затем содержание алкалоида снижалось вплоть до его полного исчезновения. На поздних стадиях экзогенно внесенный берберин поглощался клетками из среды. Такая обратимость характерна для процессов метаболизма, которые находятся в клетке под контролем как генетических, так и эпигенетических механизмов.

1.7. Перспективные методы культивирования клеток растений для получения берберина и протобербериновых адкалои-дов

Для получения берберина и протобербериновых алкалоидов используются культуры клеток растений родов Berberus L., Coptis japónica и Thalic-trum L.

В исследованиях культур клеток барбариса установлено, что основным алкалоидом, накапливаемом культивируемыми клетками, является ятрорри-зин, а второстепенными - берберин, колумбамин и пальматин. Например, каллусная культура Berberus aggregata накапливала в присутствии 0,1 мг/л 2,4-Д 3% алкалоидов в расчете на сухую массу ткани. При этом на ятрорри-зин приходилось 76%, колумбамин - 14%, пальматин ~ 6%, берберин -4%.[110,118]

В каллусных культурах Coptis japónica основное содержание алкалоидов приходилось на берберин и ятрорризин [100]. Увеличение продуктивности культуры до 2 - 4% берберина от массы сухих клеток было достигнуто за счет оптимизации условий выращивания и селекции путем клонирования небольших клеточных агрегатов. Увеличение выхода берберина достигалось за счет увеличения в клеточной популяции числа клеток с высоким содержанием берберина, а не за счет увеличения содержания берберина во всех клетках [114,131,133].

В каллусной культуре Thalictrum minus L. основным алкалоидом, содержание которого достигало 0,67% от массы сухих клеток, был берберин, содержание других алкалоидов было менее 0,1% [115]. Суспензионная культура обнаружила способность выделять в среду значительную часть синтезируемого берберина [136].

Таким образом, перспективным методом получения берберина и про-тобербериновых алкалоидов является суспензионное культивирование высокопродуктивных клеточных линий, выделенных путем селекции и клонирования. Для получения в качестве конечного продукта собственно берберина наиболее подходящим объектом являются клетки Thalictrum minus L, у которых содержание берберина намного выше, чем других алкалоидов этой группы. Для получения ятрорризина перспективно использовать клетки Coptis japónica.

Способность культуры клеток Thalictrum minus L. к экзометаболизму открывает новые перспективы в получении берберина. Использование методов иммобилизации клеток на инертный носитель позволит существенно повысить эффективность процесса. Иммобилизованные клетки, выделяющие продукт в среду, не требуют специальной химической обработки, и, следовательно, сохраняют целостность мембран и жизнеспособность. Их многократное использование при соответствующих условиях может увеличить выход целевого продукта в несколько раз.

Заключение

В настоящее время вопросы получения вторичных метаболитов растений представляют значительный практический и научный интерес. Кроме того, в связи с интенсивной эксплуатацией природных запасов лекарственных растений, остается актуальной проблема сохранения генофонда многих видов. Методы культивирования тканей и клеток растений in vitro позволяют альтернативным способом получать растительное сырье, содержащее активные вещества.

Согласно литературным данным, генетические и эпигенетические факторы в условиях in vitro в значительной степени влияют на рост клеток и накопление биологически активных веществ. Генетическая составляющая име-

ет значение при получении высокопродуктивных клеточных линий. Правильный выбор растения-донора значительно облегчает задачу максимального получения необходимых веществ. Генетическая гетерогенность растительных клеток в популяции позволяет клонировать линии в повышенным синтезом вторичных метаболитов.

Эпигенетические факторы в большей степени влияют на вторичный синтез в культуре клеток, чем генотип исходного растения. Поэтому оптимизация условий культивирования является важнейшим этапом повышения продуктивности культуры. Известно, что на выход алкалоидов влияет соотношение минеральных и органических компонентов среды для культивирования, регуляторов роста, а также кислородный баланс.

Поскольку интенсивность вторичных процессов связана со степенью дифференциации, структурированностью ткани, большое значение имеет способ выращивания ткани. Поверхностное культивирование характеризуется наибольшей степенью дифференциации клеток, но при этом отличается медленным ростом. Условия глубинного культивирования способствуют образованию более гомогенной культуры, быстрорастущей, но как правило синтезирующей меньше необходимых продуктов. Иммобилизованные клетки обладают рядом преимуществ. Иммобилизация создает благоприятные условия для дифференциации, и, следовательно, повышается выход полезных продуктов, дает возможность многократно использовать биомассу.

Анализ литературных источников показал, что культура ткани Thalic-trum minus L. — наиболее приемлемый объект для получения берберина. Наиболее перспективным способом культивирования является иммобилизация клеток на инертный носитель.

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Скуратова, Елена Валерьевна

ВЫВОДЫ

1. Из дикорастущего растения-донора была получена высокопродуктивная каллусная культура Thalictrum minus L., способная не только синтезировать берберин, но и выделять значительное его количество в среду культивирования.

2. Процессы накопления биомассы и синтеза берберина в культуре Thalictrum minus L. зависели в большей степени от содержания регуляторов роста ауксинового типа. Присутствие в питательной среде 2,4-Д (0,5 - 0,25 мг/л) стимулировало неограниченный рост культуры, тогда как присутствие НУК (10мг/л) в сочетании с БАП (0,8 - 2мг/л) активизировало синтез берберина.

3. Замена 2,4-Д на НУК в питательной среде приводила к увеличению экзо-метаболизма берберина более чем в три раза. Содержание берберина в среде возрастало при переходе на НУК от 1,31 ± 0,12 до 4,60 ± 0,25 мг/г сух. массы. На основании экспериментальных данных разработаны представления об обусловленности и физиологическом значении экзометаболизма берберина в культуре Thalictrum minus L.

4. При суспензионном культивировании клеток Thalictrum minus L. существенной особенностью являлось выделение большей части синтезируемого берберина в среду культивирования. Так, в среде содержалось до 2,1 ±0,1 мг/г сух. массы, тогда как в клеточной массе - до 0,67 ± 0,1 мг/г сух. массы.

5. При изучении условий иммобилизации клеток суспензионной культуры Thalictrum minus L. на кубики пенополиуретана обнаружено влияние начальной плотности суспензионной культуры на биомассу иммобилизованных клеток и прочность иммобилизации, которое проявлялось в более быстром накоплении иммобилизованных клеток из культур с высокой плотностью. На прочность иммобилизации большее влияние оказывала продолжительность культивирования.

6. Было обнаружено влияние числа кубиков на сосуд и их массы на такие параметры как коэффициент иммобилизации и биомассу клеток на один кубик. Увеличение числа кубиков на сосуд более 10 достоверно не увеличивало биомассу на кубик, однако существенно повышало биомассу клеток, изъятых из суспензии. Изменение массы кубиков от 10 мг до 40 мг оказывало влияние на распределение биомассы внутри кубиков.

7. Применение культивирования клеток Thalictrum minus L. в две стадии со сменой сред позволило значительно повысить выход берберина как в суспензионной так и в иммобилизованной культурах. В суспензионной культуре содержание берберина в среде достигало 0,25 ± 0,02 г/л (22,8 мг/г сухих клеток), что превышало уровень синтеза в каллусной ткани (до 9,2 мг/г сух. массы в ткани и 4,6 мг/г сух. массы в среде). Применение иммобилизации привело к увеличению содержания берберина почти в два раза по сравнению с суспензионной культурой.

8. Уменьшение массы кубиков, а также плотности биомассы на них оказывало влияние на синтез берберина иммобилизованными клетками в условиях продукционной среды. Культивирование кубиков массой 10 мг с коэффициентом иммобилизации 0,5 позволило увеличить содержание берберина в среде до 0, 67 ± 0,03 г/л (112,9 мг/г сухих клеток)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в результате проведенных исследований получена культура Thalictrum minus L., которая является перспективным продуцентом бербе-рина благодаря способности не только синтезировать этот алкалоид, но и выделять его во внешнюю среду. Имеющийся литературный материал позволил определить направления дальнейших исследований - изучение возможности регуляции биосинтеза и выделения берберина различными соотношениями регуляторов роста и способами культивирования. Особенностью настоящей работы было исследование влияния этих факторов на перераспределение берберина между клеткой и средой. Была предложена гипотеза об обусловленности процесса экзометаболизма в культуре Thalictrum minus L.

Впервые применен метод иммобилизации клеток культуры Thalictrum minus L. на пенополиуретан, открывающий возможности увеличения выхода берберина и многократного использования биомассы. Метод иммобилизации клеток данной культуры в Са-альгинатный гель, применяемый японскими исследователями [120,121], на наш взгляд уступает предлагаемому в настоящей работе в силу того, что альгинатные шарики не могут предотвратить "утечки" клеток в системе, разрушаются растущими клетками, а также создают дополнительный барьер между клетками и средой.

Пористый матрикс пенополиуретана позволяет получать прочно иммобилизованные клетки, клетки после иммобилизации имеют возможность расти, не разрушая матрикса, а также, на наш взгляд, применение пенополиуретана создает более благоприятные условия обмена как кислородом, так и питательными компонентами между клетками и средой.

Полученные результаты позволяют разработать предпосылки для повышения эффективности биотехнологического получения берберина и открывают широкие перспективы для разработки новой биотехнологии на основе иммерсионного культивирования, сочетающего в себе иммобилизацию клеток на инертный носитель и чередование воздушной и жидкой фаз культивирования. С одной стороны данный подход в перспективе должен обеспечить более эффективное использование накопленной биомассы как источника экзометабо-литов при условии эпизодической замены питательной среды и, с другой стороны - обеспечить более оптимальный режим кислородного обмена, который, по-видимому, является немаловажным фактором, влияющим на метаболизм берберина в культуре Thalictrum minus L.

В работе предприняты попытки выяснить физиологическую и экологическую обусловленность экзометаболизма с выявлением факторов, обеспечивающих регуляцию данного процесса в условиях изолированной культуры. Предлагаемая гипотеза основывается на положении, что растительные клетки в условиях in vitro образуют специфическую биологическую систему, в которой в силу влияния иных чем в целом организме механизмов контроля развития возможно создание таких условий, при которых происходит интенсификация вторичного синтеза. Соотношения концентраций искусственных регуляторов роста, а также способы культивирования клеток являются факторами регулирующими не только рост клеток и накопление вторичных веществ, но также экзометаболизм в культуре in vitro. Выделение берберина клетками Thalictrum minus L. происходит под влиянием этих факторов и как следствие утраты этой культурой механизмов компартментации этого алкалоида.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Скуратова, Елена Валерьевна, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Альферман А.И. и др. /Пер. с англ. Негрука В.И. Биотехнология сельскохозяйственных растений. - М.: Агропромиздат, 1987. - С. 5-7.

2. Архангельская Н. В. Алкалоиды клеточных культур Papaver somniferum // Известия АН ЭССР. Химия. 1989. Т.38. № 4. - С.282-283.

3. Архангельская Н.В., Кестнер А.И. Иммобилизованные растительные клетки // Иммобилизованные клетки в биотехнологии.- М.: Наука, 1986.- С. 3-20.

4. Бузук Г.Б., Ловкова М.Я. Метаболизм алкалоидов: регуляция на молекулярном уровне, пространственная организация // Прикладная биохимия и микробиология. 1995., т.31, с 467-479

5. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. - М.: Наука, 1964. - 272 с.

6. Бутенко Р.Г. Культура тканей и клеток растений. -М.: Знание, 1971. - 46 с.

7. Бутенко Р.Г. Рост и дифференциация в культуре клеток растений // Рост растений и природные регуляторы. -М.: Наука, 1977. - С.6-21.

8. Бутенко Р.Г. Выращивание клеток растений в суспензионной культуре // Известия АН СССР, Серия биологическая. - 1977, 5.-С. 697-710.

9. Бутенко Р.Г. Физиология клеточных культур, состояние и перспективы / Физиология растений. - 1978. - Т.25, № 5. - С.1009-1024

10. Бутенко Р.Г. Культура изолированных клеток и тканей в решении задач физиологии растений // Новые направления в физиологии растений. - М.: Наука, 1985.- 270 с.

11. Бутенко Р.Г. Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения // Культура клеток растений и биотехнология. - М.: Наука, 1986. - С. 3-28.

12. Бутенко Р.Г. Клеточная инженерия.- М.: Наука, 1987.- 122 с.

13. Бутенко Р.Г. Экспериментальный морфогенез в культуре клеток растений. -М.: Наука, 1975. - 87 с.

14. Бич Г., Бест Д., Брайерли К. и др. Биотехнология. Принципы и применение: Пер. с англ. / Под ред. Хиггинса И. - М.: Мир, 1988. - 480 с.

15. Болвелл Г.П., Вуд K.P., Гонзалес P.A. и др. Биотехнология растений: культура клеток. - М.: Агропромиздат, 1989. - 280 с.

16. Броделиус П. Иммобилизованные растительные клетки: методы получения и способность к биосинтезу // Иммобилизованные клетки и ферменты. - М.: Мир, 1988.-С. 156-176.

17. Воллосович А.Г., Бутенко Р.Г. Культура ткани раувольфии змеиной как продуцент алкалоидов // Культура изолированных органов, тканей и клеток растений. - М.: Наука, 1981. С.235-257.

18. Высоцкая Е.Ф., Гамбург К.З. К вопросу о природе фактора кондиционирования при изолированной культуре растительных клеток // Физиология растений, 1975. Т.22. вып.1. - С.63-69.

19. Гамбург К.З., Рекославская Н.И., Швецов С.Г. Ауксины в культурах тканей и клеток растений. - Новосибирск: Наука. Сиб. Отд-ние, 1990. - 243 с.

20. Глеба Ю.Ю., Сытник K.M., Клеточная инженерия растений. - Киев: Наукова думка, 1984. - 160 с.

21. Глеба Ю.Ю. Биотехнология растений / Тез.докл. VII Международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда». - Москва, 1997. - С.6-7.

22. Гродзинский A.M., Гродзинский Д.М. Справочник по физиологии растений. Киев,: Наукова Думка 1973. - 271 с.

23. Гутман Г.С., Ширяева Г.А. Новый способ получения культуры тканей высших растений // Растительные ресурсы.-1980.- 16.№ 4.- С. 601-606.

24. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. - М.: Мир. Т.2. 1986. - 308 с.

25. Данилов A.B., Зайцева Г.В., Константинова В.А. и др. Влияние интенсивности массообмена на рост суспензионной культуры клеток женьшеня.// Физиология растений. 1981, т.28 вып.5. с 1072-1077

26. Диксон Р.А. Изолирование и поддержание каллусных и суспензионных культур клеток // Биотехнология растенийжулътура клеток.- М.: ВО Агропромиздат, 1989.- С. 8-31.

27. Загоскина Н.В. Особенности метаболизма фенольных соединений гетеротрофных и фотомиксотрофных каллусных культур чайного растения (Camellia sinensis L.). - М.: Автореф. Докт.дисс., 1997. 49 с.

28. Загоскина Н.В. Фенольный метаболизм в культрах растительных клеток // Тез.докл. VII Международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда». - Москва, 1997. - С.34-35.

29. Загоскина Н.В., Запрометов М.Н. Культура ткани чайного растения: некоторые аспекты образования полифенолов. // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. - М.: Наука, 1991. С.32-35.

30. Зайцева Г.В., Отрогов С.Е., Травников Д.Б. и др. Исследование суспензионного метода культивирования клеток воробейника краснокорневого - продуцента шиконина. Одно- и двухстадииное культивирование. // Биотехнология, 1994. №4, с 24-27

31. Запрометов М.Н., Загоскина Н.В., Стрекова В.Ю.,Морозова Г.А. Образование фенольных соединений и процесс дифференциации в каллусной культуре чайного растения // Физиология растений. 1979. Т.26. -С.485-491.

32. Запрометов М.Н. Вторичный метаболизм в культурах клеток и тканей растений // Культура клеток растений. - М.: Наука, 1981.- С.37-51.

33. Запрометов М.Н. Фенольные соединения: Распространение, метаболизм и функции в растениях. - М.: Наука, 1993. - 272 с.

34. Запрометов М.Н. Фенольные соединения и их роль в жизни растения. - М.: Наука, 1996. - 56 с.

35. Запрометов М.Н. Фенольные соединения растений и их биогенез // Биологическая химия. Т.27. -М.: ВИНИТИ, 1988. - С.

36. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. -Киев: Наукова думка, 1980. - 487 с.

37. Кириллова Н.В., Орехова И.А., Комов В.П. Влияние фитогормонов на метаболизм ферментов антиоксидантной системы в культуре ткани раувольфии змеиной // Тез. докл. VII Международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда». -Москва, 1997. - С.25-26.

38. Константинова H.A., Зайцева Г.В., Фаустов B.C., Маханьков В.В., Уварова H.H., Еляков Г.В.// Исследование ростовых и биосинтетических способностей длительнопассируемой суспензионной культуры женьшеня // Биотехнология.- 1989.№5, С.- 571-575.

39. Кунах В.А. Геномная изменчивость соматических клеток растений.З. каллусообразование in vitro // Биополимеры и клетка.1997. т.13 №5 с362-371

40. Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высшая школа, 1980, - 291 с.

41. Лекарственные средства: свойства, применение, противопоказания: Справочник / Под ред. Клюева М.А. - М.: Русская книга, 1993. - 576 с.

42. Линдси К., Йомен М. Новые экспериментальные системы для изучения синтеза вторичных метаболитов с использованием тканей растений // Биотехнология сельскохозяйственных растений. - М.: Наука, 1987.- С. 43-66.

43. Липский А.Х. Глубинное культивирование клеток высших растений. - М.: Наука, 1989.- С. 51-69.

44. Лукнер М. Вторичный метаболизм у микроорганизмов, растений и животных. - М.: Мир. - 548 с.

45. Масек Т., Ванек Т., Бениш И. Иммобилизованные растительные клетки -некоторые аспекты их непрерывного культивирования // Труды 16-й конф» ФЕБО, Москва, 1984.№ 2,- С. 313-316.

46. Машковский М.Д. Лекарственные средства: В 2-х томах - М.: Медицина, 1986. Т.2-576 с.

47. Ментел С.Т., Смит Т. Факторы культивирования, влияющие на накопление вторичных метаболитов в культуре клеток и тканей растений // Биотехнология сельскохозяйственных растений. - М.: ВО Агропромиздат, 1987.-С. 154-198.

48. Муромцев Г.С., Чекаников Д.И., Кулаева О.Н., Гамбург К.З. Основы химической регуляции роста и продуктивности растений. - М.: Агропромиздат, 1987. - С. 316-322.

49. Мясоедов H.A., Бутенко Р.Г., Слепян JT.H. Выращивание биомассы ткани женьшеня с применением поддерживающего субстрата // Растительные ресурсы, 1986, 22 3.- С. 314-344.

50. Моррис П. Образование продуктов вторичного метаболизма в суспензионных культурах клеток. - М.: ВО Агропрмиздат, 1987.- С. 154-203.

51. Найдович Л.П., Маслова H.A., Бондаренко Е.В. Спектрофотометрический метод количественного определения берберина // Хим-фарм. журнал. 1978. — №10, —С132-134

52. Носов A.M. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. -М.: Наука, 1991. - С.5-20.

53. Носов A.M., Пауков В.Н., Бутенко Р.Г. Физиологическая регуляция синтеза стероидов культурой клеток диоскореи дельтовидной // Культура клеток растений и биотехнология. - М.: Шука, 1986. - С.76-79.

54. Носов A.M. Функции вторичных метаболитов растений in vivo и in vitro // Физиология растений, 1994. Т.41, № 6. - С.876-878.

55. Попов Ю.Г., Саркисова М.А. Вопросы производства лекарственных средств растительного происхождения // ВНИИ систем, упр., экон. исслед. и НТИ, 1989.-С. 1-27.

56. Потопальский А. И., Петличная Л. И., Ивасивка С. В. Барбарис и его препараты в биологии и медицине. Киев, 1989.

57. Рабинович С.А., Смирнов A.M. Алкалоиды каллусных тканей Papaver bracteatum L. //Культура клеток растений и биотехнология. -Москва, 1986 -С. 63-66.

58. Ржержабек Й., Горелова О.А. Влияние количества и форм азота на рост клеток и накопление стероидных соединений в суспензионной культуре Solamum laciniatum Ait. // Культура клеток растений и биотехнология. - М.: Наука, 1986. - С.70-76.

59. Рощина В.Д., Рощина В.В. Выделительная функция высших растений. -М.: Наука. 1989,214 с.

60. Самыгин Г.А., Волкова JI.A. Сравнение разных методов для оценки жизнеспособности клеток суспензионных и каллусных культур // Физиология растений. - 1983. -32.№ 4,- С. 813-815.

61. Сассон А. Биотехнология и повышение продуктивности растений / Биотехнология - свершения и надежды. -М.: Мир, 1987. - С.150-164.

62. Соколов С.Л., Замотаев И.П. Справочник по лекарственным растениям. М..1990.

63.Шамина З.Б., Архангельская Н.В., Абдвахитова А.К. Создание системы иммобилизованных клеток мака // Биотехнология.- 1992, № 3 - С. 274-276

64. Шамков Н.В., Зайцева Г.В., Белоусова Н.М. Отработка режимов культивирования клеток женьшеня на опытно-промышленной установке. Омутнинский химический завод // Биотехнология. № 1.-С. 384-386.

65. Фаулер М.В. Экономические аспекты промышленного культивирования клеток растений - М.: ВО Агропромиздат. 1987.- С. 9-42.

66. Холина А. Б., Журавлев Ю. Н., Булгаков В. П., Ожигова И. Т., Елькин Ю.Н. Получение и характеристика каллусной культуры Thalictrum minus L. // Раст, ресурсы. 1991.Т.27.вып.4.С.81-86.

67. Холина А.Б., Журавлев Ю.Н. Культура клеток растений как источник протобербериновх алкалоидов.//Раст. Ресурсы. 1996. Т.32 вып.1-2. С 134-149

68. Эльконин JI.А., Пахомова Н.В. Влияние источников азота и фосфора на рост и морфотип эмбриогенного каллуса сорго // Тез. докл. VII Международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда». - Москва, 1997. - С.187-188

69. Albersheim P., Darvill A.G., McNeil М., Oligosaccharins: naturally occurring carbohydrates with biological regionaly function // Structure and function of plant genomes. N.Y.: Plenum press, 1983. - P.293-312.

70. Alfermann A.W. Syntheses by plant cells // Biocatalysts in organ syntheses. -Netherlands, 1985. - P.225-238.

71. Albersheim P. Oligosaccharins that regulate growth, developments and defense responses in plant // Glycobiology. 1992. Vol 2. № 3 - P.181-198.

72. Archambault J., Volesky В., Kurtz W.G.W. Production of indol alkaloids by surface immobilized C.roseus cells // Biochemical engineering research unit. Monreal. 1990. Vol.35. - P.660-667.

73. Amann M., Nakagura N., Zenk M. H. (S)-tethrahydroprotoberberine oxidase the final enzyme in protoberberine biosynthesis // Tetrahedron Lett. 1984. Vol. 25, N 9. P. 953-954.

74. Amann M., Wanner G., Zenk M. H. Intracellular compartmenation of two enzymes of berberine biosynthesis in plant cell cultures // Planta. 1986. Vol. 167. P. 310-320.

75. Bailey C.M., Nicholson H., Stafford A., Smart N.J. Catharanthus roseus L.Don. A model for the biosynthethsis of indol alkaloids by cell suspensions // Appl. Biochem. Biotechnol. 1986. Vol 12. № 3 . P.215-227.

76. Beecher C. W. W., Kelleher W. J. The incorporation of berberine into jattorthizine//Tetrahedron Lett. 1983. Vol. 24, N 5. P. 469-472.

77. Beck C., Stifl P. Et.al. Cell culture bioreactors // Chem. Eng, - 1987.-94,21 - P. 121-129.

78. Bender L., Pauler B., Neumann K.H. On the photosynthetic system and assimilate methabolism of Daucus and Arachis cell cultures // Primary and secondary methabolism of plant cell cultures. B ets.: Springer, 1985. - P.25-42.

79. Biswas G., Zapata F. Callus formation and plant regeneration from protoplasts derived from suspension culture of rise // Plant breed, - 1990. - 105,2. - P. 95-100.

80. Breuling M., Alfermann A. W., Reinhard E. Cultivation of cell cultures of Berberis wilsonae in 20-1 airlift bioreactors // Plant Cell Reports. 1985. Vol. 4. P. 220-223.

81.Brodelius P., Nilson K. Entrapment of plant cells In different matrices// FEBS Left, - 1985,- 122.- P.312-316

82. Brodelius P., Pedersen H. Increasing secondary metabolic production in plant cell culture by redirecting transport // Trends in Biotechnology. 1993. Vol. 11, N I. P. 30-36.

83. Brodelius P. Use of fungal to induce or enhance secondary metabolism in plant cells cultures // World Biotech. Rept., 1989, vol. 1, pt. 4, - P. 123 -128

84. Cabral Q.M., Fevereiro P. Comparison of immobilisation metods for plant cells and protoplasts // Current Sciene - 1985, -54,7. - P. 335-336.

85. Cadra M.S., Heble M.P. Plant cells, tissue and organ culture: potential sourses for plant secondary metabolites // Proc. DAE Symp. Never Appr. Biol. Appl., 1985.-P. 183-191.

86. Chasan R. Phytochemical Forecasting // Plant Cell.l994.Vol.6.NI.P.3-9.

87. Cordell G. A. Introduction to Alcaloids. John Wiley.NewYork.1981.

88. Cosgrove . Biophlsical control of plant cell growth // Ann. Rev. Plant Phisiol. -1985.- 37. -P.377-405.

89. Dalton C.C., Peel E. Product formation and plant cell specialization: A case of photosynthetic development in plant cell cultures // Progr.Indust. Microbiol. 1983. Vol.17. -P.109-166.

90. Davis G.A., Mavituna F. Reactor for cultivation biological material such as immobilized cells // New Zealand Qournal of technology. - 1987. - 2,2. - P.71-76.

91. Dittrich H., Kutchan T. Molecular cloning, expression, and induction of berberine bridge enzyme, an enzyme essential to the formation of benzophenanthridine alcaloids in the response of plants to pathogenic attack // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1991. Vol. 88. P. 9989-9973.

92. Dougall D. Accumulation of natural products in plant tissue cultures revisited // Blotechnol. Adv. - 1986. -5,1.- 177p.

93.Drapeau D., Harvey W. et.al. Ajmalicln, serpentin and catharanthine accumulation in Catharanthus roseus bioreactor cultures // Planta med.- 1987. 53,4.-P. 154-201.

94. Drew S.W., Demain A.L. Effect of primary metabolites on secondary metabolism. // Annual revies of microbiology, vol. 31. - P.346-356.

95. Engvild K.C. Callus and suspepension cultures of carnathion // Physiol.Plant. -1972. Vol. 26, № 1.- P.62-66.

96. Fowler M.W. Process strategies for plant cell culture // Trend Blotechnol.- 1986. -9,8.-P. 214-219.

97. Fuller K.V. Chemicals from plant cell cultures - some biochemical and physiological pointers // Chemistry and industry. - Oxford. 1984. Vol. 23. - P.825-833.

98. Fujiwara H., Takeshita N., Terano Y., Fitchen J. H. et al. Expression of (S)-scoulerine- 9-O-methyltransferase in Coptis japónica plants // Phytochem. 1993. Vol.34. Issue 4. P. 949-954.

99. Fukui H., Nakagawa K., Tauda S., Tabata M. Production of isoquinoline alcaloids by cell suspension cultures of Coptis japónica // Plant Tissue Culture / Ed. A. Fujiwara, eds. 1982. P.313-314.

100. Furuya T., Syono K., Ikuta A. Isolation of berberine from callus tissue of Coptis j aponica / Phitochem. 1972. Vol.ll.P. 175.

101. Galneder E., Rueffer M., Wanner G., Tabata M., Zenk M. H. Alternative final steps in berberine biosynthesis in Coptis japónica cell cultures // Plant Cell Reports. 1988. Vol. 7. P. 1-4.

102. Gray D. Rapid grouwth in plant cell culture // Trend blotechnol. - 1988.-6.10,-P.233-234.

103. Gugler K., Funk Ch., Brodelius P. Elisitor-induced tyrosine decarboxylase in berberine-synthesizing suspension cultures of Thalictrum rugosum // Eur. J. Biochem. 1988. Vol. 170. P.661-666.

104. Gulik W.M., Meijer J.J., Hoopen H.J. Growth of a Catharanthus roseus cell suspension culture in a modified chemostat under glucoselimiting conditions // Appl. Microbiol, and biotechnol. 1989. Vol.30. - P.270-275.

105. Goodchild J., Givan C. Influence of ammonium and extracellular pH on the amino and organic acid contents of suspension culture cell of Aser pseudoplatanus //Phisiol. Plant. 1990. - 78. №1. - P.29-37.

106. Hara M., Tanaka S., Tabata M. Induction of a specific methyltransferase activity regulating by cytokinine in Thalictrum minus cell cultures // Phytochem. 1994. Vol. 36. N.2.P.327-332.

107. Hara Y., Yoshioko T., Morimoto T., Fujita Y., Yamada Y. Enhancement of berberine production in suspension cultures of Coptis japónica by gibberellic acid treatment //J. Plant Physiol. 1988. Vol. 133. P. 12-15.

108. Hara Y., Yamagata H., Morimoto T., Hiratsuka J. et al. Flow cytometric analysis of cellular berberine contents in high- and low-producing cell lines of Coptis japónica obtained by repeated se/ection // J. Planta Med. 1989. Vol. 55. P. 151-154.

109. Heinstein P.F. Future approaches to the formation of secondary natural products in plant cell suspension cultures // J. Nat. Products. - 1985.- 48.1.- P.1-9.

110. Hinz H., Zenk M. H. Production of protoberberine alcaloids by cell suspension cultures of Berberís species // Naturwissenschaften. 1981. Vol. 68, N 12. P. 620621.

111. Hiroshi A., Li Xiao-Ni, Toshiko U. Effect of inoranic phosphate on the biosynthesis of pyrimidine nucleotides in suspension-cultured cells of Catharanthus roseus. // Ann.bot., 1988, Vol.61 № 2. - P.225-232.

112. Jardin B., Tom R. Stimulated indol alcaloid release fromC.roseus immobilized cultures // Biotechnology/1991 Vol. 21. № 2. - P.43-62.

113. lose W., Redersen H., Chin C.R.-Immobilised plant cells // Acad Scl.- 1983.413- P.1807-1883.

114. Ikuta A., Syono K., Furuya T. Alkaloids in plants regenerated from Coptis callus cultures //Phytochem. 1975. Vol. 14. P. 1209-1210.

115. Ikuta A., Itokawa H. Berberine and other protoberberine alkaloids in callus tissue of Thalictrum minus. 1982. Vol. 21, N 8. P. 1419-1421.

116. Ikuta A. Isoquinolines // Cell culture and somatic cell genetics of plants. New York, 1988. Vol. S. P-Wf-St

117. Kargl F., Rosenberg M. Plant cell bloreactors: present status and future trends // Biotechnol. Progress.- 1987.- 3.1.-P.1-8.

118. Kelleher WJ., Rother A., Wellman E., Grisebach H. Enzymatic formation of protoberberine alkaloids //PlantaMed. 1980. Vol. 40. P. 127-136.

119. Ketel D. Inorganic nutriention of callus tissues of tagetes species: the effects on morphogenesis and accumulation of thiophenes and non-polar secondary methabolithes // J. Plant physiol. 1986, 125, № 1-2. - P.69-77.

120. Kobayashi Y., Fukui H., Tabata M. Berberine production by batch and semi-continuous cultures of immobilized Thalictrum cell in an improved bioreactor // Plant Cell Reports. 1988. Vol. 7. P.249-252.

121.Kobayshi Y., Fukui H., Tabata M. Effect of oxygen supply on berberine production in cell suspension cultures and immobilized cells of Thallictum minus //Plant Cell Reports. 1989. Vol. 8. P.225-228.

122. Kobayashi Y., Fukui H., Tabata M. Effect of carbon dioxide and ethylene on berberine production and cell browning in Thalictrum minus cell cultures // Plant Cell Reports. 1991. Vol. 9. P.469-499.

123. King P.I., Manstield R.I.. Street H.E. Immobilisation and permeabilisatlon of culture plant cells // Food technology, 1985.

124. Kochs G., Welle R., Grisebarh H. Differential induction of enzyme in soybean Cell cultures by elicitor or osmotic stress// J. Planta. 1987. -171. № 4. - P.519-524

125. Krueger R.J., Carew D.P. Catharanthus roseus tissue culture: the effects of precursors on growth and alkaloid production // Loydia, 1978. Vol. 41. - P.327-331.

126. Linsefors L.. Brodelius P. Immoblilsed plant cells in plant hormone studies // Symp. Young Scl. Phislol and biochim. Plants.- 1987.- 4.14.- 16 p.

127. Lindsey K., Yeoman M. The viability and biosinthetlc activity of cells of Capsicum frutescens immobilised in reticulate poliuretane // J. of Experim. Botany,- 1964.- 35,10. - P. 1684-1696

128. Lindsey K., Yeoman M. A novel method for the immobilisation and culture of plant cells//FEES Lett.- 1983.-155, 1.- P.143-148.

129. Loeffler S., Zenk M. H. The hydroxylation step in the biosynthetic pathway leading from norcoclrine to reticuline // Phytochem. 1990. Vol. 29, N 11. P. 34993503.

130. Majerus F., Parellex A. Alkaloid accumulation in Ca-alginate entrapped cells of Catharanthus roseus : using a limiting growth medium // Plant cells Reports. -1986.-5,4,-p.302-305.

131. Matsubara K., Kitani S., Yoshioka T., Morimoto T., Fujita Y. High density culture of Coptis japónica cells increases berberine production // J. Chem. Tech. Biotechnol. 1989. Vol. 46. P.61-68.

132. Misawa M. Production of useful metabolites by plant tissue culture // Biomass Convers. Technol. Prinsiples andPract.- 1887.- P.193-199.

133. Morimoto T., Hara Y., Kato Y., Hiratsuka J., Yoshioko T., Fujita Y., YamadaY. Berberine production by cultured Coptis japónica cells in a one-stage culture using medium with a high cooper concentration // Agrie. Biol. Chem. 1988. Vol. S2, N 7. P. 183S-1836.

134. Morris P. Regulation of product synthesis in cell culture of Catharanthus roseus. Comparison of production media // Planta med., 1986, № 2. - P.121-126.

135. Muller M. J., Zenk M. H. The norcoclaurine pathway in operate in berberine biosynthesis in Coptis japonica // Planta Med. 1992. Vol. 58, N 6. P. 524-527.

136. Nakagawa K., Konagai A., Fukui H., Tabata M. Release and crystallization of berberine liquid medium of Thalictrum minus cell suspension cultures // Plant Cell Reports. 1984. Vol.3. P. 254-257.

137. Payne G.F., Payne N.N., Chuler M.L. Bioreactor consideration for secondary metabolites production from plant cell tissue culture: indole alcalolds from Catharanthus roseus //Biotechnol. Bioeng.- 1988.-31,9.- P.905-912.

138. Petiard V., Steck P. Industrial applications of plant cell cultures: metabolite production // Perspect. Proc. NATO Adv. Study Yng. Trola.-1985.-17,29.- P.139-153.

139. Philips R., Henshaw G.G. The regulation of synthesis of phenolic in stationary phase cell cultures of Aser psedoplatanus // J. Exp. Bot.- 1987.-28.- P.782-794

140. Pissarra J., Santos I. Effect of ammonium on growth and lignin content of cultured callus tissue // Sciens biol.mol and cell. 1988. - 13. № 3-4. - P. 125

141. Poli F., Bonora A., Vannini G. et al. Callus formation,cell suspension culture and plant regeneration in Ranunculus serbicus Vis.// J Plant physiol/ 1989. Vol 134,№ 5 P 637-639

142. Ohlsson A., Berglund T. Effect of high MnS04 levels on cardenolide accumulation by j3igitalis lanata tissue in light and darkness // J. plant physiol.

1989. 135. №4 - P.505-507.

143. Rhodes M.J.C. Immobilised plant cell culture // Topic In ensime and fermentation biotechnology. - 1985.-10.-P.51-87.

144. Sakuta M., Komamine A. Cell growth and accumulation of secondary methabolites // Cell culture and somatic cell genetics of plants. - Acad. Press, 1987. -P.97-114.

145. Schaffler E. Koop H. Singl cell of conditioning factors // J. Plant Phlsiol.-

1990.-137,1.-P.95-101.

146. Shuler M.L. Production of secondary metabolites from plant tissue culture -problem and perspectives // Ann NY Acad Sci. 1981. Vol.369. - P.65-79.

147. Simpson A.P., Kelly S.L. Cytochrome P-450 inducer/inhibitor effects on cell cultures of Catharanthus roseus // Plant Sci. Vol.50. № 2. - P.231-236.

148. Tharacan J.P., Chau P.S. Operation and pressure distibution of immobilised cell hollow fiber bioreactors // Blotechnol. Bloeng.- 1986.- 28,7.- P. 1064-1071. 53.

149. Veropoorte R., Heijden R., Hoge J.H.C., Hoopen H.J.G. Plant cell biotechnology for the production of secondary methabolites // Pure and Appl. Chem. 1994. Vol. 10. - P.2307-2310.

150. Yamada Y., Sato F. Production of berberine in cultured cells of Coptis japonica //Phytochemistry. 1981. Vol 20. №3 P 545-547.

151. Yeoman M.M., Miedzybrodzka M.B., Lindey K., McLauchlan W.R. The synthetic potential of cultured plant cell // Plant cell cultures: Result and perspectives. Amsterdam ets.: Elsevier, 1980. - P.327-344.

152. Yoshida F., Kohono H. Regulations of mineral and especially nitrogen nutrition to growth rate of plant cell cultures // Plant cell culture. 1987. - 4. № 2. - P.53-59.