Закономерности молекулярно-клеточных адаптационных процессов в системе крови при остром и хроническом гипокинетическом стрессе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.01, доктор биологических наук Латюшин, Ян Витальевич

• Латюшин, Ян Витальевич
• доктор биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации доктор биологических наук Латюшин, Ян Витальевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Адаптационно-компенсаторные реакции системы крови в условиях стресса

1.1. Влияние стресс-реакции на систему крови и развитие общего адаптационного синдрома.

1.2. Цитокины-медиаторы взаимодействия между нейроэндокринной и иммунной системами, обеспечивающие адаптационные процессы в системе крови.

1.3. Роль кроветворных и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в адаптационных процессах в условиях стресса.

1.4. Состояние прооксидантно - антиоксидантной системы при стрессовых воздействиях.

1.5. Регулирующая роль про- и противовоспалительных цитокинов в системе крови в поддержании гомеостаза при различных экстремальных воздействиях.

1.6. Влияние гормонов и цитокинов на поведенческую активность экспериментальных животных.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Экспериментальные животные и моделирование гипокинезии.

2.2. Гематологические методы исследования.

2.3. Иммунологические методы.

2.4. Физиологические методы:.

2.5. Биохимические методы исследования.

2.5.1. Методика определения перекисного окисления липидов.

2.5.2. Методика определения малонового диальдегида.

2.5.3. Определение активности моноаминооксидазы (МАО) (К.Ф.1.4.3.4).

2.5.4. Определение активности супероксидцисмутазы (СОД) (К.Ф.1.15.1.1.) в органах.

2.5.5. Определение активности каталазы (К.Ф.1.11.1.6.) в органах.

2.5.6. Определение церулоплазмина в тканях.

2.5.7. Определение глутатионредуктазы (К.Ф. 1.6.4.2.).

2.5.8 Статистические методы обратоки данных.

ГЛАВА 3. Влияние повреждающего действия острого и хронического гипокинетического стресса на систему крови у экспериментальных животных.

3.1. Влияние острого и хронического гипокинетического стресса на содержание гормона кортикостерона и активность моноаминооксидазы (МАО).

3.2. Влияние острого и хронического гипокинетического стресса на процессы перекисного окисления липидов(ПОЛ) в ткани костного мозга, тимуса и селезенки у экспериментальных животных.

3.3. Влияние острого и хронического гипокинетического стресса на состояние стресс-лимитирующей системы у экспериментальных животных.

3.4. Влияние острого и хронического гипокинетического стресса на изменение массы тимуса и содержания в нем ЯСК у экспериментальных животных.

3.5. Влияние острого и хронического гипокинетического стресса на изменение массы селезенки и количества ядросодержащих клеток в ней у экспериментальных животных.

3.6. Влияние острого и хронического гипокинетического стресса на показатели количества лейкоцитов в периферической крови и клеток лейкоцитарной формулы у экспериментальных животных.

3.7. Влияние острого и хронического гипокинетического стресса на содержание количества клеток миелоидного ряда костного мозга экспериментальных животных.

ГЛАВА 4. Роль цитокинов в системе крови в условиях острого и хронического гипокинетического стресса.

4.1. Динамика содержания провоспалительных цитокинов в сыворотке крови у экспериментальных животных, подвергшихся действию острого и хронического гипокинетического стресса.

4.2. Динамика содержания провосполительных цитокинов в ткани костного мозга у экспериментальных животных подвегшихся действию острого и хронического гипокинетического стресса.

4.3. Динамика содержания противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови у экспериментальных животных, подвергшихся действию острого и хронического гипокинетического стресса.

4.4. Влияние острого и хронического гипокинетического стресса на содержание противовоспалительных цитокинов в ткани костного мозга у экспериментальных животных.

4.5. Изучение поведенческой активности животных, перенесших острый и хронический гипокинетический стресс.

4.6. Влияние предварительного введения препарата церулоплазмина на поведенческую активность животных, перенесших острый и хронический гипокинетический стресс (гипокинезию).

Глава 5. Влияние препарата граноцит и препарата церулоплазмин на систему крови у экспериментальных животных, подвергшихся действию острого и хронического гипокинетического стресса.

5.1. Влияние препарата граноцит на общее количество лейкоцитов, лейкоцитарную формулу периферической крови и массу тела экспериментальных животных при действии острого и хронического гипокинетического стресса.

5.1.1. Влияние препарата граноцит на общее количество лейкоцитов в периферической крови и лейкоцитарную формулу при действии острого и хронического гипокинетического стресса.

5.1.2. Влияние препарата граноцит на показатели лейкоцитарной формулы у экспериментальных животных, подвергшихся действию острого и хронического гипокинетического стресса.

5.2. Влияние препарата граноцит на количество клеток костного мозга у экспериментальных животных, подвергшихся действию острого и

5.3. Влияние препарата граноцит на общее количество кариоцитов и на количество мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в костном мозге у экспериментальных животных, подвергшихся действию

5.4. Влияние препарата граноцит на динамику массы тимуса, селезенки и ядросодержащих клеток в них у экспериментальных животных, подвергшихся действию острого и хронического гипокинетического стресса

5.4.1. Влияние препарата граноцит на массу тимуса экспериментальных животных, находящихся в условиях острого и хронического гипокинетического стресса.

5.4.2. Влияние препарата граноцит на массу селезенки экспериментальных животных, находящихся в условиях острого и хронического гипокинетического стресса.

5.4.3. Влияние препарата граноцит на количество ЯСК в селезенке экспериментальных животных, находящихся в условиях острого и хронического гипокинетического стресса.

5.5. Влияние препарата церулоплазмин на активность про- и антиоксидантных систем у экспериментальных животных, подвергшихся действию острого и хронического гипокинетического стресса.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Закономерности молекулярно-клеточных адаптационных процессов в системе крови при остром и хроническом гипокинетическом стрессе»

Актуальность проблемы

Исследования гипокинезии как стресс-фактора началось в 60-70-годы XX века в связи с активным развитием космической биологии (В.В. Португалов, 1967; Г.П. Быков, 1970; И.В. Федоров и др., 1972; С.Е. Ли, О.И. Кириллов, 1974; Е.А. Коваленко, 1975). Экспериментальные работы 8090-ых годов прошлого века характеризовались изучением адаптационных изменений на различных уровнях организации биологических систем (Е.А. Коваленко, H.H. Гуровский, 1980; П.Д. Горизонтов, 1983; В.Н. Швец и др., 1984; С.М. Иванова и др., 1986; Д.З. Шибкова, 1987; Ф.З. Меерсон, H.A. Фомин, В .И. Павлова, Д.З. Шибкова, 1988; И.А. Попова, 1988; Д.И. Бельченко, 1990).

В работах Е.А. Воротниковой (1984), О.Г. Газенко и др. (1986), Ф.З. Меерсона и др. (1988), P.A. Тиграняна (1990), А.Г. Грицука (1995), Е.А. Коваленко (2000), Т. Kawata et. al. (1988) длительная гипокинезия являлась моделью, при которой реализуются резервные механизмы адаптации организма на морфо-функциональном, биохимическом и генетическом уровне (Ф.З. Меерсон, И.Ю. Малышев, Е.Б. Манухина, 1998).

В исследованиях Б.И. Кузника, H.H. Цыбикова (1981), Д.Н. Маянского (1991), В.П. Акопяна, JI.C. Баляна и др. (1997) показано, что, попав в экстремальные условия, организм мобилизует различные адаптационные программы, достигая полноценного приспособления к стрессирующим факторам внутренней и внешней среды.

В настоящее время известно, что система крови играет большую роль при ответной реакции организма на любое стрессорное воздействие (И.А. Волчегорский, 1993; Н.В. Васильев, Ю.М. Захаров, Т.И. Коляда, 1992; Е.Д. Гольдберг и др., 2005; П.Д. Горизонтов и др., 1983; A.M. Дыгай и др., 2005; В.П. Шахов и др., 2008; В.Э. Цейликман, 1998; Б.Г. Юшков и др., 1996;

А.П. Ястребов и др., 2009; В.А. Черешнев и др., 2004,; Д.З. Шибкова,

A.B. Аклеев, 2006, С.Л Сашенков и др., 2006, 2008).

В последние десятилетия активно изучается влияние стресса на механизмы регуляторных процессов в организме человека и животных, показана его роль в адаптационном процессе при участии цитокиновой сети и антиоксидантов на моделях эмоционального, болевого, травматического и прочих стрессов. При действии стресса вся регулирующая информация идет от нервной системы через гипофизарно-адреналовую, лимфоидную систему и гемопоэтические органы. Существенно, что весь этот процесс реализуется на уровне исполнительных тканей и органов (P.M. Хаитов, 2001; Ю.Б. Лишманов и др., 2003; A.C. Симбирцев, 2004).

Очевидно, что общий адаптационный синдром развивается на фоне перестройки активности локального микроокружения, в построении которого большую роль играют стромальные элементы и цитокины (Б .Г. Юшков,

B.Г. Климин, М.В. Северин, 1999, В.П. Шахов и др., 2005, 2008).

В настоящее время разрабатываются новые схемы восстановления гемопоэза. Особая роль принадлежит мультипотентным мезенхимальным стромальным клеткам (ММСК). Они способствуют росту гемопоэтических предшественников путем секреции таких цитокинов, как ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-11, ИЛ-12, ИЛ-14, ИЛ-15 (И.Ю. Маклакова, А.П. Ястребов, Д.Ю. Гребнев, 2009). Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки участвуют в формировании специфического микроокружения многих органов, включая и костный мозг. Они являются основой матричной единицы, так называемых «ниш», в которых происходят процессы хранения, созревания и дифференцировки предшественников эритропоэза, гранулоцитомонопоэза, тромбоцитопоэза и их малодифференцированных прекурсоров (A.M. Дыгай, В.П. Шахов, 1989; Ю.А. Романов и др., 2005; Beyer et. al., 2006; L.M. da Silva et al, 2008; F.M. Watt, B.L. Hogan, 2000, 2006).

Исследований взаимодействия системы мезенхимопоэза и цитокиновой сети при хроническом стрессе крайне мало. Имеются противоречивые сведения об уровнях содержания цитокинов и костномозговых мезенхимальных стволовых клеток при хроническом стрессе, вызванном гипокинезией (И.Л. Чертков, O.A. Гуревич, 1984; A.C. Симбирцев, 2004; F.M. Watt, B.L. Hogan, 2000; Y. Miura, Z. Gao, M. Miu, 2006).

Также противоречивы сведения об участии системы крови и регулирующих её факторов в обеспечении резистентности организма к неблагоприятному действию гипокинезии (Г.И. Козинец и др., 1983; Г.Н. Дурнова и др., 1989; Б.И. Кузник и др., 1989; P.A. Тигранян и др., 1990; С.Н. Теплова, Д.А. Алексеев, 2002). По-прежнему остаются открытыми вопросы коррекции повреждающего действия гипокинезии на организм человека, животных и систему крови, в частности.

Большой интерес представляет собой гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), который является ростовым фактором для гранулоцитарно-макрофагальных типов клеток - предшественников, способным усиливать процессы фагоцитоза в лейкоцитах. В отдельных работах по изучению действия Г-КСФ на пул мезенхимальных стволовых клеток показано, что под действием данного цитокина увеличивается выброс их количества из костного мозга в кровь (В.П. Шахов, И.А. Хлусов, Г.Ц. Дамбаев и др., 2004; R.W. Johnson et al, 1997). Однако эти работы касаются преимущественно заболеваний со стороны сердечно - сосудистой системы. При таком стресс-факторе, как гипокинезия, закономерности молекулярно-клеточных адаптационных процессов в системе крови изучены недостаточно и отражены лишь в единичных работах (Ф.И. Ершов и др., 2004).

В связи с отсутствием систематизированных данных о влиянии длительной гипокинезии на состояние костномозгового кроветворения показатели миелопоэза), регулирующего влияния цитокинов на 9 кроветворение актуальным является изучение молекулярно-клеточных изменений в крови при адаптации к гипокинезии и возможности коррекции повреждающего действия гипокинетического фактора. Указанные предпосылки определили цель и направления настоящего исследования.

Цель исследования: установить закономерности адаптации системы крови на молекулярно-клеточном уровне к действию острого и хронического гипокинетического стресса с целью обоснования коррекции апластических нарушений.

В рамках этой общей цели решались следующие задачи:

1. Выявить динамику содержания гуморальных факторов регуляции в плазме крови и тканях костного мозга, селезенки и тимуса на разных этапах развития гипокинетического синдрома.

2. Определить активность системы «перекисное окисление липидов -антиоксидантная защита» у экспериментальных животных в динамике 30-ти суточной гипокинезии.

3. Выявить характер взаимосвязей между исследуемыми параметрами системы крови экспериментальных животных на разных стадиях формирования адаптационных процессов при гипокинетическом стрессе.

4. Оценить возможность снижения деструктивных процессов в органах системы крови в условиях 30-ти суточной гипокинезии при использовании препарата церулоплазмина.

5. Установить возможность ускорения репарационных процессов в органах системы крови в условиях 30-ти суточной гипокинезии при использовании препарата граноцита.

Научная новизна исследования

Установлен комплекс параметров, характеризующих состояние систем органов экспериментальных животных в зависимости от длительности воздействия гипокинетического стресса: на ранних сроках (1-ые - 7-ые сутки) в периферической крови достоверно повышается содержание кортикостерона, цитокинов (ИЛ-10, ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-4), наблюдается выраженный лейкоцитоз; в костном мозге увеличивается содержание цитокинов (ИЛ-1а, ИЛ-6, ИЛ-4), отмечена активация антиоксидантных ферментов и миелопоэза; в хронической фазе гипокинетического синдрома в плазме крови повышается содержание цитокинов (ИЛ-1а, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-4, ИЛ-10), а в костном мозге - ИЛ-10, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10.

С увеличением сроков гипокинетического воздействия нарастают деструктивные изменения в органах системы кроветворения, что подтверждается достоверным повышением уровня ПОЛ в костном мозге, селезенке и тимусе на фоне снижения содержания антиоксидантных ферментов; введение гуморального антиоксиданта церулоплазмина на ранних стадиях гипокинетического стресса сопровождалось повышением активности антиоксидантных ферментов (СОД, каталаза) и снижением интенсивности процессов липопероксидации.

Впервые экспериментально установлено, что глубина деструктивных процессов в кроветворных органах достоверно снижалась при корреции последствий, вызванных острым и хроническим гипокинетическим стрессом, препаратом граноцит. Впервые показано, что дестабилизация гомеостаза, вызванная гипокинетическим воздействием, сопровождается перестройкой регуляторных механизмов в системе крови, что приводит к включению процессов компенсации с участием мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК). Баланс между процессами деструкции и регенерации клеточных элементов в системе крови при действии гипокинетического стресса был обусловлен активацией процесса пролиферации ММСК на фоне введения препарата граноцит.

Выявленная реакция системы цитокиновых регуляторов подтверждает этапность включения молекулярно-клеточных адаптационных процессов в системе крови, что подтверждается изменением соотношения провоспалительных и противовоспалительных цитокинов при остром и хроническом гипокинетическом стрессе. Впервые показано, что уровень провоспалительных цитокинов повышался в ранние сроки воздействия ГК (исключение составил ИЛ-12), а содержание противовоспалительных цитокинов было достоверно повышено на всех сроках гипокинезии.

Использование цитокиновой стимуляции (препарат граноцит) и антиоксиданта (препарат церулоплазмин) с целью предотвращения срыва гомеостатических механизмов регуляции обеспечило активацию молекулярно-клеточных адаптационных процессов в системе крови и общую резистентность организма к гипокинетическому воздействию.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты экспериментального исследования существенно углубляют современные представления о закономерностях молекулярно-клеточных адаптационных процессов в системе крови при воздействии экстремальных факторов, в частности острого и хронического гипокинетического стресса. Получены новые данные о роли цитокиновой системы в процессах адаптации системы крови к длительному 30-ти суточному гипокинетическому стрессу, расширяющие знания в области физиологии адаптации. Экспериментально доказана эффективность использования препарата граноцит в качестве средства, снижающего уровень деструктивных процессов в костном мозге и лимфоидных органах при гипокинетическом стрессе. Существенное значение имеет факт установления защитного механизма действия церулоплазмина (метаболита антиоксидантной системы) от аплостических повреждений в

12 организме экспериментальных животных в условиях гипокинезии. По данным исследованиям подана заявка №2009139735 (056294) на получение патента.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования нашли отражения в монографии «Принципы использования фундаментальных основ клеточной и молекулярной биоинженерии для повышения физиологических возможностей живых систем», включены в лекционный материал по дисциплинам «Общая физиология», «Физиология спорта», «Основы здорового образа жизни» в Челябинском государственном педагогическом университете, ЮжноУральском государственном университете, Уральском государственном университете им. Горького (г. Екатеринбург).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Содержание гуморальных факторов регуляции (цитокинов, антиоксидантов, глюкокортикоидов) в периферической крови, ткани костного мозга, селезенки и тимуса экспериментальных животных зависит от срока гипокинетического воздействия и определяется этапностью развития адаптационных процессов.

2. Функциональная активность цитокиновой «сети» и системы «перекисного окисления липидов — антиоксидантная защита» в системе крови в динамике 30-ти суточной гипокинезии характеризуется различными фазами и обуславливает соотношение процессов деструкции и регенерации в организме экспериментальных животных.

3. Формирование адаптационных процессов при гипокинетическом стрессе сопровождается: количественно - качественной перестройкой взаимосвязей между параметрами системы крови, что отражает напряжение механизмов регуляции (с 1-ых по 7-ые сутки); изменением общего количества взаимосвязей и соотношения прямых

13 активирующих) и обратных (стабилизирующих) связей к 15-ым суткам эксперимента.

4. Использование препаратов церулоплазмина и граноцита эффективно снижает деструктивные и ускоряет репарационные процессы в системе крови экспериментальных животных в условиях 30-ти суточного гипокинетического воздействия.

Апробация работы

Основные материалы диссертации были представлены на 1-ом съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005); ХХ-ом съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007); VIII World Congress International society for adaptive medicine (ISAM, Москва, 2006); II-ой Международной научно -практической конференции «Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды» (Челябинск, 2008); IV-ым съезде физиологов Урала (с международным участием) (Екатеринбург, 2009); итоговых научных конференциях ГОУ ВПО «ЧГПУ» (2006, 2007, 2008, 2009).

Публикации по материалам диссертации

По теме диссертации опубликовано 20 работ, из них в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, - 14.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 300 страницах печатного текста и включает: введение, литературный обзор (глава 1), описание материалов и методов исследования (2), результаты собственных исследований (главы 3, 4 ,5), заключение, выводы, иллюстрирована 32 рисунком и 23 таблицами. Список литературы включает 197 зарубежных источника и 294 отечественных.