Сравнительная характеристика и потенциал хитинолитических ферментов бактериального и грибного происхождения для получения биоактивных хитоолигосахаридов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Сафина Виолетта Рамилевна

• Сафина Виолетта Рамилевна
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Сафина Виолетта Рамилевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Ферменты, гидролизующие хитин и хитозан. Принципы классификации

1.1.1. Традиционная классификация, основанная на биохимической номенклатуре

1.1.2. Молекулярная классификация гликозил-гидролаз

1.1.3. Классификация хитозаназ на основе их реакционной специфичности

1.2. Структурно-функциональные особенности и дифференциация хитиназ

1.3. Структурно-функциональные особенности и дифференциация хитозаназ

1.4. Вспомогательные и неспецифические ферменты, вовлеченные в деструкцию хитина и хитозана. Углевод-связывающие модули

1.5. Экологическая роль и распространенность микробных хитиназ и хитозаназ среди микроорганизмов водных и наземных экосистем

1.6. Биохимические пути деградации хитина в природе

1.7. Биохимия гидролиза хитозана хитиназами и хитозаназами

1.8. Механизмы антимикробной активности хитозана и хитоолигосахаридов

1.9. Факторы устойчивости микроорганизмов к биоцидному действию

хитозана и хитоолигосахаридов

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объекты исследования и условия их поддержания

2.2. Материалы

2.3. Первичный скрининг микробных культур - деструкторов хитозана

2.4. Анализ влияния параметров культивирования на продукцию хитозан-деградирующих ферментов исследуемыми штаммами

2.5. Оценка роста микробных культур и биодеградации ими хитина и хитозана

2.6. Анализ активности внеклеточных гидролаз

2.6.1. Определение общей хитозаназной и хитиназной активности

2.6.2. Анализ К-ацетил-в-О-глюкозаминидазы

2.6.3. Изучение субстратной специфичности хитозан-деградирующих ферментов

2.7. Вискозиметрический анализ ферментативной деструкции

хитозана

2.8. Очистка хитозан-деградирующих ферментов

2.8.1. Общие этапы очистки

2.8.2. Аффинная адсорбция

2.8.3. Хроматографическая очистка хитинолитических ферментов

2.8.4. Гель-электрофорез в денатурирующих условиях

2.9. Анализ физико-химических и каталитических свойств хитозаназ/хитиназ

2.10. Анализ реакционной специфичности

2.11. Определение глубины ферментативного гидролиза хитозана и оценка растворимости образуемых олигомеров

2.12. Получение олигомерных фракций хитозана с помощью очищенных ферментов

2.13. Определение молекулярной массы олигомерного хитозана

2.14. ЯМР-анализ структуры олигомеров хитозана, полученных при гидролизе хитозана очищенными ферментами

2.15. Анализ антимикробной активности высокомолекулярного хитозана и продуктов его ферментативного гидролиза

2.16. Световая микроскопия

2.17. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Объекты исследования и особенности продукции ими хитинолитических ферментов

3.2. Влияние условий культивирования на синтез хитинолитических ферментов штаммами при глубинном культивировании

3.3. Сравнительная устойчивость штаммов - продуцентов хитиназ и хитозаназ к антимикробному действию хитозана

3.4. Выделение и характеристика хитозаназ исследуемых штаммов

3.5. Сравнительная эффективность деполимеризации хитозана ферментными комплексами исследуемых штаммов

3.6. Антимикробная активность олигомеров, образуемых при деполимеризации хитозана ферментными комплексами (КЖ) и очищенными

хитозаназами / хитиназами исследуемых штаммов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Краткое описание и характеристика объектов исследования

ПРИЛОЖЕНИЕ 2. 13С-ЯМР-спектральный анализ продуктов

ферментативного расщепления хитозана

ПРИЛОЖЕНИЕ 3. Ингибирование роста фитопатогенных микромицетов на агаризованной среде КГА хитоолигомерами, полученным при разной степени деструкции хитозана

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сравнительная характеристика и потенциал хитинолитических ферментов бактериального и грибного происхождения для получения биоактивных хитоолигосахаридов»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Хитозан - линейный в-1,4-сополимер D-глюкозамина и N-ацетил-О-глюкозамина, получаемый щелочным деацетилированием хитина, второго по распространенности в природе полисахарида после целлюлозы (Beier, Bertilsson, 2013). Благодаря своим уникальным физико-химическим свойствам, экологической безопасности и разнообразной биологической активности хитозан находит все более широкое применение в различных областях медицины, пищевой промышленности и сельского хозяйства (Hadwiger et al., 2013; Muxika et al., 2017; Варламов с соавт., 2020). Однако, слабая растворимость при нейтральных значениях pH и высокая вязкость растворов хитозана ограничивают его практическое использование (Aam et al., 2010; Lodhi et al., 2014; Cheung et al., 2015; Brasselet et al., 2019; Хайруллин с соавт., 2010). Одним из перспективных способов улучшения функциональных характеристик хитозана является его ограниченный ферментативный гидролиз с помощью специфических и неспецифических гидролаз ( Xia et al., 2008; Jung, Park, 2014; Poshina et al., 2018, 2020). Преимущества ферментативной деструкции этого биополимера заключаются в возможности проведения реакции при мягких физико-химических условиях, ее упорядоченном характере и отсутствии побочных продуктов (Rahman et al_2014; Hamer et al., 2015; Gohi et al., 2017; Kaczmarek et al., 2019). Полученные в результате гидролиза хитоолигомеры (ХОС), в отличие от высокомолекулярного хитозана, не образуют высоковязких растворов и растворимы в воде, а в некоторых случаях показывают более высокую биологическую активность (Blanchard et al., 2003; Yin, 2009; Thadathil, Velappan, 2014; Rahman et al 2014; Naqvi, Moerschbacher, 2017). Кроме того, ХОС являются ценным исходным материалом для дальнейших модификаций химическими или ферментативными методами (Jung, Park, 2014; Brasselet et al., 2019).

По сравнению с неспецифическими ферментами, хитозаназы осуществляют наиболее быстрый и глубокий гидролиз хитозана, что позволяет существенно снижать время реакции и затраты ферментного препарата. Тем не менее, широкое биотехнологическое применение микробных хитозаназ в настоящее время ограничено в силу их относительно высокой стоимости и небольшого выбора доступных и стабильных продуцентов (Gohi et al., 2017; Brasselet et al., 2019). В связи с этим, актуальной задачей остается поиск и характеристика новых потенциально «технологичных» хитозан-деградирующих ферментов, в т.ч. среди хитинолитических штаммов бактерий и микромицетов. Сравнительная характеристика микробных хитозаназ и хитиназ и выявление особенностей деполимеризации хитозана этими ферментами будут способствовать совершенствованию разнообразных технологий получения целевых ХОС, различающихся по молекулярной массе, характеру распределения ацетилированных остатков и уровню биологической активности.

Целью настоящей работы являлась характеристика внеклеточных хитиназ и хитозаназ, продуцируемых штаммами почвенных эндоспорообразующих бактерий порядка Bacillales и микромицетом Pénicillium sp. IB-37-2A, со сравнительной оценкой эффективности деполимеризации хитозана для получения водорастворимых олигомеров, проявляющих антимикробную активность.

Задачи исследования:

1. Выявить особенности синтеза хитиназ и хитозаназ штаммами эндоспорообразующих бактерий порядка Bacillales и микромицетом Pénicillium sp. IB-37-2A с оценкой влияния параметров культивирования на их рост и продуктивность;

2. Провести сравнительный анализ устойчивости микробных продуцентов хитиназ и хитозаназ к биоцидному действию хитозана;

3. Выделить хитозаназы наиболее продуктивных штаммов и охарактеризовать их физико-химические и каталитические свойства;

4. Оценить возможность ферментативного получения целевых продуктов, имеющих определенные физико-химические характеристики и проявляющих биологическую активность.

5. Определить уровень антимикробной активности олигомеров, образуемых при гидролизе хитозана хитинолитическими ферментами исследуемых штаммов по показателям ингибирующих концентраций.

Научная новизна работы. Впервые проведено сравнительное исследование деполимеризации хитозана со степенью деацетилирования (СД) 85% препаратами микробных хитиназ и хитозаназ по параметрам молекулярно-массового распределения образуемых олигомеров и интегральным показателям (МИК, ЭД) их антимикробной активности. Установлено определяющее влияние уровня секреции специфических хитозаназ на растворимость образующихся ХОС и их бактерицидную и фунгицидную активность. Впервые установлена способность представителя энтомопатогенного вида Bacillus thuringiensis B-387 к конститутивной продукции внеклеточной хитозаназы, проявляющей высокую специфичность к высокодеацетилированному хитозану. Впервые охарактеризована термостабильная экзохитиназа представителя рода Cohnella. Показано, что резистентность хитинолитических штаммов бактерий и микромицетов к высокомолекулярному хитозану положительно коррелирует (R2=0,99) с уровнем синтеза ими внеклеточных хитозаназ.

Теоретическая и практическая значимость работы. Подобраны оптимальные условия синтеза хитозаназ штаммами B. thuringiensis B-387 и Pénicillium sp. IB-37-2A в лабораторных условиях глубинного культивирования, что может быть использовано для дальнейшей разработки технологического регламента производства этих ферментов. Выявлены наиболее значимые факторы и параметры культивирования, способствующие многократному или значительному увеличению продукции хитиназ и хитозаназ исследуемыми штаммами.

Оптимизированы протоколы выделения хитиназ и хитозаназ исследованных штаммов; разработана схема экспресс-очистки эндохитозаназы B. thuringiensis B-387, позволяющая получать электрофоретически гомогенный препарат фермента с высокой удельной активностью (37-50 ед/мг белка) для снижения степени загрязнения целевых олигомеров микробными метаболитами.

Определены значимые параметры (фермент-субстратное соотношение, температура и длительность реакции) деполимеризации хитозана СД 85% ферментным комплексом B. thuringiensis B-387 для получения водорастворимых ХОС, проявляющих антимикробную активность in vitro.

Методология и методы исследования. Методология исследования основывается на использовании системного подхода, включающего классические и современные методы микробиологии, биохимии, энзимологии, молекулярной биологии и химии биополимеров. Специфику работы определяет не объект, а предмет исследований, связанный с проблематикой биотехнологического применения хитозана и его олигомеров. Основной результат работы видится в данных сравнительной эффективности хитозаназ почвенных штаммов бактерий и грибов, которые могут применяться для получения биоактивных ХОС.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Штаммы хитинолитических бактерий B. atrophaeus, B. thuringiensis, Cohnella sp. и P. ehimensis характеризуются сходным уровнем синтеза индуцибельных экзохитиназ, которые не обнаружены в ферментном комплексе гриба Penicillium sp. IB-37-2.

2. Внеклеточные хитозаназы штаммов Penicillium sp. IB-37-2 и P. ehimensis IB-739 являются индуцибельными ферментами, синтезируемыми в присутствии хитозана или коллоидного крабового хитина, а хитозаназа B. thuringiensis B-387 секретируется конститутивно на уровне 3-4 ед/мл в присутствии гидролизатов казеина и лактоальбумина.

3. Штаммы, секретирующие хитозаназы, характеризуются максимальной устойчивостью к антимикробному действию хитозана СД 85% (МИК>2 мг/мл), при этом ингибирующая концентрация хитозана показывает сильную взаимосвязь ^2=0,99) с уровнем продуктивности штаммов.

4. Эндохитозаназы штаммов В. thuringiensis B-387 (Mw 40 кДа) и Р. вНтеж18 Ю-739 (Mw 46 кДа) и экзохитозаназа РвпшШиш sp. IB-37-2A (Mw 41 кДа) существенно отличаются по кинетическим характеристикам (Утах, КМ), субстратной и реакционной специфичности.

5. Ферментный комплекс В. thuringiensis B-387 показывает максимальную скорость и глубину гидролиза хитозана СД 85% до водорастворимых олигомеров (<100 мг/мл), проявляющих антибактериальную и фунгицидную активность.

Личный вклад автора. Личный вклад автора заключается в планировании и проведении экспериментов, обработке и анализе полученных данных, написании рукописи, подготовке публикаций.

Работа выполнена в Уфимском институте биологии Уфимского федерального исследовательского центра Российской Академии наук (г. Уфа).

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов подтверждается их воспроизводимостью и обеспечивается использованием современных методов микробиологии, энзимологии биополимеров. Основные результаты работы были представлены на XIV Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Севастополь, 2018); VI Всероссийской конференции с международным участием «Экобиотех» (Уфа, 2019); IX Международном научно-практическом симпозиуме «Перспективные ферментные препараты и биотехнологические процессы в технологиях продуктов питания и кормов» (Москва, 2019); IV Всероссийском микологическом форуме (Москва, 2020); XV Общероссийской конференции с международным участием «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Архангельск, 2021).

Конкурсная поддержка работы. Исследования поддержаны грантом РФФИ в рамках научного проекта № 19-34-90119 по конкурсу «Аспиранты».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ, в том числе 9 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК (из них 7 публикаций в журналах, индексируемых в международных научных базах данных WoS и Scopus).

Соответствие работы паспорту научной специальности. Работа «Сравнительная характеристика и потенциал хитинолитических ферментов бактериального и грибного происхождения для получения биоактивных хитоолигосахаридов» соответствует паспорту специальности 1.5.11 -микробиология. Определены оптимальные условия и особенности синтеза хитинолитических ферментов почвенными бактериями и микромицетами. Охарактеризованы физико-химические и каталитические свойства бактериальных и грибных хитинолитических ферментов. Проведена оценка антимикробной активности полученных продуктов.

Объем и структура работы. Работа изложена на 154 страницах машинописного текста и содержит 14 таблиц и 39 рисунков, включая Приложения. Работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследований (глава 2), результатов и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 209 ссылок, из них 21 - на русском языке.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Ферменты, гидролизующие хитин и хитозан. Принципы классификации.

1.1.1. Традиционная классификация, основанная на биохимической

номенклатуре

Специфический гидролиз высокомолекулярного хитина и хитозана катализируется хитиназами (КФ 3.2.1.14) и хитозаназами (КФ 3.2.1.132). Основными продуктами действия этих ферментов являются дисахариды -диацетил-хитобиоза и хитобиоза, которые расщепляются до мономеров N ацетил-в-О-глюкозаминидазами (КФ 3.2.1.52) и экзо-1,4-0-глюкозаминидазами (КФ 3.2.1.165), соответственно. Однако, К-ацетил-в-О-глюкозаминидазы могут гидролизовать также молекулы олигомеров более высокой степени полимеризации (п>2), тогда как экзо-1,4-0-глюкозаминидазы активно расщепляют полимерный хитозан. Существующие способы классификации хитинолитических ферментов основаны на особенностях их первичной и третичной структуры, субстратной и реакционной специфичности, механизме катализа, способности обращать или сохранять аномерную конфигурацию продуктов гидролиза (табл. 1.1).

Согласно традиционной классификации ферментов, разработанной Международным Союзом биохимии и молекулярной биологии (ШВМВ), хитиназы и хитозаназы относят к подклассу гликозил-гидролаз (3.2), подподклассу гликозидаз (3.2.1), катализирующих гидролиз О-гликозидов. Ферментам присваиваются индивидуальные номера ЕС 3.2.1.x, где «х» характеризует субстрат, на который воздействует фермент (КаишоГ^ 2011; 8ЬпуаБ1ауа, 2020; ВЯЕКОА, дата обращения 11.07.2021).

1.1.2. Молекулярная классификация гликозил-гидролаз

Международная классификация гликозил-гидролаз (СА7у), основанная на степени сходства аминокислотных последовательностей их

каталитических доменов, является в настоящее время общепризнанной (Naumoff, 2011), так как более адекватно отражает структурно -функциональные особенности различных групп хитиназ и хитозаназ и филогенетические взаимосвязи между ними (Henrissat, 1991; Lombard et al., 2014; Terrapon et al., 2017). В соответствии с принятой классификацией, гомологичные белки, показывающие степень идентичности более 30%, объединяют в семейства (Костеневич, Сапунова, 2013). Поскольку третичная структура белков более консервативна по сравнению с первичной, эволюционно родственные семейства гликозил-гидролаз со значительным сходством третичных структур объединяют на более высоком иерархическом уровне в кланы (суперсемейства). Ферменты одного клана не только обладают эволюционным родством кодирующих их генов, но и имеют одинаковое строение активного центра, стереохимию расщепляемых гликозидных связей и молекулярный механизм катализируемой реакции (Наумов, 2011; Lombard et al., 2014, Nguyen et al., 2018).

1.1.3. Классификация хитозаназ на основе их реакционной специфичности

Структура хитозана характеризуется разнообразием в порядке расположения ацетилированных остатков вдоль молекулы полимера (HoBbach, 2018), что определяет специфичный характер ферментативного гидролиза смешанных связей между остатками D-глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина. В соответствии с этим критерием была предложена классификация хитозаназ по способности гидролизовать определенные типы связей в молекуле хитозана, а ферментам, воздействующим на определенный тип связей, присвоены классы I-IV (Hirano et al., 2012; Weikert et al., 2017).

Общим свойством хитозаназ является их способность гидролизовать связь между остатками D-глюкозамина, при этом хитозаназы класса I, например, фермент Streptomyces sp. N174 (GH46), могут дополнительно расщеплять связь GlcNAc-GlcN, а хитозаназы класса III -связь GlcN-GlcNAc.

Таблица 1.1. Классификация и структурно-функциональные особенности основных групп специфических хитин - и хитозан-деградирующих ферментов.

Группы хитинолитических ферментов, шифр* Семейства гликозил- гидролаз Механизм действия на хитозан, гидролизуемые субстраты, наличие трансгликозидазной активности (+/-)** Механизм катализа Аномерная конфигурация продуктов гидролиза хитина/хитозана Пространственная структура каталитического домена

Хитиназы (КФ 3.2.1.14) GH18 (клан GH-K) ChiA (хитобиозидаза, КФ 3.2.1.201) ChiB (хитобиозидаза, КФ 3.2.1.200) ChiC (1,4^-поли^ ацетилглюкозаминидаза, КФ 3.2.1.14) GH19 (представлен исключительно хитиназами) Эндо-процессивный и непроцессивный. Хитин и хитозан со СД 30-70%. ± Субстратный (GH18) и кислотно-основной (GH19) в- (сохранение) для ОИ18 и а-(инверсия) для ОИ19 ф/а)8-бочонок (GH18) и a+ß-лизоцим (GH19)

К-ацетил-ß-D-гексозаминидазы (КФ 3.2.1.52) / N- ацетил-ß-D-глюкозаминидазы GH20 (клан GH-K) На хитозан не действуют. К-ацетил-глюкозиды / галактозиды, димеры хитина, хитин (экзо). + Субстратный в- (сохранение) ф/а)8-бочонок

Хитозаназы (КФ 3.2.1.132) GH3, GH5 (клан GH-A), GH7 (клан GH-B), GH8 (клан GH-M) -включают различные группы ферментов, преимущественно, эндо-и экзо-глюканаз, ксиланаз, глюкозидаз, маннаназ, галактаназ, целлюлаз и др. Эндо-механизм. Характерно наличие бифункциональных ферментов, активных в отношении различных форм хитозана, нерастворимой целлюлозы, Ка-КМЦ, лихенана, разветвленных Р-глюка- нов и др. ± Кислотно-основной - для всех Р- (сохранение) - для ОН3, ОН5 и ОН7 а-(инверсия) -для ОН8 Вариабельная - для ОН3, (Р/а)8-бочонок -для ОН5, Р-сэндвич (Р-швейцарский рулет) - для ОН7, (а/а)б-бочонок -для ОН8

GH46 и GH80 (клан GHI), GH75, -включают исключительно хитозаназы Высокоспецифичные хитозаназы, гидролизуют хитозан со СД 65-100% по эндо-механизму Кислотно-основной - для ОН46 и ОН75, для 0Н80 -неизвестен а-(инверсия) для всех а+Р-лизоцим для ОН46 и 0Н80, для ОН75 -неизвестна

Экзо-1,4- ß-D-глюкозаминидазы (КФ 3.2.1.165) GH2 (клан GH-A) - включает различные группы ß-галактозидаз, ß-маннозидаз, ß-глюкуронидаз и др. Экзо-механизм (отщепление мономера с нередуцирующего конца). Хитозан (СД~50-100%) и олигомеры от ИеК с максимумом для О1сК5- ОШб. + Кислотно-основной Р- (сохранение) (Р/а)8-бочонок

*Согласно биохимической номенклатуре ШВМВ.

**Наличие трансгликозидазной активности (+), ее отсутствие (—), наличие этой активности у отдельных представителей (±)

Ферменты класса II, в частности, хитозаназа Bacillus sp. No.7-M (семейство GH8), проявляют активность только в отношении связи GlcN-GlcN. Наконец, у ряда представителей Pseudomonas и Amycolatopsis описаны хитозаназы класса IV, отличающиеся способностью расщеплять все три типа связей, за исключением GlcNAc-GlcNAc. Хитозаназа штамма Streptomyces coelicolor A3(2), помимо всех перечисленных типов связей, гидролизует также связь между остатками N-ацетил-Б-глюкозамина GlcNAc-GlcNAc, подобно хитиназе, хотя и проявляет большую специфичность в отношении остатков D-глюкозамина (Heggset et al., 2010).

Несмотря на то, что знание класса специфичности хитозаназы может давать первоначальную информацию о потенциальном порядке распределения ацетилированных остатков у продуктов ее действия (Heggset et al., 2010; 2012), состав и распределение остатков зависит преимущественно от общей эффективности фермента в гидролизе различных типов связей (Boucher et al., 1992; Weikert et al., 2017). Помимо этого, при высоких концентрациях конечных продуктов в реакционной смеси может иметь место субстратное ингибирование, приводящее к снижению эффективности фермента (Pelletier, Sygusch, 1990; Boucher et al., 1992). Перечисленные аспекты могут искажать сравнительную оценку специфичности хитозаназ на основе экспериментальных данных.

1.2. Структурно-функциональные особенности и дифференциация хитиназ

Хитиназы различного происхождения представлены в семействах GH18, GH19, GH23 и GH48 (табл. 1.1). Подавляющее большинство охарактеризованных микробных хитиназ составляют семейство GH18. Помимо хитиназ, в семействе GH18 представлены лизоцимы (КФ 3.2.1.17), эндо^-Ы-ацетилглюкозаминидазы (КФ 3.2.1.96), пептидогликангидролазы, гидролазы Nod-факторов и ряд белков, не обладающих энзиматической

активностью (конканавалин B, нарбонин, ингибитор ксиланазы и др.). Хитиназы семейства GH19 менее многочисленны и встречаются в основном у растений и бактерий рода Streptomyces (Watanabe et al., 1999; Itoh et al., 2002, 2003; Kawase et al., 2006). Позднее хитиназы GH19 были обнаружены у других видов актинобактерий, а также ряда простейших и многоклеточных организмов (Kawase et al., 2004; Han et al., 2016; Oyeleye, Normi 2018).

Хитиназы GH18 и GH19 принципиально отличаются по молекулярному механизму катализа, осуществляя гидролиз субстрата соответственно с сохранением и обращением аномерной конфигурации образуемых продуктов (табл. 1.1). Их функциональные особенности проявляются в различном уровне фунгцидной активности и способности эффективно гидролизовать кристаллические формы хитина (Kawase et al., 2006).

По типу пространственной структуры каталитического домена хитиназы GH19 имеют больше общего с лизоцимами (семейства 22 -24) и хитозаназами (семейства 46 и 80), чем с хитиназами семейства GH18 (Fukamizo, 2000; Наумов, 2011). В то же время, хитиназы семейства GH18 по своей пространственной структуре сходны с белками семейств GH20 (N-ацетилглюкозаминидазы и N-ацетилгексозаминидазы бактерий и эукариот, КФ 3.2.1.52) и GH85 (эндо-Р-Ы-ацетиглюкозаминидазы, КФ 3.2.1.96), на основании чего они объединены в один клан GH K. Ферменты с N-ацетил-в-D-гексозаминидазной активностью обнаруживаются среди хитиназ GH18, а также в семействах GH 3, 5, 84, 109 и 116 (CAZy database, дата обращения: 25.01.2020).

Бактериальные хитиназы семейства GH18 в соответствии с гомологией аминокислотной последовательности каталитических доменов разделены на подсемейства ChiA, ChiB и ChiC (Fukamizo, 2000). Структурно-функциональные различия этих хитиназ проявляются в субстратной специфичности, в количестве и строении функциональных доменов, а также сигнальной последовательности (Brurberg et al., 1996; Patil et al., 2000).

Все три хитиназы являются мультимодулярными, несущими N-

16

терминальный хитин-связывающий модуль с фибронектин III (FnlII)-подобной укладкой (ChiA), либо C-терминальный СВМ 5 хитин-связывающий модуль (у ChiB), или C-терминальный FnIII модуль, соединенный со следующим за ним СВМ 12 хитин-связывающим модулем (ChiC).

В микробных сообществах природных экосистем наиболее распространены гены, кодирующие экзохитиназу ChiA (Ramaiah et al., 2000; Cretoiu et al., 2012). Эндохитиназы, подобные ChiC, распространены в меньшей степени и, по-видимому, играют вспомогательную роль в биодеградации хитина бактериальными сообществами.

1.3. Структурно-функциональные особенности и дифференциация хитозаназ

Хитозаназы (КФ 3.2.1.132) по степени сходства первичной структуры разделены на семь семейств гликозил-гидролаз, филогенетически удаленных от хитиназ (табл. 1.1). Семейства GH 46, 75 и 80 представлены исключительно эндохитозаназами, строго специфичными в отношении хитозана. Наиболее изученными и многочисленными среди них являются хитозаназы семейства GH46, включающие преимущественно ферменты актинобактерий и бацилл. Филогенетический анализ первичной структуры секвенированных хитозаназ позволил четко разделить эти ферменты на пять кластеров - A, B, C, D и E (Viens et al., 2015). Наибольшим среди них является кластер А, включающий почти половину известных хитозаназ, в основном, из ГЦ-богатых геномов грамположительных бактерий, относящихся к родам Streptomyces, Amycolatopsis, а также редких представителей грамотрицательных бактерий (Pseudomonas, Microbacterium). Кластер B представлен почти исключительно хитозаназами бацилл, относящихся к ветви грамположительных бактерий с низким содержанием ГЦ оснований в геноме.

Особенностью хитозаназ GH46 является наличие отрицательно

заряженного субстрат-связывающего центра, состоящего из остатков

17

глутаминовой и аспарагиновой кислот, что обуславливает высокую специфичность хитозаназ GH46 и слабое узнавание ими хитиновых высокоацетилированных субстратов (Lyu et al., 2014). Ряд хитозаназ семейства GH46 обладают также предполагаемыми пептидогликан связывающими модулями и N-концевыми доменами с неизвестной функцией (Viens et al. 2015). Очень близки к семейству GH46 эндохитозаназы из небольшого семейства GH80, обнаруженные у грамотрицательных бактерий (Amakata et al., 2005). Как и хитиназы GH19, они имеют каталитический домен лизоцимового типа, а катализ осуществляют с обращением аномерной конфигурации субстрата (табл. 1.1).

Хитозаназы GH75, напротив, не обнаруживают сходства с хитозаназами семейства GH46 и исследованы пока очень фрагментарно, хотя ранее было изучено действие хитозаназы SaCsn75A на хитозан различной степени ацетилирования, и показана более высокая специфичность взаимодействия этого фермента с полимером в субсайтах связывания субстрата (Heggset et al., 2012). Семейство GH75 гликозил-гидролаз представлено преимущественно грибными эндохитозаназами, первая из которых была описана у Fusarium solani (текущее название Nectria haematococca var. brevicona) (Shimosaka et al., 1996).

Семейства GH3, GH5, GH7 и GH8 содержат разнообразные группы глюкозидаз, экзо- и эндо-1,3- и 1,4-глюканаз, ксиланаз, целлюлаз и т.п. Хитозаназы этих семейств характеризуются широкой субстратной специфичностью, часто представляя собой мультифункциональные ферменты, содержащие каталитические домены, принадлежащие различным семействам гликозил-гидролаз. (Xia et al., 2008; Aam et al., 2010; Hoell et al., 2010; Viens et al., 2015). Таким образом, хитозаназная активность данных гликозил гидролаз имеет вторичный характер.

Чаще всего белки с высокой хитозаназной активностью

обнаруживаются в семействе GH8. Они хорошо охарактеризованы в

биохимическом и молекулярном аспектах (Hoell et al., 2010; Viens et al.,

18

2015), однако экспериментально кристаллическая структура представителей этого семейства была изучена у ферментов с преимущественной ß-1,4-глюканазной и ß-1,4-ксиланазной активностью (CAZy database, дата обращения: 25.01.2020). Бифункциональность хитозаназ семейства GH8 обусловлена тем, что в узнавании субстрата участвуют несколько ароматических аминокислотных остатков за счет стэкинг-взаимодействий с пиранозными кольцами хитозана. Это позволяет им проявлять, помимо хитозаназной, гидролитическую активность в отношении ß-1,4-глюканов (Shinya, Fukamizo, 2017).

Экзо- 1,4 - ß - глюкозаминидазы (ЕС 3.2.1.165) согласно классификации Henrissat (1991), входят в семейства GH2, GH9 и GH35 гликозил-гидролаз (CAZy database, дата обращения: 25.01.2020). Однако, включение этих ферментов в два последних семейства, вероятно, обусловлено вторичным обнаружением экзо-1,4^-О-глюкозаминидазной активности у ранее охарактеризованных ферментов с другой субстратной специфичностью.

Экзохитозаназы наиболее широко представлены в семействе GH2, наряду с ферментами, гидролизующими ß-гликозиды различной природы, и отщепляющими мономерные звенья сахаров у олигомерных и полимерных субстратов, включая гетерополисахариды. По пространственной организации каталитического домена и механизму катализа экзо-1,4^-О-глюкозаминидазы существенно отличаются от хитозаназ и даже более близки к хитиназам и К-ацетил^-О-гексозаминидазам. Однако, в отличие от аналогичных ферментов хитинолитической системы - К-ацетил-ß-D-гексозаминидаз, большинство экзо-1,4^-О-глюкозаминидаз способны эффективно гидролизовать полимерный хитозан, а не только его низшие олигомеры. Другой особенностью экзохитозаназ является их преимущественное распространение у микромицетов родов Aspergillus, Penicillium и др., хотя первоначально ферменты этого типа были открыты у актинобактерий Amycolatopsis orientalis (бывшее название - Nocardia

orientalis) (Nanjo et al., 1990). Среди прокариот 1,4-Р-Б-глюкозаминидазы описаны у архей Thermococcus kodakaraensis (Tanaka et al., 2003) и бактерий семейства Vibrionaceae (Hunt et al., 2008). Охарактеризованные экзохитозаназы демонстрируют различную структурную организацию и свойства (Nogawa et al., 1998), и их молекулярная классификация остается пока недостаточно разработанной по сравнению с эндохитозаназами.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Сафина Виолетта Рамилевна, 2023 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Актуганов, Г.Э Особенности продукции комплекса хитинолитических ферментов в периодической культуре Bacillus sp. 739/ Г.Э Актуганов, А.И. Мелентьев, Н.Г. Усанов // Биотехнология. - 2001. - №3. С. 25-33.

2. Актуганов, Г.Э. Синтез экзо-в-глюкозаминидаз грибом Penicillium sp. IB-37-2/ Г.Э. Актуганов, Н.Ф. Галимзянова, Г.А. Терегулова, А.И. Мелентьев // Прикл. биохимия и микробиология. -2016. - Т. 52, №5. - С. 520-526. https://doi.org/10.7868/S0555109916050020

3. Варламов, В.П. Хитин / хитозан и его производные: фундаментальные и прикладные аспекты / В.П. Варламов, А.В. Ильина, Б.Ц. Шагдарова, А.П. Луньков, И.С. Мысякина // Успехи биологической химии. - 2020. - Т. 60. -С. 317-368.

4. Журавлева, Н. В. Хитинолитические ферменты: источники, характеристика и применение в биотехнологии / Н. В. Журавлева, П. A. Лукьянов // Вестник Дальневосточного отделения Российской академии наук. - 2004. - №. 3. - С.76-86.

5. Костеневич, А.А. Бактериальные в-галактозидазы: биохимическое и генетическое разнообразие / А.А. Костеневич, Л.И. Сапунова // Труды БГУ. -2013. - Т. 8, Ч. 1. - С.52-63. http://elib.bsu.by/handle/123456789/103525

6. Куличевская, И.С. Выявление хитинолитического потенциала у пресноводного планктомицета Planctomicrobium piriforme / И.С. Куличевская, Д.Г. Наумов, А.А. Иванова, А.Л. Ракитин, С.Н. Дедыш // Микробиология. - 2019. - Т. 88, № 4. - С. 426-437. https://doi.org/10.1134/S0026365619040074

7. Кулиш, Е.И. Изучение процесса ферментативного расщепления хитозана в уксусной кислоте / Е.И. Кулиш, И.Ф. Туктарова, В.В. Чернова, С.В. Колесов //Вестник Башкирского университета. - 2013. - Т. 18, №3. - С. 688690. eLIBRARY ID:20418084.

8. Куликов, С.Н. Роль структуры в элиситорной активности хитозана / С.Н.

Куликов, В.П. Варламов // Вестник Казанского технологического университета. - 2008. - Т. 150, №2 - С.43-58.

9. Куликов, С.Н. Роль структуры в биологической активности хитозана / С.Н. Куликов, Ю.А. Тюрин, Д.А. Долбин, Р.З. Хайруллин // Вестник Казанского технологического университета. - 2007. - №6. - С.10-14.

10. Куликов, С.Н. Антибактериальная и антимикотическая активность хитозана: механизмы действия и роль структуры / С.Н. Куликов, Ю.А. Тюрин, Р.С. Фассахов, В.П. Варламов // Ж. Микробиологии, Эпидемиологии и Иммунобиологии. - 2009. - №5. - С.91-97.

11. Куликов, Д.Р. Антибактериальное действие низкомолекулярного хитозана в отношении Escherichia coli / Д.Р. Куликов, Д.Р. Оберемок, Е.А. Безродных, В.Е. Тихонов, В.П. Варламов // Ученые записки казанского университета. - 2013. - Том 155, кн. 3. - С.27-39.

12. Куликов, С.Н. Влияние структуры на биоцидные свойства хитозанового полимера / С.Н. Куликов, Р.З. Хайруллин // Вестник технологического университета. - 2016. - Т.19, №6. - С.152-155.

13. Мелентьев, А.И., Штамм бактерий Bacillus sp. для получения препарата против грибных возбудителей болезней злаковых культур / А.И. Мелентьев, Н.Г. Усанов, О.Н. Логинов. Патент РФ № 1743019. Заявл. 03.10.1989. Опубл. 30.05.1994.

14. Наумов, Д.Г. Иерархическая классификация гликозил-гидролаз / Д.Г. Наумов // Биохимия. - 2011. - Т. 76. - № 6. - С. 764-780. https://doi.org/10.31857/S0026365620040102

15. Наумов, Д.Г. Хитиназы, кодируемые в геномах ацидобактерий: происхождение и эволюция / Д.Г. Наумов, С.Н. Дедыш // Микробиология. - 2020. - T. 89, № 4. - С. 381-389. https://doi.org/10.31857/S0026365620040102

16. Немцев, С.В. Получение хитина и хитозана из медоносных пчел / С.В. Немцев, О.Ю. Зуева, Р.Г. Хисматуллин, А.И. Албулов, В.П. Варламов // Прикл. биохимия и микробиология. - 2004. - Т. 40, № 1. - С. 46-50.

eLIBRARY ID:17756873.

17. Полюдова, Т.В. Бактериальная адгезия и образование биопленок в присутствии хитозана и его производных / Т.В. Полюдова, Б.Ц. Шагдарова, В.П. Коробов, В.П. Варламов // Микробиология. - 2019. - T. 88, № 2. - С. 129-136. https://doi.org/10.1134/S0026365619020083

18. Синицын, А.П. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов / А.П. Синицын, В.М. Черноглазов, А.В. Гусаков // М., (Итоги науки и техники.) Сер. Биотехнология. -1993. - Т. 25. - С. 152.

19. Талалаев, Е.В. Отечественный препарат дендробациллин / Е.В. Талалаев, З.П. Федосова, Н.К. Федоров; Глав. упр. микробиол. пром-сти при Совете Министров СССР. Спец. отделение науч. -техн. информации микробиол. промышленности. Москва, - 1971. - С. 52.

20. Федорова, П.Ю. Новая циклодекстринглюканотрансфераза бактерий Paenibacillus ehimensis ВКМ B-2680D/ П.Ю. Федорова, Е.А. Гильванова, Г.Э. Актуганов, Н.Г. Усанов // Биотехнология. - 2012. - № 4. С. 31-38.

21. Хайруллин, Р.З. Зависимость растворимости хитозана от молекулярной массы и значения рН среды/ Р.З. Хайруллин, С.Н. Куликов, В.Е. Тихонов, Е.А. Степанов, С.А. Лопатин, В.П. Варламов // Вестник Казанского технологического университета. - 2010. - №7. - С.148-152.

22. Aam, B. Production of chitooligosaccharides and their potential application in medicine. Review / B. Aam, E. Heggset, A. Norberg, M. Sorlie, K. Varum, V. Ejsink //Mar. Drugs. - 2010. - V. 8, No. 5. - P.1482-1517. https://doi.org/10.3390/md8051482

23. Akiyama, K. Purification and gene cloning of a chitosanase from Bacillus ehimensis EAG1 / K. Akiyama, T. Fujita, K. Kuroshima, T. Sakane, A. Yokota, R. Takata // J. Biosci. Bioeng. - 1999. - V. 87, No. 3. - P. 383-385. https://doi.org/10.1016/s1389-1723(99)80050-4

24. Aliabadi, N. Thermostable chitinase from Cohnella sp. A01: isolation and product optimization/ N. Aliabadi, S. Aminzadeh, A.A. Karkhane, K. Haghbeen

// Braz. J. Microbiol. - 2016. - V. 47, No. 4. - P. 931-940. https://doi.org/10.1016/j.bjm.2016.07.009

25. Al-qwabah, A.A. Bacillus atrophaeus A7 Crude chitinase: characterization and potential role against Drosophila melanogaster Larvae/ A.A. Al-qwabah, M.O. Al-limoun, A.H. Al-Mustafa, W.A. Al-Zereini // Jordan J. Biol. Sci. -2018. - V. 11, No. 4. P. 451-459

26. Alfonso, C. Purification and properties of two endochitosanases from Mucor rouxii implicated in its cell wall degradation // FEMS Microbiol. Lett. -1992. -V. 95, No. 2-3. - P. 187-194. https://doi.org/10.1016/0378- 109790427-P

27. Attjioui, M. Synergistic antimicrobial effect of chitosan polymers and oligomers / M. Attjioui, D Gillet, N. El Gueddari, M. Moerschbacher // Molecular Plant-Microbe Interactions. - 2021. - V. 34, No. 7. - P. 770-778. https://doi.org/10.1094/MPMI-07-20-0185-R

28. Amakata, Y. Mitsuaria chitosanitabida gen. nov., sp. nov., an aerobic, chitosanase-producing member of the 'Betaproteobacteria' / Y. Amakata, Y. Matsuo, K. Shimono, J.K. Park, C.S. Yun, H. Matsuda, A. Yokota, M. Kawamukai // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 2005. - V. 55. (Pt 5). - P. 19271932. https://doi.org/10.1099/ijs.0.63629-0

29. Ando, A. Primary structure of chitosanase produced by Bacillus circulans MH-K1/ A. Ando, K. Noguchi, M. Yanagi, H. Shinoyama, Y. Kagawa, H. Hirata, M. Yabuki, T. Fujii // J. Gen. Appl. Microbiol. -1992.- V. 38, No. 2. - P. 135-144. https://doi.org/10.2323/jgam.38.135

30. Aragunde, H. Substrate Recognition and Specificity of Chitin Deacetylases and Related Family 4 Carbohydrate Esterases / H. Aragunde, X. Biarnes, A. Planas // Int. J. Mol. Sci. - 2018. - V. 19, No. 2. - P. 2- 30. doi:10.3390/ijms19020412

31. Baban, J. The roles of three Serratia marcescens chitinases in chitin conversion are reflected in different thermodynamic signatures of allosamidin binding / J. Baban, S. Fjeld, S. Sakuda, V.G. Eijsink, M. Sorlie // J. Phys. Chem. B. - 2010. - V. 114, No. 18. - P. 6144-6149. https://doi.org/10.1021/jp909801x

32. Bai, Y. Genomic comparison of chitinolytic enzyme systems from terrestrial and aquatic bacteria / Y. Bai, V.G.H. Eijsink, A.M. Kielak, J.A. van Veen, W. de Boer Genomic comparison of chitinolytic enzyme systems from terrestrial and aquatic bacteria // Environ. Microbiol. - 2016. - V. 18, No. 1. - P. 38-49. https://doi.org/10.1111/1462-2920.12545

33. Bayer, E.A. The cellulosomes: multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides / E.A. Bayer, J.-P. Belaich, Y. Shoham, R. Lamed // Annu. Rev. Microbiol. - 2004. - V. 58. - P. 521-554. https://doi.org/10.1146/annurev.micro.57.030502.091022

34. Beier, S. Bacterial chitin degradation - mechanisms and ecophysiological strategies. Review / S. Beier, S. Bertillsson // Front. Microbiol. - 2013. - V. 4. -P. 1-12. https://doi.org/10.3389/fmicb.2013.00149

35. Belova, S.E. Hydrolytic capabilities as a key to environmental success: chitinolytic and cellulolytic Acidobacteria from acidic Sub-arctic soils and boreal peatlands / S.E. Belova, N.V. Ravin, T.A. Pankratov, A.L. Rakitin, A.A. Ivanova, A.V. Beletsky, A.V. Mardanov, J.S. Sinninghe Damste, S.N. Dedysh // Front. Microbiol. - 2018. - V.9. - 2775. - P. 1-14. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.02775

36. Blanchard, J. Industrial applications of chitosanases / J. Blanchard, J.K. Park, I. Boucher, R. Brzezinski // In: Recent Advances in Marine Biotechnology. Ed. by: Fingerman M., Nagabhushanam R. New Hampshire: Biomaterials and bioprocessing, Science Publishers, 2003.- V. 9. - P. 257-277

37. Boucher, I. Purification and characterization of a chitosanase from Streptomyces N174 / I. Boucher, A. Dupuy, P. Vidal, W. Neugebauer, R. Brzezinski // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1992. - V. 38. - P. 188-193. https://doi.org/10.1007/BF00174466

38. Burke, S.A. Detection of molecular diversity in Bacillus atrophaeus by amplified fragment length polymorphism analysis/ S.A. Burke, J.D. Wright, M.K. Robinson, B.V. Bronk, R.L. Warren // Appl. Environ. Microbiol. - 2004. -

V. 70, No. 5. - P. 2786-2790. https://doi.org/10.1128/AEM.70.5.2786-2790.2004

39. Brasselet, C. Modification of chitosan for the generation of functional derivatives / C. Brasselet, G. Pierre, P. Dubessay, M. Dols-Lafargue, J. Coulon, J. Maupeu, A. Vallet-Courbin, H. de Baynast, T. Doco, P. Michaud, C. Delattre // Appl. Sci. - 2019. - V. 9, No. 7. - 1321. https://doi.org/10.3390/app9071321

40. BRENDA [Электронный ресурс]: The Comprehensive Enzyme Information System. URL: http://www.brenda-enzymes.org (дата обращения: 11.07.2021)

41. Brzezinska, M.S. Chitinolytic microorganisms and their possible application in environmental protection / M.S. Brzezinska, U. Jankiewicz, A. Burkowska, M. Walczak // Curr. Microbiol. -2014. - V. 68, No. 1. - P. 71- 81. https ://doi.org/10.1007/s00284 -013 -0440-4

42. Brurberg, M.B. Comparative studies of chitinases A and B from Serratia marcescens/ M.B. Brurberg, I.F. Nes, V.G.H. Eijsink // Biocatal. Biotransformation. - 1996. - V. 142. (Pt. 7). - P. 1581-1589. https://doi.org/10.1099/13500872-142-7-1581

43. CAZy database [Электронный ресурс]: Carbohydrate-Active enZYmes Database. URL: http://www.cazy.org/Glycoside-Hydrolases.html (дата обращения: 25.01.2020)

44. Chang, W.-T. An antifungal chitinase produced by Bacillus subtilis using chitin waste as a carbon source / W.-T. Chang, M.-L. Chen, S.-L. Wang // World J. Microbiol. Biotechnol. - 2010. - V. 26, No. 5. - P. 945-950. https://doi.org/10.1007/s11274- 009-0244-7

45. Cheung, R.C.F. Chitosan: an update on potential biomedical and pharmaceutical applications / R.C.F. Cheung, T.B. Ng, J.H. Wong, W.Y. Chan // Mar. Drugs. - 2015. - V. 13, No. 8. - P. 5156-5186. https://doi.org/10.3390/md13085156

46. Choi, Y.J. Purification and characterization of chitosanase from Bacillus sp. strain KCTC 0377BP and its application for the production of chitosan

oligosaccharides / Y.J. Choi, E.J. Kim, Z. Piao, Y.C. Yun, Y.C. Shin. // Appl. Environ. Microbiol. - 2004. - V. 70, No. 8. - P. 4522-4531. https://doi.org/10.1128/AEM.70.8.4522-4531.2004

47. Courtade, G. Chitin-active lytic polysaccharide monooxygenases / G. Courtade, F.L. Aachmann // Adv. Exp. Med. Biol. - 2019. - V. 1142. - P. 115129. https://doi.org/10.1007/978-981-13-7318-3_6

48. Cretoiu, M.S. Mining of unexplored habitats for novel chitinases--chiA as a helper gene proxy in metagenomics / M.S. Cretoiu, A.M. Kielak, W. Abu Al-Soud, S.J. Sorensen, J.D. van Elsas // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2012. - V. 94, No. 5. - P. 1347-1358. https://doi.org/10.1007/s00253-012-4057-5

49. Cruz Camarillo, R. Chitosanase activity in Bacillus thuringiensis / R. Cruz Camarillo, O. Sanchez Perez, Rojas N.G. Avelizapa, M. Gymez Ramirez, L.I. Rojas Avelizapa // Folia Microbiol. - 2004. - V. 49. No. 1. - P. 94-96. http://doi.org/10.1007/BF0 931653

50. da Silva, L.C.A. Optimization of chitosanase production by Trichoderma koningii sp. under solid-state fermentation / L.C.A. da Silva, T.L. Honorato, T.T. Franco, S. Rodrigues // Food Bioprocess. Technol. - 2012. - V. 5. - P. 1564-1572. https://doi.org/10.1007/s11947-010-0479-1

51. de Araujo, N.K. Production of enzymes by Paenibacillus chitinolyticus and Paenibacillus ehimensis to obtain chitooligosaccharides / N.K. de Araujo, C.F. de Assis, E.S. Dos Santos, G.R. de Macedo, L.F. de Farias, H.Jr. Arimateia, M. de Freitas Fernandes Pedrosa, M.G. Pagnoncelli // Appl. Biochem. Biotechnol. -2013. - V. 170, No. 2. - P. 292-300. https://doi.org/10.1007/s12010-013-0143-0

52. De Boer, W. Response of the chitinolytic microbial community to chitin amendments of dune soils / W. De Boer, S. Gerards, P.J.A. Klein Gunnewiek, R. Modderman // Biol. Fertil. Soils. - 1999. - V. 29, No. 2. - P. 170-177. https://doi.org/10.1007/s003740050541

53. De Marco, J.L. A Trichoderma harzianum chitinase destroys the cell wall of the phytopathogen Crinipellis perniciosa, the causal agent of witches' broom disease of cocoa/ J.L. De Marco, L.H.C. Lima, M.V. de Sousa, C.R. Felix //

World J. Microbiol. Biotechnol. - 2000. - V. 16, No. 4. - P. 383-386. https://doi.org/10.1023/A:1008964324425

54. De Tender, C. Peat substrate amended with chitin modulates the N-cycle, siderophore and chitinase responses in the lettuce rhizobiome / C. De Tender, B. Mesuere, F. Van der Jeugt, A. Haegeman, T. Ruttink, B. Vandecasteele, P. Dawyndt, J. Debode, E.E. Kuramae // Sci. Rep. - 2019. - V. 9, No. 1. - 9890. https ://doi.org/10.103 8/s41598-019-46106-x

55. Eibinger, M. Cellulose surface degradation by a lytic polysaccharide monooxygenase and its effect on cellulase hydrolytic efficiency / M. Eibinger, T. Ganner, P. Bubner, S. Rosker, D. Kracher, D. Haltrich, R. Ludwig, H. Plank, B. Nidetzky // J. Biol. Chem. - 2014. - V. 289, No. 52. - P. 35929-35938. https://doi.org/10.1074/jbc.M114.602227

56. Eisental, R. The direct linear plot: a new graphical procedure for estimation of enzyme kinetic parameters / R. Eisental, A. Cornish-Bowden // Biochem. J. -1974. - V. 139, No. 3. - P. 715-720. http://doi.org/10.1042/bj1390715

57. Frankowski, J. Purification and properties of two chitinolytic enzymes of Serratia plymuthica HRO-C48 / J. Frankowski, M. Lorito, F. Scala, R. Schmid, G. Berg, H. Bahl // Arch. Microbiol. - 2001. - V. 176, No. 6. - P. 421-426. https://doi.org/10.1007/s002030100347

58. Frey-Klett, P. Bacterial-fungal interactions: hyphens between agricultural, clinical, environmental, and food microbiologists / P. Frey-Klett, P. Burlinson, A. Deveau, M. Barret, M. Tarkka, A. Sarniguet // Microbiol. Mol. Biol. Rev. -2011. - V. 75, No. 4. - P. 583-609. https://doi.org/10.1128/MMBR.00020-11

59. Fukamizo, T. Chitinolytic enzymes: catalysis, substrate binding, and their application / T. Fukamizo // Curr. Protein. Pept. Sci. - 2000. - V. 1, No. 1. - P. 105-124. https://doi.org/10.2174/1389203003381450

60. Fukamizo, T. Reaction mechanism of chitosanase from Streptomyces sp. N174 / T. Fukamizo, Y. Honda, S. Goto, I. Boucher, R. Brzezinski // Biochem. J.-1995. - V.311. (Pt2). - P.377-83. https://doi.org/10.1042/bj3110377

61. Gao, J. Growth of hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus on chitin

involves two family 18 chitinases / J. Gao, M.W. Bauer, K.R. Shockley, M.A. Pysz, R.M. Kelly // Appl. Environ. Microbiol. - 2003. - V. 69, No. 6. - P. 3119. - 3128. https://doi.org/10.1128/aem.69.6.3119-3128.2003

62. Ghinet, M.G. Chitosanase from Streptomyces coelicolor A3(2): biochemical properties and role in protection against antibacterial effect of chitosan / M.G. Ghinet, S. Roy, D. Poulin-Laprade, M.-E. Lacombe-Harvey, M. Morosoli, R. Brzezinski // Biochem. Cell Biol. - 2010. - V. 88, No. 6. -P. 907-916. https://doi.org/10.1139/010-109

63. Golaki, B.P. Cloning, expression, purification, and characterization of lipase 3646 from thermophilic indigenous Cohnella sp. A01/ B.P. Golaki, S. Aminzadeh, A.A. Karkhane, B. Yakhchali, P. Farrokh, S.H. Khaleghinejad, A.A. Tehrani, S. Mehrpooyan // Protein Expr. Purif. - 2015. - V. 109. - P. 120126. https://doi.org/j.pep.2014.10.002

64. Gohi, B.FC.A. pH Dependence of chitosan enzymolysis / B.FC.A. Gohi, H.Y. Zeng, A.D. Pan, J. Han, J. Yuan // Polymers. - 2017. - V. 9, No. 5. - P. 174. https://doi.org/10.3390/polym9050174

65. Gooday, GW. Aggressive and defensive roles for chitinases / G.W. Gooday // EXS. - 1999. - V. 87. - P. 157-169. https://doi.org/10.1007/978-3-0348-8757-1_11

66. Frederiksen, R. F. Bacterial chitinases and chitin-binding proteins as virulence factors / R.F. Frederiksen, D.K. Paspaliari, T. Larsen, B.G. Storgaard, M.H. Larsen, H. Ingmer, J.J. Leisner // Microbiology. - 2013 - V. 159. (Pt5). -P. 833-847. doi:10.1099/mic.0.051839-0

67. Haab, D. Formation of the extracellular proteases from Trichoderma reesi QM 9414 involved in cellulase degradation / D. Haab, K. Hagspiel, K. Szakmary, P. Kubicek // J. Biotechnol. - 1990. - V. 16, No. 3-4. - P. 187-198. https://doi.org/10.1016/0168-1656(90)90035-A

68. Hadwiger, L.A. Plant science review: Multiple effects of chitosan on plant systems: solid science or hype / L.A. Hadwiger // Plant Sci. - 2013. - V. 208. - P. 42-49. https ://doi.org/10.1016/j.plantsci.2013.03.007

69. Hamer, S.N. Enzymatic production of defined chitosan oligomers with a specific pattern of acetylation using a combination of chitin oligosaccharide deacetylases / S.N. Hamer, S. Cord-Landwehr, X. Biarnes, A. Planas, H. Waegeman, B.M. Moerschbacher, S. Kolkenbrock // Sci. Rep. - 2015 - V. 5. -8716. https://doi.org/10.1038/srep08716

70. Hadwiger, L.A. Plant science review: Multiple effects of chitosan on plant systems: solid science or hype / L.A. Hadwiger // Plant Sci. - 2013. - V. 208. - P. 42-49. https ://doi.org/10.1016/j.plantsci.2013.03.007

71. Hamer, S.N. Enzymatic production of defined chitosan oligomers with a specific pattern of acetylation using a combination of chitin oligosaccharide deacetylases / S.N. Hamer, S. Cord-Landwehr, X. Biarnes, A. Planas, H. Waegeman, B.M. Moerschbacher, S. Kolkenbrock // Sci. Rep. - 2015 - V. 5. -8716. https://doi.org/10.1038/srep08716

72. Heggset, E.B. Degradation of chitosans with a family 46 chitosanase from Streptomyces coelicolor A3(2) / E.B. Heggset, A.I. Dybvik, I.A. Hoell, A.L. Norberg, M. Sorlie, V.G.H. Eijsink, K.M. Varum // Biomacromol. - 2010. - V. 11, No. 9. - P. 2487-2497. https://doi.org/10.1021/bm1006745

73. Heggset, E.B. Mode of action of a family 75 chitosanase from Streptomyces avermitilis/ E.B. Heggset, T.R. Tuveng, I.A. Hoell, Z. Liu, V.G.H. Eijsink, K.M. Varum // Biomacromol. - 2012. - V. 13, No. 6. - P.1733-41. https ://doi.org/10.1021/bm201521 h

74. Hekmat, O. Subsite structure of the endo-type chitin deacetylase from a deuteromycete, Colletotrichum lindemuthianum: an investigation using steady-state kinetic analysis and MS / O. Hekmat, K. Tokuyasu, S.G. Withers // Biochem J. - 2003. - V. 374. (Pt 2). - P. 369-380. https://doi.org/10.1042/BJ20030204

75. Helistö, P. Lytic enzyme complex of an antagonistic Bacillus sp. X-b: Isolation and purification of components / P. Helistö, G. Aktuganov, N. Galimzianova, A. Melentjev, T. Korpela // J. Chromatogr. B Biomed Sci. Appl. - 2001. - V. 758, No. 2. - P. 197-205. https://doi.org/10.1016/s0378-

4347(01)00181-5

76. Hemsworth, G.R. Lytic polysaccharide monooxygenases in biomass conversion / G.R. Hemsworth, E.M. Johnston, G.J. Davies, P.H. Walton // Trends Biotechnol. - 2015. - V. 33, No. 12. - P. 747-761. https ://doi.org/10.1016/j .tibtech.2015.09.006

77. Henrissat, B. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities / B. Henrissat // Biochem J. - 1991. - V. 280 (Pt2). - P. 309-316. https://doi.org/10.1042/bj2800309

78. Hirano, S. Classification of chitosanases by hydrolytic specificity toward N1, N4- diacetylchitohexaose / S. Hirano, M. Watanabe, K. Seki, A. Ando, A. Saito, M. Mitsutomi // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2012. - V. 76, No. 10. - P.1932-1937. https://doi.org/10.1271/bbb.120408

79. Hoell, I. Structure and function of enzymes acting on chitin and chitosan / I. Hoell, G. Vaaje-Kolstad, V. Eijsink // Biotechnol. Genet. Eng. Rev. - 2010. -V.27. - P.331-366. https://doi.org/10.1080/02648725.2010.10648156

80. Horn, S.J. Costs and benefits of processivity in enzymatic degradation of recalcitrant polysaccharides / S.J. Horn, P. Sikorski, J.B. Cederkvist, G. Vaaje-Kolstad, M. Sorlie, B. Synstad, G. Vriend, K.M. V.G. Varum, Eijsink // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2006. - V. 103, No. 48. - P. 18089-18094. https://doi.org/10.1073/pnas.0608909103

81. Horn, S.J. Novel enzymes for the degradation of cellulose / S.J. Horn, G. Vaaje-Kolstad, B. Westereng, V.G. Eijsink // Biotechnol. Biofuels. - 2012. - V. 5, No. 1. - P. 45. https://doi.org/10.1186/1754-6834-5-45

82. Hoßbach, J. A chitin deacetylase of Podospora anserina has two functional chitin binding domains and a unique mode of action / J. Hoßbach, F. Bußwinkel, A. Kranz, J. Wattjes, S. Cord-Landwehr, B.M. Moerschbacher // Carbohydr. Polym. - 2018. - V. 183. - P. 1-10. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2017.11.015

83. Huang, C.-J. Identification of an antifungal chitinase from a potential biocontrol agent, Bacillus cereus 28-9 / C.-J. Huang, T.-K. Wang, S.-C. Chung, C.-Y. Chen // J. Biochem. Mol. Biol. - 2005. - V. 38, No. 1. - P. 82-88.

https://doi.org/10.5483/BMBRep.2005.38.L082

84. Huang, L. Improved extracellular expression and high-cell-density fed-batch fermentation of chitosanase from Aspergillus fumigatus in Escherichia coli / L. Huang, Q. Wang, S. Jiang, Y. Zhou, G. Zhang, Y. Ma // Bioprocess. Biosyst. Eng. - 2016. - V. 39, No. 11.- P.1679-1687. https://doi.org/10.1007/s00449-016-1643-4

85. Hunt, D.E. Conservation of the chitin utilization pathway in the Vibrionaceae / D.E. Hunt, D. Gevers, N.M. Vahora, M.F. Polz // Appl. Environ. Microbiol. - 2008. - V. 74, No. 1. - P. 44-51. PMID: 17933912. https://doi.org/10.1128/AEM.01412-07

86. Ike, M. Cellobiohydrolase I (Cel7A) from Trichoderma reesei has chitosanase activity / M. Ike, Y. Ko, K. Yokoyama, J.-I. Sumitani, T. Kawaguchi, W. Ogasawara, H. Okada, Y. Morikawa // J. Mol. Catal. B Enzym.

- 2007. - V. 47, No. 3-4. - P. 159-163. https://doi.org/10.1016/j.molcatb.2007.05.004

87. Imoto, T. A simple activity measurement of lyzozyme / T. Imoto, K. Yagishita // Agric. Biol. Chem. - 1971. - V. 35, No. 7. P. -1154-1156. http://doi.org/10.1080/0001369.1971.10860050

88. Itoh, T. Crystal structure of chitinase ChiW from Paenibacillus sp. str. FPU-7 reveals a novel type of bacterial cell- surface-expressed multi-modular enzyme machinery/ T. Itoh, T. Hibi, F. Suzuki, I. Sugimoto, A. Fujiwara, K. Inaka, H. Tanaka, K. Ohta, Y. Fujii, A. Taketo, H. Kimoto // PLoS One. - 2016. - V. 11. -12:e0167310. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0167310

89. Itoh, Y. Functional analysis of the chitin-binding domain of a family 19 chitinase from Streptomyces griseus HUT6037: substrate-binding affinity and cis-dominant increase of antifungal function / Y. Itoh, T. Kawase, N. Nikaidou, H. Fukada, M. Mitsutomi, T. Watanabe, Y. Itoh // Biosci. Biotechnol. Biochem.

- 2002. - V. 66, No. 5. - P. 1084-1092. https://doi.org/10.1271/bbb.66.1084

90. Itoh, Y. Family 19 chitinase of Streptomyces griseus HUT6037 increases plant resistance to the fungal disease / Y. Itoh, K. Takahashi, H. Takizawa, N.

Nikaidou, H. Tanaka, H. Nishihashi, T. Watanabe, Y. Nishizawa // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2003. - V. 67, No. 4. - P. 847-855. https://doi.org/10.1271/bbb.67.847

91. Juárez-Hernández, E.O. The crystal structure of the chitinase ChiA74 of Bacillus thuringiensis has a multidomain assembly / E.O. Juárez-Hernández, L.E. Casados-Vázquez, L.G. Brieba, A. Torres-Larios, P. Jimenez-Sandoval, J.E. Barboza-Corona // Sci. Rep. - 2019. - V. 9. - P. 2591. https ://doi.org/10.103 8/s41598-019-39464-z

92. Jouzani, GS. Bacillus thuringiensis: a successful insecticide with new environmental features and tidings/ GS. Jouzani, E. Valijanian, R. Sharafi // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2017. - V. 101, No. 7. - P. 2691-2711. https://doi: 10.1007/s00253-017-8175-y

93. Jung, W.-J. Bioproduction of chitooligosaccharides. Review / W.-J. Jung, R.-D. Park // Mar. Drugs. - 2014. - V. 12, No. 11. - P. 5328-5356. https://doi.org/10.3390/md12115328

94. Kaczmarek, M.B. Enzymatic modifications of chitin, chitosan, and chitooligosaccharides / M.B. Kaczmarek, K. Struszczyk-Swita, X. Li, M. Szczçsna-Antczak, M. Daroch // Front. Bioeng. Biotechnol. - 2019. - V. 7. -243. https://doi.org/10.3389/fbioe.2019.00243

95. Kämpfer, P. Cohnella thermotolerans gen. nov., sp. nov., and classification of 'Paenibacillus hongkongensis' as Cohnella hongkongensis sp. nov. / P. Kämpfer, R. Rosselló-Mora, E. Falsen, H.J. Busse, B.J. Tindall // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 2006. - V. 56. (Pt 4). - P. 781-786. https://doi.org/10.1099/ijs.0.63985-0

96. Kanai, T. A global transcriptional regulator in Thermococcus kodakaraensis controls the expression levels of both glycolytic and gluconeogenic enzyme-encoding genes/ T. Kanai, J. Akerboom, S. Takedomi, H.J. van de Werken, F. Blombach, J. van der Oost, T. Murakami, H. Atomi, T. Imanaka // J. Biol. Chem. - 2007. - V. 282, No. 46. - P. 33659-33670. https://doi.org/10.1074/jbc.M703424200

97. Kang, L. Enzymatic production of high molecular weight chitooligosaccharides using recombinant chitosanase from Bacillus thuringiensis BMB171/ L. Kang, S. Jiang, L. Ma // Korean J. Microbiol. Biotechnol. - 2018. -V. 46. - P. 45-50. http://doi.org/10.4014/mbl.1712.12012

98. Karlsson, M. Evolution of family 18 glycoside hydrolases: diversity, domain structures and phylogenetic relationships/ M. Karlsson, J. Stenlid // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. - 2009. - V. 16, No. 3-4. - P. 208-223. https://doi.org/10.1159/000151220

99. Kawase, T. Comparison of enzymatic and antifungal properties between family 18 and 19 chitinases from S. coelicolor A3(2) / T. Kawase, S. Yokokawa, A. Saito, T. Fujii, N. Nikaidou, K. Miyashita, T. Watanabe // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2006. - V. 70, No. 4. - P. 988-998. https://doi.org/10.1271/bbb.70.988

100. Kawase, T. Distribution and phylogenetic analysis of family 19 chitinases in Actinobacteria / T. Kawase, A. Saito, T. Sato, R. Kanai, T. Fujii, N. Nikaidou, K. Miyashita, T. Watanabe // Appl. Environ. Microbiol. - 2004. - V. 70, No. 2. - P. 1135-1144. https://doi.org/10.1128/AEM.70.2.1135-1144.2004

101. KEGG PATHWAY Database [Электронный ресурс]: Carbohydrate metabolism. Amino sugar and nucleotide sugar metabolism - Reference pathway URL: https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html (дата обращения 15.02.2021).

102. Kendra, D.F. Characterization of the smallest chitosan oligomer that is maximally antifungal to Fusarium solani and elicits pisatin formation in Pisum sativum /D.F. Kendra, L.A. Hadwiger // Exp. Mycol. - 1984. - V. 8, No. 3. - P. 276-281. https://doi.org/10.1016/0147-5975(84)90013-6

103. Keyhani, N.O. The chitin catabolic cascade in the marine bacterium Vibrio furnissii. Molecular cloning, isolation, and characterization of a periplasmic chitodextrinase / N.O. Keyhani, S. Roseman // J. Biol. Chem. - 1996. - V. 271, No. 52. - P. 33414-33424. https://doi.org/10.1074/jbc.271.52.33414

104. Khan, N. Antifungal activity of Bacillus species against Fusarium and analysis of the potential mechanisms used in biocontrol / N. Khan, P. Martinez-

Hidalgo, T.A. Ice, M. Maymon, E.A. Humm, N. Nejat, E.R. Sanders, D. Kaplan, A.M. Hirsch // Front. Microbiol. - 2018 - 9:2363. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.02363

105. Kim, P. Purification of a constitutive chitosanase produced by Bacillus sp. MET 1299 with cloning and expression of the gene/ P. Kim, T.H. Kang, K.J. Chung, I.S. Kim, K.C. Chung // FEMS Microbiol. Lett. - 2004. - V. 240, No. 1. -P. 31-39. https://doi.org/10.1016/j.femsle.2004.09.006

106. Kimoto, H. Discoidin domain of chitosanase is required for binding to the fungal cell wall / H. Kimoto, M. Akamatsu, Y. Fujii, H. Tatsumi, H. Kusaoke, A. Taketo // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. - 2010. -V. 18, No. 1. - P. 14-23. https://doi.org/10.1159/000274308

107. Kobayashi, T. Characterization of chitosanase of a deep biosphere Bacillus strain / T. Kobayashi, O. Koide, S. Deguchi, K. Horikoshi // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2011. - V. 75. - P. 669-673. http://doi.org/10.1 71/bbb.100782

108. Koga, S. Biochemical characterization, cloning, and sequencing of ADP-dependent (AMP-forming) glucokinase from two hyperthermophilic archaea, Pyrococcus furiosus and Thermococcus litoralis / S. Koga, I. Yoshioka, H. Sakuraba, M. Takahashi, S. Sakasegawa, S. Shimizu, T. Ohshima // J. Biochem. (Tokyo) - 2000. - V. 128, No. 6. - P. 1079-1085. https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.jbchem.a022836

109. Kumar, M. Chemoenzymatic production and engineering of chitooligosaccharides and n-acetyl glucosamine for refining biological activities / M. Kumar, M. Rajput, T. Soni, V. Vivekanand, N. Pareek // Front. Chem. -2020 - V. 8, A. 469. - P. 19. https://doi.org/10.3389/fchem.2020.00469

110. Kumar, M. Chitinases — potential candidates for enhanced plant resistance towards fungal pathogens / M. Kumar, A. Brar, M. Yadav, A. Chawade, V. Vivekanand N. Pareek // Agriculture. - 2018. - V.8, No. 7. - P. 1-12. https://doi.org/10.3390/agriculture800088

111. Kuroshima, K. Bacillus ehimensis sp. nov. and Bacillus chitinolyticus sp. nov., new chitinolytic members of the genus Bacillus / K. Kuroshima, T.

Sakane, R. Takata, A. Yokota // Int. J. Syst. Evol. Bacterid. - 1996. - V. 46, No.

1. - P. 76-80. https://doi.org/10.1099/00207713-46-1-76

112. Lacombe-Harvey, M.-E. Chitinolytic functions in actinobacteria: ecology, enzymes, and evolution / M.-E. Lacombe-Harvey, R. Brzezinski, C. Beaulieu // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2018. - V. 102, No. 17. - P. 7219-7230. https://doi.org/10.1007/s00253-018-9149-4

113. Laokuldilok, T. Physicochemical, antioxidant, and antimicrobial properties of chitooligosaccharides produced using three different enzyme treatments / T. Laokuldilok, T. Potivas, N. Kanha et al. // Food Bioscience. - 2017. - V. 18. - P. 28-33. https://doi.org/10.1016/j.fbio.2017.03.004

114. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. -1970. - V. 227, No. 5259. -P. 680-685. http://doi.org/10.1038/22768a0

115. Lee, H.S. Identification and expression of GH-8 family chitosanases from several Bacillus thuringiensis subspecies / H.S. Lee, J.S. Jang, S.K. Choi, D.W. Lee, E.J. Kim, H.C. Jung, J.G. Pan // FEMS Microbiol. Lett. - 2007- V. 277, No.

2. - P. 133-141. http://doi.org/10.1111/j.1574-6968. 007.00944.x

116. Lee, J.S. Transfer of Bacillus ehimensis and Bacillus chitinolyticus to the genus Paenibacillus with emended descriptions of Paenibacillus ehimensis comb. nov. and Paenibacillus chitinolyticus comb. nov. / J.S. Lee, Y.R. Pyun, K.S. Bae // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. -2004. - V. 54. Pt. 3. P. 929-933. http://doi.org/10.1099/ijs.0.02765-0

117. Leveau, J.H. Bacterial mycophagy: definition and diagnosis of a unique bacterial-fungal interaction / J.H. Leveau, G.M. Preston // New Phytologist. -2008. - V. 177, No. 4. - P. 859-876. https://doi.org/10.1111/j.1469-8137.2007.02325.x

118. Li, X. The chitinolytic cascade in Vibrios is regulated by chitin oligosaccharides and a two-component chitin catabolic sensor/kinase / X. Li, S. Roseman // Proc.Natl. Acad. Sci. USA. - 2004. - V. 101, No. 2. - P. 627-631. https://doi.org/10.1073/pnas.0307645100

119. Lin, S.B. Low molecular weight chitosan prepared with the aid of cellulase, lysozyme and chitinase: characterization and antibacterial activity / S.B. Lin, Y.C. Lin, H.H. Chen // Food Chem. - 2009. - V. 116, No. 1. - P. 4753. http://doi.org/10.1016/j.foodchem.2009.02.002

120. Limón, M.C. Increased antifungal activity of Trichoderma harzianum transformants that overexpress a 33-kDa chitinase / M.C. Limón, J.A. Pintor-Toro, T. Benítez // Phytopathol. - 1999. - V. 89, No. 3. - P. 254-261. https://doi.org/10.1094/PHYT0.1999.89.3.254

121. Lodhi, G. Chitooligosaccharide and its derivatives: preparation and biological applications / G. Lodhi, Y.-S. Kim, J.-W. Hwang, S.-K. Kim, Jeon, Y.-J. J.-Y. Je, C.- B. Ahn, S.-H. Moon, B.-T. Jeon, P.-J. Park // BioMed Res. Int. - 2014. - Article ID 654913. - P. 1-13. https://doi.org/10.1155/2014/654913

122. Lombard, V. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013 / V. Lombard, H. Golaconda Ramulu, E. Drula, P.M. Coutinho, B. Henrissat // Nucleic Acids Res. - 2014. - V. 42 (Database issue). - P. 490-495. https://doi.org/10.1093/nar/gkt1178

123. Lopez-Moya, F. Omics for investigating chitosan as an antifungal and gene modulator / F. Lopez-Moya, L.V. Lopez-Llorca // J. Fungi (Basel). - 2016. - V. 2, No. 1: 11. https://doi.org/10.3390/jof2010011

124. Lopez-Moya, F. Molecular mechanisms of chitosan interactions with fungi and plants / / F. Lopez-Moya, M. Suarez-Fernandez, L.V. Lopez-Llorca // Int. J. Mol. Sci. - 2019. - V. 20, No. 2: 332. https://doi.org/10.3390/ijms20020332

125. Lyu, Q. Structural insights into the substrate-binding mechanism for a novel chitosanase / Q. Lyu, S. Wang, W. Xu, B. Han, W. Liu, D.N.M. Jones W. Liu, // Biochem. J. - 2014. - V. 461, No. 2. - P. 335-345. https://doi.org/10.1042/BJ20140159

126. Marín, P. Potential effects of environmental conditions on the efficiency of the antifungal tebuconazole controlling Fusarium verticillioides and Fusarium proliferatum growth rate and fumonisin biosynthesis / P. Marín, A. de Ory, A. Cruz, N. Magan, M.T. González-Jaén // Int. J. Food Microbiol. - 2013. - V.

165, No. 3. - P. 251-258. https://doi.Org/10.1016/j.ijfoodmicro.2013.05.022

127. Martinez-Zavala, S.A. Chitinases of Bacillus thuringiensis: phylogeny, modular structure, and applied potentials / S.A. Martinez-Zavala, U.E. Barboza-Perez, G. Hernandez-Guzman, D.K. Bideshi, Barboza-Corona J.E. // Front. Microbiol. - 2020. - V. 10:3032. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.03032

128. Matsumura, S. One-step preparation of alkyl ß-d-glucosaminide by the transglycosylation of chitosan and alcohol using purified exo-ß-d-glucosaminidase / S. Matsumura, E. Yao, K. Toshima // Biotechnol. Lett. -1999.- V. 21. - P. 451-456. https://doi.org/10.1023/A:1005598722617

129. Measuring protein concentration in the presence of nucleic acids by a 80/a 60: the method of Warburg and Christian, CHS Protoc., 2006; 1:pdb.prot4252. http ://doi.org/ 10.1101/pdb.prot4252

130. Meibom, K.L. The Vibrio cholerae chitin utilization program. / K.L. Meibom, X.B. Li, A.T. Nielsen, C.-Y. Wu, S. Roseman, G.K. Schoolnik // PNAS. - 2004. - V. 101, No. 8. - P. 2524-2529. https://doi.org/10.1073/pnas.0308707101

131. META CYC [Электронный ресурс]: Metabolic Pathway Database. URL: https://metacyc.org/MetaCycUserGuide.shtml (дата обращения: 11.05.2020).

132. Moebius, N. Active invasion of bacteria into living fungal cells / N. Moebius, Z. Üzüm, J. Dijksterhuis, G. Lackner, C. Hertweck // Elife. - 2014. -V. 2. - 3:e03007. https://doi.org/10.7554/eLife.03007

133. Mosallatpour, S. Novel halo- and thermo-tolerant Cohnella sp. A01 L-glutaminase: heterologous expression and biochemical characterization / S. Mosallatpour, S. Aminzadeh, M. Shamsara, R. Hajihosseini // Sci. Rep. - 2019.-V. 9. No. 1. P. 19062. https://doi.org/10.1038/s41598-019-55587-9

134. Muxika, A. Chitosan as a bioactive polymer: Processing, properties and applications / A. Muxika, A. Etxabide, J. Uranga, P. Guerrero, K. de la Caba // Int. J. Biol. Macromol. - 2017. - V. 105 (Pt 2). - P. 1358-1368. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2017.07.087

135. Nakagawa, Y.S. A small lytic polysaccharide monooxygenase from

Streptomyces griseus targeting a- and ß-chitin / Y.S. Nakagawa, M. Kudo, J.S. Loose, T. Ishikawa, K. Totani, V.G. Eijsink, G. Vaaje-Kolstad // FEBS J. -2015. - V. 282, No. 6. - P. 1065-1079. https://doi.org/10.1111/febs.13203

136. Nakamura, L.K. Taxonomic relationship of black-pigmented Bacillus subtilis strains and a proposal for Bacillus atrophaeus sp. nov. / L.K. Nakamura // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 1989. - V. 39, No. 3. - P. 295-300. https ://doi.org/10.1099/00207713 -39-3 -295

137. Nanjo, F. Purification and characterization of exo-ß-D-glucosaminidase, a novel type of enzyme, from Nocardia orientalis/ F. Nanjo, R. Katsumi, K. Sakai // J. Biol. Chem. - 1990. - V. 265, No. 17. - P. 10088-10094. PMID: 2351651.

138. Nampally, M. A high diversity in chitinolytic and chitosanolytic species and enzymes and their oligomeric products exist in soil with a history of chitin and chitosan exposure / M. Nampally, M.B. Govinda Rajulu, D. Gillet, T.S. Suryanarayanan, B.B. Moerschbacher // J. Biomed. Biotechnol. - 2015. - V. 2015 - 857639. https://doi.org/10.1155/2015/857639

139. Naqvi, S. The cell factory approach toward biotechnological production of high-value chitosan oligomers and their derivatives: an update / S. Naqvi, B.M. Moerschbacher // Crit. Rev. Biotechnol. - 2017. - V. 37, No. 1. - P. 11-25. https://doi.org/10.3109/07388551.2015.1104289

140. Naumoff, D.G. Hierarchical classification of glycoside hydrolases / D.G. Naumoff // Biochem. (Mosc). - 2011. - V. 76, No. 6. - P. 622-635. https://doi.org/10.1134/S0006297911060022

141. Nguyen, S.T.C. Function, distribution, and annotation of characterized cellulases, xylanases, and chitinases from CAZy / S.T.C. Nguyen, H.L. Freund, J. Kasanjian, R. Berlemont // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2018. -V. 102, No. 4. - P. 1629-1637. https://doi.org/10.1007/s00253-018-8778-y

142. Nguyen, A.D. Production and purification of a fungal chitosanase and chitooligomers from Penicillium janthinellum D4 and discovery of the enzyme activators / A.D. Nguyen, C.C. Huang, T.W. Liang, V.B. Nguyen, P.S. Pan, S.L. Wang // Carbohydr. Polym. - 2014. - V. 108. - P. 331-337.

https://doi.Org/10.1016/j.carbpol.2014.02.053

143. Ni, M. Identification and comprehensive evaluation of a novel biocontrol agent Bacillus atrophaeus JZB120050 / M. Ni, Q. Wu, J. Wang, W.C. Liu, J.H. Ren, D.P. Zhang, J. Zhao, D.W. Liu, Y.H. Rao, C.G. Lu // J. Environ. Sci. Health, Part B. - 2018. - V. 53, No. 12. - P. 777-785. https://doi.org/10.1080/03601234.2018.1505072

144. Nogawa, M. Purification and characterization of exo-beta-d-glucosaminidase from a cellulolytic fungus, Trichoderma reesei PC-3-7 / M. Nogawa, H. Takahashi, A. Kashiwagi, K. Ohshima, H. Okada, Y. Morikawa // Appl. Environ. Microbiol. - 1998. - V. 64, No. 3. - P. 890-895. https://doi.org/10.1128/AEM.64.3.890-895.1998

145. Olicón-Hernández, D.R. Comparison of chito-oligosaccharide production from three different colloidal chitosans using the endochitonsanolytic system of Bacillus thuringiensis / D.R. Olicón-Hernández, P.A. Vázquez-Landaverde, R. Cruz-Camarillo, L.I. Rojas-Avelizapa // Prep. Biochem. Biotechnol. - 2016.- V. 47, No. 2. - P. 116-122. https://doi.org/10.1080/10826068.2016.1181086

146. Oliveira Junior, E.N. Growth of phytopathogenic fungi in the presence of partially acetylated chitooligosaccharides / E.N. Oliveira Junior, N.E. El Gueddari, B.M. Moerschbacher, M.G. Peter, T.T. Franco // Mycopathologia -2008. - V. 166. - P. 163-174. https://doi.org/ 10.1007/s11046-008-9125-0

147. Oyeleye, A. Chitinase: diversity, limitations, and trends in engineering for suitable applications / A. Oyeleye, Y.M. Normi // Biosci. Rep. - 2018. - V. 38, No. 4. - BSR2018032300. https://doi.org/10.1042/BSR20180323

148. Pagnoncelli, M.G.B. Chitosanase production by Paenibacillus ehimensis and its application for chitosan hydrolysis / M.G.B. Pagnoncelli , N.K. de Araújo, N.M.P. da Silva , C.F. de Assis, S. Rodrigues., G.R. de Macedo // Braz. Arch. Biol. Technol. - 2010. - V. 53, No. 6. - P.1461-1468

149. Pantaleon, D. Unusual susceptibility of chitosan to enzymic hydrolysis / D. Pantaleon, M. Yalpani, M. Scollar // Carbohydr. Res. - 1992. - V. 237. - P. 325322. https://doi.org/10.1016/S0008-6215(92)84256-R

150. Park, J.K. Chitin catabolism in the marine bacterium Vibrio furnissii. Identification, molecular cloning, and characterization of a N,N'-diacetylchitobiose phosphorylase / J.K. Park, N.O. Keyhani, S. Roseman // J. Biol. Chem. - 2000. - V. 275, No. 42. - P. 33077-33083. https ://doi.org/10.1074/jbc.M001042200

151. Patil, R.S. Chitinolytic enzymes: an exploration / R.S. Patil, V. Ghormade, M.V. Deshpande // Enzyme Microb. Technol. - 2000. - V. 26, No. 7. - P. 473483. https://doi.org/10.1016/S0141 -0229(00)00134-4

152. Pelletier, A. Purification and characterization of three chitosanase activities from Bacillus megaterium P1 / A. Pelletier, J. Sygusch // Appl. Environ. Microbiol. - 1990. - V. 56, No. 4. - P. 844-848. https://doi.org/10.1128/aem.56A844-848.1990

153. Poshina, D.N. Accessibility of chitin and chitosan in enzymatic hydrolysis: A review / D.N. Poshina, S.V. Raik , A.N. Poshina, Y.A. Skorik // Polym. Degrad. Stab. - 2018. - V. 156. - P. 269-278. https ://doi.org/10.1016/j .polymdegradstab.2018.09.005

154. Poshina, D.N. Nonspecific enzymatic hydrolysis of a highly ordered chitopolysaccharide substrate / D.N. Poshina, S.V. Raik, A.A. Sukhova , I.V. Tyshkunova , D.P. Romanov, E.V. Eneyskaya, A.A. Kulminskaya, Y.A. Skorik // Carbohydr. Res. - 2020. - V. 498. - 108191. https ://doi.org/10.1016/j.carres.2020.108191

155. Raafat, D. Development of in vitro resistance to chitosan is related to changes in cell envelope structure of Staphylococcus aureus / D. Raafat, N. Leib, M. Wilmes, P. François, J. Schrenzel, H.G. Sahl // Carbohydr Polym. -2017. - V. 157. - P. 146-155. https://doi.org/10.1016Zj.carbpol.2016.09.075

156. Radjacommare, R. Purification and antifungal activity of chitinase against Pyricularia grisea in finger millet / R. Radjacommare, A. Ramanathan, A. Kandan, G.V. Sible, S. Harish, R. Samiyappan // World J. Microbiol. Biotechnol. - 2004. - V.20, No. 3. - P.251-256. https://doi.org/10.1023/B:WIBI.0000023829.98282.0f

157. Rahman, M.H. Inhibition of Fungal Plant Pathogens by Synergistic Action of Chito-. Oligosaccharides and Commercially Available Fungicides. / M.H. Rahman, L.R. Shovan, L.G. Hjeljord, B.B. Aam, V. Eijsink // PLoS ONE. -2014. - V. 9, No. 4. - e93192. doi:10.1371/journal.pone.0093192

158. Ramaiah, N. Use of a chiA probe for detection of chitinase genes in bacteria from the Chesapeake Bay (1) / N. Ramaiah, R.T. Hill, J. Chun, J. Ravel, M.H. Matte, W.L. Straube, R.R. Colwell // FEMS Microbiol. Ecol. - 2000. - V. 34, No. 1. - P. 63-71. https://doi.org/10.1111/j.1574-6941.2000.tb00755.x

159. Ransom-Jones, E. The Fibrobacteres: an important phylum of cellulose-degrading bacteria / E. Ransom-Jones, D.L. Jones, A.J. McCarthy, J.E. McDonald // Microb. Ecol. - 2012. - V. 63, No. 2. - P. 267-281. https://doi.org/10.1007/s00248-011-9998-1

160. Ravin, N.V. Genome analysis of Fimbriiglobus ruber SP5T, a planctomycete with confirmed chitinolytic capability / N.V. Ravin, A.L. Rakitin, A.A. Ivanova, A.V. Beletsky, I.S. Kulichevskaya, A.V. Mardanov, S.N. Dedysh // Appl. Environ. Microbiol. - 2018. - V. 84, No. 7. e02645-17. https://doi.org/10.1128/AEM.02645-17

161. Rebollar-Alviter, A. Baseline and differential sensitivity to two QoI fungicides among isolates of Phytophthora cactorum that cause leather rot and crown rot on strawberry / A. Rebollar-Alviter, L.V. Madden, S.N. Jeffers, M.A. Ellis // Plant Dis. - 2007. - V. 91, No. 12. - P. 1625-1637. https://doi.org/10.1094/PDIS-91-12-1625

162. Rodriguez-Kabana, R. The determination of soil chitinase activity: conditions for assay and ecological studies / R. Rodriguez-Kabana, G. Godoy, G. Morgan-Jones, R.A. Shelby // Plant Soil. - 1983. - V. 75, No. 1. - P. 95-106. https://doi.org/10.1007/BF02178617

163. Roman, D.L. Assessment of the properties of chitin deacetylases showing different enzymatic action patterns / D.L. Roman, M. Roman, H. Sletta, V. Ostafe, A. Isvoran // J. Mol. Graphics and Modelling. - 2019. - P. 41-48. https://doi.org/10.1016/jjmgm.2019.01.002

164. Sampson, M.N. Involvement of chitinases of Bacillus thuringiensis during pathogenesis in insects / M.N. Sampson, G.W. Gooday // Microbiology (Reading). - 1998. - V. 144. Pt 8. P. 2189-2194. https://doi.org/10.1099/00221287-144-8-2189.

165. Santos-Moriano, P. Efficient conversion of chitosan into chitooligosaccharides by a chitosanolytic activity from Bacillus thuringiensis / P. Santos-Moriano, P.E. Kidibule, E. Alleyne, A.O. Ballesteros, A. Heras, M. Fernandez-Lobato, F.J. Ploy // Process Biochem. - 2018. - V. 73. P. 10-108. http ://doi.org/ 10.1016/j .procbio.2018.07.017

166. Sawaguchi, A. Chitosan degradation and associated changes in bacterial community structures in two contrasting soils / A. Sawaguchi, S. Ono, M. Oomura, K. Inami, Y. Kumeta, K. Honda, R. Sameshima-Saito, K. Sakamoto, A. Ando, A. Saito // Soil Sci. Plant Nutr. - 2015. - V. 61, No. 3. - P. 471-480. http://dx.doi.org/10.1080/00380768.2014.1003965

167. Sella, S.R. Vandenberghe L.P., Soccol C.R. Bacillus atrophaeus: main characteristics and biotechnological applications - a review / S.R. Sella // Crit. Rev. Biotechnol. - 2015. - V. 35, No. 4. - P. 533-545. https://doi.org/10.3109/07388551.2014.922915

168. Sheng, J. Improvement in the thermostability of chitosanase from Bacillus ehimensis by introducing artificial disulfide bonds / J. Sheng, X. Ji, Y. Zheng, Z. Wang, M. Sun // Biotechnol. Lett. - 2016. - V. 38. No. 10. - P. 1809-1815. https ://doi.org/10.1007/s 10529-016-2168-2

169. Shimosaka, M. Cloning and characterization of a chitosanase gene from the plant pathogenic fungus Fusarium solani / M. Shimosaka, M. Kumehara, X.Y. Zhang, M. Nogawa, M. Okazaki // J. Ferment. Bioeng. - 1996. - V. 82, No. 5. -P. 426-431. https://doi.org/10.1016/S0922-338X(97)86977-2

170. Shinya, S. Interaction between chitosan and its related enzymes: A review / S. Shinya, T. Fukamizo // Int. J. Biol. Macromol. - 2017. - V. 104 (Pt B). - P. 1422- 1435. https ://doi.org/ 10.1016/j. ijbiomac.2017.02.040

171. Shinya, S. The first identification of carbohydrate binding modules specific

to chitosan / S. Shinya, T. Ohnuma, R. Yamashiro, H. Kimoto, H. Kusaoke, P. Anbazhagan, A.H. Juffer, T. Fukamizo // J. Biol. Chem. - 2013. - V.288, No. 2. -P. 30042-30053. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.503243

172. Shrivastava, S. Introduction to glycoside hydrolases: classification, identification and occurrence / S. Shrivastava // In: Industrial applications of glycoside hydrolases. Ed. by Shrivastava S. Springer: Singapore. - 2020. - P. 384. https://doi.org/10.1007/978-981-15-4767-6_1

173. Simunek, J. Excretome of the chitinolytic bacterium Clostridium paraputrificum J4 / J. Simunek, I. Koppova, G. Tiscenko, J. Dohnalek, J. Duskova // Folia Microbiol. (Praha) - 2012. - V. 57, No. 4. - P. 335-339. https://doi.org/10.1007/s12223-012-0137-2

174. Singh, R. Structural and biochemical insight into mode of action and subsite specificity of a chitosan degrading enzyme from Bacillus spec. MN / R. Singh, T. Weikert, S. Basa, B.M. Moerschbacher // Sci. Rep. - 2019. - V. 9, No. 1. - P. 1132. https://doi.org/10.1038/s41598-018-36213-6

175. Sorokin, D.Y. Natrarchaeobius chitinivorans gen. nov., sp. nov., and Natrarchaeobius halalkaliphilus sp. nov., alkaliphilic, chitin-utilizing haloarchaea from hypersaline alkaline lakes / D.Y. Sorokin, A.G. Elcheninov, S.V. Toshchakov, N.J. Bale, J.S. Sinninghe Damste, T.V. Khijniak, I.V. Kublanov // Syst. Appl. Microbiol. - 2019. - V. 42, No. 3. - P. 309-318. https ://doi.org/10.1016/j. syapm.2019.01.001

176. Sorokin, D.Y. Genome analysis of Chitinivibrio alkaliphilus gen. nov., sp. nov., a novel extremely haloalkaliphilic anaerobic chitinolytic bacterium from the candidate phylum termite group 3 / D.Y. Sorokin, V.M. Gumerov, A.L. Rakitin, A.V. Beletsky, J. Damste, G. Muyzer, Mardanov A.V., N.V. Ravin // Environ. Microbiol. - 2014. - V. 16, No. 6. - P. 1549-1565. https://doi.org/10.1111/1462-2920.12284

177. Sorokin, D.Y. Phenotypic and genomic properties of Chitinispirillum alkaliphilum gen. nov., sp. nov., a haloalkaliphilic anaerobic chitinolytic bacterium representing a novel class in the phylum Fibrobacteres / Sorokin

D.Y., A.L. Rakitin, V.M. Gumerov, A.V. Beletsky, J.S. Sinninghe Damste, A.V. Mardanov, N.V. Ravin // Front. Microbiol. - 2016. - V. 7. - P. 407. https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.00407

178. Sorlie, M. Using chitosan to understand chitinases and the role of processivity in the degradation of recalcitrant polysaccharides / M. Sorlie, S.J. Horn, G. Vaaje-Kolstad, V.G.H. Eijsink // React. Funct. Polym. - 2020. - V. 148:104488. https://doi.org/10.1016Zj.reactfunctpolym.2020.104488

179. Tanaka, T. A unique chitinase with dual active sites and triple substrate binding sites from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus kodakaraensis KOD1 / T. Tanaka, S. Fujiwara, S. Nishikori, T. Fukui, M. Takagi // Appl. Environ. Microbiol. - 1999. - V. 65, No. 12. - P. 5338-5344. https://doi.org/10.1128/AEM.65.12.5338-5344.1999

180. Tanaka, T. Different cleavage specificities of the dual catalytic domains in chitinase from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis KOD1 / T. Tanaka, T.Fukui, T.Imanaka // J. Biol. Chem. - 2001. - V. 276, No. 38. - P. 35629-35635. https://doi.org/10.1074/jbc.M105919200

181. Tanaka, T. Characterization of an exo-^-D-glucosaminidase involved in a novel chitinolytic pathway from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis KOD1 / T. Tanaka, T. Fukui, H. Atomi, T. Imanaka // J. Bacteriol. - 2003. - V. 185, No. 17. - P. 5175-5181. https://doi.org/10.1128/JB.185.17.5175-5181.2003

182. Terrapon, N. The CAZy database/the carbohydrate-active enzyme (CAZy) database: principles and usage guidelines / N. Terrapon, V. Lombard, E. Drula, P.M. Coutinho, B. Henrissat // Ed. by Aoki-Kinoshita K.F. Tokyo: Springer. -2017. - P 117-131. https://doi.org/10.1007/978-4-431-56454-6_6

183. Thadathil, N. Recent developments in chitosanase research and its biotechnological applications: A review / N. Thadathil, S.P.Velappan // Food Chem. - 2014. - V. 150. - P. 392-399. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2013.10.083

184. Tokura, S. Molecular weight dependent antimicrobial activity by chitosan /

S. Tokura, K. Ueno, S. Miyazaki, N. Nishi // Macromol. Symp. - 1997. - V. 120, No. 1. - P. 1-9. https://doi.org/10.1002/masy.19971200103

185. Vaaje-Kolstad, G. A. A small lytic polysaccharide monooxygenase from Streptomyces griseus targeting a- and P-chitin / G. A. Vaaje-Kolstad // FEBS J. - 2015. - V. 282, No. 6. - P. 1065-1079. https://doi.org/10.1111/febs.13203

186. Vaaje-Kolstad, G. The chitinolytic machinery of Serratia marcescens - a model system for enzymatic degradation of recalcitrant polysaccharides / G. Vaaje-Kolstad, S.J. Horn, M. Sorlie, V.G. Eijsink // FEBS J. - 2013. - V. 280, No. 13. - P. 3028-3049. https://doi.org/10.1111/febs.12181

187. Vaaje-Kolstad, G. An oxidative enzyme boosting the enzymatic conversion of recalcitrant polysaccharides / G. Vaaje-Kolstad, B. Westereng, S.J. Horn, Z. Liu, H. Zhai, M. Sorlie, V.G. Eijsink // Science. - 2010. - V. 330. (6001). - P. 219-222. https://doi.org/10.1126/science .1192231

188. van den Burg, H.A. Cladosporium fulvum Avr4 protects fungal cell walls against hydrolysis by plant chitinases accumulating during infection / H.A. van den Burg, S.J. Harrison, M.H. Joosten, J. Vervoort, de Wit // Mol. Plant Microbe Interact. - 2006. - V. 19, No. 12. - P. 1420-1430. https://doi.org/10.1094/MPMI- 19-1420

189. Veliz, E.A. Chitinase-producing bacteria and their role in biocontrol / E.A. Veliz, P. Martínez-Hidalgo, A.M. Hirsch // AIMS Microbiol. - 2017. - V. 4, No. 3(3). - P. 689-705. https://doi.org/10.3934/microbiol.2017.3.689

190. Vermaas, J.V. Effects of lytic polysaccharide monooxygenase oxidation on cellulose structure and binding of oxidized cellulose oligomers to cellulases / J.V. Vermaas, M.F. Crowley, G.T. Beckham, C.M. Payne // J. Phys. Chem. B. -2015. -V. 119, No. 20. - P. 6129-6143. https://doi.org/10.1021/acs.jpcb.5b00778

191. Viegas de Souza, R.H. Hydrophobic effect of amphiphilic derivatives of chitosan on the antifungal activity against Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus / R.H. Viegas de Souza, M. Takaki, R. de Oliveira Pedro, J. dos Santos Gabriel, M.J. Tiera, V.A. de Oliveira Tiera // Molecules. - 2013 - V. 18, No. 4. - P. 4437-4450. https://doi.org/10.3390/molecules18044437

192. Viens, P. Chitosanases from Family 46 of Glycoside hydrolases: from proteins to phenotypes / P. Viens, M.-E. Lacombe-Harvey, R. Brzezinski // Mar. Drugs. - 2015. - V. 13, No. 11. - P. 6566-6587. https://doi.org/10.3390/md13116566

193. Visagie, C.M. Identification and nomenclature of the genus Penicillium /

C.M. Visagie, J. Houbraken, J.C. Frisvad, S.B. Hong, C.H.W. Klaassen, G. Perrone, K.A. Seifert, J. Varga, T. Yaguchi, A. Samson // Stud. Mycol. - 2014. -V. 78. - P. 343-371. https://doi.org/10.1016/j.simyco.2014.09.001

194. Viterbo, A. Antifungal activity of a novel endochitinase gene (chit36) from Trichoderma harzianumRifai TM / A. Viterbo, S. Haran, D. Friesem, O. Ramot, I. Chet // FEMS Microbiol. Lett. - 2001. - V. 200, No. 2. - P. 169-174. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2001.tb10710.x

195. Viterbo, A. Significance of lytic enzymes from Trichoderma sp. in biocontrol of fungal plant pathogens / A. Viterbo, O. Ramot, Chernin, L. I. Chet // Antonie van Leeuwenhoek. - 2002. - V. 81, No. 1-4. - P. 549-556. https://doi.org/10.1023/a:1020553421740

196. Wang, J. Characterization of a novel fungal chitosanase Csn2 from Gongronella sp. JG / J. Wang, W. Zhou, H. Yuan, Y. Wang // Carbohydr. Res. -2008. - V. 343, No. 15. - P. 2583-2588. https://doi.org/10.1016/j.carres.2008.08.004

197. Watanabe, T. Family 19 chitinases of Streptomyces species: characterization and distribution / T. Watanabe, R. Kanai, T. Kawase, T. Tanabe, M. Mitsutomi, S. Sakuda, K. Miyashita // Microbiol. - 1999. - V. 145, No. 12. - P. 3353- 3363. https://doi.org/10.1099/00221287-145-12-3353

198. Weikert, T. Reassessment of chitosanase substrate specificities and classification / T. Weikert, A. Niehues, S. Cord-Landwehr, M.J. Hellmann, B.M. Moerschbacher // Nat. Commun. - 2017. - V. 8. - 1698. https ://doi.org/10.103 8/s41467-017-01667-1

199. Wilson, D.B. Three microbial strategies for plant cell wall degradation /

D.B. Wilson // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2008. - V. 1125. - P. 289-297.

https://doi.org/10.119 6/annals .1419.026

200. Worner, S. Microbial succession of anaerobic chitin degradation in freshwater sediments / S. Worner, M. Pester // Appl. Environ. Microbiol. - 2019. - V. 85, No. 18. - e00963-19. https://10.1128/AEM.00963-19

201. Xia, W. Advance in chitosan hydrolysis by non- specific cellulases. Review / W. Xia, L. Ping, L. Jing // Bioresour. Technol. - 2008. - V. 99, No. 15. - P. 6751 -6792. https ://doi.org/10.1016/j.biortech.2008.01.011

Xia, W. Biological activities of chitosan and chitooligosaccharides / W. Xia, P. Liu, J. Zhang, J. Chen // Food Hydrocolloids. - 2011. - V. 25, No. 2. - P. 170179. https://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2010.03.003

202. Yin, H. Low molecular weight and oligomeric chitosans and their bioactivities / H. Yin, Y. Du, J. Zhang // Curr. Top. Med. Chem. - 2009. - V. 9, No. 16. - P. 1546-1559. https://doi.org/10.2174/156802609789909795

203. Yoon, M.H. Cohnella panacarvi sp. nov., a xylanolytic bacterium isolated from ginseng cultivating soil / M.H. Yoon, L.N. Ten, W.T. Im // J. Microbiol. Biotechnol. - 2007.- V. 17, No. 6. - P. 913-918. PMID: 18050908

204. Zhang, J. Characterization of a new family 75 chitosanase from Aspergillus sp. W-2 / J. Zhang, H. Cao, S. Li, Y. Zhao, W. Wang, Q. Xu, Y. Du, H. Yin // Int. J. Biol. Macromol. - 2015. - V. 81. - P. 362-369. lttps://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2015.08.026

205. Zhang, W. Biochemical characterization of a bifunctional chitinase/lysozyme from Streptomyces sampsonii suitable for ^-acetyl chitobiose production / W. Zhang, Y. Liu, J. Ma, Q. Yan, Z. Jiang, S. Yang // Biotechnol. Lett. - 2020. - V. 42, No. 8. - P. 1489-1499. https://doi.org/10.1007/s10529-020-02834-z

206. Zhang, Y.-H. Kinetics and relative importance of phosphorolytic and hydrolytic cleavage of cellodextrins and cellobiose in cell extracts of Clostridium thermocellum / Y.-H. Zhang, L.R. Lynd // Appl. Environ. Microbiol. - 2004. - V. 70, No. 3. - P. 1563-1569. https://doi.org/10.1128/AEM.70.3.1563-1569.2004

207. Zhang, Z. The role of chitinase production by Stenotrophomonas maltophilia strain C3 in biological control of Bipolaris sorokiniana / Z. Zhang, G.Y. Yuen // Phytopathol. - 2000. - V. 90, No. 4. - P. 384-389. https://doi.org/10.1094/PHYTO.2000.90.4.384

208. Zhao, Y. Chitin-deacetylases: properties and application / Y. Zhao, R.-D. Park, R.A.A. Muzzarelli // Mar. Drugs. - 2010. - V. 8, No. 1. - P. 46. https://doi.org/10.3390/md8010024

209. Zhu, X.F. Cloning and overexpression of a new chitosanase gene from Pénicillium sp. D-1/ X.F Zhu, H.Q. Tan, C. Zhu, L. Liao, X.Q. Zhang, M. Wu // AMB Express. - 2012. - V. 2, No. 1. - P. 13. https://doi.org/10.1186/2191-0855- 2-13

ПРИЛОЖЕНИЕ 1 Краткое описание и характеристика объектов исследования

1.1. Штамм B. atrophaeus IB-33-1

Вид B. atrophaeus, известный ранее как B. subtilis var. niger, был отделен от близкородственного B. subtilis в 1989 г. (Nakamura et al., 1989; Burke et al., 2004). Для данного вида характерно образование темно-бурого пигмента на многих типах сред (Burke et al., 2004). Вид B. atrophaeus представляет собой перспективный продуцент для получения биоактивных соединений и ферментов (Sella et al., 2015). Эндоспоры B. atrophaeus имеют фундаментальное значение в разработке стандартов и биоиндикаторов мониторинга стерилизации и микробной дезинфекции (Sella et al., 2014, 2015). Хитиназы B. atrophaeus изучены недостаточно подробно; известно, в частности, о ларвицидной активности неочищенных хитиназ штамма А7 в отношении личинок Drosophila melanogaster (Al-qwahab et al., 2018). Хитиназы обнаружены в комплексе литических ферментов биоконтрольного штамма B. atrophaeus JZB120050, деградирующего клеточные стенки фитопатогенных грибов (Ni et al., 2018).

Штамм B. atrophaeus IB-33-1 был выделен в 1989 г. как антагонист фитопатогенных микромицетов - возбудителей корневых гнилей пшеницы. В культуральной среде штамма обнаружены циклические липопептиды, показывающие фунгицидную и бактерицидную активность (неопубликованные данные). На основе идентификации фрагмента гена 16 S рРНК (1415 п.о.) показано наибольшее сходство (99,3%) с типовым штаммом вида B. atrophaeus JCM 9070T.

1.2. Штамм B. thuringiensis B-387

О наличии хитозанолитической активности у представителей вида B. thuringiensis сообщалось ранее (Cruz Camarillo et al., 2004). У многих подвидов B. thuringiensis охарактеризованы хитозаназы семейства GH8,

индуцируемые в присутствии коллоидного или растворимого хитозана (Lee et al., 2008; Koboyashi et al., 2011). Применение хитозаназ B. thuringiensis для получения биоактивных олигомеров хитозана изучено в ограниченном количестве работ (Olicon-Hernandez et al., 2016; Kang et al., 2018; Santos-Moriano et al., 2018).

Штамм B. thuringiensis var. dendrolimus ВКМ B-387 был выделен в 1950-х гг. советским микробиологом Е.В. Талалаевым в Иркутском государственном университете и являлся основой биопрепарата «Дендробациллин», успешного применяемого ранее для борьбы с сибирским шелкопрядом (Талалаев, 1971).

В отличие от хитиназ, хитозаназы B. thuringiensis, включая их потенциальную роль в патогенезе к насекомым-вредителям (Sampson, Gooday, 1998; Martinez-Zavala et al., 2020) и антагонизме к фитопатогенным микромицетам, остаются малоизученными.

1.3. Штамм Cohnella sp. IB-P192

Род Cohnella был отделен от рода Paenibacillus в 2006 г. и состоял тогда лишь из четырех видов (Kämpfer et al., 2006; Kim et al., 2010). К настоящему времени этот род насчитывает более четырех десятков видов, многие из которых являются термофильными или термотолерантными. Среди представителей Cohnella охарактеризованы продуценты различных термостабильных ферментов, в т.ч. ксиланаз, протеаз, липаз и др. (Yoon et al., 2007; Golaki et al., 2015; Mosallatpour et al., 2019; Saghian et al., 2021). Термостабильная хитиназа обнаружена и частично охарактеризована только у штамма Cohnella sp. A01 (Aliabadi et al., 2016). Отобранный нами штамм Cohnella sp. IB-P192 на основе анализа фрагмента гена 16S рРНК (1492 п.о.) филогенетически наиболее близок (степень гомологии 99,7%) к типовому виду C. laevoribosii RI-39T. Секвенированная последовательность 16S рРНК депонирована в GenBank под номером FN432806 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/254826544).

1.4. Штамм Paenibacillus ehimensis IB-739

Вид P. ehimensis довольно подробно изучен в отношении синтеза хитинолитических ферментов и возможности применения для получения биоактивных олигомеров хитозана. Впервые он был охарактеризован в 1996 г. как представитель рода Bacillus., наряду с видом B. chitinolyticus (Kuroshima et al., 1996; Lee et al., 2004). Установлена способность оригинального изолята P. ehimensis к синтезу хитозаназы с Mw 31 кДа, данный фермент был очищен и охарактеризован (Akiyama et al., 1999). Клонирование и анализ гена хитозаназы P. ehimensis EAG1 позволили выяснить первичную структуру данного фермента и отнести его к семейству гликозил-гидролаз GH46 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/BAA23489). На основе анализа трехмерной модели 3-D структуры этой хитозаназы продемонстрирована возможность повышения ее термостабильности и каталитической активности за счет введения в молекулу белка искусственных дисульфидных мостиков (Sheng et al., 2016). К настоящему времени исследована деполимеризация хитозана, главным образом, под действием ферментного комплекса данного штамма. В ряде работ показана высокая степень конверсии хитозана хитинолитическим комплексом P. ehimensis до олигомеров со СП=2-6 (Pagnocelli et al., 2010; De Araujo et al., 2013).

Штамм P. ehimensis IB-739 был выделен в 1987 г. в качестве антагониста фитопатогенных грибов и продуцента ß-ЦГТазы. В дальнейшем у штамма была обнаружена ростостимулирующая активность по отношению к сельскохозяйственным растениям и животным. На основе P. ehimensis IB-739 был разработан и зарегистрирован биопрепарат Бациспецин БМ (Патент РФ № 1743019, 1989). Текущее филогенетическое положение штамма было уточнено в 2003 г. и полностью установлено в 2009 г. (Федорова с соавт., 2012). Его ближайшими родственными видами оказались P. ehimensis KCTC 3748T (AY116665), P. ehimensis IB-G2P (FN582330), P. ehimensis HSCC 595 (AB045101) и P. elgii SD17 (AY090110) с гомологией генов 16S рРНК 98,7%, 99,4%, 99,1% и 97,6% соответственно. Последовательность гена 16 S рРНК

(1486 п.н.) P. ehimensis IB-739 депонирована в базе данных NCBI под номером FN582329

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/268688097?report=genbank&log$=nucl align&blast_rank= 1&RID=TKBVZK5N015).

1.5. Штамм Penicillium sp. IB-37-2A

Представители мицелиальных грибов рода Penicillium демонстрируют хорошую способность к продукции внеклеточных хитозаназ, включая ферменты эндо- и экзо-действия (Zhu et al., 2012; Nguyen et al., 2014; Matsumura et al., 1999). Исследуемый в работе штамм был выделен как доминирующий изолят из выщелоченного чернозема в результате скрининга хитозан-деградирующих микроорганизмов. В ряду других активных изолятов пенициллов штамм развивался и активно деградировал хитозан на агаризованной среде при рН 4 и 37 °С.

На агаризованных средах с хитином и хитозаном гриб формировал умеренно опушенные округлые колонии среднего и крупного размера с мицелием серовато-оливкового цвета без интенсивного пигментообразования. В средах, содержащих 1-2% глюкозы (КГА, агар Чапека), колонии гриба приобретали более выраженное рыжевато-коричневое окрашивание с незначительной секрецией пигмента в агар.

По совокупности макро- и микроскопических свойств данный изолят был отнесен к роду Penicillium. По результатам филогенетического анализа секвенированной последовательности, охватывающей фрагменты 18S рРНК, регионы ITS1 - 5,8S рРНК - ITS2 и 28S рРНК (574 п.н.) исследуемый штамм показал наибольшую степень сходства (99%) с несколькими видами пенициллов, входящих в кладу P. janthinellum. В связи с этим, видовое наименование штамма было сохранено как Penicillium sp. до его дальнейшего уточнения с помощью дополнительных молекулярных баркодов (BenA, CamM, and RPB2) и фенотипических методов, используемых в идентификации представителей рода Penicillium (Visage et al., 2014).

Прочитанная ITS-последовательность была депонирована в GenBank под номером KY681453.1 (https://www.ncbi.nlm.nih.gOv/nuccore/KY681453.1).

Оптимальная температура для роста штамма Pénicillium sp. IB-37-2A на агаризованных средах 28±1°С. На средах с хитозаном и коллоидным хитином гриб рос медленнее, чем на КГА и агаре Чапека. Гидролиз обоих полимеров в агаре грибом наблюдается по периметру роста его колоний. Деградация коллоидного хитина в агаре протекает более медленно, с формированием размытых и непрозрачных зон просветления. При глубинном культивировании в жидкой среде скорость конверсии хитозана Pénicillium sp. IB-37-2A многократно превышала динамику утилизации коллоидного хитина, а выход сухой биомассы гриба при использовании хитозана в качестве источника углерода был в 2 раза выше по сравнению с хитином (рис. 1.1).

й 350 -

и

и

s 300 -

«

et

v

a и 250 -

й

<я

н <я 200 -

a

н

и

ю ¡^ 150 -

и

v

S

S 100 -

<я

К

a

v et 50 -

о

и

0 -

Убыль хитозана Убыль хитина

Биомасса в среде с хитозаном Биомасса в среде с хитином

10

8

«

Ю S

а

и

6 и s

п

а Я S

- 4

о

Й 2 со

50

100

150

200

250

Время культивирования, ч

Рис. 1.1. Динамика деградации коллоидного хитина и хитозана СД 85% штаммом Pénicillium sp. IB-37-2A и накопление биомассы гриба при глубинном культивировании в жидкой среде (28° С, 220 об/мин).

Основная особенность штамма Pénicillium sp. IB-37-2A состояла в наличии в преимущественной продукции хитозаназ при низком уровне

2

0

0

хитинолитической активности. Кроме того, штамм демонстрировал высокий уровень секреции К-ацетил-в-О-глюкозаминидазы (>1,5-2 тыс. ед/мл).

Общая оценка хитозан-деградирующего потенциала РвтсШшш Бр. 1В-37-2А позволяет рассматривать его ферментный комплекс как удобный объект для сравнительного изучения эффективности применения специфических гидролаз с экзо- и эндо-механизмом действия для получения хитоолигомеров, проявляющих антимикробную активность.

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

13С-ЯМР-спектральный анализ продуктов расщепления хитозаназ

Сравнительный 13С-ЯМР-анализ проводили для олигомерных продуктов 1, 2 и 4-ч гидролиза хитозана СД 85% (М^г 370 кДа) очищенной хитозаназой В. thuringiensis В-387 с соответствующими значениями средневесовой молекулярной массы М^^ 66,5, 45,3 и 2,4 кДа. В качестве стандартов использовали коммерческие образцы Б-глюкозамина (01еК) и N ацетил-Б-глюкозамина (01еКЛе). Сравнение 13С-ЯМР-спектров олигомеров глубокого (4 ч) и частичного (1 ч) гидролиза хитозана выявило у последних наличие более высокомолекулярной структуры. Концевым остаткам 01еК и 01еКЛе соответствовали сигналы С1 (а+в) (х.с. ~90 и 93 м.д.) и СН2-(С6) (а+в) (при х.с. ~54 и 57 м.д.) (рис. 2.1).

Рис. 2.1. 13С-ЯМР-спектры продуктов гидролиза хитозана СД 85% очищенной хитиназой (А) и хитозаназой (Б, В, Г) В. thuringiensis В-387.

Для срединных (внутриэфирных) остатков оценивали сигналы С1 при 99 м.д. и СН2 (С6) при 56 м.д. Ключевые различия в спектрах хитоолигомеров М№ 66,5 и 2,4 кДа проявлялись только в соотношении интенсивностей концевых групп к срединным без изменения положения сигналов. Расчет

средней степени полимеризации (N) хитоолигомеров, согласно критерию сравнения интегральных интенсивностей CH2 (C6) и интенсивностей протонов CH-групп (Ci- и С2-метиновых групп), подтвержденному дополнительным С13-интегральным экспериментом, показал значения ^р=6,5 и ^р=26,7 для хитоолигомеров Mw 2,4 кДа и Mw 66,5, соответственно.

Сравнительный анализ 13С-ЯМР-спектров олигомеров, полученных ферментативным гидролизом хитозана очищенной хитозаназой B. thuringiensis B-387 показал, что со стороны аномерного остатка выявляются только GlcN (деацетилированные фрагменты), поскольку химический сдвиг CH (C1) и CH (C2) в них идентичен химическому сдвигу модельного GlcN при полном отсутствии сигналов, соответствующих N-ацетилированному остатку. Это указывает на то, что хитозаназа B. thuringiensis B-387 способна катализировать только два типа гликозидных связей - основной GlcN-GlcN и GlcN-GlcNAc, т.е. относится к классу III. В спектрах продуктов гидролиза хитозаназы B. thuringiensis B-387 в качестве внутриэфирных (негидролизуемых) сигналов выявлялись только N-ацетилированные остатки, а у продуктов хитиназы этого же штамма - исключительно деацетилированные (рис. 2.1).

Соотношение аномерных продуктов ферментативной деполимеризации хитозана определяли в соответствии с интенсивностью H1-a и H1-ß сигналов в ^-ЯМР-спектрах образцов олигомеров. Согласно расчетам, соотношение a/ß-аномеров составляло около 2:1 для хитоолигосахаридов, образуемых хитозаназой B. thuringiensis B-387 и 1,6:1 - для продуктов хитиназы B. thuringiensis B-387. Данный факт указывает на инвертирующий механизм катализа хитозаназы B. thuringiensis B-387, который свойственен как для хитозаназ семейств GH8, так и для GH46. Подтверждение этого находят, как правило, в оценке динамики изменения редуцирующих сигналов H1a.

В 13С-ЯМР-спектре олигомеров (М№ 15,4 кДа), образуемых с помощью очищенной хитиназы В. thuringiensis В-387 (рис. 2.1, А), регистрировались (а+в)-аномерные сигналы, соответствующие как деацетилированным (01сК), так К-ацетилированным (01еКЛе) остаткам, при этом соотношение концевых 01сК/01сКЛс составляло около 2,8:1, что связано с преобладанием деацетилированных групп в исходном хитозане, а также может определяться способностью хитиназы В. thuringiensis В-387 гидролизовать помимо связей 01сКАс-01сКЛс, также связи 01сКАс-01сК и 01сК-01сКЛс.

Сравнение 13С-ЯМР-спектров продуктов гидролиза хитозаназ и хитиназ В. thuringiensis В-387 и хитоолигомеров, полученных с помощью аналогичных ферментов Р. ehimensis 1В-739, не выявило принципиальных различий в механизме гидролиза субстрата (рис. 2.2).

Рис. 2.2. 13С-ЯМР-спектры продуктов гидролиза хитозана СД 85% очищенной хитиназой (А) и хитозаназой (Б) Р. ehimensis 1В-739, а также хитозаназой (В) В. thuringiensis В-387.

Таким образом, хитиназы В. thuringiensis В-387 и Р. ehimensis 1В-739 проявляли сходство в механизме гидролиза хитозана, образуя олигомеры, содержащие преимущественно деацетилированные группы в качестве внутриэфирных связей. На редуцирующих концах данных олигомеров были представлены как деацетилированные, так и ацетилированные остатки.

На спектрах, снятых для олигомеров, образуемых хитиназой СокпвИа Бр. 1В-Р192, присутствовали (а+в)-аномерные сигналы, соответствующие исключительно ацетилированным остаткам. Тогда как у олигомеров, полученных с помощью хитиназ В. thuringiensis В-387 и Р. еНтвж18 1В-739, в равной степени были представлены сигналы деацетилированных (а+в) -аномеров (рис. 2.3).

Рис. 2.3. 13С-ЯМР-спектры продуктов 24-ч гидролиза хитозана СД 85% очищенными хитиназами Р. ehimensis 1В-739 (А), В. thuringiensis В-387 (Б) и СоЫеНа Бр. 1В-Р192 (В). Тонкими стрелками обозначены сигналы, соответствующие ацетилированным (а+в)-аномерам, жирными -деацетилированным (а+в)-аномерам.

Приведенные данные свидетельствуют об исключительной специфичности хитиназы Cohnella Бр. 1В-Р192 в отношении связи 01еКАе-01еКАе, что косвенно подтверждалось также низкой эффективностью этого фермента в деградации высокодеацетилированных форм хитозана.

ПРИЛОЖЕНИЕ 3

Ингибирование роста фитопатогенных микромицетов на агаризованной среде КГА хитоолигомерами, полученными при разной степени деструкции хитозана

Тест-штамм/ концентрация хитоолигомеров

Время обработки хитозана ферментом

sorokjnignçi 1ВГ-124/ 10 м г/мл

Altemarjja ajternata ВКМ F-3047/ 10 мг/мл

Fusarium culmorum ВКМ Г 844/ 0,5 мг/мл

Вода

Контроль 1 час 2 часа 3 часа 4 часа

■éft ^Иг 0 О

to • { 1*1 (О)

V*4 ( Э щ □

Mw 66,5 кДа

Mw 45,9 кДа

Mw 16,7 кДа

Mw 2,4 кДа

Средневесовая молекулярная масса хитоолигосахаридов

Рис. 3.1. Влияние олигомеров, полученных при гидролизе хитозана СД 85% очищенной хитозаназой B. thuringiensis B-387 в течение 1, 2, 3 и 4 ч инкубации (соотношение фермент/субстрат 1:600 о/о) на рост и развитие фитопатогенных микромицетов (5-е сутки инкубации культуры).

Рис. 3.2. Распределение фунгицидной активности в различных фракциях олигомеров, образующихся после 2-ч ферментативного гидролиза хитозана СД 85% хитозаназой B. thuringiensis B-387 (фермент - субстрат 1:600, о/о; 120 ч инкубации при 28° С) на развитие фитопатогенных микромицетов.

*Супернатант - низкомолекулярные олигомеры Mw, 2,2 кДа, DPI 1,12, растворимость >100 мг/мл;

**Осадок - олигохитозан Mw, 45,3 кДа, DPI 1,95, растворимость >50 мг/мл.