Взаимодействие лимфоцитов с эпителиальными клетками различного происхождения in vitro тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат медицинских наук Лиепиньш, Дмитрий Янович

• Лиепиньш, Дмитрий Янович
• кандидат медицинских наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Лиепиньш, Дмитрий Янович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Лимфоидная ткань, ассоциированная со слизистыми и иммунная система кожи

1.2 Популяции Т-лимфоцитов, контактирующих с эпителиальными клетками ко- 13 жи и легких.

1.2.1 Активированные эффекторные Т-лимфоциты и Т-клетки памяти.

1.2.2 Интраэпителиальные лимфоциты кожи и легких.

1.3 Т-лимфоциты с у8 ТКР.

1.4 Хемокины и Т-клетки.

1.5 Эпителиальные клетки.

1.5.1 Эпителиальные клетки кожи.

1.5.2 Эпителиальные клетки бронхолегочного аппарата.

1.5.2 1 Эпителиальные клетки трахеи, бронхов и бронхиол.

1.5.2.2 Альвеолярные эпителиальные клетки.

1.6 Пролиферация Т-лимфоцитов после взаимодействия с эпителиоцитами кожи и 35 легких.

1.6.1 Пролиферация Т-клеток в сингенной системе.

1.6.1.1 Покоящиеся Т-клетки.

1.6.1.2. Т-клетки, активированные митогенным лектином- ФГА или конканавалином А.

1.6.1.3 Ответ на стимуляцию анти-СБЗ антителами.

1.6.1.4 Ответ на суперантигены.

1.6.2 Пролиферация Т-клеток в аллогенной системе.

1.6.2.1 Покоящиеся Т-клетки.

1.6.2.2 Ответ на стимуляцию анти-СБЗ антителами.

1.6.3 Ответ на стимуляцию другими активаторами.

1.7 Апоптоз в процессе взаимодействия Т-клеток с эпителиоцитами.

ГЛАВА И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Клетки и их источники.

2.2 Животные.

2.3 Моноклональные антитела.

2.4 Проточная лазерная цитометрия.

2.5 Образование клеточных агрегатов- розеток.

2.6 Оценка пролиферации и клеточного цикла лимфоцитов.

2.6.1 Оценка пролиферации лимфоцитов.

2.6.2 Оценка клеточного цикла лимфоцитов.

2.7 Оценка апоптоза лимфоцитов.

2.7.1 Ранний апоптоз Т-лимфоцитов.

2.7.2 Поздний апоптоз лимфоцитов.

2.8 Определение внутриклеточной продукции цитокинов Т-лимфоцитами.

2.9 Статистическая обработка полученых данных.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Получение клеток и их совместное культивирование.

3.1.1 Получение культур эпителиальных клеток и мононуклеаров периферической крови (МНПК).

3.1.2. Активация эпителиальных клеток и лимфоцитов.

3.1.3 Образование комплексов между эпителиальными клетками и лимфоцитами.

3.2 Пролиферация лимфоцитов.

3.2.1 Подавление пролиферации лимфоцитов, активированных ФГА в совместной культуре с аллогенными эпителиальными клетками, но не их супернатантами. Дозозависимость цитостатического эффекта.

3.2.2 Определение роли молекул главного комплекса гистосовместимости в цито-статическом эффекте эпителиальных клеток на лимфоциты, активированные ФГА.

3.2.3 Цитостатический эффект эпителиальных клеток на аллогенные активированные ФГА лимфоциты не опосредован ТФР-Р.

3.2.4 Роль дефицита ИЛ-2 и экспрессии CD25 в угнетении пролиферации лимфоцитов эпителиальными клетками.

3.3 Отсутствие изменения поверхностного фенотипа лимфоцитов при их совместном культивировании с базальными кератиноцитами, клетками БАЭ или эпителиальными супернатантами.„.

3.4 Апоптоз лимфоцитов.

3.4.1 Ранний апоптоз.

3.4.2 Поздний апоптоз.

3.5 Экспрессия активированными Т-клетками ИФН-у и ИЛ-4.

ГЛАВА IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Взаимодействие лимфоцитов с эпителиальными клетками различного происхождения in vitro»

Актуальность темы диссертации

Поверхности нашего тела защищаются эпителием. В состоянии покоя эпителиальные клетки практически иммунологически неактивны. В активированном состоянии- в условиях инфекции, воспаления или повреждения, эпителиальные клетки становятся активными иммуноцитами, продуцирующими ряд цитокинов (в том числе хемокинов), обладают повышенной способностью к непосредственному взаимодействию с другими участниками иммунного ответа, посредством поверхностных молекул и, при определенных условиях, становятся способными процессировать и представлять на своей поверхности фрагменты антигена вместе с костимулирующими молекулами, превращаясь в воспомога-тельные антигенпрезентирующие клетки. К Т-клеткам, непосредственно контактирующим с эпителиальными клетками легких и кожи, относятся активированные эффекторные Т-клетки и интраэпителиальные лимфоциты (ИЭЛ). Абсолютное большинство ИЭЛ любых слизистых и кожи являются Т-клетками. Несмотря на высокий процент у8 Т-клеток среди ИЭЛ, основную массу составляют Т-клетки с ар Т клеточным рецептором из которых, в свою очередь, большинство клеток являются Т-клетками памяти. В условиях активации эпителиальные клетки способны увеличивать экспрессию молекул ICAM-1, LFA-3, а также экспрессировать молекулы CD80, 86 и молекулы гистосовместимости II класса наряду с продукцией целого ряда провоспалительных цитокинов, стимулирующих иммунный ответ. С другой стороны, эпителиальные клетки способны выделять различные иммуносу-прессорные факторы, например простагландин Е2 или трансформирующий фактор роста бета (ТФР-Р), способные угнетать Т-клеточную пролиферацию.

Взаимодействие лимфоидных и эпителиальных клеток играет важную роль при многих заболеваниях, таких как атопический дерматит, псориаз, лимфомы кожи, бронхиальная астма и др. Несмотря на активное изучение взаимодействия лимфоцитов с эпителиальными клетками, на данный момент не достигнуто полной ясности и факты, описанные в литературе, нередко оказываются противоречивыми. Это определило цель и задачи нашего исследования.

Целью данной диссертации явилось изучение феноменологии, последствий и некоторых механизмов взаимодействия лимфоидных и эпителиальных клеток барьерных тканей человека in vitro, в частности в условиях активации взаимодействующих клеток.

В соответствии с выбранной целью были поставлены следующие ЗАДАЧИ:

1. Оценить адгезию Т-лимфоцитов крови человека на эпителиальных клетках кожи и респираторного тракта.

2. Изучить влияние сокультивирования лимфоцитов человека с гомологичными эпителиальными клетками указанного тканевого происхождения на соотношение пролиферации и апоптоза при стимуляции Т-клеток митогенами.

3. Определить влияние указанного сокультивирования на соотношение Т-лимфоцитов, содержащих внутриклеточные интерферон-гамма (ИФН-у) и интер-лейкин-4 (ИЛ-4), т.е. на выбор Т-клетками дифференцировки в цитокинпродуци-рующие клетки 1-го и 2-го типов.

4. Оценить влияние активации лимфоцитов и эпителиальных клеток на проявление эффектов их взаимодействия.

5. Проанализировать роль мембранных молекул и цитокинов, выделяемых взаимодей ствующими клетками в совместной культуре, в реализации обнаруженных феноме нов.

Научная новизна диссертации.

Новизна проведенного исследования состоит в обнаружении комплекса феноменов, опосредованных влиянием эпителиальных клеток человека на лимфоциты при их совместном культивировании.

Установлено подавление пролиферации Т-клеток, активированных ФГА, при их сокультивировании с эпителиальными клетками кожи и бронхиального тракта. Показана роль контактных взаимодействий между лимфоцитами и указанными эпителиальными клетками в реализации этого цитостатического эффекта. Показано, что в совместной культуре активированных лимфоцитов и эпителиальных клеток указанного происхождения незначительно усиливается апоптоз лимфоцитов, но этим нельзя объяснить наблюдаемое подавление пролиферации Т-клеток. Установлено изменение профиля Thl/Th2 цитокинов, продуцируемых Т-лимфоцитами под влиянием сокультивирования с эпителиальными клетками. Активация лимфоцитов была обязательным условием для проявления вышеуказанных феноменов.

Научная и практическая значимость диссертации

Результаты проведенного исследования способствуют пониманию функциональных последствий контактных взаимодействий между лимфоцитами и эпителиальными клетками, прежде всего-модифицирующих эффектов эпителиальных клеток на пролифе-ративный ответ лимфоцитов. Эти данные проясняют ситуацию, которая складывается при Т-клеточном ответе, развертывающемся в барьерных тканях, когда ведущим фактором микроокружения для отвечающих Т-лимфоцитов служат эпителиальные клетки и их гуморальные продукты. Таким образом, исследование вносит вклад в понимание условий поддержания иммунного гомеостаза и осуществления иммунных процессов в барьерных тканях.

Работа выполнена в русле фундаментальных научных исследований, однако, результаты могут иметь в дальнейшем и практическое применение. Так, выявление механизмов подавления пролиферации активированных лимфоцитов после контакта с керати-ноцитами и клетками бронхоальвеолярного эпителия, может способствовать разработке новых подходов к терапии различных иммунопатологических процессов, реализуемых в респираторном тракте и коже. Методы исследования взаимодействий эпителиальных и лимфоидных клеток могут быть использованы в лабораторной практике.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Лимфоциты периферической крови образуют прочный контакт с эпителиальными клетками. Для адгезии эпителиальной клеткой максимального количества лимфоцитов, необходимы два фактора: активация эпителиальной клетки и активация лимфоцитов.

2. Кератиноциты и клетки бронхоальвеолярного эпителия (БАЭ) обладают способностью угнетать пролиферацию фитогемагглютинин (ФГА)- активированных лимфоцитов в совместной культуре in vitro. Кератиноциты имеют более выраженный ингибирующий эффект на пролиферацию лимфоцитов, активированных ФГА, чем клетки БАЭ.

3. Выявленный феномен является дозозависимым. При увеличении соотношения между эпителиальными клетками и лимфоцитами, наблюдается тенденция к усилению угнетения пролиферации.

4. Цитостатический эффект опосредован мембран-мембранным взаимодействием, а не гуморальными факторами, такими как трансформирующий фактор роста бета (ТФР Р), выделяемыми эпителиальными клетками.

5. Различие по молекулам главного комплекса гистосовмесгимости (ГКГ) между эпителиальными клетками и лимфоцитами не играет роли в подавлении пролиферации лимфоцитов.

6. Угнетение пролиферации не кореллирует с изменением экспрессии а цепи рецептора для интерлейкина-2 (CD 25) на поверхности активированных лимфоцитов и не отменяется экзогенным интерлейкином-2 (ИЛ-2).

7. При воздействии эпителиальных клеток наблюдается незначительное усиление апоптоза лимфоцитов, с которым нельзя связать двукратное подавление пролиферации.

8. В совместной культуре с эпителиальными клетками, особенно бронхоалььеоляр-ными, увеличивается соотношение лимфоцитов, продуцирующих ИФН-у к лимфоцитам производящим ИЛ-4.

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ. Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых института иммунологии в 2001 году (Москва), на научно-практической конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» в 2001 году (Санкт-Петербург), 4 конгрессе РААКИ в 2001 году (Москва), а также на 6-й углубленной летней программе по иммунологии имени Джона Хамфри в 2002 году (Пущино).

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Лиепиньш, Дмитрий Янович

ВЫВОДЫ

1. Лимфоциты образуют прочный контакт с эпителиальными клетками. Для образования такого контакта важна активация как лимфоцитов, так и эпителиальных клеток.

2. Кератиноциты и клетки бронхоальвеолярного эпителия способны угнетать пролиферацию ФГА-активированных лимфоцитов в совместной культуре in vitro. Инги-бирующий эффект кератиноцитов выражен сильнее, чем аналогичное действие клеток БАЭ

3. Выявленный цитостатический эффект является дозозависимым: при увеличении соотношения между эпителиальными клетками и лимфоцитами в совместной культуре в пользу эпителиальных клеток, угнетение пролиферации усиливается; это угнетение не является следствием прямого токсического эффекта или истощения среды в результате увеличения количества клеток в культуре.

4. Цитостатический эффект опосредован контактными взаимодействиями клеток. Гуморальные факторы, выделяемые эпителиальными клетками, не подавляют пролиферацию лимфоцитов и подавление пролиферации не связано с секрецией эпителиальными клетками ТФР р.

5. Угнетение пролиферации не сопряжено с изменением экспрессии а цепи рецептора ИЛ-2 на поверхности лимфоцитов, активированных ФГА, и не связано с дефицитом ИЛ-2 в совместной культуре лимфоцитов и эпителиальных клеток.

6. Подавление пролиферации лимфоцитов мышей в одинаковой степени проявляется в их ко-культуре с аллогенными и сингенными эпителиальными клетками, т.е. совместимость по молекулам ГКГ не играет роли в вышеупомянутом феномене.

7. Под воздействием эпителиальных клеток наблюдается незначительное усиление позднего (72 часа) апоптоза лимфоцитов, которым нельзя объяснить выраженное подавление пролиферации.

8. В совместной культуре с эпителиальными клетками, особенно бронхоальвеоляр-ными, увеличивается соотношение лимфоцитов, продуцирующих ИФН-у к лимфоцитам производящим ИЛ-4.

ГЛАВА IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Кератиноциты и эпителиальные клетки респираторного тракта, эффективно активируются рекомбинантным ИФН-у. Активацию полученных нами эпителиальных клеток мы оценивали по усилению экспрессии молекул CD54 (ICAM-1) и появлению экспрессии молекул ГКГ II класса HLA-DR, а степень чистоты эпителиальных культур определяли по тому, какой процент клеток в первичной культуре экспрессировал цитокератин 5 (для базальных кератиноцитов) или цитокератин 18 (для клеток БАЭ). Для экспериментов использовались эпителиальные культуры, в которых более 95% клеток экспрессирова-ли соответствующий цитокератин.

Принципиальная способность лимфоцитов и, в частности Т-клеток, непосредственно взаимодействовать с эпителиальными клетками, была нами показана с помощью методики образования клеточных агрегатов- розеток. Эксперименты с блокирующими антителами, проведенные другими исследователями, показали, что для образования такого контакта важную роль играют взаимодействия С02(Т-клетка)/ЬРА-3(эпителиальная клетка), LFA-l(T-KjieTKa)/ICAM-l (эпителиальная клетка), а также иьтегрина схеР7 (Т-клетка) с Е-кадхерином (кератиноцит). Значимость взаимодействий между молекулами клеточной адгезии скорее всего не сводится к простому механическому прикреплению Т-клеток к эпи-телиоцитам. Несколько лет назад была показана способность сигнала, возникающего при связывании различных интегринов (наиболее изученными в этом смысле являются (31 и РЗ интегрины), позитивно регулировать верхнюю часть каскада внутриклеточных сигналов, запускаемых взаимодействием различных факторов роста со своими рецепторами. Интег-риновый сигнал также способен вмешиваться в регуляцию клеточного цикла, а именно влиять на фосфорилирование белка ретинобластомы (pRb) и экспрессию циклина Д. Сигналы от других молекул клеточной адгезии, например Е-кадхерина и селектинов, также способны влиять на пролиферацию клетки. Так как экспрессия молекул CD2 и LFA-Цна Т-лимфоцитах), а также LFA-3 и ICAM-1 (на эпителиоцитах) значительно усиливается поеле активации клеток, то можно было предположить, что активация клеток, образующих розетки, значительно усилит процесс розеткообразования. Это предположение полностью подтвердилось в последующих экспериментах. Т-лимфоциты, полученные из периферической крови здоровых доноров, образовывали прочный контакт с эпителиальными клетками. Для адгезии эпителиальной клеткой максимального количества лимфоцитов, оказались необходимы два фактора обладавшие взаимоусиливающим эффектом: активация эпителиальной клетки и активация лимфоцитов. Для получения максимального количества розеток, активация лимфоцитов ФГА оказалась более важной, чем активация эпителиальных клеток ИФН-у. Такой вывод был сделан на. основании того, что количество розеток между неактивированными эпителиальными клетками и лимфоцитами, активированными ФГА, оказалось больше чем при взаимодействии активированных эпителиальных клеток с неактивированными лимфоцитами.

В условиях активации эпителиальные клетки способны увеличивать экспрессию молекул ICAM-1, LFA-3, а также экспрессировать молекулы CD80, 86 и молекулы гисто-совместимости II класса наряду с продукцией целого ряда провоспалительных цитокинов, стимулирующих иммунный ответ. С другой стороны, эпителиальные клетки способны выделять различные иммуносупрессорные факторы, например PGE2 или ТФР-Р, способные угнетать Т-клеточную пролиферацию.

При исследовании пролиф фации в совместной культуре in vitro, большинство исследователей обнаружило костимулирующий эффект кератиноцитов и эпителиальных клеток респираторного тракта на пролиферацию сингенных Т-лимфоцитов, активированных ФГА, конканавалином А, анти-СБЗ антителами или при добавлении бактериальных суперантигннов в совместную культуру. При активации эпителиоцитов ИФН-у, костимулирующий эффект значительно усиливался. Обнаруженный эффект зависел от взаимодействий молекул клеточной адгезии, т.е. зависел от мембран-мембранного взаимодействия и не зависел от влияния эпителиальных супернатантов. Следует отметить, что существует, по крайней мере, одна работа, описывающая ингибирующее, а не стимулирующее влияние эпителиальных клеток на пролиферацию активированных лимфоцитов в схожей син-генной системе. В аллогенной системе кератиноциты угнетали пролиферацию Т-клеток, активированных aHTH-CD3 антителами, продуцируя ТФР-Р и простагландин Е2. Обращает на себя внимание тот факт, что, несмотря на противоположность воздействия эпителиальных клеток на пролиферативную активность Т-лимфоцитов в сингенной и аллогенной системах, была выявлена слабая зависимость полученных результатов от блокировки антителами молекул ГКГ I и II классов. Учитывая неоднородность и противоречивость результатов, описываемых в литературе, а также важность исследуемой темы, мы попытались ответить на вопрос, каким эффектом обладают эпителиальные клетки кожи и респираторного тракта на пролиферацию лимфоцитов, активированных Т-клеточным митоге-ном ФГА в совместной культуре in vitro. Полученные нами данные указывают на то, что кератиноциты и клетки бронхоальвеолярного эпителия обладают способностью угнетать пролиферацию лимфоцитов, активированных ФГА в совместной культуре in vitro. Кератиноциты имеют более выраженный ингибирующий эффект на пролиферацию лимфоцитов, активированных ФГА, чем клетки БАЭ, но менее выраженный, чем эпителиальные клетки тимуса (данные Т.Ю. Григорьевой). Несмотря на эффективную активацию эпителиальных клеток ИФН-у, нам не удалось выявить статистически достоверной разницы между эффектами неактивированных и активированных эпителиальных клеток. Возможно, что после контакта неактивированных эпителиальных клеток с лимфоцитами, активированными ФГА, происходит выделение цитокинов, например ИФН-у, достаточное для изменения фенотипа эпителиальной клетки по типу активированной. Это предположение можно проверить, используя фиксированные в параформальдегиде интактные или предварительно активированн ые эпителиальные клетки. Выявленный цитостатический эффект оказался дозозависимым: при увеличении соотношения между эпителиальными клетками и лимфоцитами в совместной культуре в пользу эпителиальных клеток, угнетение пролиферации усиливалось. Цитостатический эффект опосредован контактными взаимодействиями клеток. При выявлении в будущем конкретных поверхностных молекул, ответственных за данный феномен, необходимо, прежде всего, проверить взаимодействия CD2/LFA3, LFA-1/ICAM-1, а также (ХеР7/ Е-кадхерин. Одним из возможных вариантов является применение блокирующих антител. Супернатанты эпителиальных клеток не влияли на уровень пролиферации активированных лимфоцитов. Супернатанты монокультуры лимфоцитов и общие супернатанты, полученные из 24 часовых совместных культур эпителиоцитов и лимфоцитов, также не изменяли уровень пролиферативной активности лимфоцитов. Данные по оценке воздействия эпителиальных клеток на пролиферативную активность лимфоцитов по включению меченного тимидина, были подтверждены анализом клеточного цикла, который показал, что при совместном культивировании с эпителиальными клетками кожи и респираторного тракта происходил арест клеточного цикла лимфоцитов в фазе G0-G1.

Одним из недостатков используемой нами человеческой модели, являлась ее алло-генность. Для оценки роли молекул главного комплекса гистосовместимости в выявленном феномене, нами было произведено прямое сравнение цитостатического эффекта мышиных базальных кератиноцитов и клеток бронхоальвеолярного эпителия на лимфоциты с применением сингенных и аллогенных систем. Для исключения неспецифичного эффекта угнетения пролиферации лимфоцитов в совместной культуре из-за роста эпителиальных клеток, последние были предварительно обработаны цитостатическими дозами митомицина С. Полученные результаты указали на то, что совместимость по молекулам ГКГ не играет важной роли в вышеупомянутом феномене, так как подавление пролиферации лимфоцитов мышей почти в одинаковой степени проявляется в их ко-культуре с аллогенными и сингенными эпителиальными клетками. Эти данные желательно подтвердить в опытах с блокирующими антителами к молекулам ГКГ I и II классов.

Учитывая данные, полученные при анализе литературы и, несмотря на полученные нами ранее результаты, указывающие на непричастность растворимых факторов к выявленному феномену, мы решили проверить вклад ТФР-Р в цитостатический эффект эпителиальных клеток, предварительно обработав их блокирующими моноклональными антителами к ТФР-Р 1 и 2. ТФР-Р мог проявить свое действие вследствие накопления в зонах контакта клеток. Как мы и ожидали, подавление пролиферации не отменялось антителами к ТФР-р.

Так как эпителиальные клетки стабильно угнетают пролиферацию только активированных лимфоцитов, была изучена возможная роль дефицита ИЛ-2 и недостаточность экспрессии его рецептора в данном феномене. С этой целью в совместную культуру был добавлен экзогенный рекомбинантный ИЛ-2 человека. При добавлении в культуру реком-бинантного ИЛ-2 человека в концентрации 750 Ед/мл., мы не смогли отменить или снизить эффект угнетения пролиферации ФГА- активированных лимфоцитов. Параллельно с пролиферацией определяли экспрессию CD25 на поверхности лимфоцитов. В результате активации ФГА, на поверхности лимфоцитов наблюдалось значительная экспрессия а-цепи рецептора ИЛ-2 (CD25), причем уровень экспрессии был одинаков в монокультуре ФГА-активированных лимфоцитов и в их совместной культуре с эпителиальными клетками, т.е. не коррелировал с уровнем пролиферации лимфоцитов. На основании полученных результатов мы пришли к выводу, что угнетение пролиферации не сопряжено с изменением экспрессии а цепи рецептора ИЛ-2 на поверхности лимфоцитов, активированных ФГА, и не связано с дефицитом ИЛ-2 в совместной культуре лимфоцитов и эпителиальных клеток.

В использованных нами аллогенной человеческой, а также в аллогенной и синген-ной мышиных моделях, эпителиальные клетки оказались неспособны стимулировать пролиферацию покоящихся Т-лимфоцитов, что полностью совпало с результатами исследований других авторов.

Нами также был определен фенотип как неактивированных, так и ФГА стимулированных лимфоцитов после их совместного культивирования в течение 3 суток с базальными кератиноцитами, клетками бронхоальвеолярного эпителия или эпителиальными 24 часовыми супернатантами. Нам не удалось выявить значительных изменений в экспрессии CD25, CD69, молекул ГКГ II класса (HLA-DR), CD95 и CD45RA/RO на поверхности лимфоцитов под влиянием контактов с эпителиальными клетками или при действии их гуморальных продуктов.

Следует отметить, что в большинстве наших экспериментов использовались культуры содержащие примесь В-лимфоцитов и моноцитов, что могло повлиять на конечный результат. Так как создание сингенных систем на основе клеток человека часто затруднительно, более совершенной моделью могло бы быть использование мышей, иммунизированных различными антигенами, введенными подкожно или в виде аэрозоля с последующим выделением лимфоцитов из региональных узлов, дренирующих соответственные участки. Эти лимфоциты можно использовать для дальнейшего совместного культивирования с сингенными кератиноцитами или клетками БАЭ без или с добавлением в культуру антигена, вызвавшего их появление. Отдельным вопросом был бы захват и представление антигена активированными эпителиальными клетками, который не входил в задачи данного исследования.

Так как общее ослабление пролиферативной активности активированных Т-лимфоцитов в совместной культуре с эпителиальными клетками могло быть связано не только с арестом их клеточного цикла, но и с их гибелью, мы решили определить уровень как раннего (через 18 часов культивирования), так и позднего (через 72 часа культивирования) апоптоза. При определении раннего апоптоза активированных ФГА CD3+ лимфоцитов, с помощью аннексина V, не было выявлено значимой разницы между уровнем апоптоза в монокультуре лимфоцитов и совместной культуре лимфоцитов и эпителиальных клеток или эпителиальных супернатантов. Однако через 72 часа в совместной культуре наблюдалось усиление апоптоза активированных лимфоцитов по сравнению с этим показателем в монокультуре ФГА-активированных лимфоцитов. Степень усиления апоптоза всегда была меньше, чем степень подавления пролиферации клеток и мы сделали вывод, что усиление апоптоза лимфоцитов не может полностью объяснить выраженное подавление пролиферации, которое наблюдалось в совместных культурах. Тем не менее, другая часть клеток могла быть подвергнута не апоптозу, а некрозу, по неизвестной причине и, для чистоты эксперимента, желательно подсчитать общее количество лимфоцитов до и после совместного культивирования в контрольных и опытных лунках.

Нами также исследовалась избирательная способность эпителиальных клеток кожи и легких влиять на баланс Т-лимфоцитов, продуцирующих ИФН-у (CD8+ и CD4+Thl клетки) и ИЛ-4 (CD4+Th2 клетки). Под влиянием бронхоальвеолярных эпителиальных клеток индекс ИФН-у+/ ИЛ-4+ существенно повышался, тогда как под воздействием кератиноцитов он повышался незначительно.

Согласно данным анализа литературы, апоптоз Т-лимфоцитов при их совместном культивировании с кератиноцитами в большинстве случаев является Fas зависимым, а экспрессия функционального FasL кератиноцитами значительно усиливается после добавления в культуру ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-15 или HJI-ip. Цитокининдуцированная экспрессия FasL кератиноцитами угнетается ИЛ-10 и ТФР-Р 1. Согласно полученным нами результатам, увеличение, под влиянием эпителиоцитов, индекса ИФН-у+/ ИЛ-4+ в пользу клеток, продуцирующих ИФН-у+, могло привести к локальному повышению концентрации ИФН-у с последующим усилением экспрессии FasL на эпителиоцитах, ведущей к индук-кии апоптоза Fas+ лимфоцитов. Такое предположение совпадает с полученными нами данными, когда клетки БАЭ оказывали значительное (по сравнению с кератиноцитами) увеличение индекса ИФН-у+/ ИЛ-4+ и, в то же время, вызывали более сильный, чем кератиноциты апоптоз лимфоцитов, опосредованный мембрансвязанным фактором; а также с данными анализа литературы указывающими на то, что апоптоз Т-лимфоцитов при совместном культивировании с эпителиоцитами в большинстве случаев является Fas зависимым и что стимуляция ИФН-у значительно усиливает экспрессию функционально активного мембрансвязанного FasL клетками БАЭ и кератиноцитами. Эту гипотезу можно подтвердить прямым измерением экспрессии CD95L на эпителиальных клетках с последующим определением его функциональности в Fas+ культуре лимфоцитов, а также в экспериментах по определению апоптоза с добавлением блокирующих антител или с использованием мутантных линий мышей, например 1рг.

Для легких, находящихся под постоянным воздействием вдыхаемых антигенов, крайне важно точное местное регулирование, обеспечивающее тонкий баланс между защитой организма и излишне сильным иммунным ответом, который несовместим с главной физиологической функцией легких. Это утверждение также справедливо для других слизистых и кожи. Мы предполагаем, что клетки бронхоальвеолярного эпителия и эпите-лиоциты кожи могут иметь конститутивную способность к негативной иммунорегуляции, в частности при адаптивном иммунном ответе. В настоящее время нам не ясны причины расхождения наших результатов с данными других авторов, указывающими на костиму-лирующее влияние эпителиальных клеток кожи и респираторного тракта на иммунный ответ и, в частности, на пролиферацию активированных Т-лимфоцитов. Причиной, скорее всего, являются различные исходные условия постановки эксперимента. Необходимо использование модели максимально приближенной к естественным условиям развития иммунного ответа. Применение такой модели, вероятно, позволило бы снять разногласия в данной области исследований или смогло бы объяснить, почему эпителиальные клетки способны прямо противоположно влиять на активированные Т-лимфоциты.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Лиепиньш, Дмитрий Янович, 2003 год

1. Зимина И.В., Лопухин Ю.М., Арион В.Я. Кожа как иммунный орган: клеточные элементы и цитокины // Иммунология-1994.-№4. С.8-13.

2. Клаус Дж. Лимфоциты. Методы. М., Мир, 1990. Выд МНПК ПРОЛ

3. Петров Р.В. Иммунология. М.: Медицина, 1982.

4. Фрейдлин И.С., Тотолян А.А. Клетки иммунной системы. СПб., Наука, 2001.

5. Хаитов P.M. Физиология иммунной системы. М.: ВИНИТИ РАН, 2001.

6. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. М.: Медицина, 2000.

7. Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. М.: ВНИ-РО, 1995.

8. Эндельсон Р.Л., Финк Д.М. Иммунологическая функция кожи // В мире науки-1985.-№8.-С. 16-24.

9. Ярилин А.А, Никонова М.Ф и др. Апоптоз, роль в патологии и значимость его оценки при клинико-иммунологическом обследовании больных. Мед.иммунология, 2000, 2,1, 7-16. ПА

10. Ярилин А.А. Кожа как часть иммунной системы // Materia Medica.-1994.-№2. С.7-36.

11. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М.: Наука, 1999.

12. Abbas А.К., Lichtman А.Н., Pober J.S. Cellular and Molecular Immunology.-4th ed. W.B. Saunders Company 2000. p-553.

13. Agace W.W., Higgins M.G., Sadasivan В., Brenner M.B., and Parker C.M. T-lymphocyte-epithelial-cell interactions: integrin E(CD 103)7, LEEP-CAM and chemoki-nes. Current Opinion in Cell Biology 2000,12:563-568.

14. Akdis C.A., Akdis M., Trautmann A., Blaser K. Immune regulation in atopic dermatitis. Curr Opin Immunol 2000; 12:641-646.

15. Akdis M., Akdis C.A., Weigl L., Disch R., Blaser K. Skin-homing, CLA+memory T cells are activated in atopic dermatitis and regulate IgE by an IL-13-dominated cytokine pattern. IgG4 counter-regulation by CLA- memory T cells. Immunol 1997; 159:4611-4619.

16. Akdis M., Simon H.U at al. Skin Homing (Cutaneous Lymphocyte-Associated Antigen-Positive) CD8+ T Cells Respond to Superantigen and Contribute to Eosinophilia and IgE Production in Atopic Dermatitis. The Journal of Immunology, 1999,163: 466-475.

17. Andrian U.H. and Mackay C. R.T-cell function and migration. Two sides of the same coin. N. Engl. J.Med. 343, 1020-1034 (2000).

18. Aplin A.E., Howe A.K., Juliano R.L. Cell adhesion molecules, signal transduction and cell growth. Current Opinion in Cell Biology 1999,11:737-744.

19. Arnold R., Seifert M., Asadullah K., Volk H.D. Crosstalk between keratinocytes and T lymphocytes via Fas/Fas ligand interaction: modulation by cytokines. Journal of Immunology, 1999,162:7140-7147.

20. Baggiolini M. Chemokines and leukocyte traffic. Nature 1998;392:565-568.

21. Baggiolini M., Dahinden C.A. CC chemokines in allergic inflammation. Immunol Today 1994;15:127-133.

22. Bevilaqua M., Butcher E., Furie B. et al. Selectins: a family of adhesion receptors. Cell 1991,67:233.

23. Bos J.D., Kapsenberg M.L. The skin immune system. Its cellular constituents and their interactions. Immunology Today, 1986-V. 7-P. 235-240.

24. Butcher E. C., Williams M., Youngman K., Rott L. and Briskin M. Lymphocyte trafficking and regional immunity. Adv. Immunol. 72, 209-253 (1999).

25. Campbell J. J., and Butcher E. C. Chemokines in tissue-specific and microenvironment-specific lymphocyte homing. Curr. Opin. Immunol. 12, 336-341 (2000).

26. Campbell J.J., Murphy K.E., Kunkel E.J., at al. CCR7 expression and memory T cell diversity in humans. J Immunol 2001 Jan 15;166(2):877-84.

27. Charalambopoulos K., Karachalios G. Adhesion molecules and lung disease Pneumon 2000, 13 (1): 50-56.

28. Cheng G., Ueda Т., Eda F., Arima M., Yoshida N., and Fukuda Т. A549 Cells Can Express Interleukin-16 and Stimulate Eosinophil Chemotaxis. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., Volume 25, Number 2, August, 2001 212-218.

29. Christensen P.J., Kim S., Simon R.H., Toews G.B., Paine R 3rd. Differentiation-related expression of ICAM-1 by rat alveolar epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol 1993 Jan;8(l):9-15.

30. Christopherson К. II, Hromas R. Chemokine Regulation of Normal and Pathologic Immune Responses. Stem Cells 2001;19:388-396.

31. Chuong C.M., Nickoloff B.J at al. What is the 'true' function of skin?Exp Dermatol. 2002 Apr; 11 (2): 159-87.

32. Cunningham A.C., Kirby J.A. Regulation and function of adhesion molecule expression by human alveolar epithelial cells. Immunology 1995 Oct;86(2):279-86.

33. Cunningham A.C., Zhang J.G., Moy J.V., Ali S., Kirby J.A. A comparison of the antigen-presenting capabilities of class II МНС-expressing human lung epithelial and endothelial cells. Immunology 1997 Jul;91(3):458-63.

34. Cyster J. G. Chemokines and cell migration in secondary lymphoid organs. Science 286, 2098-2102 (1999).

35. Danto S.I., Shannon J.M., Borok Z., Zabski S.M., Crandall E.D. Reversible transdifferen-tiation of alveolar epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol 1995, 12:497-502.

36. Davidson J.M. Biochemistry and turnover of lung interstitium. Eur Resp J 1990, 3(9):1048-1063.

37. Dobbs L.G., Geppert E.F., Williams M.C., Greenleaf R.D., Mason R.J. Metabolic properties and ultrastructure of alveolar type II cells isolated with elastase. Biochim Biophys Acta 1980, 618: 510-523.

38. Eidelman G.M., Crossin K.L. Cell adhesion molecules: Implications for a molecular histology. Annu Rev Biochem 1991, 60:155-161.

39. Erie D.J., Pabst R. Intraepithelial Lymphocytes in the Lung. A Neglected Lymphocyte Population. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., Volume 22, Number 4, April 2000 398-400.

40. Evans M.J., Cabral L.J., Stephens R.J., Freeman G. Renewal of alveolar epithelium in the rat following exposure to N02. Am J Pathol 1973, 70:175-198.

41. Evans M.J., Cabral L.J., Stephens R.J., Freeman G. Transformation of alveolar type 2 cells to type 1 cells following exposure to N02. Exp Mol Pathol 1975,22:142-150.

42. Fehrenbach H. Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited. Respir Res 2001, 2:33-46.

43. Feng L. Role of chemokines in inflammation and immunoregulation. Immunol Res 2000;21:203-210.

44. Ferri K.F. and Kroemer G. Organelle-specific initiation of cell death pathways. Nat Cell Biol 3:255-263,2001.

45. Furie M.B., Randolph G.J. Chemokines and tissue injury. Am J Pathol 1995;146:1287-1301.

46. Gaspari A.A., Sempowski G.D., Chess P., Gish J., Phipps R.P. Human epidermal kerati-nocytes are induced to secrete interleukin-6 and co-stimulate T lymphocyte proliferation by a CD40-dependent mechanism. Eur J Immunol (Germany), Jun 1996,26(6) pl371-7.

47. Ginkel F.W., Nguyen H.H., and McGhee J.R. Vaccines for Mucosal Immunity to Combat Emerging Infectious Diseases. Emerging Infectious Diseases Vol. 6, No. 2, March-April 2000.

48. Goto E., Kohrogi H. Human Bronchial Intraepithelial T Lymphocytes as a Distinct T-Cell Subset. Their Long-Term Survival in SCID-Hu Chimeras. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., Volume 22, Number 4, April 2000 405-411.

49. Gueniche A., Viae J., Charveron M., Schmidtt D. Effect of gamma-interferon on IL-1 alfa, beta and receptor antagonist production by normal human keratinocytes. Exp Dermatol 1994 Jun; 3(3): 113-8.

50. Harris A. Epithelial cell culture. Cambridge University Press 1996. -182p.

51. Homey В., Alenius H. at al. CCL27-CCR10interactions regulate T-cell mediated skin inflammation. Nature medicine.Vol.8, Number 2,157-165.

52. Howe A., Aplin A.E., Alahari S.K., Juliano R.L. Integrin signaling and cell growth control. Curr Opin Cell Biol 1998,10:220-231.

53. Hunkapiller Т.Н., Hood L. Diversity of the immunoglobulin superfamily. Adv Immunol 1989,44:3-63.

54. Hynes R.Q. Integrins: Versatility, modulation and signaling in cell adhesion. Cell 1992, 69:11-25.

55. Jameson J., Ugarte K., Chen N., Yachi P., Fuchs E., Boismenu R., Havran W.L. A role for skin gammadelta T cells in wound repair. Science 2002 Apr 26;296(5568):747-9

56. Janeway C.A., Travers P. Immunobiology. The immune system in health and disease/London, San Francisco, New York: Garland Publishing, Inc-1997. -621 p.

57. Jones G.E. Human cell culture protocols. Humana Press 1996.- p544.

58. Jung Т., Scauer U. et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J.Immunol.Meth. 1993,159,197-207.

59. Kacinski B.M. and Flick M. Apoptosis and cutaneous T cell lymphoma. Ann NY Acad Sci 941: 194-199, 2001.

60. Kalb Т.Н., Chuang M.T., Marom Z., Mayer L. Evidence for accessory cell function by class II MHC antigen-expressing airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol 1991 Apr;4 (4):320-9.

61. Kalina M., Riklis S., Blau H. Pulmonary epithelial cell proliferation in primary culture of alveolar type II cells. Exp Lung Res 1993, 19:153-175.

62. Kanduc D., Mittelman A., Farber E. Cell death: Apoptosis versus necrosis (Review) International Journal of oncology. 21: 165-170, 2002.

63. Kaneko F., Suzuki M., Takiguchi Y., Itoh N., Minagawa T. Immunohistopathologic studies in the development of psoriatic lesion influenced by gamma-interferon and the producing cells. J Dermatol Sci 1990 Nov;l(6):425-34.

64. Kasper M., Haroske G. Alterations in the alveolar epithelium after injury leading to pulmonary fibrosis. Histol Histopathol 1996,11:463-483.

65. Kasper M., Singh G. Epithelial lung cell marker: current tools for cell typing. Histol Histopathol 1995,10:155-169.

66. Kim C.H., Broxmeyer H.E. Chemokines: signal lamps for trafficking of T and В cells for development and effector function. J Leukoc Biol 1999;65:6-15.

67. Koopman G. et al. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on В cell undergouing apoptosis. Blood, 84,1415-1420.

68. Krishan A. Rapid DNA content analysis by the propidium iodide hypotonic citrate method. Methods in cell Biology, 1990, 33, 121-125.

69. Laning J.C., Isaacs C.M., Hardin-Young J. Normal human keratinocytes inhibit the proliferation of unprimed T cells by TGFbeta and PGE2, but not IL-10. Cell Immunol (United States), Jan 10 1997,175(1) pi6-24.

70. Lawrence S., Young A. at al. CD40 and epithelial cells: across the great divide. Immunology Today 1998,19:502-506.

71. Locati M., Murphy P.M. Chemokines and chemokine receptors: biology and clinical relevance in inflammation and AIDS. Annu Rev Med 1999;50:425-440.

72. Loetscher P., Moser B. and Baggiolini M. Chemokines and their receptors in lymphocyte traffic and HIV infection. Adv. Immunol. 74,127-180 (2000).

73. Luther S. A. and Cyster J. G. Chemokines as regulators of T cell differentiation. Nature Immunol. 2,102-107 (2001).

74. Masafumi A., Plitt J., at al. Expression of Interleukin-16 by Human Epithelial Cells Inhibition by Dexamethasone. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., Volume 21, Number 6, December, 1999 684-692.

75. Mason R.J., Shannon J.M. Alveolar type II cells. In The Lung. Scientific Foundations. Edited by Crystal R.G., West J.B., Barnes P.J., et al. Philadelphia New York; Lippin-cott - Raven Publishers, 1997:543-555.

76. Mason R.J., Walker S.R., Shields B.A., Henson J.E., Williams M.C. Identification of rat alveolar type II epithelial cells with tannic acid and polychrome stain. Am Rev Respir Dis 1985,131:786-788.

77. Mohamadzadeh M., Takashima A., Dougherty I., Knop J., Bergstresser P.R. and Cruz Jr. P.D. Ultraviolet В radiation up-regulates the expression of IL-15 in human skin. The Journal of Immunology, Vol 155, Issue 9 4492-4496.

78. Moser В., Loetscher P. Lymphocyte traffic control by chemokines. Nature Publishing Group 2001.

79. Murphy P. M., et al. International union of pharmacology. XXII. Nomenclature for chemokine receptors. Pharmacol. Rev. 52, 145-176 (2000).

80. Nagasawa Т., Kikutani H. and KishimotoT. Molecular cloning and structure of a pre-B-cell growthstimulating factor. Proc. Natl Acad. Sci. USA 91,2305-2309 (1994).

81. Neuber K., Steinrucke K., Kowalzick L., Kohler I., Ring J. Cytokine-mediated effects of peripheral blood mononuclear cells from patients with atopic eczema on keratinocytes (HaCaT) in a new coculture system. Br J Dermatol 1995 Nov;133(5):750-6.

82. Nickoloff B.J. Keratinocytes produce a lymphocyte inhibitory factor which is partially reversible by an antibody to transforming growth factor-beta. Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor 48109-0602.

83. Oppenheim J.J. Overview of chemokines. Adv Exp Med Biol 1993;351:183-186.

84. Paine R 3rd., Mody C.H., Chavis A., Spahr M.A., Turka L.A., Toews G.B. Alveolar epithelial cells block lymphocyte proliferation in vitro without inhibiting activation. Am J Respir Cell Mol Biol 1991 Sep;5(3):221-9.

85. Rossi D., Zlotnik A. The biology of chemokines and their receptors. Annu Rev Immunol 2000;18:217-242.

86. Ruckert R., Asadullah K., Seifert M., Budagian V., Arnold R., Trombotto C., Paus R and Bulfone-Paus S. Inhibition of Keratinocyte Apoptosis by IL-15: A New Parameter in the Pathogenesis of Psoriasis. The Journal of Immunology, 2000, 165: 2240-2250.

87. Salik E., Tyorkin M., Mohan S., George I., Becker K., Oei E., Kalb Т., and Sperber K. Antigen Trafficking and Accessory Cell Function in Respiratory Epithelial Cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., Volume 21, Number 3, September 1999 365-379.

88. Sallusto F., Mackay C. R. and Lanzavecchia A. The role of chemokine receptors in primary, effector, and memory immune responses. Annu. Rev. Immunol. 18, 593-620 (2000).

89. Sanchez-Madrid F. and del Pozo M.A. Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions. EMBO J. 18, 501-511 (1999).

90. Schall T.J., Bacon K.B. Chemokines, leukocyte trafficking, and inflammation. Curr Opin Immunol 1994;6:865-873.

91. Schwartz M.A., Baron V. Interactions between mitogenic stimuli, or a thousand and one connections. Curr Opin Cell Biol 1999,11:197-202.

92. Shaw A.J. Epithelial Cell Culture. A practical approach. Oxford University Press, 1996. -218p.

93. Sherry В., Horii Y., Manogue K. R., Widmer U. and Cerami A. in Interleukin-8 (NAP-1) and Related Chemotactic Cytokines Vol. 4. (eds Baggiolini, M. & Sorg, C.) 117-130 (Karger, Basel, 1992).

94. Strieter R.M., Standiford T.J., Huffnagle G.B., et al. "The good, the bad, and the ugly." The role of chemokines in models of human disease. J Immunol 1996;156:3583-3586.

95. Takeichi M. Cadherin cell adhesion receptors as morphogenetic regulator. Science, 1991, 251:1451-1459.

96. Teraki Y., Shiohara Т. Apoptosis and the skin. Eur. J. Dermatology 1999; 9: 413-26.

97. Trautmann A., Akdis M., Brocker E.B., Blaser K., Akdis C.A. New insights into the role of T cells in atopic dermatitis and allergic contact dermatitis. Trends Immunol 2001; 22:530-532.

98. Ulich T.R., Yi E.S., Longmuir K., Yin S., Biltz R., Morris C.F., Housley R.M., Pierce G.F. Keratinocyte growth factor is a growth factor for type II pneumocytes in vivo. J Clin Invest 1994, 93:562-572.

99. Vaux D.L. and Strasser A. The molecular biology of apoptosis Proc Natl Acad Sci USA 93: 2239-2244, 1996.

100. Vyth-Dreese F.A., Dellemijn T.A., Frijhoff A., van Kooyk Y., Figdor C.G. Role of LFA-1/ICAM-1 in interleukin-2-stimulated lymphocyte proliferation. Eur J Immunol. 1993 Dec;23(12):3292-9.

101. Wang D., Sun L., Zborowska E., Willson J.K., Gong J., Verraraghavan J., Brattain M.G. Control of type II transforming growth factor-b receptor expression by integrin ligation. J Biol Chem 1999,274:12840-12847.

102. Wolyniec W.W., De Sanctis G.T., at al. Reduction of Antigen-induced Airway Hyperreactivity and Eosinophilia in ICAM-1-deficient Mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., Volume 18, Number 6, June 1998 777-785.

103. Woodcock-Mitchell J., Rannels S.R., Mitchell J., Rannels D.E., Low R.B. Modulation of keratin expression in type II pneumocytes by the extracellular matrix. Am Rev Respir Dis 1989,139: 343-351.

104. Zissel G., Ernst M., Rabe K., Papadopoulos Т., Magnussen H., Schlaak M., Muller-Quernheim J. Human alveolar epithelial cells type II are capable of regulating T-cell activity. J Investig Med 2000 Jan;48(l):66-75.

105. Zlotnik A. and Yoshie 0. Chemokines: a new classification system and their role in immunity. Immunity. 12,121-127 (2000).

106. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ