Влияние паратиреоидного гормона на кроветворные и стромальные клетки-предшественники тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.29, кандидат биологических наук Свинарева, Дарья Анатольевна

• Свинарева, Дарья Анатольевна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Свинарева, Дарья Анатольевна

Оглавление.

Основные использованные обозначения и сокращения.

Введение.

1 Актуальность проблемы.

2 Цель работы.

3 Основные задачи.

4 Научная новизна и практическое значение работы.

5 Материалы и методы исследования.

6 Основные положения, выносимые на защиту.

7 Содержание работы по

главам.

8 Благодарности.

Глава 1. Обзор литературы.

1 Ниша для стволовых клеток.

1.1 Ниша для кроветворных клеток.

1.2 Основные свойства стволовых кроветворных клеток и их регуляция.

1.2.1 Схема кроветворения.

1.2.2 Регуляция самоподдержания и дифференцировки СКК.

2 Мезенхимальная стволовая клетка.

3 Функции паратиреоидного гормона.

3.1 Свойства паратиреоидного гормона.

3.2 Роль ПТГ в регуляции клеток стромы и гемопоэза.

Глава 2. Материалы и методы.

1 Животные и их содержание.

2 Условия облучения животных и культур клеток.

3 Получение клеток костного мозга здоровых доноров.

4 Пассирование клеток костного мозга человека.

5 Длительные культуры костного мозга Декстеровского типа (32).

5.1 Получение длительной культуры костного мозга мыши.

5.2 Получение длительной культуры костного мозга человека.

6 Определение количества КО ОБ.

7 Получение и анализ КОЕ-С.

8 Определение количества КОЕ-ГМ (агаровая культура клеток из суспензионной фракции ДККМ).

9 Определение количества КОЕ-К (колоний в метилцеллулозе).

10 Определение интенсивности пролиферации предшественников разной степени зрелости.

11 Проверка функционального состояния подслоев ДККМ после воздействия ПТГ.

11.1 Определение частоты кроветворных клеток-предшественников после культивирования клеток КМ на предварительно обработанных ПТГ подслоях ДККМ.

11.2 Определение изменения количества "ниш" (выживания КООБ) после кратковременного культивирования клеток КМ на предварительно обработанных ПТГ подслоях ДККМ.

11.3 Сравнение способности стромальных подслоев, предварительно обработанных ПТГ, поддерживать рост КООБ.

11.4 Проверка способности клеток подслоя ДККМ формировать очаг эктопического кроветворения.

12 Режим обработки мышей ПТГ.

13 Получение очагов эктопического кроветворения.

14 Метод конкурентной репопуляции.

15 Определение фактора оседания (Ф-24) СКК в КМ и селезенке.

16 Подсчет клеток.

17 Выделение геномной ДНК из селезеночных колоний и клеток подслоя ДККМ.

18 Выделение РНК из анализируемых клеток.

18.1 Выделение РНК.

18.2 Определение количества и чистоты полученной РНК.

19 Анализ геномной ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

20 Анализ экспрессии различных генов методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).

20.1 Построение первых цепей ДНК на РНК.

20.2 Полуколичественный анализ полученной кДНК методом ПЦР и Саузерн блот-гибридизации с изотопным мечением продукта реакции.

20.2.1 Получение количественных данных экспрессии генов с помощью прибора Фосфоимаджер.

20.2.2 Анализ результатов, полученных на приборе Фосфоимаджер.

21 Методы статистической обработки данных.

22 Иммуноцитохимия.

22.1 FISH анализ.

22.1.1 Приготовление препаратов хромосом.

22.1.2 Флюоресцентная in situ гибридизация.

Глава 3. Результаты.

1 Влияние ПТГ на стволовые кроветворные клетки-предшественники.

1.1 Изучение влияния ПТГ на функциональный статус ранних кроветворных клеток-предшественников.

1.2 Анализ количества КООБ в КМ мышей, получавших ПТГ.

1.3 Анализ количества КОЕ-С в КМ мышей, получавших ПТГ.

1.4 Анализ количества КОЕ-К в КМ мышей, получавших ПТГ.

1.5 Определение пролиферации клеток-предшественников.

2 Влияние ПТГ на кроветворение в длительных культурах костного мозга мыши и человека.

2.1 Анализ кроветворения в культурах при добавлении ПТГ.

2.1.1 Клеточная продукция в ДККМ мыши и человека.

2.1.2 Анализ количества КОЕ-ГМ и КОЕ-К в ДККМ мыши и человека, обработанных и не обработанных ПТГ.

2.1.3 Анализ спектра кроветворных предшественников методом КООБ на разных сроках культивирования ДККМ мыши и человека.

2.1.4 Пролиферация клеток-предшественников в ДККМ мыши.

2.1.5 Анализ экспрессии генов в стромальных подслоях ДККМ мыши и человека.

2.2 Анализ кроветворения и адгезии кроветворных клеток на стромальных подслоях ДККМ, предварительно обработанных ПТГ.

2.2.1 Клеточная продукция в ДККМ мыши и человека после второй посадки КМ на подслои, обработанные ПТГ в различных концентрациях.

2.2.2 Частота кроветворных клеток-предшественников после культивирования клеток КМ на предварительно обработанных ПТГ подслоях ДККМ мыши и человека.

2.2.3 Определение изменения количества "ниш" (выживания КООБ) после кратковременного культивирования клеток КМ на предварительно обработанных ПТГ подслоях ДККМ.

3 Влияние ПТГ на мезенхимальные стволовые клетки и строму кроветворных органов.

3.1 Анализ очагов эктопического кроветворения, сформировавшихся из КМ мышей, предварительно получивших курс инъекций ПТГ.

3.1.1 Определение веса костной раковины и клеточности трансплантатов, сформировавшихся из обработанного ПТГ КМ.

3.2 Анализ очагов эктопического кроветворения, формировавшихся из КМ во время инъекций ПТГ.

3.2.1 Определение веса костной раковины и клеточности трансплантатов, формировавшихся из КМ во время инъекций ПТГ.

3.2.2 Характеристики кроветворных клеток-предшественников в очагах эктопического кроветворения, сформировавшихся из интактного КМ во время инъекций ПТГ.

3.3 Анализ очагов эктопического кроветворения, сформировавшихся из клеток подслоя ДККМ, обработанной и не обработанной ПТГ.

3.4 Влияние ПТГ на самоподдержание клеток, способных к переносу кроветворного микроокружения.

3.5 Влияние ПТГ на способность стромальных клеток ДККМ мыши и человека поддерживать рост КООБ.

3.6 Изучение влияния ПТГ на взаимодействие стромального микроокружения с СКК.

3.6.1 Фактор оседания КОЕ-С в КМ и селезенке.

3.6.2 Фактор оседания КООБ в КМ и селезенке.

3.6.3 Распределение КОЕ-С и КООБ в КМ и селезенке.

Глава 4. Обсуждение.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние паратиреоидного гормона на кроветворные и стромальные клетки-предшественники»

1 Актуальность проблемы.

Кроветворение представляет собой процесс образования, по меньшей мере, 10 видов зрелых клеток крови, выполняющих совершенно разные функции. Клетки крови имеют короткий жизненный цикл и погибают в течение нескольких дней или месяцев. Основная масса клеток крови представлена конечными специализированными, неспособными к делению клетками. Поэтому в течение всей жизни происходит новообразование и созревание клеток крови в специальных кроветворных тканях - в костном мозге, селезенке, тимусе, лимфатических узлах. Известно, что в основе гемопоэза лежит стволовая кроветворная клетка (СКК). Большинство СКК находятся в стадии покоя клеточного цикла, и в каждый момент времени только несколько клеток поддерживают гемопоэз. Основополагающими свойствами СКК являются способность к самоподцержанию, под которым понимают высокий пролиферативный потенциал, и к дифференцировкам в предшественники каждого из ростков клеток крови. Главным кроветворным органом млекопитающих является костный мозг (КМ), который обеспечивает специфическое микроокружение, необходимое для развития и поддержания пула стволовых клеток на протяжении жизни организма, а кроме этого регулирует процессы дифференцировки СКК. В норме гемопоэз поддерживается за счет взаимодействий между стволовыми клетками и стромой КМ (17,44,46). К строме КМ относят разные типы клеток: фибробласты, адипоциты, гладкомышечные клетки, остеобласты, хондроциты, эндотелиальные клетки, а также вырабатываемый ими внеклеточный матрикс. Все эти элементы формируют кроветворные «ниши» (131), регулирующие функциональное состояние СКК и препятствующие потере их высокого пролиферативного потенциала. В настоящее время очень актуальна возможность воздействия на кроветворные «ниши» или на молекулы сигнальных путей взаимодействия СКК с микроокружением для стимуляции их роста, т.к. задача получения большого количества полноценных СКК имеет важное значение для лечения больных, нуждающихся в пересадке таких клеток.

Не так давно было установлено, что основным структурным элементом ниши являются остеобласты, количество и активацию которых можно регулировать с помощью паратиреоидного гормона (ПТГ). В организме ПТГ регулирует обмен кальция и остеогенез. В зависимости от дозы и условий введения он может вызывать как увеличение массы кости (благодаря активации остеобластов), так и ее резорбцию (активируя остеокласты). Показано, что СКК локализуются на эндостальной поверхности губчатой кости (49,106) и контактируют с веретеновидными остеобластами. Недавние эксперименты показали, что после инъекций небольших количеств ПТГ, сопоставимых с используемыми для лечения остеопороза (43), число самых ранних полипотентных СКК увеличивалось в 2 раза, а мыши, восстановленные после летального облучения обработанным ПТГ костным мозгом, лучше выживали (15). Этот эффект связан с повышением экспрессии Jagged 1 - лиганда, локализованного на поверхности остеобластов, который взаимодействует с рецептором Notch 1, экспрессированным на поверхности СКК. Такое взаимодействие стимулирует пролиферацию СКК.

Таким образом, впервые был выявлен системный регулятор кроветворных ниш -паратиреоидный гормон. В связи с этим, появилась возможность: во-первых -воздействовать на ранние кроветворные клетки-предшественники, чего раньше не удавалось, во-вторых - воздействовать на ниши СКК, и в-третьих - изучать регуляторные механизмы задействованные в этих процессах. Полученные результаты могут быть использованы в экспериментальной гематологии и работах по экспансии стволовых кроветворных клеток in vivo.

2 Цель работы.

Изучение влияния паратиреоидного гормона на кроветворные клетки-предшественники из отделов поли- и олигопотентых стволовых кроветворных клеток, на мезенхимальные стволовые клетки, отвечающие за перенос кроветворного микроокружения и на их потомков, in vivo и в длительных культурах костного мозга (ДККМ) мыши и человека.

3 Основные задачи.

1. Оценить основные характеристики кроветворения in vivo и изменения происходящие in vitro, в ДККМ мыши и человека под воздействием паратиреоидного гормона.

2. Изучить влияние паратиреоидного гормона на мезенхимальные стволовые клетки и строму кроветворных органов.

3. Проанализировать возможные изменения экспрессии некоторых важных генов, ответственных за поддержание стволовых кроветворных клеток, маркеров дифференцировок, молекул адгезии и ростовых факторов в стромальных клетках после воздействия паратиреоидного гормона.

4 Научная новизна и практическое значение работы.

В данной работе in vivo впервые было функционально показано, что применение паратиреоидного гормона (ПТГ), приводит к увеличению количества ранних полипотентных стволовых кроветворных клеток (СКК) в 2-4 раза, однако не оказывает действия на более поздние мультипотентные стволовые кроветворные клетки. Длительное введение ПТГ снижает способность коротко репопулирующих СКК попадать в костный мозг после трансплантации, чем может объясняться отсутствие экспансии зрелых клеток крови. Аналогичное действие паратгормона наблюдалось в модельной системе кроветворения - длительной культуре костного мозга человека и мыши. Добавление ПТГ не влияет на продукцию зрелых клеток, однако число поздних олигопотентных предшественников увеличивается в 7 раз, а в культурах мышиного костного мозга количество более ранних полипотентных предшественников увеличивается в 9-10 раз.

Полученные в работе данные выявили, что ПТГ не влияет на мезенхимальные стволовые клетки, отвечающие за перенос кроветворного микроокружения, действуя только на стромальные остеобласты и длительно репопулирующие СКК, что говорит в пользу возможного практического использования ПТГ в качестве фармакологического метода воздействия на СКК и стромальные клетки. На основе поученных данных, в настоящее время, в лаборатории физиологии кроветворения ведется работа по изучению влияния паратиреоидного гормона на стволовые клетки, в модельной системе, доноров и больных гематопролиферативными заболеваниями. Результаты работы применяются для изучения повреждений стромального микроокружения у больных апластической анемией в ГУ ГНЦ РАМН.

5 Материалы и методы исследования.

Получение длительных культур костного мозга мыши и человека и функциональные тесты проводились стандартными методами культивирования.

Функциональное состояние клеток-предшественников оценивали методом конкурентной репопуляции и в различных клональных тестах, таких, как подсчет колониеобразующих единиц селезенки на 12 день (КОЕ-С 12)) в сублетально облученных мышах-реципиентах, подсчет колониеобразующих единиц культуры (КОЕ-К) в полужидкой среде, подсчет клеток, образующих области булыжника (КООБ), с использованием метода Пломахера. Интенсивность пролиферации клетокпредшественников оценивали по доле клеток, чувствительных к воздействию цитостатиков.

Изменения функционального состояния ниш для кроветворных клеток под действием ПТГ определяли с помощью фактора оседания через 24 часа (Ф-24).

Экспрессию интересующих генов определяли методом обратной транскрипции и последующей полимеразной цепной реакции, полуколичественную оценку продукта реакции проводили с помощью метода Саузерн-блот гибридизации.

6 Основные положения, выносимые на защиту.

1. Паратиреоидный гормон стимулирует пролиферацию и увеличение количества ранних стволовых кроветворных клеток к которым относятся наиболее примитивные стволовые клетки, способные длительно поддерживать кроветворение.

2. Введение паратиреоидного гормона не влияет на более зрелые мульти- и олигопотные клетки-предшественники.

3. Мезенхимальные стволовые клетки не чувствительны к воздействию паратиреоидного гормона.

4. Паратиреоидный гормон изменяет свойства компонентов стромального микроокружения, активирует остеобласты, регулирующие ранние СКК, и модулирует элементы васкулярной ниши, отвечающие за способность более поздних гемопоэтических предшественников находить свое место после трансплантации.

7 Содержание работы по главам.

Оглавление;

Основные обозначения и сокращения; Введение;

Заключение диссертации по теме «Гематология и переливание крови», Свинарева, Дарья Анатольевна

1 Выводы

1. Применение паратиреоидного гормона (ПТГ), вызывающего активацию и пролиферацию остеобластов, приводит к увеличению в 2-4 раза количества ранних стволовых кроветворных клеток (СКК), способных длительно поддерживать кроветворение.

2. После введения ПТГ в костном мозге животных концентрация более поздних поли- и олигопотентных клеток-предшественников (КООБ 7, КОЕс, КОЕ-К) не изменяется.

3. Добавление ПТГ в длительную культуру костного мозга человека и мыши не влияет на продукцию зрелых клеток, однако число поздних олигопотентных предшественников (КОЕ-К) увеличивается в 7 раз, а в культурах мышиного костного мозга количество более ранних мультипотентных предшественников (КООБ 28) увеличивается в 9-10 раз.

4. На обработанных паратиреоидным гормоном стромальных подслоях длительных культур костного мозга мыши и человека адгезия и выживание кроветворных клеток улучшается, что отражается в увеличении числа ранних мультипотентных предшественников (КООБ 28) в 2-2,5 раза. Вместе с тем, отмечается увеличение уровня экспрессии гена BMI-1, отвечающего за самоподдержание СКК.

5. Длительное введение ПТГ снижает способность коротко репопулирующих СКК попадать в костный мозг после трансплантации, чем объясняется отсутствие экспансии зрелых клеток крови.

6. ПТГ не влияет на мезенхимальные стволовые клетки, отвечающие за перенос кроветворного микроокружения, действуя только на их потомки - стромальные остеобласты.

Печатные работы

По теме диссертации опубликованы следующие печатные работы:

1. Свинарева Д.А., Нифонтова И.Н., Дризе Н.И., 2004. Влияние паратиреоидного гормона /ПТГ (1-34)/ на кроветворные и стромальные стволовые клетки. Бюлл. экспер. биол. мед., Том 138, №12, с. 645-648.

2. Свинарева Д.А., Нифонтова И.Н., Чертков И.Л., Дризе Н.И., 2005. Экспансия кроветворных клеток-предшественников ex vivo на подслое, обработанном паратиреоидным гормоном. Бюлл. экспер. биол. мед., Том 140, №9, с. 320-324.

3. Свинарева Д.А., Нифонтова И.Н., Чертков И.Л., Дризе Н.И., 2006. Изменение хоуминга кроветворных клеток-предшественников после длительного воздействия паратиреоидного гормона. Бюлл.экспер.биол.мед., Том. 142, №7, с. 97-101.

4. Свинарева Д.А., Нифонтова И.Н., Чертков И.Л., Дризе Н.И., 2005. Действие паратиреоидного гормона на кроверворные и стромальные стволовые клетки. Научные труды I Съезда Физиологов, Том 1, с. 215.jSvinareva D.A., Nifontova I.N., Drize N.J., 2004. РТН treatment induce alterations in murine Long-Term Bone Marrow Culture. The Hematology Journal, vol. 5, Suppl. 3, S68.

6. Svinareva D.A., Nifontova I.N., Drize N.J., 2004. Mesenchymal stem cells capable to transfer hematopoietic microenvironment did not change their behavior after PTH treatment. Experimental Hematology, Vol 32, N7, Suppl. 1, p. 89.

7. Nina Drize, Daria Svinareva, Irina Nifontova, Joseph Chertkov, 2004. Parathyroid Hormone (1-34) Treatment Induces Hematopoietic Precursor Cells Expansion in Murine Long-Term Bone Marrow Culture. Blood, Vol 104, N11, part 2, p. 127b.

8. Svinareva D.A., Nifontova I.N., Momotuk K.S., Savchenko V.G., Chertkov J.L., Drize N.J., 2005. Effect of PTH on hematopoiesis in human and murine Long-Term Bone Marrow Cultures. Hematologica/The Hematology Journal, Vol. 90: Suppl. 3, S2., p. 120. 9. Svinareva D.A., Nifontova I.N., Chertkov J.L., Drize N.I., 2005. Effect of parathyroid hormone on hematopoietic and stromal precursor cells. Experimental Hematology, Vol. 33, №7, Suppl. 1, p.121.

Svinareva D.A., Nifontova I.N., Chertkov J.L., Drize N.I., 2006. Effect of PTH (1-34) on homing of hematopoietic stem cells. Hematologica/The Hematology Journal, Vol. 91, Suppl. l,p. 309.

Заключение

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Свинарева, Дарья Анатольевна, 2006 год

1. Свинарева Д.А., Нифонтова И.Н., Чертков И.Л. and Дризе НИ. 2006. Изменение хоуминга кроветворных клеток-предшественников после длительного воздействия паратиреоидного гормона. Бюлл экспер биол мед 142: 97-101.

2. Чертков И.Л., Гуревич О.А. 1984. Стволовая кроветворная клетка и ее микроокружение. Москва: Медицина.

3. Adams, G. B. and D. T. Scadden. 2006. The hematopoietic stem cell in its place. Nat.Immunol. 7:333-337.

4. Akahane, К., T. Hosoi, A. Urabe, M. Kawakami, and F. Takaku. 1987. Effects of recombinant human tumor necrosis factor (rhTNF) on normal human and mouse hemopoietic progenitor cells. Int.J.Cell Cloning 5:16-26.

5. Arai, F., A. Hirao, M. Ohmura, H. Sato, S. Matsuoka, K. Takubo, K. Ito, G. Y. Koh, and T. Suda. 2004. Tie2/angiopoietin-l signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell 118:149-161.

6. Boskey, A. L. and A. S. Posner. 1984. Bone structure, composition, and mineralization. Orthop.Clin.North Am. 15:597-612.

7. Bradfute, S. В, T. A. Graubert, and M. A. Goodell. 2005. Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function. Exp.Hematol. 33:836-843.

8. Brown, A. J., M. Zhong, J. Finch, C. Ritter, and E. Slatopolsky. 1995. The roles of calcium and 1,25-dihydroxyvitamin D3 in the regulation of vitamin D receptor expression by rat parathyroid glands. Endocrinology 136:1419-1425.

9. Calvi, L. M. 2006. Osteoblastic activation in the hematopoietic stem cell niche. Ann.N.Y.Acad.Sci. 1068:477-488.

10. Chertkov J.L. and Gurevitch O.A. 1984. Стволовая кроветворная клетка и ее микроокружение. Медицина, Москва.

11. Chertkov, J. L., N. J. Drize, О. A. Gurevitch, and R. S. Samoylova. 1985. Origin of hemopoietic stromal progenitor cells in chimeras. Exp.Hematol. 13:1217-1222.

12. Chertkov, J. L., N. J. Drize, 0. A. Gurevitch, and G. A. Udalov. 1985. Self-renewal capacity and clonal succession of haemopoietic stem cells in long-term bone marrow culture. Cell Tissue Kinet. 18:483-491.

13. Chertkov, J. L. and 0. A. Gurevitch. 1980. Self-maintenance ability and kinetics of haemopoietic stroma precursors. Cell Tissue Kinet. 13:535-541.

14. Chomczynski, P. and N. Sacchi. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal.Biochem. 162:156-159.

15. Corral, D. A., M. Amling, M. Priemel, E. Loyer, S. Fuchs, P. Ducy, R. Baron, and G. Karsenty. 1998. Dissociation between bone resorption and bone formation in osteopenic transgenic mice. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 95:13835-13840.

16. Deguchi, К., H. Yagi, M. Inada, K. Yoshizaki, T. Kishimoto, and T. Komori. 1999. Excessive extramedullary hematopoiesis in Cbfal-deficient mice with a congenital lack of bone marrow. Biochem.Biophys.Res.Commun. 255:352-359.

17. Denning-Kendall, P., S. Singha, B. Bradley, and J. Hows. 2003. Cobblestone area-forming cells in human cord blood are heterogeneous and differ from long-term culture-initiating cells. Stem Cells 21:694-701.

18. Devine, S. M., C. Cobbs, M. Jennings, A. Bartholomew, and R. Hoffman. 2002. Mesenchymal stem cells distribute to a wide range of tissues following systemic infusion into non-human primates. Blood.

19. Dexter, Т. M., T. D. Allen, and L. G. Lajtha. 1977. Conditions controlling the proliferation of haemopoietic stem cells in vitro. J.Cell Physiol 91:335-344.

20. Dexter, Т. M., M. A. Moore, and A. P. Sheridan. 1977. Maintenance of hemopoietic stem cells aid production of differentiated progeny in allogeneic and semiallogeneic bone marrow chimeras in vitro. J.Exp.Med. 145:1612-1616.

21. Dick, J. E., M. C. Magli, D. Huszar, R. A. Phillips, and A. Bernstein. 1985. Introduction of a selectable gene into primitive stem cells capable of long-term reconstitution of the hemopoietic system of W/Wv mice. Cell 42:71-79.

22. Dobnig, H. and R. T. Turner. 1995. Evidence that intermittent treatment with parathyroid hormone increases bone formation in adult rats by activation of bone lining cells. Endocrinology 136:3632-3638.

23. Dobnig, H. and R. T. Turner. 1997. The effects of programmed administration of human parathyroid hormone fragment (1-34) on bone histomorphometry and serum chemistry in rats. Endocrinology 138:4607-4612.

24. Domen, J., S. H. Cheshier, and I. L. Weissman. 2000. The role of apoptosis in the regulation of hematopoietic stem cells: Overexpression of Bcl-2 increases both their number and repopulation potential. J.Exp.Med. 191:253-264.

25. Domen, J. and I. L. Weissman. 2000. Hematopoietic stem cells need two signals to prevent apoptosis; BCL-2 can provide one of these, Kitl/c-Kit signaling the other. J.Exp.Med. 192:1707-1718.

26. Drize, N. J., J. R. Keller, and J. L. Chertkov. 1996. Local clonal analysis of the hematopoietic system shows that multiple small short-living clones maintain life-long hematopoiesis in reconstituted mice. Blood 88:2927-2938.

27. Duncan, A. W., F. M. Rattis, L. N. DiMascio, K. L. Congdon, G. Pazianos, C. Zhao, K. Yoon, J. M. Cook, K. Willert, N. Gaiano, and T. Reya. 2005. Integration of Notch and Wnt signaling in hematopoietic stem cell maintenance. Nat.Immunol. 6:314-322.

28. Ejersted, C., T. T. Andreassen, M. H. Nilsson, and H. Oxlund. 1994. Human parathyroid hormone(l-34) increases bone formation and strength of cortical bone in aged rats. Eur.J.Endocrinol. 130:201-207.

29. El Badri, N. S., B. Y. Wang, Cherry, and R. A. Good. 1998. Osteoblasts, promote engraftment of allogeneic hematopoietic stem cells. Exp.Hematol. 26:110-116.

30. Finkelstein, J. S., A. Hayes, J. L. Hunzelman, J. J. Wyland, H. Lee, and R. M. Neer. 2003. The effects of parathyroid hormone, alendronate, or both in men with osteoporosis. N.Fngl.J.Med. 349:1216-1226.------------- ---------- -----------------

31. Friedenstein, A. 1989. Stromal-hematopoietic interrelationships: Maximov's ideas and modern models. Haematol.Blood Transfus. 32:159-167.

32. Friedenstein, A. and A. I. Kuralesova. 1971. Osteogenic precursor cells of bone marrow in radiation chimeras. Transplantation 12:99-108.

33. Friedenstein, A. J., N. V. Latzinik, Y. Gorskaya, E. A. Luria, and I. L. Moskvina. 1992. Bone marrow stromal colony formation requires stimulation by haemopoietic cells. Bone Miner. 18:199-213.

34. Gallien-Lartigue, 0. and D. Carrez. 1974. In vitro induction of the S phase in multipotent stem cells of bone marrow by parathyroid hormone., C.R.Acad.Sci.Hebd.Seances Acad.Sci.D. 278:1765-1768.

35. Giebel, В., Т. Zhang, J. Beckmann, J. Spanholtz, P. Wernet, A. D. Ho, and M. Punzel. 2006. Primitive human hematopoietic cells give rise to differentially specified daughter cells upon their initial cell division. Blood 107:2146-2152.

36. Gong, J. K. 1978. Endosteal marrow: a rich source of hematopoietic stem cells. Science 199:1443-1445.

37. Gothot, A., R. Pyatt, J. McMahel, S. Rice, and E. F. Srour. 1998. Assessment of proliferative and colony-forming capacity after successive in vitro divisions of single human CD34+ cells initially isolated in GO. Exp.Hematol. 26:562-570.

38. Gupta, P., T. R. Oegema, Jr., J. J. Brazil, A. Z. Dudek, A. Slungaard, and С. M. Verfaillie. 1998. Structurally specific heparan sulfates support primitive human hematopoiesis by formation of a multimolecular stem cell niche. Blood 92:4641-4651.

39. Hackney, J. A., P. Charbord, B. P. Brunk, C. J. Stoeckert, I. R. Lemischka, and K. A. Moore. 2002. A molecular profile of a hematopoietic stem cell niche. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.

40. Heinrich, G., H. M. Kronenberg, J. T. Potts, Jr., and J. F. Habener. 1984. Gene encoding parathyroid hormone. Nucleotide sequence of the rat gene and deduced amino acid-sequence of rat preproparathyroid hormonerJ.Biol.Chem.259:3"320-3329.

41. Hoare, S. R. and Т. B. Usdin. 2001. Molecular mechanisms of ligand recognition by parathyroid hormone 1 (PTH1) and PTH2 receptors. Curr.Pharm.Des 7:689-713.

42. Horst G., H. Farih-Sips, C. W. Lowik, and M. Karperien. 2005. Multiple mechanisms are involved in inhibition of osteoblast differentiation by PTHrP and PTH in KS483 Cells. J.Bone Miner.Res. 20:2233-2244.

43. Huang, S., P. Law, K. Francis, B. 0. Palsson, and A. D. Ho. 1999. Symmetry of initial cell divisions among primitive hematopoietic progenitors is independent of ontogenic age and regulatory molecules. Blood 94:2595-2604.

44. Ikebuchi, K., S. C. Clark, J. N. Ihle, L. M. Souza, and M. Ogawa. 1988. Granulocyte colony-stimulating factor enhances interleukin 3-dependent proliferation of multipotential hemopoietic progenitors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 85:3445-3449.

45. Ikebuchi, K, G. G. Wong, S. C. Clark, J. N. Ihle, Y. Hirai, and M. Ogawa. 1987. Interleukin 6 enhancement of interleukin 3-dependent proliferation of multipotential hemopoietic progenitors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 84:9035-9039.

46. Iwata, M., N. Awaya, L. Graf, C. Kahl, and B. Torok-Storb. 2004. Human marrow stromal cells activate monocytes to secrete osteopontin, which down-regulates Notchl gene expression in CD34+ cells. Blood 103:4496-4502.

47. Janeway, C. A., P. Travers, M. Walport, and M. Shlomnik. 2001. Immunology. Garland Publishing, New York, NY.

48. Jiang, Y., B. Vaessen, T. Lenvik, M. Blackstad, M. Reyes, and C. Verfaillie. 2002. Multipotent progenitor cells can be isolated from postnatal murine bone marrow, muscle, and brain. Exp.Hematol. 30:896.

49. Juppner, H. 1999. Receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related peptide: exploration of their biological importance. Bone 25:87-90.

50. Karanu, F. N., B. Murdoch, L. Gallacher, D. M. Wu, M. Koremoto, S. Sakano, and M. Bhatia. 2000. The notch ligand jagged-1 represents a novel growth factor of human hematopoietic stem cells. J.Exp.Med. 192:1365-1372.

51. Kiel, M. J., О. H. Yilmaz, T. Iwashita, О. H. Yilmaz, C. Terhorst, and S. J. Morrison. 2005. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell 121:1109-1121.

52. Klarmann, К., M. Ortiz, M. Davies, and J. R. Keller. 2003. Identification of in vitro growth conditions for c-Kit-negative hematopoietic stem cells. Blood 102:3120-3128.

53. Kobari, L., A. Dubart, F. Le Pesteur, W. Vainchenker, and F. Sainteny. 1995. Hematopoietic-promoting activity of the murine stromal cell line MS-5 is not related to the expression of the major hematopoietic cytokines. J.Cell Physiol 163:295-304.

54. Kondo, M., I. L. Weissman, and K. Akashi. 1997. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell 91:661-672.

55. Kopp, H. G., S. T. Avecilla, A. T. Hooper, and S. Rafii. 2005. The bone marrow vascular niche: home of HSC differentiation and mobilization. Physiology.(Bethesda.) 20:349356.

56. Koury, M. J. 1992. Programmed cell death (apoptosis) in hematopoiesis. Exp.Hematol. 20:391-394.

57. Kulkarni, N. H., D. L. Halladay, R. R. Miles, L. M. Gilbert, C. A. Frolik, R. J. Galvin, T. J. Martin, M. T. Gillespie, and J. E. Onyia. 2005. Effects of parathyroid hormone on Wnt signaling pathway in bone. J.Cell Biochem. 95:1178-1190.

58. Lajtha, L. G. 1979. Stem cell concepts. Nouv.Rev.Fr.Hematol. 21:59-65.

59. Lane, N. E., S. Sanchez, G. W. Modin, H. K. Genant, E. Pierini, and C. D. Arnaud. 1998. Parathyroid hormone treatment can reverse corticosteroid-induced osteoporosis. Results of a randomized controlled clinical trial. J.Clin.Invest 102:1627-1633.

60. Lapidot, Т., A. Dar, and O. Kollet. 2005. How do stem cells find their way home? Blood 106:1901-1910.

61. Lapidot, T. and I. Petit. 2002. Current understanding of stem cell mobilization: the roles of chemokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines, and stromal cells. Exp.Hematol. 30:973-981.

62. Li, W., S. A. Johnson, W. C. Shelley, and M. C. Yoder. 2004. Hematopoietic stem cell repopulating ability can be maintained in vitro by some primary endothelial cells.--Hxp.Hematol. 32:1226-1237.------------------------------------------

63. Liesveld, J. L„ J. M. Winslow, К. E. Frediani, D. H. Ryan, and C. N. Abboud. 1993. Expression of integrins and examination of their adhesive function in normal and leukemic hematopoietic cells. Blood 81:112-121.

64. Lord, В. I., N. G. Testa, and J. H. Hendry. 1975. The relative spatial distributions of CFUs and CFUc in the normal mouse femur. Blood 46:65-72.

65. Luria, E. A., A. F. Panasyuk, and A. Y. Friedenstein. 1971. Fibroblast colony formation from monolayer cultures of blood cells. Transfusion 11:345-349.

66. Ma, Q., D. Jones, P. R. Borghesani, R. A. Segal, T. Nagasawa, T. Kishimoto, R. T. Bronson, and T. A. Springer. 1998. Impaired B-lymphopoiesis, myelopoiesis, and derailed cerebellar neuron migration in C. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 95:9448-9453.

67. Mamus, S. W., M. M. Oken, and E. D. Zanjani. 1986. Suppression of normal human erythropoiesis by human recombinant DNA- produced alpha-2-interferon in vitro. Exp.Hematol. 14:1015-1022.

68. Maniatis, Т., E. F. Fritsch, and J. Sambrook. 1982. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory.

69. Mayer, H., E. Breyel, C. Bostock, and J. Schmidtke. 1983. Assignment of the human parathyroid hormone gene to chromosome 11. Hum.Genet. 64:283-285.

70. Mayer, P. 1983. The growth of swine bone marrow cells in the presence of heterologous colony stimulating factor: characterization of the developing cell population. Comp Immunol.Microbiol.Infect.Dis. 6:171-187.

71. McDonald, T. P. and P. S. Sullivan. 1993. Megakaryocyte and erythrocytic cell lines share a common precursor cell. Exp.Hematol. 21:1316-1320.

72. Meghji, S. 1992. Bone remodelling. Br.Dent.J. 172:235-242.

73. Metcalf, D., G. R. Johnson, and A. W. Burgess. 1980. Direct stimulation by purified GM-CSF of the proliferation of multipotential and erythroid precursor cells. Blood 55:138147.

74. Metcalf, D. and M. A. S. Moore. 1971. Hematopoietic cells. North-Holland Publishing Company, Amsterdam-London.

75. Miller, C. L. and C. J. Eaves. 1997. Expansion in vitro of adult murine hematopoietic stem cells with transplantable lympho-myeloid reconstituting ability. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 94:13648-13653.

76. Miyamoto, Т., H. Iwasaki, В. Reizis, М. Ye, Т. Graf, I. L. Weissman, and K. Akashi. 2002. Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment. Dev.Cell 3:137-147.

77. Moore, К. A., H. Ema, and I. R. Lemischka. 1997. In vitro maintenance of highly purified, transplantable hematopoietic stem cells. Blood 89:4337-4347.

78. Moore, K. A. and I. R. Lemischka. 2006. Stem cells and their niches. Science 311:18801885.

79. Musashi, M., Y. C. Yang, S. R. Paul, S. C. Clark, T. Sudo, and M. Ogawa. 1991. Direct and synergistic effects of interleukin 11 on murine hemopoiesis in culture. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 88:765-769.

80. Nagata, S. and P. Golstein. 1995. The Fas death factor. Science 267:1449-1456.

81. Nilsson, S. К., H. M. Johnston, and J. A. Coverdale. 2001. Spatial localization of transplanted hemopoietic stem cells: inferences for the localization of stem cell niches. Blood 97:2293-2299.

82. Nilsson, S. K., P. J. Simmons, and I. Bertoncello. 2006. Hemopoietic stem cell engraftment. Exp.Hematol. 34:123-129.

83. Ogawa, M. 1993. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood 81:2844-2853.

84. Ohta, M., J. S. Greenberger, P. Anklesaria, A. Bassols, and J. Massague. 1987. Two forms of transforming growth factor-beta distinguished by multipotential haematopoietic progenitor cells. Nature 329:539-541.

85. Partridge, N. C., S. R. Bloch, and A. T. Pearman. 1994. Signal transduction pathways mediating parathyroid hormone regulation of osteoblastic gene expression. J.Cell---Biochcm. 55:321-327. ------------------------------

86. Perris, A. D. and J. F. WHITFIELD. 1967. Calcium and the control of mitosis in the mammal. Nature 216:1350-1351.

87. Peschel, C, W. E. Paul, J. Ohara, and I. Green. 1987. Effects of В cell stimulatory factor-1/interleukin 4 on hematopoietic progenitor cells. Blood 70:254-263.

88. Peters, R., S. Leyvraz, and L. Perey. 1998. Apoptotic regulation in primitive hematopoietic precursors. Blood 92:2041-2052.

89. Pittenger, M. F., A. M. Mackay, S. C. Beck, R. K. Jaiswal, R. Douglas, J. D. Mosca, M. A. Moorman, D. W. Simonetti, S. Craig, and D. R. Marshak. 1999. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284:143-147.

90. Ploemacher, R. E., J. P. van der Sluijs, J. S. Voerman, and N. H. Brons. 1989. An in vitro limiting-dilution assay of long-term repopulating hematopoietic stem cells in the mouse. Blood 74:2755-2763.

91. Prosper, F., D. Stroncek, J. B. McCarthy, and С. M. Verfaillie. 1998. Mobilization and homing of peripheral blood progenitors is related to reversible downregulation of alpha4 betal integrin expression and function. J.Clin.Invest 101:2456-2467.

92. Raefsky, E. L., L. C. Platanias, N. C. Zoumbos, and N. S. Young. 1985. Studies of interferon as a regulator of hematopoietic cell proliferation. J.Immunol. 135:2507-2512.

93. Reya, Т., A. W. Duncan, L. Ailles, J. Domen, D. C. Scherer, K. Willert, L. Hintz, R. Nusse, and I. L. Weissman. 2003. A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature 423:409-414.

94. Reyes, M., A. Dudek, B. Jahagirdar, L. Koodie, P. H. Marker, and С. M. Verfaillie. 2002. Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow. J.Clin.Invest 109:337-346.

95. Reyes, M., T. Lund, T. Lenvik, D. Aguiar, L. Koodie, and С. M. Verfaillie. 2001. Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow-mesodermal-progenitor cells. Blood 98:2615-2625.

96. RIXON, R. H. and J. F. WHITFIELD. 1961. The radioprotective action of parathyroid extract. Int.J.Radiat.Biol. 3:361-367.

97. Rixon, R. H. and J. F. Whitfield. 1972. Hypoplasia of the bone marrow in rats following removal of the parathyroid glands. J.Cell Physiol 79:343-352.

98. RIXON, R. H., J. F. WHITFIELD, and T. YOUDALE. 1958. Increased survival of rats irradiated with x-rays and treated with parathyroid extract. Nature 182:1374.

99. Rodan, G. A. and T. J. Martin. 2000. Therapeutic approaches to bone diseases. Science 289:1508-1514.

100. Sauvageau, G., N. N. Iscove, and R. K. Humphries. 2004. In vitro and in vivo expansion of hematopoietic stem cells. Oncogene 23:7223-7232.

101. Schiller, P. C., G. D'Ippolito, B. A. Roos, and G. A. Howard. 1999. Anabolic or catabolic responses of MC3T3-E1 osteoblastic cells to parathyroid hormone depend on time and duration of treatment. J.Bone Miner.Res. 14:1504-1512.

102. Schofield, R. 1978. The relationship between the spleen colony-forming cell and the haemopoietic stem cell. Blood Cells 4:7-25.

103. Scott, D. M., I. E. Ehrmann, P. S. Ellis, P. R. Chandler, and E. Simpson. 1997. Why do some females reject males? The molecular basis for male-specific graft rejection. J.Mol.Med. 75:103-114.

104. Selye H. 1932. On the stimulation of new bone formation with parathyroid extract and irradiated ergosterol. Endocrinology 16:547-558.

105. Silver, J. and T. Naveh-Many. 1994. Regulation of parathyroid hormone synthesis and secretion. Semin.Nephrol. 14:175-194.

106. Silver, J., C. Yalcindag, A. Sela-Brown, R. Kilav, and T. Naveh-Many. 1999. Regulation of the parathyroid hormone gene by vitamin D, calcium and phosphate. Kidney Int.Suppl 73:S2-S7.

107. Siminovitch, L., E. A. McCulloch, and J. E. Till. 1963. THE DISTRIBUTION OF COLONY-FORMING CELLS AMONG SPLEEN COLONIES. J.Cell Physiol 62:327336.

108. Sone, Т., M. Fukunaga, S. Ono, and T. Nishiyama. 1995. A small dose of human parathyroid hormone(l-34) increased bone mass in the lumbar vertebrae in patients with senile osteoporosis. Miner.Electrolyte Metab 21:232-235.

109. Suda, T, J. Suda, M. Ogawa, and J. N. Ihle. 1985. Permissive role of interleukin 3 (IL-3) in proliferation and differentiation of multipotential hemopoietic progenitors in culture. J.Cell Physiol 124:182-190.

110. Swarthout, J. Т., R. C. D'Alonzo, N. Selvamurugan, and N. C. Partridge. 2002. Parathyroid hormone-dependent signaling pathways regulating genes in bone cells. Gene 282:1-17.

111. Szilvassy, S. J., R. K. Humphries, P. M. Lansdorp, A. C. Eaves, and C. J. Eaves. 1990. Quantitative assay for totipotent reconstituting hematopoietic stem cells by a competitive repopulation strategy. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 87:8736-8740.

112. Takano, H., H. Ema, K. Sudo, and H. Nakauchi. 2004. Asymmetric division and lineage commitment at the level of hematopoietic stem cells: inference from differentiation in daughter cell and granddaughter cell pairs. J.Exp.Med. 199:295-302.

113. Teitelbaum, S. L. 2004. Postmenopausal osteoporosis, T cells, and immune dysfunction. Proc.Natl. Acad. Sci.U. S .A 101:16711-16712.

114. Till, J. E. and E. A. McCulloch. 1961. A direct measurement of radiation sencitivity of normal mouse bone marrow. Radiation Research 14:213-221.

115. Tobimatsu, Т., H. Kaji, H. Sowa, J. Naito, L. Canaff, G. N. Hendy, T. Sugimoto, and K. Chihara. 2006. Parathyroid hormone increases beta-catenin levels through Smad3 in mouse osteoblastic cells. Endocrinology 147:2583-2590.

116. Trentin, J. J. 1976. Hemopoietic inductive microenvironment, p. 255-264. Stem cells of renewing cell populations. New York.

117. Tsuji, К., К. M. Zsebo, and M. Ogawa. 1991. Enhancement of murine blast cell colony formation in culture by recombinant rat stem cell factor, ligand for c-kit. Blood 78:12231229.

118. Uher, F., M. Hajdu, and V. Vas. 2003. Self-renewal and differentiation of hematopoietic stem cells: a molecular approach (a review). Acta Microbiol.Immunol.Hung. 50:3-21.

119. Verfaillie, С. M. 1998. Adhesion receptors as regulators of the hematopoietic process. Blood 92:2609-2612.

120. Visnjic, D., Z. Kalajzic, D. W. Rowe, V. Katavic, J. Lorenzo, and H. L. Aguila. 2004. Hematopoiesis is severely altered in mice with an induced osteoblast deficiency. Blood 103:3258-3264.

121. Wagers, A. J. 2005. Stem cell grand SLAM. Cell 121:967-970.

122. Weber, J. M., S. R. Forsythe, C. A. Christianson, B. J. Frisch, B. J. Gigliotti, С. T. Jordan, L. A. Milner, M. L. Guzman, and L. M. Calvi. 2006. Parathyroid hormone stimulates expression of the Notch ligand Jagged 1 in osteoblastic cells. Bone.

123. Welte, К., E. Platzer, L. Lu, J. L. Gabrilove, E. Levi, R. Mertelsmann, and M. A. Moore. 1985. Purification and biochemical characterization of human pluripotent hematopoietic colony-stimulating factor. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 82:1526-1530.

124. WHITFIELD, J. F. 2006. Parathyroid hormone: A novel tool for treating bone marrow depletion in cancer patients caused by chemotherapeutic drugs and ionizing radiation. Cancer Lett.

125. Wickremasinghe, R. G. and A. V. Hoffbrand. 1999. Biochemical and genetic control of apoptosis: relevance to normal hematopoiesis and hematological malignancies. Blood 93:3587-3600.

126. Wright, D. E., A. J. Wagers, A. P. Gulati, F. L. Johnson, and I. L. Weissman. 2001. Physiological migration of hematopoietic stem and progenitor cells. Science 294:19331936.

127. Yamashita, Y. M., D. L. Jones, and M. T. Fuller. 2003. Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science 301:1547-1550.

128. Yarbro, J. W. 1992. Mechanism of action of hydroxyurea. Semin.Oncol. 19:1-10.

129. Yin, T. and L. Li. 2006. The stem cell niches in bone. J.Clin.Invest 116:1195-1201.

130. Zhu, J. and S. G. Emerson. 2004. A new bone to pick: osteoblasts and the haematopoietic stem-cell niche. Bioessays 26:595-599.