Получение алкилированных и ацилированных производных хитозана и исследование их биологических свойств тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Шагдарова, Бальжима Цырендоржиевна

• Шагдарова, Бальжима Цырендоржиевна
• кандидат наук
• 2016

Оглавление диссертации кандидат наук Шагдарова, Бальжима Цырендоржиевна

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Хитозан - уникальный полимер для биомедицины

1.2. Источники получения и основные физико-химические характеристики хитозана

1.2.1 Биодеградируемость

1.2.2.Биосовместимость

1.2.3 Токсичность

1.3. Влияние основных физико-химических характеристик хитозана (ММ, СД) на растворимость при рН 5,5-7,4

1.3.1. Влияние СД на растворимость хитозана

1.3.2 Влияние ММ хитозана на растворимость и способы её снижения

1.4 Водорастворимые производные хитозана, получение и применение в биомедицине

1.4.1 .Карбоксиметилирование

1.4.2. Сукцинилирование

1.4.3. Сульфатирование

1.4.4. Гликозилирование

1.4.5. Тиолирование

1.4.6. Кватернизирование

ГЛАВА II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 Реагенты и растворители

2.2 Лабораторное оборудование

2.3 Кислотный гидролиз хитозана

2.4 Синтез производных низкомолекулярного хитозана

2.4.1 Синтез ацилированных производных хитозана

2.4.2 Синтез алкилированных производных хитозана с различными степенями замещения

2

2.4.3 Синтез производных хитозана с двумя группами (алкилированные и ацилированные)

2.5 Физико-химическая характеристика хитозана и его производных

2.5.1 Определение степени дезацетилирования и степени замещения НМХ и его производных методом протонного магнитного резонанса (1Н-ЯМР)

2.5.2 Определение молекулярной массы хитозана с помощью высокоэффективной гель-проникающей хроматографии

2.5.3 Определение степени замещения производных хитозана

2.5.4 ИК-спектроскопия

2.5.5 Определение растворимости хитозана и его алкилированных производных

2.5.6 Установление зависимости растворимости производных хитозана от рН

2.5.7 Измерение размера и дзета-потенциала хитозана, его производных и частиц

2.5.8 Ферментативная деградация производного КвХ98

2.6 Формирование частиц и конъюгатов производных хитозана с пептидами

2.6.1Формирование частиц алкилированных производных

2.6.2 Формирование частиц К-сукцинил хитозана

2.6.2.1 Сорбция варнерина на частицы сукцинил хитозана

2.6.3 Синтез конъюгатов алкилированных производных с варнерином и мелиттином

2.6.3.1 Очистка препарата трансглутаминазы

2.6.3.2 Определение структуры конъюгатов

2.6.3.3 Определение количества пептида в конъюгате

2.6.4 Атомно-силовая микроскопия

2.7 Изучение биологических активностей хитозана, производных хитозана, коньюгатов

2.7.1 Изучение антибактериальной активности хитозана и его производных, конъюгатов и частиц производных хитозана

2.7.2 Изучение совместного действия алкилированных производных хитозана с лизостафином и варнерином на клетки стафилококков

2.7.3 Изучение антиоксидантной активности алкилированных производных

2.7.4 Изучение хелатирующей способности алкилированных производных

2.8 Изучение внутриклеточного транспорта алкилированных производных

2.8.1 Получение ФИТЦ-меченных производных хитозана

2.8.2 Цитотоксичность производных хитозана

2.8.3 Определение эффективности связывания и проникновения препаратов в клетку методом проточной цитометрии

2.8.4 Конфокальная микроскопия

2.9 Исследование взаимодействия алкилированных производных хитозана с компонентами крови и оценка их способности к нейтрализации антикоагулянтной активности гепаринов в системах in vitro, in vivo

2.9.1 Подготовка крови и плазмы

2.9.2 Влияние алкилированных производных хитозана и СПТ на гемолиз эритроцитов

2.9.3 Влияние алкилированных производных хитозана и СПТ на агрегацию тромбоцитов

2.9.4 Нейтрализация антитромбиновой активности НФГ алкилированными производными хитозана и СПТ

2.9.5 Нейтрализация активности НМГ клексана по отношению к фактору Ха алкилированными производными хитозана и СПТ

2.9.6 Влияние внутривенного введения производных хитозана на антикоагулянтную активность плазмы гепаринизированных морских свинок

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Получение низкомолекулярного хитозана

3.2 Синтез алкилированных и ацилированных производных НМХ

3.3 Физико-химическая характеристика хитозана и его производных

3.3.1 Спектральные характеристики хитозана и его производных

3.3.2 Растворимость и заряд алкилированных производных хитозана

3.3.3. Ферментативная деградация КвХ98

3.4 Формирование частиц и конъюгатов с производными хитозана

3.4.1 Получение частиц на основе алкилированных производных хитозана методом ионотропного гелеобразования

3.4.2 Получение частиц на основе сукцинил хитозана

3.4.3 Предварительная очистка варнерина и его сорбция на частицы сукцинил хитозана

3.4.4 Физико-химические характеристики загруженных частиц

3.4.5 Формирование конъюгатов алкилированных производных с варнерином и мелиттином

3.5 Исследование биологических свойств хитозана, производных хитозана и коньюгатов на их основе

3.5.1 Антибактериальное действие хитозана и его производных

3.5.2 Антиоксидантная активность алкилированных производных

3.5.3 Хелатирующая способность алкилированных производных

3.5.4 Антибактериальное действие частиц и коньюгатов

3.5.4.1 Изучение антибактериального действия конъюгатов пептидов и кватернизированного производного хитозана с помощью атомно-силовой микроскопии

3.5.5 Совместное действие алкилированных производных хитозана с лизостафином и варнерином на клетки стафилококков

3.6 Изучение взаимодействия алкилированных производных с клетками млекопитающих

3.6.1 Токсичность алкилированных производных

3.6.2 Исследование взаимодействия алкилированных производных с клеткой методом проточной цитометрии

3.6.3 Визуализация взаимодействия алкилированных производных с клеткой методом конфокальной микроскопии

3.7 Исследование взаимодействия алкилированных производных хитозана с компонентами крови и оценка их способности к нейтрализации антикоагулянтной активности препаратов гепарина в системах in vitro, in vivo

3.7.1 Гемолиз эритроцитов

3.7.2 Агрегация тромбоцитов

3.7.3 Оценка прокоагулянтного действия алкилированных производных и СПТ при нейтрализации активности НФГ и НМГ

3.7.4 Оценка нейтрализации алкилированными производными антикоагулянтной активности плазмы морских свинок в результате введения НФГ или НМГ

ВЫВОДЫ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение 1

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение алкилированных и ацилированных производных хитозана и исследование их биологических свойств»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Полимеры активно используются в области биотехнологии и медицины. Они находят свое применение в качестве инструментов для решения биомедицинских проблем, таких как системы доставки лекарств, конструирование биосенсоров, применение в тканевой инженерии, регенеративной медицине [1-3]. Синтетические полимеры обладают тем преимуществом, что их состав и структуру легко контролировать, однако перспективными для использования в биомедицинской области являются, природные полимеры, благодаря их биосовместимости и способности к биодеградации.

Важное место среди природных полимеров занимает хитозан, получаемый реакцией дезацетилирования хитина. Хитозан имеет большой потенциал за счет своих полиэлектролитных свойств, а также высокой адсорбционной способности, биодеградации, биосовместимости, низкой токсичности [4]. Наличие гидроксильных и аминогрупп позволяет модифицировать молекулу хитозана путем введения различных функциональных заместителей, с получением отличающихся по свойствам производных, что значительно расширяет области применения данного биополимера, благодаря возможности направленного изменения его свойств. Производные хитозана, растворимые в воде при значениях рН близких к нейтральному, обращают на себя повышенное внимание ввиду возможности их применения в разных областях химии и биологии [5-7]. Универсальность и широкие возможности применения водорастворимых производных хитозана делают их интересными и актуальными объектами исследования.

Целью работы является получение алкилированных и ацилированных производных низкомолекулярного хитозана, изучение их свойств и возможности применения синтезированных производных в биомедицинской области.

Задачи исследования:

1. Синтез алкилированных и ацилированных производных низкомолекулярного хитозана, определение их физико-химических характеристик;

2. Формирование частиц и конъюгатов с пептидами на основе синтезированных производных хитозана и их характеристика;

3. Изучение антибактериальных свойств производных, частиц и конъюгатов на их основе;

4. Изучение взаимодействия алкилированных производных хитозана с эукариотическими клетками in vitro;

5. Исследование взаимодействия алкилированных производных хитозана с компонентами крови и оценка их способности к нейтрализации активности гепаринов в системах in vitro, in vivo.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Хитозан - уникальный полимер для биомедицины

В последних достижениях науки нередко участвуют полимеры, поэтому многие исследователи называют этот век - веком полимеров. Молекулы объединенные в длинные цепочки, называются полимерами или макромолекулами. Полимеры по происхождению подразделяют на два типа: природные и синтетические [8].

Природные полимеры широко изучаются и находят свое применение в повседневной жизни, а также используются в промышленности, благодаря своим уникальным свойствам. Среди природных полимеров, полисахариды являются наиболее широко изучаемыми и используются в системах доставки лекарств, тканевой инженерии, в составе перевязочных средств благодаря таким свойствам, как биосовместимость, биоразлагаемость и низкая токсичность [9]. Хитозан является полусинтетическим природным полисахаридом, который получают деацетилированием хитина в щелочной среде.

Более 200 лет назад в 1811 году французский профессор H. Braconnot впервые выделил нерастворимый полисахарид при исследовании состава грибов и назвал его фунгином. В 1923 году A. Odier выделил из надкрылий майского жука соединение, которое он назвал хитином. Но только в 1931 году Rammelberg идентифицировал фунгин и хитин и дал им общее название хитин. Биологи и химики, в основном во Франции и Германии начали исследования этого биополимера. Активное изучение хитина можно отнести к первой половине ХХ века. Вскоре стало очевидно, что его производное хитозан может иметь практическое значение и его начали детально исследовать в разных странах, в том числе и в России [10]. Новый этап в изучении хитина/хитозана и их производных отмечается и в последние пять лет. В этих исследованиях большая доля приходится на работы, связанные с применением данного полимера в области медицины, фармацевтики [11-15].

9

Было показано, что в организме человека происходит деградация хитина/хитозана [16,17]. Установлено, что биополимер и продукты его биодеструкции обладают антибактериальной [18,19], антиоксидантной [20], иммунологической активностями [21,22]. Исследования последних лет доказывают, что хитозан и его производные являются функциональным материалом, который может быть использованы в качестве носителя для доставки биологически активных веществ в органы и ткани организма [23,24].

1.2. Источники получения и основные физико-химические характеристики хитозана.

Хитозан является продуктом переработки хитина - это второй по распространённости биополимер после целлюлозы. Часто его рассматривают как производное целлюлозы, так как он структурно идентичен ей, но имеет ацетамидные группы (-NHCOCHз) в звеньях полимерной цепи в положениях при С-2 атоме.

Рисунок 1 - Структура хитина (т>п) и хитозана (п>т) Хитин - линейный полисахарид, состоящий из элементарных звеньев 2-ацетамидо-2-дезокси-0-глюкозы, соединенных 1,4-Р-гликозидными связями (Рисунок 1). Он служит основным структурным компонентом наружного скелета беспозвоночных, включая ракообразных (крабов, креветок, криля, раков, лангустов, омаров, лобстеров), кальмаров, моллюсков; насекомых (мух, пчел, тараканов), а также является одной из составляющих клеточных стенок высших и низших грибов.

Промышленным источником получения хитина, главным образом, служат различные ракообразные [25]. Альтернативным источником в

ОН

ОН

т

п

основном для исследовательских целей также служит биомасса различных грибов [26,27].

Из вышеперечисленного сырья хитин можно получать несколькими способами: химическим, биотехнологическим, физико-химическим и др. Основным способом является химический, который заключается в проведении стадий депротеинирования, деминерализации и депигментации с помощью химических реагентов - кислот, щелочей, перекисей. Широко используются биотехнологические методы, предусматривающие использование различных ферментных препаратов. Разрабатываются новые физико-химические методы, например электрохимический, сущность которого заключается в проведении стадий депротеинирования, деминерализации и обесцвечивания панцирьсодержащего сырья в виде водно-солевой суспензии в электролизерах под действием электромагнитного поля [28].

Широко изучаемым производным хитина является хитозан, благодаря лучшей расвторимости и различным биологическим активностям. Хитозан получают из хитина при помощи реакции отщепления от КЫ-ацетил^-глюкозамина ацетильной группы. Чаще используется процесс химического дезацетилирования раствором №ОН в диапазоне концентраций (от 35 до 50 %), температур (от 20 до 140 °С) и времени обработки (от 0,5 ч до 10 сут).

Основными характеристиками, влияющими на физико-химические

свойства хитозана являются степень дезацетилирования (СД) и молекулярная

масса (ММ). Степень дезацетилирования - параметр, определяющий

отношение 2-амино-2-дезокси-0-глюкопиранозы к общему числу звеньев в

полимерной цепи. СД имеет большое влияние на растворимость хитина и

свойства его растворов. Хитозан - это дезацетилированный хитин, который

растворим в разбавленных уксусной, муравьиной кислотах. В структуре

хитина обычно преобладают ацетилированные звенья (СД обычно 0,10), у

хитозана типичная СД более 0,65 [29]. Для определения СД используется

множество подходов, которые включают аналитические методы:

кондуктометрическое титрование, нингидриновая реакция, элементный анализ; спектральные методы: 1Н-ЯМР спектроскопия, ИК-спектроскопия, УФ-спектрофотометрия; деструктивные методы: гель-проникающая хроматография [30]. Молекулярная масса является основной характеристикой любого химического соединения, а в случае высокомолекулярных соединений играет особую роль, так как она также служит мерой длины полимерной цепи. ММ хитозана определяется при помощи таких методов как, высокоэффективная жидкостная хроматография, динамическое и статическое светорассеяние, вискозиметрия и пр. [31,32].

1.2.1 Биодеградируемость

Важным аспектом использования хитозана в биомедицине является его способность к биодеструкции в организме. При биодеградации происходит расщепление полимерной цепи до олигосахаридов различной длины, которые могут быть впоследствии включены в гликозаминогликановый и гликопротеиновый метаболические пути. Хитозан расщепляется под действием специфических карбогидраз [33-35] и неспецифического действия протеиназ [36], которые гидролизуют глюкозамин-глюкозамин, глюкозамин-N-ацетил-глюкозамин и ^ацетил-глюкозамина-Ы-ацетил-глюкозамин связи. Считается, что хитозан и его производные деградируют в организме позвоночных преимущественно при действии лизоцима и бактериальных ферментов в толстой кишке [33]. Лизоцим - гидролаза, присутствующая во всех тканях млекопитающих, она играет важную роль в деградации хитина и хитозана. Кинетика деградации, по-видимому, обратно пропорциональна степени кристалличности, которая в основном контролируется степенью дезацетилирования. Кроме того, распределение ацетильных групп также влияет на способность к биоразложению, отсутствие ацетильных групп или их равномерное распределение (случайное, а не блочное) приводит к низким показателям ферментативной деградации [4]. Молекулярная масса хитозана также влияет на скорость деградации. Zhang H. и др в своей работе

сохранили СД неизменной, в результате было показано, что хитозан с более высокой ММ деградировал медленнее, чем хитозан, с меньшей ММ [34].

Биоразложение хитозана было исследовано в экспериментах in vivo с помощью разных подходов. Так как хитозан широко используется в качестве пищевой добавки, была изучена его биодеструкция после перорального введения. Исследования показали, что хитозан с относительно низкой СД (~50%) хорошо деградировал и легко выводился с мочой, таким образом, указывая на отсутствие накопления полимера в организме [37]. Биодеструкция хитозана при пероральном введении также зависит и от молекулярной массы, так при уменьшении ММ, всасывание хитозана в кишечнике возрастало [38].

В исследованиях Yang Y.M. и др. [39] было показано, что хитозан в виде волокнистого каркаса с различной СД, был имплантирован между двумя нервными стволами седалищного нерва крысы. Авторы продемонстрировали, что хитозан с СД 92,3 % был устойчив к биодеградации, в то время как хитин и хитозан с более низкой СД легко разлагались. Структурные параметры хитозана, такие как ММ, СД и кристалличность могут быть использованы по отдельности или в комбинации для подбора скорости деструкции, требуемой для конкретных применений.

1.2.2.Биосовместимость

Под биосовместимостью подразумевается способность биоматериала не только выполнять функции необходимые для медицинской терапии, не вызывая при этом у испытуемого каких-либо нежелательных местных или системных эффектов, но и создание наиболее подходящего клеточного или тканевого ответа в конкретной ситуации, и оптимизацию клинически значимых показателей этой терапии [40].

Ряд исследователей изучали реакцию тканей на различные имплантаты на основе хитозана [41,42]. Было определено, что эти материалы вызывали минимальную реакцию организма. В большинстве случаев, не наблюдалось

серьезной фиброзной инкапсуляции. Формирование нормальной грануляционной ткани, часто с ускорением ангиогенеза, представляло собой типичную картину заживления. В течение 7 дней наблюдали значительное скопление нейтрофилов в непосредственной близости от имплантатов, количество которых постепенно снижалось, не приводя к воспалительной реакции. Стимулирующие эффекты хитозана и его фрагментов на иммунные клетки, упомянутые выше, могут играть определенную роль в индуцировании местной клеточной пролиферации и, в конечном счете, способствуют интеграции имплантируемого материала с тканями организма [43].

Например, в работе J.D. Bumgardner белым кроликам в берцовую кость были имплантированы титановые штифты покрытые хитозаном. Гистологическая оценка тканей после контакта с указанными материалами показала минимальный воспалительный ответ и нормальную последовательность заживления, формирование костной ткани, с последующим развитием пластинчатой кости [44].

СД хитозана оказывает некоторое влияние на биологическую эффективность биополимера, как in vivo, так и in vitro. Результаты исследований свидетельствуют о том, что хитозан с высокой СД лучше поддерживает клеточный рост [45], вызывает меньшую воспалительную реакцию [46] и, следовательно является, наиболее совместимым.

1.2.3 Токсичность

Хитозан известен как нетоксичный полимер и одобрен FDA (Управление по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных препаратов, США) для наружного применения как компонент раневых покрытий [47], перевязочных материалов (Hemcon®), материалах восстанавливающих хрящи суставов (BST-CarGel®) [48] и др. Безопасным является пероральное применение хитозана: он широко используется при

производстве биологически активных добавок к пище («Tiens Group Co. Ltd», «Эвалар», «Биопрогресс»).

Тем не менее, парентеральное использование хитозана и его производных является дискуссионным вопросом. В настоящее время активно ведутся работы, касающиеся гемосовместимости этого полимера и его различных модификаций [49]. Известно, что введение отрицательно заряженных групп в молекулу хитозана, а также формирование субмикронных носителей на его основе может существенно улучшить гемосовместимость [50].

В работе [51] хитозаны с различными характеристиками (Mw и СД; <5 кДа, 65,4 % СД; 5-10 кДа, 55,3 % СД; и >10 кДа, 55,3 % СД) оказывали незначительную цитотоксичность относительно клеточных линий CCRF-CEM (лимфобластный лейкоз человека) и L132 (эмбриональные клетки легких человека), минимальная полуингибирующая концентрация (МПК) составила >1 мг/мл. В своих работах Schipper и др. описывали действие хитозана с различными ММ и СД на клетки Caco-2, HT29-H и in situ у крыс с раком тонкой кишки. Авторы выяснили, что при высокой СД токсичность связана с ММ и концентрацией, при снижении СД токсичность была менее выражена и не зависила от ММ [52,53].

Хитозаны с разными характеристиками в целом не токсичны, возможно, в силу их нерастворимости в условиях эксперимента при нейтральном значении pH. Химическая модификация полимера, направленная на увеличение растворимости или придания молекуле гидрофобных свойств может влиять на токсичность.

Из результатов представленных в работах [54] и [55] следует, что МПК у хитозана варьирует от 0,21 мг/мл до 2,5 мг/мл. Однако модифицированный хитозан может иметь большие значения МПК (от 0,8 мг/мл для триметил хитозана ММ 100 кДа, 36 % степень замещения до 200 мг/мл для N-октил-О-сульфат хитозана ММ 65 кДа).

Авторы Кеап Т. и др. показали, что К,К,К-триметил хитозан с ММ 3-6 кДа, степенью кватернизации менее 55 % имел МПК >10 мг/мл, однако при увеличении степени триметилирования, увеличивалась и цитотоксичность [56].

Сукцинильные производные хитозана, а также наночастицы на их основе практически не влияли на пролиферацию клеток фибробластов и лимфобластов человека К562 [57]. Частицы, полученные из хитозана с ММ 100-150 кДа, СД 20%, О-карбоксиметил хитозана, ^О-карбоксиметил хитозана, также оказались не токсичны в тесте МТТ с использованием клеток линии МСБ-7 (аденокарцинома молочной железы человека) [58].

1.3. Влияние основных физико-химических характеристик хитозана (ММ, СД) на растворимость при рН 5,5-7,4

На сегодняшний день, влияние ММ и СД на физико-химические и биологические свойства хитозана интенсивно исследуется. Так как знание структуры хитозана имеет большое значение для понимания взаимосвязи структура-свойство с активностью хитозана. Результаты обобщены в обзоре Киш1гека I и др. [59] и представлены в Таблице 1.

Таблица 1 - Влияние СД и ММ на физико-химические и биологические свойства образцов хитина/хитозана [59].

Физико- химические свойства Растворимость СДТ

Кристалличность СД|

Вязкость СДТ

Биодеградируемость СД|, мм|

Биосовместимость СДТ

Биологические свойства Антимикробная активность СДТ, ММТ или|

Антиоксидантная активность сдт, мм|

Гемостатическая активность СДТ

Мукоадгезивность сдт, мм т

Эффективность проникновения в клетку сдт, мм т

Противоопухолевая активность ММ|

1.3.1. Влияние СД на растворимость хитозана.

Основным ограничением в использовании хитозана в биомедицинской области является чрезвычайно малая растворимость при значениях рН 5,5 -7,5 независимо от ММ биополимера. Варьируя такую характеристику как СД, можно влиять на растворимость хитозана [60]. Ьи Б. и др. изучали влияние реацетилирования хитозана (уменьшение СД в полимерной цепи), имеющего исходные характеристики — ММ 1,8 х 105 - 6,3 х 105 кДа и СД 83 - 90 %, на его растворимость [61]. Полученные образцы с ММ 2,8 х 105 кДа и СД 62,5 - 46,7 были растворимы в воде (10 мг/мл, рН 5-7, 25 °С). Время растворения для образцов хитозана со СД 62,5 % составляло более 10 ч, со СД 52-50 % менее 4 ч и со СД 47 % более 10 ч. Авторы показали, что реацетилирование хитозана сопровождалось нарушением вторичной структуры за счёт разрушения меж- и внутримолекулярных водородных связей, что приводило к снижению кристалличности хитозана. Результатом явилось увеличение растворимости образцов. Наибольший эффект достигался для хитозана со СД 52 - 50 %. При этом авторы отмечали, что ММ не влияла на растворимость образцов. Тем не менее, при увеличении значений рН среды выше 7,0 молекулярная масса вносила определяющий вклад в растворимость.

1.3.2 Влияние ММ хитозана на растворимость и способы её снижения

Общепринятым считается мнение, что с уменьшением ММ растворимость хитозана должна увеличиваться, при прочих равных условиях.

Одним из способов увеличения растворимости хитозана служит деполимеризация, то есть снижение ММ благодаря расщеплению О-гликозидной связи между соседними звеньями в полимерной цепи. Деполимеризацию хитозана можно осуществлять ферментативным, физическим или химическим методами, в зависимости от поставленной задачи. Каждый из методов имеет свои преимущества и недостатки.

Ферментативный метод гидролиза хитина/хитозана [62] наиболее доступен. Оптимизируя условия проведения гидролиза можно получить олигосахариды со степенью полимеризации (СП) 2-10, которые будут растворимы в воде при рН 5,5 - 7,4. Зачастую использование высокоочищенных ферментов является экономически нецелесообразным из-за их высокой стоимости. Несмотря на это, ферментативный гидролиз часто применяют благодаря возможности использования неспецифических гидролаз (липазы, протеиназы, карбогидразы, целлюлазы, амилазы, пектиназы) [63-65]. Например, при использовании ферментного комплекса, продуцируемого Myceliophthora sp., получен низкомолекулярный хитозан с ММ 8-24 кДа, имеющий одинаковую СД (85 %) и индекс полидисперсности, растворимый в диапазоне рН 5-7, с выходом 50-80 % [66].

Физический метод деполимеризации полисахаридов и хитозана в настоящее время применяется также широко. Для этого можно использовать действие электронно-пучковой плазмы. Исследователи в работе [67] изучили процесс деполимеризации под действием электронно-пучковой плазмы. Энергия электронов в реакционной камере на входе была постоянной и равной 30 кВ. Полисахариды обрабатывали в течение 1-60 мин. В результате получили водорастворимые олигосахариды (ММ = 1-2 кДа).

Чаще для деструкции хитозана используется у-излучение [68,69].

Известно об использовании у-излучения или его сочетания с излучением от

пучка электронов. В работе Kim H. др. у-облучение проводили в дозе из

расчета 10 кГр ч-1 от источника изотоп кобальта-60 (60Со) в атмосфере

воздуха. Электронное облучение также осуществлялось при мощности дозы

10 кГр со скоростью носителя 10 м/мин-1, дозы облучения варьировали от 0

до 200 кГр. Авторы выяснили, что при проведении процедуры в воде хитозан

деградировал лучше за счет присутствия гидроксильных радикалов при

облучении. При деградации воздействием излучения от пучка электронов

хитозан имел меньший молекулярный вес, чем при использовании у-

излучения [70]. Также использовали у-излучение в сочетании с перекисью

18

водорода. Суспензию хитозана для деградации у-излучением готовили в 2 % растворе уксусной кислоты с добавлением перекиси водорода при ультразвуковом диспергировании. Суспензию дегазировали путем барботирования азотом в течение 1 ч для удаления кислорода, с последующим облучением в атмосфере азота у-лучами, использовали источник 60Со при мощности дозы 10 кГр/ч, дозы варьировали от 10 до 100 кГр. При этом авторы наблюдали синергетический эффект за счет образования гидроксильных радикалов при радиолизе перекиси водорода [71,72].

Химический метод деполимеризации хитозана является самым экономичным для широкомасштабного применения с целью получения олигомеров (СП 2-10) и глюкозамина [73-76]. Для получения низкомолекулярного хитозана используют метод, в основе которого лежат окислительно-восстановительные процессы. Одним из примеров может служить деполимеризация хитозана в присутствии перекиси водорода. Данная реакция характеризуется высокой скоростью протекания и, как правило, приводит к высокому содержанию мономеров (40-50 %). Получаемый конечный продукт обычно темнеет, что свидетельствует о деструкции и модификации сахарных остатков [77].

При деполимеризации хитозана под действием различных кислот происходит расщепление как гликозидных, так и амидных связей, то есть происходят процессы дезацетилирования, деполимеризации. Растворимость получаемых продуктов гидролиза при рН 5,5 - 7,4 значительно выше по сравнению с низкомолекулярным хитозаном [78].

Известен способ с использованием азотистой кислоты. Первоначально

протекает реакция нитрозирования непротонированной аминогруппы

глюкозамина по цепи хитозана с последующим деаминированием и

образованием 2,5-ангидро-0-маннозы с редуцирующим концом.

Ангидроманнозный остаток является нестабильным. Альдегидная группа

маннозного остатка может реагировать с аминогруппами олигомеров

хитозана с образованием основания Шиффа, что способствует расщеплению гликозидной связи, следующей за ангидроманнозным остатком, с отщеплением воды и образованием 5-гидроксиметилфурфурола, то есть имеет место частичное изменение в первичной структуре хитозана, что может приводить к изменению биологической активности [79].

Для получения низкомолекулярного хитозана используют соляную кислоту, например 0,1 М НС1 при 83 °С (продолжительность реакции от 10 до 30 ч, концентрация хитозана 10 мг/мл), СП полученных продуктов гидролиза составляла от 41,5 до 12,9. При использовании 12 М НС1 при 30 °С (продолжительность реакции 60 - 240 мин), СП составляла от 20,8 до 7,81 [80]. Существенным недостатком этого метода является использование специального оборудования и отсутствие экологической безопасности, ввиду применения агрессивных реагентов (концентрированные кислоты).

Ряд авторов нашли способ гидролиза хитозана «твёрдой» кислотой, с помощью которого можно, по их мнению, преодолеть недостатки деполимеризации в растворе [81]. Первоначально исследователи обработали активированный уголь концентрированной серной кислотой согласно методике [82], и полученную «твёрдую» кислоту использовали для гидролиза с целью получения низкомолекулярного хитозана. Причём «твёрдая» кислота могла быть использована для гидролиза без регенерации более четырёх раз без потери качества получаемых продуктов, которые хорошо растворимы при рН 6,0.

1.4 Водорастворимые производные хитозана, получение и применение в биомедицине

Не смотря на ряд преимуществ, главным ограничением использования хитозана в биомедицинской области является его низкая растворимость в физиологических условиях при значениях рН близких к нейтральному. Увеличение растворимости при рН больше 6, может улучшить адгезию полимера на слизистых, а также способствовать лучшей биодоступности при пероральном введении.

Хитозан хорошо растворим в разбавленных неорганических (соляная), органических (уксусная, щавелевая, молочная) кислотах и не растворим в нейтральной и щелочной средах. При растворении хитозана происходит протонирование функциональной аминогруппы при С-2 атоме глюкозаминного звена. Распределение ацетильных групп по длине цепи хитозана и их количество влияют на его растворимость.

Следует подчеркнуть, что рН тонкой кишки составляет 4,5, рН подвздошной кишки составляет 7,4, то есть значения рН постепенно изменяются от тонкой кишки к подвздошной кишке, значит, хитозан не растворяется в нижней части кишечника. Для того чтобы улучшить доступность препаратов необходимо модифицировать хитозан так, чтобы он растворялся при значениях рН близких к нейтральному [83,84].

Синтез водорастворимых производных хитозана возможен благодаря присутствию в молекуле хитозана реакционноспособных аминогрупп при С-2 атоме, а также первичных и вторичных гидроксильных групп при С-3 и С-6 атомах в звеньях полимерной цепи [85].

1.4.1.Карбоксиметилирование

Производные хитозана получаемые карбоксиметилированием известны давно, и они подразделяются на три типа: К-карбоксиметил хитозан (К-КМХ), О-карбоксиметил хитозан (О-КМХ) и К,О-карбоксиметил хитозан (К,О-КМХ). Схемы реакций представлены на рисунке 2.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Шагдарова, Бальжима Цырендоржиевна, 2016 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Furth M.E., Atala A., Van Dyke M.E. Smart biomaterials design for tissue engineering and regenerative medicine // Biomaterials. 2007. Vol. 28, № 34. P. 5068-5073.

2. Langer R., Tirrell D. Designing materials for biology and medicine // Nature. 2004. P. 487-492.

3. Priya James H., John R., Alex A. Smart polymers for the controlled delivery of drugs - a concise overview // Acta Pharm. Sin. B. 2014. Vol. 4, № 2. P. 120-127.

4. Aranaz I. et al. Functional characterization of chitin and chitosan // Curr. Chem. Biol. 2009. Vol. 3. P. 203-230.

5. Lim S., Hudson S. Synthesis and antimicrobial activity of a water-soluble chitosan derivative with a fiber-reactive group // Carbohydr. Res. 2004.

6. Zhang C. et al. Synthesis and characterization of water-soluble O-succinyl-chitosan // Eur. Polym. J. 2003. Vol. 39, № 8. P. 1629-1634.

7. Mourya V.K., Inamdar N.N., Tiwari A. Carboxymethyl chitosan and its applications // Adv. Mater. Lett. 2010. Vol. 1, № 1. P. 11-33.

8. Pillai O., Panchagnula R. Polymers in Drug Delivery // Curr. Opin. Chem. Biol. 2001. Vol. 5. P. 447-451.

9. Ramesh H.P., Tharanathan R.N. Carbohydrates—The Renewable Raw Materials of High Biotechnological Value // Crit. Rev. Biotechnol. 2003. Vol. 23, № 2. P. 149-173.

10. Хитозан / ed. Скрябин К.Г., Михайлов С.Н. В.В.П. Москва: Центр "Биоинженерия" РАН, 2013. 593 p.

11. Anitha A. et al. Chitin and chitosan in selected biomedical applications // Prog. Polym. Sci. Elsevier Ltd, 2014. Vol. 39, № 9. P. 1644-1667.

12. Elieh D., Komi A., Hamblin M. Chitin and Chitosan: Production and Application of Versatile Biomedical Nanomaterials // Int. J. Adv. Res. 2016. Vol. 4, № 3. P. 411-427.

13. Azuma K. et al. Chitin, Chitosan, and Its Derivatives for Wound Healing: Old and New Materials // J. Funct. Biomater. Multidisciplinary Digital Publishing Institute, 2015. Vol. 6, № 1. P. 104-142.

14. Cheung R. et al. Chitosan: An Update on Potential Biomedical and Pharmaceutical Applications // Mar. Drugs. Multidisciplinary Digital Publishing Institute, 2015. Vol. 13, № 8. P. 5156-5186.

15. Ding F. et al. Emerging chitin and chitosan nanofibrous materials for

117

biomedical applications // Nanoscale. The Royal Society of Chemistry, 2014. Vol. 6, № 16. P. 9477.

16. Kean T., Thanou M. Biodegradation, biodistribution and toxicity of chitosan // Adv. Drug Deliv. Rev. Elsevier B.V., 2010. Vol. 62, № 1. P. 3-11.

17. Aam B.B. et al. Production of Chitooligosaccharides and Their Potential Applications in Medicine // Mar. Drugs. Multidisciplinary Digital Publishing Institute (MDPI), 2010. Vol. 8, № 5. P. 1482-1517.

18. Li Z., Yang F., Yang R. Synthesis of chitosan derivative with dual-antibacterial functional groups and its antibacterial activity // J. Appl. Polym. Sci. 2015. Vol. 132, № 43. P. n/a - n/a.

19. Younes I. et al. Influence of acetylation degree and molecular weight of homogeneous chitosans on antibacterial and antifungal activities // Int. J. Food Microbiol. Elsevier B.V., 2014. Vol. 185. P. 57-63.

20. Dai-Hung Ngo S.-K.K. Advances in Food and Nutrition Research // British Medical Journal / ed. Se-Kwon Kim and Fidel Toldra. Elsevier B.V., 2014. Vol. 1, № 3973. 435-438 p.

21. Li K. et al. Advances in preparation, analysis and biological activities of single chitooligosaccharides // Carbohydr. Polym. 2016. Vol. 139. P. 178190.

22. Scherließ R. et al. In vivo evaluation of chitosan as an adjuvant in subcutaneous vaccine formulations // Vaccine. 2013. Vol. 31, № 42. P. 4812-4819.

23. Faizuloev E. et al. Water-soluble N-[(2-hydroxy-3-trimethylammonium)propyl]chitosan chloride as a nucleic acids vector for cell transfection // Carbohydr. Polym. 2012. Vol. 89, № 4. P. 1088-1094.

24. Saranya N. et al. Chitosan and its derivatives for gene delivery // Int. J. Biol. Macromol. 2011. Vol. 48, № 2. P. 234-238.

25. Hamed I., Özogul F., Regenstein J.M. Industrial applications of crustacean by-products (chitin, chitosan, and chitooligosaccharides): A review // Trends Food Sci. Technol. 2016. Vol. 48. P. 40-50.

26. Chung L.Y. et al. Biocompatibility of potential wound management products: Hydrogen peroxide generation by fungal chitin/chitosans and their effects on the proliferation of murine L929 fibroblasts in culture // J. Biomed. Mater. Res. 1998. Vol. 39, № 2. P. 300-307.

27. Yen M.-T., Mau J.-L. Physico-chemical characterization of fungal chitosan from shiitake stipes // LWT - Food Sci. Technol. 2007. Vol. 40, № 3. P. 472479.

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

Kuprina E.E., Bobylev V.S., Kirillov A.I. Electrochemical methods for the preservation of crustaceous wastes from shellfish processing // Prog. Chem. Appl. Chitin its Deriv. 2013. Vol. 18. P. 5-12.

Ravi Kumar M.N.. A review of chitin and chitosan applications // React. Funct. Polym. 2000. Vol. 46, № 1. P. 1-27.

Alvarenga E.S. De. Characterization and Properties of Chitosan // Biotechnol. Biopolym. 2011. P. 91-108.

Wu A.C.M. Determination of molecular-weight distribution of chitosan by high-performance liquid chromatography // Methods in enzymology. 1988. Vol. 161, № 1976. P. 447-452.

De Morais W.A., Pereira M.R., Fonseca J.L.C. Characterization of gelification of chitosan solutions by dynamic light scattering // Carbohydr. Polym. Elsevier Ltd., 2012. Vol. 87, № 4. P. 2376-2380.

Verheul R.J. et al. Influence of the degree of acetylation on the enzymatic degradation and in vitro biological properties of trimethylated chitosans. // Biomaterials. Elsevier Ltd, 2009. Vol. 30, № 18. P. 3129-3135.

Zhang H., Neau S.H. In vitro degradation of chitosan by a commercial enzyme preparation: effect of molecular weight and degree of deacetylation // Biomaterials. 2001. Vol. 22, № 12. P. 1653-1658.

Funkhouser J.D., Aronson N.N., Jr. Chitinase family GH18: evolutionary insights from the genomic history of a diverse protein family. // BMC Evol. Biol. BioMed Central, 2007. Vol. 7. P. 96.

S. Bhaskara Rao and Chandra P. Sharma. Use of chitosan as a biomaterial: Studies on its safety and hemostatic potential // J. Biomed. Mater. Res. 1997. Vol. 34. P. 21-28.

Onishi H., Machida Y. Biodegradation and distribution of water-soluble chitosan in mice // Biomaterials. 1999. Vol. 20, № 2. P. 175-182.

Zeng L. et al. Absorption and distribution of chitosan in mice after oral administration // Carbohydr. Polym. 2008. Vol. 71, № 3. P. 435-440.

Yang Y.M. et al. The controlling biodegradation of chitosan fibers by N-acetylation in vitro and in vivo // J. Mater. Sci. Mater. Med. 2007. Vol. 18, № 11. P. 2117-2121.

Williams D.F. On the mechanisms of biocompatibility // Biomaterials. 2008. Vol. 29, № 20. P. 2941-2953.

Denuziere A. et al. Chitosan-chondroitin sulfate and chitosan-hyaluronate polyelectrolyte complexes: biological properties // Biomaterials. 1998. Vol.

19, № 14. P. 1275-1285.

42. Muzzarelli R.A.A. et al. Osteoconductive properties of methylpyrrolidinone chitosan in an animal model. // Biomaterials. 1993. Vol. 14, № 12. P. 925929.

43. Suh J.K., Matthew H.W. Application of chitosan-based polysaccharide biomaterials in cartilage tissue engineering: a review. // Biomaterials. 2000. Vol. 21, № 24. P. 2589-2598.

44. Bumgardner J.D. et al. The integration of chitosan-coated titanium in bone: an in vivo study in rabbits. // Implant Dent. 2007. Vol. 16, № 1. P. 66-79.

45. Prasitsilp M. et al. Cellular responses to chitosan in vitro: the importance of deacetylation. // J. Mater. Sci. Mater. Med. 2000. Vol. 11, № 12. P. 773-778.

46. Molinaro G. et al. Biocompatibility of thermosensitive chitosan-based hydrogels: An in vivo experimental approach to injectable biomaterials // Biomaterials. 2002. Vol. 23, № 13. P. 2717-2722.

47. Wedmore I. et al. A special report on the chitosan-based hemostatic dressing: experience in current combat operations. // J. Trauma. 2006. Vol. 60, № 3. P. 655-658.

48. Casettari L., Illum L. Chitosan in nasal delivery systems for therapeutic drugs. // J. Control. Release. Elsevier B.V., 2014. Vol. 190. P. 189-200.

49. Balan V., Verestiuc L. Strategies to improve chitosan hemocompatibility: A review // Eur. Polym. J. Elsevier Ltd, 2014. Vol. 53, № 1. P. 171-188.

50. Svirshchevskaya E. V. et al. Analysis of toxicity and biocompatibility of chitosan derivatives with different physico-chemical properties // Appl. Biochem. Microbiol. 2016. Vol. 52, № 5. P. 483-490.

51. Richardson S.C.W., Kolbe H.V.J., Duncan R. Potential of low molecular mass chitosan as a DNA delivery system: Biocompatibility, body distribution and ability to complex and protect DNA // Int. J. Pharm. 1999. Vol. 178, № 2. P. 231-243.

52. Schipper N.G.M. et al. Chitosans as absorption enhancers of poorly absorbable drugs. 3: Influence of mucus on absorption enhancement // Eur. J. Pharm. Sci. 1999. Vol. 8, № 4. P. 335-343.

53. Schipper N.G., Vârum K.M., Artursson P. Chitosans as absorption enhancers for poorly absorbable drugs. 1 : Influence of molecular weight and degree of acetylation on drug transport across human intestinal epithelial (Caco-2) cells. // Pharm. Res. 1996. Vol. 13, № 11. P. 1686-1692.

54. Carreno-Gomez B., Duncan R. Evaluation Of the biological properties of

soluble chitosan and chitosan microspheres // Int. J. Pharm. 1997. Vol. 148, № 2. P. 231-240.

55. Opanasopit P. et al. Effect of salt forms and molecular weight of chitosans on in vitro permeability enhancement in intestinal epithelial cells (Caco-2). // Pharm. Dev. Technol. 2007. Vol. 12. P. 447-455.

56. Kean T., Roth S., Thanou M. Trimethylated chitosans as non-viral gene delivery vectors: Cytotoxicity and transfection efficiency // J. Control. Release. 2005. Vol. 103, № 3. P. 643-653.

57. Aiping Z. et al. Synthesis and characterization of N-succinyl-chitosan and its self-assembly of nanospheres // Carbohydr. Polym. 2006. Vol. 66, № 2. P. 274-279.

58. Anitha A. et al. Synthesis, characterization, cytotoxicity and antibacterial studies of chitosan, O-carboxymethyl and N,O-carboxymethyl chitosan nanoparticles // Carbohydr. Polym. Elsevier Ltd, 2009. Vol. 78, № 4. P. 672677.

59. Kumirska J. et al. Biomedical activity of chitin/chitosan based materials-influence of physicochemical properties apart from molecular weight and degree of N-Acetylation // Polymers (Basel). 2011. Vol. 3, № 4. P. 18751901.

60. Gamiz-Gonzalez M.A. et al. Determining the influence of N-acetylation on water sorption in chitosan films // Carbohydr. Polym. Elsevier Ltd., 2015. Vol. 133. P. 110-116.

61. Lu S. et al. Preparation of water-soluble chitosan // J. Appl. Polym. Sci. 2004. Vol. 91. P. 3497-3503.

62. Mekasha S. et al. A novel analytical method for D-glucosamine quantification and its application in the analysis of chitosan degradation by a minimal enzyme cocktail // Carbohydr. Res. 2016. Vol. 433. P. 18-24.

63. Pan A.D. et al. Enzymolysis of chitosan by papain and its kinetics // Carbohydr. Polym. Elsevier Ltd., 2016. Vol. 135. P. 199-206.

64. Pan S., Wu S., Kim J. Preparation of glucosamine by hydrolysis of chitosan with commercial a-amylase and glucoamylase. // J. Zhejiang Univ. Sci. B. 2011. Vol. 12, № 11. P. 931-934.

65. Xie Y. et al. Preparation of chitooligosaccharides by the enzymatic hydrolysis of chitosan // Polym. Degrad. Stab. Elsevier Ltd, 2009. Vol. 94, № 10. P. 1895-1899.

66. Khasanova L.M. et al. Hydrolysis of Chitozan with an Enzyme Complex from Myceliophthora sp. // Appl. Biochem. Microbiol. 2014. Vol. 50, № 4.

67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77

78

79

80

P. 422-428.

Vasil'eva T.M., Lopatin S.A., Varlamov V.P. Production of the low-molecular-weight chitin and chitosan forms in electron-beam plasma // High Energy Chem. 2016. Vol. 50, № 2. P. 150-154.

Won-Seok Choi, Ki-Jin Ahn, Dong-Wook-Lee M.-W.B. Preparation of chitosan oligoment by irradiation // Plymer Degrad. Stab. 2002. Vol. 78. P. 533-538.

El-sawy N.M. et al. Preparation of Low Molecular Weight Natural Polymers by y -Radiation and Their Growth Promoting Effect on Zea Maize Plants. 2013. Vol. 3, № 13. P. 66-79.

Kim H. Bin et al. Molecular Weight Control of Chitosan Using Gamma Ray and Electron Beam Irradiation // J. Radiat. Ind. 2013. Vol. 7, № 1. P. 51-54.

Kang B. et al. Synergetic degradation of chitosan with gamma radiation and hydrogen peroxide // Polym. Degrad. Stab. 2007. Vol. 92, № 3. P. 359-362.

Hien N.Q. et al. Degradation of chitosan in solution by gamma irradiation in the presence of hydrogen peroxide // Carbohydr. Polym. Elsevier Ltd., 2012. Vol. 87, № 1. P. 935-938.

Knill C.J. et al. Acid hydrolysis of commercial chitosans // J. Chem. Technol. Biotechnol. 2005. Vol. 80, № 11. P. 1291-1296.

Dolgopyatova N. V. et al. Mechanism of acid hydrolysis of N-acetyl-D-glucosamine // Russ. J. Appl. Chem. 2013. Vol. 86, № 7. P. 986-991.

Mourya V.K., Inamdar N.N., Choudhari Y.M. Chitooligosaccharides: Synthesis, characterization and applications // Polym. Sci. Ser. A. 2011. Vol. 53, № 7. P. 583-612.

Kazami N. et al. A simple procedure for preparing chitin oligomers through acetone precipitation after hydrolysis in concentrated hydrochloric acid // Carbohydr. Polym. Elsevier Ltd., 2015. Vol. 132. P. 304-310.

Tian F. et al. Study of the depolymerization behavior of chitosan by hydrogen peroxide // Carbohydr. Polym. 2004. Vol. 57, № 1. P. 31-37.

Yan X., Evenocheck H.M. Chitosan analysis using acid hydrolysis and HPLC/UV // Carbohydr. Polym. 2012. Vol. 87, № 2. P. 1774-1778.

T0mmeraas K. et al. Preparation and characterisation of oligosaccharides produced by nitrous acid depolymerisation of chitosans // Carbohydr. Res. 2001. Vol. 333, № 2. P. 137-144.

Varum K.M., Ottoy M.H., Smidsrod O. Acid hydrolysis of chitosans // Carbohydr. Polym. 2001. Vol. 46, № 1. P. 89-98.

122

81. Krishnan R.A. et al. Proton play in the formation of low molecular weight chitosan (LWCS) by hydrolyzing chitosan with a carbon based solid acid // Carbohydr. Polym. Elsevier Ltd., 2016. Vol. 151. P. 417-425.

82. Onda A., Ochi T., Yanagisawa K. Selective hydrolysis of cellulose into glucose over solid acid catalysts // Green Chem. 2008. Vol. 10, № 10. P. 1033.

83. Bashir S. et al. N-succinyl chitosan preparation, characterization, properties and biomedical applications: a state of the art review // Rev. Chem. Eng. 2015. Vol. 31, № 6. P. 563-597.

84. Ngo D.-H. et al. Biological effects of chitosan and its derivatives // Food Hydrocoll. Elsevier Ltd, 2015. Vol. 51. P. 200-216.

85. Rajasree R., Rahate K.P. An overview on various modifications of chitosan and its applications // Int. J. Pharm. Sci. Res. 2013. Vol. 4, № 11. P. 41754193.

86. Muzzarelli R.A.A. et al. N-(carboxymethylidene)chitosans and N-(carboxymethyl)chitosans: Novel chelating polyampholytes obtained from chitosan glyoxylate // Carbohydr. Res. 1982. Vol. 107, № 2. P. 199-214.

87. Dung P. le et al. Water soluble derivatives obtained by controlled chemical modifications of chitosan // Carbohydr. Polym. 1994. Vol. 24, № 3. P. 209214.

88. Zhao D. et al. Biochemical activities of N,O-carboxymethyl chitosan from squid cartilage // Carbohydr. Polym. 2011. Vol. 85, № 4. P. 832-837.

89. Chen L., Tian Z., Du Y. Synthesis and pH sensitivity of carboxymethyl chitosan-based polyampholyte hydrogels for protein carrier matrices // Biomaterials. 2004. Vol. 25, № 17. P. 3725-3732.

90. Hjerde R.J.N. et al. Chemical composition of O-(carboxymethyl)-chitins in relation to lysozyme degradation rates // Carbohydr. Polym. 1997. Vol. 34, № 3. P. 131-139.

91. Chen L., Du Y., Zeng X. Relationships between the molecular structure and moisture-absorption and moisture-retention abilities of carboxymethyl chitosan - II. Effect of degree of deacetylation and carboxymethylation // Carbohydr. Res. 2003. Vol. 338, № 4. P. 333-340.

92. Pang H.T. et al. Preparation and rheological properties of deoxycholate-chitosan and carboxymethyl-chitosan in aqueous systems // Carbohydr. Polym. 2007. Vol. 69, № 3. P. 419-425.

93. Ferreira Felicio S.G. et al. Spherical aggregates obtained from N-carboxymethylation and acetylation of chitosan // Colloid Polym. Sci. 2008.

Vol. 286, № 12. P. 1387-1394.

94. Aiping Z., Jianhong L., Wenhui Y. Effective loading and controlled release of camptothecin by O-carboxymethylchitosan aggregates // Carbohydr. Polym. 2006. Vol. 63, № 1. P. 89-96.

95. Shi X. et al. Effect of degree of substitution and molecular weight of carboxymethyl chitosan nanoparticles on doxorubicin delivery // J. Appl. Polym. Sci. 2006. Vol. 100, № 6. P. 4689-4696.

96. Sahu S.K. et al. Hydrophobically modified carboxymethyl chitosan nanoparticles targeted delivery of paclitaxel. // J. Drug Target. 2011. Vol. 19, № 2. P. 104-113.

97. Chen S.C. et al. A novel pH-sensitive hydrogel composed of N,O-carboxymethyl chitosan and alginate cross-linked by genipin for protein drug delivery // J. Control. Release. 2004. Vol. 96, № 2. P. 285-300.

98. Lu G. et al. Degradation of covalently cross-linked carboxymethyl chitosan and its potential application for peripheral nerve regeneration // Eur. Polym. J. 2007. Vol. 43, № 9. P. 3807-3818.

99. Budiraharjo R. et al. Bioactivity of novel carboxymethyl chitosan scaffold incorporating MTA in a tooth model // Int. Endod. J. 2010. Vol. 43, № 10. P. 930-939.

100. Kurita K. Chemistry and application of chitin and chitosan // Polym. Degrad. Stab. 1998. Vol. 59, № 1-3. P. 117-120.

101. Hirano S., Yamaguchi Y., Kamiya M. Novel N-saturated-fatty-acyl derivatives of chitosan soluble in water and in aqueous acid and alkaline solutions // Carbohydr. Polym. 2002. Vol. 48, № 2. P. 203-207.

102. Wu Y. et al. Layered structures of hydrophobically modified chitosan derivatives // Carbohydr. Polym. 2006. Vol. 63, № 4. P. 493-499.

103. Yan C. et al. Preparation of N-succinyl-chitosan and its physical-chemical properties as a novel excipient. // Yakugaku Zasshi. 2006. Vol. 126, № 9. P. 789-793.

104. Mukhopadhyay P. et al. PH sensitive N-succinyl chitosan grafted polyacrylamide hydrogel for oral insulin delivery // Carbohydr. Polym. Elsevier Ltd., 2014. Vol. 112. P. 627-637.

105. Yan C. et al. Nanoparticles of 5-fluorouracil (5-FU) loaded N-succinyl-chitosan (Suc-Chi) for cancer chemotherapy: preparation, characterization--in-vitro drug release and anti-tumour activity. // J. Pharm. Pharmacol. 2006. Vol. 58, № 9. P. 1177-1181.

106. Mura C. et al. Design, characterization and in vitro evaluation of 5-aminosalicylic acid loaded N-succinyl-chitosan microparticles for colon specific delivery // Colloids Surfaces B Biointerfaces. Elsevier B.V., 2012. Vol. 94. P. 199-205.

107. Toh E.K.W. et al. Succinated chitosan as a gene carrier for improved chitosan solubility and gene transfection // Nanomedicine Nanotechnology, Biol. Med. Elsevier Inc., 2011. Vol. 7, № 2. P. 174-183.

108. Yan C. et al. Synthesis of Tat tagged and folate modified N-succinyl-chitosan self-assembly nanoparticles as a novel gene vector // Int. J. Biol. Macromol. Elsevier B.V., 2015. Vol. 72. P. 751-756.

109. Jayakumar R. et al. Sulfated chitin and chitosan as novel biomaterials // Int. J. Biol. Macromol. 2007. Vol. 40, № 3. P. 175-181.

110. Mourya V.K., Inamdar N.N. Chitosan-modifications and applications: Opportunities galore // React. Funct. Polym. 2008. Vol. 68, № 6. P. 10131051.

111. Pires N.R. et al. Sulfated chitosan as tear substitute with no antimicrobial activity // Carbohydr. Polym. Elsevier Ltd., 2013. Vol. 91, № 1. P. 92-99.

112. Zhou H. et al. Enhanced bioactivity of bone morphogenetic protein-2 with low dose of 2-N, 6-O-sulfated chitosan in vitro and in vivo // Biomaterials. Elsevier Ltd, 2009. Vol. 30, № 9. P. 1715-1724.

113. Zhang K. et al. FT Raman investigation of novel chitosan sulfates exhibiting osteogenic capacity // Carbohydr. Polym. Elsevier Ltd., 2011. Vol. 83, № 1. P. 60-65.

114. Vikhoreva G. et al. Preparation and anticoagulant activity of a low-molecular-weight sulfated chitosan // Carbohydr. Polym. 2005. Vol. 62, № 4. P. 327-332.

115. Karadeniz F. et al. Sulfation of chitosan oligomers enhances their anti-adipogenic effect in 3T3-L1 adipocytes // Carbohydr. Polym. Elsevier Ltd., 2011. Vol. 86, № 2. P. 666-671.

116. Huang R. et al. A new approach to chemically modified chitosan sulfates and study of their influences on the inhibition of Escherichia coli and Staphylococcus aureus growth // React. Funct. Polym. 2004. Vol. 59, № 1. P. 41-51.

117. Xing R. et al. Preparation of high-molecular weight and high-sulfate content chitosans and their potential antioxidant activity in vitro // Carbohydr. Polym. 2005. Vol. 61, № 2. P. 148-154.

118. Zhang K. et al. Synthesis and characterization of biologically active chitosan

sulfates // ACS Symp. Ser. 2012. Vol. 1107. P. 297-314.

119. Holme K.R., Perlin A.S. Chitosan N-sulfate. A water-soluble polyelectrolyte // Carbohydr. Res. 1997. Vol. 302, № 1. P. 7-12.

120. Vongchan P. et al. Anticoagulant Activities of the Chitosan Polysulfate Synthesized from Marine Crab Shell by Semi-heterogeneous Conditions // Symp. A Q. J. Mod. Foreign Lit. 2003. Vol. 29. P. 115-120.

121. Huang R. et al. Influence of functional groups on the in vitro anticoagulant activity of chitosan sulfate // Carbohydr. Res. 2003. Vol. 338, № 6. P. 483489.

122. Vongchan P. et al. Anticoagulant activity of a sulfated chitosan. // Carbohydr. Res. 2002. Vol. 337, № 13. P. 1239-1242.

123. Zhang C. et al. Preparation of N-alkyl-O-sulfate chitosan derivatives and micellar solubilization of taxol // Carbohydr. Polym. 2003. Vol. 54, № 2. P. 137-141.

124. Chung Y.C., Tsai C.F., Li C.F. Preparation and characterization of water-soluble chitosan produced by Maillard reaction // Fish. Sci. 2006. Vol. 72, № 5. P. 1096-1103.

125. Il'ina A. V et al. Obtaining and study of monosaccharide derivatives of low-molecular-weight chitosan // Prikl. Biokhim. Mikrobiol. 2008. Vol. 44, № 5. P. 606-614.

126. Il'ina A. V., Varlamov V.P. Galactosylated derivatives of low-molecular-weight chitosan: Obtaining and properties // Appl. Biochem. Microbiol. 2007. Vol. 43, № 1. P. 73-77.

127. Ruiz Matute A.I. et al. Synthesis, characterization and functional properties of galactosylated derivatives of chitosan through amide formation // Food Hydrocoll. Elsevier Ltd, 2013. Vol. 33, № 2. P. 245-255.

128. Feng Z.Q. et al. The effect of nanofibrous galactosylated chitosan scaffolds on the formation of rat primary hepatocyte aggregates and the maintenance of liver function // Biomaterials. Elsevier Ltd, 2009. Vol. 30, № 14. P. 27532763.

129. Strand S.P. et al. Tailoring of chitosans for gene delivery: Novel self-branched glycosylated chitosan oligomers with improved functional properties // Biomacromolecules. 2008. Vol. 9, № 11. P. 3268-3276.

130. Chung Y.C., Yeh J.Y., Tsai C.F. Antibacterial characteristics and activity of water-soluble chitosan derivatives prepared by the Maillard reaction // Molecules. 2011. Vol. 16, № 10. P. 8504-8514.

131. Kurita K. et al. Nonnatural branched polysaccharides: Synthesis and properties of chitin and chitosan having disaccharide maltose branches // Biomacromolecules. 2003. Vol. 4, № 5. P. 1264-1268.

132. Хотимченко Ю.С. Углеводные биополимеры для адресной доставки белковых препаратов , нуклеиновых кислот и полисахаридов // Тихоокеанский медицинский журнал. 2014. № 2. P. 5-13.

133. Schmitz T. et al. Synthesis and characterization of a chitosan-N-acetyl cysteine conjugate // Int. J. Pharm. 2008. Vol. 347, № 1-2. P. 79-85.

134. Guggi D. et al. Comparative evaluation of cytotoxicity of a glucosamine-TBA conjugate and a chitosan-TBA conjugate // Int. J. Pharm. 2004. Vol. 278, № 2. P. 353-360.

135. Kafedjiiski K. et al. Improved synthesis and in vitro characterization of chitosan- thioethylamidine conjugate // Biomaterials. 2006. Vol. 27, № 1. P. 127-135.

136. Kast C.E. et al. Chitosan-thioglycolic acid conjugate: A new scaffold material for tissue engineering? // Int. J. Pharm. 2003. Vol. 256, № 1-2. P. 183-189.

137. Esquivel R. et al. Synthesis and Characterization of New Thiolated Chitosan Nanoparticles Obtained by Ionic Gelation Method // Int. J. Polym. Sci. 2015. Vol. 2015. P. 1-18.

138. Han B. et al. Correlation of the structure, properties, and antimicrobial activity of a soluble thiolated chitosan derivative // J. Appl. Polym. Sci. 2012. Vol. 125, № S2. P. E143-E148.

139. Sonia T.A., Sharma C.P. Chitosan and Its Derivatives for Drug Delivery Perspective // Advances in Polymer Science. 2011. № May 2012. P. 23-53.

140. Zhu X. et al. Synthesis of thiolated chitosan and preparation nanoparticles with sodium alginate for ocular drug delivery. // Mol. Vis. 2012. Vol. 18, № July. P. 1973-1982.

141. Zhao X. et al. Thiolated trimethyl chitosan nanocomplexes as gene carriers with high in vitro and in vivo transfection efficiency // J. Control. Release. Elsevier B.V., 2010. Vol. 144, № 1. P. 46-54.

142. Domard A., Rinaudo M., Terrassin C. New method for the quaternization of chitosan // Int. J. Biol. Macromol. 1986. Vol. 8, № 2. P. 105-107.

143. Polnok A. et al. Influence of methylation process on the degree of quaternization of N-trimethyl chitosan chloride // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2004. Vol. 57, № 1. P. 77-83.

144

145

146

147

148

149

150

151

152

153

154

155

156

157

Wu M. et al. Recent research progress on preparation and application of N, N, N-trimethyl chitosan // Carbohydr. Res. Elsevier Ltd, 2016. Vol. 434, № 1800. P. 27-32.

Muzzarelli R.A.A., Tanfani F. The N-permethylation of chitosan and the preparation of N-trimethyl chitosan iodide // Carbohydr. Polym. 1985. Vol. 5, № 4. P. 297-307.

Jia Z., Shen D., Xu W. Synthesis and antibacterial activities of quaternary ammonium salt of chitosan. // Carbohydr. Res. 2001. Vol. 333, № 1. P. 1-6.

Sajomsang W. Synthetic methods and applications of chitosan containing pyridylmethyl moiety and its quaternized derivatives: A review // Carbohydr. Polym. Elsevier Ltd, 2010. Vol. 80, № 3. P. 631-647.

de Britto D., Assis O.B.G. A novel method for obtaining a quaternary salt of chitosan // Carbohydr. Polym. 2007. Vol. 69, № 2. P. 305-310.

Holappa J. et al. Synthesis and Characterization of Chitosan N -Betainates Having Various Degrees of Substitution // Macromolecules. 2004. Vol. 37, № 8. P. 2784-2789.

Stepnova E.A. et al. New approach to the quaternization of chitosan and its amphiphilic derivatives // Eur. Polym. J. 2007. Vol. 43, № 6. P. 2414-2421.

Avadi M.R. et al. Optimized Synthesis and Characterization of N-Triethyl Chitosan // J. Bioact. Compat. Polym. 2003. Vol. 18, № 6. P. 469-479.

Gruskiene R., Deveikyte R., Makuska R. Quaternization of chitosan and partial destruction of the quaternized derivatives making them suitable for electrospinning // Chemija. 2013. Vol. 24, № 4. P. 325-334.

Benediktsdottir B.E. et al. N-alkylation of highly quaternized chitosan derivatives affects the paracellular permeation enhancement in bronchial epithelia in vitro // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2014. Vol. 86, № 1. P. 55-63.

Sandri G. et al. Buccal penetration enhancement properties of N-trimethyl chitosan: Influence of quaternization degree on absorption of a high molecular weight molecule // Int. J. Pharm. 2005. Vol. 297, № 1-2. P. 146155.

Ji Q. et al. In vitro evaluation of the biomedical properties of chitosan and quaternized chitosan for dental applications // Carbohydr. Res. 2009.

Kaminski K. et al. Chitosan derivatives as novel potential heparin reversal agents. // J. Med. Chem. 2010. Vol. 53, № 10. P. 4141-4147.

Sajomsang W. et al. Quaternization of N-aryl chitosan derivatives: synthesis, characterization, and antibacterial activity // Carbohydr. Res. Elsevier Ltd,

2009. Vol. 344, № 18. P. 2502-2511.

158. Xu T. et al. Synthesis, characterization, and antibacterial activity of N,O-quaternary ammonium chitosan. // Carbohydr. Res. Elsevier Ltd, 2011. Vol. 346, № 15. P. 2445-2450.

159. Xie Y., Liu X., Chen Q. Synthesis and characterization of water-soluble chitosan derivate and its antibacterial activity // Carbohydr. Polym. 2007. Vol. 69, № 1. P. 142-147.

160. Kong M. et al. Antimicrobial properties of chitosan and mode of action: a state of the art review. // Int. J. Food Microbiol. Elsevier B.V., 2010. Vol. 144, № 1. P. 51-63.

161. Eaton P. et al. Atomic force microscopy study of the antibacterial effects of chitosans on Escherichia coli and Staphylococcus aureus. // Ultramicroscopy. 2008. Vol. 108, № 10. P. 1128-1134.

162. Jarmila V., Vavrikova E. Chitosan derivatives with antimicrobial, antitumour and antioxidant activities--a review. // Curr. Pharm. Des. 2011. Vol. 17, № 32. P. 3596-3607.

163. Peng Z.-X. et al. Adjustment of the antibacterial activity and biocompatibility of hydroxypropyltrimethyl ammonium chloride chitosan by varying the degree of substitution of quaternary ammonium // Carbohydr. Polym. Elsevier Ltd., 2010. Vol. 81, № 2. P. 275-283.

164. Il'ina A. V., Varlamov V.P. Effect of the Degree of Acetylation of Chitosan on Its Enzymatic Hydrolysis with the Preparation Celloviridin G20kh // Appl. Biochem. Microbiol. 2003. Vol. 39, № 3. P. 239-242.

165. Shigemasa, Y.; Matsuura, H.; Sashiwa, H.; Saimato H. An improved IR spectroscopic determination of degree of deacetylation of chitin // In Advances in Chitin Science / ed. Domard, A., Jeuniaux, C., Muzzarelli, R.A.A., Roberts G.A.F. Lyon, France: André Publisher, 1994. Vol. 1. P. 204-209.

166. Lopatin S.A. et al. Fractionation of chitosan by ultrafiltration // J. Anal. Chem. 2009. Vol. 64, № 6. P. 648-651.

167. Qin C. et al. Calorimetric studies of the action of chitosan-N-2-hydroxypropyl trimethyl ammonium chloride on the growth of microorganisms. // Int. J. Biol. Macromol. 2004. Vol. 34, № 1-2. P. 121-126.

168. Il'ina A. V. et al. Nanoparticles based on succinylchitosan with doxorubicin: Preparation and properties // Nanotechnologies Russ. 2012. Vol. 7, № 1-2. P. 85-92.

169. Korobov V.P. et al. Isolation and characterization of a new low-molecular

antibacterial peptide of the lantibiotics family // Microbiology. 2010. Vol. 79, № 2. P. 206-215.

170. Zhu X. et al. Antibacterial activity of chitosan grafting nisin: Preparation and characterization // React. Funct. Polym. Elsevier B.V., 2015. Vol. 91-92. P. 71-76.

171. Kulikov S.N., Shumkova Y.A. Effect of Chitosan on Lysostaphin Lysis of Staphylococcal Cells // Bull. Exp. Biol. Med. 2014. Vol. 157, № 2. P. 243245.

172. Yen M.T., Yang J.H., Mau J.L. Antioxidant properties of chitosan from crab shells // Carbohydr. Polym. 2008. Vol. 74, № 4. P. 840-844.

173. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays // J. Immunol. Methods. 1983. Vol. 65, № 1-2. P. 55-63.

174. Dash B.C. et al. The influence of size and charge of chitosan/polyglutamic acid hollow spheres on cellular internalization, viability and blood compatibility. // Biomaterials. Elsevier Ltd, 2010. Vol. 31, № 32. P. 81888197.

175. Born G.V.R. Aggregation of Blood Platelets by Adenosine Diphosphate and its Reversal // Nature. 1962. Vol. 194, № 4832. P. 927-929.

176. Teien A.N., Lie M. Heparin assay in plasma: A comparison of five clotting methods // Thromb. Res. 1975. Vol. 7. P. 777-788.

177. Yin E.T., Wessler S. B.J. Plasma heparin: a unique, practical, submicrogram-sensitive assay // J. Lab. Clin. Med. 1973. Vol. 81, № 2. P. 298-310.

178. Макаров В.А., Спасов А.А., Плотников М.Б. и др. Методические рекомендации по изучению лекарственных средств, влияющих на гемостаз // Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Гриф и К (Тула), 2012. P. 453-479.

179. Yadav S.C., Kumari A., Yadav R. Development of peptide and protein nanotherapeutics by nanoencapsulation and nanobioconjugation. // Peptides. Elsevier Inc., 2011. Vol. 32, № 1. P. 173-187.

180. Soppimath K., Aminabhavi T. Biodegradable polymeric nanoparticles as drug delivery devices // J. Control. Release. 2001. Vol. 70. P. 1-20.

181. Fennell J.F., Shipman W.H., Cole L.J. Antibacterial Action of Melittin, a Polypeptide from Bee Venom // Exp. Biol. Med. 1968. Vol. 127, № 3. P. 707-710.

182. Wu X. et al. Characterization of antimicrobial activity against Listeria and

cytotoxicity of native melittin and its mutant variants // Colloids Surfaces B Biointerfaces. 2016. Vol. 143. P. 194-205.

183. Son D. et al. Therapeutic application of anti-arthritis, pain-releasing, and anti-cancer effects of bee venom and its constituent compounds // Pharmacol. Ther. 2007. Vol. 115, № 2. P. 246-270.

184. Shweta A., Sonia P. Pharmaceutical relevance of crosslinked chitosan in microparticulate drug delivery // Int. Res. J. Pharm. 2013. Vol. 4, № 2. P. 4551.

185. Zheng L.-Y., Zhu J.-F. Study on antimicrobial activity of chitosan with different molecular weights // Carbohydr. Polym. 2003. Vol. 54, № 4. P. 527-530.

186. Halliwell B., Gutteridge J.M., Cross C.E. Free radicals, antioxidants, and human disease: where are we now? // J. Lab. Clin. Med. 1992. Vol. 119, № 6. P. 598-620.

187. Hosseinnejad M., Mahdi S. Evaluation of different factors affecting antimicrobial properties of chitosan // Int. J. Biol. Macromol. Elsevier B.V., 2016. Vol. 85. P. 467-475.

188. Xing R. et al. Relevance of molecular weight of chitosan-N-2-hydroxypropyl trimethyl ammonium chloride and their antioxidant activities. // Eur. J. Med. Chem. 2008. Vol. 43, № 2. P. 336-340.

189. Chang K.C. et al. Atomic force microscopy in biology and biomedicine // Tzu Chi Med. J. Elsevier Taiwan LLC, 2012. Vol. 24, № 4. P. 162-169.

190. Qi L. et al. Preparation and antibacterial activity of chitosan nanoparticles // Carbohydr. Res. 2004. Vol. 339, № 16. P. 2693-2700.

191. Dosler S., Mataraci E. In vitro pharmacokinetics of antimicrobial cationic peptides alone and in combination with antibiotics against methicillin resistant Staphylococcus aureus biofilms. // Peptides. Elsevier Inc., 2013. Vol. 49. P. 53-58.

192. Tammam S.N., Azzazy H.M.E., Lamprecht A. A high throughput method for quantification of cell surface bound and internalized chitosan nanoparticles // Int. J. Biol. Macromol. Elsevier B.V., 2015. Vol. 81. P. 858-866.

193. Gallagher J.T. Heparin - A Century of Progress // Handbook of Experimental Pharmacology. 2012. Vol. 207. 347-360 p.

194. A.M. Cumming, G.R. Jones, R.T. Wensley R.B.C. In vitro neutralization of heparin in plasma prior to the activated partial thromboplastin time test: An assessment of four heparin antagonists and two anion exchange resins // Thromb. Res. 2004. Vol. 41, № 1. P. 43-56.

195. Smythe M.A. et al. Guidance for the practical management of the heparin anticoagulants in the treatment of venous thromboembolism // J. Thromb. Thrombolysis. Springer US, 2016. Vol. 41, № 1. P. 165-186.