Антибактериальная и антимикотическая активность водорастворимых низкомолекулярных и олигомерных форм хитозана тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Хайруллин, Руслан Зуфарович

• Хайруллин, Руслан Зуфарович
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Хайруллин, Руслан Зуфарович

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Хитин и хитозан: химическое строение и свойства

1.2. Хитозан - источник хитоолигосахаридов

1.2.1. Ферментативное получение хитоолигосахаридов

1.2.2. Способы получения хитоолигосахаридов

1.2.2.1. Кислотный гидролиз хитозана

1.2.2.2. Химический синтез хитоолигосахаридов

1.3. Антибактериальные и антимикотические свойства хитозана

1.3.1. Действие хитозана на грамотрицательные бактерии

1.3.2. Действие хитозана на грамположительные бактерии

1.3.3. Действие хитозана на микроскопические грибы

1.4. Чувствительность микроорганизмов к хитозану

1.5. Влияние структуры на биоцидные свойства хитозана

1.5.1. Биоцидные свойства наночастиц хитозана

1.5.2. Биоцидные свойства производных хитозана

1.6. К проблеме условий определения антимикробных свойств

1.7. К проблеме характеристики хитозанов

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 5 8 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 5 8 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Оценка растворимости хитозана в зависимости от его 67 молекулярной массы и рН среды

2. Подбор буферной системы

3. Антибактериальные и антимикотические свойства 74 олигохитозанов

3.1. Антибактериальные свойства олигохитозанов

3.2. Антимикотические свойства олигохитозанов в отношении 78 дрожжеподобных и мицелиальных грибов

3.3. Антибактериальные свойства ацильных производных 81 хитозана ^

3.4. Влияние рН на антибактериальные свойства олигохитозанов с 85 различной молекулярной массой

3.5. Влияние хитозана на морфологию бактериальных клеток

3.6. Оценка влияния хитозана на проницаемость 94 цитоплазматической мембраны

3.7. Оценка активации олигохитозанами лизостафина

3.8. Влияние хитозана на морфологию дрожжеподобных грибов

3.9. Влияние хитозана на морфологию мицелиальных грибов 102 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Характеристика растворимости низкомолекулярных и 103 олигомерных форм хитозанов

2. Антибактериальная активность олигохитозанов

3. Антимикотическая активность олигохитозанов 113 ВЫВОДЫ 116 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

SDS - додецилсульфат NPN - 1 -N-фенил-нафтиламин

ACES - ТЧГ-(2-ацетамидо)-2-аминоэтансульфоновая кислота MES - морфолинэтансульфоновая кислота

TES - 2-[трис(гидроксиметил)метиламино]-1-этансульфоновая кислота

ONPG - орто-нитрофенил-Р-Б-галактопиранозид

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

ЛПС - липополисахарид

ЦПМ - цитоплазматическая мембрана

ЭПР - эндоплазматический ретиклум

МПА - мясо-пептонный агар

МПБ - мясопептонный бульон

ВЭГПХ - высокоэффективная гельпроникающая хроматография МИК - минимальная ингибирующая концентрация МБК - минимальная биоцидная концентрация ИП - индекс полидисперсности СП - степень полимеризации

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Антибактериальная и антимикотическая активность водорастворимых низкомолекулярных и олигомерных форм хитозана»

ВВЕДЕНИЕ

Поиск новых антибактериальных и антимикотических веществ в настоящее время остаётся актуальной задачей в связи с постоянным появлением резистентных к классическим антибиотикам и антимикотикам штаммов условно-патогенных микроорганизмов. Важным направлением такого поиска является получение и исследование биоцидных свойств поликатионов - положительно заряженных полимеров различного происхождения, обладающих широким спектром биоцидного действия. Особый научно-практический интерес в этом плане представляет хитозан -природный полиаминосахарид, представляющий собой сополимер глюкозамина и ацетилглюкозамина, обладающий рядом ценных свойств (нетоксичность, биосовместимость, гипоаллергененность,

биодеградируемость), которые востребованы в медицине и биотехнологии, а также дающий возможность создания на его основе многочисленных производных.

Несмотря на то, что биоцидной активности хитозана посвящено большое количество экспериментальных работ, механизмы биоцидного действия этого биополимера на клеточном и молекулярном уровнях раскрыты не полностью. Остаётся до конца не выясненной взаимосвязь между химической структурой хитозанового полимера и его биологическим эффектом на клетки микроорганизмов. Установление подобной взаимосвязи осложняется тем, что хитозан представляет собой гетерогенную группу веществ, различающихся по молекулярной массе, степени ацетилирования, расположению ацетилированных звеньев вдоль полимерной цепи, вязкости, значению рКа.

До сих пор остаются противоречивыми сведения о влиянии молекулярной массы хитозана на его антимикробное действие. Практически отсутствуют работы по изучению антибактериальных свойств с использованием низкомолекулярных и олигомерных форм хитозана с

различной молекулярной массой в сравнительном аспекте. Только в единичных работах можно встретить использование узкодисперсных образцов. Подобные противоречия обусловлены отсутствием полной молекулярно-массовой характеристики используемых в экспериментах образцов, в том числе по причине отсутствия стандартов молекулярной массы с низким индексом полидисперсности. Поэтому для установления взаимосвязи между химической структурой хитозана и его биоцидной активностью необходимо использовать узкодисперсные образцы полимера с охарактеризованным молекулярно-массовым распределением.

Целью работы являлась оценка антибактериальных и антимикотических свойств водорастворимых низкомолекулярных и олигомерных форм хитозана, обладающих высокой степенью деацетилирования.

Основные задачи исследования:

1. Провести оценку антибактериальных и антимикотических свойств низкомолекулярных и олигомерных форм хитозана в отношении различных видов микроорганизмов;

2. Установить влияние кислотности среды на растворимость олигохитозанов с различной молекулярной массой и их антибактериальную активность;

3. Провести исследование антибактериальных свойств ацилированных производных низкомолекулярного хитозана;

4. Определить антибактериальные свойства и влияние на морфологию клеток олигомерных форм хитозана в отношении бактерий и микроскопических грибов;

5. Провести оценку активации действия лизостафина на деградацию клеток бактерий олигохитозанами.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное исследование антибактериальных и антимикотических свойств низкомолекулярных и олигомерных форм хитозана с различной молекулярной массой, характеризующихся низким уровнем полидисперсности образцов и высокой степенью деацетилирования в отношении различных групп микроорганизмов - условно-патогенных энтеробактерий и стафилококков, дрожжеподобных и мицелиальных грибов. Определено влияние ацильных групп различной длины, искусственно введённых в молекулы низкомолекулярного хитозана, на его антибактериальную активность в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий.

Впервые установлен эффект инверсии зависимости антибактериальной активности хитозанового полимера от его степени полимеризации в условиях меняющейся кислотности среды. Проведенная оценка антибактериальной активности хитозана с различной молекулярной массой при разных уровнях рН среды показала, что в характере изменения биоцидных свойств хитозанового полимера важную роль играет показатель рКа поликатиона.

Впервые представлены данные по активирующему действию хитозана на лизис клеточных стенок бактерий лизостафином, позволяющие предположить механизм антибактериального действия поликатиона посредством активации бактериальных автолизинов.

Получены данные по влиянию низкомолекулярных и олигомерных форм хитозана на способность клеток дрожжеподобных условно-патогенных грибов формировать мицелиальные структуры.

Практическая значимость. Определение взаимосвязи молекулярно-массовых параметров хитозана и его антибактериальных или антимикотических свойств позволит получать образцы хитозана с максимально высокой биоцидной активностью в отношении конкретного вида микроорганизма. Внедрение в молекулы хитозанового полимера ацильных остатков может служить одним из вариантов усиления антибактериальных свойств хитозана. Установление эффекта инверсии

зависимости антибактериальной активности хитозанового полимера от его молекулярной массы может быть использовано для обоснования рационального применению хитозана в качестве антибактериального агента с получением максимально возможного эффекта в конкретных условиях с использованием минимальных количеств образца вещества. Полученные в работе данные позволяют предсказать усиление бактерицидного действия хитозана модуляцией величины рКа при его химической модификации.

Положения, выносимые на защиту:

1. Антибактериальная и антимикотическая активность хитозана зависит от его молекулярной массы. Олигомерные формы хитозана с низкой степенью полимеризации (менее 2 кДа) проявляют наименьшую биоцидную активность. Максимальным биоцидным эффектом обладают образцы полимера с молекулярной массой более 5 кДа.

2. В кислых условиях более сильным антибактериальным действием обладают образцы с большей молекулярной массой (более 5 кДа), тогда как в слабощелочных условиях большую активность проявляют олигомерные формы хитозана (3-4 к Да).

3. Действие хитозана в субингибирующих концентрациях на клетки дрожжеподобных грибов рода Candida приводит к предотвращению образования ими ростовых трубок и мицелиальных структур.

Связь работы с научными программами. Работа выполнялась в соответствии с планом НИР Казанского НИИ эпидемиологии и микробиологии (договор № 76-Д с Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Научные аспекты обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в Российской Федерации», 2006-2010гг.; Отраслевая научно-исследовательская программа «Научные исследования и разработки с целью обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия и снижения инфекционной заболеваемости в Российской Федерации», 2011-2015 гг.). Исследования

выполнены при поддержке регионального гранта РФФИ №09-04-99035 р_поволжье_а.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на Международной конференции молодых учёных «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2010г.), Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Нижний Новгород, 2010г.), International Conference of the European Chitin Society (Saint-Petersburg, 2011 г.), Межрегиональной научно-практической конференции "Инфекционные болезни взрослых и детей. Актуальные вопросы диагностики, лечения и профилактики» (Казань, 2011г.), IV ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным заболеваниям (Москва, 2012г.), X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения российской Федерации», (Москва, 2012г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, из них 6 статей в центральных рецензируемых журналах, 1 заявка на изобретение.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 133 страницах машинописного текста, включает 12 таблиц, 21 рисунок. Библиография содержит 126 наименований, в том числе 118 - зарубежных авторов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Хитин и хитозан: химическое строение и свойства

Хитин - линейный полисахарид, состоящий из остатков Ы-ацетил-Б-глюкозамина, соединённых Р-(1-4) связями (рис. 1). Хитиновый полимер является вторым по распространённости в природе полисахаридом после целлюлозы и содержится в качестве структурного компонента в клеточных стенках мицелиальных и дрожжеподобных грибов, экзоскелетах членистоногих - насекомых и ракообразных, некоторых моллюсках. Хитин не растворяется в воде и существует в основном в двух кристаллических полиморфных формах - а и (3.

Рис. 1. Структурная формула хитина (хитозана)

Наиболее часто встречаемый в природе а-хитин состоит из слоёв плотно упакованных и антипараллельно направленных нитей полимера [Minke and Blackwell, 1978] и содержится в грибных клеточных стенках и экзоскелетах членистоногих. Гораздо более редким является (3-хитин, полимерные цепи которого расположены параллельно друг другу [Gardner and Blackwell, 1975]. Данная форма хитина содержится в гладиусах членистоногих - кальмарах и каракатицах.

Хитозан получают из хитина с помощью частичного деацетилирования, поэтому он представляет собой гетерополимер, состоящий из остатков D-глюкозамина и Ы-ацетил-Э-глюкозамина. В отличие от хитина, хитозан растворим в разбавленных водных растворах кислот. Хитозан представляет собой гетерогенную группу веществ, которая может быть описана и классифицирована по степени полимеризации,

молекулярной массе, молекулярно-массовому распределению или полидисперсности, степени ацетилирования или деацетилирования, расположению остаточных ацетилированных звеньев вдоль полимерной цепи, вязкости и значению средней величины рКа. Хитозану присуще разнообразие как физико-химических, так и биологических свойств. В сочетании с нетоксичностью, биосовместимостью, биодеградируемостью, это делает его пригодным для использования в самых разнообразных приложениях - сельском хозяйстве, медицине и ветеринарии, косметологии, биотехнологии и пищевой промышленности.

Хитоолигосахариды - олигомеры хитозана, получаемые из него химическим или ферментативным путём. Хитозан может быть деполимеризован до хитоолигосахаридов с помощью кислотного гидролиза или ферментативным гидролизом с использованием гликогидролаз, таких как хитиназы или хитозаназы. При этом молекулярно-массовые характеристики получаемых хитоолигосахаридов могут также варьировать в зависимости от их степени полимеризации, степени деацетилирования и т.д. Физико-химические параметры смеси получаемых олигосахаридов можно регулировать за счёт оптимизации хитозан-ферментной комбинации.

В литературе описаны многочисленные биологические эффекты хитозана, но сравнительно мало сведений, касающихся свойств хитоолигосахаридов [Kim and Rajapakse, 2005; Yin et al, 2009]. Достаточно мало внимания уделено механизмам действия этой группы веществ в проявлении ими биологических воздействий. Необходимо отметить, что хитоолигосахариды способны взаимодействовать с белками, которые могут взаимодействовать с хитином, например, хитиназы, а также имеющие хитин-связывающие домены, например, лектины. Хитоолигосахариды находят широкое применение в медицинской области, например при лечении астмы [Kawada et al., 2007], в качестве биоактивного компонента ранозаживляющих и противоожоговых повязок [You et al., 2004], вектора доставки в генной терапии [Koping-Hoggard et al., 2004], как антибактериальный [Rhoades et al.,

2006] и антимикотический компонент [Seyfarth et al., 2008]. Установлено, что олигомерные формы хитозана могут уменьшать метастазирование раковых опухолей [Shen et al., 2009], способствовать упрочнению костной ткани при остеопорозе [Ratanavaraporn et al., 2009], а также могут быть использованы для ингибирования хитиназ у Plasmodium, выступая средством против малярии [Shahabuddin et al., 1993]. Имеются сведения об иммуномодулирующих свойствах хитоолигосахаридов [Kim et al., 2006], а также их способности снижать уровень глюкозы в сыворотке больных диабетом [Lee et al., 2003]. Следует отметить тот факт, что многие биологические эффекты, которые описаны для хитозана, могут в действительности быть связаны с хитоолигосахаридами, которые появляются в результате воздействия на хитозановый полимер различных гидролитических ферментов.

До настоящего времени подавляющее большинство исследований по биологической активности хитоолигосахаридов проведено с использованием смесей олигосахаридов без их удовлетворительной молекулярно-массовой характеристики. Более того, образцы хитоолигосахаридов используемые разными исследователями, часто имели различное происхождение, то есть были получены из различных источников, которые зачастую не указываются в их работах. Использование таких образцов затрудняет выяснение истинной химической структуры олигохитозана, проявляющей исследуемый биологический эффект, что влечёт за собой сложность воспроизводимости результатов при повторных опытах. Поэтому, несмотря на большое количество публикаций по биологической активности хитоолигосахаридов, остается малоизученным вопрос о влиянии химической структуры молекул олигохитозанов на их свойства.

1.2. Хитозан — источник хитоолигосахаридов

Существует ряд методов получения хитозана и хитоолигосахаридов непосредственно из биологических источников, например из клеточных стенок некоторых грибов. Однако коммерчески доступным является

хитозановый полимер, полученный в результате гетерогенного процесса деацетилирования.

Хитозан может быть получен из хитина двумя принципиально разными методами - в условиях гомогенного и гетерогенного процесса [8аппап е! а1., 1976].

В первом случае хитин растворяется в щелочном растворе в процессе деацетилирования при интенсивном перемешивании. Обычно этот процесс происходит при низких температурах. В случае гетерогенного процесса хитин подвергают деацетилированию в горячем щелочном растворе, где процесс отщепления от полимера ацетильных остатков происходит только на поверхности твёрдого хитинового субстрата. При деацетилировании хитина в гомогенных условиях расположение ацетилированных и деацетилированных углеводных остатков в полимерной цепи будет иметь случайное распределение в соответствии с распределением Бернулли. Тогда как в случае гетерогенного процесса получаемый хитозан имеет в своём составе неравномерное распределение двух разных видов мономерных остатков.

Несмотря на наличие ряда работ, указывающих на тот факт, что в случае гетерогенного деацетилирования также могут образовываться полимеры хитозана со случайным распределением двух разных мономерных остатков, используемые в таких случаях методы ЯМР-спектроскопии также не могут дать точный ответ на данный вопрос в связи с возможностью детекции только среднего распределения в исследуемом образце. Это означает, что хитозан, полученный при гетерогенном процессе, может содержать области с повышенной степенью ацетилирования, представляющие собой блоки из областей исходного хитина с повышенной кристаллической макроструктурой.

Годовой объем синтеза хитина в природе составляет порядка 10-10" тонн в год. Количество хитина, хитозана и их производных, которое используются или производятся в промышленных процессах, в последние годы ежегодно составляет порядка 30 ООО тонн для хитина и около 10 ООО

тонн для хитозана. Большая доля хитина находит примененние в качестве сырья для производства моносахарида -глюкозамина, который является довольно распространенной пищевой добавкой в США для облегчения боли при остеоартрите.

Практически всё производство хитозана из хитина основано на химических процессах, а ферментативные альтернативы, обладающие аналогичной эффективностью и себестоимостью, до сих пор не предложены. В качестве ферментативного метода возможно использование дезацетилаз [Некта! е1 а1., 2003], которые гидролизуют И-ацетильные связи и превращают ацетилглюкозамин в глюкозамин. Основной проблемой на пути использования данных ферментов лежит малая доступность субстрата ввиду высокой кристалличности исходного материала. Хитиндезацетилазы также могут быть использованы для изменения структуры Ы-ацетилирования молекул олигохитозанов. Хотя данная технология находится в зачаточном состоянии, однако её развитие представляется весьма перспективным.

1.2.1. Ферментативное получение хитоолигосахаридов

Несмотря на распространённость химического метода получения хитоолигосахаридов, использование ферментативных технологий можно считать более перспективным при необходимости получения хитоолигосахаридов с заданными молекулярно-массовыми характеристиками и степенью деацетилирования. Специфичность хитозан-расщепляющих ферментов традиционно оценивалась по способности быстро расщеплять хитозан с последующей характеристикой получаемого низкомолекулярного продукта. Однако последние исследования показали, что кинетика реакции гидролиза такова, что химический состав продуктов реакции деполимеризации значительно варьирует в зависимости от стадии процесса. Поскольку различные ферменты имеют сродство к различным последовательностям ацетилированных и деацетилированных звеньев полимерной цепи хитозана, реакция деполимеризации может иметь сложную многостадийную кинетику, где по окончании каждой фазы образуются

промежуточные продукты с определённой химической структурой, которые существенно отличаются от продуктов других фаз процесса. При этом динамика процесса гидролиза каждого последующего промежуточного продукта может существенно отличаться друг от друга. В целом это означает, что выбор исходного образца хитозана, фермента или ферментного препарата, а также выбор условий и режима процесса деполимеризации оказывает существенное влияние на конечный продукт, что также указывает на возможность регулирования в нужном направлении протекающего процесса [Sikorski et al., 2005], о чём свидетельствует также наличие многочисленных публикаций по данной теме [Sikorski et al., 2005; Heggset et al., 2009; Sasaki et al., 2006].

Для деполимеризации хитозана также возможно использование неспецифических ферментов, в первую очередь целлюлаз, а также некоторых протеаз и липаз [Sashiwa et al., 2003; Terbojevich et al., 1996; Xie et al., 2010]. В ряде случаев авторы используют неочищенные ферментные препараты, которые могут содержать примеси энзимов с искомой ферментативной активностью, в связи с чем способность этих ферментов расщеплять некоторыми исследователями ставится под сомнение. Тем не менее, использование таких дешёвых ферментных препаратов может оказаться полезным для практического получения хитоолигосахаридов.

1.2.2. Способы получения хитоолигосахаридов

1.2.2.1. Кислотный гидролиз хитозана

Из химических методов гидролиза хитозана, кислотный гидролиз, вероятно, самый известный. Ранние исследования кислотного гидролиза хитозана показали, что при использовании концентрированной соляной кислоты удается достичь полного перевода полимера в олигосахариды [Domard and Cartier, 1992]. В более поздних работах [Einbu and Varum, 2007] с использованием хитозана из различных источников, было показано влияние

степени ацетилирования хитозана на динамику процесса деполимеризации.

/

Установлено, что катализируемое кислотой расщепление гликозидных связей

зависит от химической структуры образующих эти связи сахаридных остатков. Так расщепление гликозидных связей внутри последовательности А-А и А-Д, где А-ацетилированное звено, Д-деацетилированное звено и правое звено расположено в стороне к редуцирующему концу полимера, происходит со скоростью на два-три порядка выше, чем внутри последовательностей Д-Д и Д-А.

Такое предпочтение расщеплению может зависеть от двух главных факторов: присутствия положительно заряженной группы, ингибирующей каталитический процесс, и от наличия ацетамидной группы, участвующей в качестве субстрата вспомогательной структуры в гидролитическом процессе. В том же исследовании показано, что скорость деацетилирования была меньше одной десятой скорости деполимеризации в присутствии концентрированной кислоты, тогда как скорость этих двух процессов оказалась равной в разбавленных кислотах. Предполагается, что это связано с различиями в механизме этих двух процессов, имеющих различные скорости [Einbu and Varum, 2007].

1.2.2.2. Химический синтез хитоолигосахаридов

Получение хитоолигосахаридов также возможно путём химического синтеза. Получение олигосахаридов данным методом требует обеспечения защиты отдельных групп хитозана от нежелательного химического взаимодействия с последующим снятием такой защиты. В связи с этим при использовании химического синтеза появляется возможность получения очень чистых соединений, требующих при их производстве использования различных растворителей и проведения многочисленных длительных реакций. Кроме этого при таком подходе получаются гомоолигомеры, не воспроизводящие того разнообразия химической структуры хитоолигосахаридов, которое можно получить ферментативным методом. Всё это делает процесс получения олигомеров данным способом достаточно сложным и дорогостоящим, особенно при необходимости получения большого количества вещества.

В настоящее время имеется достаточно небольшое количество работ, посвященных химическому синтезу олигомеров. Так описано получение полностью деацетилированного додекамера хитозана, где в качестве исходного материала использовался глюкозамин, аминогруппа которого была защищена диметилмалеоилом [Киуата е1 а1., 1993]. Также синтезированы полностью ацетилированные тетра- и гексаолигомеры [А1у й а1., 2001], при этом ацетилирование аминогрупп можно вести параллельно с процессом отсоединения защитной диметилмалеоильного остатка [А1у е1 а1., 1998]. Сочетание данных подходов позволяет получать частично деацетилированные хитоолигосахариды.

Также разработан метод химического получения хитоолигосахаридов из полностью деацетилированного хитозана с высокой молекулярной массой [ТготЬойо е1 а1., 2008]. Исходный хитозан подвергают частичной деполимеризации с использованием соляной кислоты для - получения полностью деацетилированных олигомеров, которые затем подвергаются селективному осаждению и ультрафильтрации, что в итоге приводит к получению смеси олигомеров со степенью полимеризации от 2 до 12. Полученные олигомеры затем можно ацетилировать до необходимого уровня путём добавления ацетилирующего реагента в расчётном стехиометрическом количестве. Таким образом появляется возможность получать смесь олигомеров указанной степени полимеризации с заданной величиной степени ацетилирования. Недостатком данного метода по сравнению с ферментативным способом является неоднородность молекулярно-массового состава вещества.

Имеется аналогичный подход: высокодеацетилированный высокомолекулярный хитозан сначала гидролизуют в соляной кислоте, а затем полученные олигосахариды фракционируют с помощью гель-фильтрации и также контролируемо ацетилируют до необходимого уровня \LetzeX ег а1., 2000].

Перспективным можно считать хемоэнзиматический метод синтеза хитоолигосахаридов, сочетающий возможность получения олигомеров с заданными параметрами молекулярно-массового состава и химической структуры с отсутствием необходимости в проведении трудоёмких процедур защиты реакционноспособных групп. На сегодняшний день данный подход был продемонстрирован при использовании оксазолина, который имитирует гидролиз хитозана, выступая в качестве гликозил-донора в фермент-опосредуемой реакции, где другие (ацетил)глюкозаминные остатки действуют в качестве гликозил-акцепторов [Ohmae et al., 2006]. При использовании оксазолин-олигомерных блоков с определённой начальной структурой, представляется вероятным в дальнейшем получать олигохитозаны с заданными химическими особенностями. Основным недостатком данного способа является то, что продукт реакции одновременно является и субстратом, что может привести к существенному снижению выхода целевого продукта. Чтобы этого избежать, предлагается использование модифицированных продуктов со сниженной гидролитической активностью. Изменения в ферменте должны быть направлены на уменьшение гидролитической активности для увеличения возможности акцептирования в процессе гликозилирования [Jahn et al., 2003]. 1.3. Антибактериальные и антимикотические свойства хитозана Хитозан, впервые описанный Rouget в 1859 году, обладающий широким спектром биологических свойств, стал находить практическое применение только в последние два десятилетия [XX., 2002]. Одними из первых свойств, обнаруженных у хитозана, стали его антибактериальная и антимикотическая активности.

Эти свойства хитозана нашли применение для защиты от развития гнили, плесневения и обеспечения более длительного хранения растительных продуктов [Bautista-Banos et al., 2006] - плодов дыни [Chen W et al., 2012], абрикоса [Lou et al., 2011], ягод клубники [Devlieghere et al., 2004], соков [Roller and Covill, 1999; Rhoades and Roller, 2000], в пищевой отрасли - для

изготовления плёнок и упаковочного матерала из хитозана, либо плёнок, содержащих хитозан в качестве модифицирующей добавки [Belalia et al., 2008; Bordenave et al., 2010], консервирования рыбы [Tsai et al., 2002] и икры [Быкова с соавт., 2009], в медицине - для профилактики и лечения периодонта [Choi et al., 2001], кариеса [Kim et al., 2003], костных заболеваний [Dunne et al., 2008], инфекционных заболеваний [Lee et al., 2009], для раневых повязок [Muzzarelli et al., 1990], а также в текстильной отрасли [Lim and Hudson, 2003; Fernandes et al., 2010; Abdel-Mohsen et al., 2012; Tavaria et al., 2012].

Близким к антибактериальному действию хитозанового полимера можно отнести его использование для нейтрализации токсинов бактерий. Например для создания гликоконъюгата на основе хитозана к которому присоеденён глоботриозный фрагмент, который способен эффективно связывать шига-токсин Е. coli и тем самым препятствовать развитию инфекционной болезни [Li et al., 2012].

Одним из направлений использования хитозана и гликонъюгатов на его основе можно считать его применение для снижения адгезивных свойств условно-патогенных бактерий [Xu et al., 2010].

Биоцидной активности хитозана посвящено большое количество экспериментальных работ [Rabea et al., 2003]. В отличие от хитина, который биоцидной активностью не обладает, его частично деацетилированное производное - хитозан имеет свободные аминогруппы, что обуславливает поликатионную природу хитозановой молекулы при кислых и нейтральных значениях рН. Положительный заряд позволяет молекулам хитозана связываться с отрицательно-заряженными поверхностными структурами клеток микроорганизмов, что препятствует нормальному обмену веществ с окружающей средой [Raafat and Sahl, 2009; Kumar et al., 2005; Krajewska et al., 2011].

Проникая внутрь клетки, хитозан может взаимодействовать с различными компонентами цитоплазматического содержимого, нарушая их нормальное функционирование [Liu et al., 2001]. При этом, проявляя ингибирующее действие на грамотрицательные и грамположительные прокариоты, мицелиальные и дрожжеподобные грибы, хитозан оказывает меньшее влияние на клетки млекопитающих [Rhoades and Roller, 2000; Roller and Covill, 1999]. Это подтверждается различием в особенности взаимодействия поликатиона с мембранными структурами, состоящие из молекул липидов, имеющих различное строение и заряд [Krajewska et al., 2011]. Однако для установления механизма антибактериальной и антигрибной активности хитозана требуется точное установление тех клеточных компонентов и процессов, которые являются главными мишенями действия хитозанового полимера.

1.3.1. Действие хитозана на грамотрицательные бактерии

Грамотрицательные бактерии имеют внешнюю мембрану, которая является мощным барьером для многих антибиотических веществ. В составе мембраны присутствуют ЛПС и многочисленные структурные белки, придающие поверхности микробной клетки отрицательный заряд и гидрофильные свойства, благодаря чему затрудняется проникновение внутрь гидрофобных молекул с антибиактериальным действием. Эти же компоненты могут взаимодействовать с поликатионными молекуламичто приводит к нарушению барьерной функции внешней мембраны, что, впрочем, не всегда ведёт к гибели клетки. Подобными свойствами обладают алифатические и положительно-заряженные полимеры, например, полиэтиленимин, который при связывании с поверхностью клетки грамотрицательной бактерии изменяет проницаемость внешней мембраны, делая клетку более чувствительной к детергент-индуцированному лизису, а также к гидрофобным антибиотическим веществам и красителям [Helander et al., 1997].

Нонапептидный антибиотик полимиксин В, обладающий свободными аминогруппами, связывается с внешней мембраной, что приводит к серьёзным структурным изменениям, которые отчётливо видны на микрофотографиях [Vaara and Vaara, 1983; Heiander et al., 1998a, Heiander et al., 1998b]. Контакт поверхности клеток бактерий с протамином или полилизином приводит к обильному высвобождению во внешнюю среду компонентов мембраны, в том числе ЛПС [Vaara and Vaara, 1983]. Высвобождению ЛПС способствует и ЭДТА, обладающий сильными хелатирующими свойтвами, что позволяет ему связывать ионы двухвалентных металлов, которые выполняют важную стабилизирующую роль для мембранных структур [Hukari et al., 1986].

Поликатионная природа хитозана позволяет хитозану связываться с отрицательно-заряженным компонентами внешней мембраны грамотрицательных бактерий [Liu et al., 2004]. Установлено, что такая связь приводит к изменениям во внешней мембране у E.coli, Pseudomonas aeruginosa и Salmonella typhimurium, что подтверждается уменьшением устойчивости клеток к действию некоторых веществ, например, к SDS [Heiander et al., 2001].

Нарушение целостности мембраны при взаимодействии с поликатионом ведёт к гибели клетки бактерий [Chen et al., 2012]. Необходимо отметить, что изменения в структуре мембраны, вызываемые хитозаном, могут быть обратимыми, так как после удаления поликатиона с поверхности микробных клеток они приобретают свой прежний уровень устойчивости [Heiander et al., 2001].

Эффективное связывание хитозана с мембранными структурами бактерий может определяться особенностями их состава, а именно наличием большого количества анионных липидов [Krajewska et al., 2011]. Тогда как к липидам имеющих цвиттер-ионные или нейтральные свойства хитозановый полимер обладает меньшим родством, чем может быть обусловлена меньшая чувствительность к хитозану клеток млекопитающих.

Важную роль в проявлении хитозаном антибактериального действия играет заряд ЛПС, который наряду со многими другими компонентами внешней мембраны заряжен отрицательно. Наличие в мутантном штамме & 1урЫтигшт 8Н7426 ЛПС заряженного положительно делает его более устойчивым к поликатиону по сравнению с исходным штаммом фрШтигшт 8Н9178, который содержит обычный отрицательно заряженный ЛПС [Не1апёег е1 а1., 2001]. Данное обстоятельство делает мембрану мутантного штамма более устойчивой к дестабилизирующему действию хитозана и включению в её состав гидрофобного экзогенных гидрофобных веществ, таких как ЫРЫ.

Также более чувствительными к действию хитозана являются мутантные штаммы & 1урЫтигшт, у которых нарушено присоединение И-ацетил-глюкозамина к остатку глюкозы II в коровой части ЛПС, а также нарушено фосфорилирование коровой части ЛПС [Ме1^агё е1 а1., 2011], что подтверждается наличием более низких значений минимальных ингибирующих и бактерицидных концентраций хитозана в отношении данной бактерии и повышенной проницаемостью внешней мембраны для гиброфобных веществ в присутствии хитозанового полимера.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Хайруллин, Руслан Зуфарович

выводы

1. Определены минимальные ингибирующие и бактерицидные концентрации олигохитозанов в отношении бактерий и микроскопических грибов. Наиболее чувствительными к хитозану являются Staphylococcus epidermidis и Klebsiella pneumoniae для которых минимальная ингибирующая концентрация составляет соответственно 0,4 и 3,9 мкг/мл,. Для большинства исследованных в работе видов энтеробактерий минимальная ингибирующая концентрация составляет 125 мкг/мл. Самым устойчивым к действию хитозана оказался Staphylococcus aureus с минимальной ингибирующей концентрацией 250 мкг/мл.

2. Показано, что в характере изменения антибактериальных свойств хитозанового полимера важную роль играет показатель рКа. Впервые был обнаружен эффект инверсии зависимости ингибирующей активности хитозана от его молекулярной массы при изменении рН среды. Установлено, что образцы хитозана с молекулярной массой более 5,5 кДа, растворимые только в кислой среде, обладают антибактериальным действием только в кислых условиях. Образцы хитозана с молекулярной массой от 2,5 до 5,5 кДа, растворимые в нейтральных условиях, обладают меньшей антибактериальной активностью по сравнению с более высокомолекулярными образцами в кислых условиях, однако, характеризуются наличием антибактериального действия в нейтральных и слабощелочных условиях.

3. Проведено исследование антибактериальных и антимикотических свойств ацилированных производных олигохитозанов. Установлено, что внесение в молекулу поликатиона ацильного остатка со степенью замещения 6-12%, усиливает антибактериальные свойства полимера, а наибольшим биоцидным действием обладает миристил-производное хитозана.

4. Выявлены, в том числе и на ультраструктурном уровне, существенные морфологические изменения клеток микроорганизмов при действии олигохитозанов. Так у грамотрицательных бактерий внешняя мембрана частично теряет свою целостность и приобретает прерывистый вид, а количество цитоплазматического содержимого уменьшается, в результате чего образуются обширные вакуолеобразные области. У грамотрицательных бактерий происходит утончение клеточной стенки с нарушением симметрии при формировании межклеточной перегородки во время деления. Также показано, что присутствие олигохитозанов приводит к ингибированию образования мицелиальных структур у Candida albicans.

5. Впервые показано активирующее действие хитозана на лизис клеточных стенок бактерий ферментом - лизостафином. Это, а также отмеченное при ультраструктурном исследовании утончение клеточных стенок у стафилококков, позволяет предположить механизм антибактериального действия поликатиона, заключающийся в вытеснении поликатионом бактериальных автолизинов из их комплекса с тейхоевыми кислотами и вовлечением их в деградацию пептидогликана клеточной стенки.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Хайруллин, Руслан Зуфарович, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Быкова В.М. «Милахит» в консервировании зернистой икры лососёвых рыб [Текст] / В.М. Быкова, C.B. Немцев, Л.И. Кривошеина, Е.А. Ежова, О.И. Глазунов // Рыбпром. -2009. -№ 1. -С.33-34.

2. Герасименко Д. В. Антибактериальная активность водорастворимых низкомолекулярных хитозанов в отношении различных микроорганизмов [Текст] / Д.В. Герасименко, И.Д. Авдиенко, Г.Е.Банникова, О.Ю.Зуева, В.П.Варламов // Прикладная биохимия и микробиология. -2004. -Т.40. -№3. -С.301-306.

3. Дмитриева Н.Ф., Тимофеев Ю.М. Липотейхоевые и тейхоевые кислоты патогенных стрептококков: структура, функции, роль во взаимодействии возбудителя с макроорганизмом [Текст] / Н.Ф. Дмитриева, Ю.М. Тимофеев // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -2007. -№6. -С.100-107.

4. Ильина A.B. Хитозан - природный полимер для формирования наночастиц [Текст] / A.B. Ильина, В.П. Варламов, Ю.А.Ермаков // ДАН. -2008а. -№421(2). -С. 199-201.

5. Ильина A.B. Получение и исследование моносахаридных производных низкомолекулярного хитозана [Текст] / A.B. Ильина, С.Н.Куликов, Г.И.Чаленко, Н.Г.Герасимова, В.П. Варламов // Прикладная Биохимия и Микробиология. -20086. -Т. 44. -№ 5. -С.606-614.

6. Ильина A.B. О необходимости фракционирования образцов низкомолекулярного хитозана для оценки его биологической активности [Текст] / A.B. Ильина, В.П.Варламов // Материалы 7-ой международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». Санкт-Петербург. -2003. -С. 311-315.

7. Лопатин С.А. Исследование возможности получения узкодисперсного хитозана [Текст] / С.А. Лопатин, М.С. Дербенева, С.Н. Куликов, В.П. Варламов, O.A. Шпигун // Материалы 9-ой международной конференции

«Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». -Ставрополь. -2008. -С. 76-79.

8. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение [Текст] / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. -М.: Наука. -2002. -С.339-345.

9. Abdel-Mohsen A.M. Antibacterial cotton fabrics treated with core-shell nanoparticles [Text] / A.M. Abdel-Mohsen, R.M. Abdel-Rahman, R. Hrdina, A. Imramovsky, L. Burgert, A.S. Aly // Int. J. Biol. Macromol. -2012, -V.50. -№5. -P. 1245-1253.

10. Alburquenque C. Antifungal activity of low molecular weight chitosan against clinical isolates of Candida spp. [Text] / C. Alburquenque, S.A. Bucarey, A. Neira-Carrillo, B. Urzua, G. Hermosilla, C.V. Tapia // Med. Mycol. -2010, -V.48. -№8. -P. 1018-1023.

11. Amarnath K. Synthesis and characterization of chitosan and grape polyphenols stabilized palladium nanoparticles and their antibacterial activity [Text] / K. Amarnath, J. Kumar, T. Reddy, V. Mahesh, S.R. Ayyappan, J.Nellore // Colloids Surf В Biointerfaces. -2012. - V.92. -P.254-261.

12. Bautista-Banos S. Chitosan as a potential natural compound to control pre and postharvest diseases of horticultural commodities [Text] / S. Bautista-Banos, A.N. Hernandez-Lauzardo, M.G. Velazquez-del Valle, M. Hernandez-Lopez, E. Ait Barka, E. Bosquez-Molina, C.L. Wilson // Crop Protection. -2006. -№25. -P.108-118.

13. Belalia R. New bioactive biomaterials based on quaternized chitosan [Text] / R. Belalia, S. Grelier, M. Benaissa, V. Coma // J. Agric. Food Chem.-2008. -V.56. - V.5. -P.1582-1588.

14. Bhaskara Reddy M.V. Effect of chitosan on growth and toxin production by Alternaria alternata f. sp. lycopersici [Text] / M.V. Bhaskara Reddy, J. Arul, E. Ait-Barka, P. Angers, C. Richard, F. Castaigne // Biocontrol Science Technol. -1998. -V.8. -P.33-43.

15.Bierbaum G. Autolytic system of Staphylococcus simulans 22: influence of cationic peptides on activity of N-acetylmuramoil-L-alanine amidase [Text] / G. Bierbaum, H.G. Sahl //J. Bacteriol. -1987. -V.169. -P.5452-5458.

16. Boorsma A. Characterization of the transcriptional response to cell wall stress in Saccharomyces cerevisiae [Text] / A. Boorsma, H. de Nobel, B. ter Riet, B. Bargmann, S. Brul, K.J. Hellingwelf, F.M. Klis // Yeast. -2004. - V.21. -P.413-427.

17. Bordenave N. Hydrophobization and antimicrobial activity of chitosan and paper-based packaging material [Text] / N. Bordenave, S. Grelier, V. Coma // Biomacromol. -2010. -V.ll. -№1. -P.88-96.

18. Calamari S.E. Antifungal and post-antifungal effects of Chlorhexidine, fluconazole, chitosan and its combinations on Candida albicans [Text] / S.E.Calamari, M.A.Bojanich, S.R.Barembaum, N.Berdicevski, A.I. Azcurra // Med. Oral Patol. Oral Cir. Bucal. -2011. -V.16. -№1. -P.23-28.

19. Chamundeeswari M. Preparation, characterization and evaluation of a biopolymeric gold nanocomposite with antimicrobial activity [Text] / M. Chamundeeswari, S.S. Sobhana, J.P. Jacob, M.G. Kumar, M.P. Devi, T.P. Sastry,

A.B. Mandal / Biotechnol. Appl. Biochem. -2010. -V.55. -№1. -P.29-35.

20. Chen W. Inactivation of Salmonella on whole cantaloupe by application of an antimicrobial coating containing chitosan and allyl isothiocyanate [Text] / W. Chen, T.Z. Jin, J.B. Gurtler, D.J. Geveke, X. Fan // Int. J. Food Microbiol. -2012. -V.155. -№3. -P.165-170.

21. Chen Y.M. Antibacterial properties of chitosan in waterborne pathogen [Text] / Y.M. Chen, Y.C. Chung, L.W. Wang, K.T.Chen, S.Y. Li // J. Environ. Sei. Health A Tox. Hazard Subst. Environ. Eng. -2002. -V.37. -№7. -P. 1379-1390.

22. Choi B.K. In vitro antimicrobial activity of a chitooligosaccharide mixture against Actinobacillus actinomycetemcomitans and Streptococcus mutans [Text] /

B.K. Choi, K.Y. Kim, Y.J. Yoo, S.J. Oh, J.H. Choi, C.Y. Kim / Int. J. Antimicrob. Agents. -2001. -V.18. -№6. -P.553-557.

23. Chung Y. Relationship between antibacterial activity of chitosan and , surface characteristics of cell wall [Text] / Y.Chung, Y.Su, C.Chen, G.Jia, H.Wang,

J.C.G.Wu, J.Lin // Acta Pharmacol. Sin. -2004. -V.25.-№7. -P.932-936.

24. Chung Y.C. Antibacterial characteristics and activity of acid-soluble chitosan [Text] / Y.C.Chung, C.Y. Chen // Bioresource Technology. -2008. -V.99. -P.2806-2814.

25. Cuero R.G. N-carboxymethylchitosan inhibition of aflatoxin production: role of zinc [Text] / R.G. Cuero, G. Osuji, A.Washington // Biotechnology Letters. -1991. -V. 13. -№6. -P.441-444.

26. Devlieghere F. Chitosan: antimicrobial activity, interactions with food components and applicability as a coating on fruit and vegetables [Text] / F. Devlieghere, A. Vermeulen, J. Debevere // Food Microbiol. -2004. -V.21. -P.703-714.

27. Decker E.M. Comparison of antiadhesive and antibacterial effects of antiseptics on Streptococcus sanguinis [Text] / E.M. Decker, R. Weiger, I. Wiech, P.E. Heide, M. Brecx//Eur. J. Oral Sei. -2003. -V.lll. -№2. -P.144-148.

28. Didenko L.V. Ultrastructural study of chitosan effects on Klebsiella and staphylococci [Text] / L.V. Didenko, D.V. Gerasimenko, N.D. Konstantinova, T.A. Silkina, I.D. Avdienko, G.E. Bannikova, V.P. Varlamov / Bull. Exp. Biol. Med. -2005. V.140. -P.356-360.

29. Dunne N. In vitro testing of chitosan in gentamicin-loaded bone cement: no antimicrobial effect and reduced mechanical performance [Text] / N. Dunne, F. Buchanan, J. Hill, C. Newe, M. Tunney, A. Brady, G. Walker // Acta Orthop. -2008. -V.79. -№6, -P.851-860.

30. Eaton P. Atomic force microscopy study of the antibacterial effects of chitosans on Escherichia coli and Staphylococcus aureus [Text] / P. Eaton, J.C. Fernandes, E. Pereira, M.E. Pintado, F. Xavier Malcata // Ultramicroscopy. -2008. -V.108. -№10. -P.l 128-1134.

31. Fedtke I. A staphylococcus aureus ypfP mutant with strongly reduced lipoteichoic acid (LTA) content: LTA governs bacterial surface properties and autolysin activity [Text] /1. Fedtke, D. Mader, T. Kohler, H. Moll, G. Nicholson, R. Biswas, K. Henseler, F. Götz, U. Zähringer, A. Peschel / Mol. Microbiol. -2007.

- V.65.-P.1078-1091.

32. Ferket K.K. Isolation and characterization of Neurospora crassa mutants resistant to antifungal plant defensins [Text] / K.K. Ferket, S.B. Levery, C. Park, B.P. Cammue, K. Thevissen // Fungal Genet. Biol. -2003. - V.40. -P. 176-185.

33. Fernandez J.C. Antimicrobial effects of chitosans and chitooligosaccharides, upon Staphylococcus aureus and Escherichia coli, in food model systems [Text] / J.C. Fernandez, F.K. Tavaria, J.C. Soares, O.S. Ramos, M.J. Monteiro, M.E. Pintado, F.X. Malcata // Food Microbiol. -2008. - V.25. -P.922-928.

34. Fernandes J.C. Study of the antibacterial effects of chitosans on Bacillus cereus (and its spores) by atomic force microscopy imaging and nanoindentation [Text] / J.C. Fernandes, P. Eaton, A.M. Gomes, M.E. Pintado, F. Xavier Malcata // Ultramicroscopy. -2009. -V.109 -№8. -P.854-860.

35. Fernandes J.C. In vitro screening for anti-microbial activity of chitosans and chitooligosaccharides, aiming at potential uses in functional textiles [Text] / J.C. Fernandes, F.K. Tavaria, S.C. Fonseca, O.S. Ramos, M.E. Pintado, F.X. Malcata // J. Microbiol. Biotechnol. -2010. -V.20. -№2. -P.311-318.

36. Fuchs S. Anaerobic gene expression in Staphylococcus aureus [Text] / S. Fuchs, J. Pane-Farre, C. Kohler, M. Hecker, S. Engelmann / J. Bacteriol. -2007.

- V.189. -p.4275-4289.

37. Guo Z. The influence of the cationic of quaternized chitosan on antifungal activity [Text] / Z. Guo, R. Xing, S. Liu, Z. Zhong, X. Ji, L. Wang, P. Li // Int. J. Food Microbiol. -2007. -V.118. -№2. -P.214-217.

38. Gasch A.P. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes [Text] / A.P. Gasch, P.T. Spellman, C.M. Kao, O. Carmel-Harel, M.B. Eisen, G. Storz, D. Botstein, P.O. Brown // Mol. Biol. Cell. -2000. -V.ll. -P.4241-4257.

39. Heiander I.M. Polyethyleneimine is an effective permeabilizer of Gramnegative bacteria [Text] / I.M. Heiander, H. Alakomi, K. Latva-Kala-, P. Koski // Microbiology. -1997. - V.143. -P.3193-3199.

40. Heiander I.M. Permeabilizing action of polyethyleneimine on Salmonella typhimurium involves disruption of the outer membrane and interactions with lipopolysaccharide [Text] / I.M. Heiander, K. Latva-Kala, K. Lounatmaa // Microbiology. -1998. - V.144. -P.385-390.

41. Helander I.M. Characterization of the action of selected essential oil components on Gram-negative bacteria [Text] / I.M. Helander, H. Alakomi, K. Latva-Kala, T. Mattila-Sandholm, I. Pol, E.J. Smid, L.G.M. Gorris, A. von Wright // J. Agric. Food Chem. -1998. - V.46. -P.3590-3595.

42. Helander I.M. Chitosan disrupts the barrier properties of the outer membrane of gram-negative bacteria [Text] / I.M. Helander, E.L. Nurmiaho-Lassila, R. Ahvenainen, J. Rhoades, S. Roller // Int. J. Food Microbiol. -2001. -V.71. -№2-3. -P.235-244.

43. Hernandez-Lauzardo A.N. Antigungal effects of chitosan with different molecular weights on in vitro development of Rhizopus stolonifer (Ehrenb.:Fr.) Vuill. [Text] / A.N. Hernandez-Lauzardo, S. Bautista-Banos, M.G. Velazquez-del Valle, M.G. Mendez-Montealvo, M.M. Sanchez-Rivera, L.A. Bello-Perez // Carbohydr. Polym. -2008. - V.73. -P.541-547.

44. Hukari R. Chain length heterogeneity of lipopolysaccharide released from Salmonella typhimurium by ethylenediaminetetraacetic acid or polycations [Text] / R. Hukari, I.M. Helander, M. Vaara // Eur. J. Biochem. -1986. - V.154. -P.673-676.

45. Ing L.Y. Antifungal activity of chitosan nanoparticles and correlation with their physical properties [Text] / L.Y. Ing, N.M. Zin, A. Sarwar, H. Katas // Int J Biomater. 2012; 2012:632698. doi: 10.1155/2012/632698

46. Jaime M.D. Identification of yeast genes that confer resistance to chitosan oligosaccharide (COS) using chemogenomics [Text] / M.D. Jaime, L.V. Lopez-Llorca, A. Conesa, A.Y. Lee, M. Proctor, L.E. Heisler, M. Gebbia,

G. Giaever, J.T. Westwood, C. Nislow // BMC Genomics. -2012. -V.13. -№1. -P.267.

47. Je J.Y. Chitosan derivatives killed bacteria by disrupting the outer and inner membrane [Text] / J.Y. Je, S.K. Kim // J. Agric. Food Chem. -2006. -V.54. -№18.-P.6629-6633.

48. Jena P. Toxicity and antibacterial assessment of chitosancoated silver nanoparticles on human pathogens and macrophage cells [Text] / P. Jena, S. Mohanty, R. Mallick, B. Jacob, A. Sonawane // Int. J. Nanomedicine. -2012. - V.7. -P.1805-1818.

49. Jeon Y.-J. Production of chitooligosaccharides using an ultrafiltration membrane reactor and their antibacterial activity [Text] / Y.-J. Jeon, S.-K. Kim // Carbohydrate Polymers. -2000. - V.41. -P.133-141.

50. Kendra D.F. Characterisation of the smallest chitosan oligomer that is maximally antifungal to Fusarium solani and elicits pisatin formation in Pisum sativum [Text] / D.F.Kendra, L.A. Hadwiger // Exp Mycol. -1984. - V.8. -P.276-281.

51. Kim J.Y. Synthesis of chitooligosaccharide derivative with quaternary ammonium group and its antimicrobial activity against Streptococcus mutans [Text] / J.Y. Kim, J.K. Lee, T.S. Lee, W.H. Park // Int. J. Biol. Macromol. -2003. -V.32. -№1-2, -P.23-27.

52. Kim S.-K. Enzymatic production and biological activities of chitosan oligosaccharides (COS): a review [Text] / S.-K. Kim, N. Rajapakse // Carb. Polym. -2005. - V.62. -P.357-368.

53. Klis F.M. Dynamics of cell wall structure in Saccharomyces cerevisiae [Text] / F.M. Klis, P. Mol, K. Hellingwerf, S. Brul // FEMS Microbiol. Rev. -2002. - V.26. -P.239-256.

54. Kohler C. Physiological characterization of a heme-deficient mutant of Staphylococcus aureus by a proteomic approach [Text] / C. Kohler, C. von Eiff, G. Peters, R.A. Proctor, M. Hecker, S. Engelmann // J. Bacteriol. -2003. - V.185. -P.6928-6937.

55. Kong M. Antibacterial mechanism of chitosan microspheres in a solid dispersing system against E. coli [Text] / M. Kong, X.G. Chen, C.S. Liu, C.G. Liu, X.H. Meng, L.J. Yu // Colloids Surface B: Biointerfaces. -2008. - V.65. -P. 197-202.

56. Kong M. Antimicrobial properties of chitosan and mode of action: a state of the art review [Text] / M. Kong, X.G. Chen, K. Xing, H.J. Park // Int. J. Food Microbiol. -2010. -V.144 -№1. -P.51-63.

57. Krajewska B. Probing the modes of antibacterial activity of chitosan. Effects of pH and molecular weight on chitosan interactions with membrane lipids in Langmuir films [Text] / B. Krajewska, P. Wydro, A. Janczyk // Biomacromol. -2011. -V.12. -№11. -P.4144-4152.

58. Vishu Kumar A.B. Low molecular weight chitosans: preparation with the aid of papain and characterization [Text] / A.B. Vishu Kumar, M.C. Varadaraj, R.G. Lalitha R.N. Tharanathan // Biochim Biophys Acta.. -2004. - V.1670. -№2. -P.137-146.

59. Kumar A.B.V. Characterization of chito-oligosaccharides prepared by chitosanolysis with the aid of papain and pronase, and their bactericidal action against Bacillus cereus and Escherichia coli [Text] / A.B.V. Kumar, M.C. Varadaraj, L.R. Gowda, R.N. Tharanathan // Biochem J. -2005. -V.391. -№2. -P.167-175.

60. Kumar A.B.V. Low molecular weight chitosan preparation with the aid of pepsin, characterization, and its bactericidal activity [Text] / A.B.V. Kumar, M.C. Varadaraj, R.N. Tharanathan // Biomacromol. -2007. - V.8. -№2. -P.566-572.

61. Kurita K. Preparation of nonnatural branched chitin and chitosan [Text] / K. Kurita, T. Kojima, T. Munakata, H. Akao, T. Mori, Y. Nishiyama, M. Shimojoh //Chem. Lett.-1998. -p.317.

62. Kurita K. Nonnatural branched polysaccharides: synthesis and properties of chitin and chitosan having alpha-mannoside branches [Text] / K. Kurita, K. Shimada, Y. Nishiyama, M. Shimojoh, S.I. Nishimura // Macromol. -1998. -V.31. -№15, -P.4764-4769.

63. Kurita K. Nonnatural branched polysaccharides: synthesis and properties of chitin and chitosan having disaccharide maltose branches [Text] / K. Kurita, H. Akao, J. Yang, M. Shimojoh//Biomacromol. -2003. -V.4. -№5. -P. 1264-1268.

64. Lee B.C. In vitro and in vivo antimicrobial activity of water-soluble chitosan oligosaccharides against Vibrio vulnificus [Text] / B.C. Lee, M.S. Kim, S.H. Choi, K.Y. Kim, T.S. Kim // Int. J. Mol. Med. -2009. -V.24. -№3. -P.327-333.

65. Li X. Synthesis and assessment of globotriose-chitosan conjugate, a novel inhibitor of shiga toxins produced by Escherichia coli [Text] / X. Li, P. Wu, S. Cheng, X. Lv // J. Med. Chem. -2012. -V.55. -№6. -P.2702-2710.

66. Lim S.H. Review of chitosan and its derivatives as antimicrobial agents and their uses as textile chemicals [Text] / S.H. Lim, S.M. Hudson // J. Macromol. Sei. -2003. - V.43. -№2. -P.223-269.

67. Liu H. Chitosan kills bacteria through cell membrane damage [Text] / H. Liu, Y. Du, X. Wang, L. Sun // Int. J. Food Microbiol. -2004. - V.95. -P. 147-155.

68. Liu H. Antifungal effect and mechanism of chitosan against the rice sheath blight pathogen, Rhizoctonia solani [Text] / H. Liu, W. Tian, B. Li, G. Wu, M. Ibrahim, Z. Tao, Y. Wang, G. Xie, H. Li, G. Sun // Biotechnol Lett. -2012. -V. 34. -№12. -P. 2291-2298.

69. Liu X.F. Antibacterial action of chitosan and carboxymethylated chitosan [Text] / X.F. Liu, Y.L. Guan, D.Z. Yang, Z. Li, K.D. Yao // J. Appl. Polym. Sei. -2001. - V.79. -P.1324-1335.

70. Lou M.M. Antibacterial activity and mechanism of action of chitosan solutions against apricot fruit rot pathogen Burkholderia seminalis [Text] / M.M. Lou, B. Zhu, I. Muhammad, B. Li, G.L. Xie, Y.L. Wang, H.Y. Li, G.C. Sun // Carbohydr. Res. -2011. - V.346. -№11. -P. 1294-1301.

71. Mallick S. Iodine-stabilized Cu nanoparticle chitosan composite for antibacterial applications [Text] / S. Mallick, S. Sharma, M. Banerjee, S.S. Ghosh, A. Chattopadhyay, A. Paul // ACS Appl. Mater. Interfaces. -2012. -V.4. -№ 3. -P.1313-1323.

72. Mellegárd H. Antibacterial activity of chemically defined chitosans: influence of molecular weight, degree of acetylation and test organism [Text] / H. Mellegárd, S.P. Strand, B.E. Christensen, P.E. Granum, S.P. Hardy // Int. J. Food Microbiol. -2011. -V.148. -№1. -P.48-54.

73. Meng X. Molecular weight and pH effects of aminoethyl modified chitosan on antibacterial activity in vitro [Text] / X. Meng, R. Xing, S. Liu, H. Yu, K. Li, Y. Qin, P. Li // Int. J. Biol. Macromol. -2012. - V.50. -№4. -P.918-924.

74. Moon J.S. The antibacterial and immunostimulative effect of chitosan-oligosaccharides against infection by Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis [Text] / J.S. Moon, H.K. Kim, H.C. Koo, Y.S. Joo, H.M. Nam, Y.H. Park, M.I. Kang // Appl. Microbiol. Biotechnol. -2007. - V.75. -P.989-998.

75. Muzzarelli R. Antimicrobial properties of N-carboxybutyl chitosan [Text] / R. Muzzarelli, R. Tarsi, O. Filippini, E. Giovanetti, G. Biagini, P.E. Varaldo // Antimicrob. agents chemother. -1990. - V.34. -P.2019-2023.

76. Pag U. Analysis of in vitro activities and modes of action of synthetic antimicrobial peptides derived from an a-helical sequence template [Text] / U. Pag, M. Oedenkoven, V. Sass, Y. Shai, O. Shamova, N. Antcheva, A. Tossi, H.G. Sahl // J. Antimicrob. Chemother. -2008 - V.61. -P.341-352.

77. Palma-Guerrero J. Chitosan permeabilizes the plasma membrane and kills cells of Neurospora crassa in an energy dependent manner [Text] / J. Palma-Guerrero, I.C. Huang, H.B. Jansson, J. Salinas, L.V. Lopez-Llorca, N.D. Read // Fungal Genet. Biol. -2009. -V.46. -№8. -P.585-594.

78. Palma-Guerrero J. Membrane fluidity determines sensitivity of filamentous fungi to chitosan [Text] / J. Palma-Guerrero, J.A. Lopez-Jimenez, A.J. Pérez-Berná, I.C. Huang, H.B. Jansson, J. Salinas, J. Villalain, N.D. Read, L.V. Lopez-Llorca // Mol. Microbiol. -2010. -V.75. -№ 4. -P.1021-1032.

79. Palmeira-de-Oliveira A. Anti-Candida activity of a chitosan hydrogel: mechanism of action and cytotoxicity profile [Text] / A. Palmeira-de-Oliveira, M.P. Ribeiro, R. Palmeira-de-Oliveira, C. Gaspar, S. Costa-de-Oliveira, I.J. Correia, C. Pina Vaz, J. Martinez-de-Oliveira, J.A. Queiroz, A.G. Rodrigues // Gynecol. Obstet.

Invest. -2010. - V.70. -№4. -P.322-327.

80. Papageorgiou I. The effect of nano- and micron-sized particles of cobalt-chromium alloy on human fibroblasts in vitro [Text] /1. Papageorgiou, C. Brown, R. Schins, S. Singh, R. Newson, S. Davis, J. Fisher, E. Ingham, C.P. Case // Biomaterials. -2007. - V.28. -№19. -P. 2946-2958.

81. Papageorgiou G.Z. Tailoring the release rates of fluconazole using solid dispersions in polymer blends [Text] / G.Z. Papageorgiou, D. Bikiaris, F.I. Kanaze, E. Karavas, A. Stergiou, E. Georgarakis // Drug Dev. Ind. Pharm. -2008. -V.34. -№3. -P.336-346.

82. Park Y. Investigation of the antifungal activity and mechanism of action of LMWS-chitosan [Text] / Y. Park, M.H. Kim, S.C. Park, H. Cheong, M.K. Jang, J.W. Nah, K.S. Hahm // J Microbiol. Biotechnol. -2008. -V.18. -№10. -P.1729-1734.

83. de Oliveira Pedro R. Synthesis, characterization and antifungal activity of quaternary derivatives of chitosan on Aspergillus flavus [Text] / R. de Oliveira Pedro, M. Takaki, T.C. Gorayeb, V.L. Bianchi, J.C. Thomeo, M.J. Tiera, V.A. de Oliveira Tiera // Microbiol. Res. -2012. -V.168. -№1. -P.50-55^

84. Peschel A. Inactivation of the dlt operon in Staphylococcus aureus confers sensitivity to defensins, protegrins, and other antimicrobial peptides [Text] / A. Peschel, M. Otto, R.W. Jack, H. Kaibacher, G. Jung, F. Götz // J. Biol. Chem. -1999.

- V.274. -P.8405-8410.

85. Qi L. Preparation and antibacterial activity of chitosan nanoparticles [Text] / L. Qi, Z. Xu, X. Jiang, C. Hu, X. Zou // Carb. Research. -2004. - V.339. -P.2693-2700.

86. Qin C. Water-solubility of chitosan and its antimicrobial activity [Text] / C.Qin, H. Li, Q. Xiao, Y. Liu, J. Zhu, Y. Du // Carbohydrate Polymers. -2006.

- V.63.-P.367-374.

87. Raafat D. Insight into the mode of action of chitosan as an antibacterial compound [Text] / D. Raafat, K. Bargen, A. Haas, H.G. Sahl // Appl. Env. Microbiol. -2008. - V.74. -№12. -P.3764-3773.

88. Raafat D. Chitosan and its antimicrobial potential - a critical literature survey [Text] / D. Raafat, H.G. Sahl // Microb. Biotechnol. -2009. -V.2. -№2. -P. 186-201.

89. Rabea E.I. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action [Text] / E.I. Rabea, M.E. Badawy, C.V. Stevens, G. Smagghe, W. Steurbaut // Biomacromol. -2003. - V.4. -№6. -P. 1457-1465.

90. Rawlinson L.A. Antibacterial effects of poly(2-(dimethylamino ethyl)methacrylate) against selected gram-positive and gram-negative bacteria [Text] / L.A. Rawlinson, S.M. Ryan, G. Mantovani, J.A. Syrett, D.M. Haddleton, D.J. Brayden //Biomacromol. -2010. -V.l 1. -№2. -P.443-453.

91. Rhoades J. Antimicrobial actions of degraded and native chitosan against spoilage organisms in laboratory media and foods [Text] / J. Rhoades, S. Roller // Appl. Environ. Microbiol. -2000. - V.66 -P.80-86.

92. Roller S. The antifungal properties of chitosan in laboratory media and apple juice [Text] / S. Roller, N. Covill // Int. J. Food Microbiol. -1999. - V.47. -P.67-77.

93. Sadeghi A.M. Preparation, characterization and antibacterial activities of chitosan, N-trimethyl chitosan (TMC) and N-diethylmethyl chitosan (DEMC) nanoparticles loaded with insulin using both the ionotropic J gelation and poly electrolyte complexation methods [Text] / A.M. Sadeghi, F.A. Dorkoosh, M.R. Avadi, P. Saadat, M. Rafiee-Tehrani, H.E. Junginger // Int. J. Pharm. -2008. -V.355. -№ 1-2. -P.299-306.

94. Saita K. Preparation and characterization of dispersible chitosan particles with borate crosslinking and their antimicrobial and antifungal activity [Text] / K. Saita, S. Nagaoka, T. Shirosaki, M. Horikawa, S. Matsuda, H. Ihara // Carbohydr. Res. -2012. - V.349. -P.52-58.

95. Sass V. Mode of action of human (3-defensin 3 against Staphylococcus aureus and transcriptional analysis of responses to defensin challenge [Text] / V. Sass, U. Pag, A. Tossi, G. Bierbaum, H.G. Sahl // Int. J. Med. Microbiol. -2008. - V.298. -№7-8. -P.619-633.

96. Schlievert P.M. Chitosan malate inhibits growth and exotoxin production of toxic shock syndrome-inducing Staphylococcus aureus strains and group A streptococci. / P.M. Schlievert // Antimicrob. Agents Chemother. -2007. - V.51. -№9. -P.3056 - 3062.

97. Seyfarth F. Antifungal effect of high- and low-molecular-weight chitosan hydrochloride, carboxymethyl chitosan, chitosan oligosaccharide and N-acetyl-D-glucosamine against Candida albicans, Candida krusei and Candida glabrata [Text] / F. Seyfarth, S. Schliemann, P. Eisner, U.C. Hipler // Int. J. Pharm. -2008 -V.353. -№1-2. -P.139-148.

98. Seymour I.J., Piper P.W. Stress induction of HSP30? The plasma membrane heat shock protein gene of Saccharomyces cerevisiae, appears not to use known stress-regulated transcription factors [Text] / I.J. Seymour, P.W. Piper // Microbiology. -1999. -V.145. -P.231-239.

99. Simunek J. The antimicrobial action of low-molar-mass chitosan, chitosan derivatives and chitooligosaccharides on bifidobacteria [Text] / J. Simunek, I. Koppova, L. Filip, G. Tishchenko, G. Belzecki // Folia Microbiol. -2010. - V.55. -№4. -P.379-382.

100. Simunek J. The antimicrobial action of chitosan, low molar mass chitosan, and chitooligosaccharides on human colonic bacteria [Text] / J. Simunek, V. Brandysova, I. Koppova, J.Jr. Simunek // Folia Microbiol. -2012. - V.57. -№4. -P.341-345.

101. Singla A.K. Chitosan: some pharmaceutical and biological aspects - an update [Text] / A.K. Singla, M. Chawla // J. Pharm. Pharmacol. -2001. -№53. -p.1047-1067.

102. Tajdini F. Production, physiochemical and antimicrobial properties of fungal chitosan from Rhizomucor miehei and Mucor racemosus [Text] / F. Tajdini, M.A. Amini, N. Nafissi-Varcheh, M.A. Faramarzi // Int. J. Biol. Macromol. -2010. - V.47. -№2. -P. 180-183.

103. Tang H. Antibacterial action of a novel functionalized chitosan-arginine against Gram-negative bacteria [Text] / H. Tang, P. Zhang, T.L. Kieft, S.J. Ryan, S.M. Baker, W.P. Wiesmann, S. Rogelj // Acta Biomater. -2010. -V.6. -№7. -P.2562-2571.

104. Tao Y. Effect of chitosan on membrane permeability and cell morphology of Pseudomonas aeruginosa and Staphyloccocus aureus [Text] / Y. Tao, L.-H. Qian, J. Xie // Carbohydrate Polymers. -2011. - V.86. -№2. -P.969-974.

105. Tapia P.C. Efecto antifüngico de quitosän de alto peso molecular en cepas de Candida sp. aisladas de muestras clinicas [Text] / P.C. Tapia, M.D. Soto, G.L. Vergara, O.C. Alburquerque, R.A. Maccioni, C.A. Matamala, D.D. Hermosilla, V.S. Bucarey//Rev. Chil. Infect. -2009. -V.26. -№6. -P.515-519

106. Tavaria F.K. Chitosan: antimicrobial action upon staphylococci after impregnation onto cotton fabric [Text] / F.K. Tavaria, J.C. Soares, I.L. Reis, M.H. Paulo, F.X. Malcata, M.E. Pintado // J. Appl. Microbiol. -2012. - V.l 12. -№5. -P. 1034-1341.

107. Tikhonov V.E. Bactericidal and antifungal activities of a low molecular weight chitosan and its N-/2(3)-(dodec-2-enyl)succinoyl/-derivatives [Text] / V.E. Tikhonov, E.A. Stepnova, V.G. Babak, I.A. Yamskov, J. Palma-Guerrero, H.-B. Jansson, L.V. Lopez-Llorca, J. Salinas, D.V. Gerasimenko, I.D. Avdienko, V.P. Varlamov // Carbohydrate Polymers. -2006. - V.64. -P.66-72.

108. Tharanathan R.N. Chitin - the undisputed biomolecule of great potential [Text] / R.N. Tharanathan, F.S. Kittur // Crit. Rev. Nutr. -2003. - V.43. -P.61-87.

109. Thevissen K. Permeabilization of fungal membranes by plant defensins inhibits fungal growth [Text] / K. Thevissen, F.R.G. Terras, W.F. Broekaert // Apl. Environ. Microbiol. -1999. - V.65. -P.5451-5458.

110. Thevissen K. Interactions of antifungal plant defensins with fungal membrane components [Text] / K. Thevissen, K.K.A. Ferket, I.E.J.A. Francois, B.P. Cammue // Peptides. -2003. - V.24. -P. 1705-1712.

111. Thevissen K. DmAMPl, an antifungal plant defensin from dahlia (Dahlia merckii), interacts with sphingolipids from Saccharomyces cerevisiae [Text] / K. Thevissen, Thevissen K., I.E.J.A. Francois, J.Y. Takemoto, K.K.A. Ferket, E.M.K. Meert, B.P.A. Cammue // FEMS Microbiol. Lett. -2003. -V.226. -P. 169-173.

112. Thevissen K. Defensins from insects and plants interact with fungal glucosylceramides [Text] / K. Thevissen, D.C. Warnecke, I.E. Francois, M. Leipelt, E. Heinz, C. Ott, U. Zahringer, B.P. Thomma, K.K.A. Ferket, B.P.A. Cammue // J. Biol. Chem. -2004. - V.279. -P.3900-3905.

113. Tin S. Activity of Chitosans in combination with antibiotics in Pseudomonas aeruginosa [Text] / S. Tin, K.R. Sakharkar, Lim C.S., M.K. Sakharkar // Int. J. Biol. Sei. -2009. - V.5. -№ 2 -P. 153-160.

114. Tin S. Synergistic Combinations of Chitosans and Antibiotics in Staphylococcus aureus [Text] / S. Tin, C.S. Lim, M.K. Sakharkar, K.R. Sakharkar // Letters in Drug Design & Discovery. -2010. - V.7. -P.31-35.

115. Tomitori H. Multiple polyamine transport systems on the vacuolar membrane in yeast [Text] / H. Tomitori, K. Kashiwagi, T. Asakawa, Y. Kakinuma, A.J. Michael, K. Igarashi // Biochem. J. -2001. - V.353. -P.681-688.

116. Tsai G.-J. Antimicrobial activity of shrimp chitin and chitosan from different treatments and applications of fish preservation [Text] / G.-J. Tsai, W.-H. Su, H.-C. Cen, C.-L. Pan // Fisheries Science. -2002. - V.68. -P.170-177.

117. Vaara M. Polycations as outer membrane-disorganizing agents [Text] / M. Vaara, T. Vaara // Antimicrob. Agents Chemother. -1983. - V.24. -P. 114-122.

118. Weidenmaier C. Role of teichoic acids in Staphylococcus aureus nasal colonization, a major risk factor in nosocominal infections [Text] / C. Weidenmaier, J.F. Kokai-Kun, S.A. Kristian, T. Chanturiya, H. Kaibacher, M. Gross, G. Nicholson, B. Neumeister, J.J. Mond, A. Peschel // Nat. Med. -2004. - V.10. -P.243-245.

119. Xu Y. Synthesis of galabiose-chitosan conjugate as potent inhibitor of Streptococcus suis adhesion [Text] / Y. Xu, H. Fan, C. Lu, G.F. Gao, X. Li // Biomacromolecules. -2010. - V.ll. -№7. -P.1701-1704.

120. Yang T.C. Cell age, suspending medium and metal ion influence the susceptibility of Escherichia coli 0157:H7 to water-soluble maltose chitosan derivative [Text] / T.C. Yang, C.F.Li, C.C. Chou // Int. J. Food Microbiol., -2007. - V.113.-№3. -P.258-262.

121. Yang F. Interaction of low-molecular-weight chitosan with mimic membrane studied by electrochemical methods and surface plasmon resonance [Text] / F. Yang, X. Cui, X. Yang // Biophys. Chem. -2002. - V.99. -P.99-106.

122. Zaki N.M. Enhanced antibacterial effect of ceftriaxone sodium-loaded chitosan nanoparticles against intracellular Salmonella typhimurium [Text] / N.M. Zaki, M.M. Hafez//AAPS Pharm. Sei. Tech. -2012. - V.13. -№2. -P.411-421.

123. Zakrzewska A. Transcriptional response of Saccharomyces cerevisiae to the plasma membrane-perturbing compound chitosan [Text] / A. Zakrzewska, A. Boorsma, S. Brul, K.J. Hellingwert, F.M. Klis // Eukaryotic Cell. -2005. -V.4. -№ 4. -P.703-715.

124. Zakrzewska A. Cellular processes and pathways that protect Saccharomyces cerevisiae cells against the plasma membrane-perturbing compound chitosan / A. Zakrzewska, A. Boorsma, D. Delneri, S. Brul, S.G. Oliver, F.M. Klis //

Eukaryotic Cell. -2007. - V.6.-№ 4. -P.600-608.

125. Zheng L.-Y. Study on antimicrobial activity of chitosan with different molecular weights [Text] / L.-Y. Zheng, J.-F. Zhu // Carbohydrate Polymers. -2003. - V.54. -P.527-530.

126. Zivanovic S. Molecular weight of chitosan influences antimicrobial activity in oil-in-water emulsions [Text] / S. Zivanovic, C.C. Basurto, S. Chi, P.M. Davidson, J. Weiss // J. Food Prot. -2004. -V.67.-№5. -P.952-959.