Характеристика in vitro стромального микроокружения костного мозга больных апластической анемией тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.29, кандидат биологических наук Петрова, Татьяна Владимировна

• Петрова, Татьяна Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Петрова, Татьяна Владимировна

Оглавление.

Основные использованные обозначения и сокращения.

Введение.

1.1 Актуальность проблемы.

1.2 Цель работы.

1.3 Основные задачи.

1.4 Научная новизна и практическое значение работы.

1.5 Материалы и методы исследования.

1.6 Основные положения, выносимые на защиту.

1.7 Содержание работы по

главам.

1.8 Благодарности.

Глава 1. Обзор Литературы.

1.1 Стволовая кроветворная клетка.

1.2 Стволовая мезенхимная клетка.

1.3 Ниша стволовых кроветворных клеток.

1.4 Сигнальные пути кроветворной ниши, участвующие в регуляции СКК. , СшЬ. Ы -33 оеллшсytyutf

1.5 Апластическая анемия.f.<!.:./.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1 Получение клеток костного мозга здоровых доноров и больных апластической анемией.

2.1.1 Подсчет клеток.

2.1.2 Получение мезенхимных стромальных клеток человека.

2.2 Дифференцировка МСК человека.

2.2.1 Жировая дифференцировка МСК человека.

2.2.2 Костная дифференцировка МСК.

2.4 Культивирование колониеобразующих единиц фибробластов человека.

2.5 Получение длительных культур костного мозга человека декстеровского типа.

2.6 Получение сыворотки от больных апластической анемией.

2.7 Выделение РНК из анализируемых клеток.

2.7.1 Выделение РНК.

2.8 Определение количества и чистоты полученной РНК.

2.8.1 Построение первых цепей ДНК на РНК.

2.8.2 Метод полимеразной цепной реакции.

2.9 Методы оценки экспрессии генов.

2.9.1 Оценка экспрессии генов с помощью программы GelPro.

2.9.2 Оценка экспрессии генов при помощи метода - модификации Саузерн-блот-гибридизации.

2.9.2.1 Перенос ПЦР фрагментов на нейлоновые фильтры.

2.9.2.2 Создание гибридизационных зондов.

2.9.2.3 Гибридизация.

2.9.2.4 Анализ фильтров с помощью прибора Фосфоимаджер.

2.9.2.5 Оценка результатов, полученных на приборе Фосфоимаджер.

2.10 ПЦР в реальном времени Taqman.

2.11 Статистическая обработка данных.

Глава 3. Результаты.

3.1 Сравнительная характеристика мезенхимных стромальных клеток, полученных из костного мозга доноров и больных апластической анемией.

3.1.1 Рост МСК в культуре.

3.1.2 Дифференцировка МСК в культуре.

3.1.2.1 Жировая дифференцировка МСК.

3.1.2.2 Костная дифференцировка МСК.

3.2 Сравнительная характеристика потомков МСК - колониеобразующих единиц фибробластов, полученных из костного мозга больных АА и доноров.

3.3 Изменение экспрессии генов в ДККМ больных АА и доноров.

3.4 Влияние сыворотки больных на экспрессию генов в подслоях доноров.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Характеристика in vitro стромального микроокружения костного мозга больных апластической анемией»

1.1 Актуальность проблемы.

Приобретенная апластическая анемия (АА) - это заболевание системы крови, характеризующееся значительным уменьшением количества кроветворных предшественников, сопровождающееся замещением функционально активного красного костного мозга (КМ) инертной жировой тканью и панцитопенией (уменьшением количества клеток всех ростков кроветворения периферической крови). Существует несколько гипотез о причинах данного заболевания, однако патогенез до сих пор остается неясным. На основании результатов некоторых экспериментов, а также достаточно успешного применения иммуносупрессивной терапии (ИСТ) на данный момент считается, что существенную роль в патогенезе апластической анемии играет неправильное функционирование иммунной системы (168, 161). С другой стороны отсутствие ответа на стандартное лечение у 30% больных и провалившиеся попытки найти аутоантигены, вызывающие неадекватный иммунный ответ привели к поиску альтернативных гипотез, способных объяснить механизм возникновения данного заболевания.

Известно, что стволовые кроветворные клетки (СКК) функционируют в тесном контакте с кроветворным микроокружением. Важным компонентом кроветворного микроокружения, регулирующего СКК, являются веретеновидные остеобласты, формирующие вместе с другими клетками функциональную нишу для покоящихся СКК (17). Регуляция самоподдержания СКК в этой нише происходит, в том числе, за счет взаимодействия молекул TIE-2, находящихся на их поверхности, и ANG-1, соответственно, экспрессированных на остеобластах (9). Ниша для пролиферирующих СКК располагается в синусах костного мозга и связана с эндотелиальными клетками, экспрессирующими различные факторы роста. Одним из важнейших является фактор роста и регуляции клеток эндотелия VEGF (70). Адгезия СКК к нишам является принципиальной для их самоподдержания, и молекулы адгезии, в том числе VCAM-1 играют здесь значимую роль (38).

Нарушение взаимодействия стволовой кроветворной клетки со своим микроокружением может приводить к патологическим изменениям пролиферации и дифференцировки СКК. Так, анализ мезенхимных стромальных клеток (МСК) - одного из клеточных типов, составляющих кроветворное микроокружение, у больных с различными заболеваниями крови, в том числе с миелодиспластическим синдромом (МДС) показал их функциональную несостоятельность (93). В работе других авторов было показано, что концентрация фибробластов - потомков МСК в КМ была изменена у больных лейкозом по сравнению со здоровыми донорами (100).

Было выдвинуто предположение, что у больных апластической анемией могут иметь место аналогичные нарушения в морфо-функциональных характеристиках МСК и их потомков. Однако данные о способности стромального микроокружения костного мозга больных апластической анемией поддерживать кроветворные клетки оказались противоречивыми. В исследованиях 2-х групп ученых было продемонстрировано, что в отличие от длительных культур костного мозга доноров на стромальных подслоях больных АА кроветворение практически отсутствует (91, 122). В то же время Новицкий и соавторы не выявили различий в способности поддерживать кроветворение стромальными подслоями больных АА и здоровых доноров (104).

Таким образом, на данный момент наблюдается недостаток в информации о роли стромального микроокружения в патогенезе апластической анемии. Исследование кроветворного микроокружения больных АА, а также изучение возможного изменения экспрессии важных для самоподцержания СКК белков (ANG-1, VEGF, VCAM-1) является необходимым для более глубокого понимания патогенеза заболевания, а также для понимания функционирования СКК и ее взаимодействия со стромальным микроокружением костного мозга.

1.2 Цель работы.

Охарактеризовать in vitro стромальное микроокружение костного мозга больных апластической анемией.

1.3 Основные задачи.

1. Сравнить способность мезенхимных стромальных клеток к росту и дифференцировкам больных апластической анемией и доноров.

2. Охарактеризовать способность к росту потомков мезенхимных стромальных клеток - колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕ-Ф) больных апластической анемией и доноров.

3. Проанализировать возможные изменения экспрессии генов, ответственных за поддержание стволовых кроветворных клеток (ANG-1), молекул адгезии (VCAM-1) и ростовых факторов (VEGF) в длительных культурах костного мозга (ДККМ) больных апластической анемией и доноров.

Заключение диссертации по теме «Гематология и переливание крови», Петрова, Татьяна Владимировна

Выводы

1. У больных апластической анемией выявлены изменения в клетках, находящихся на разном уровне иерархии мезенхимных стволовых клеток: 1) на уровне мезенхимных стромальных клеток (МСК); 2) их потомков полипотентных клеток образующих колонии фибробластов (КОЕ-Ф); и 3) функционирования зрелых клеток стромы костного мозга.

2. Мезенхимные стромальные клетки (МСК) больных апластической анемией на начальном этапе болезни способны к более длительному пассированию и накоплению большей клеточной продукции в культуре, чем МСК доноров.

3. На этапе длительной иммуносупрессивной терапии в МСК больных апластической анемией после индукции жировой дифференцировки происходят аномальные морфологические изменения и снижение экспрессии гена PPARgamma в 2,8 раза по сравнению с донорами; после индукции костной дифференцировки в МСК больных в 4 раза слабее экспрессируется ген PTHR по сравнению с донорами.

4. Концентрация колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕ-Ф) в костном мозге больных апластической анемией на первом этапе болезни достоверно повышена по сравнению с донорами, при этом КОЕ-Ф образуют колонии в 2,2 раза большего размера.

5. У большинства больных апластической анемией в ремиссии происходит нормализация концентрации КОЕ-Ф и размера образуемых ими колоний.

6. После длительной иммуносупрессивной терапии у больных увеличивается экспрессия генов ANG-1 и VCAM-1 в 3 раза по сравнению с донорами, что свидетельствует об активации стромального микроокружения.

Печатные работы

По теме диссертации опубликованы следующие печатные работы:

1. Петрова Т.В., Свипарева Д.А., Нифонтова И.Н., Момотюк К.С., Савченко В.Г., Дризе Н.И., 2006. Стромальная регуляция стволовых кроветворных клеток в длительных культурах костного мозга человека под действием паратиреоидного гормона. Клеточные технологии в биологии и медицине, №4, с.218-223.

2. Петрова Т.В. Нифонтова И.Н., Свинарева Д.А., Виноградова М.А., Михайлова Е.А., Дризе Н.И., 2008. Нарушение экспрессии генов, регулирующих гомеостаз стволовых кроветворных клеток, в стромальных клетках больных апластической анемией. Терапевтический архив, Том 80, №1, с. 61-65.

3. Герасимова Л.П., Дризе Н.И., Лубкова О.Н., Манакова Т.Е., Нифонтова И.Н., Петрова Т.В. Свипарева Д.А., Момотюк К.С., Михайлова Е.А., Ольшанская Ю.В., Соколова М.А., Туркина А.Г., Цветаева Н.В., 2008. Нарушения стромального микроокружения у больных с различными заболеваниями системы крови. Гематология и трансфузиология, Том 53, №5, с. 59-62.

4. Shipounova I.N, Petrova T.V., Svinareva D.A., Momotuk K.S., Mikhailova E.A., Drize N.J., 2009. Alterations in Hematopoietic Microenvironment in Patients with Aplastic Anemia. Clinical and Translational Science, Vol. 2, issue 1, p. 67-74.

5. Petrova T.V. Svinareva D.A., Nifontova I.N.,Vinogradova M.A., Michaylova E.A., Drize N.J., 2006. Alterations of gene expression in PTH(l-34) treated long-term bone marrow cultures from patients with aplastic anemia Hematologica/The hematology journal, Vol. 91(sl), p. 393.

6. Petrova Т. V. Nifontova I.N. Svinareva D. A., Vinogradova M. A., Michaylova E. A., Drize N. J., 2006. Improvement of Hematopoietic and Stromal Cells Interaction after PTH Treatment of Long-Term Bone Marrow Cultures from Patients with Aplastic Anemia. Blood, Vol. 108, №11, part 1, p. 407a.

7. Петрова T.B. Нифонтова И.Н., Свинарева Д.А., Виноградова М.А., Михайлова Е.А., Дризе Н.И., 2007. Изменение экспрессии генов, регулирующих взаимодействие стволовых кроветворных клеток со стромальными элементами, остеобластной и сосудистой ниш у больных апластической анемией. Вестник гематологии, Том 3, №2, с. 59-60.

8. Petrova T.V. Svinareva D.A., Nifontova I.N.,Vinogradova M.A., Michaylova E.A., Drize N.J., 2007. Alterations in osteoblastic and vascular niches revealed in adherent cell layers of long-term bone marrow cultures from patients with aplastic anemia Hematologica/The hematology journal, Vol. 92, Suppl.l, p. 27.

9. Petrova T.V., Svinareva D.A., Nifontova I.N., Vinogradova M.A., Michaylova E.A., Drize N.J., 2007. Neutralization of supressive effect of blood serum from aplastic anemia patients on donor stromal cells by PTH treatment. Experimental Hematology, Vol. 35, №9, Suppl.2, p. 114.

10. Petrova T.V. Nifontova I.N., Mikhaylova E.A. Drize N.J., 2008. Alterations of mesenchymal stromal cells in patients with aplastic anemia. Haematologica, Vol. 93(s), p. 21.

11. Petrova Т.V.,Nifontova I.N., Michaylova E.A., Drize N.J., 2008. Alterations of mesenchymal stromal cells in patients with aplastic anemia. Modern Trends in Human Leukemia XVII. p. 158

12. И. Н.Шипунова, Т.В.Петрова. Д.А. Свинарева, Н.В. Сац, Н.И. Дризе, 2009 Пролиферативный потенциал человеческих мезенхимных стромальных клеток (МСК) доноров и больных апластической анемией. Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования, факультет фундаментальной медицины МГУ им. М.В.Ломоносова, Москва 2009, стр. 63

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Петрова, Татьяна Владимировна, 2009 год

1. Михайлова Е.А. (2002). Апластическая анемия. Руководство по гематологии (Москва: Ныодиамед). 302-311.

2. Михайлова Е.А., Савченко В.Г., Устинова Е.Н. (2001). Эффективность циклоспорина А в лечении взрослых больных апластической анемией. Терапевтический архив 73, 56-61.

3. Михайлова Е.А, Савченко В.Г., Устинова Е.Н., Виноградова М.А., Кохно А.В., Карагулян С.Р., Данишян К.И., Гржимоловский А.В., Захаров Г.Н. (2006). Спленэктомия в программной терапии апластической анемии. Терапевтический архив 78, 52-57.

4. Чертков И.Л., Гуревич О.А. (1984). Стволовая кроветворная клетка и ее микроокружение. (Москва: Медицина).

5. Чертков И.Л., Дризе Н.И., Воробьев А.И., Бриллиант М.Д. (2002). Кроветворение. Руководство по гематологии (Москва: Ньюдиамед). 28-43.

6. Шипунова И.Н., Свинарева Д.А., Дризе Н.И. (2008). Стромальные клоногенные предшественники кроветворного микроокружения и их место в иерархии мезенхимных стволовых клеток. Клеточные технологии в биологии и медицине.

7. Adams, G. В., Martin, R. P., Alley, I. R., Chabner, К. Т., Cohen, К. S., Calvi, L. М., Kronenberg, Н. М., and Scadden, D. Т. (2007). Therapeutic targeting of a stem cell niche. Nat.Biotechnol. 25, 238-243.

8. Arai, F., Hirao, A., Ohmura, M., Sato, H., Matsuoka, S., Takubo, K., Ito, K., Koh, G. Y., and Suda, T. (2004). Tie2/angiopoietin-l signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell 118, 149-161.

9. Betschinger, J. and Knoblich, J. A. (2004). Dare to be different: asymmetric cell division in Drosophila, C. elegans and vertebrates. Curr.Biol. 14, R674-R685.

10. Calado, R. Т., Pintao, M. C., Silva, W. A., Jr., Falcao, R. P., and Zago, M. A. (2002). Aplastic anaemia and telomerase RNA mutations. Lancet 360, 160817. Calvi, L. M., Adams, G. В., Weibrecht, K. W., Weber, J. M., Olson, D. P., Knight, M.

11. C., Martin, R. P., Schipani, E., Divieti, P., Bringhurst, F. R., Milner, L. A., Kronenberg, H. M., and Scadden, D. T. (2003). Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature 425, 841-846.

12. Caplan, A. I. (1991). Mesenchymal stem cells. J.Orthop.Res. 9, 641-650.

13. Clausen, N., Kreuger, A., Salmi, Т., Storm-Mathisen, I., and Johannesson, G. (1996). Severe aplastic anaemia in the Nordic countries: a population based study of incidence, presentation, course, and outcome. Arch.Dis.Child 74, 319-322.

14. Corcione, A., Benvenuto, F., Ferretti, E., Giunti, D., Cappiello, V., Cazzanti, F., Risso, M., Gualandi, F., Mancardi, G. L., Pistoia, V., and Uccelli, A. (2006). Human mesenchymal stem cells modulate B-cell functions. Blood 107, 367-372.

15. Corral, D. A., Amling, M., Priemel, M., Loyer, E., Fuchs, S., Ducy, P., Baron, R., and Karsenty, G. (1998). Dissociation between bone resorption and bone formation in osteopenic transgenic mice. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 95, 13835-13840.

16. Deguchi, K., Yagi, H., Inada, M., Yoshizaki, K., Kishimoto, Т., and Komori, T. (1999). Excessive extramedullar hematopoiesis in Cbfal-deficient mice with a congenital lack of bone marrow. Biochem.Biophys.Res.Commun. 255, 352-359.

17. Di Nicola, M., Carlo-Stella, C., Magni, M., Milanesi, M., Longoni, P. D., Matteucci, P., Grisanti, S., and Gianni, A. M. (2002). Human bone marrow stromal cells suppress T

18. DiMascio, L., Vocrmans, C., Uqoezwa, M., Duncan, A., Lu, D., Wu, J., Sankar, U., and Reya, T. (2007). Identification of adiponectin as a novel hemopoietic stem cell growth factor. J.Immunol. 178, 3511-3520.

19. Drize, N. J., Keller, J. R., and Chertkov, J. L. (1996). Local clonal analysis of the hematopoietic system shows that multiple small short-living clones maintain life-long hematopoiesis in reconstituted mice. Blood 88, 2927-2938.

20. Dubey, S., Shukla, P., and Nityanand, S. (2005). Expression of interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha in bone marrow T cells and their levels in bone marrow plasma in patients with aplastic anemia. Ann.Hematol. 84, 572-577.

21. Faloon, P., Arentson, E., Kazarov, A., Deng, С. X., Porcher, C., Orkin, S., and Choi, K. (2000). Basic fibroblast growth factor positively regulates hematopoietic development. Development 127, 1931-1941.

22. Friedenstein, A. and Kuralesova, A. I. (1971). Osteogenic precursor cells of bone marrow in radiation chimeras. Transplantation 12, 99-108.

23. Geiger, H., Rennebeck, G., and Van Zant, G. (2005). Regulation of hematopoietic stem cell aging in vivo by a distinct genetic element. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 102, 5102-5107.

24. Gerber, H. P., Malik, A. K., Solar, G. P., Sherman, D., Liang, X. H., Meng, G., Hong, K., Marsters, J. C., and Ferrara, N. (2002). VEGF regulates haematopoietic stem cell survival by an internal autocrine loop mechanism. Nature 417, 954-958.

25. Giebel, В., Zhang, Т., Beckmann, J., Spanholtz, J., Wernet, P., Ho, A. D., and Punzel, M. (2006). Primitive human hematopoietic cells give rise to differentially specified daughter cells upon their initial cell division. Blood 107, 2146-2152.

26. Gothot, A., Pyatt, R., McMahel, J., Rice, S., and Srour, E. F. (1997). Functional heterogeneity of human CD34(+) cells isolated in subcompartments of the GO /G1 phase of the cell cycle. Blood 90, 4384-4393.

27. Greenberg, B. R., Wilson, F. D., Woo, L., Klein, A. K., and Rosenblatt, L. S. (1984). Increased in vitro radioresistance of bone marrow fibroblastic progenitors (CFU-F) from patients with acute non-lymphocytic leukemia. Leuk.Res. 8, 267-273.

28. Hashimoto, Т., Wu, Y., Boudreau, N., Li, J., Matsumoto, M., and Young, W. (2004). Regulation of tie2 expression by angiopoietin—potential feedback system. Endothelium 11, 207210.

29. Hirano, N., Butler, M. O., Guinan, E. C., Nadler, L. M., and Kojima, S. (2005). Presence of anti-kinectin and anti-PMSl antibodies in Japanese aplastic anaemia patients. Br.J.Haematol. 128,221-223.

30. Hirata, J., Takahira, H., Kaneko, S., Nishimura, J., and Nawata, H. (1989). Bone marrow stromal cells in myeloproliferative disorders. Acta Haematol. 82, 35-39.

31. Issaragrisil, S., Kaufman, D. W., Anderson, Т., Chansung, K., Leaverton, P. E., Shapiro, S., and Young, N. S. (2006). The epidemiology of aplastic anemia in Thailand. Blood 107, 1299-1307.

32. Ito, Т., Sawada, R., Fujiwara, Y., Seyama, Y., and Tsuchiya, T. (2007). FGF-2 suppresses cellular senescence of human mesenchymal stem cells by down-regulation of TGF-beta2. Biochem.Biophys.Res.Commun. 359, 108-114.

33. Iwata, M., Awaya, N., Graf, L., Kahl, C., and Torok-Storb, B. (2004). Human marrow stromal cells activate monocytes to secrete osteopontin, which down-regulates Notchl gene expression in CD34+ cells. Blood 103, 4496-4502.

34. Jiang, X. X., Zhang, Y., Liu, В., Zhang, S. X., Wu, Y., Yu, X. D., and Mao, N. (2005). Human mesenchymal stem cells inhibit differentiation and function of monocyte-derived dendritic cells. Blood 105,4120-4126.

35. Karanu, F. N., Murdoch, В., Gallacher, L., Wu, D. M., Koremoto, M., Sakano, S., and Bhatia, M. (2000). The notch ligand jagged-1 represents a novel growth factor of human hematopoietic stem cells. J.Exp.Med. 192, 1365-1372.

36. Kashiwakura, I. and Takahashi, T. A. (2005). Fibroblast growth factor and ex vivo expansion of hematopoietic progenitor cells. Leuk.Lymphoma 46, 329-333.

37. Ann.Rheum.Dis. 67, 741-749.

38. Kiel, M. J., Acar, M., Radice, G. L., and Morrison, S. J. (2009). Hematopoietic stem cells do not depend on N-cadherin to regulate their maintenance. Cell Stem Cell 4, 170-179.

39. Kiel, M. J., Iwashita, Т., Yilmaz, О. H., and Morrison, S. J. (2005). Spatial differences in hematopoiesis but not in stem cells indicate a lack of regional patterning in definitive hematopoietic stem cells. Dev.Biol. 283, 29-39.

40. Kiel, M. J., Radice, G. L., and Morrison, S. J. (2007). Lack of evidence that hematopoietic stem cells depend on N-cadherin-mediated adhesion to osteoblasts for their maintenance. Cell Stem Cell 1, 204-217.

41. Kirstetter, P., Anderson, K., Porse, В. Т., Jacobsen, S. E., and Nerlov, C. (2006). Activation of the canonical Wnt pathway leads to loss of hematopoietic stem cell repopulation and multilineage differentiation block. Nat.Immunol. 7, 1048-1056.

42. Koch, U., Wilson, A., Cobas, M., Kemler, R., MacDonald, H. R„ and Radtke, F. (2008). Simultaneous loss of beta- and gamma-catenin does not perturb hematopoiesis or lymphopoiesis. Blood 111, 160-164.

43. Kollet, O., Dar, A., Shivtiel, S., Kalinkovich, A., Lapid, K., Sztainberg, Y., Tesio, M., Samstein, R. M., Goichberg, P., Spiegel, A., Elson, A., and Lapidot, T. (2006). Osteoclasts

44. Koni, P. A., Joshi, S. K., Temann, U. A., Olson, D., Burkly, L., and Flavell, R. A. (2001). Conditional vascular cell adhesion molecule 1 deletion in mice: impaired lymphocyte migration to bone marrow. J.Exp.Med. 193, 741-754.

45. Lapidot, T. and Petit, I. (2002). Current understanding of stem cell mobilization: the roles of chemokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines, and stromal cells. Exp.Hematol. 30, 973-981.

46. Lataillade, J. J., Pierre-Louis, O., Hasselbalch, H. C., Uzan, G., Jasmin, C., Martyre, M. C., and Bousse-Kerdiles, M. C. (2008). Does primary myelofibrosis involve a defective stem cell niche? From concept to evidence. Blood 112, 3026-3035.

47. Lazarchick, J., Russell, R., and Horn, B. (1990). Anti-thymocyte globulin induced thrombocytopenia. Ann.Clin.Lab Sci. 20, 373-378.

48. Li, W., Fu, J., Wang, F., Yu, G., Wang, Y., and Zhang, X. (2004). Distinct overexpression of Fas ligand on T lymphocytes in aplastic anemia. Cell Mol.Immunol. 1, 142147.

49. Lobo, N. A., Shimono, Y., Qian, D., and Clarke, M. F. (2007). The biology of cancer stem cells. Annu.Rev.Cell Dev.Biol. 23, 675-699.

50. Lord, В. I., Testa, N. G., and Hendry, J. H. (1975). The relative spatial distributions of CFUs and CFUc in the normal mouse femur. Blood 46, 65-72.

51. Malhotra, S. and Kincade, P. W. (2009). Canonical Wnt pathway signaling suppresses VCAM-1 expression by marrow stromal and hematopoietic cells. Exp.Hematol. 37, 19-30.

52. Mancini, S. J., Mantei, N., Dumortier, A., Suter, U., MacDonald, H. R., and Radtke, F. (2005). Jagged 1-dependent Notch signaling is dispensable for hematopoietic stem cell self-renewal and differentiation. Blood 105, 2340-2342.

53. Marsh, J. C. (1996). Long-term bone marrow cultures in aplastic anaemia. Eur.J.Haematol.Suppl 60, 75-79.

54. Mayani, H. (2007). Abnormal stromal cells in myelodysplastic syndromes: genomics presents further evidence. Leuk.Res. 31, 577-578.

55. Miyazaki, Т., Miyauchi, S., Tawada, A., Anada, Т., Matsuzaka, S., and Suzuki, O. (2008). Oversulfated chondroitin sulfate-E binds to BMP-4 and enhances osteoblast differentiation. J.Cell Physiol 217, 769-777.

56. Moore, K. A. and Lemischka, I. R. (2006). Stem cells and their niches. Science 311, 1880-1885.

57. Nagao, Т., Yamauchi, K., Komatsuda, M., Noguchi, K., Shimizu, M., Yonekura, S., and Nozaki, H. (1983). Inhibition of human bone marrow fibroblast colony formation by leukemic cells. Blood 62, 1261-1265.

58. Nie, Y., Han, Y. C., and Zou, Y. R. (2008). CXCR4 is required for the quiescence of primitive hematopoietic cells. J.Exp.Med. 205, 777-783.

59. Novitzky, N. and Jacobs, P. (1995). Immunosuppressive therapy in bone marrow aplasia: the stroma functions normally to support hematopoiesis. Exp.Hematol. 23, 1472-1477.

60. Parmar, K., Mauch, P., Vergilio, J. A., Sackstein, R., and Down, J. D. (2007). Distribution of hematopoietic stem cells in the bone marrow according to regional hypoxia. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 104, 5431-5436.

61. Piao, W., Grosse, J., Czwalinna, A., Ivanyi, P., Ganser, A., and Franzke, A. (2005). Antigen-recognition sites of micromanipulated T cells in patients with acquired aplastic anemia. Exp.Hematol. 33, 804-810.

62. Pittenger, M. F., Mackay, A. M., Beck, S. C., Jaiswal, R. K., Douglas, R., Mosca, J. D., Moorman, M. A., Simonetti, D. W., Craig, S., and Marshak, D. R. (1999). Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284, 143-147.

63. Preville, X., Flacher, M., LeMauff, В., Beauchard, S., Davelu, P., Tiollier, J., and Revillard, J. P. (2001). Mechanisms involved in antithymocyte globulin immunosuppressive activity in a nonhuman primate model. Transplantation 71, 460-468.

64. Prevosto, C., Zancolli, M., Canevali, P., Zocchi, M. R., and Poggi, A. (2007). Generation of CD4+ or CD8+ regulatory T cells upon mesenchymal stem cell-lymphocyte interaction. Haematologica 92, 881-888.

65. Reya, Т., Duncan, A. W., Ailles, L., Domen, J., Scherer, D. C., Willert, K., Hintz, L., Nusse, R., and Weissman, I. L. (2003). A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature 423, 409-414.

66. Risitano, A. M., Maciejewski, J. P., Green, S., Plasilova, M., Zeng, W., and Young,

67. N. S. (2004). In-vivo dominant immune responses in aplastic anaemia: molecular tracking of /putatively pathogenetic T-cell clones by TCR beta-CDR3 sequencing. Lancet 364, 355-364.

68. Rochman, Y., Spolski, R., and Leonard, W. J. (2009). New insights into the regulation of T cells by gamma(c) family cytokines. Nat.Rev.Immunol. 9, 480-490.

69. Schofield, R. (1978). The relationship between the spleen colony-forming cell and the haemopoietic stem cell. Blood Cells 4, 7-25.

70. Selleri, C., Maciejewski, J. P., Sato, Т., and Young, N. S. (1996). Interferon-gamma constitutively expressed in the stromal microenvironment of human marrow cultures mediates potent hematopoietic inhibition. Blood 87, 4149-4157.

71. Shiohara, M., Koike, K., Nakahata, Т., and Komiyama, A. (1994). Hematopoietic progenitors and synergism of interferon-gamma and stem cell factor. Leuk.Lymphoma 14, 203211.

72. Smith, M. T. (1996). Overview of benzene-induced aplastic anaemia. Eur.J.Haematol.Suppl 60, 107-110.

73. Solchaga, L. A., Penick, K., Porter, J. D., Goldberg, V. M., Caplan, A. I., and Welter, J. F. (2005). FGF-2 enhances the mitotic and chondrogenic potentials of human adult bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J.Cell Physiol 203, 398-409.

74. Solomou, E. E., Gibellini, F., Stewart, В., Malide, D., Berg, M., Visconte, V., Green, S., Childs, R., Chanock, S. J., and Young, N. S. (2007). Perforin gene mutations in patients with acquired aplastic anemia. Blood 109, 5234-5237.

75. Solomou, E. E., Keyvanfar, K., and Young, N. S. (2006). T-bet, a Thl transcription factor, is up-regulated in T cells from patients with aplastic anemia. Blood 107, 3983-3991.

76. Solomou, E. E., Rezvani, K., Mielke, S., Malide, D., Keyvanfar, K., Visconte, V., Kajigaya, S., Barrett, A. J., and Young, N. S. (2007). Deficient CD4+ CD25+ FOXP3+ T regulatory cells in acquired aplastic anemia. Blood 110, 1603-1606.

77. Suri, C., McClain, J., Thurston, G., McDonald, D. M., Zhou, H., Oldmixon, E. H., Sato, T. N., and Yancopoulos, G. D. (1998). Increased vascularization in mice overexpressing angiopoietin-1. Science 282, 468-471.

78. Taichman, R. S. and Emerson, S. G. (1998). The role of osteoblasts in the hematopoietic microenvironment. Stem Cells 16, 7-15.

79. Takano, H., Ema, H., Sudo, K., and Nakauchi, H. (2004). Asymmetric division and lineage commitment at the level of hematopoietic stem cells: inference from differentiation in daughter cell and granddaughter cell pairs. J.Exp.Med. 199, 295-302.

80. Thurston, G., Suri, C., Smith, K., McClain, J., Sato, T. N., Yancopoulos, G. D., and McDonald, D. M. (1999). Leakage-resistant blood vessels in mice transgenically overexpressing angiopoietin-1. Science 286, 2511-2514.

81. Tontonoz, P., Ни, E., and Spiegelman, В. M. (1995). Regulation of adipocyte gene expression and differentiation by peroxisome proliferator activated receptor gamma. Curr.Opin.Genet.Dev. 5, 571-576.

82. Varma, Т. K., Toliver-Kinsky, Т. E., Lin, C. Y., Koutrouvelis, A. P., Nichols, J. E., and Sherwood, E. R. (2001). Cellular mechanisms that cause suppressed gamma interferon secretion in endotoxin-tolerant mice. Infect.Immun. 69, 5249-5263.

83. Varnum-Finney, В., Brashem-Stein, C., and Bernstein, I. D. (2003). Combined effects of Notch signaling and cytokines induce a multiple log increase in precursors with lymphoid and myeloid reconstituting ability. Blood 101, 1784-1789.

84. Visnjic, D., Kalajzic, Z., Rowe, D. W., Katavic, V., Lorenzo, J., and Aguila, H. L. (2004). Hematopoiesis is severely altered in mice with an induced osteoblast deficiency. Blood 103, 3258-3264.

85. Wang, Y., Schulte, B. A., and Zhou, D. (2006). Hematopoietic stem cell senescence and long-term bone marrow injury. Cell Cycle 5, 35-38.

86. Wen, J. Q., Feng, H. L., Wang, X. Q., and Pang, J. P. (2008). Hemogram and bone marrow morphology in children with chronic aplastic anemia and myelodysplastic syndrome. World J.Pediatr. 4, 36-40.

87. Wilkinson, P. C. and Liew, F. Y. (1995). Chemoattraction of human blood T lymphocytes by interleukin-15. J.Exp.Med. 181, 1255-1259.

88. Wilson, A. and Trumpp, A. (2006). Bone-marrow haematopoietic-stem-cell niches. Nat.Rev.Immunol. 6, 93-106.

89. Wright, D. E., Wagers, A. J., Gulati, A. P., Johnson, F. L., and Weissman, I. L. (2001). Physiological migration of hematopoietic stem and progenitor cells. Science 294, 19331936.

90. Yamaguchi, H., Baerlocher, G. M., Lansdorp, P. M., Chanock, S. J., Nunez, O., Sloand, E., and Young, N. S. (2003). Mutations of the human telomerase RNA gene (TERC) in aplastic anemia and myelodysplastic syndrome. Blood 102, 916-918.

91. Yamaguchi, H., Calado, R. Т., Ly, H., Kajigaya, S., Baerlocher, G. M., Chanock, S. J., Lansdorp, P. M., and Young, N. S. (2005). Mutations in TERT, the gene for telomerase reverse transcriptase, in aplastic anemia. N.Engl.J.Med. 352, 1413-1424.

92. Yamashita, Y. M., Jones, D. L., and Fuller, M. T. (2003). Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science 301, 1547-1550.

93. Young, N. S. and Maciejewski, J. (1997). The pathophysiology of acquired aplastic anemia. N.Engl.J.Med. 336, 1365-1372.

94. Yu, J. M., Emmons, R. V., Hanazono, Y., Sellers, S., Young, N. S., and Dunbar, C. E. (1999). Expression of interferon-gamma by stromal cells inhibits murine long-term repopulating hematopoietic stem cell activity. Exp.Hematol. 27, 895-903.

95. Zaragosi, L. E., Ailhaud, G., and Dani, C. (2006). Autocrine fibroblast growth factor 2 signaling is critical for self-renewal of human multipotent adipose-derived stem cells. Stem Cells 24, 2412-2419.

96. Zeng, W., Kajigaya, S., Chen, G., Risitano, A. M., Nunez, O., and Young, N. S. (2004). Transcript profile of CD4+ and CD8+ T cells from the bone marrow of acquired aplastic anemia patients. Exp.Hematol. 32, 806-814.

97. Zheng, X. X., Maslinski, W., Ferrari-Lacraz, S., and Strom, Т. B. (2003). Cytokines in the treatment and prevention of autoimmune responses-a role of IL-15. Adv.Exp.Med.Biol. 520, 87-95.

98. Zheng, Y., Liu, Y., and Chu, Y. (2006). Immunosuppressive therapy for acquired severe aplastic anemia (SAA): a prospective comparison of four different regimens. Exp.Hematol. 34, 826-831.

99. Zhen-ming, H., Sean, A. F., Stephen, K., George, K., Cameron M. (2009). Comparison of platelet-rich plasma, bovine BMP, and rhBMP-4 on bone matrix protein expression in vitro. Growth Factors, 27(5): 280-288.