Биологический синтез олигомеров хитина и их терминально деацетилированных производных с помощью ферментов клубеньковых бактерий тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Леппянен, Ирина Викторовна

• Леппянен, Ирина Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Леппянен, Ирина Викторовна

Содержание

Условные обозначения и сокращения

Введение

Глава 1. Обзор литературы

Часть 1. Биосинтетический способ получения широкого спектра соединений в клетках микроорганизмов, растений и животных

1.1. Биологический синтез в клетках микроорганизмов

1.2. Использование трансгенных растений для получения биологически активных соединений

1.3. Особенности использования животных систем для синтеза биологически активных соединений

Часть 2. Физиологическая роль олигосахаридов как универсальных сигнальных регуляторов межклеточного и межорганизменного взаимодействия

2.1. Функции олигосахаридов, состоящих из остатков аминосахаров - Б-глюкозамина, О-галактозамина, Ы-ацетил-О-глюкозамина и ]Ч-ацетил-0-галактозамина

2.2. Биологическая активность хитоолигосахаридов

Часть 3. Основные способы получения хитоолигосахаридов

3.1. Химический и ферментативный гидролиз полимеров хитина и хитозана

3.2. Химический синтез хитоолигосахаридов

3.3. Ферментативный синтез хитоолигосахаридов

Заключение

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Штаммы микроорганизмов

2.2. Условия культивирования микроорганизмов

2.3. Растительный материал

2.4. Условия выращивания растений

2.5. Олигонуклеотиды, ферменты и векторы для клонирования

2.6. Компьютерные и интернет-ресурсы

2.7. Выделение ДНК бактерий

2.8. Получение генетических конструкций, содержащих полноразмерные гены nodC двух видов ризобий Rhizobium sp. GRH2 и M. loti 1803

2.9. Получение генетических конструкций, содержащих полноразмерные гены nodC и nodBM. loti 1803

2.10. Определение нуклеотидных последовательностей генов

2.11. Экспрессия белков в клетках Е. coli. Приготовление экстрактов клеток Е. coli и выделение различных субклеточных фракций

2.12. Электрофорез белков в ПААГ и Вестерн-блот гибридизация

2.13. Синтез хитоолигосахаридов in vivo

2.14. Выделение хитоолигосахаридов

2.15. Разделение хитоолигосахаридов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

2.16. Анализ синтезированных хитоолигосахаридов с помощью метода масс-спектрометрии

2.17. Анализ деацетилированных олигомеров хитина методом тонкослойной хроматографии

2.18. Выделение РНК растений

2.19. Анализ экспрессии генов Pal томата и гороха методом полимеразной цепной реакции, совмещенной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и определением продуктов реакции в реальном времени

2.20. Определение содержания перекиси водорода в корнях растений

2.21. Анализ влияния олигомеров хитина на рост фитопатогенного гриба Fusarium culmorum 333

2.22. Выделение ДНК растений

2.23. Оценка интенсивности заражения растений

2.24. Статистическая обработка результатов

Глава 3. Результаты и обсуждение

Часть 1. Ферментативный синтез гекса- и пентамерных хитоолигосахаридов с помощью N-ацетилглюкозаминилтрансферазы ризобий

3.1. Гетерологичная экспрессия фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, кодируемого геном nodC, двух видов ризобий Rhizobium sp. GRH2 и M. loti 1803

3.2. Синтез хитоолигосахаридов в культивируемых клетках Е. coli и анализ этих соединений

Часть 2. Анализ биологической активности хитоолигосахаридов, полученных биосинтетическим способом

3.3. Тестирование элиситорной активности хитоолигосахаридов

Часть 3. Биосинтез терминально N-деацетилированных хитоолигосахаридов с помощью ферментов ризобий N-ацетилглюкозаминилтрансферазы и хитоолигосахарид деацетилазы

3.4. Получение генетических конструкций, содержащих полноразмерные последовательности генов nodC и nodB M. loti 1803

3.5. Синтез деацетилированных по терминальному положению хитоолигосахаридов с помощью ферментов N-ацетилглюкозаминилтрансферазы и хитоолигосахарид деацетилазы M loti 1803

3.6. Анализ синтезированных терминально N-деацетилированных хитоолигосахаридов методом тонкослойной хроматографии

Заключение

Выводы

Список литературы

Благодарности

Условные обозначения и сокращения

АФК - активные формы кислорода

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

дпи - дни после инокуляции

MC - масс-спектрометрия

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция, совмещенная с обратной транскрипцией ПЦР - полимеразная цепная реакция ХОС - хитоолигосахариды

CEBiP - рецепторная киназа, участвующая в связывании хитоолигосахаридов (от англ. -

Chitin Elicitor Binding Protein) CERK1 - рецепторная киназа, участвующая в связывании хитоолигосахаридов (от англ. -

Chitin Elicitor Receptor Kinase 1) LysM-РПК - LysM-содержащие рецептор-подобные киназы NodB - фермент хитоолигосахарид деацетилаза NodC - фермент N-ацетилглюкозаминилтрансфераза

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биологический синтез олигомеров хитина и их терминально деацетилированных производных с помощью ферментов клубеньковых бактерий»

Введение

Одной из приоритетных задач современной молекулярной микробиологии является получение высокопродуктивных штаммов микроорганизмов, обладающих хозяйственно-полезными свойствами. Развитие этого направления исследования определяется необходимостью перехода от традиционного способа выделения штаммов микроорганизмов с полезными свойствами из природных источников к направленному получению в результате селекции, а также созданию с помощью методов генной инженерии микроорганизмов с новыми заданными свойствами. В результате таких исследований могут быть получены микроорганизмы - продуценты ценных биологически активных соединений (аминокислот, ферментов, гормонов, антибиотиков, витаминов и т.п.) для медицины, сельского хозяйства и различных промышленных технологий.

При селекции спонтанных или индуцированных (с помощью химического мутагенеза или ультрафиолетового облучения) мутантов проводят поиск, отбор и тестирование большого количества колоний на предмет наличия у них необходимых свойств, что позволяет выбрать микроорганизмы с высокой производительностью. Например, в известных работах с представителями рода Pénicillium с помощью селекции был примерно в тысячу раз увеличен выход пенициллина в сравнении с исходными дикими штаммами (Chain et al., 1940). Однако метод селекции занимает достаточно много времени. Более того, при этом можно рассчитывать только на усовершенствование уже существующих свойств штамма, а не на изменение его возможностей.

С развитием методов генной инженерии целенаправленное изменение свойств живых организмов заметно ускорилось и расширилось. Разработка новых подходов дала возможность использовать прокариотические и эукариотические организмы, как «биологические фабрики» для производства инсулина, интерферона, гормона роста, вирусных антигенов и др. Микроорганизмы стали использоваться как естественные «биореакторы», в которых экспрессируются новые или измененные гены, которые никогда не могли бы быть получены методами мутагенеза или скрещивания.

Основные проблемы при использовании молекулярных методов связаны с низкой эффективностью экспрессии экзогенной ДНК в клетках микроорганизмов, а также с преждевременной деградацией продуктов трансляции. Наконец, серьезной проблемой является токсичность синтезируемых белков или продуктов их реакции для микроорганизмов из-за нарушения метаболизма. Разработка новых векторных конструкций для переноса ДНК, совершенствование методов трансформации и ко-трансформации клеток, оптимизация условий синтеза чужеродных белков в клетках

имеют большое значение как для фундаментальных исследований по молекулярной микробиологии и биохимии, так и для практического применения. Именно на решение этих проблем были направлены наши исследования.

В последние годы значительно вырос интерес к изучению, а также практическому использованию олигосахаридов (как конъюгированных, так и свободных) (Aam et al., 2010; Mourya et al., 2011). Это связано с особой ролью олигосахаридов в процессах межклеточного взаимодействия, в основе которых лежит узнавание этих соединений поверхностными рецепторами клеток у различных организмов (Gagneux, Varki, 1999). Конъюгированные олигосахариды входят в состав гликопротеинов и гликолипидов, углеводные части которых являются специфическими лигандами для многих рецепторов. Свободные олигосахариды также вовлечены в лиганд-рецепторные взаимодействия, выполняя во многих случаях функцию сигнальных молекул, регулирующих различные биохимические, иммунологические и морфогенетические процессы. Основной проблемой при изучении функций олигосахаридов является невозможность выделить их в интактном виде и достаточном количестве из биологического материала.

Отдельную группу составляют олигосахариды, которые содержат в своем составе аминосахара D-глюкозамин, D-галактозамин, а также И-ацетил-В-глюкозамин и N-ацетил-Б-галактозамин. Эти соединения выполняют ряд важных функций у различных организмов. У человека конъюгированные с гликопротеинами и гликолипидами мембран эритроцитов олигосахариды, состоящие из остатков N-ацетил-О-галактозамина, определяют специфичность групп крови (АВО система) (Yamamoto et al, 1990). Олигосахариды грудного молока, содержащие в своем составе М-ацетил-О-глюкозамин, действуют как ростовые факторы для Bifidobacterium bifidum и, вместе с тем, участвуют в подавлении развития патогенной микрофлоры Shigella sp., Helicobacter jejuni, Vibrio cholerae, Salmonella sp. (подавление адгезии бактерий в результате лиганд - рецепторных взаимодействий) (Kunz et al., 2000).

У представителей высших растений семейства бобовых (сем. Leguminosae) олигосахариды, состоящие из трех - шести остатков N-ацетил-О-глюкозамина и декорированные жирной кислотой на невосстанавливающем конце молекулы (Nod-факторы), выполняют роль сигнальных молекул. Олигосахаридная часть Nod-фактора представляет собой хитоолигосахарид, поскольку содержит в своем составе подобно полимеру хитину только остатки Ы-ацетил-О-глюкозамина. Синтезируемые симбиотическими бактериями Nod-факторы способны стимулировать развитие специализированных органов - азотфиксирующих корневых клубеньков, действуя в наномолярных концентрациях (Spaink et al., 1991). В результате связывания этих

соединений со специфичными рецепторами растений активируется целый комплекс регуляторных белков и гормонов, что приводит к органогенезу клубеньков. Возможность активации внеклеточными олигосахаридами рецепторов самого растения указывает на наличие у них сходных по структуре эндогенных соединений, влияющих на морфогенез и дифференцировку тканей. Поиск таких олигосахаридов в растении в настоящее время продолжается.

Олигосахариды, состоящие из остатков 1М-ацетил-0-глюкозамина, играют важную роль в эмбриогенезе позвоночных животных (Semino et al., 1996; Bakkers et al., 1997). В геноме пресноводных рыб Danio rerio семейства карповых Cyprinidae, а также в геноме мышей были выявлены близкие гомологи гена DG42 Xenopus, контролирующего синтез олигосахаридов, состоящих из остатков N-ацетил-О-глюкозамина (Ryan, Farmer, 1991; Semino et al., 1996; Kamst et al., 1999). Было показано, что выявленные гены влияли на раннее развитие эмбрионов (Semino, Allende, 2000). Сравнительный анализ показал гомологию между белком DG42 Xenopus и белком-ферментом ризобий NodC (N-ацетилглюкозаминилтрансферазой, контролирующей синтез хитоолигосахаридных молекул Nod-факторов) (Sargent, Dawid, 1983; Geremia et al., 1994). Более того, введение гена ризобий, вовлеченного в синтез хитоолигосахаридов, в эмбрионы рыб и мышей оказывало значительное влияние на их развитие, что подтвердило предположение об участии хитоолигосахаридов в контроле эмбриогенеза у позвоночных животных (Bakkers et al., 1997; Semino et al., 1998).

У низших растений, грибов и беспозвоночных животных (в основном, членистоногих - насекомых и ракообразных) выявлены как олигосахариды, так и полисахариды, состоящие из остатков аминосахаров. Полисахариды представлены, главным образом, такими соединениями как хитин и его деацетилированное производное хитозан, мономерными единицами которых являются Ы-ацетил-О-глюкозамин и D-глюкозамин, соответственно связанными между собой р-1,4-гликозидными связями. Эти соединения выполняют опорные и механические функции в организмах низших растений, грибов и беспозвоночных животных. Под влиянием целого комплекса ферментов полимеры хитин и хитозан могут быть расщеплены до низкомолекулярных производных, включая хитоолигосахариды (олигомеры хитина и хитозана).

Хитоолигосахариды обладают рядом уникальных свойств, оказывая специфичное воздействие на бактерии, высшие растения, человека и позвоночных животных. Известно, что некоторые хитоолигосахариды обладают противовоспалительным, антибактериальным и противоопухолевым действием (Harish Prashanth, Tharanathan, 2005; Xu et al., 2008; Simunek et al., 2010; Venkatesan et al., 2010). Олигомеры хитозана (n = 10 -

30) используются в качестве носителей для транспортировки белков, ДНК и лекарственных соединений через мембрану (Thanou et al., 2002; Koping-Hoggard et al., 2004). Кроме того, хитоолигосахариды способны индуцировать защитные реакции при взаимодействии с растениями (являются сигнальными молекулами - элиситорами) (Albersheim et al., 1983; Khan et al., 2003), а также обладают ростстимулирующим действием по отношению ко многим растениям. Применение этих соединений и их модифицированных аналогов для развития устойчивости растений к фитопатогенам и стимуляции роста является перспективным направлением в практике защиты растений. При этом хитоолигосахариды не токсичны в высоких концентрациях и легко утилизируются, что делает их применение предпочтительным по сравнению с химическими соединениями. Известно, что элиситорная и ростстимулирующая активность хитоолигосахаридов по отношению к растениям проявляется при степени полимеризации молекул не менее 5-6 остатков N-ацетил-О-глюкозамина.

Необходимость изучения олигосахаридов, состоящих из остатков аминосахаров, а также широкие возможности для практического использования этих соединений, определяют необходимость разработки подходов к их получению в достаточно больших количествах. Химический и ферментативный гидролиз полимеров малоэффективен для получения олигосахаридов с необходимой степенью полимеризации и определенными химическими модификациями, так как в результате этого процесса получают смесь соединений, часто с неопределенной структурой, что предполагает дальнейшие очистку и анализ структуры полученных соединений. Химический синтез олигосахаридов является очень сложной задачей, так как в процессе синтеза необходимо проводить стабилизацию и защиту активных групп на всех этапах, что делает синтез соединений со степенью полимеризации больше трех нецелесообразным (Boons, 1996; Кочетков, 2000). Ферментативный синтез олигосахаридов может иметь ряд преимуществ (Ruffing et al., 2006 a, b). В процессе биосинтеза могут быть решены такие проблемы синтеза олигосахаридов как региоспецифичность (формирование олигомеров, состоящих только из одного типа ан ом еров) и стереоспецифичность (образование только (3-1-4-гликозидной связи между мономерами), что позволяет получать соединения со строго определенной структурой. Для биосинтеза преимущественно используют ферменты гликозилтрансферазы, контролирующие образование гликозидной связи в результате трансгликозилирования, при этом донорами гликозильных остатков могут быть нуклеотиды и фосфаты Сахаров (Endo, 2000; Perugino et al., 2004; Murata, Usui, 2006). Основные трудности при проведении ферментативного синтеза связаны с выделением ферментов из природных источников. Однако гетерологичная экспрессия

гликозилтрансфераз в клетках микроорганизмов, животных или растений может решить проблему биосинтеза олигосахаридов (Ruffing et al., 2006).

Основной задачей нашей работы являлась разработка подходов для биосинтетического получения хитоолигосахаридов - соединений, имеющих важное практическое применение в медицине, биотехнологии, сельском хозяйстве и других областях. У клубеньковых бактерий порядка Rhizobiales выявлена уникальная гликозилтрансфераза - N-ацетилглюкозаминилтрансфераза, контролирующая синтез сигнальных молекул Nod-факторов (Spaink et al., 1991; Geremia, 1994; Kamst et al., 1995; Mergaert et al., 1995). Этот фермент способен катализировать синтез хитоолигосахаридов, составляющих основу Nod-факторов и состоящих из определенного числа остатков N-ацетил-й-глюкозамина (п = 4 - 6), что может быть удобным для получения соединений с определенной степенью полимеризации. Хитоолигосахариды со степенью полимеризации не менее 5 и 6 остатков М-ацетил-О-глюкозамина проявляют элиситорную и ростстимулирующую активность по отношению к растениям. Для синтеза таких соединений мы предложили использовать фермент N-ацетилглюкозаминилтрансферазу двух видов ризобиальных бактерий - Rhizobium sp. GRH2 (симбионт акации) и Mesorhizobium loti (симбионт лядвенца). Rhizobium sp. GRH2 способен осуществлять синтез Nod-факторов, состоящих из шести остатков N-ацетилглюкозамина (наряду с пентамерами), a M. loti синтезирует строго пентамерные молекулы (Lopez-Lara et al., 1993, 1995). Следовательно, ферменты этих бактерий контролируют синтез гекса- и пентамерных хитоолигосахаридов, что можно использовать для биосинтетических целей.

У ризобий выявлен другой уникальный фермент хитоолигосахарид деацетилаза, способный деацетилировать олигомеры хитина по N-терминальному положению (John et al., 1993; Spaink et al., 1994; Mergaert et al., 1995; Roche et al., 1996). Этим фермент отличается от деацетилазы грибов, которая деацетилирует все остатки аминосахаров. С помощью хитоолигосахарид деацетилазы можно получить терминально N-деацетилированные хитоолигосахариды, что позволило бы ковалентно присоединять к ним через аминогруппу различные соединения. Это свойство может быть использовано для облегчения переноса различных соединений (в частности, лекарственных веществ) в клетку за счет их конъюгации с олигомерами хитина. Известно, что олигомеры хитина с низкой степенью полимеризации (п < 10) свободно проникают через мембраны клеток по механизму облегченной диффузии. Это позволяет рассчитывать, что конъюгация олигомеров с лекарственными соединениями откроет путь для получения препаратов, эффективных при существенно более низких концентрациях. Синтез монодеацетилированных олигомеров хитина химическим путем практически невозможен

из-за одинаковой химической активности аминогрупп в сахарных остатках, что не позволяет проконтролировать степень прохождения реакции деацетилирования. Именно поэтому перед нами стояла задача биосинтетического получения терминально N-деацетилированных олигомеров хитина.

Ранее была осуществлена гетерологичная экспрессия фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы ризобий, синтезирующих преимущественно тетра- и пентамерные молекулы (Kamst et al., 1997; Samain et al., 1997; Bettler et al., 1999; Koizumi, 2003). Такие исследования позволили детально изучить свойства ферментов отдельных видов ризобий и их роль в процессе синтеза Nod-факторов. В нашей экспериментальной работе впервые была предпринята попытка синтезировать гексамерные хитоолигосахариды, а также добиться высокого уровня синтеза пентамерных хитоолигосахаридов, поскольку эти соединения непосредственно могут быть использованы в качестве эффективных элиситоров и стимуляторов для развития растений. Кроме того, мы планировали получить штаммы Е. coli, с помощью которых можно было бы синтезировать монодеацетилированные олигомеры хитина, которые в перспективе могут быть использованы для конъюгации с биологически активными веществами.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационной работы являлось изучение возможности биосинтеза гекса-и пентамерных хитоолигосахаридов, а также деацетилированных по терминальному положению хитоолигосахаридов с помощью уникальных ферментов ризобий.

Задачами работы являлись:

1. Получение генетических конструкций, содержащих последовательности полноразмерных генов nodC, кодирующих N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, двух видов ризобий Rhizobium sp. GRH2 и Mesorhizobium loti 1803.

2. Оптимизация условий для эффективного синтеза олигомеров хитина, состоящих из пяти и шести остатков N-ацетилглюкозамина, в клетках Е. coli, трансформированных конструкциями для экспрессии N-ацетилглюкозаминилтрансферазы.

3. Разработка методов выделения и анализа синтезированных олигомеров хитина методами ВЭЖХ и масс-спектрометрии.

4. Тестирование способности олигомеров хитина (п = 5, 6), полученных в процессе биосинтеза, индуцировать у растений защитные реакции (образование активных форм кислорода и экспрессию фермента фенилаланин-аммоний-лиазы).

5. Анализ способности хитоолигосахаридов индуцировать устойчивость у ячменя и томата к фитопатогенному грибу Fusarium culmorum.

6. Биосинтез терминально N-деацетилированных хитоолигосахаридов с помощью ферментов ризобий N-ацетилглюкозаминилтрансферазы и хитоолигосахарид деацетилазы.

Научная новизна. В ходе выполнения данной работы была определена нуклеотидная последовательность ранее не известного гена nodC Rhizobium sp. GRH2, а также получены конструкции, содержащие полноразмерный ген этого вида ризобий, с помощью которых впервые биосинтетическим способом получены гексамерные хитоолигосахариды (п = 6). В процессе биосинтеза получена тетра-]М-ацетилхитопентаоза (деацетилированная по терминальному остатку хитопентаоза), которая может быть использована для конъюгации с биологически активными веществами.

Практическая ценность. Полученные в процессе работы штаммы-продуценты хитоолигосахаридов могут быть использованы для синтеза олигомеров хитина in vivo (в клетках микроорганизмов) из простых предшественников, либо для очистки экспрессируемых ферментов и синтеза олигомеров хитина in vitro. Разработанные подходы позволили осуществить синтез достаточно значительных количеств хитоолигосахаридов (до 100 мг на 1 л бактериальной культуры). Таким образом, полученные штаммы и разработанные подходы для синтеза хитоолигосахаридов позволят значительно снизить затраты на производство этих соединений.

Показана способность синтезированных хитоолигосахаридов вызывать активацию защитных систем растения, которая определяет развитие устойчивости растений к фитопатогенным грибам. Полученные соединения могут быть использованы в качестве эффективных элиситоров растений.

По результатам работы получен патент РФ на изобретение № 2460800 от 04.08.2010.

Выполнение работы было поддержано;

грантами РФФИ-офи 08-04-12214, РФФИ 07-08-00700-а, РФФИ 12-08-01044-а, Министерством образования и науки (ГК № 16.512.11.2183, соглашение № 8056), грантом Президента РФ для поддержки научных школ (соглашение № 16.120.11.337-НШ), грантами Комитета по науке и высшей школе г. Санкт Петербурга за 2008, 2009, 2010.

Апробация работы. По результатам работы были представлены доклады на 11 международной конференции "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана" (РосХит 2012) в 2012 (г. Мурманск), 17 международном конгрессе по азотфиксации в 2011, г. Перт, Австралия, 10 международной конференции Европейского хитинового общества в 2011, г. Санкт-Петербург, 10 международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (РосХит 2010) в 2010 (г.

Нижний Новгород), школе-конференции для аспирантов AB-RMS («Агробиотехнология в корневых-микробных системах») в рамках программы NOVA University Network в 2008 (г. Тюне, Дания), VIII Санкт-Петербургской Ассамблеи молодых ученых и специалистов в 2008, г. Санкт-Петербург.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ (4 статьи и 1 патент) и 5 тезисов докладов на российских и международных научных конференциях.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа включает в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и их обсуждение, выводы, список литературы (234 источника). Работа изложена на 127 страницах, содержит 37 рисунков и 5 таблиц.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Леппянен, Ирина Викторовна

107 Выводы

1. Выявлена последовательность гена nodC Rhizobium sp. GRH2, кодирующего фермент N-ацетилглюкозаминилтрансферазу. Осуществлена эффективная гетерологичная экспрессия фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы двух видов ризобий в клетках Е. coli с помощью генетических конструкций pRSETb-RhGRH2nodC, pRSETb-MlnodC, p\JC\9-RhGmi2nodC, pUC19-MlnodC, содержащих полноразмерные гены nodC Rhizobium sp. GRH2 и M. loti 1803.

2. Получена в растворимом виде в Е. coli редуцированная форма фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, представляющая собой каталитический домен, которая использована для синтеза олигомеров хитина in vitro.

3. С помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Rhizobium sp. GRH2 осуществлен синтез in vivo гекса-Ы-ацетилхитогексаозы и пента-N-ацетилхитопентаозы (до 20 - 30 мг на литр бактериальной культуры), высокий уровень синтеза п е нта-N-а цет и л х ито п е н таозы (до 100 мг на 1 л) достигнут при использовании фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы M. loti 1803.

4. Синтезирован терминально N-деацетилированный хитоолигосахарид - тетра-N-ацетилхитопентаоза - при культивировании штамма Е. coli, экспрессирующего одновременно два фермента M. loti N-ацетилглюкозаминилтрансферазу и хитоолигосахарид деацетилазу.

5. Анализ изменений в уровне экспрессии генов Pal, кодирующих защитный фермент фенилаланинаммонийлиазу показал, что элиситорная активность олигомеров хитина, полученных биосинтетическим способом, сравнима с активностью коммерческих аналогов этих соединений.

6. Показана способность олигомеров хитина, полученных биосинтетическим способом, снижать заболеваемость фузариозом растений томата и ячменя.

Заключение

В ходе проведенных исследований была изучена возможность ферментативного синтеза хитоолигосахаридов со степенью полимеризации 5 и 6 остатков N-ацетилглюкозамина, а также терминально N-деацетилированных хитоолигосахаридов с помощью уникальных ферментов N-ацетилглюкозаминилтрансферазы и хитоолигосахарид деацетилазы двух видов ризобиальных бактерий Rhizobium sp. GRH2 и Mesorhizobium loti 1803.

На первом этапе исследований нами был впервые клонирован ген nodC Rhizobium sp. GRH2, кодирующий фермент N-ацетилглюкозаминилтрансферазу, последовательность которого ранее не была известна. Сравнительный анализ последовательности выявленного гена с известными ранее последовательностями генов nodC других штаммов ризобий показал наиболее высокий процент сходства с геном nodC S. meliloti GVPV12 (76% сходства), Sinorhizobium sp. BR816 (75,6%), Rhizobium sp. N33 (74%), M. loti MAFF303099 (70%). Нами также была определена последовательность гена nodC для использованного в работе штамма M. loti 1803. Полноразмерные гены nodC двух видов ризобий были использованы для получения генетических конструкций в векторах pRSETb и pUC19 -pRSETb-i?/zGRH2«o

При гетерологичной экспрессии в клетках Е. coli нам удалось добиться высокого уровня экспрессии фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы двух видов ризобий. При сравнении уровней синтеза рекомбинантных белков, полученных с помощью двух разных векторов, было показано, что белок экспрессировался на более высоком уровне при использовании конструкции в векторе pRSETb, в котором клонированный ген фермента находился под контролем промотора Т7. Однако при этом большая часть белка присутствовала в виде нерастворимых образований телец включения. При использовании конструкции в векторе pUC19 (промотор гена LacZ) уровень экспрессии был ниже, но весь белок был сосредоточен, главным образом, в мембранной фракции.

При экспрессии в клетках Е. coli конструкции pRSETb-Mf«oi/C-KD, содержащей фрагмент гена nodC, кодирующий каталитический домен фермента, нам впервые удалось подобрать условия для синтеза белка в растворимой форме. Было показано, что такой растворимый фермент после очистки можно непосредственно использовать для синтеза хитоолигосахаридов in vitro.

Для синтеза хитоолигосахаридов штаммы Е. coli, несущие конструкции с клонированным полноразмерным геном nodC двух видов ризобий, инкубировали в среде с субстратом N-ацетилглюкозамином. Было показано, что уровень синтеза хитоолигосахаридов отличается при использовании разных штаммов. При культивировании бактерий Е. coli DH5a, несущих плазмиду pUC19-/?/zGRH2no¿/C со встроенным геном nodC Rhizobium sp. GRH2, в присутствии предшественника были синтезированы гекса-Ы-ацетилхитогексаоза и пента-Ы-ацетилхитопентаоза. После культивирования в течение 24 ч основным синтезируемым продуктом была пентаоза, а после 48 ч - гексаоза. Количество синтезируемых хитоолигосахаридов составляло до 20 -30 миллиграмм на литр бактериальной культуры.

При культивировании бактерий Е. coli DH5a, несущих плазмиду pUC19-MlnodC со встроенным геном nodC M. loti 1803, была синтезирована пента-1Ч-ацетилхигопентаоза, количество которой в среднем составляло до 100 миллиграмм на литр бактериальной культуры. Таким образом, мы показали, что рекомбинантные ферменты обладают всеми свойствами нативных ферментов и могут быть использованы для синтеза двух типов хитоолигосахаридов - гекса-И-ацетилхитогексаозы и пента-М-ацетилхитопентаозы. Синтез хитоолигосахаридов происходил внутри клеток культивируемых бактерий, без выделения в среду культивирования.

Напротив, при использовании культуры клеток Е. coli, содержащих плазмиду pRSETb-7?/zGRH2/ioö?C или ^RSETh-MlnodC, нам не удалось выявить сколько-нибудь значительного синтеза хитоолигосахаридов. Таким образом, при использовании разных векторов для создания конструкций уровень активности рекомбинантных белков при экспрессии в Е. coli может быть разным. Синтез хитоолигосахаридов in vivo происходит эффективнее при невысоком уровне экспрессии рекомбинантного фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы.

Для очистки синтезированных соединений использовали метод ВЭЖХ, при этом нам удалось подобрать оптимальные условия для эффективного разделения хиоолигосахаридов, отличающихся по степени полимеризации. Для подтверждения того, что синтезированные в клетках Е. coli соединения являются гекса-]Ч-ацетилхитогексаозой и пента-М-ацетилхитопентаозой, нами был использован метод масс-спектрометрии. Проведенный анализ показал присутствие соединений с соотношением массы к заряду (m/z) равным 1259,5 и 1056,7, что соответствовало массе гекса-М'-ацетилхитогексаозы и пента-М-ацетилхитопентаозы.

На следующем этапе исследований были проанализированы элиситорная и биологическая активность полученных биосинтетическим способом олигомеров хитина. С этой целью был проведен анализ изменений в уровне экспрессии генов Pal, кодирующих фермент фенилаланинаммонийлиазу, а также образования активных форм кислорода -Ог\ Н2О2, ОН", у обработанных и не обработанных этими соединениями растений томата и гороха. В качестве контроля использовали коммерческие аналоги олигомеров хитина со степенью полимеризации п = 5 и 6. Исследования показали, что полученные биосинтетическим способом хитоолигосахариды вызывают значительную индукцию экспрессии генов Pal у проростков томата S. licopersicum, но не стимулируют экспрессию генов Pal у проростков гороха P. sativum L., для которого по литературным данным эффективными элиситорами являются олигомеры хитозана со степенью полимеризации п = 8-10. Таким образом, было показано, что элиситорная активность олигомеров хитина, полученных биосинтетическим способом, соответствует активности коммерческих аналогов. Проведенный анализ образования АФК в ответ на обработку хитоолигосахаридами показал, что оба вещества являются эффективными индукторами образования АФК как у растений томата, так и гороха. Это позволяет сделать вывод о том, что анализ изменения экспрессии гена Pal у растений может быть более специфичным тестом при оценке влияния на растения хитоолигосахаридов различной структуры, чем тест на изменение уровня образования АФК.

На следующем этапе нашей работы было изучено влияние предобработки растений хитоолигосахаридами, полученными биосинтетическим способом, на развитие устойчивости растений томата и ячменя к фитопатогенным грибам (биологическая активность). Проведенный анализ показал, что предварительная обработка хитоолигосахаридами растений позволяет значительно уменьшить проявление признаков заболеваемости фузариозом - поражение корней гнилями, подавление развития корневой системы. У растений томата, предварительно обработанных хитоолигосахаридами перед заражением фитопатогенным грибом F. culmorum, признаки заболевания практически полностью отсутствовали. У растений ячменя происходило значительное снижение уровня заболеваемости. Кроме того, в наших экспериментах было показано, что хитоолигосахариды способны оказывать ростстимулирующее действие на обработанные растения. Длина корней проростков томата, которые были предварительно обработаны хитоолигосахаридами перед заражением, превышала длину корней необработанных растений на 11 сутки в 4,6 и 3,8 раз, соответственно. Разница была заметна и на 17 сутки после обработки, длина корней томата была больше, чем у необработанных растений в 1,3 - 1,5 раза. Длина корней проростков ячменя, обработанных пента-К-ацетилхитопентаозой и гекса-М-ацетилхитогексаозой, также превышала длину корней необработанных растений в 1,5 и 1,7 раза соответственно.

Нами не было выявлено прямого фунгицидного действия олигомеров хитина на грибы F. culmorum. Таким образом, снижение признаков заболеваемости фузариозом растений, обработанных хитоолигосахаридами, было связано с активацией защитных систем растений, но не с фунгицидным действием этих соединений непосредственно на фитопатогенные грибы.

Важной задачей нашей работы являлось получение терминально N-деацетилированных хитоолигосахаридов. Для этого были получены штаммы Е. coli, экспрессирующие одновременно два фермента: N-ацетилглюкозаминилтрансферазу (NodC) и хитоолигосахарид деацетилазу (NodB). В нашей работе были использованы две стратегии получения деацетилированных соединений: синтез с использованием отдельных конструкций для каждого гена (с помощью плазмид рК18, содержащей ген MlnodB и pUC19, содержащей ген MlnodC) и синтез хитоолигосахаридов с помощью ферментов, экспрессирующихся с помощью одной конструкции, содержащей оба гена.

При культивировании бактерий Е. coli, содержащих плазмиду pUC19-MlnodC-MlnodB, были получены соединения, анализ которых методом масс-спектрометрии показал присутствие вещества с соотношением массы к заряду (m/z) 1056.7 (ацетилированная пента-Ы-ацетилхитопенгаоза), а также впервые - с m/z, равному 996,4. Таким образом, нам впервые удалось получить с помощью ферментов M. loti терминально деацетилированную хитопентаозу (тетра-]\1-ацетилхитопентаозу).

На основании полученных результатов были сделаны следующие выводы:

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Леппянен, Ирина Викторовна, 2013 год

Список литературы

1. Андрианова Л.Е., Силуянова С.Н. Биохимия межклеточного матрикса // Биохимия: учебник для вузов / под ред. Е.С. Северина. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2003. - 779 с.

2. Белооков A.A. Базовые лекции по курсу «Основы биотехнологии переработки сельскохозяйственной продукции». - Троицк: УГАВМ, 2006. - 112 с.

3. Евтушенков А. Н., Фомичев Ю. К. Введение в биотехнологию. Курс лекций. -Минск: БГУ. 2002.

4. Журавлева Н.В. и Лукьянов П.А. Хитинолитические ферменты: источники, характеристика и применение в биотехнологии // Вестник ДВО РАН. 2004. №4. С. 7686.

5. Ильина A.B., Варламов В.П., Мелентьев А.И. Актуганов Т.Е. Деполимеризация хитозана хитинолитическим комплексом бактерии рода Bacillus sp. 739 // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т. 37. С. 160-163.

6. Ильина A.B., Варламов В.П., Тихонов В.Е., Ямсков И.А., Даванков В.А. Выделение высокоочищенной хитиназы Streptomyces kurssanovii на модифицированном хитине // Биотехнология. 1993. № 2. С. 25-28.

7. Ильина A.B., Татаринова Н.Ю., Тихонов В.Е., Варламов В.П. Внеклеточные протеиназа и хитиназа, продуцируемые культурой Streptomyces kurssanovii //Прикладная биохимия и микробиология. 2000. Т. 36. № 2. С. 173-177.

8. Ильина A.B., Ткачева Ю.В., Варламов В.П. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом Целловиридин Г20х // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. Т. 38. С. 132-135.

9. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия: Пер. с нем. - М.: Мир. 2000. - 469 с.

10. Кочетков Н. К.. Твердофазный синтез олигосахаридов и гликоконъюгатов // Успехи химии. 2000. Т. 69. № 9. С. 869-89.

11. Маслова Г.В. Теоретические аспекты и технология получения хитина электрохимическим способом // Рыбпром. 2010. № 2. С. 17-22.

12. Новиков В.Ю. Химический гидролиз хитина и хитозана. Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана // Материалы Седьмой Междунар конф. - М.: Изд-во ВНИРО, 2003. С. 38-42.

13. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. - М.: Наука, 2000. - 830 с.

14. Семенова М. Л. Зачем нужны трансгенные животные // Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7 . № 4. С. 13-20.

15. Скрябин К. Г., Вихорева Г. А., Варламов В. П. (Ред.). Хитин и хитозан. Получение, свойства, применение. - М: Наука. 2002.

16. Танский В. И., Левитин М. М., Павлюшин В. А., Буров В. Н., Гончаров Н. Р., Ишкова Т. И., Сухорученко Г. И., Зубков А. Ф. Экологический мониторинг и методы совершенствования защиты зерновых культур от вредителей, болезней и сорняков (Методические рекомендации). СПб. ВИЗР. 2002. 76 с.

17. Тихонович И.А., Проворов Н.А. Принципы селекции растений на взаимодействие с симбиотическими микроорганизмами // Вестник ВОГиС. 2005. Т. 9. № 3. С. 295-305.

18. Турчинович А.А., Дейнеко Е.В., Филипенко M.JL, Храпов Е.А., Шумный В.К. Трансгенные растения как биопродуценты белков медицинского назначения// Информационный вестник ВОГиС. 2004. №28. [Электронная версия журнала] / Режим доступа: http://www.bionet.nsc.ru/vogis/vestnik.php?f=2004&p=28 1, свободный.

19. Ааш В. В., Heggset Е. В., Norberg A. L., Serlie М., Várum К. М. and Eijsink V. G. Н. Production of Chitooligosaccharides and Their Potential Applications in Medicine // Marine Drugs. 2010. V. 8. P. 1482-1517.

20. Agathos S.N. Production scale insect cell culture // Biotechnol Adv. 1991. V. 9. P. 51-68.

21. Albersheim P., Darvill A.G., McNeil M., Valent В., Sharp J.K. Oligosaccarins, naturally occurring carbohydrates with biological regulatory functions // Structure and Function of Plant Genomes/ Eds. Ciferri O., Dure I. L.. New York. Plenum. 1983. P. 293 - 312.

22. Alfonso C., Nuero O.M., Santamaría F., Reyes F. Purification of a heat-stable chitin deacetylase from Aspergillus nidulans and its role in cell wall degradation // Curr Microbiol. 1995. V. 30. P. 49-54.

23. Alibolandi M., Mirzahoseini H., Nehi F. M., Tabatabaian G., Amini H. and Sardari S. Improving recombinant protein solubility in Escherichia coli: Identification of best chaperone combination which assists folding of human basic fibroblast growth factor // African Journal of Biotechnology. 2010. V. 9. № 47. P. 8100-8109.

24. Allan C. and Hadwiger L.A. The fungicidal effect of chitosan on fungi of varying cell wall composition// Exp Mycol. 1979. V. 3. P. 285-287.

25. Awais M., Shah A. A., Hameed A. and Hasan F. Isolation, Identification and Optimization of Bacitracin Produced by Bacillus sp. // Pak J Bot. 2007. V. 39. № 4. P. 1303-1312.

26. Azaman S.N.A., Ramanan R. N., Tan J. S., Rahim R. A., Abdullah M. P. and Ariff A. B. Screening for the optimal induction parameters for periplasmic producing interferon-a2b in Escherichia coli // African Journal of Biotechnology. 2010. V. 9. № 38. P. 6345-6354.

27. Aziz A., Trotel-Aziz P., Dhuicq L., Jeandet P., Couderchet M., and Vernet G. Chitosan Oligomers and Copper Sulfate Induce Grapevine Defense Reactions and Resistance to Gray Mold and Downy Mildew // Disease Control and Pest Management. 2006. V. 96. №11. P. 1188- 1194.

28. Bakkers J., Semino C. E., Stroband H., Kijne J. W., Robbins P. W., and Spaink H. P. An important developmental role for oligosaccharides during early embryogenesis of cyprinid fish// Proc Natl Acad Sci USA. 1997. V. 94. P. 7982-7986.

29. Baneyx F. Recombinant protein expression in Escherichia coli II Curr Opin' Biotechnol. 1999. V. 10. №5. P. 411-421.

30. Barber M. S., Bertram R. E., Ride J. P. Chitin oligosaccharides elicit lignification in wounded wheat leaves // Physiological and molecular plant pathology. 1989. V. 34. №1. P. 3-12.

31. Barny M.A. and Downie J.A. Identification of the NodC protein in the inner but not the outer membrane of Rhizobium leguminosarum // Mol Plant-Microbe Interact. 1993. V. 6. P. 669-672.

32. Baureithel K., Felix G., and Boll T. Specific, High Affinity Binding of Chitin Fragments to Tomato Cells and Membranes//The Journal of Biological Chemistry. 1994. V. 269. № 27. P. 17931-17938.

33. Bec-Ferte M. P., Krishnan H. B., Savagnac A., Pueppke S. G., Prome J.-C. Rhizobium fredii synthesizes an array of lipooligo-saccharides, including a novel compound with glucose inserted into the backbone of the molecule // FEBS Lett. 1996. V. 393. P. 273-279.

34. Benhamou N., Lafontaine P. J., and Nicol M. Induction of systemic resistance to Fusarium crown and root rot in tomato plants by seed treatment with chitosan// Phytopathology. 1994. V. 84. P. 1432-1444.

35. Bettler . E., Samain E., Chazalet V., Bosso C., Heyraud A., Joziasse D.H., Wakarchuk W.W., Imberty A., Geremia A.R. The living factory: in vivo production of N-acetyllactosamine containing carbohydrates in E. coli 11 Glycoconjugate J. 1999. V. 16. P. 205-212.

36. Birnboim H.C., and Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA //Nucleic Acids Research. 1979. V. 7. P. 1513-1523.

37. Bisbee C.A. Current perspectives on manufacturing and scaleup of biopharmaceuticals // Gen Eng News. 1993. V. 13. P. 8-10.

38. Blattner F., Plunkett G., Bloch C., Perna N.. Burland V., Riley M., Collado-Vides J., Glasner J., Rode C., Mayhew G., Gregor J., Davis N., Kirkpatrick H., Goeden M., Rose D.,

Mau B. and Shao Y. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12 // Science. 1997. V. 277. P. 1453-1474.

39. Boehm G. and Stahl B. Oligosaccharides from Milk // The Journal of Nutrition. 2007. P. 847 - 849.

40. Boons G.-J. Strategies in oligosaccharide synthesis // Tetrahedron. 1996. V. 52. P. 10951121.

41. Boot K. J. M., van Brussel A. A. N., Tak T., Spaink H. P. and Kijne J. W. Lipochitin oligosaccharides from rhizobium leguminosarum bv. viciae reduce auxin transport capacity in Vicia sativa subsp. nigra roots//MPMI. 1999. V.12. № 10. P. 839-844.

42. Bowen A. R., Chen-Wu J. L., Momany M., Young R., Szaniszlo P. J., Robbins P. W. Classification of fungal chitin synthases // Proc Natl Acad Sci USA. 1992. V. 89. P. 519523.

43. Biihler T.A., Bruyère T., Went D.F., Stranzinger G., Biirki K. Rabbit beta-casein promoter directs secretion of human interleukin-2 into the milk of transgenic rabbits // Biotechnology. 1990. V. 8. № 2. P. 140-143.

44. Bulawa C.E. and Wasco W. Chitin and nodulation // Nature. 1991. V. 353. P. 710.

45. Bulawa C.E. Genetics and Molecular biology of chitin synthesis in fungi // Annu Rev Microbiol. 1993. V. 47. P. 505-534.

46. Bulawa C. E. CSD2, CSD3, and CSD4, Genes Required for Chitin Synthesis in Saccharomyces cerevisiae: the CSD2 Gene Product Is Related to Chitin Synthases and to Developmental 1 y Regulated Proteins in Rhizobium Species and Xenopus laevis // Molecular and Cellular Biology. 1992. V. 12. № 4. P. 1764-1776.

47. Cabrera J. C., Messiaen J., Cambier P., and Van Cutsem P. Size, acetylation and concentration of chitooligosaccharide elicitors determine the switch from defence involving PAL activation to cell death and water peroxide production in Arabidopsis cell suspensions // Physiologia Plantarum. 2006. V. 127. P. 44-56.

48. Carver A., Wright G., Cottom D., Cooper J., Dalrymple M., Temperley S., Udell M., Reeves D., Percy J., Scott A., et al. Expression of human alpha 1 antitrypsin in transgenic sheep // Cytotechnology. 1992. V. 9. № 1-3. P. 77-84.

49. Chain E., Florey H.W., Gardner A.D., Heatley N.G., Jennings M.A., Orr-Ewing J., Sanders A.G. Penicillin as a Chemotherapeutic Agent // The Lancet. 1940. V. 236. № 6104. P. 226 -228.

50. Chen-Wu J. L., Zwicker J., Bowen A. R., Robbins P. W. Expression of chitin synthase genes during yeast and hyphal growth phases of Candida albicans II Mol Microbiol. 1992. V. 6. P. 497-502.

51. Choi J.H. Lee S.Y. Secretory and extracellular production of recombinant proteins using Escherichia coli II Appl Microbiol Biotechnol. 2004. V. 64. P. 625-635.

52. Cohen S. N., Chang A. C. Y., and Hsu L. Nonchromosomal Antibiotic Resistance in Bacteria: Genetic Transformation of Escherichia coli by R-Factor DNA // Proc Nat Acad Sei USA. 1972. V. 69. № 8. P. 2110-2114.

53. Cohen S. N., Chang A. C. Y., Boyer H. W., and Helling R.B. Construction of Biologically Functional Bacterial Plasmids in vitro II Proc Nat Acad Sei USA. 1973. V. 70. № 11. P. 3240-3244.

54. Conrath U., Domard A., and Kauss H. Chitosan-elieited synthesis of callose and of coumarin derivatives in parsley cell suspension cultures//Plant Cell Reports. 1989. V. 8. P. 152-155.

55. Cornelis P. Expressing genes in different Escherichia coli compartments // Curr Opin Biotechnol. 2000. V. 11. N. 5. P. 450-454.

56. Cote F., and Hahn M.G. Oligosaccharins: structures and signal transduction // Plant Mol Biol. 1994. V. 26. P. 1379-1411.

57. Cregg J.M., Vedvick T.S., Raschke W.C. Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastor is II BioTechnology. 1993. V. 11. P. 905-910.

58. Da Sacco L. and Masotti A. Chitin and Chitosan as Multipurpose Natural Polymers for Groundwater Arsenic Removal and As203 Delivery in Tumor Therapy//Marine Drugs. 2010. №8. P. 1518-1525.

59. Dale C, Allen A, Fogarty S. Pichia pastoris: a eukaryotic system for the large-scale production of biopharmaceuticals // Biopharm. 1999. V. 12. № 11. P. 36-42.

60. Day R. B., Okada M., Ito Y., Tsukada K., Zaghouani H., Shibuya N. and Stacey G. Binding site for chitin oligosaccharides in the soybean plasma membrane//Plant Physiol. 2001. V.126. P.1162-1173.

61. De Jong A. J., Heidstra R., Spaink H. P., Hartog M. V., Hendriks T., Lo Schavio F., Terzi M., Bisseling T., van Kämmen A. & de Vries S. Rhizobium Lipooligosaccharides Rescue a Carrot Somatic Embryo Mutant // Plant Cell. 1993. V. 5. P. 615-620.

62. Debelle F., Plazanet C., Roche P., Pujol C., Savagnac A., Rosenberg C., Prome J.C., Denarie J. The NodA proteins of Rhizobium meliloti and Rhizobium tropici specify the N-acylation of Nod factors by different fatty acids // Mol Microbiol. 1996. V. 22. № 2. P. 303314.

63. Demain A. L. The business of biotechnology // Industrial Biotechnology. 2007. V. 3. № 3. P. 269-283.

64. Denarie J., Cullimore J. Lipo-oligosaccharide nodulation factors: a minireview new class of signaling molecules mediating recognition and morphogenesis // Cell. 1993. V.74. P. 951954.

65. Denarie J., Debelle F., Prome J.-C. Rhizobium lipochitooligosaccharide nodulation factors: signaling molecules mediating recognition and morphogenesis II Annu Rev Biochem. 1996. V. 65. P. 503-535.

66. Denman J., Hayes M., O'Day C., Edmunds T., Bartlett C., Hirani S., Ebert K.M., Gordon K., McPherson J.M. Transgenic expression of a variant of human tissue-type plasminogen activator in goat milk: purification and characterization of the recombinant enzyme. //Biotechnology (NY). 1991. V. 9. № 9. P. 839-843.

67. D'Haeze W., Holsters M. Nod factor structures, responses, and perception during initiation of nodule development // Glycobiology. 2002. V. 2. № 6. P. 79R-105R.

68. Dhugga K.S., Anderson P.C., Nichols S.E. Expression of chitin synthase and chitin deacetylase genes in plants to alter the cell wall for industrial uses and improved disease resistance. 2000. WO 2000/009729 A2.

69. Dinter S., Bunger U., Sieferi E. Enzymatic degradation of chitin by microorganisms // In: Advan Chitin Sci. M.G. Peter, A. Domard, R.A.A. Muzzarelli eds. University of Potsdam. 2000. V. 4. P. 506-510.

70. Dixon R. A., Harrison M. J. Activation, Structure, and Organization of Genes Involved in Microbial Defense in Plants // Advances in Genetics. 1990. V. 28. P. 165-234.

71.Doi R. H. Genetic Engineering in Bacillus subtilis II Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 1984. V. 2. P. 121-155.

72. Endo T., Koizumi S., Tabata K., Ozaki A. Large-scale production of CMP-NeuAc and sialylated oligosaccharides through bacterial coupling // Appl Microbiol Biotech. 2000. V. 53. P. 257-261.

73. Falcon-Rodriguez A. B., Wegria G. and Cabrera J.-C. Exploiting plant innate immunity to protect crops against biotic stress: chitosaccharides as natural and suitable candidates for this purpose // In: New Perspectives in Plant Protection, by Bandani A. R. 2012. Ch. 7. P. 139-166.

74. Fan W., Zhang M., Zhang H., Zhang P. Improved Tolerance to Various Abiotic Stresses in Transgenic Sweet Potato (Ipomoea batatas) Expressing Spinach Betaine Aldehyde Dehydrogenase // PLoS ONE. 2012. V. 7. № 5. e37344.

75. Faus I. Recent developments in the characterization and biotechnological production of sweet-tasting proteins // Appl Microbiol Biotech. 2000. V. 53. P. 145-151.

76. Fitzgerald D.A. Revving up the green express // Scientist. 2003. V. 17. № 14. P. 45-47.

77. Folch-Mallol J. L., Marroqui S., Sousa C., Manyani H., Lopez-Lara I. M., van der Drift K. M. G. M., Haverkamp J., Quinto C., Gil-Serrano A., Thomas-Oates J., Spaink H. P., Megias M. Characterization of Rhizobium tropici CIAT899 nodulation factors: the role of nodH and nodPQ genes in their sulfation // Mol Plant-Microbe Interact. 1996. V. 9. P. 151— 163.

78. Fuhrmann M. Oertel W., Hegemann P. A synthetic gene coding for the green fluorescent protein (GFP) is a versatile reporter in Chlamydomonas reinhardtii II Plant J. 1999. V. 19. P. 353-361.

79. Fujiwara M., Ichinomiya M., Montoyama T., Horiuchi H., Ohta A., Takagi M. Evidence that the Aspergillus nidulans Class I and Class II Chi tin synthase genes, chsC and chsA, share critical roles in hyphal wall integrity and conidiophore development // J Biochem. 2000. V. 127. P. 359-366.

80. Gagneux P., and Varki A. Evolutionary considerations in relating oligosaccharide diversity to biological function // Glycobiology. 1999. V. 9. № 8. P. 747-755.

81. Gao X.D., Katsumoto T., Onodera K. Purification and characterization of chitin deacetylase from Absidia coerulea IIJ Biochem. 1995. V. 117. P. 257-263.

82. Gayoso G., Pomar F., Novo-Uzal E., Merino M., de Ilarduya O. M. The Ve-mediated resistance response of the tomato to Verticillium dahliae involves H2O2, peroxidase and lignins and drives PAL gene expression//Plant Biology. 2010. V. 10. № 232. P. 1471-2229.

83.Geremia R. A., Mergaert P., Geelen D., Van Montagu M., and Holsters M. The NodC protein of Azorhizobium caulinodans is an A^-acetylglucosaminyltransferase // Proc Natl Acad Sci USA. 1994. V. 91. P. 2669-2673.

84. Gibson G. R. Functional foods: probiotics and prebiotics // Culture. 2007. V. 28. № 2. P. 17.

85. Giddings G., Allison G., Brooks D. and Carter A. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals // Nature Biotechnology. 2000. V. 18. P. 1151 - 1155.

86. Gil G.C., Velander W.H., Van Cott K.E. Analysis of the N-glycans of recombinant human Factor IX purified from transgenic pig milk // Glycobiology. 2008. V. 18. № 7. P. 526-539.

87. Gimenez-Ibanez S., Hann D. R., Ntoukakis V., Petutschnig E., LipkaV. and Rathjen J. P. AvrPtoB Targets the LysM Receptor Kinase CERK1 to Promote Bacterial Virulence on Plants // Current Biology. 2009. V. 19. № 5. P. 423-429.

88. Goethals K., Gao M., Tomekpe K., Van Montagu M., Holsters M. Common nodABC genes in Nod locus 1 of Azorhizobium caulinodans: nucleotide sequence and plant-inducible expression // Mol Gen Genet. 1989. V. 219. № 1-2. P. 289-298.

89. Goffeau A., Barrell B. G., Bussey H., Davis R. W., Dujon B., Feldmann H., Galibert F., Hoheisel J. D., Jacq C., Johnston M., Louis E. J., Mewes H. W., Murakami Y., Philippsen P., Tettelin H., and Oliver S. G. Life with 6000 genes // Science. 1996. V. 274 (5287). № 546. P. 563-567.

90. Grajek W., Olejnik A. and Sip A. Probiotics, prebiotics and antioxidants as functional foods// Acta Biochimica Polonica. 2005. V. 52. № 3. P. 665-671.

91. Gupta A. S., Heinen J. L., Holaday A. S., Burket J. J., and Allen R. D. Increased resistance to oxidative stress in transgenic plants thatoverexpress chloroplastic Cu/Zn superoxide dismutase // Proc Nati Acad Sei USA. 1993. V. 90. P. 1629-1633.

92. Hadwiger L.A., Ogawa T., Kuyama H. Chitosan polymer sizes effective in inducing phytoalexin accumulation and fungal suppression are verified with synthesized oligomers // Mol Plant Microb Interact. 1994. V. 7. P. 531-533.

93. Hahn S. K., Chang Y. K. and Lee S. Y. Recovery and characterization of poly(3-hydroxybutyric acid) synthesized in Alcaligenes eutrophus and and Recombinant Escherichia coli II Applied and Environmental Microbiology. 1995. P. 34-39.

94. Hakkarainen J., Toivanen M., Leinonen A., Fmngsmyr L., Strn,mberg N., Lapinjoki S., Nassif X., and Tikkanen-Kaukanen C. Human and Bovine Milk Oligosaccharides Inhibit Neisseria meningitides Pili Attachment In Vitro // The Journal of Nutrition. 2005. P. 24452448.

95. Harming G. and Makrides S. C. Strategies for optimizing heterologous protein expression in Escherichia coli II Trends Biotechnol. 1998. V. 16. P. 54-60.

96. Harish Prashanth K.V., Tharanathan R.N. Depolymerized products of chitosan as potent inhibitors of tumor-induced angiogenesis // Biochim Biophysic Acta. 2005. V. 1722. P. 2229.

97. Hightower R., Baden C., Penzes E., Lund P. and Dunsmuir P. Expression of antifreeze proteins in transgenic plants//Plant Molecular Biology. 1991. V. 17. P. 1013-1021.

98. Hilkens J., Lightenberg M.J., Vos H.L., Litvinov S.V. Cell membrane-associated mucins and their adhesion-modulating property // Trends Biochem Sei. 1992. V. 17. P. 359-363.

99. Hirano S., Yamamoto T., Hayashi M., Nishida T. and Inui H. Chitinase Activity in Seeds Coated with Chitosan Derivatives//Agric Biol Chem. 1990. V. 54. № 10. P. 2719-2720.

100. Ho N. W. Y., Chen Z., and Brainard A. P. Genetically Engineered SaccharomycesYeast Capable of Effective Cofermentation of Glucose and Xylose 11 Appl Environ Microbiol. 1998. V. 64. №5. P. 1852-1859.

101. Hodgson J. Making Monoclonals in Microbes // BioTechnology. 1991. V. 9. P. 421 - 425.

102. Hood E.E. From green plants to industrial enzymes // Enzyme Microb Technol. 2002. V. 30. P. 279-283.

103. Houdebine L.-M. Production of pharmaceutical proteins by transgenic animals//Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2009. V. 32. P. 107-121.

104. Huang C.J., Lin H., Yang X. Industrial production of recombinant therapeutics in Escherichia coli and its recent advancements // J Ind Microbiol Biotechnol. 2012. V. 39. №. 3. P. 383-399.

105. Ihssen J., Kowarik M., Dilettoso S., Tanner C., Wacker M., Thony-Meyer L. Production of glycoprotein vaccines in Escherichia coli II Microbial Cell Factories. 2010. V. 9. №. 61. P. 494-497.

106. Iizasa E., Mitsutomi M., and Nagano Y. Direct Binding of a Plant LysM Receptor-like Kinase, LysM RLK1/CERK1, to Chitin in Vitro II The Journal Of Biological Chemistry. 2010. V. 285. № 5. P. 2996-3004.

107. Innis M.A., Holland M.J., McCabe P.C., Cole G.E., Wittman V.P., Tal R., Watt K.W., Gelfand D.H., Holland J.P., Meade J.H. Expression, Glycosylation, and Secretion of an Aspergillus Glucoamylase by Saccharomyces cerevisiae II Science. 1985. V. 228. № 4695. P. 21-26.

108. Inoue H., Nojima H., and Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids // Gene. 1990. V. 96. P. 23-28.

109. Inui H., Yamaguchi Y., Hirano S. Elicitor actions of Nacetylchitooligosaccharides and laminarinoligosaccharides for chitinase and ¿-phenylalanine ammonia-lyase induction in rice suspension culture // Biosci Biotechnol Biochem. 1997. V. 61. P. 975-978.

110. Ito Y., Kaku H., Shibuya N. Identification of a high-affinity binding protein for Nacetylchitooligosaccharide elicitor in the plasma membrane of suspension-cultured rice cells by affinity labeling // Plant J. 1997. V. 12. № 2. P. 347-356.

111. Jensen H. L. Nitrogen fixation in leguminous plants. I. General characters of root-nodule bacteria isolated from species of Medicago and Trifolium in Australia // Proceedings Of The Linnean Society Of NSW. 1942. № 67. P. 98-108.

112. John M., Rohrig H., Schmidt J., Wieneke U., Schell J. Rhizobium NodB protein involved in nodulation signal synthesis is a chitooligosaccharide deacetylase // Proc Natl Acad Sci USA. 1993. V. 90. P. 625-629.

113. Kafetzopoulos D., Martinou A., Bouriotis V. Bioconversion of chitin to chitosan: Purification and characterization of chitin deacetylase from Mucor rouxii II Proc Natl Acad. Sci USA. 1993. V. 90. P. 2564-2568.

114. Kaku H., Nishizawa Y., Ishii-Minami N., Akimoto-Tomiyama C., Dohmae N., Takio K., Minami E., and Shibuya N. Plant cells recognize chitin fragments for defense signaling through a plasma membrane receptor// Proc Natl Acad SciUSA. 2006. V.103. P. 1108611091.

115. Kamst E., Bakkers J., Quaedvlieg N.E.M. Pilling J., Kijne J.W., Ben J. J., Lugtenberg B.J.J. Chitin oligosaccharide synthesis by rhizobia and zebrafish embryos starts by glycosyl transfer to 04 of the reducing-terminal residue // Biochemistry. 1999. V. 38. P. 4045-4052.

116. Kamst E., Pilling J., Raamsdonk L. M., Lugtenberg B. J. J., Spaink H. P. Rhizobium nodulation protein NodC is an important determinant of chitin oligosaccharide chain length in Nod factor biosynthesis // J Bacteriol.. 1997. V. 179. P. 2103.

117. Kamst E., Spaink H.P. Functional domains in the chitin oligosaccharide synthase NodC and related (3-polysaccharide synthases // Trends in Glycoscience and Glycotechnol. 1999. V. 11. P. 187-200.

118. Kamst E., van der Drift K.M.G.M., Thomas-Oates J. E., Lugtenberg B. J. Mass spectrometric analysis of chitin oligosaccharides produced by Rhizobium NodC protein in E. coli IIJ Bacteriol. 1995. V. 177. P. 6282-6285.

119. Kawamata S., Yamada T., Tanaka Y., Sriprasertsak P., Kato H., Ichinose Y., Kato H., Shiraishi T. and Oku H. Molecular cloning of phenylalanine ammonia-lyase cDNA from Pisum sativum!I Plant Molecular Biology. 1992. V. 20. P. 167-170.

120. Kay R.A., Barton L.L. Microalgae as food and supplement // Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 1991. V. 30. № 6. P. 555-573.

121. Khan W., Prithiviraj B., Smith D. L. Chitosan and chitin oligomers increase phenylalanineammonia-lyase and tyrosine ammonia-lyase activities in soybean leaves // J Plant Physiol. 2003. V. 160. P. 859-863.

122. Kiyota H. Synthesis of Naturally Derived Bioactive Compounds of Agricultural Interest // Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 2006. V. 70. N. 2. P. 317-324.

123. Knight P. Baculovirus vectors for making proteins in insect cells // ASMNews. 1991. V. 57. P. 567-570.

124. Koizumi S. Large-scale production of oligosaccharides using bacterial functions // Trends Glycosci Glycotechnol. 2003. V.15. № 82. P. 65-74.

125. Koping-Hoggard M., Varum K.M., Issa M., Danielsen S., Christensen B.E., Stokke B.T., Artursson P. Improved chitosan-mediated gene delivery based on easily dissociated chitosan polyplexes of highly defined chitosan oligomers // Gene Therapy. 2004. V. 11. P. 1441-1452.

126. Kotzsch A., Vernet E., Hammarström M., Berthelsen J., Weigelt J., Gräslund S., Sundström M. A secretory system for bacterial production of high-profile protein targets // Protein Sei. 2011. V. 20. №3. P. 597-609.

127. Kuchitsu K., Kikuyama M. and Shibuya N. N-Acetylchitooligosaccharides, biotic elicitor for phytoalexin production, induce transient membrane depolarization in suspension-cultured rice cells // Protoplasma. 1993. V. 174. P. 79-81.

128. Kuchitsu K., Kosaka T., Shiga T. and Shibuya N. EPR evidence for generation of hydroxyl radical triggered by N-acetylchitooligosaccharide elicitor and a protein phosphatase inhibitor in suspension-cultured rice cells// Protoplasma. 1995. V.188. P.138-142.

129. Kuchitsu K., Yazaki Y., Sakano K. and Shibuya N. Transient cytoplasmic pH change and ion fluxes through the plasma membrane in suspension-cultured rice cells triggered by N-acetylchitooligosaccharide elicitor// Plant Cell Physiol. 1997. V.38. №.9. P. 1012-1018.

130. Kues W.A., Niemann H. The contribution of farm animals to human health.// Trends Biotechnol. 2004. V. 22. № 6. P. 286-294.

131. Kunst F., Ogasawara N., Moszer I., Albertini A.M., Alloni G., Azevedo V., Bertero M.G., Bessières P., Bolotin A., Borchert S., Borriss R., Boursier L., Brans A., Braun M., Brignell S.C., Bron S., Brouillet S., Bruschi C.V., Caldwell B., Capuano V., Carter N.M., Choi S.K., Codani J.J., Connerton I.F., Danchin A., et al. The complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis II Nature. 1997. V. 390. P. 249-256.

132. Kunz C., Rudloff S. Biological functions of oligosaccharides in human milk // Acta Paediatr. 1993. V. 82. № 11. P. 903-912.

133. Kunz C., Rudloff S., Baier W., Klein N., Strobel S. Oligosaccharides in human milk: structural, functional and metabolic aspects // Annu Rev Nutr. 2000. V. 20. P. 699-722.

134. Kusnadi A. R., Nikolov Z. L. and Howard John A. Production of recombinant proteins in transgenic plants: Practical considerations // Biotechnology and Bioengineering. 1997. V. 56. № 5. P. 473-484.

135. Laemmli U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. // Nature. 1970. V. 227. P. 680 - 685.

136. Lee H.G., Lee H.C., Kim S.W., Lee P., Chung H.J., Lee Y.K., Han J.H., Hwang I.S., Yoo J.I., Kim Y.K., Kim H.T., Lee H.T., Chang W.K., Park J.K. Production of recombinant human von Willebrand factor in the milk of transgenic pigs // J Reprod Dev. 2009. V. 55. № 5. P. 484-490.

137. Lee S.Y. High cell-density culture of Escherichia coli II Trends Biotechnol. 1996. V. 14. N 3. P. 98-105.

138. Linden J. C. and Stoner R. J. Proprietary Elicitor Affects Seed Germination and Delays Fruit Senescence// Journal of Food, Agriculture & Environment. 2005. V. 3. P. 184-189.

139. Linden J. C., Stoner R. J., Knutson K. W., and Gardner-Hughes C. A. Organic desease control elicitors// Agro Food Industry Hi-Tech. 2000. P.12-15.

140. Lopez-Lara I. M., van den Berg J. D. J., Thomas-Oates J.E., Glushka J. N., Lugtenberg B. J. J., Spaink H. P. Structural identification of the lipo-chitin oligosaccharide nodulation signals of Rhizobium loti. // Mol Microbiol. 1995. V. 15. P. 627-638.

141. Lopez-Lara I.M., Orgambide G., Dazzo F.B. Olivares J., Toro N. Characterization and symbiotic importance of acidic extracellular polysaccharides of Rhizobium sp. strain GRH2 isolated from acacia nodules // J Bacteriology. 1993. V. 175. № 10. P. 2826-2832.

142. Ma J. K-C., Drake P. M.W. and Christou P. The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants // Nature Reviews. Genetics. 2003. V. 4. P.794-805.

143. Macauly-Patrick S., Fazenda M.L., McNeil B., Harvey L.M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system // Yeast. 2005. V. 22. P. 249-270.

144. Machida S., Niimi S., Shi X. Expression of the cytoplasmic domain of NodC as an active form in Drosophila S2 cells // J Biosci Bioeng. 2001. V. 91. № 3. P. 251-255.

145. Machida S., Niimi S., Shi X. Expression of the cytoplasmic domain of NodC as an active form in Drosophila S2 cells // J Biosci Bioeng. 2001. V. 91. № 3. P. 251-255.

146. Mandal S. Induction of phenolics, lignin and key defense enzymes in eggplant {Solarium melongena L.) roots in response to alicitors // African Journal of Biotechnol. 2010. V. 9. № 47. P.8083-8047.

147. McAuliffe J.C. and Hindsgaul O. Carbohydrates in Medicine // In: Molecular and Cellular Glycobiology (eds. M. Fukuda, O. Hindsgaul). Oxford University Press. 2000. P. 249-275.

148. Mergaert P., D'Haeze W., Geelen D., Prome D., Van Montagu M., Geremia R., Prome J.C., Holsters M. Biosynthesis of Azorhizobium caulinodans Nod Factors // J Biolog Chem. 1995. V. 270. № 49. P. 29217-29223.

149. Minami E., Kuchitsu K., He D.-Y., Kouchi H., Midoh N., Ohtsuki Y., and Shibuya N. Two Novel Genes Rapidly and Transiently Activated in Suspension-Cultured Rice Cells by Treatment with N-Acetylchitoheptaose, a Biotic Elicitor for Phytoalexin Production // Plant Cell Physiol. 1996. V. 37. № 4. P. 563-567.

150. Ming Y. M., Zhang W. W., Chen Y. L. and Gong Y. S. Development of a Bacillus subtilis expression system using the improved Pglv promoter // Microbial Cell Factories. 2010. V. 9. №55. P. 1-8.

151. Miya A., Albert P., Shinya T., Desaki Y., Ichimura K., Shirasu K., Narusaka Y., Kawakami N., Kaku H. and Shibuya, N. CERK1, a LysM receptor kinase, isessential for chitin elicitor signaling in Arabidopsis // Proc Natl Acad Sci USA. 2007. V.104. P. 19613— 19618.

152. Morikawa M. Beneficial Biofilm Formation by Industrial Bacteria Bacillus subtilis and Related Species // Journal of Bioscience and Bioengineering. 2006. V.101. № l.P. 1-8.

153. Mourya V. K., Inamdar N. N., and Choudhari Y. M. Chitooligosaccharides: Synthesis, Characterization and Applications // Polymer Science Ser. A. 2011. V. 53. №. 7. P. 583612.

154. Murata T., and Usui T. Large-scale Production of Oligosaccharides Using Bacterial Functions // Biosci Biotechnol Biochem. 2006. V. 70. № 5. P. 1049-1059.

155. Nakakuki T. Development of Functional Oligosaccharides in Japan // Trends in Glycoscience and Glycotechnology. 2003. V. 15. № 82. P. 57-64.

156. Nevalainen KMH, Te'o VSJ, Bergquist PL. Heterologous protein expression in filamentous fungi // Trends Biotech. 2005. V. 23. P. 468-474.

157. Niemann H., Kues W. and Carnwath J.W. Transgenic farm animals: present and future // Revue Scientifique et Technique (International Office of Epizootics). 2005. V. 24. № l.P. 285-298.

158. Ning W., Chen F., Mao B., Li Q., Liu Z., Guo Z., He Z. N-acetylchitooligosaccharides elicit rice defence responses including hypersensitive response-like cell death, oxidative burst and defence gene expression // Physiological and Molecular Plant Pathology. 2004. V. 64. P. 263-271.

159. Nishizawa Y., Kawakami A., Hibi T., He D-Y., Shibuya N. and Minami E. Regulation of the chitinase gene expression in suspension-cultured rice cells by N-acetylchitooligosaccharides. Differences in the signal transduction pathways leading to the activation of elicitor-responsive genes // Plant Mol Biol. 1999. V.39. P.907-914.

160. Nissim A., Chernajovsky Y. Historical development of monoclonal antibody therapeutics // Handb Exp Pharmacol. 2008. V. 181. P. 3-18.

161. Okada M., Matsumura M, Ito Y. and Shibuya N. High-Affinity Binding Proteins for N-Acetylchitooligosaccharide Elicitor in the Plasma Membranes from Wheat, Barley and Carrot Cells: Conserved Presence and Correlation with the Responsiveness to the Elicitor // Plant Cell Physiol. 2002. V. 43. № 5. P. 505-512.

162. Olsthoorn M. M. A., Lo'pez-Lara I. M., Petersen B. O., Bock K., Haverkamp J., Spaink H. P., and Thomas-Oates J. E. Novel Branched Nod Factor Structure Results from R-(lf3) Fucosyl Transferase Activity: The Major Lipo-Chitin Oligosaccharides from

Mesorhizobium loti Strain NZP2213 Bear an R-(lf3) Fucosyl Substituent on a Nonterminal Backbone Residue // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 9024-9032.

163. Pacios-Bras C., van der Burgt Y.E., Deelder A.M., Vinuesa P., Werner D., Spaink H.P. Novel lipochitin oligosaccharide structures produced by Rhizobium etli KIM5s // Carbohydr Res. 2002. V. 337. P. 1193-1202.

164. Paleyanda R.K., Velander W.H., Lee T.K., Scandella D.H., Gwazdauskas F.C., Knight J.W., Hoyer L.W., Drohan W.N., Lubon H. Transgenic pigs produce functional human factor VIII in milk // Nat Biotechnol. 1997. V. 15. № 10. P. 971-975.

165. Park B. K. and Kim M.-M. Applications of Chitin and Its Derivatives in Biological Medicine// Int J Mol Sci. 2010. V. 11. P. 5152-5164.

166. Park B.-G., Chun J.-M., Lee Ch.-J., Chun G.-T., Kim I.-H., and Jeong Y.-H. Development of High Density Mammalian Cell Culture System forthe Production of Tissue-Type Plasminogen Activator// Biotechnol Bioprocess Eng. 2000. V. 5. P. 123-129.

167. Parlato M. C., Kamat M. N., Wang H., Stine K. J., and Demchenko A. V. Application of Glycosyl Thioimidates in Solid-Phase Oligosaccharide Synthesis// J Org Chem. 2008. V. 73. P. 1716-1725.

168. Perkins J.B., Sloma A., Hermann T., Theriault K., Zachgo E., Erdenberger T., Hannett N., Chatterjee N.P., Williams II V., Rufo G.A. Jr., Hatch R. and Pero J. Genetic engineering of Bacillus subtilis for the commercial production of riboflavin // Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 1999. V. 22. P. 8-18.

169. Perret X., Staehelin Ch., Broughton W.J. Molecular basis of symbiotic promiscuity // Mirobiology and Molecular Biology Reviews. 2000. V.64. № 1. P. 180-201.

170. Perugino G, Trincone A., Rossi and Moracci M. Oligosaccharide synthesis by glycosynthases// Trends in Biotechnology. 2004. V. 22. № 1. P. 31-37

171. Petutschnig E. K., Jones A.M.E., Serazetdinova L., Lipka U., and Lipka V. The LysM-RLK CERK1 is a major chitin binding protein in Arabidopsis thaliana and subject to chitin-induced phosphorylation // J Biol Chem. 2010. V. 285. № 37. P. 28902-28911.

172. Punt P.J. van Biezen N., Conesa A., Albers A., Mangnus J. and van den Hondel C. Filamentous fungi as cell factories for heterologous protein production // Trends Biotechnol. 2002. V. 20. P. 200-206.

173. Riego E, Limonta J, Aguilar A, PSrez A, de Armas R, Solano R, Ramos B, Castro FO, de la Fuente J. Production of transgenic mice and rabbits that carry and express the human tissue plasminogen activator cDNA under the control of a bovine alpha S1 casein promoter //Theriogenology. 1993. V. 39. № 5. P. 1173-1185.

174. Riggs A. D. Bacterial Production of Human Insulin // Diabetes Care. 1981. V. 4 № l.P. 64-68.

175. Roche P., Maillet F., Plazanet C., Debelle F., Ferro M., Truchet G., Prome J.-C., Denarie J. The common nodABC genes of Rhizobium meliloti are host-range determinants // Proc Natl Acad Sci USA. 1996. V. 93. P. 15305-15310.

176. Roh J.Y., Choi J.Y., Li M.S., Jin B.R. Je Y.H. Bacillus thuringiensis as a specific, safe and effective tool for insect pest // J Microbiol Biotechnol. 2007. V. 17. P. 547-559.

177. Rohrig, H., Schmidt, J., Walden, R., Czaja, I., Miklasevics, E., Wieneke, U., Schell, J. & John, M. Growth of tobacco protoplasts stimulated by synthetic lipo-chitooligosaccharides // Science. 1995. V. 269. P. 841-843.

178. Rotondo G., Meniero G., Toffano G. New perspectives in the treatment of hypoxic and ischemic brain damage: effect of gangliosides // Aviat Space Enviton Med, 1990, V. 61, № 2, P. 162-164.

179. Ruffing A., Chen R. R. Metabolic engineering of microbes for oligosaccharide and polysaccharide synthesis // Microbial Cell Factories. 2006a. V. 5. P. 25.

180. Ruffing A., Mao Z., Chen R. R. Metabolic engineering of Agrobacterium sp. for UDP-galactose regeneration and oligosaccharide synthesis // Metabolic Engineering, 20066,V. 8, P. 465^173.

181. Ryan E. G. and Farmer F. A. Homologs of the Xenopus developmental gene DG42 are present in zebrafish and mouse and are involved in the synthesis of Nod-like chitin oligosaccharides during early embryogenesis // Proc Natl Acad Sci USA. 1991. V. 93. P. 4548-4553.

182. Samain E., Drouillard S., Heyraud A., Driguez H., Geremia R.A. Gram-scale synthesis of recombinant chitooligosaccharides in Escherichia coli II Carbohydrate Research. 1997. V. 302. P. 35-42.

183. Sargent T.D. and Dawid I.B. Differential gene expression in the gastrula of Xenopus laevis // Science. 1983. V. 222. P. 135-139.

184. Schallmey M., Singh A., Ward O.P. Development in the use of Bacillus species for industrial production // Can J Microbiol. 2004. V. 50. P. 1-17.

185. Schein C. H. and Noteborn M. H. M. Formation of Soluble Recombinant Proteins in Escherichia Coli is Favored by Lower Growth Temperature // Nature Biotechnology. 1988. V. 6. P. 291 -294.

186. Schmidt J., Rohrig H., John M., Wieneke U., Stacey G., Koncz C., Schell J. Alteration of plant growth and development by Rhizobium nodA and NodB genes involved in the synthesis of oligosaccharide signal molecules // Plant Journal. 1993. V. 4. № 4. P. 651-658.

187. Schnieke A. E., Kind A. J. Human Factor Ix Transgenic Sheep Produced By Transfer Of Nuclei From Transfected Fetal Fibroblasts.// Science. 1997. V. 278. № 5364. P. 2130-2133.

188. Schwarz T. F. Clinical update of the AS04-Adjuvanted human Papillomavirus-16/18 cervical cancer vaccine, Cervarix® // Advances in Therapy. 2009. V. 26. N. 11. P. 983-998.

189. Semino C. E. and Allende M. L. Chitin oligosaccharides as candidate patterning agents in zebrafish embryogenesis // Int J Dev Biol. 2000. V. 44. P. 183-193.

190. Semino C. E., Specht C. A., Raimondi A., and Robbins P. W. Homologs of the Xenopus developmental gene DG42 are present in zebrafish and mouse and are involved in the synthesis of Nod-like chitin oligosaccharides during early embryogenesis // Proc Natl Acad Sci USA. 1996. V. 93. P. 4548-4553.

191. Semino C.E., Allende M.L., Bakkers J., Spaink H.P. and Robbins P.W. Expression of Rhizobium chitin oligosaccharide fucosyltransferase (NodZ) in zebrafish embryos disrupts normal development // Ann NY Acad Sci. 1998. V. 842. P. 49-54.

192. Sharm A. K., Jani D., Raghunath C. and Tyagi A. K. Transgenic plants as bioreactors // Indian Journal of Biotechnology. 2004. V. 3. P. 274-290.

193. Shchelkunov S. N and Shchelkunova G. A Plant-based vaccines against human hepatitis B virus // Expert Rev. Vaccines. 2010. V. 9. № 8. P. 947-955.

194. Shimizu T., Nakano T., Takamizawa D., Desaki Y., Ishii-Minami N., Nishizawa Y., Minami E., Okada K., Yamane H., Kaku H., and Shibuya N. Two LysM receptor molecules, CEBiP and OsCERKl, cooperatively regulate chitin elicitor signaling in rice // The Plant Journal. 2010. V. 64. P. 204-214.

195. Silverman S. J. Similar and different domains of chitin synthases 1 and 2 of Saccharomyces cerevisiae. Two isozymes with distinct functions // Yeast. 1989. V. 5. P. 459-467.

196. Simunek J., Koppova I., Filip L., Tishchenko G. and Belzecki G. The antimicrobial action of low-molar-mass chitosan, chitosan derivatives and chitooligosaccharides on bifidobacteria // Folia Microbiologica. 2010. V. 55. № 4. P. 379-382.

197. Sohn B. H., Chang H. G., Kang H.-S., Yoon H., Bae Y. S., Lee K.-K., Kim S. J. High level expression of the bioactive human interleukin-10 in milk of transgenic mice // Journal of Biotechnology. 2003. V. 103. P. 11-19.

198. Sohn J.H., Kang H.A., Rao K.J., Kim C.H., Choi E.S., Chung B.H., et al. Current status of the anticoagulant hirudin: its biotechnological production and clinical practice // Appl Microbiol Biotechnol. 2001. V. 57. P. 606-613.

199. Serensen H.P., Mortensen K.K. Advanced genetic strategies for recombinant expression in Escherichia coli IIJ Biotechnol. 2005. V. № 115. P. 113-128.

200. Spaink H. P. Regulation of plant morfogénesis by lipo-chitin oligosaccharides // Critical Reviews in Plant Sciences. 1996. V. 15. P.559-582.

201. Spaink H. P., Sheeley D. M., van Brussel A. A. N„ Glushka J., York W. S., Tak T., Geiger O., Kennedy E. P., Reinhold V. N. and Lugtenberg B. J. J. A novel highly unsaturated fatty acid moiety of lipooligosaccharide signals determines host specificity of Rhizobium//Nature. 1991. V. 354. P. 125-130.

202. Spaink H. P., Wijfjes A. H. M., van der Drift K. M. G. M„ Haverkamp J., Thomas-Oates J. E., Lugtenberg B. J. J. Structural identification of metabolites produced by the NodB and NodC proteins of Rhizobium leguminosarum II Molecular Microbiology. 1994. V. 13. № 5. P. 821-831.

203. Spaink H.P. The molecular basis of infection and nodulation by rhizobia: the ins and outs of sympathogenesis//Annual Reviews Phytopathology. 1995. V.33. P.345-368.

204. Stacey G. and Keen N. T. Plant-Microbe Interaction//APS PRESS, 1999, V. 4.

205. Stalker D. M., McBride K. E. and Malyj L. D. Herbicide resistance in transgenic plants expressing a bacterial detoxification gene // Science. 1988. V. 242. P. 419^123.

206. Stam M., Mol J. N.M. and Kooter J. M. The Silence of Genes in Transgenic Plants // Annals of Botany. 1997. V. 79. P. 3-12.

207. Stoger E., Sack M., Perrin Y., Vaquero C., Torres E., Twyman R. M., Christou P. and Fischer R. Practical considerations for pharmaceutical antibody production in different crop systems // Molecular Breeding. 2002. V. 9. P. 149-158.

208. Stossel, P. and Leubow, J.L. Effect of chitosan, chitin and some aminosugars on growth of various soilborne phytopathogenic fungi // Phytopathol. Z. 1984. V. 111. P. 82-90.

209. Surabattula R., Rao K.R.S. S. and Polavarapu R.An Optimized Process for Expression, Scale-Up and Purification of Recombinant Erythropoietin Produced in Chinese Hamster Ovary Cell Culture // Research in Biotechnology. 2011. V. 2. № 3. P. 58-74.

210. Suyama A., Iwakiri R., Kimura N., Nishi A., Nakamura K., and Furukawa K. Engineering hybrid Pseudomonads capable of utilizing a wide range of aromatic hydrocarbons and of efficient degradation of trichloroethylene // Journal Of Bacteriology. 1996. V. 178. № 14. P. 4039-4046.

211. Tabashnik B.E., Gassmann A.J., Crowder D.W., Carriére Y. Insect resistance to Bt crops: evidence versus theory // Nat Biotechnol. 2008. V. № 26. P. 199-202.

212. Taghipoura F., Huyopa F. Synthetic bxn gene utilization in the resistance of crops to the herbicide bromoxynil. A Review// Jurnal Teknologi. 2012. V. 59. P. 81-85.

213. Thanou M., Florea B.I., Geldof M., Junginger H.E., and Borchard G. Quaternized chitosan oligomers as novel gene delivery vectors in epithelial cell lines // Biomaterials. 2002. V. 23. № i.p. 153-159.

214. Timmis K. N., Steffan R. J., and Unterman R. Designing Microorganisms for the Treatment of Toxic Wastes // Annual Review of Microbiology. 1994. V. 48. P. 525-557.

215. Tsigos I., Bouriotis V. Purification and characterization of chitin deacetylase from Colletotrichum lindemuthianum // J Biol Chem. 1995. V. 270. P. 26286-26291.

216. Tsigos I., Martinou A., Kafetzopoulos D., Bouriotis V. Chitin deacetylases: New, versatile tools in biotechnology // Trends Biotechnol. 2000. V. 18. P. 305-312.

217. Tsigos I., Zydowicz N., Martinou A., Domard A., Bouriotis V. Mode of action of chitin deacetylase from Mucor rouxii on iV-acetylchitooligosaccharides // Eur J Biochem. 1999. V. 61. P. 698-705.

218. Uchida Y, M. Izume and A. Ohtakara . Preparation of chitosan oligomers with purified chitosanase and its application. In: Skjek-Brack G et al, editors. Chitin and chitosan: sources, chemistry, biochemistry, physical properties and applications// Elsevier Applied Science. 1989. P. 373-382.

219. Vander P., Verum K. M., Domard A., El Gueddari N. E., and Moerschbacher B. M. Comparison of the Ability of Partially N-Acetylated Chitosans and Chitooligosaccharides to Elicit Resistance Reactions in Wheat Leaves//Plant Physiol. 1998. V. 118. P. 1353-1359.

220. Varki A. Does DG42 synthesize hyaluronan or chitin?: A controversy about oligosaccharides in vertebrate development// Proc Natl Acad Sci USA. 1996. V. 93. P. 4523-4525.

221. Velander W.H., Johnson J. L., Page R. L., Russell C. G., Subramanian A., Wilkins T. D., Gwazdauskas F. C., Pittius C., and Drohan W. N. High-level expression of a heterologous protein in the milk of transgenic swine using the cDNA encoding human protein C // Proc Natl Acad Sci USA. 1992. V. 89. № 24. P. 12003-12007.

222. Vellanki R.N., Komaravelli N., Tatineni R., Mangamoori L.N. Expression of hepatitis B surface antigen in Saccharomyces cerevisiae utilizing glyceraldeyhyde-3-phosphate dehydrogenase promoter of Pichiapastoris II Biotechnol Lett. 2007. V. 2. P. 313-318.

223. Venkatesan J., Pangestuti R., Qian Z.-J., Ryu B. M. and Kim S.-K. Biocompatibility and alkaline phosphatase activity of phosphorylated chitooligosaccharides on the osteosarcoma MG63 Cell Line // J Func Biomaterials. 2010. V. 1. P. 3-13.

224. Wan J., Zhang X.-C., Neece D., Ramonell K. M., Clough S., Kim S.-y., Stacey M. G., and Stacey G. A LysM Receptor-Like Kinase Plays a Critical Role in Chitin Signaling and Fungal Resistance in Arabidopsis//The Plant Cell. 2008. V. 20. P. 471-481.

225. Wang Y, Liang Z-H, Zhang Y-S, Yao S-Y, Xu Y-G, Tang Y.H., Zhu S.Q., Cui D.F., Feng Y.M. Human insulin from a precursor overexpressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris and a simple procedure for purifying the expression product // Biotech Bioeng. 2001. V. 73. P. 74-79.

226. Ward M., Lin C., Victoria D.C., Fox B.P., Fox J.A., Wong D.L., Meerman H.J., Pucci J.P., Fong R.B., Heng M.H., Tsurushita N., Gieswein C., Park M., Wang H. Characterization of humanized antibodies secreted by Aspergillus niger // Appl Environ Microbiol. 2004. V. 70. P. 2567-2576.

227. Ward O.P., Qin W.M., Hanjoon J.D., Singh E.J.Y.A. Physiology and biotechnology of Aspergillus II Adv Appl Microbiol. 2006. V. 58. P. 1-75.

228. Werten MWT, van den Bosch TJ, Wind RD, Mooibroek H, De Wolf FA. High-yield secretion of recombinant gelatins by Pichia pastoris II Yeast. 1999. V. 15. P. 1087-1096.

229. Wright G., Carver A., Cottom D., Reeves D., Scott A., et al. High level expression of active human alpha-1-antitrypsin in the milk of transgenic sheep // BioTechnology. 1991. V. N. 9. P. 830-834.

230. Xu Q., Dou J., Wei P., et al. Chitooligosaccharides induce apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells via up-regulation of Bax // Carbohydrate Polymers. 2008. V. 71. P. 509-514.

231. Yamada A., Shibuya N., Kodama O. and Akatsuka T. Induction of phytoalexin farmation in suspension-cultured rice cells by N-acetylchitooligosaccharides // Biosci Biotechnol Biochem. 1993. V.57. P.405-409.

232. Yamamoto F., Clausen H., White T., Marken J., Hakomori S. Molecular genetic basis of the histo-blood group ABO system //Nature. 1990. V. 345. № 6272. P. 229-233.

233. Yunus A. M. M., Parveez G. K. A. and Ho Ch.-L. Transgenic Plants Producing Polyhydroxyalkanoates// AsPac J Mol Biol Biotechnol. 2008. V. 16. № 1. P. 1-10.

234. Zeng L., Velasquez A.C., Munkvold K.R., Zhang J., Martin G.B. A tomato LysM receptor-like kinase promotes immunity and its kinase activity is inhibited by AvrPtoB // Plant J. 2012. V. 69. № 1. P. 92-103.

Благодарности у

Автор выражает глубокую и искреннюю благодарность своим научным руководителям - Тихоновичу Игорю Анатольевичу за ценные советы, критику и предложения, высказанные им при прочтении и редактировании работы, Долгих Елене Анатольевне за чуткое и внимательное руководство, помощь в обсуждении результатов и подготовке текста рукописи.

Автор также выражает благодарность и признательность сотрудникам лаборатории молекулярной и клеточной биологии: Цыганову Виктору Евгеньевичу, Цыгановой Анне Викторовне, Овцыной Александре Олеговне - за мудрость и понимание, помощь и моральную поддержку; Кулаевой Ольге, Китаевой Анне, Серовой Татьяне, Кириенко Анне за «чувство локтя», душевное тепло и помощь в постановке экспериментов.

Автор также благодарен сотрудникам других лабораторий ВНИИСХМ за помощь, поддержку и создание теплой и дружественной обстановки: Пинаеву Александру Георгиевичу, Андронову Евгению Евгеньевичу, Белимову Андрею Алексеевичу, Воробьеву Николаю Ивановичу, Ахтемовой Гульнар Асановне, Штарк Оксане Юрьевне, Дворяниновой Людмиле Евгеньевне, а также молодым ученым, друзьям и коллегам -Жукову Владимиру, Жернакову Александру, Мунтян Алексею, Мунтян Виктории, Лактионову Юрию, Осиповой Марии и многим-многим другим за моральную поддержку.

Особую благодарность автор выражает сотрудникам кафедры генетики и селекции биолого-почвенного факультета СПбГУ, и лично заведующему кафедрой Инге-Вечтомову Сергею Георгиевичу, Лутовой Людмиле Алексеевне и другим за мудрые советы и помощь при выборе места научной работы.

Отдельное спасибо сотрудникам московского Центра «Биоинженерии» РАН, лаборатории инженерии ферментов: профессору Варламову Валерию Петровичу и Лопатину Сергею Александровичу, а также сотрудникам «Аналитического центра нано- и биотехнологий ГОУ СПбГПУ» на базе ФГБОУ ВПО «СПбГПУ»: Артамоновой Татьяне Олеговне и профессору Ходорковскому Михаилу Алексеевичу за сотрудничество и помощь в проведении экспериментов.