Индукция апоптоза тимоцитов, активированных и трансформированных лимфоцитов растворимыми факторами амебы штамма CDHT и тимусных эпителиальных клеток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат медицинских наук Корочкина, Светлана Леонидовна

• Корочкина, Светлана Леонидовна
• кандидат медицинских наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Корочкина, Светлана Леонидовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРА ТУРЫ.

1.1. Основные механизмы и проявления программированной клеточной гибели апоптоза.

1.2. Апоптоз и заболевания крови.

1.3. Взаимодействие амеб рода Acanthamoeba с различными клеточными линиями и культурами клеток человека и животных.

1.3.1. Биология амеб рода Acanthomoeba

1.3.2. Механизмы цитопатогенности представителей рода Acanthamoeba.

1.4. Взаимодействие эпителиальных клеток тимуса и их гуморальных факторов с тимоцитами.

1.4.1. Классификация эпителия тимуса и разнообразие его функций.

1.4.2. Индукция тимическими эпителиальными клетками и растворимыми факторами эпителия тимуса апоптоза тимоцитов.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Клетки и их источники.

2.2. Характеристика обследованных групп больных.

2.3. Культивирование клеток.

2.4. Фракционирование супернатанта CDHT и ТЭК.

2.5. Световая микроскопия.

2.6. Моноклональные антитела.

2.7. Цитофлуориметрия.

2.8. Оценка апоптоза клеток.

2.8.1. Регистрация раннего апоптоза и расчет клеточных фракций, вступивших в апоптоз.

2.8.2. Регистрация апоптоза с применением пропидия иодида. Расчет клеточных фракций, вступивших в апоптоз.

2.9. Статистика.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Оценка активности цельных супернатантов CDHT и ТЭК, а также амебы CDHT и ТЭК в отношении тимоцитов.

3.2. Фракционирование супернатантов ТЭК и CDHT.

3.2.1. Обнаружение активных фракций суперпатанта CDHT.

3.2.2. Обнаружение активных фракций супернатанта ТЭК.

3.3. Анализ спектра апоптотической активности фракций супернатантов CDHT и

3.3.1. Апоптоз мононуклеаров периферической крови здоровых доноров под действием фракций супернатантов CDHT и ТЭК ТЭК.

3.4. Влияние продуктов амебы CDHT и супернатанта ТЭК на апоптоз лейкозных клеток.

3.4.1. Апоптоз миелобластов периферической крови больных острым миелолейкозом под действием фракций супернатантов и самих супернатантов CDHT и ТЭК.

3.4.2. Апоптоз лимфоцитов периферической крови больных ХЛЛ под действием фракций супернатантов и цельных супернатантов CDHT и ТЭК.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Индукция апоптоза тимоцитов, активированных и трансформированных лимфоцитов растворимыми факторами амебы штамма CDHT и тимусных эпителиальных клеток»

Роль апоптоза в осуществлении нормальных и патологических процессов представляет большой интерес для практической и фундаментальной иммунологии. Тимические эпителиальные клетки (ТЭК), являющиеся основным компонентом стромы тимуса, играют ключевую роль в формировании Т-клеточного репертуара иммунной системы, обеспечивая выживание, пролиферацию и дальнейшую дифференцировку Т-клеточных клонов, распознавших комплекс МНС - пептид. При этом решающее значение имеет способность ТЭК и продуцируемых ими растворимых факторов индуцировать апоптоз тимоцитов, что, по-видимому, имеет значение в удалении ненужных клонов тимоцитов, не поддержанных в процессе позитивной селекции (.Rinner et al. 1996, Sharova etal., 2001).

Ранее в Институте Иммунологии Минздрава РФ была получена линия клеток из тимуса ребенка (Sharova et al., 1993), оперированного по поводу порока сердца. Линия клеток получила название CDHT (Cells Derived from Human Thymus). С участием протистологов было показано, что эти клетки происходят не из организма-хозяина, а являются амебами, принадлежавшими классу Lobosea, роду Acanthamoeba (Комогорова и соавт.). Клетки акантамебы штамма CDHT демонстрируют впечатляющую схожесть биологических эффектов с клетками тимического эпителия. В совместной культуре с тимоцитами клетки CDHT выделяют гуморальный фактор, который вызывает апоптоз тимоцитов, а также активированных и трансформированных лимфоцитов. Другие секретируемые ими факторы перекрестно реагируют с антителами к гормонам тимуса — тимулину и al-тимозину. Активность тимусных гормонов появляется в сыворотке тимэктомированных мышей, которым подсаживали клетки CDHT. В то время, как, при введении мышам этих клеток происходит опустошение лнмфоидных органов и ослабление гуморального иммунного ответа на тимусзависимый антиген.

Литературные источники, посвященные способности ТЭК и акантамеб, а также их гуморальных факторов, индуцировать апоптоз, в том числе опухолевых и активно пролиферирующих клеток, немногочисленны, и данный вопрос остается мало изученным, в частности, не охарактеризованы гуморальные факторы ТЭК и акантамеб, вызывающие апоптоз, недостаточно изучен спектр их клеток-мишеней. Кроме того, вызывает интерес тот факт, что клетки амебы, паразитирующей в тимусе, обладают свойствами, сближающими их с эпителиальными клетками тимуса. Сопоставление этих свойств и эффектов гуморальных факторов, выделяемых теми и другими клетками, послужит источником данных, представляющих обще биологический интерес и важных для понимания взаимоотношений клеток тимуса и паразитирующих в нем микроорганизмов. Кроме того, эти факторы могут явиться основой для создания новых противолейкозных препаратов.

Цель работы состояла в сравнительной характеристике гуморальных продуктов эпителиальных клеток тимуса и клеток амебы штамма CDHT, вызывающих апоптоз и дифференцировку тимоцитов.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Фракционировать супернатанты ТЭК и амеб штамма CDHT и выявить факторы, вызывающие апоптоз тимоцитов.

2. Изучить развитие апоптоза тимоцитов под влиянием гуморальных факторов амебы штамма CDHT и тимусных эпителиальных клеток in vitro.

3. Сопоставить биологическую активность растворимых факторов амебы и ТЭК путем оценки их влияния на апоптоз нормальных и активированных клеток крови человека.

4. Оценить способность гуморальных факторов амебы и тимусных эпителиальных клеток вызывать апоптоз лейкозных клеток крови человека. Научная новизна

Впервые подвергнуто комплексному сравнительному исследованию способность гуморальных факторов эпителиальных клеток тимуса и амеб штамма CDHT, выделенной из тимуса, индуцировать апоптоз тимоцитов. Показана роль индукции апоптоза в реализации цитопатогенного эффекта амебы и зависимость чувствительности к апоптозу, вызываемому, растворимыми факторами CDHT, от активационного статуса клеток-мишеней. Показана способность гуморальных факторов амебы и эпителиальных клеток тимуса вызывать апоптоз клеток миелоидного и лимфоидного лейкозов. Выявлены активные факторы супернатантов амеб и эпителиальных клеток тимуса, способных значительно усиливать апоптоз активированных и трансформированных клеток-мишеней (лимфоцитов). Проведена сравнительная характеристика выделенных гуморальных факторов клеток CDHT и тимусных эпителиальных клеток.

Теоретическая и практическая значимость

Теоретическая значимость работы состоит в выяснении сходства ряда функциональных эффектов клеток амебы, паразитирующей в тимусе, и эпителиальных клеток тимуса, в частности, в способности индуцировать апоптоз тимоцитов, активированных и трансформированных лимфоцитов.

Полученные результаты позволят уточнить патогенез иммунологических нарушений при паразитировании амебы в тимусе человека.

Гуморальные факторы амебы могут рассматриваться в перспективе как основа для создания препаратов, с противолейкозной активностью, реализуемой через индукцию апоптоза трансформированных лимфоцитов.

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Корочкина, Светлана Леонидовна

Выводы

1. Цитопатогенный эффект амебы штамма CDHT и ее супернатанта в отношении тимоцитов человека реализуется через индукцию апоптоза клеток-мишеней. Аналогичным, но более слабым действием обладают тимусные эпителиальные клетки (ТЭК) и их гуморальные продукты.

2. Апоптогенная активность супернатанта CDHT связана преимущественно белком, обладающим мол. массой 12-13 кДа. Аналогичная активность супернатанта ТЭК связана с белком мол. массой 14-16 кДа.

3. Покоящиеся лимфоциты перхтферической крови не подвергаются апоптозу при действии клеток CDHT , а также их гуморальных факторов. Активация лимфоцитов митогенами делает их чувствительными к аптогенному действию гуморальных факторов амебы штамма CDHT. Гуморальные продукты ТЭК не индуцируют апоптоз покоящихся и активированных лимфоцитов.

4. Белок супернатанта амебы с мол. массой 12-13 кДа вызывает апоптоз миелобластов крови больных острым миелолейкозом с максимальным эффектом через 72 часа культивирования.

5. В-клетки крови больных хроническим лимфолейкозом подвергаются апоптозу при действии супернатанта амебы CDHT и его активной фракции с максимальным эффектом через 18 часов.

6. Гуморальные факторы ТЭК вызывают апоптоз лейкозных клеток крови больных OMJI и ХЛЛ. Активность факторов ТЭК выражена слабее, чем факторов амебы.

3.5. Заключение

В более ранних исследованиях нашей лаборатории было установлено, что акантамеба, выделенная из тимуса ребенка (штамм CDHT), обладает рядом свойств, сближающих ее с нормальными ТЭК. Одно из таких свойств — способность индуцировать апоптоз тимоцитов.

Данная работа посвящена более детальному сравнению этой способности ТЭК и амебы штамма CDHT, роли их гуморальных факторов, а также уточнению спектра клеток-мишеней апоптогенного действия, в частности, среди лейкозных клеток.

Предположение, что гибель ядросодержащих клеток, подвергшихся сокультивированию с амебой CDHT, может осуществляться по механизму апоптоза, было подтверждено в специфических тест-системах.

Использованные методы позволили оценивать ранние этапы развития апоптоза (по эксперессии фосфатидилсерина, выявляемому по связыванию аннексина V) и значительно более поздние его этапы (по утрате части ДНК, выявляемому методом проточной цитометрии). При тестировании тимоцитов, раньше в апоптоз вступают клетки, проконтактировавшие с клетками CDHT, несколько позднее - клетки, обработанные супернатантом CDHT. ТЭК и их супернатант индуцируют апоптоз в одни и те же сроки. Все это может быть связано с тем, что индукция апоптоза может происходить как в результате контактных взаимодействий клеток, так и при действии гуморальных факторов, причем для выработки апоптотического фактора акантамебе требуется большее время, чем для продуцирования активных фракций ТЭК. Выраженность апоптоза под влиянием CDHT и ее факторов несколько выше, чем при действии ТЭК и ее продуктов. Через 24 часа инкубации клетки амебы вызывают более сильный апоптоз, чем их супернатант, а после сокультивации в течение 48 часов эффекты клеток CDHT и гуморальных факторов не различаются. При использовании ТЭК и их продуктов, последние вызывали более сильный апоптоз, чем клетки. Таким образом, апоптоз тимоцитов, вызываемый контактом с клетками амебы, развивается несколько быстрее, чем апоптоз, индуцируемый супернатантом, и является более выраженным, чем при воздействии на клетки-мишени тимусных эпителиальных клеток. В более поздние сроки эффекты CDHT и их гуморальных продуктов выравниваются, а эффект гуморальных продуктов ТЭК превышает таковой самих клеток.

С целью выявления активных белковых фракций обоих супернатантов было предпринято их фракционирование методом гель-фильтрации. Анализ аптогенной активности проб супернатанта CDHT выявил несколько пиков с апоптогенной активностью. Наибольшая активность сосредоточена во фракции с мол. массой 12-13 кДа. Активность выявлена также в высокомолекулярных (134 и 258 кДа) фракциях. Можно предположить, что апоптогенная активность супернатанта связана по преимуществу с белком с Mr около 12 — 13 кДа. Наличие активности в пробах с высокой мол. массой вероятнее всего отражает наличие молекулярных агрегатов активных белков.

Супернатант ТЭК содержит несколько фракций с апоптогенной активностью, главная из которых связана с белками Mr 14-16 кДа, а другие, вероятно, отражают активность молекулярных агрегатов.

Кроме тимоцитов в качестве мишеней апоптогенного действия ТЭК и CDHT использованы нормальные лимфоциты периферической крови здоровых доноров. Использовались как цельные супернатанты, так и активные фракции, полученные гель-фильтрацией: фракции супернатанта CDHT с Mr 12-13 кДа и фракции супернатанта ТЭК с Mr 14-16 кДа.

Очистка активных продуктов амебы и ТЭК сопровождается лишь незначительным повышением их активности и не привела к получению гомологичных продуктов.

Ни клетки CDHT, ни ТЭК, ни их гуморальные факторы не вызывают апоптоза покоящихся мононуклеаров крови человека. Стимуляция Т и В-клеток митогенами делает их чувствительными к гуморальным факторам CDHT, но не к факторам, секретируемым

ТЭК. При действии супернатанта и активной фракции CDHT на мононуклеары крови, стимулированных Т-клеточным митогеном ФГА, наблюдается усиление апоптоза мононуклеаров в основном за счет индукции гибели Т (CD3+) клеток. Аналогично, при активации мононуклеаров митогеном лаконоса, мишенью апоптогенного действия фактора CDHT становятся преимущественно В-клетки. Эти закономерности в сходной степени проявляются при оценке апоптоза через 18 часов (аннексиновым методом) и через 72 часа (в тесте на гиподиплоидию). Не выявлено лишь достоверного апоптогенного эффекта на В-клетки в тесте на гиподиплоидию. В то же время гуморальные факторы ТЭК проявляют аналогичное действие только в 72-часовом тесте на гиподиплоидию.

Исходя из различий в чувствительности к факторам CDHT и ТЭК покоящихся и активированных лимфоцитов, мы предположили, что мишенью для апоптогенного эффекта этих продуктов могут быть трансформированные лимфоциты, в частности лейкозные клетки, которые по ряду свойств, напоминают активированные клетки. Исследование распространили не только на В-лимфоциты больных хроническим лимфолейкозом, но и на лейкозные миелоидные клетки больных острым мономиелобластным лейкозом.

Чувствительность клеток OMJI к апоптогенному действию гуморальных факторов амебы штамма CDHT, а также ТЭК проявилась только при оценке по накоплению гиподиплоидных клеток через 72 часа культивирования. При этом фракции супенатанта CDHT обладают наибольшей активностью.

Мы изучали апоптогенность супернатантов ТЭК и CDHT и их фракций в отношении лимфоцитов периферической крови больных XJIJI с содержанием CD19+ в периферической крови свыше 50%. Исследованные гуморальные продукты вызывали апоптоз почти исключительно В-лимфоцитов (вероятно, лейкозных). При этом факторы амебы были активны как в аннексиновом тесте, так и в тесте на гиподиплоидию.

Супернатант ТЭК вызывал апоптоз В-клеток преимущественно в 72-часовой, а фракция 14-16 кДа - в 18-часовой культуре.

Таким образом, как акантамеба штамма CDHT, так и нормальные ТЭК вырабатывают гуморальные факторы, способные вызывать апоптоз тимоцитов и активированных лимфоцитов, не влияя на жизнеспособность интактных лимфоцитов.

Гуморальные факторы из обоих источников индуцируют апоптоз лейкозных миелоидных клеток и В-лимфоцитов, факторы амебы проявляют при этом более высокую активность, чем факторы ТЭК, а В-лимфоциты являются более чувствительными мишенями, чем клетки острого миелолейкоза.

При действии изучаемых факторов на тимоциты, было установлено, что несмотря на невысокие проценты апоптотических клеток, регистрируемые в конкретных пробах, данные факторы способны вызывать в относительно короткий срок полную элиминацию тимоцитов из культуры. По аналогии можно предположить, что эти факторы способны вызывать гибель всех доступных лейкозных клеток. Это дает основание рассматривать, по крайней мере, гуморальные факторы амебы 12-13 кДа в качестве агента с потенциальной противолейкозной активностью in vivo.

В случае наличия такой активности, данный агент будет подвергнут испытанию как потенциальный антилейкозный фактор.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Корочкина, Светлана Леонидовна, 2005 год

1. Барышников А.Ю., Шелепов В.П., Кузнецов С.В., и др. Гематология и трансфузиология. 1996, № 5, с.42-44.

2. Будагян В.М. Апоптоз нормальных и трансформированных лимфоцитов при взаимодействии с эпителиальными клетками тимуса in vitro. Диссертация на соискание ученой степени канд. мед. наук. М., 1996, с. 130.

3. Галактионов В.Г. Иммунология. М., МГУ им. Ломоносова, 1998.

4. Дзуцев А.Х. Влияние эпителиальных клеток тимуса и их гуморальных факторов на апоптоз тимоцитов. Диссертация на соискание ученой степени канд. мед. наук. М., 2001, с.122.

5. Клиническая иммунология. Под ред. Е.И. Соколова. М., Медицина, 1998.

6. Комогорова В.В. Проявления и некоторые механизмы апоптоза, индуцируемого клетками акаитамебы линии CDHT и их гуморальными продуктами. Диссертация на соискание ученой степени канд. биол. наук. М., 2002, с.99.

7. Комогорова В.В., Шарова Н.И., Ярилин А.А. Иммунология, 2003.

8. Кульберг А.Я. Регуляция иммунного ответа. М., Медицина, 1986.

9. Лимфоциты. Методы. Пер. с англ. под ред. Дж. Клауса. М., Мир. 1990.

10. Окороков А.Н. Диагностика болезней внутренних органов. М.: Мед. Литература, 2001, №4, с.502.

11. Петров Р.В. Иммунология. М., Медицина, 1987.

12. Полосухина Е.Р., Заботина Т.Н., Шишкин Ю.В. и др. Экспериментальная онкология.1997, №19, с.206-211.

13. Программированная клеточная гибель. Под ред. B.C. Новикова. С.-П., Наука, 1996.

14. Ройт А. Основы иммунологии. М., Мир, 1991.

15. Скоупс Р. Методы очистки белков. М., Мир, 1985.

16. Сопина В.А. Клеточная биология амеб и амебожгутиконосцев — паразитов человека и животных. Цитология 1997, Т.39, №4/5, с.361-385.

17. Хаитов РМ, Игнатьева ГА, Сидорович ИГ. Иммунология. М., Медицина, 2000.

18. Шишкин Ю.В., Седяхина Н.П., Заботина Т.Н. Бюлл. Экспериментальная биология. 1997, Т. 122, №11, с.544-546.

19. Ярилин А.А., Шарова Н.И., Дзуцев А.Х., Комогорова В.В. Апоптоз тимоцитов и активация эпителиальных клеток тимуса человека при их совместном культивировании. В кн. «Проблемы биомедицины на рубеже XXI века». М., 2000, с.226-235.

20. Ярилин А.А., Шарова Н.И., Дзуцев А.Х., Комогорова В.В. Последствия взаимодействий лимфоидных и эпителиальных клеток тимуса человека in vitro.// Росс, физиологич. журнал им. И.М. Сеченова, 2000, Т.86, №3, с.285-291.

21. Ярилин А.А, Никонова МФ и др. Апоптоз, роль в патологии и значимость его оценки при клинико-иммунологическом обследовании больных. Медицинская иммунология. 2000, №2, с. 1-7.

22. Ярилин А.А., Основы Иммунологии, М., Медицина, 1999.

23. Ярилин А.А. Апоптоз. Природа феномена и его роль в целостном организме. Патологическая физиология и эксп. Терапия, 1998, №2, с.38-48.

24. Ярилин А.А., Пинчук В.Г., Гриневич Ю.А. Структура тимуса и дифференцировка Т-лимфоцитов. Киев, Наукова думка, 1991.

25. Abbas АК, Lichtman АН, Pobe JS. Cellular and Molecular Immunology. 4-th Ed. 2000, 553

26. Akbar A, Salmon M, Savil J. A possible role for bcl-2 in regulating T-cell memory- a 'balancing act' between cell death and survival. Immunol. Today. 1993, N14, p.526-532.

27. Alizadeh H, Pidherney MS, McCulley JP, Niederkorn JY. Apoptosis as a mechanism of cytolysis of tumor cells by a pathogenic free-living amoeba. Infect Imun. 1994, N62(4), p.1298-1303.

28. Anderson M.S., Venanzi E.S., et al. Science. 2002, v.298, p.1395-1401.

29. Andreeff M, Darzynkiewicz Z, Sharpless TK, Clarkson BD, Melamed MR. Blood, Abstr., 1980, N55, p.282-293.

30. Ashkenazy A, Dixit VM. Death receptors: signaling and modulation. Science. 1998, N76, p.1305-1308.

31. Beg. AA, and D. Baltimore. An essential role for NF-k in preventing TNFa- induced cell death. Science. 1996, N274, p.782.

32. Bichi R, Shinton SA, Martin ES, KovalA, Calin GA, Cesari R, Russo G, Hardy RR, Croce CM. Human chronic lymphocytic leukemia modeled in mouse by targeted TCL1 expression// Proc Natl Acad Sci USA. 2002, v. 14; N99(10), p.6955-6960.

33. Bonilla HF, Whitehurst A, Kauffman CA. Acanthamoeba sinusitis and disseminated infection in a patient with AIDS. Infect Med. 1999, N16(6), p.397-400.

34. Brita Gaudecker Functional histology of the human thymus. Anat. Embryol. 1991, N183,p.1-15.

35. Buendia В., Santa-Maria A., and Courvalin J.C. Caspase-dependent proteolysis of integral and peripheral proteins of nuclear membranes and nuclear pore complex proteins during apoptosis. Journal of Cell Science. 1999, N112, p.1743-1753.

36. Brockhaus M, Schoenfeld HJ, Schlaeger EJ, Hunzicher W, Less-lauer W, Loetsher H. Identification of two types of tumor necrosis factor receptors on human cell lines by monoclonal antibodies. Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 1990, N87, p.3127-3131.

37. Cao Z, Jefferson DM, Panjwani N. Role of carbohydrate-mediated adherence in cytopathogenic mechanisms of Acanthamoeba. J Biol Chem. 1998, N273(25), p.138-145.

38. Cho JH, Na BK, Kim TS, and Song CY. Purification and characterization of an extracellularserine proteinase from Acanthamoeba castellanii. Appl. Environ. Microbiol. 2000, N66(10), p.4408-4413.

39. Cohen JJ, Duke RC. Glucocorticoid activation of a calcium-dependent endonuclease in thymocyte nuclei leads to cell-death. J Immunol. 1984, N132, p.38-42.

40. Colic M, Jovanovic S, Mitrovic S Dujic A. Immunohisto-chemical identification of six cytokeratin-defined subsets of rat thymic epithelial cells. Thymus. 1989, N13, p.174-185.

41. Colic M, Vucevic D, Popovic P, Dujic A. Bidirectional interactions between thymocytes and thymic epithelial cell lines in vitro// Dev Immunol. 1998, N6(1-2), p.71-79.

42. Dechat T, Korbei B, Vaughan OA, Vlcek S, Hutchison C., and Foisner R. Lamina-associated polypeptide 2 (alpha) binds intranuclear A-type lamins. J. Cell. Sci. 2000, N113, p.3473-3484.

43. Denecker G, Vercammen D, Declercq W, and Vandenabeele P. Apoptotic and necrotic cell death induced by death domain receptors. Cell Mol. Life Sci. 2001, N58(3), p.356-370.

44. Di Giuseppe JA, Le Beau P, Augebraun J, Borowitz MJ. Amer. J. Clin. Path. 1996, N106, p.438-441.

45. Dodson JM, Petri WA. Pore formation ant cytolysis by Entamoeba hystolytica. Parasitol Today. 2004, N10, p.7-8.

46. Duke RC, Witter RZ, Nash PB, Young J, Ojcius DM. Cytolysis mediated by ionophores and pore-forming agents: role of intracellular calcium in apoptosis. FASEB J. 1994, N8(2), p. 237-246.

47. Fulda S., Meyer E., Friesen C., Susin S.A., Kroemer G., and Debatin K.M. Cell type specific involvement of death receptor and mitochondrial pathways in drug-induced apoptosis. Oncogene. 2001, N20(9), p.1063-1075.

48. Gilliland DG. Molecular genetics of human leukemias: new insights into therapy//Semin Hematol. 2002, N39(4 Suppl 3), p.6-11. ,

49. Gisselbrecht S. Oncogenes and leukemia: history and perspectives//Med Sci. 2003, N19(2), p.201-210.

50. Gotzmann J., Vlcek S., and Foisner R. Caspase-mediated cleavage of the chromosome-binding domain of lamina-associated polypeptide 2 alpha. J. Cell. Sci. 2000, N113(21), p.3769-3780.

51. Griffith T.S., Yu X., Herndon J.M., Green D.R., and Ferguson T.A. CD95-induced apoptosis of lymphocytes in an immune privileged site induces immunological tolerance. Immunity. 1996, N5, p.7-16.

52. Gruss H., Boaiani N. et al, Pleotropic effects of the CD30 ligand on CD30- expressing cells and lymphoma cell lines. Blood. 1994, N83, p.2045-2056.

53. Guidos, C. J. et al. V(D)J recombination activates a p53-dependent DNA damage checkpoint in scid lymphocyte precursors. Genes Dev. 1996, N10, p.203 8-2054.

54. Hakem, R., A. Hakem, G. S. Duncan, J. T. Henderson, M. Woo, M. S. Soengas et al. Differential requirement for caspase 9 in apoptotic pathways in vivo. Cell. 1998, N94, p.339.

55. Hawley HB, Czachor JS, Malhotra V, Funkhouser JW. Acanthamoeba encephalitis in patients with AIDS. The AIDS Reader. 1997, N7(4), p.134-137.

56. Hsu, H., J. Xiong, and D. V. Goeddel. The TNF receptor 1-associated protein TRADD signals cell death and NF-kB activation. Cell. 1995, N81, p.495.

57. Ichiyoshi H, Kiyozuka Y, Kishimoto y. et al. Massive telomere loss and telomerase RNA expression in dexamethasone-induced apoptosis in mouse thymocytes.//Exp Mol Pathol. 2003, N75(2), p. 178-186.

58. Jaison PL, Cao Z, Panjwani N. Binding of Acanthamoeba to mannose-glycoproteins of corneal epitelium: effect of injury. Curr Eye Res. 1998, N17(8), p.770-776.

59. Janeway C.A., P. Travers, M. Walport, J.D. Capra. Immunobiology. 4-th Ed. 1999, p.635.

60. Jamson S.C., Bevan M.J. Curr.Opin.Immunol. 1998, N10, p.214-219.

61. Kerr J et al. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implication in tissue kinetics. Br. J. Cancer. 1972, N26, p.239-257.

62. Kerr JF, Gobe GC, Winterford CM, Hormon BV. Anatomical methods in cell death.

63. Methods Cell Biol. 1995, N46, p. 1-27.

64. Khan N.A., E. L. Jarroll, N. Panjwani, Z. Cao, and T. A. Paget. Proteases as markers fordifferentiation of pathogenic and nonpathogenic species of Acanthamoeba. J. Clin. Microbiol. 2000; N38 (8), p.2858-2861.

65. KingstonR., E.Jenkinson. Characterization of stromal cell populations in the developing thymus of normal and nude mice. J.Immunol. 1984, N14, p.1052-1056.

66. Kotani Т., Aratake Y., Kondo S. et al. Leuk. Res. 1994, v.18, p.305-310.

67. Krammer PH. CD95 (APO-l/Fas)-mediated apoptosis: live and let die. Adv. Immunol. 1999, v.71, p.163-210.

68. Lagrota- Candido JM, Villa-Verde DM et al. Extracellular matrix components of the mouse thymus microenvironment. Cell Immunol. 1996, Jun, N170(2), p.235-244.

69. Leher H, Silvany R, Alizadeh H, Huang J, Niederkorn JY. Mannose induces the release of cytopathic factors from Acanthamoeba castellanii/ Infect Immun. 1998, N66(1), p.5-10.

70. Luiz Alves, Antonio Campos et al. Functional Gap Junctions in Thymic Epithelial Cells are Formed by Connexin 43, Cell Tissue Res. 1996, N279, p.221-231.

71. MattanaA, Bennardini F, Usai S, Fiori PL, Franconi F, Cappuccinelli P. Acanthamoeba castellanii metabolites increase the intracellular calcium level and cause cytotoxicity in wish cells. Microb Pathog. 1997, N2392, p. 85-93.

72. Mitra MM, Alizadeh H, Gerard , Niederkorn JY. Characterization of a plasminogen activator produced by Acanthamoeba castellanii. Mol Biochem Parasitol. 1995, N73(1-2), p.157-164.

73. Murakawa GJ, McCalmont T, Altman J, Telang GH, Hoffman MD, Kantor GR, Berger TG. Disseminated acanthamebiasis in patients with AiDS. A report of five cases and a rewiew of the literature. Arch Dermatol. 1995, N131(11), p.1291-1296.

74. Murphy, M., L. Pike-Nobile, V.W. Soo, and L. B. Epstein. Characterization of TNF receptors on human thymocytes. Thymus. 1994, N.23, p.177.

75. Musci MA, Latinis KM, and Koretzky GA. Signaling events in T lymphocytes leading to cellular activation or programmed cell death. Clin. Imunol. And Immunopath. 1997, N83(3), p.205-222.

76. Na В., Kim J., and Song C. Characterization and pathogenetic role of proteinase from Acanthamoeba castellanii. Microb. Pathog. 2001, N30(1), p.39-48.

77. Narducci MG, Pescarmona E, Lazzeri C, Signoretti S et al. Cancer Res, Abstr., 2000, N60, p.2095-2100.

78. Nilsson K, Cheson BD. Chronic lymphocytic leukemia: Scientific Advances and Clinical Development (Dekker, New York). 1992.

79. Niszl IA, Veale RB, Markus MB. Cytopathiogenicity of clinical and environmental Acanthamoeba isolates for two mammalian cell lines. J Parasitol. 1998; v.84, N50, p.961-967.

80. O'Brien M.A., Moravee R.A., and Riss T.L. Poly (ADP-ribose) polymerase cleavage monitored in situ in apoptotic cells. Biotechniques. 2001, v.30. N4, p.886-891.

81. Orrenius S, McConkey DJ, Bellomo G, Nicotera P. Role of Ca + in toxic cell killing. Trends Pharmacol Sci. 1989, N10, p.281-285.

82. Pazirandeh A, Xue Y, Rafter I, Sjovall J, Jondal M, Okret S. Paracrine glucocorticoid activity produced by mouse thymic epithelial cells. FASEB J. 1999, May, v.13, N8, p.893-901.

83. Pekarsky Y, Hallas C, Croce CM. Targeting mature T cell leukemia: new understanding of molecular pathways// Am J Pharmacogenomics. 2003, v.3, N1, p.31-36.

84. Pekarsky Y, Hallas C, Croce CM. Molecular basis of mature T-cell leukemia// JAMA. 2001, v.14, N286(18), p.2308-2314.У

85. Pettit DA, Williamson J, Cabral GA, Marciano-Cabral F. In vitro destruction of nerve cell cultures by Acanthamoeba spp.: a transmission and scanning electron microscopy study. J Parasitol. 1996, N82(5), p.769-777.

86. Pezzano M, Samms M, Guyden JC. TNF and FAS-induced apoptosis during negative selection in thymic nurse cells. Ethn Dis. 2001, N11(1), p. 154-156.

87. Pidherney MS, Alizadeh H, Stewart GL, McCulley JP, Niedercorn JY. In vitro and in vivo tumoricidal properties of a pathogenic/free-living amoeba. Cancer Lett. 1993, N72(1-2), p.91-98.

88. Rinner I, Eren R, Skreiner E, Thymocyte-directed enhancement of apoptosis via soluble factor(s) derived from a cortical and a medullary thymic epithelial cell line. Cell Tissue Res. 1996, May, N284(2), p.327-330.

89. Roitt I. Essential Immunology (9th ed.). Blackwell Science, 1997.

90. Salmena L., Lemmers В et al. Essential role of caspase 8 in T-cell-mediated immunity. Genes Dev. 2003, v.l, N17(7), p.883-895.

91. Schmitz I, Clayton LK, Reinherz EL. Gene expression analysis of thymocyte selection in vivo//Int Immunol. 2003, N15(10), p.1237-1248.

92. Schreiber L, Sharabi Y et al, Induction of apoptosis and p53 expression in immature thymocytes by direct interaction with thymic epithelial cells. Scand J Immunol. 1996, Oct, N44(4), p.314-322.

93. Selby DM, Chandra RS, Rakusan ТА, Loechelt B, Markle BM, Visvesvara GS. Amebic osteomyelitis in a child with acquired immunodeficiency syndrom: a case report. Pediatr Pathol Lab Med. 1998, N18(1), p. 89-95.

94. Shanker A, Singh SM. Immunopotentiation in mice bearing a spontaneous transplantable T-cell lymphoma: role of thymic extract.Neoplasma. 2003, N50(4), p.272-279.

95. Shin HJ, Cho MS, Lee M, Park S, Sohn S, Im KI. Apoptosis of primary-culture rat microglial cells induced by pathogenic Acanthamoeba spp. Clin Diagn Lab Immunol. 2000, v.7. N3, p. 510-514.

96. Takizawa J, Suzuki R, Kuroda H, Utsunomiya A, Kagami Y, Joh T, Aizawa Y, Ueda R, Seto M. Jpn. J. Cancer Res.Abstr., 1998, N89, p.712-718.

97. Tan B, Weldon-Linne CM, Rhone DP, Penning CL, Visvesvara GS. Acanthamoeba infection presenting as skin lesions in patients with the acquired immunodeficiency syndrom. Arch Pathol Lab Med. 1993, N117(10), p. 1043-1046.

98. Taylor WM, Pidherney MS, Alizadeh H, Niederkorn JY. In vitro characterization of Acanthamoeba castellanii cytopathic effect. J Parasitol. 1995, N81(4), p.603-609.

99. Tucek-Szabo C., Andjelic S. Surface T-cell Fas-receptor/CD95 regulation in vitro activation and apoptosis. Activation induced death can occure without Fas-receptor. J Immunol. 1996, N156, p. 192-200.

100. Vieira HL, Boya P, Cochen I, EL Hamel C, Haouzi D, Druillenec S, Belzacq AS, Brenner C, Roques B, Kroemer G. Cell permeable ВНЗ-peptides overcome the cytoprotective effect of Bcl-2 and Bcl-X(L). Oncogene. 2002, Mar, v.27, N21(13), p.1963-77.

101. Wajant, H., F. J. Johannes, E. Haas, K. Siemienski. Dominant-negative FADD inhibits TNFR60-, Fas/Apol- and TRAIL-R/Apo2-mediated cell death but not gene induction. Curr. Biol. 1998, N8, p.13.

102. Wang S, El-Deiry WS. TRAIL and apoptosis induction by TNF-family death receptors// Oncogene. 2003, v.22, p.8628-8633.

103. Wang X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes Dev. 2001, v. 15, p.2922-2933.

104. Wang E., Marcotte R., and Petroulakis E. Signaling pathway for apoptosis: a racetrack for life or Death. J. Cell Biochem. Suppl. 1999, N32/33, p.95-102.

105. Winoto A. Cell death in the regulation of immune responses. Current Opinion in Immunol. 1997, N9, p.3 65-370.

106. Yang Z, Cao Z, Panjwani N. Pathogenesis of Acanthamoeba keratitis: carbohydrate-mediated host-parasite interactions. Infect Immune. 1997, N65(2), p.439-445.

107. Yarilin A.A., Belyakov I.M. Current Medicinal Chemistry. 2004, N11, p.447-464.

108. Yarilin A.A., SharovaN.I., Dzutsev A.Kh., Litvina M.M., Pleskovskaya G.N., Kharchenko T.Yu. Immunology Letters. 2001, v.78, p.201-207.

109. Yarilin A, Sharova N, Komogorova V, Vasilenko R, Khlebnikov V, Vasiliev A, Abramov

110. V. Interaction of lymphotropic strain of Acantamoeba with human and mouse cells//3nd f1.tern conf on Emerg Zoonoses. Holland. 2001, p. 69.

111. Yarilin A.A. What the thymus is needed for? Intrathymic events and their uniqueness. Russian. J. Immunol. 1998, N3(1), p.5-20.

112. Zheng L, Fisher G, Miller RE, Peschon J, Lynch DH, Lenardo MJ. Induction of apoptosis in mature T cell by TNF. Nature, 1995, p.377, p.348-351.

113. Zilberman Y, Yefenof E, Katzav S, Dorogin A, Rosenheimer-Goudsmid N, Guy R. Apoptosis of thymic lymphoma clones by thymic epithelial cells: a putative model for 'death by neglect'. Immunol Lett. 1999, v.l, N67(2), p.95-104.