Фотоморфогенез Artemisia annua L. in vitro тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.05, кандидат биологических наук Песяк, Сергей Владимирович

• Песяк, Сергей Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Песяк, Сергей Владимирович

Оглавление

Введение

Глава 1. Особенности культивирования клеток лекарственных растений in vitro

1.1 Клеточные культуры растений как источник биологически-активных веществ

1.2 Вторичные метаболиты Artemisia annua L. и их фармакологическое действие

1.3 Морфологические изменения клеток в процессе культивирования

Глава 2. Фоторегуляция роста и морфогенез клеточных культур лекарственных растений

2.1 Фотоморфогенез интактных растений

2.2 Действие селективного света на ростовые, биохимические параметры и морфогенез клеточных культур

Глава 3. Материалы и методы

3.1 Ботаническая характеристика Artemisia annua L

3.2. Получение клеточных культур Artemisia annua L

3.3 Исследование действия селективного света

3.4 Морфометрические исследования клеточных культур

3.5 Определение содержания фотосинтетических пигментов

3.6 Определение содержания флавоноидов

3.7 Методы обработки данных

Глава 4. Оптимизация условий культивирования каллусной культуры и получение суспензионной культуры Artemisia annua L

4.1 Влияние физиологически-активных веществ на рост каллусной культуры Artemisia annua L

4.1.1 Действие экзогенных гормонов

4.1.2 Действие физиологически-активных добавок

4.1.3 Действие элиситоров

4.2 Морфологические изменения при введении в суспензионную культуру

клеток Artemisia annua L

4.2.1 Оптимизация условий культивирования суспензионной культуры Artemisia annua L

4.2.2 Динамика роста суспензионной культуры Artemisia annua L

4.3 Получение культуры генетически-трансформированных корней Artemisia annua L

Глава 5 .Роль света в морфогенезе клеточной культуры Artemisia annua L

annua L

5.2 Действие селективного света на суспензионную культуру Artemisia

annua L

Глава 6. Накопление биологически-активных веществ в клеточных культурах

6.1 Определение содержания фотосинтетических пигментов в каллусной и суспензионной культурах Artemisia annua L

6.2 Определение содержания флавоноидов в каллусной и суспензионной культурах

Заключение

Выводы

Литература

з

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фотоморфогенез Artemisia annua L. in vitro»

Введение

Актуальность проблемы. Роль лекарственных растений, как источников веществ медицинского назначения постоянно возрастает. Более 25% всех фармпрепаратов, в настоящее время, содержат соединения растительного происхождения. В основном это стероиды, алкалоиды, сапонины, флавоноиды, вещества терпеновой природы и другие. Однако использование в медицинской промышленности природных источников лекарственного сырья приводит к снижению их ареала в результате неограниченного сбора или воздействия антропогенных факторов [180, 219, 238].

Поэтому альтернативным источником вторичных метаболитов является культура клеток и тканей лекарственных растений, используемая в фармацевтической промышленности. Этот метод имеет ряд преимуществ перед сбором лекарственного сырья в природе и, в определенной мере, выращивания интактных растений на полях. Технология in vitro позволяет регулировать накопление биологически активных веществ (БАВ) в культуре, оптимизируя питательную среду путем добавления в нее гормонов, элиситоров и предшественников синтеза [165]. Регуляторами роста и морфогенеза также могут служить факторы внешней среды, особое место среди которых занимает свет, который не только выступает как источник энергии для фотосинтеза, но также через систему рецепторов различных участков спектра может воздействовать на процессы роста клеточных культур и накопления ими вторичных метаболитов [8, 9, 28, 29, 30, 34, 44, 59, 68].

Успешно культивируются в качестве источников алкалоидов - Atropa belladonna L., Symphytum officinale L., Aconitum sp.; алкалоидов и сапонинов -Nigella sativa L..; витамина E - Carthamus tinctorius L.; эфирных масел -Lavandula sp. и многие другие растения [69, 187, 192] Известно о способности генетически трансформированных культур «бородатых корней»

(hairy root) к биосинтезу вторичных соединений [35, 36, 37, 227].

К перспективным растениям для введения в культуру in vitro относится полынь однолетняя - Artemisia annua L, (семейство сложноцветные Asteraceae) которая продуцирует ценные сесквитерпеновые лактоны. Основным из них является артемизинин и его производные [70]. Показано их противомалярийное, противопаразитарное, противоопухолевое и противовирусное действие [76, 88, 130, 131, 183, 223]. Важным источником получения артемизинина и его производных являются интактные растения, выращиваемые на полях. Однако содержание искомых веществ зависит от природных факторов и меняется в зависимости от возраста растений [85, 105]. Введение Artemisia annua L. в асептическую культуру in vitro открывает перспективу круглогодичного получения растительного материала в качестве возможного источника сесквитерпеновых лактонов [192]. Но нет данных по морфогенезу клеточной культуры Artemisia annua L., его зависимости от эндогенных и экзогенных факторов при культивировании in vitro, что и явилось целью наших исследований.

Цель диссертационной работы заключалась в получении каллусной, суспензионной культуры клеток полыни однолетней {Artemisia annua L.), а также культуры hairy root (бородатых корней), и исследовании регуляторной роли селективного света в фотоморфогенезе этих культур in vitro.

Задачи исследования:

1. Получить каллусную, суспензионную культуры Artemisia annua L. и культуру hairy root, определить оптимальные условия их роста. Изучить действие различных концентраций ростовых, сигнальных веществ и элиситоров на рост и морфологические характеристики клеток каллусной и суспензионной культур.

2. Изучить действие селективного света на рост клеток каллусной и суспензионной культуры Artemisia annua L.

3. Исследовать влияние условий культивирования на содержание пигментов хлорофиллов А, Б и каротиноидов в клетках культуры.

5

4. Установить характер накопления флавоноидов в клеточных культурах Artemisia аппиа L. и зависимость этих процессов от действия селективного света.

Научная новизна: впервые изучено действие различных концентраций фитогормонов на морфологические параметры клеток каллусной и суспензионной культур Artemisia аппиа L. Показано, что гомобрассинолид в концентрации 5-10 мкг/л и сахароза в концентрации 15 г/л стимулировали рост каллусной культуры. Впервые изучено регуляторное действие селективного света на рост и морфогенез клеточных культур Artemisia аппиа L. Показано, что синий свет (450 нм) с экспозицией 16 часов стимулировал рост каллусной культуры Artemisia аппиа L, уменьшая размер всех типов клеток, что может свидетельствовать о специфическом действии этого участка спектра на процессы клеточного деления, в то время как зеленый свет (550 нм) равной интенсивности и экспозиции подавлял рост каллусной культуры, с одновременным увеличением объема клеток.

Практическая значимость. Полученные нами данные по светорегуляторной зависимости морфогенеза клеточных культур Artemisia аппиа L. могут быть использованы в дальнейшем для интенсификации роста культур ш vitro не только этого растения, но и других ценных видов, а также для интенсификации образования вторичных метаболитов, в том числе флавоноидов. Культуры и методики, полученные и разработанные в ходе выполнения этой работы, используются при проведении большого практикума по биотехнологии растений, в лекционных курсах «Клеточная культура растений» и «Физиология растений» для биологов, агрономов и специалистов по защите растений в Томском государственном университете. Получен патент на состав оптимизированной питательной среды для культивирования каллусной культуры Artemisia аппиа L. Подана заявка на патент по действию селективного света на рост каллусной культуры Centaurea scabiosa L., в материалах которого использованы методы, выработанные в процессе выполнения диссертационной работы.

6

Глава 1. Особенности культивирования клеток лекарственных растений in vitro

1.1 Клеточные культуры растений как источник биологически-активных веществ

Многие растения, способные синтезировать ценные вторичные метаболиты, трудно или практически невозможно выращивать в условиях сельского хозяйства. Химический синтез данных соединений часто экономически невыгоден из-за их большой сложности и специфических стереохимических характеристик. Использование клеточных культур в данных случаях представляет собой привлекательную альтернативу интактным растениям. Впервые клеточные культуры растений были получены в 1930-е годы. Однако только в 1956 году фирма Pfizer получила первый патент на выделение вторичных метаболитов из клеточной культуры. Виснагин и диосгенин накапливался в культуре в большем количестве по сравнению с интактными растениями [182]. Zenk в 1978 году показал метаболическую пластичность клеточных культур растений и возможность выделить на этой основе высокопродуктивные линии [235]. С конца 1970-х годов эта проблема привлекла внимание все большего количества исследователей, что повлекло за собой рост количества патентов, связанных с клеточными культурами. В 1983 на предприятии Mitsui Petrochemical впервые было запущено промышленное производство шиконина из клеточной культуры.

На сегодняшний день культуры клеток растений используются в коммерческой деятельности, а также служат основой для проведения исследований в клеточной биологии, физиологии, генетике и биохимии [166].

Применение данных культур идет по трем основным направлениям [237]:

1. Выращивание растений и генетика — сохранение редких и

7

исчезающих видов, проведение скрещивания для получения новых сортов и разновидностей, проведение генетических исследований, получение трансгенных растений.

2. Модельные системы для изучения физиологии, биохимии и патологии растений.

3. Получение вторичных метаболитов — выращивание клеточных культур в жидкой питательной среде в качестве источников искомых веществ.

По сравнению с интактными растениями клетки культур растений часто продуцируют отличающиеся как по качественным, так и по количественным и временным характеристикам вещества. Некоторые метаболиты в клеточных культурах накапливаются в больших количествах, чем в интактных растениях подтверждая потенциал этих культур в качестве источников искомых веществ [182].

Kim с сотр. [131] показали что шиконин в культуре Lithospermum erythrorhizon L. накапливается в больших количествах, чем в интактных растениях. Похожие результаты были получены на культуре Coleus bluemei накапливающей розмариновую кислоту [179, 194]. Высокие концентрации берберина были показаны в растущих клетках Coptis japónica. Это растение накапливает высокие концентрации берберина в корнях в течение четырех или шести лет, такие же количества можно получить из 4-х недельной культуры клеток [112]. Нага с сотр. получили клеточную линию Coptis japónica Salisb. которая содержит до 13% сухого веса берберина, что составляет около 1500 мг/л этого антибактериального алкалоида за 14 дней [182].

Преимущества клеточных культур как источников лекарственных веществ следующие [233]:

1. Они не зависят от географических и сезонных вариаций и факторов внешней среды — синтез вторичных метаболитов происходит в контролируемых условиях и отсутствии негативных воздействий, которые

могут повлиять на выход искомых веществ.

2. Они представляют собой ясную продукционную систему, которая может поддерживать в постоянстве выход продуктов, их качественные и количественные характеристики.

3. Возможность выбора клеточных линий с лучшей продуктивностью для получения вторичных метаболитов.

4. Возможность получения новых веществ, не продуцируемых интактными растениями.

5. Возможность влиять на продукционный процесс клеточных культур при помощи химических или физических факторов.

Существует некоторое количество успешно внедренных в промышленное производство клеточных культур продуцирующих высокое количество вторичных метаболитов. Однако на сегодняшний день эти технологии находятся в постоянном развитии и, несмотря на все их успехи, существует множество проблем, которые необходимо решить на пути внедрения лабораторных образцов культур в производство. Среди таких проблем существуют как биологические (медленный темп роста клеток, физиологическая гетерогенность, генетическая нестабильность, низкое содержание метаболитов) так и чисто технические, связанные с особенностями роста культуры в больших масштабах (слипание клеточных стенок, необходимость светового режима, асептических условий) [237]. Для решения данных проблем были предложены различные методы, позволяющие повысить накопление вторичных метаболитов в культурах [189].

Основной целью данных методов является увеличение синтеза вторичных метаболитов в культурах клеток растений до той ступени, когда их получение данным методом менее затратно, чем выделение из интактных растений или с помощью химического синтеза [93]. Существует общепринятая схема активации синтеза биологически активных веществ, каждая ступень из которой может использоваться отдельно от других [182]:

9

1. Начальная ступень данной схемы включает в себя отбор растений, от которых будут получены клеточные культуры. Растения отбираются по генетическим или биохимическим параметрам, в основном по максимальному содержанию искомых веществ. Для индукции каллусообразования используются органы растения, накапливающие максимальное количество вторичных метаболитов.

2. После получения культур клеток может проводиться их селекция. Отбираются быстрорастущие линии с максимальным накоплением вторичных метаболитов [92].

3. Для увеличения их синтеза могут использоваться различные химические и физические факторы, кардинально влияющие на метаболические пути биологической клетки. В качестве таких факторов используется изменение качественного и количественного состава питательной среды (по основным макроэлементам, гормонам и витаминам), действие физических факторов (свет, температура и рН), а также действие специфических веществ, изменяющих метаболизм клеток: фитогормонов, элиситоров и предшественников синтеза вторичных метаболитов [236]. Например, увеличение образования алкалоидов в культуре клеток раувольфии змеиной (Rauwolfia serpentina Benth.) стимулировали регуляторами роста р-индолилуксусная кислота (ИУК) и а-нафтилуксусная кислота (а-НУК) [46, 53]. Аналогичное действие оказала а-НУК на биосинтез антрахинонов в культуре клеток моринды цитрусолистной (Morinda citrifolia L.) и на образование алкалоидов в каллусной ткани дурмана индийского (Datura metel L.). Известно и ингибирующее влияние гормоноподобных соединений на образование вторичных веществ. Так, гормон 2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) подавлял образование антоцианов в каллусной ткани Haplopappus gracilis, а в культуре клеток моркови при действии НУК и 2,4-Д происходило ослабление образование каротиноидов [20, 21, 22].

Для увеличения синтеза алкалоидов и фенольных соединений в

ю

суспензионной культуре василистника малого (Thalictrum minus L.) вносили предшественника фенольных соединений — фенилаланина [55, 62]. Культивируемые клетки верблюжьей колючки (Alhagi kirghisorum Gagnebia) индуцировали синтез фенольных соединений в 7-8 раз больше, чем в контрольных клетках при действии стрессового фактора (NaCl), и в 1,5 - 2,5 раза больше при действии элиситора (гриб Helminthosporium satiyum). Очень большое влияние на рост суспензионной среды оказывает ее непрерывное перемешивание, которое обеспечивает хорошую аэрацию и предотвращает осаждение клеток [182]

Содержание вторичных метаболитов также регулируется физическими факторами внешней среды, основными из которых являются температура, световой режим и рН среды. Оптимальной температурой для индукции роста большинства клеточных культур является 17-25 °С. Однако для каждого вида растения оптимальная температура может отличаться от данного предела. Courtois и Guren [90] показали возможность 12-кратного увеличения продукции алкалоидов в клеточной культуре Catharanthus roseus L. при 16 °С, по сравнению с контрольной температурой в 27 °С.

Впервые клеточные культуры Artemisia annua L., в том числе каллусную и суспензионную, стали изучать в 80-х гг. 20 в. [76, 123, 196, 206]. Blando с сотр. использовали стерильные экспланты растения, взятые от листьев Artemisia annua L. и инкубировали их на различных средах в темноте, чтобы вызвать образование каллусной культуры [83]. Экспериментальный проект был выполнен с использованием широкого спектра модифицированных сред Мурасиге-Скуга (MS) [157] с добавлением 49 комбинаций а-НУК или 2,4-Д с 6-бензилуксусной кислотой (6-БАП) в различных концентрациях. Количественный и качественный анализ быстрого увеличения каллусной культуры был выполнен в нескольких субкультурах, позволяющих идентифицировать самые подходящие условия для клеток. Лучшие результаты были получены, когда 2,4-Д и 6-БАП добавлялись в среду MS в отношении 5:1 [83].

Были получены стерильные меристематические пластинки, которые также возможно было получить от культуры побегов, которые были размножены на среде MS с добавлением 6-БАП (0,5 мг/л) и а-НУК (0,01 мг/л). Этот результат был получен, когда авторы выявили оптимальный состав, способный уменьшить возникновение витрификации (превращение в стекловидное тело). Снижение витрификации достигалось понижением концентрации ауксинов и увеличением агаровой концентрации [116] .

Gupta с сотр. [120] в своей работе использовали в качестве эксплантов сегменты, взятые с центральной части соцветий. Ими был получен хороший результат циклического микроразмножения in vitro растений с высоким содержанием артемизинина, превосходящим таковое у отобранных интактных растений Artemisia annua L. Авторами была использована среда MS с добавлением витаминов по прописи RT, 1 г/л гидролизата казеина и 1 мл/л 6-БАП. На данной среде из эксплантов, взятых от соцветия формировались листовые структуры с последующим их ростом и образованием побегов под освещением интенсивностью 3000-4000 Лк. На среде с добавлением 5 мг/л БАП формировались корни. В результате было отобрано 24 растения Artemisia annua L., которые были размножены. Клонированные растения быстро адаптировались к почве в тепличных условиях и в дальнейшем были готовы к росту в полевых условиях. Также как и в работах авторов, речь, о которых шла выше, здесь размножение данной методикой культуры Artemisia annua L. позволило повысить содержание артемизинина во много раз. В то время как у интактных растений в стадии репродукции содержание артемизинина во много раз ниже.

Whipkey и Charles [216] вместе с соавторами ввели в культуру Artemisia annua L, используя верхушечные побеги зрелой части растения. Поверхность верхушечных побегов была стерилизована и культивирована в среде MS с несколькими комбинациями гормонов 2,4-Д (0; ОД; 1,0 мг/л) и БАП (0; 0,1; 10,0 мг/л). Образование осевых и боковых побегов было отмечено во всех

12

вариантах. При добавлении 10 мл/л БАП авторы наблюдали самое большое число побегов, но наиболее жизнеспособные побеги были получены при добавлении 1,0 мл/л БАП. Побеги были получены на среде MS при добавлении БАП 1 мл/л.

Определенная степень дифференциации клеточных культур это, возможно, одно из необходимых условий синтеза артемизинина. Paniego и Giuletti [175, 176] показали отсутствие накопления артемизинина в суспензионной культуре Artemisia annua L. и наличие следовых количеств этого соединения в культуре побегов. Woerdenbag [220] показал высокий процент содержания артемизинина в культуре побегов, выращенной на среде Уг MS с добавлением фитогормона 0,05 мг/л НУК, 0,2 мг/л БАП и 2% сахарозы. Максимальное накопление артемизинина наблюдалось в фазу цветения культуры побегов in vitro, вызванного добавлением фитогормона гиббереллиновой кислоты. Исследователями также не были обнаружены процессы накопления артемизинина в корнях интактных растений Artemisia annua L., однако при выращивании побегов в культуре, содержание артемизинина было выше в стеблях растений, выращиваемых с корнями, чем без них [105, 162]. Дальнейшие усилия исследователей были направлены на то, чтобы увеличить содержание артемизинина, оптимизируя состав питательной среды, добавляя фитогормоны, предшественники синтеза искомых веществ и элиситоры, а также изменяя физические факторы внешней среды, такие, как интенсивность и спектральный состав света а также температура [141] .

Способность Agrobacterium rhizogenes, вызывать образование культуры косматых корней (hairy root) на растении-хозяине заложила основу для изучения синтеза и накопления биологически активных веществ. Образование hairy root вызвано переходом Т-ДНК от плазмиды агробактерии к геному растения - хозяина, заканчивающемуся формированием корней с геном синтеза ауксинов, кодируемого бактериальной ДНК [37]. Культура hairy root имеет несколько преимуществ, благодаря которым ее часто

13

используют для получения биологически активных веществ биотехнологическими методами. Часто она растет очень быстро, напоминая культуру клеток, но, в отличие от последней, это полностью дифференцированные ткани, синтезирующие вторичные метаболиты. Легкость выращивания этой культуры и способность к синтезу широкого диапазона вторичных веществ, делает ее одной из наиболее выгодных с точки зрения продукции ценных вторичных метаболитов. Культура hairy root генетически устойчива. Кроме того, штаммы могут быть источником постоянного и стандартизированного производства вторичных метаболитов. Многочисленные исследования показали, что hairy root могут производить вторичные метаболиты во многих поколениях без потери генетической и биосинтетической стабильности. Это может быть связано с тем фактом, что их хромосомный набор остается таким же, как и в исходном растение и не подвержен легкой сомаклональной изменчивости, как в обычных культурах клеток растения [35, 36].

Потенциал культуры косматых корней по синтезу БАВ был подтвержден многочисленными группами исследователей. В дополнение к алкалоидам и никотину, культура косматых корней может производить терпеноиды, полиацетилен и другие вещества. Кроме низкомолекулярных соединений, корни могут накапливать полимеры типа крахмала, фруктозы и белков. Для оптимизации культивирования культуры hairy root и максимизации роста и продукции искомых веществ используют те же приемы, как и для клеточных культур [37].

Wang и Tan [205] показали интенсификацию накопления артемизинина в культуре hairy root при увеличении показателя NO3/NH4 и общей начальной концентрации нитратов. При уровне показателя NO3/NH4 в 5/1, оптимальная концентрация общих нитратов для максимального накопления артемизинина составила 20 мМ. При этом выход артемизинина увеличился на 57%. Wearthers и его группа исследователей [210] изучали воздействие методов стерилизации среды и типов источников углеводов в ней на рост культуры

hairy root и синтез ею артемизинина. Было показано, что хотя применение стерилизованной через фильтр среды культивирования способствует накоплению биомассы, по сравнению с автоклавируемой средой, накопление артемизинина в культуре на фильтр-стерилизованной среде было меньше. Рост культуры на среде с сахарозой (3,99 г/л) не отличался от роста на среде с фруктозой (3,75 г/л) и был лучше, чем рост на среде глюкозой (2,16 г/л), но культура, выращенная на глюкозе, отличалась увеличенным в 2-3 раза показателем накопления артемизинина. Гидрализат казеина, источник аминокислот и олигопептидов, в небольших концентрациях увеличивал выход артемизинина в культуре побегов [127, 212]. Комбинация БАП и кинетина увеличивала накопление искомого вещества в культуре побегов в 3,6 и 2,6 раза [216]. Гиббереллиновая кислота, гормон растений, индуцирующий цветение, как было показано, способен ускорять рост и увеличивать синтез артемизинина в культурах побегов, модифицированных корней и проростков Artemisia annua L. [113, 205, 211, 229]. Метилжасмонат, гормон стресса растений, также способен индуцировать синтез вторичных метаболитов [201]. A. Baldi и V.K. Dixit [78] получили суспензионную культуру полыни однолетней которая продуцировала 20 мг/л артемизинина. Добавление предшественника синтеза мевалоновой кислоты и элиситора метилжасмоната позволило увеличить накопление биомассы культуры до 15,2 г/л, а продукцию артемизинина до 110,2 мг/л, что в 5,93 раза больше чем в контроле. Кроме гиббереллинов и жасмоновой кислоты накоплению артемизинина также может способствовать эндогенное внесение брассиностероидов. Показано, что внесение 228-гомобрассинолида в культуральную среду приводит к увеличению накопления искомого вещества на 57% [214]. Синтез артемизинина также можно стимулировать добавлением в культуральную среду элиситоров, таких, как экстракт мицелия грибов Colletotrichum sp. [213], фитогормонов [78]. Изменение температуры в промежутке между 15-35 °С также влияет на рост и синтез артемизинина культурой hairy root. Максимальный рост был отмечен при 25

15

°С, в то время, как накопление артемизинина - при 30 °С [117]. Были изучены взаимосвязи между добавлением предшественников биосинтеза артемизинина и его накоплением. Добавление предшественников артемизинина в среду для тканевой культуры Artemisia annua L. увеличило его накопление в культуре в 11 раз и в среде - в 4 раза [209, 210]. Добавление одной мевалоновой кислоты не приводило к увеличению биосинтеза данного лактона [220]. Однако при добавлении таких веществ как нафтифин (ингибитор фермента сквален эпоксидазы) в культуральную среду увеличивало накопление артемизинина. Другие регуляторные вещества, такие, как 5-азацитидин (регулятор генов), колхицин, миконазол (ингибитор стерол деметилазы) и тербинафин (ингибитор фермента сквален эпоксидазы) оказались токсичными для культур, но также стимулировали синтез искомого вещества [153]. Для того, чтобы получить как можно больше потенциальных противомалярийных веществ и увеличить их стабильность in vivo, были предприняты большие усилия по изучению структурные модификации артемизинина и его аналогов. В связи с тем, что химические методы для получения данных модификация оказались дорогостоящи и ненадежны, были использованы методы микробной трансформации, как ценный инструмент, который может играть большую роль в данных модификациях. К сегодняшнему дню получено несколько таких веществ, представляющих собой модификацию артемизинина. Эти трансформации включают в себя превращение в За-гидроксидеоксиартемизинин и деоксиартемизинин, 9[3-гидроксиартемизинин и За-гидроксиартемизинин, и в 10-гидроксиартемизинин и 9[3-гидрокси-1 la-артемизинин. В дополнение к этому с помощью микроорганизмов были получены трансформанты аналогов артемизинина: артеметера, артеетера, артемизитена и 12-дексиартемизинина [154,178].

1.2 Вторичные метаболиты Artemisia annua L. и их фармакологическое действие

Благодаря своим способностям синтезировать биологически активные вещества, проявляющие противомалярийные свойства, Artemisia annua L. привлекла большое внимание ученых, которые изучали синтез в данном растении вторичных метаболитов [76, 138, 144, 159, 191, 198]. Наибольшее внимание исследователей привлекают сесквитерпены, т.к. именно к ним относится сесквитерпеновый лактон артемизинин, химическая структура которого была определена в 1972 году [73, 74, 75]. Артемизинин определяет антималярийные свойства экстрактов полыни однолетней. Артемизинин содержит эндопероксидную группу, редко встречающуюся в природных соединениях. Структура этого лактона была определена различными методами и полностью изучена при помощи рентгеновской кристаллографии [76, 82, 151, 155]. В надземных органах интактных растений были найдены соединения, родственные артемизинину. Это артеаннуины от А до G, деоксиартеаннуин В, артемизиновая кислота, метилэстер артемизиновой кислоты, эпоксиартемизиновая кислота, дигидроартемизиновая кислота, деоксиартемизинин, артемизитен, артемизин, артемизинол и другие (Рисунок 1) [71, 72, 76, 124, 222, 221]. Артемизинин, артеаннуин В и артемизининовая кислота это наиболее важные вторичные метаболиты вида [148]. Артемизинин в интактных растениях, выращенных в Китае, накапливается в концентрациях от ОД до 0,7%, в то время, как артеаннуин В и артемизининовая кислота накапливаются соответственно в 2-4 и 7-8 раз выше [197].

Артемизинин и его производные, сесквитерпеновые лактоны артеметер и артеаннуин используются в фармацевтике для лечения паразитарных заболеваний, в частности малярии [76, 145, 146]. Малярия одно из самых серьезных паразитарных заболеваний на сегодняшний день, являющееся причиной миллиона смертей и до 500 миллионов случаев заболеваний

ежегодно.

Рисунок 1 - Формулы основных сесквитерпенов Artemisia annua L.: а -артемизинон, б - дигидроартемизинин, в - артеметер

Несмотря на все предпринимаемые усилия, цифры смертности за последние 50 лет от малярии практически не изменились. Одной из ключевых проблем в данном случае является поиск эффективных лекарственных средств против данного заболевания. Одним из таких средств и является сесквитерпеновый лактон артемизинин, увеличивающий свою популярность как эфффективное и безопасное лекарство для лечения малярии. Артемизинин и его производные эффективны против устойчивых ко многим лекарствам штаммов Plasmodium falciparum в основном в Юго-Восточной Азии и Африке, без известных случаев устойчивости. В случае внутривенного введения артесунат действует более быстро чем хинин, что может приводить к уменьшению смертности [217]. Артемизинин прямо действует на бесполую стадию Р. falciparum, наиболее вредоносную форму данного паразита. Из-за увеличивающейся частоты встречаемости устойчивых к традиционным лекарствам штаммов малярийного плазмодия, комбинации артесунат- амодиакнина и артеметер-люмефантрина являются наиболее подходящими кандидатами для лечения устойчивых к лекарствам штаммов в Африке [136].

На сегодняшний день в общих чертах понятен механизм действия

артемизинина на Plasmodium falciparum. Его лекарственное действие может объясняться специфическими реакциями артемизинина с трансляционно-контролируемым тканевым белком, ингибированием

саркоэндоплазматическо ретикулярной Са2+АТФ-азы и цистеин протеазы [96, 128, 170, 185]. Эффективность действия сесквитерпеновых лактонов могут увеличивать другие биологически активные вещества присутствующие в растении: кастицин, артеметин, хризосфленетин, хризосфленол D и циркилинеол [76].

Известное противораковое действие сесквитерпеновых лактонов Artemisia annua L. артемизинина и его производных связано с мРНК экспрессией генов, которые, вероятно, воздействуют на пролиферацию опухолевых клеток (гены-регуляторы клеточного цикла, ростовые факторы вместе со связанными рецепторами, онкогены и гены-подавители роста опухоли) [99, 142]. При использовании методов микромассивов и кластерного анализа были выделены гены регуляции апоптоза, чья экспрессия коррелирует с IC50 значениями артемизинина клеточных линий Национального института рака США [100]. Дигидроартемизинин, компонент пути метаболизма артемизинина, проявляет свойства цитотоксичности по отношению к раковым клеткам легких, груди, яичников [188, 204]. Механизм, способный объяснить действие дигидроартемизинина, может включать в себя цитотоксическую активность, вызванную индукцией апоптоза лимфатических эндотелиальных клеток [207].

Артемизинин и его производные способны контролировать процесс ангиогенеза в опухоли - формирование новых сосудов, доставляющих кислород и питательные вещества опухолевым клеткам и способствующих распространению метастазов по другим органам и тканям [87]. В опытах на ксенотрансплантанте рака прямой кишки артемизинин не только подавляет клеточный рост, но также уменьшает спонтанные метастазы печени. Этот эффект может объясняться мембранной транслокацией |3-катенина и ингибированием активации пути биосинтеза Wnt/p-катенина [147].

19

Раковые клетки для роста и размножения нуждаются в большом количестве железа [188]. Артемизинин содержит эндопероксидную группу, которая под воздействием ионов железа вызывает формирование цитотоксичных радикальных остатков, что, в свою очередь, приводит к окислительному стрессу и гибели клетки [100]. Дигидроартемизинин способен удлинять S-фазу клеточного роста, действуя на циклинзависимые киназы, что снижает темп пролиферации опухолевой ткани. Клинические исследования показывают, что артемизинин и дигидроартемизинин могут подавлять рост клеток рака яичников, прямой кишки, поджелудочной железы [224].

Таким образом показан положительный противоопухолевый эффект выделяемых из полыни однолетней сесквитерпеновых лактонов, что, возможно, приведет в дальнейшем к использованию этих веществ в качестве основ для противораковых лекарств нового поколения [188].

Сесквитерпеновый лактон артесунат также способен проявлять противовирусные свойства. Показано, что артесунат ингибирует экспрессию человеческого цитомегаловируса в культуре клеток [97].

Артемизинин, как эндопероксидный сесквитерпеновый лактон, принадлежащий к группе изопреноидных соединений, образуется по пути биосинтеза всех изопреноидов [76, 137, 171]. Этот путь один из наиболее важных в растении. Терпеноиды образуются из двух общих предшественников, изопентенил дифосфата и его изомера, диметилаллил дифосфата [104, 156]. Установлено, что высшие растения осуществляют два независимых пути биосинтеза, ведущих к образованию изопентенил дифосфата: происходящий в цитоплазме мевалонатный путь и локализованный в пластидах мевалонат-независимый путь биосинтеза [101, 210]. Образующийся в результате артемизинин, как было показано, накапливается в листьях, стеблях, почках, семенах и гландулярных трихомах Artemisia annua L [95, 203]. Максимальное его количество обнаруживается в листьях, содержание колеблется в зависимости от места произрастания,

20

условий выращивания и стадии развития растения [105, 106, 143] (табл. 1-2).

Таблица 1 - Содержание артемизинина в различных органах Artemisia annua L., выращенной в оранжереи и на поле [105].

Орган растения Артемизинин (% от сырой массы)

Оранжерея Поле

листья 0,003-0,03 0,006-0,06

главный стебель 0-0,003 0,0004-0,007

боковые стебли 0 0,004-0,014

корни 0 0

соцветия 0,012-0,042 0,104-0,264

пыльца 0 Не обнаружен

кожица семян Не обнаружен 0,116

семена 0,036 0,081

Таблица 2 - Относительное распределение артемизинина в различных частях растения Artemisia annua L [105].

Часть растения1 Артемизинин (% от сухой массы) % от общего количества артемизинина в растении

Верхняя треть 0,15 41,7

Средняя треть 0,09 25,0

Нижняя треть 0,08 22,2

Боковые побеги 0,04 11,1

Главный стебель Следы —

Корни Отсутствует —

Семена2 0,04 —

1 - рассматриваются растения, после пересадки, которых до их цветения прошло 8 недель.

2 - семена собраны от 13-недельных растений.

21

Следующей по значимости для практического применения группой вторичных соединений Artemisia annua L. являются флавоноиды [81, 118]. Из интактных растений было выделено большое количество разнообразных флавоноидов [184, 228]. Из листьев растения были выделены следующие аглюконы: артеметин, хризосфленетин, хризосфленол D, кастицин, кверцетин, кемпферол, лютеолин, аксилларин и патулетин, цирсилинеол, евпаторин, пендулетин и другие [230]. Состав гликозидов представлен кверцетин-3-рутинозидом, лютеолин-7-О-глюкозидом и З-О-глюкозидами кемпферола, кверцетина, патулетина, и 6-метокси кемпферола (рис. 2)

Рисунок 2 - Формулы основных флавоноидов Artemisia annua L.: а -артеметин, б - кастицин.

Установлен возможный синергетический эффект действия некоторых флавоноидов интактных растений Artemisia annua L. Артеметин, кастицин, хризопленетил, эупаторин при совместном введении с артемизинином в коцентрациях 5 мкМ способны усиливать противомалярийные свойства артемизинина. Как предполагается, это связано с тем, что флавоноиды имеют большое сродство к серин-треонин киназам малярийного плазмодия, что приводит к снижению пролиферативных способностей паразитов [107].

Кроме противомалярийного действия флавоноидов, показано, что некоторые из них способны проявлять противоопухолевые свойства [218]. Флавоноиды способны предотвращать мутации в критических генах, таких, как онкогены или подавляющие рост опухолей гены, которые могут привести

[161,231, 232].

а

б

к развитию раковых заболеваний [125]. Апигенин и лютеолин, также найденные в интактных растениях Artemisia annua L., могут ингибировать пролиферацию опухолевых клеток [103]. Синергизм между флавоноидами и артемизинином, как потенциальным противораковым лекарственным агентом широкого спектра действия, на сегодняшний день пока не обнаружен [107]. Флавоноиды могут потенциально усиливать противораковый эффект артемизинина и его производных, увеличивая их биодоступность, ингибируя ферменты метаболизма, увеличивая в клетке содержание Fe2+ и снижая уровень Fe3+, а также действуя на ключевые предапоптозные и антиапоптозные белки [139, 177]. Для флавоноидов эупатина, кверцетина, апигенина, лютеолина и кемпферола показаны синергетические эффекты действия при комбинировании их с противораковыми препаратами (митоксантрон, пакликсател, рапамицин, винбланстин и другие) [98,107,167,].

1.3 Морфологические изменения клеток в процессе культивирования

В основе культивирования растительных клеток лежит свойство тотипотентности, благодаря которому соматические клетки растения способны полностью реализовать наследственную информацию, то есть обеспечить развитие всего растения [3,4].

В зависимости от способа, условий культивирования и происхождения можно выделить несколько типов культур клеток и тканей. Если культивирование происходит поверхностно на агаризованной питательной среде, то образуется каллусная ткань. Она не имеет четко выраженной структуры, но может различаться по плотности. Происхождение и условия выращивания определят, будет ли каллусная ткань рыхлой, средней плотности или плотной. Кроме того, существует суспензионная культура клеток, которую выращивают способом глубинного культивирования, т. е. с погружением в жидкую питательную среду в колбах на шейкерах или в биореакторах [234].

Каллусные культуры делят на типы по некоторым морфологическим признакам: цвет, консистенция, характер поверхности, пушение, интенсивность роста, способности к зеленению, а также тип морфогенной реакции. В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусная ткань бывает плотной с элементами дифференцировки (с зонами редуцирования камбия и сосудов); средней плотности с хорошо выраженными меристематическими очагами (органогенез); рыхлой, состоящей из сильно обводненных клеток [6,158].

Процесс образование каллусной ткани начинается с остановки клеточных делений в экспланте. Это состояние называется лаг-фазой и длится 24-48 часов. За это время клетки экспланта изменяют свою генетическую программу, увеличиваются в размерах и происходит разрыхление ткани. После окончания лаг-фазы клетки, потерявшие

специализацию и превратившиеся в меристематические, начинают усиленно делиться (логарифмическая фаза). Образование основной массы клеток приходится на экспоненциальную фазу роста, после чего начинается замедление и переход культуры клеток в стационарную фазу. В общем случае клеточный цикл у каллусных клеток более длительный, чем у интактных растений [4, 5].

Превращению любой клетки в каллусную предшествует процесс глубокой биохимической и структурной перестройки. Все изменения индуцируются экзогенными гормонами, но, кроме того, на этот эффект оказывает влияние физиологическая характеристика ткани-экспланта [39]. Например, частота каллусообразования на всех изучаемых средах при помещении листа адаксиальной стороной на поверхность агара была в 1,5-2 раза выше по сравнению с абоксиальной стороной и при этом формировался более обильный каллус [19]. Так же процент образования каллуса растительными тканями может быть связан с анатомо-морфологическими особенностями строения листовой пластинки и физиологической полярностью, обусловленной градиентом эндогенных и экзогенных физиологически активных веществ. У слоновой травы (Pennisetum purpureum Schumach.) основания молодых листьев содержат больше эндогенных фитогормонов (ПУК и АБК), чем средняя и апикальная зона листьев. Эта базальная зона содержит много делящихся клеток и более способна к каллусогенезу, чем другие части листа [17, 41].

Каллусные ткани в условиях in vitro можно выращивать неопределенно долго, периодически пересаживая. Состав среды определяется в процессе эксперимента. Изменяя в ней соотношение гормонов, можно индуцировать образование отдельных органов и эмбрионов, из которых получают растения-регенеранты.

При переходе клетки к каллусному росту многие свойства, присущие нормальным клеткам, сохраняются, в том числе способность к синтезу вторичных соединений. Вместе с тем каллусные клетки приобретают ряд

25

свойств, отличающих их от клеток в системе целого растения. Исчезают белки, характерные для фотосинтезирующих клеток листа, появляется большая гетерогенность, что выражается, прежде всего, в различной плоидности. Генетически стабильными in vitro являются меристематические ткани, тогда как в клетках остальных тканей при культивировании могут возникать полиплоидия, анеуплоидия, хромосомные аберрации, генные мутации. После 5-6 пересадок новый кариотип клеточной популяции стабилизируется, если условия культивирования остаются постоянными. В противном случае изменение физических или трофических факторов приведет к новым генетическим изменениям [3,39].

У многих видов тканей in vitro показано разнообразие форм и размеров клеток. Число и форма ядер в клетках также варьируется. При цитологическом исследовании клеток пиона и традесканции in vitro Yamada и Synoto [225] встречали наряду с клетками обычных размеров гигантские клетки, достигающие в диаметре 250 - 350 мкм у пиона и 800 мкм у традесканции. Гигантские многоядерные клетки наблюдались у моркови и люцерны. В суспензионной культуре табака (Nicotiana tabacum L.) [173]. Павловой выделено два типа клеток: мелкие округлые с диаметром 60-80 мкм и вытянутые, их длина превышала 2 мм. Загорской определены размер ы каллусных клеток табака, происходящих от диплоидного и полиплоидного растений, и показано, что в первом случае размеры клеток колебались от 50 до 240 мкм. В ткани, происходящей от полиплоидного растения, колебания клеточных размеров были более значительны - от 57 мкм до 750 мкм. Эти результаты показывают, что вариабельность клеточных размеров может быть связана не только с видовыми особенностями клеток, но и с уровнем их плоидности [20].

Величина клетки зависит также от её возрастного состояния. Известно, что стареющие клетки могут достигать гигантских размеров (500 - 1000 мкм), в то время как молодые каллусные клетки имеют небольшие размеры (15 - 30 мкм) [64]. При микроскопировании ткани гидрастиса установлено,

26

что ткань состоит из клеток меристемного и паренхимного типов, причем доля клеток каждого типа закономерно изменяется в течение пассажа. Приделы изменения длины меристемных клеток 8-40 мкм, а приделы изменения длины паренхимных клеток 36-996 мкм [1].

Условия культивирования каллусной культуры так же сказываются на морфологии и размерах клеток. Одним из таких факторов является состав среды. В каллусной ткани клена показано, что в отсутствии кинетина клетки увеличиваются и становятся более однородными по размерам [64]. Добавление в среду 2,4-Д или НУК по отдельности или вместе приводит к изменению микроморфологии каллусных клеток табака в течение пассажа [173]. Сравнительное изучение влияния различной продолжительности пассирования каллусных тканей чайного растения (10, 47 и 70-й пассажи) на среде, содержащей 2,4-Д, показало, что при этом происходит повышение темпов их роста, увеличение размера и степени вакуолизации клеток. Усиление роста длительно культивируемых каллусов чая обусловлено, в основном, растяжением клеток [22].

Широкое распространение при культивировании клеток и тканей получили суспензионные культуры - культуры клеток растений, выращиваемые в жидкой питательной среде при постоянной аэрации (доступ кислорода) в асептических условиях.

Особенности метаболизма, роста и дифференцировки культивируемой растительной клетки определяются ее видовой принадлежностью, дифференцировкой исходной тканевой клетки растения, из которой она возникла, и условиями выращивания.

Характерной особенностью популяции клеток высших растений, выращиваемых в суспензионной культуре, является гетерогенность по генетическим характеристикам клеток и фазам клеточного цикла. В результате этого суспензии не бывают однородными. Обычно в ней различают 4 основные фракции: одиночные клетки, мелкие агрегаты (2-10 клеток), средние агрегаты (10 - 30 клеток), крупные агрегаты (более 50

27

клеток). Наиболее часто клеточные суспензии представлены группами из 2 -10 клеток и многоклеточных агрегатов [6].

Субкультивирование в экспоненциальной фазе роста популяции приводит к получению более агрегированных культур, тогда как использование инокулята из суспензии, переходящей в стационарную фазу, дает более диссоциированную суспензию.

Как правило, при субкультивировании более диссоциированной фракции, клеточная продуктивность уменьшается. В группах и агрегатах клеточные деления наблюдается чаще, чем у одиночных клеток. Таким образом, фракции одиночных клеток и агрегатов можно рассматривать как своеобразные субпопуляции с разным коэффициентом размножения, с возможностью взаимных переходов из одного состояния в другое и зависимостью равновесия между ними от условий выращивания [4, 5].

Так как суспензии клеток высших растений в различные периоды культивирования содержат отдельные клетки, группы клеток, а также небольшие кусочки недифференцированной ткани, то в популяции клеток отмечается большой полиморфизм по форме, размеру, включениям, степени проявления подвижности цитоплазмы и др.

Для выращивания клеточных суспензий используют в основном те же питательные среды, что и для каллусных культур, однако необходима оптимизация сред с учетом влияния факторов аэрации и перемешивания, добавок к средам с целью увеличения их буферности и предотвращения пенообразования.

На сегодняшний день в России успешно культивируются суспензионные культуры высших растений: источник БАВ с адаптогенным действием Polyscias filicifolia Bailey, продуцент гипотензивных и противоаритмических индольных алкалоидов Rauwolfia serpentina Benth., источник синтеза алколоида берберина с антибактериальной и противоопухолевой активностью Thalictrum minus L., продуцент гиперцина Hypericum perforatum L., источник панаксозидов Panax japonicus (var. Repens) [7, 40, 66].

28

Суспензионные культуры могут быть не только источником уже известных ценных вторичных метаболитов, но также новых необычных соединений, не встречающихся в интактных растениях, таких, как камтотецин, харрингтонин и другие антиканцерогены, пептиды (ингибиторы протеаз, ингибитор фитовирусов). При использовании культуры клеток появляется возможность получения новых веществ при внесении в среды промежуточных реагентов, необходимых для биосинтеза тех или иных вторичных метаболитов. Такой подход представляет большой интерес при создании новых или модификации уже существующих лекарственных препаратов. Однако, необходимы продолжительные затратные усилия для того, чтобы культура смогла достигнуть оптимального уровня производства БАВ, в связи с необходимостью наличия клеточных культур растений, способных сохранять высокую стабильность выхода продуцируемого компонента [6].

Глава 2. Фоторегуляция роста и морфогенез клеточных культур лекарственных растений

2.1 Фотоморфогенез интактных растений

Ответ на световой сигнал затрагивает все аспекты роста растений. От прорастания до образования листьев и цветения, информация о световом окружении растений влияет на все их процессы жизнедеятельности [12, 13, 14, 32]. Свет действует на растение как комбинация положительных и отрицательных сигналов. Свет стимулирует прорастание и рост корней в процессе прорастания растений (ответ на красный и дальний красный компоненты светового сигнала), образование листьев и деление листовой палисадной паренхимы. В то же время свет ингибирует рост гипокотилей и междоузлий в процессе прорастания семян и акклиматизации растений к условиям освещенности [160, 164].

Растения содержат три основных класса рецепторов светового сигнала, ответственных за процессы фотоморфогенеза: фитохромы, криптохромы и фототропины [119]. Фитохромы ответственны за рецепцию красного и дальнего красного участков спектра и кодируются четырьмя генами в АгаЫйоръЬз МаНапа Ь. РНУВ-РНУЕ, или в томате РНУВ1, РНУВ2, РНУЕ, РНУБ, из которых РНУВ наиболее экспрессируемый [89, 122]. Рецепцию синего света осуществляют два класса фоторецепторов. Первый из них это криптохром, в АгаЫйор81Б кодируется генами СИУ! и СИУ2. Второй — фототропин, в АгаЫйорз18 продукт генов РНОТ1 и РНОТ2. Фототропин содержит флавиновую хромофорную группу в ЬОУ домене. Растительный геном также кодирует другие ЬОУ доменсодержащие белки, некоторые из которых, как было показано, могут играть роль в качестве фоторецепторов [133]. На сегодняшний день окончательно не выяснен путь рецепции зеленого света. Существуют как данные показывающие возможность существования отдельного рецептора зеленого света, так и данные,

подтверждающие гипотезу о том, что рецепция зеленого света осуществляется криптохромом или фототропином [111].

Взаимодействие различных рецепторов светового сигнала можно увидеть на примере переключения развития растений со скотоморфогенеза на фотоморфогенез при воздействии света на растения, выращенные в темноте [200]. Действие светового сигнала вызывает массивное траскрипционное перепрограммирование, наиболее важные компоненты из которого происходят под контролем фитохромов и криптохромов. Фототропины, связанные с мембраной, в основном контролируют быстрый ответ на световой сигнал, в том числе тропизмы, открытие устьиц и перемещение хлоропластов [195]. По прошествии нескольких часов после воздействия светового сигнала криптохромы изменяют экспрессию генов в ответ на синюю составляющую спектра, в то время как фитохромы реагируют на световой сигнал посредством изменения конформации цитоскелета или мембран [160].

Дальнейшая трансдукция световых сигналов от фитохромов и криптохромов, которые часто пересекаются, происходит через многочисленные метаболические пути, многие из которых расположены в ядре. Основной целью является протеолитическое разрушение репрессоров фотоморфогенеза, активных при выращивания растений в темноте. Это разрушение происходит посредством убиквитин\протеосомного пути. Изучение copldetlfus мутантов Арабидопсиса, которые, при выращивании в темноте, формируют характерный фенотип фотоморфогенеза, показало, что белки COP/DET/FUS служат отрицательными регуляторами фотоморфогенеза. Впоследствии было показано, что эти шесть этих белков взаимодействуют с 450-550 kDa комплексом, состоящим из 8 субъединиц и названным СОР9 сигналосома (CSN). Кроме того, выяснено что CSN регулирует цветение растений, гормональный ответ и устойчивость к патогенам (рис. 3) [160, 229].

¿> ^ А,

Темнота

Фоторецепторы PHY/CRY

CSN СОРЮ

СОР1 DET

Сеет

Фотй«шйщенез

Рисунок 3 - регуляция морфологического ответа на световой сигнал в АгаЫ^о/шя ШаИапа Ь. [160].

Свет через систему рецепторов действует на прорастание семян. Центральным процессом прорастания является активность апикальных меристем. Свет и фитогормоны гиббереллины, как показали исследования, это факторы, запускающие прорастание. Прорастание начинается с рецепции света, часто это лунный свет, и контролируется фоторецептором фитохромом А [190]. Действие этого и других фитогормонов контролируется гиббереллинами, как показано на экспериментах с выращиванием мутантов по Гиббереллиновой кислоте (ГК) в темноте и на свету. Кроме того, фитохром регулируется траскрипцией гена ОАЗох1, который преобразует неактивную ГК в активную форму ГК4 [226]. Контроль биосинтеза ГК осуществляется через короткий сигнальный каскад, использующий стабилизированные фитохром содержащие траскрипционные регуляторы. Одним из таких регуляторов является белок Р1И/Р1Ь5, который напрямую дестабилизируется взаимодействием с активным фитохромом и негативно действует на гены биосинтеза ГК. Таким образом, действие ГК, которые

32

напрямую или косвенно приводят к активизации деления корневой меристемы, происходит через дестабилизацию подавляющего рост белка БЕЬЬА [84].

Одним из наиболее ярких аспектов действия селективного света на рост растений является феномен противоположного действия в примыкающих соседних органах. Переход растений от скотоморфогенеза к фотоморфогенезу вызывает разрыв эмбриональных семядолей и возобновление деятельности апикальной меристемы побега. Например, полное отсутствие или снижение уровня экспрессии генов фитохромов рЬуА и рИуВ, а также криптохромов приводит к аномальному развитию гипокотиля в длину на свету, а также к задержке образования листьев [163].

Световой сигнал также регулирует развитие листа, как самого главного светособирающего органа растения. На свету высокой интенсивности в толще листа формируется толстый слой палисадной паренхимы, состоящей из множества слоев, с клетками вытянутыми перпендикулярно листовой поверхности. Такие изменения являются результатом как деления клеток, так и их взаимного расположения. Окончательной целью таких изменений является выработка такого внутреннего строения листа, при котором внутренняя затененность высока, большинство хлоропластов расположены параллельно световому потоку (минимизируя его поглощение), что препятствует фотоповреждению хлоропластов [199]. С другой стороны, в условиях низкой освещенности, клетки листа формируют тонкую листовую пластинку для того, чтобы максимально полно поглотить все доступные кванты солнечного света [202].

Таким образом, палисадная паренхима контролирует сама себя в зависимости от условий освещенности. По некоторым данным, для формирования клеток палисадной паренхимы необходимы две предпосылки - воздействие синего света и присутствие функциональных хлоропластов. Специфичность синего света обеспечивается фотоморфогенными световыми

рецепторами. Природа их остается нераскрытой, однако в данном процессе не участвует ни о криптохром ни фототропин [150]

Из всего вышеизложенного ясно, что на сегодняшний день в общих чертах изучено действие селективного света на уровне целых интактных растений [160], однако действие селективного света на морфологические и физиологические параметры отдельных клеток, в том числе клеточных культур, остается до конца не раскрытым [119, 150].

2.2 Действие селективного света на ростовые, биохимические параметры и морфогенез клеточных культур

Среди всех факторов регуляции роста клеточных культур свет занимает особое место [14, 52]. Для многих культур in vitro показано влияние света на ростовые параметры и накопление биомассы [18, 31, 56, 57, 172]. При этом иногда наблюдается взаимосвязь между эффектом освещения и концентрациями сахарозы, фитогормонов и других ростовых веществ [11]. В работах с культурой клеток амаранта (Amaranthus paniculatus L.j отмечали ускоренный рост каллуса в условиях освещения белым светом на среде с пониженным содержанием сахарозы, с сохранением и усиление зелёной окраски культур. В результате были выявлены оптимальные концентрации фитогормона 2,4-Д (1-5 мг/л), и получена автотрофная каллусная культура для дальнейших исследований [38]. Изучение влияния света на рост каллуснои ткани солодки голой показало, что скорость роста на свету в 2 раза больше, чем в темноте [61].

Выращивание клеточной культуры серпухи венценосной Serratula coronata L. на красном свету приводило к стимуляции роста, замедлению старения культуры. Обнаружена действие облучения длинноволновым участком спектра на накопление фитоэкдистероидов [23]. В работах с каллусной культурой Camellia sinensis L., выращенной в темноте и на свету (интенсивность 3000 лк), с добавлением в среду культивирования гормона 2,4-Д (2-Ю"5 М)

и глюкозы (2,5%), наблюдалось накопление культурой, помимо флаванов, также флавонолов (кемпферол и кверцетин) и гликозидов. Таким образом, хлоропласты являются одним из центров синтеза фенольных соединений в клетках растения [33]. Sakamoto с сотр. [186] показали стимуляторное действие света на продукцию антоцианов, виндолина, катарантина и каффеина в суспензионных культурах. Также накопление антоцианов зависит от света в случае клеточных культур Daucus carota L. и Vitis vinifera L. [91]. Mulder-Krieger с сотр. [168] обнаружили, что освещение

35

каллусных культур Marticaria chamomilla L. вызывает накопление сесквитерпенов. Свет увеличивает содержание кофеина в суспензионных культурах Cojfea arabica L. в 10 раз по сравнению с темновой культурой [140].

Исследовали экспрессию генов синтеза шиконина в культуре Onosma paniculatum Pall, на свету и в темноте. Была выделена полноразмерная комплиментарная Днк-библиотека из клеточных культур, выращенных в темноте и на белом свету. Анализ экспрессии генов показал, что в световой культуре в сравнении с темновой обнаружено 23 гена - 17 генов с известными функциями, 2 гена с запутанными функциями и 4 новых гена. Из этого количества генов, 2 гена связаны с синтезом этилена, что может объяснить участием этого фитогормона в светозависимом синтезе шиконина [181].

Было исследовано накопление антоцианов в суспензионной культуре Vit is vinifera L. Установлено, что освещение культуры непрерывным белым светом интенсивностью 8000-8300 люкс увеличивает накопление антоцианов в 7 раз, а добавление жасмоновой кислоты в 8 раз. При одновременном внесении в среду культивирования жасмоновой кислоты и освещении белым светом накопление антоцианов увеличилось в 14 раз [91].

Исследовали действие селективного света на рост каллусной культуры Cistanche deserticola Ma и синтез ею фенилэтаноидных гликозидов. Установлено, что синий свет увеличивал на ростовые показатели культуры и накопление ею гликозидов на 19% и 41% соответственно, по сравнению с белым светом [174].

В условиях, приближенных к промышленным, в биореакторах было изучено действие света на накопление пигментов культурой Carthamus tinctorius L. Использовалась двухстадийная схема культивирования, при которой суспензия сначала выращивалась в 10 литровом пузырьковом биореакторе для накопления биомассы, а затем переносилась в 5-литровый биореактор с воздушной продувкой для накопления пигментов. Таким

образом было установлено, что свет и добавление сахарозы в больших концентрациях стимулирует рост суспензии и накопление ею пигментов [115].

Изучено накопление антоцианов клетками Fragaria ananassa Duchesne cv. Shikimari в зависимости от интенсивности и периода освещения. Показано, что синтез антоцианов стимулировался белым светом. Максимальное их накопление обнаружено в культуре, выращиваемой под постоянным освещением [141].

При изучении влияния солнечного света на рост интактных растений Artemisia annua L. установлено, что максимальных значений ростовых показателей и накопления артемизинина показывали растения, выращиваемые на полном освещении солнечным светом, в то время, как уменьшение этого фактора приводило к снижению исследуемых величин [207]. Изучалось действие света на рост и синтез артемизинина культуры hairy root Artemisia annua L. Показано, что максимальных значений в накоплении сухой массы (13,8 г/л) и артемизинина (244,5 мг/л) достигала культура, выращиваемая на белом свету интенсивностью 3000-4000 Люкс и с фотопериодом 16 часов [152].

Изучено действие селективного света на рост культуры hairy root Artemisia annua L. Показано, что выращивание под красным светом, с максимумом излучения 640 нм, данной культуры в течении 30 дней приводит к увеличению накопления биомассы на 17% и накопления артемизинина на 67% по сравнению с белым светом. Зеленый свет приводит к снижению данных параметров [208].

Таким образом ясно, что в процессах выращивания клеточных культур для получения вторичных метаболитов селективный свет может играть ключевую роль как фактор, могущий способствовать ускорению роста культур и накоплению искомых веществ. Однако, на сегодняшний день процессы фотоморфогенеза в культурах не изучены в достаточной степени, что мешает применить полученные знания в промышленных процессах.

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Песяк, Сергей Владимирович

Выводы

1. Получены светозависимые каллусная и суспензионная культуры Artemisia annua L. и определены основные параметры наиболее благоприятных условий для их культивирования. 6-Бензиламинопурин в концентрации 0,5 мг/л в среде уменьшает объемы каллусных клеток в возрасте 15 суток. Увеличение содержания 6-Бензиламинопурина в среде до 1 мг/л снижает долю вытянутых каллусных клеток по сравнению с округлыми. Наибольший прирост биомассы и объемов клеток суспензии отмечен на 9-е сутки культивирования.

2. Получена культура hairy root корней Artemisia annua L., рост которой не зависит от света.

3. Синий свет (450 нм) с экспозицией 16 часов стимулировал рост каллусной культуры Artemisia annua L, уменьшая размер всех типов клеток. Зеленый свет (550 нм) равной интенсивности и экспозиции подавлял рост каллусной культуры, с одновременным увеличением объема клеток.

4. В культуре клеток Artemisia annua L. in vitro на свету разного спектрального состава идет синтез пигментов: хлорофиллов А, Б и каротиноидов.

5. Свет подавлял образование флавоноидов, максимальные значения накопления которых обнаружены в каллусной культуре Artemisia annua L. в условиях темнового режима культивирования

Заключение

Нами была получена каллусная культура полыни однолетней (штамм 1М) для которой была оптимизирована среда выращивания по качественному и количественному составу фитогормонов. Установлено, что оптимальной средой для культивирования каллусной культуры Artemisia annua L. является среда MS с 0,5 мг/л а-НУК и 0,2 мг/л 6-БАП. Добавление в питательную среду гормона 6-БАП в концентрации 0,5 мг/л приводит к снижению объемов клеток культуры. При увеличении концентрации 6-БАП до 1 мг/л отмечено снижение доли вытянутых клеток по сравнению с округлыми.

Изучено действие мио-инозитола, гиббереллиновой кислоты, гидролизата казеина и активированного угля на рост каллусной культуры Artemisia annua L. Добавление мио-инозитола в концентрации 100 мг/л в питательную среду стимулировало рост каллусной культуры Artemisia annua L., в то время как добавление активированного угля, гидролизата казеина и фитогормона ГК3 подавляло этот процесс. Однако, при дальнейшем субкультивировании каллусной культуры отличия между ними на среде с мио-инозитолом и без него становились незначимы. Гомобрассинолид в концентрации 5-10 мкг/л стимулировал рост каллусной культуры.

Показано, что сахароза в концентрации 15 г/л среды стимулировала рост каллусной культуры, в отличии от глюкозы и сахарозы в концентрации 30 г/л. Жасмоновая кислота 5 мкг/л среды не способствовала накоплению воздушно-сухой массы каллусной культуры.

Впервые нами получена суспензионная культура (штамм 1ПС), обладающая высокой и стабильной скоростью роста, для которой была подобрана среда и оптимизирован режим культивирования. Установлено, что оптимальной средой культивирования является MS, 0,5 мг/л а-НУК и 0,2 мг/л БАП. Изучены кинетические характеристики роста суспензионной культуры. Увеличение количества клеток в 1 мл среды и их объемов происходило на 9-е сутки.

Показана световая зависимость роста и морфогенеза клеточной культуры Artemisia annua L., которая активно синтезировала хлорофиллы А, Б и каротиноиды.

При исследовании регуляторной роли монохроматического красного, синего и зеленого света на морфогенез клеток каллусной культуры полыни однолетней, максимальные значения индекс роста показаны у каллусной культуры, выращенной на синем свету по сравнению с контролем в темноте (экспозиция 16 часов). Увеличение объемов клеток каллусной культуры, отмеченное в варианте на зеленом свету вероятно связано с задержкой клеточного деления, которое происходило более активно на красном и синем. При увеличении интенсивности света происходило пропорциональное увеличение скорости роста каллусной культуры на зеленом свету, в отличие от синего и красного. Это подтверждает предположение о специфическом действии зеленого света на рост каллусной культуры.

Для суспензионной культуры Artemisia annua L. установлено, что значимое увеличение ростового индекса и накопления сухой массы происходит на синем свету по сравнению с красным.

Изучено накопление флавоноидов в клеточных культурах Artemisia annua L. Свет (26±1 °С) подавлял синтез флавоноидов. Добавление гомобрассинолида в концентрации 10 мкг/л в культуральную среду увеличивало содержание флавоноидов в каллусных клетках на белом свету.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Песяк, Сергей Владимирович, 2012 год

Литература

1. Александрова И.В., Аверьянов В.А., Чернышев Р.В., Быков В.А. Каллусная ткань и суспензионная культура Hydrastis Canadensis L.: ростовые, цитогенетические особенности и первичная оценка биосинтетического потенциала // Биотехнология. - 2004. - № 1. - С. 39-46.

2. Барыкина Г.П., Веселова Т.Д., Девятов А.Г. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы. - М.: Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова (МГУ), 2004. - 312 с.

3. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей как метод изучения процессов роста морфогенеза растений. - М.: Колос, 1959. - С. 32-37.

4. Бутенко, Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. - М.: Наука, 1964. - 287 с.

5. Бутенко, Р.Г. От свободноживущей клетки к растению. - М.: Изд-во «Колос», 1971.-93 с.

6. Бутенко, Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе. - М.: ФБК- ПРЕСС, 1999. - 48-70 с.

7. Вардапетян P.P., Киракосян А.Б., Чарчоглян А.Г. Кинетические закономерности роста глобулярных структур в клеточных культурах зверобоя продырявленного Hypericum perforatum L. // Биотехнология. - 2000. - № 4. - С. 5358.

8. Воскресенская Н.П. Фоторегуляторные аспекты метаболизма растений // XXXVIII Тимирязевские чтения: сб. ст. - М.: Наука, 1979. - С. 47-58.

9. Воскресенская Н.П., Поляков М.А. Регуляторное действие синего света на фотосинтетический газообмен: спектр действия и световое насыщение газообмена С02 у левкои и ландыша // Физиология растений. - 1976. - Т. 23. - С. 23

10. Георгиевский В.П., Рыбаченко А.И., Казаков А.П. Физико-химические и аналитические характеристики флавоноидных соединений. -Ростов: Издательство Ростовского университета, 1988 - 144 с.

90

11. Головацкая И.Ф., Карначук P.A. Регуляторная роль света в процессах фотосинтеза и роста лекарственных растений // Теоретические и практические аспекты изучения лекарственных растений: Материалы, посвящённые памяти профессора JI.M. Березнеговской. - Томск: Сибирский госмедуниверситет, кафедра фармакогнозии с курсом ботаники. - 1996. - С. 49-51.

12. Головацкая И.Ф., Карначук P.A. Динамика роста растений и содержание эндогенных фитогормонов в процессе ското- и морфогенеза фасоли // Физиология растений. - 2007. - Т. 54. - № 3. - стр. 461- 468

13. Головацкая И. Ф. Регуляция гиббереллинами роста, развития и гормонального баланса растений арабидопсис на зеленом и синем свету // Физиология растений. - 2008. - Т. 55 - № 2 - С. 548 -552

14. Головацкая И.Ф., Карначук P.A. Влияние жасмоновой кислоты на морфогенез и содержание фотосинтетических пигментов у проростков арабидопсис на зеленом свету // Физиология растений. - 2008. - Т. 55 - № 2 -С. 240-244

15. Государственная фармакопея СССР: Вып. 1. Общие методы анализа / МЗ СССР — 11-е изд. доп. - М.: Медицина, 1987. - 336 с.

16. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР — 11-е изд. доп. -М.: Медицина, 1990. - 336 с.

17. Гюнтер Е.Ф. Получение каллусных культур Silene vulgaris (М.) // Биотехнология. - 2002. - № 6. - С. 41-45.

18. Евстигнеев В.Б. Методы исследования фотохимических реакций фотосинтеза in vitro и in vivo. -Пущино. - 1975. - С.34-56.

19. Егорова H.A. Культура каллусных тканей лаванды // Физиология и биохимия культурных растений. - 2003. - Т. 35. - № 2. - С. 285-290.

20. Загоскина Н.В., Запрометов М.Н. Влияние 1-Нафтилуксусной кислоты на рост и образование фенольных соединений в культуре ткани чайного растения // Физиология растений. -1979. - Т. 26. - Вып. 4. - С. 681-687.

91

21. Запрометов М.Н. Вторичный метаболизм в культурах клеток и тканей растений: Культура клеток растений. - М.: Наука, 1981. - 37-51 с.

22. Запрометов М.Н., Стрекова В.Ю., Субботина Г.А., Загоскина Н.В. Действие кинетина на дифференциацию и образование фенольных соединений в каллусной культуре чайного растения // Физиология растений. -1986. -Т. 33. Вып. - 2. -С. 357-364.

23. Карначук P.A., Бенсон H.A., Трофимова H.A. Клеточная культура серпухи венценосной как перспективный продуцент фитоэкдистероидов (Томский университет, Томский мединститут) // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. - М.: Наука. -1991.-С.39-41.

24. Карначук P.A., Клепикова Т.В., Шилова И.В. Культура ткани Atragene sibirica L. - продуцент биологически активных сапонинов // Физиолого-биохимические аспекты изучения лекарственных растений: Материалы Международного совещания, посвященного памяти В.Г. Минаевой. - Новосибирск. -1998. - С.29.

25. Карначук P.A., Дорофеев В.Ю., Шилова И.В., Краснов Е.А. Синтез сапонинов в культуре ткани Atragene sibirica L. // IV съезд общества физиологов растений России «Физиология растений - наука III тысячелетия»: тез. докл. междунар. конф. - М., 1999. - Т.2. - С.593.

26. Карначук P.A., Краснов Е.А., Дорофеев В.Ю., Шилова И.В. Клеточная культура княжика сибирского - перспективный источник лекарственных средств // Биотехнология на рубеже двух тысячелетий: матер, междунар. научн. конф. - Саранск: Изд-во Мордов. ун-та,2001. - С. 182-183.

27. Карначук P.A., Дорофеев В.Ю. Клеточная культура княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.) в контролируемых условиях in vitro // Актуальные проблемы экологии: матер, междунар. науч.-практ. конф. -Караганда: Изд-во Карагандинского государственного ун-та, 2003. - Ч. 1. - С. 261-263.

28. Карначук P.A. Дорофеев В.Ю. Регуляция роста клеточной культуры княжика сибирского {Atragene speciosa Weinm.) in vitro II Вестник Томского

92

государственного университета. Серия «Биологические науки» (биология, почвоведение, лесоведение). Приложение. - 2003. - №8 - С. 68-70.

29. Карначук P.A., Якимов Ю.Е., Дорофеев В.Ю. Влияние жасмоновой кислоты на рост миниклубней оздоровленного in vitro картофеля в условиях гидропоники // Физиология растений - основа биотехнологии: тез. докл. междун. конф.- Пенза, 2003. - С. 397-398.

30. Карначук P.A., Вайшля О.Б., Дорофеев В.Ю. Влияние условий выращивания на гормональный статус и урожайность высокорослой и карликовой линий пшеницы // Физиология растений. - 2003. - Т. 50. - № 2. -С. 1-6.

31. Карначук P.A., Гвоздева Е.С., Ефимова М.В. Световая регуляция морфогенеза растений табака, трансформированных геном интерлейкина-18 человека //Физиология растений. - 2008. - Т. 55 - № 4 - С. 260-264

32. Карначук P.A., Медведева Ю.В., Песяк C.B., Дорофеев В.Ю. Клеточная культура Artemisia annua L. как возможный источник веществ противопаразитарного действия // Биотехнология начала III тысячелетия: тез. докл. междунар. науч. конф. - Саранск: Типография ООО «Мордовия -Экспо», 2010-С. 117-118

33. Карпилов Ю.С., Опарина JI.A., Кузнецова Л.Г. Изменение фотосинтетического аппарата при переходе культуры ткани руты от фотогетеротрофного питания к автотрофному // Физиология и биохимия культурных растений. - 1977. - Т.9. - Вып.1 (46) (январь-февраль). - С. 9399.

34. Клешнин А.Ф. Растение и свет. - М.: Наука, 1954. - 453 с.

35. Кузовкина, И.Н. Культивирование генетически трансформированных корней: возможности, перспективы использования физиологии растений // Физиология растений. - 1992. - Т. 39. - № 6. - С. 1208-1214.

36. Кузовкина И.Н., Гусева A.B., Альтерман И.Е., Карначук P.A. Образование флавоноидов в трансформированных корнях Scutellaria

93

baicalensis и пути их регуляции // Физиология растений. - 2001. - Т. 48. - № З.-С. 523-528.

37. Кузовкина И.Н., Сарка С., Хетели Е., Лемберкович Е., Сёке Е. Состав компонентов эфирного масла генетически трансформированных корней руты душистой // Физиология растений - 2009. - Т. 56. - № 1. - С. 935-941.

38. Кузьменко Н.Ю. Некоторые аспекты культивирования амаранта in vitro // Фотосинтез и фотобиотехнология: тез. докл. межд. конф. - Пущино, 1991.-С. 34-36.

39. Кунах В.А. Изменчивость растительного генома в процессе дедифференцировки и каллусообразования in vitro II Физиология растений. - 1999. -Т. 46.-С. 919-929.

40. Кунах В.А. Особенности получения и продуктивность суспензионных культур и клеточных клонов раувольфии змениной Rauwolfia serpentina Benth. in vitro II Биотехнология. - 2001. - № 4. - С. 9-21.

41. Кунах В.А., Можилевская Л.П., Потапчук Е.А., Музыка В.И. Получение культуры тканей Ungernia victoris и её особенности при выращивании на питательных средах различного состава // Биотехнология. - 2007. - № 1. - С. 14 -21.

42. Лекарственное растительное сырье, офиц. изд. - М.: Изд-во стандартов, 1980. - 269 с.

43. Минаева В.Г. Лекарственные растения Сибири. - Новосибирск: Наука. Сиб. отделение, 1978. - 252 с.

44. Мокроносов А.Т. Онтогенетический аспект фотосинтеза. - М.: Наука, 1981.- 196 с.

45. Мокроносов А.Т., Березенкова P.A. Методика количественной оценки структуры и функциональной активности фотосинтезирующих тканей и органов // Труды по прикл. ботанике, генетике и селекции - 1978. -Т. 61. - Вып.З. - С. 119-133.

46. Николаева Л.А., Воллосович Л.Г. Влияние стимуляторов роста на

накопление биомассы и алкалоидов в суспензионной культуре ткани Rauwolfia serpentina Benth // Растительные ресурсы. - 1977. - Вып. 13. - С.450.

47. Патент Cl 2393217 RU C12N 5/04. Питательная среда для культивирования каллусной культуры Artemisia annua L. / P.A. Карначук, Ю.В. Медведева, В.Ю. Дорофеев, C.B. Песяк - № 2009100365; заявлено 11.01.2009; опубл. 27.06. 2010, Бюл. № 18 - 5 с.

48. Песяк C.B., Комлева Е.В., Карначук P.A. Оптимизация условий культивирования каллусной культуры полыни однолетней // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: тез. докл. межд. конф. - Москва: ИД ФБК-ПРЕСС, 2008 - С. 295-296.

49. Песяк C.B., Комлева Е.В. Оптимизация питательной среды для эффективного культивирования каллусной культуры Artemisia annua L. // Современные фундаментальные проблемы физиологии и биотехнологии растений и микроорганизмов: тез. докл. молодежи, всерос. школы-семинара. - Томск: Самиздат, 2008 - С. 26-27.

50. Песяк C.B. Действие селективного света на рост клеточных культур растения Artemisia annua L. // Вестник ТГУ. Биология. - 2010. - № 2(10) - С. 29-36.

51. Песяк C.B. Действие селективного света на рост суспензионной культуры Artemisia annua L. // XVI международн. научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «JIOMOHOCOB-2010»: тез. докл. -Москва: Издательство МГУ, 2010 - С. 260-261

52. Протасова H.H., Уеллс М.Д. Светокультура как способ выявления потенциальной продуктивности растений // Физиология растений. - 1987. - Т. 37. -Вып. 4.-С. 812-817.

53. Решетняк О.В., Князьков И.Е., Смоленская И.Н. Изменение состава и соотношения гинзенозидов в биомассе каллусной и суспензионной культуры клеток Panax japonicus (var. repens) в зависимости от условий сушки // Биотехнология. - 2003. - №2. - С. 69-75.

54. Саитбаева И.М., Сидякин Г.П. Кумарины из Artemisia annua // Химия природных соединений. - 1970 - T6.-c.758.

55. Скуратова Е.В., Гольд В.М., Юшкова Е.В., Репях С.М. Влияние фитогормонов на процессы роста и синтеза вторичных веществ в культуре in vitro василистника малого // Биотехнология. - 1999. - № 2. - С. 46-52.

56. Смолов А.П., Игнатьев А.Р., Полевая B.C. Становление функций фотосинтетического аппарата в культуре тканей in vitro // Физиология растений: Институт фотосинтеза АН СССР. - 1975. - Т.22. - Вып.2. - С. 428429.

57. Смолов А.П., Полевая B.C. Физиологические аспекты утилизации сахарозы гетеротрофной и фотогетеротрофной культурой изолированных тканей // Физиология растений: Институт фотосинтеза АН СССР. - Т.27. -Вып.З.-С. 612-617.

58. Тихомиров A.A., Золотухин И.Р. Газообмен и продуктивность растений выращенных на красном свету // Фотосинтез и фотобиотехнология: тез. докл. и сообщ. межд. конф. - Пущино, 1991. - С. 32-37.

59. Тихомиров A.A., Шарупич В.П., Лисовский Г.М. Светокультура растений. - Новосибирск: Изд-во Сибирского отделения Российской Академии наук, 2000. - 213 с.

60. Точнова Т.В., Бубенчикова В.Н. Спектрофотометрический метод количественного определения суммы флавоноидов в цветках липы // Ресурсоведческое и фитохимическое изучение лекарственной флоры СССР: Научн. труды. - 1991. - Т.29. - С.150-154

61. Уразалиев K.P., Сванбаев Е.С. Фотогетеротрофный рост и фотосинтез в каллусной культуре солодки голой // Известия Академии наук Казахской ССР. - Сер. биологическая. - 1989. - Вып. 4 (154). - С. 23-30.

62. Урманцева В.В., Гаевская O.A., Карягина Т.Б., Баирамашвили Д.И. Влияние аминокислот как компонентов питательной среды на накопление протобербериновых алкалоидов в культуре клеток василистника малого // Физиология растений. - 2005. - Т. 52. - № 3. - С. 438-442

63. Флора Сибири, т. 13 Asteraceae / под. ред. проф. Красноборова -Новосибирск: Наука, Сиб. Предприятие РАН, 1997 - 472 с.

96

64. Фролова J1.B. Особенности популяции культивируемых клеток // Культура клеток растений: сб. ст. - М.: Наука, 1981. - С. 64 - 69.

65. Цельникер Ю.Л., Мокроносов А.Т. Физиологические основы теневыносливости древесных растений. - М.: Наука, 1978. - 215 с.

66. Чайко А.Л., Решетняк О.В., Куличенко И.Е. Культура клеток женьшеня японского Panax japonicus (var. repens): получение каллусной и суспензионной культуры, оптимизация роста и анализ панаксозидов // Биотехнология. -1999. - № 6.-С. 51-55.

67. Шлык А.А. Определение хлорофиллов и каротиноидов в экстрактах зеленых листьев // Биохимические методы в физиологии растений: сб. ст. -М.: Наука, 1971.-С. 154-171.

68. Шульгин И.А. Растение и солнце. - Л.: Гидрометеоиздат, 1973. - 382 с.

69. Юшкова Е.В. Особенности роста каллусных тканей Catharanthus roseus L. в зависимости от способа культивирования // Биотехнология. -1998. - № 6. - С. 42-47.

70. Abdin M.Z., Israr М., Rehman R.U., Jsin S.K. Artemisinin, a novel antimalarial drug: biochemical and molecular approaches for enhanced production // Planta Med. - 2003. - Vol. 69 - P. 289-299

71. Agrawal P.K., Bisnoi V. Sterols and taraxastane derivatives from Artemisia annua and a rational approach based on 13C NMR for the identification of skeletal type of amorphane sesquiterpene // Ind. J. Chem. - 1996. - Vol. 35. - P. 86-88.

72. Ahmad A., Mishra L.N. Terpenoids from Artemisia annua and constituents of its essential oil // Phytochem. - 1993 - № 37 - P 183-186.

73. Anon. Co-ordinating Group of Research on the structure of Qing Hau Sau. A new type of sesquiterpene lactone-Qing Hau Sau // Chem. Abs. - 1977. -№ 87. - P. 987-988

74. Anon. Qinghaosu Antimalarial Co-ordinating Research Group. Antimalarial studies on Qinghaosu, Artemisia annua // Chin. Med. J. - 1979. -Vol. 92.-№8.-P. 811-816.

75. Anon. Fourth meeting of the Scientific Working Group on the Chemotherapy of Malaria - Beijing, People's Republic of China; WHO report, 1981.-312 p.

76. Artemisia. Medicinal and Aromatic Plants - Industrial profiles / ed. by C. Wright. - London: Taylor and Francis, 2002. - 359 p.

77. Avery M.A., Chong W.K.M., Jennings-White C. Stereoselective total synthesis of (+)-artemisinin, the antimalarial constituent of Artemisia annua L. // J. Am. Chem. Soc. - 1994. - Vol. 114. - P. 974-979.

78. Baldi A., Dixit V.K. Yield enhancement strategies for artemisinin production by suspension cultures of Artemisia annua / A. Baldi, V.K. Dixit I I Bioresource Techn. - 2007. - Vol. 24. - P. 143-149

79. Barkovich R., Liao J.C. Metabolic engineering of isoprenoids // Metab. Eng. - 2001. - Vol. 3. - P. 27-39

80. Beekman A.C., Wierenga P.K. Artemisinin-derived sesquiterpene lactones as potential antitumour compounds: cytotoxic action against bone marrow and tumour cells // Planta medicine. - 1998. - № 64. - P. 615-619.

81. Bhakuni D., Jain C., Sharma R.P., Kumar S. Secondary metabolites of Artemisia annua and their biological activity 11 Current science. - 2001. - Vol. 80. -№. 1. - P.125-128

82. Bharathi A., Yan-Hong W., Troy J.S., Mabusela W. Comparison of LC-UV, LC-ELSD and LC-MS methods for the determination of desquiterpenoids in various species of Artemisia // Chromatographia. - 2009. - Vol. 70. - P. 343-349

83. Blando F., Albrizio M., Marti L., Mita G. Establishment of in vitro cell cultures of Artemisia annua L. for the production of the antimalarian phytochemical artemisinin I I Proceedings of the 50th Italian Society of Agricultural Genetics Annual Congress Ischia, Italy - 10/14 September, 2006. - P. 24

84. Cao D., Hussain A., Cheng H., Peng J. Loss of function of four DELLA genes leads to light- and gibberellin-independent seed germination in Arabidopsis // Planta - 2002.- Vol. 223. - P. 105-113

85. Chan K.L., Chris K.H., Jinadasa S., Yuen J.H. Selection of high

98

artemisinin yielding Artemisia annua // Planta Med. - 1995 - Vol. 61. - P. 285287

86. Charles D.J., Simon J.E., Wood K.V., Heinstein P. Germplasm variation in artemisinin content of Artemisia annua using an alternative method of artemisinin analysis from crude plant extract / D.J. Charles, J.E. Simon, K.V. Wood, P. Heinstein // J. Nut. Prod. - 1990. - Vol. 53. - P. 157-160.

87. Chen H.H., Zhou H.J., Fang X. Inhibition of human cancer cell line growth and human umbilical vein endothelial cell angiogenesis by Artemisinin derivatives in vitro I I Pharmacol. Res. - 2003. - Vol. 48 - P. 231-236.

88. Chen H.H., Hui-Jun Z., Wei-Qin W., Guo-Dong W. Antimalarial dihydroartemisinin also inhibits angiogenesis // Cancer Chemother. Pharmacol. -2004 - Vol. 53 - P. 423-432.

89. Clack T., Mathews S., Sharrock R.A. The phytochrome apoprotein family in Arabidopsis is encoded by five genes: the sequences and expression of PHYD and PHYEI I Plant Mol Biol - 1997. - Vol.25. - P. 413-427

90. Courtois D., Guren J. Temperature response of Catharanthus roseus cells cultivated in liquid medium I I Plant. Sci. Lett. - 1980. - Vol. 17. -P. 473-482

91. Curtin C., Zhang W., Franco C. Manipulating anthocyanin composition in Vitis vinifera suspension cultures by elicitation with jasmonic acid and light irradiation // Biotechnol. Lett. - 1993. - Vol. 25. - №14. - P. 1131-1135.

92. Dicosmo F., Misawa M. Plant cell and tissue culture: alternatives for metabolite production // Biotechnol Adv - 1995. - Vol. 13. - P. 425-435

93. Dixon R.A. Engineering of plant natural product pathways // Curr. Opin. Plant Biol. - 2005. - Vol. 8. - №3. - P. 329-336

94. Dougher T.A.O., Bugbee B. Evidence for yellow light suppression of lettuce growth // Photochem. Photobiol. - 2001 - № 73 - P. 208-212

95. Duke S.O., Paul R.N. Development and fine structure of the glandular trichomes of Artemisia annua // Int. J. Plant Sci. - 1993. - Vol. 154. - P. 107-118.

96. Eckstein-Ludwig U., Webb R.J., Van Goethem I.D. Artemisinins target the SERCA of Plasmodium falciparum // Nature. - 2003. - Vol. 424. - P. 957-961.

99

97. Efferth T., Marschall M., Wang X., Hauber I. Huong,Antiviral activity of artesunate towards wild-type, recombinant, and ganciclovir-resistant human cytomegaloviruses // Journal of. molecular medicine. - 2001. - № 80. - P. 233242.

98. Efferth T., Dunstan H., Sauerbrey A., Miyachi H. The anti-malarial artesunate is also active against cancer // Int. J. Oncol. - 2001. - Vol. 18. - P. 767773.

99. Efferth T., Olbrich A., Bauer R. mRNA expression profiles for the response of human tumor cell lines to the antimalarial drugs artesunate, arteether, and artemether // Biochem. Pharmacol. - 2002. - Vol. 64. - P. 617-23.

100. Efferth T., Sauerbrey A., Olbrich A. Molecular modes of action of artesunate in tumor cell lines // Mol. Pharmacol. - 2003. - Vol. 64 - P. 382-94.

101. Eisenreich W., Bachera A., Arigonib D., Rohdich F. Biosynthesis of isoprenoids via the non-mevalonate pathway // Cell. Mol. Life Sci. - 2004. - Vol. 61-P. 1401-1426

102. Eisinger W.R., .Bogomolni R.A., Taiz L. Interactions between a blue-green reversible photoreceptor and a separate UV-B receptor in stomatal guard cells // Am. Journ. Bot. - 2003 - Vol. 90 - P. 1560-1566

103. Elford B.C., Roberts M.F., Phillipson J.D., Wilson R.J. Potentiation of the antimalarial activity of qinghaosu by methoxylated flavones // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. - 1987. - Vol. 81 - P. 434-436.

104. Elkholy S., Wobbe K. Artemisinin: the biosynthetic pathway and its regulation in Artemisia annua, a terpenoid-rich species // in vitro Cell. Dev. Biol.—Plant - 2006. - Vol. 42. - P. 309-317

105. Ferreira J.F.S., Janick J. Distribution of artemisinin in Artemisia annua L. // Progress in new crops. - ASHS Press, Arlington, VA, 1996. - P. 579-584.

106. Ferreira J.F.S., Janick J. Immunoquantitative analysis of artemisinin from A. annua using polyclonal antibodies // Phytochemistry - 1996. - Vol. 41. -P. 97-104

107. Ferreira J.F.S., Devanand Luthria L., Tomikazu S., Heyerick A.

100

Flavonoids from Artemisia annua L. as antioxidants and their potential synergism with artemisinin against malaria and cancer // Molecules. - 2010. - Vol. 15. - P. 3135-3170

108. Folta K.M. Green light stimulates early stem elongation, antagonizing light-mediated growth inhibition // Plant. Physiol. - 2003 - № 135 - P. 1407-1416

109. Folta K.M., Spalding E.P. Unexpected roles for cryptochrome 2 and phototropin revealed by high-resolution analysis of blue light-mediated hypocotyl growth inhibition // Plant. J. - 2004. - Vol. 26. P. 471-478

110. Frechilla S., Talbott L.D., Bogomolni R.A., Zeiger E. Reversal of blue light-stimulated stomatal opening by green light // Plant. Cell. Physiol. - 2000 -Vol. 41-P. 171-176

111. Fujita Y., Tabata M. Secondary metabolites from plant cells: pharmaceutical applications and progress in commercial production // Plant Tissue and Cell Culture. - New York: Alan R. Liss, 1987 - P. 169-185

112. Fulzele D.P., Heble M.R., Rao P.S. Production of terpenoid from Artemisia annua L. plantlet cultures in bioreactor //J. Biotechnol. - 1998. - Vol. 40. - P. 139-143

113. Gao W.Y., Fan L., Paek K.Y. Yellow and red pigment production by cell cultures of Carthamus tinctorius in a bioreactor / W.Y. Gao, I I Plant Cell, Tissue and Organ Culture - 2000. - Vol. 60. - P. 95-100.

114. Goto N., Yamamoto K.T., Watanabe M. Action spectra for inhibition of hypocotyl growth of wild-type plants and of the Hy2 long-hypocotyl mutant of Arabidopsis thaliana L. 11 Photochem Photobiol - 1993. - Vol. 57 - P. 867-871

115. Gulati A., Bharel S., Jain S.K., Abdin M.Z. In vitro micropropagation and flowering in Artemisia annua 11 J. Plant. Biochem. Biotech. - 1996. - Vol. 5. -P.31-35

116. Guo C., Liu C.Z., Ye H.C., Li G.F. Effect of temperature on growth and artemisinin biosynthesis in hairy root cultures of Artemisia annua // Acta. Bot. Boreal.-Occident. Sin. - 2004. - Vol. 24. - P. 1828-1831

117. Guo Q.Z. Cytotoxic terpenoids and flavonoids from Artemisia annua //

101

Planta Med. - 1994. - № 60. - P. 54-57.

118. Gupta M.M., Jain D.C., Mathur A.K., Verma R.K. Isolation of high artemisinic acid containing plant of Artemisia annua // Planta. Med. - 1996. - Vol. 62.-P. 280-281.

119. Gyula P., Schäfer E., Nagy F. Light perception and signalling in higher plants // Curr. Opin. Plant. Biol. - 2003.- Vol. 64 - P. 46-452

120. Hajiem M., Hayashi H. Biosynthesis and biotransformation // Transgenic crop plants. - Berlin Heidelberg: [Springer-Verlag], 2010 - P. 124-173.

121. Hauser B.A., Pratt L.H., Cordonnier-Pratt M.M. Absolute quantification of five phytochrome transcripts in seedlings and mature plants of tomato (Solanum lycopersicum L.) // Planta. - 1997. - № 201. - P. 379-387

122. He X.C., Zeng M.Y., Li G.F., Liang Z. Callus induction and regeneration of plantlets from Artemisia annua and changes of qinghaosu contents I I Acta. Bot. Sin. - 1983. - Vol. 25. - P. 87-90

123. Hethelyi E.B., Cseko I.B., Grosy M., Mark G. Chemical composition of Artemisia annua essential oils from Hungary // J. Ess. Oil. Res. - 1987. - Vol. 7 -P. 4548.

124. Hollman P.C.H., Gaag M.V.D, Mengelers M.J.B.,; Van Trijp J.M.P. Absorption and disposition kinetics of the dietary antioxidant quercetin in man // Free. Rad. Biol. Med. - 1996 - Vol. 21. - P. 7 03-707.

125. Huahong W., Chenfei M., Zhenqiu L., Lanqing M. Effects of exogenous methyl jasmonate on artemisinin biosynthesis and secondary metabolites in Artemisia annua L. // Industrial Crops and Products. - 2010. - Vol. 31. - P. 214218

126. Jiao Y., Lau O.S., Deng X.W. Light-regulated transcriptional networks in higher plants // Nat. Rev. Genet. - 2007. - Vol. 8. - P. 217-230

127. Johanna P. Antimalarial drug therapy: the role of parasite biology and drug resistance // J. Clin. Pharmacol. - 2006 - Vol. 46 - P. 1487

128. Jorge F.S., Ferreira J.F.S. Artemisia annua L.: the hope against malaria and cancer // Medicinal and Aromatic Plants: Production, Business &

102

Applications. - 2004 - P. 56-61.

129. Kee-Won Y., Hosakatte N.M., Eun-Joo H., Kee-Yoeup P. Ginsenoside production by hairy root cultures of Panax ginseng: influence of temperature and light quality // Biochem. Engin. Journ. - 2005. - Vol. 23 - P. 53-56

130. Keiser J., Rinaldi L., Vincenzo V., Mezzino L., Efficacy and safety of artemether against a natural Fasciola hepatica infection in sheep // Parasitol. Res.

- 2003. - Vol. 34 - P. 134-139

131. Kim D.J., Keiser J., Rinaldi L., Vincenzo V. Enhanced shikonin production from Lithospermum erythrorhizon by in situ extraction and calcium alginate immobilization // Biotechnol. Bioengin. - 1990 - Vol. 36. - № 5. - P. 460-466

132. Kim H.H., Goins G., Wheeler R., Sager J. Green light supplementation for enhanced lettuce growth under red and blue light-emitting diodes // Hortiscience - 2004 - Vol. 39 - P. 1617-1622

133. Kim W.Y., Fujiwara S., Suh S.S., Kim J. ZEITLUPE is a circadian photoreceptor stabilized by GIGANTEA in blue light // Nature. - 2007. - Vol. 449

- P. 356-360

134. Klein R.M., Repression of tissue culture growth by visible and near visible radiation // Plant Physiol. - 1964. - Vol. 39 - P. 546-539

135. Kress W.J., Wurdack K.J., Zimmer E.A., Weigt L.A. Use of DNA barcodes to identify flowering plants // Proc. Natl Acad. Sci. - 2005. - Vol. 102. -P. 8369-8374.

136. Krishna S., Uhlemann A.C., Haynes R.K. Artemisinins: mechanisms of action and potential for resistance // Drug. Resist. Updat. - 2004. - Vol. 7. - P. 233-244

137. Krushkal J., Pistilli M., Ferrell K.M., Souret F.F. Computational analysis of the evolution of the structure and function of l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase, a key regulation of the mevalonate-independent pathway in plants // Gene. - 2003. - №. 313. - P. 127-138

138. Kumaran A.P., Tyo K., Carlsen S., Mucha O. Terpenoids: Opportunities

103

for biosynthesis of natural product drugs using engineered microorganisms // Molecular Pharmaceutics - 2003 - Vol. 5. - № 2. - P. 167-90

139. Kun J.F.J., Hibbs A.R., Saul A., McColl D.J. A putative Plasmodium falciparum exported serine/threonine protein kinase // Mol. Biochem. Parasitol. -1997-№. 85-P. 41-51.

140. Kurata H., Achioku T., Okuda N., Furusaki S. Intermittent light irradiation with a second-scale interval enhances caffeine production by Coffea arabica cells I I Biotechnol. Prog. - 1998. - Vol. 14. - №. 5. - P. 797-799

141. Kurata H., Mochizuki A., Okuda N., Seki M. Intermittent light irradiation with second- or hour-scale periods controls anthocyanin production by strawberry cells // Enz. Microb. Tech. - 2000. - Vol. 26 - P. 621-629

142. Lai H., Singh N.P. Selective cancer cell cytotoxicity from exposure to dihydroartemisinin and holotransferrin // Cancer. Lett. - 1995 - Vol. 91. - P. 4146.

143. Laughlin J. C. The influence of distribution of anti-malarial constituents in Artemisia annua L. on time and method of harvest I I Acta. Hort. - 1995. - № 390. - P. 67-73

144. Lawerence B.M. Progress in essential oils // Perfumer and Flavourist. -1993.-№. 7.-P. 4344.

145. Le W.J. Artemisinin derivatives against Schistosoma japonicum in animals // Chin. Pharmaceu. Bull. - 1980 - Vol. 15. - P. 182.

146. Le W.J. Studies on the efficacy of artemether in experimental schjitosomiasis // Acta. Pharmaceu.Sin. - 1982. - Vol. 17. - P. 187-193.

147. Li L.N., Zhang H.D., Yuan S.J. Artesunate attenuates the growth of human colorectal carcinoma and inhibits hyperactive Wnt/beta-catenin pathway // Int. J. Cancer. - 2007. - № 121. - P. 1360-1365.

148. Libby L.M., Sturtz A. Unusual essential oils grown in Oregon in Artemisia annua // J. Ess. Oil Res. -1983. - Vol. 1. - P. 201-202.

149. Lichtenthaler H.K. Chlorophylls and carotenoids: pigments of photosynthetic membranes // Methods Enzymol. - 1987. - №. 148. - P. 350-382.

104

150. Light sensing in plants / ed. by M.Wada, K.Shimazaki, M.Iino. - Tokyo: Springer-Verlag, 2005 - 370 p.

151. Lisgarten J.N., Potter B.S., Bantuzeko C., Palmer R.A. Structure, absolute configuration, and conformation of the antimalarial compound, artemisinin // J. Chem. Crystall. - 1998. - Vol. 28. - P. 539-543.

152. Liu C.-Z., Guo C., Wang Y.C., Ouyang F. Effect of light irradiation on hairy root growth and artemisinin biosynthesis of Artemisia annua L. I I Process Biochem. - 2002. - Vol. 38. - P. 581-585

153. Liu C., Yan Z., Wang Y. Artemisinin: current state and perspectives for biotechnological production of an antimalarial drug // Appl Microbiol. Biotechnol.

- 2006. - Vol. 72. - P. 11-20

154. Liu J.H., Chen Y.G., Yu B.Y., Chen Y.J. A novel ketone derivative of artemisinin biotransformed by Streptomyces griseus ATCC 13273 // Bioorg. Med. Chem. Lett. - 2006. - Vol. 16. - P. 1909-1912

155. Liu J.M., Ni M.Y., Fan J.F., Tu Y.Y. Structure and reactions of arteannuin // Acta. Chemica. Sinica. - 1979. - Vol. 37. - P. 129-143.

156. Liu Y., Wang H., Ye H.C., Li G.F. Advances in the plant isoprenoid biosynthesis pathway and its metabolic engineering // J. Integr. Plant. Biol. - 2005.

- Vol. 47. - P. 769-782

157. Loughrin J.H., Kasperbauer M.J. Aroma content of fresh basil (Ocimum basilicum L.) leaves is affected by light reflected from colored mulches I I J. Agric. Food. Chem. - 2003 - Vol. 51 - P. 2272-2276

158. Luczkiewicz M., Glod D. Callus cultures of Genista plants in vitro material producing high amounts of isoflavones of phytoestrogenic activity // Plant Science - 2003. - Vol. 165 - P. 1101-1108

159. Luo X.D., Shen C.C. The chemistry, pharmacology and clinical applications of Qinghaosu (artemisinin) and its derivatives // J. Nat. Prod. China. -1997.-Vol. 25.-P. 234-251

160. Lypez-Juez A., Devlin P. F. Light and the control of plant growth // Plant. Cell. Monogr., Plant Growth Signaling - Berlin Heidelberg: Springer-

105

Verlag, 2008.-P. 327-371.

161. Marco S.A., Sanz J.F., Bea J.F., Barbera O. Phenolic constituents of Artemisia annua 11 Pharmazie. - 1990. -Vol. 45. - P. 382-383.

162. Martinez B.C., Staba E.J. The production of artemisinin in Artemisia annua L. tissue cultures // Adv. Cell. Cult. - 1988. - Vol. 6. - P. 69-87.

163. Mazzella M.A., Cerdan P.D., Staneloni R.J., Casal J.J. Hierarchical coupling of phytochromes and cryptochromes reconciles stability and light modulation of Arabidopsis development // Development. - 2001. - №. 128. - P. 2291-2299

164. McVaugh R. Flora Novo-Galiciana: a descriptive account of the vascular plants of Western Mexico // Flora. - 1984. - Vol. 12 - P. 114-124

165. Medical natural product: a biosynthetic approach / ed. by P.M. Devick. -Chichester: John Wiley & Sons, 2002 - 507 p.

166. Medicinal plant biotechnology. From basic research to industrial applications. / ed. by Oliver Kayser and Wim J. Quax. - Weinheim: WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2007 - 576 p.

167. Moore J.C., Lai H., Li J.-R., Ren R.-L. Oral administration of dihydroartemisinin and ferrous sulfate retarded implanted fibrosarcoma growth in the rat // Cancer Lett. - 1995. - №. 98. - P. 83-87.

168. Mulder-Krieger T., Verpoorte R., Svendse A., Scheffer J. Production of essential oils and flavours in plant cell and tissue cultures // Plant Cell Tissue Org. Cult. - 1988. - Vol. 13. - P. 85-114.

169. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - Vol. 35. - №. 3. - P. 473-497.

170. Namdeo A.G., Mahadik K. R., Kadam S.S. Antimalarial drug -Artemisia annua pharmacognosy I I Magazine. - 2006. - Vol. 2. - №. 6 - P. 137139.

171. Newman J.D., Chappell J. Isoprenoid biosynthesis in plantsxarbon partitioning within the cytoplasmic pathway // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. -

106

1999. - Vol 34. - P. 95-106.

172. Noe N., Eccher T., Del Signore E., Montoldi A. Growth and proliferation in vitro of Vaccinium corymbosum under different irradiance and radiation spectral composition // Biologia Plantarum. - 1998. - V. 42. - № 2. - P. 161-167.

173. Opatrna J., Novak P., Opatrny Z. Paclobutrazol stimulates bud regeneration in Solanum tuberosum L. primary explant cultures // Biologia plantarum. - 1997 - V. 39 -P. 151 -158.

174. Ouyang J., Wang X., Zhao B., Wang Y. Light intensity and spectral quality influencing the callus growth of Cistanche deserticola and biosynthesis of phenylethanoid glycosides I I Plant Science. - 2003. - №. 165. - P. 657-661

175. Paniego N.B., Giuletti A.M. Artemisia annua L. dedifferentiated and differentiated cultures // Plant Cell Tissue Organ Cult. - 1994. - Vol. 36. - P. 163168

176. Paniego N.B., Giuletti A.M. Artemisinin production by Artemisia annua L.-transformed organ cultures // Enz. Microbiol. Technol. - 1996. - Vol. 18. - P. 1-5.

177. Patel D., Shukla S., Gupta S. Apigenin and cancer chemoprevention: progress, potential and promise (review) // Int. J. Oncol. - 2007. - Vol. 30. - P. 233-245.

178. Patrick S.C. Making artemisinin // Phytochemistry. - 2008. - № 69. - P. 2881-2885

179. Petersen M., Simmonds M.S. Rosmarinic acid // Phytochemistry. -2003. - Vol. 62. - №. 2. - P. 121-125

180. Phillipson J.D. Plants as source of valuable products // Secondary products from plant tissue culture. - Oxford: Clarendon Press, 1997 - P. 1-21

181. Qi J.L., Zhanga W.J., Liua S.H., Wanga H. Expression analysis of lightregulated genes isolated from a full-length-enriched cDNA library of Onosma paniculatum cell cultures I I Journal of Plant Physiology. - 2008 - Vol. 165. - P. 1474-1482

182. Ratledge C., Sasson A. Production of useful biochemicals by higherplant cell cultures: biotechnological and economic aspects - Cambridge: Cambridge University Press, 1992 - 402 p.

183. Riley E.M. The London School of Tropical Medicine: a new century of malarial research // Mem Inst Oswaldo Cruz - 1995. - Vol 95. - P. 25-32

184. Rucker G., Mayer R., Manns D. a- and p-myrcene hydroperoxide from Artemisia annua // J. Nat. Prod. - 1993. - №. 50. - P. 287-289.

185. Ryden A.-M., Kayser O. Chemistry, biosynthesis and biological activity of artemisinin and related natural peroxides //Top. Heterocycl. Chem. - 2007 -Vol. 9-P. 1-31

186. Sakamoto K., Iida K., Sawamura K., Hajiro K. Anthocyanin production in cultured cells otAralia cor data // Thunb. Plant Cell Tissue Org. Cult. - 1994. -Vol. 36. - №. l.-P. 21-26

187. Schmauder H.-P., Doebel P. Nigella spp.: in vitro culture, regeneration, and the formation of secondary metabolites // Biotechnology in Agriculture and Forestry 15. Medicinal and Aromatic Plants III. - Berlin, Heidelberg: SpringerVerlag, 1991.-P. 311-336.

188. Serkan S., Plinkert P., Efferth T. Novel developments on artemisinin and its derivatives for cancer therapy // Supportive cancer care with Chinese medicine. - Berlin: Springer Science+Business Media B.V., 2010. - P. 227-251

189. Sheludko Y.V. Recent advances in plant biotechnology and genetic engineering for production of secondary metabolites // Cytology and Genetics. -2010. - Vol. 44. - №. 1. - P. 52-60.

190. Shinomura T, Nagatani A., Hanzawa H., Kubota M. Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1996. - Vol. 93. - P. 8129-8133

191. Shukla A., Farooqui A.H.A., Shukla Y.N. Growth inhibitors from Artemisia annua // Indian Drugs. - 1993. - Vol. 28. - P. 376-377.

192. Smetanska I. Production of secondary metabolites using plant cell cultures // Adv Biochem Engin/Biotechnol - 2005. - Vol. 111. - P. 187-228

108

193. Smith T.C., Weathers P.J., Cheetham R.C. Effect of gibberellic acid on hair root cultures of Artemisia annua growth and artemisinin production // in vitro Cell. Dev. Bio.l Plant. - 1997. - Vol. 33. - P. 75-79

194. Szabo E., Thelen A., Petersen M. Fungal elicitor preparations and methyl jasmonate enhance rosmarinic acid accumulation in suspension cultures of Coleus blumei // Plant Cell Rep. - 1999. - Vol. 18. - №. 6. - P. 485-489

195. Takemiya A., Inoue S., Doi M., Kinoshita T. Phototropins promote plant growth in response to blue light in low light environments // Plant Cell. - 2005. -Vol. 17-P. 1120-1127

196. Tawfiq N.K., Anderson L.A., Roberts M.F., Phillipson J.D. Antiplasmodial activity of Artemisia annua plant cell cultures // Plant Cell Rep. -1989. - Vol. 8. - P. 425-428

197. Tu Y.Y., Ni M.Y., Chung Y.Y., Li L.N. Chemical constituents in Artemisia annua L. and the derivatives of artemisinin // Chem. Abs. - 1981. - Vol. 95-P. 1756164.

198. Ulubulen A., Halfon B. Phytochemical investigation of the herb of Artemisia annua 11 Planta Medica. - 1977. - Vol. 29. - P. 258-260.

199. Vinicius M., Nascimento L., Moreira N., Reinert F. Influence of blue light on the leaf morphoanatomy of in vitro Kalanchoe pinnata Lamarck (Crassulaceae) // Persoon Microsc. Microanal. - 2010. - Vol. 16. - P. 576-582.

200. von Arnim A.G., Deng X.W. Light control of seedling development // Plant. Mol. Biol. - 1996. - Vol. 47. - P. 215-243

201. Walker T.S., Bais H.P., Vivanco J.M. Jasmonic acid induced hypercin production in Hypericum perforatum L. (St. John wort) // Phytochemistry - 2002. -Vol. 60-P. 289-293.

202. Walters R.G., Towards an understanding of photosynthetic acclimation // J. Exp. Bot. - 2005. - Vol. 56. - P. 435-447

203. Wang H., Ge L., Ye H.C., Chong K. Studies on the effects of fpfl gene on Artemisia annua flowering time and on the linkage between flowering and artemisinin biosynthesis // Planta Med. - 2004. - Vol. 70. - P. 347-352

109

204. Wang J., Guo Y., Zhang B.C. Induction of apoptosis and inhibition of cell migration and tubelike formation by dihydroartemisinin in murine lymphatic endothelial cells // Pharmacology. - 2007. - Vol. 80 - P. 207-218.

205. Wang J.W., Tan R.X. Artemisinin production in Artemisia annua hair root cultures with improved growth by altering the nitrogen source in the medium // Biotechnol. Lett. - 2002. - Vol. 24. - P 1153-1156

206. Wang M., Park C., Wu Q., Simon J. Analysis of Artemisinin in Artemisia annua L. by LC-MS with selected ion monitoring I I Agric. Food Chem. - 2005. - Vol. 53 - P. 7010-7013

207. Wang M.L., Jiang Y.S., Wei J.Q., Wei X. Effects of irradiance on growth, photosynthetic characteristics, and artemisinin content of Artemisia annua L. // Photosynthetica. - 2007. - Vol. 46. - №. 1. - P. 17-20.

208. Wang Y.C., Zhang H.X., Zhao B., Yuan X.F. Improved growth of Artemisia annua L. hairy roots and artemisinin production under red light conditions // Biotechnol. Lett. - 2001 - Vol. 23. - P. 1971-1973

209. Weathers P.J., Cheethan R.D., Follansbee E., Theohairides K. Artemisinin production by transformed roots of Artemisia annua // Biotechnol. Lett. - 1994. - Vol. 16. - P. 1281-1286

210. Weathers P.J., De Jesus-Gonzalez L., Kim Y.J. Alteration of biomass and artemisinin production in Artemisia annua hairy roots by media sterilization method and sugars // Plant Cell Rep. - 2004. - Vol. 23. - P. 414-418

211. Weathers P.J., Bunk G., McCoy M.C. The effect of phytohormones on growth and artemisinin production in Artemisia annua hairy roots // In Vitro Cell Dev. Biol. Plant. - 2005. - Vol. 41. - P. 47-53

212. Weathers P.J., Towler M.J., Xu J. Bench to batch: advances in plant cell culture for producing useful products // Applied microbiological biotechnology. -2010.-№85.-P. 1339-1351.

213. Wen W. J., Zhen Z., Ren X.T. Stimulation of artemisinin production in Artemisia annua hairy roots by the elicitor from the endophytic Colletotrichum sp. // Biotechnology Letters. - 2001. - Vol. 23. - P. 857-860

no

214. Wen W J., Fang X. K., Ren X. T. Improved artemisinin accumulation in hairy root cultures of Artemisia annua by (22S, 23S)-homobrassinolide // Biotechnology Letters. - 2002. - Vol. 24. - P. 1573-1577.

215. Went F.W., The experimental control of plant growth // Chronica Botanica, Waltham, MA, 1957 - 343 p.

216. Whipkey A., Simon J.E., Charles D.J., Janic J. In vitro production of artemisinin from Artemisia annua L. // Phytother. Res - 1992. - Vol. 1. - P. 15-25

217. World malaria report: 2010. World health organization. - Geneva: WHO Press, 2010 - 205 p.

218. Willcox, M. Artemisia species: from traditional medicines to modern antimalarials-and back again // JACM. - 2009. - Vol. 15. - P. 101-109.

219. William G. H. Plant Biotechnology / G. H. William. - Infobase Publishing, New York, 2007. - 143 p.

220. Woerdenbag H.J., Luers J.F.J., Van Uden W., Pras N. Production of the new antimalarial drug artemisinin in shoot cultures of Artemisia-annua L. I I Plant Cell Tissue Organ Cult. - 1993. - Vol. 32. - P. 247-257.

221. Woerdenbag H.J., Bos R., Salomons M.C., Hendriks H. Volatile constituents of Artemisia annua L. (Asteraceae) I I Flav. Frag. J. - 1993. - № 8. -P. 131-137.

222. Woerdenbag H.J., Pras N., Noguyen G.C., Bui T.B. Artemisinin related sesquiterpenes and essential oil in Aremisia annua during a vegetation period in Vietnam // Phytochemistry. - 1994. - Vol. 60. - P. 272-275.

223. Xiao S.H., Wu Y. L., Tanner M. Schistosoma japonicum: in vitro effects of artemeter combined with haemin depend on cultivation media and appraisal of artemether products appearing in the media // Parasitology resources. - 2003. - № 89. - P. 459-466.

224. Yamachika E., Habte T., Oda D. Artemisinin: an alternative treatment for oral squamous cell carcinoma // Anticancer Res. - 2004. - Vol. 24. - P. 21532160.

225. Yamada T., Sinoto J. Citological inverstigations of plant cell culture //

in

Kromosomo. -1967. - Vol. 69. - № 70. - P. 2271-2280

226. Yamaguchi S., Smith M.W., Brown R.G., Kamiya Y. Phytochrome regulation and differential expression of gibberellin 3beta-hydroxylase genes in germinating Arabidopsis seeds I I Plant. Cell. - 1998. - Vol. 10 - P. 2115-2126

227. Yamamoto H., Chatani N., Kitayama Z., Tomimori T. Flavonoid production in Scutellaria baicalensis callus cultures // Plant Cell Tissue Organ Culture. - 1986. - V. 5. - P. 219-222.

228. Yamamoto H. Scutellaria baicalensis George: in vitro culture and the production of flavonoids // Biotechnology in Agriculture and Forestry 15. Medicinal and Aromatic Plants III. - Berlin Heidelberg: Springer-Verlag, 1991. -P. 398-417.

229. Yanagawa Y., Sullivan J.A., Komatsu S., Gusmaroli G. Arabidopsis COPIO forms a complex with DDB1 and DET1 in vivo and enhances the activity of ubiquitin conjugating enzymes // Genes Dev. - 2004. - Vol. 18. - P. 2172-2181

230. Yang S., Roberts M.F., Phillipson J.D. Methoxylated flavones and coumarins from Artemisia annua // Phytochem. - 1989. - Vol. 28. - P. 1509-1511.

231. Yang S., Roberts M.F., O'Neill M.J., Bucar F. Flavonoids and chromones from Artemisia annua // Phytochem. - 1995. - Vol. 38. - P. 255-257.

232. Yang Y.Z., Little B., Meshnick S.R. Alkylation of proteins by artemisinin, effects of heme, pH and drug structure // Biochem. Pharm. - 1994. -Vol. 48.-P. 569-573.

233. Yeoman M.M., Yeoman C.L. Manipulating secondary metabolism in cultured plant cells // New Phytol. - 1996. - Vol. 134. - P. 553-569

234. Yukihiro S., Itsuo N., Koji H. Aconitum spp. (Monkshood): somatic embryogenesis, plant regeneration, and the production of aconitine and other alkaloids // Biotechnology in Agriculture and Forestry 15. Medicinal and Aromatic Plants III. - Berlin Heidelberg: Springer-Verlag, 1991. - P. 68-73.

235. Zenk M.H. The impact of plant cell cultures on industry // Frontiers of plant tissue culture. - Calgary: The International Association of Plant Tissue Culture, 1977.-P. 1-14

236. Zenk M.H. Plant tissue culture and its bio-technological application -Berlin, Heidelberg: Springer, 1997. - 327 p.

237. Zhong J .J., Biochemical engineering of the production of plant-specific secondary metabolites by cell suspension cultures. // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. - 2001 - Vol. 72. - P. 26

238. Zhu Y.-Z, B.K.-H. Tan, B.-H. Bay, C.-H. Liu. Natural products: essential resources for human survival. - Singapore: World Scientific Publishing Co., 2007-454 p.