Кроветворные клетки-предшественники в культуре печени мыши тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.29, кандидат биологических наук Ган, Ольга Игоревна

• Ган, Ольга Игоревна
• кандидат биологических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ган, Ольга Игоревна

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. II

1. Кроветворные клетки-предшественники в нормальной гемопоэтической ткани. II

2. Регуляция дифференцировки и пролиферации кроветворных клеток-предшественников

3. Кроветворные клетки-предшественники в эмбриогенезе млекопитающих.

4. Органные культуры гемопоэтических органов.

5. Длительная культура клеток костного мозга.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Получение клеток.

2. Органная культура 17-, 18-дневной эмбриональной печени мыши.

3. Метод агаровых диффузионных камер.

4. Клонирование кроветворных клеток в полутвердой агаровой среде in vitro J

5. Подсчет клеточных агрегатов в диффузионных камерах и в агаровых культурах in vitro

6. Определение колониеобразушцих единиц селезенки (КОЕс).

7. Метод селективной элиминации клеток, находящихся в s-фазе клеточного цикла, цитостатиками.

8. Определение радиочувствительности колонией бразущих единиц селезенки (КОЕс).

9. Статистическая обработка результатов

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава I. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ КРОВЕТВОРНЫХ КЛЕТОК-ПРВДШЕСТВЕННИКОВ В ШБРИО-НАЛЪНОЙ ПЕЧЕНИ МЫШИ.

1) Клетки-предшественники гранулоцитов и макрофагов в 17-, 18-суточной эмбриональной печени мыши.

A. Колониеобразувдие единицы агаровых диффузионных камер в эмбриональной печени мыши.

Б. Колониеобразувдие единицы гранулоцитов и макрофагов в эмбриональной печени мыши.

B. Пролиферативная активность клеток-предшественников гранулоцитов и макрофагов в эмбриональной печени мыши.

2) КОЕс эмбриональной печени мыши, регистрируемые в различные сроки после введения кроветворных клеток.

A. Картирование 7- и П-суточных селезеночных колоний.

Б. Содержание и пролиферативная активность 7-8- и П-суточных КОЕс в эмбриональной печени мыши.

B. Радиочувствительность 7- и Посуточных КОЕс в эмбриональной печени и костном мозге взрослой мыши.

Глава 2. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ КОЕс И КЛЕТОК-ПРЕЩШЕСТ-ВЕННИКОВ ГРАНУЛОМОНОЦИТОПО ЭЗА В ОРГАННОЙ КУЛЬТУРЕ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ ПЕЧЕНИ МЫШИ.

I) Колониеобразующие единицы агаровых диффузионных камер в органной культуре эмбриональной печени мыши.

2) Колониеобразующие in vitro единицы гранулоцитов и макрофагов в органной культуре эмбриональной печени мыши.

3) КОЕс, регистрируемые в различные сроки после введения кроветворных клеток из органных культур эмбриональной печени.

4) Пролиферативная активность различных классов кроветворных клеток-предшественников из органных культур эмбриональной печени.

Глава Ш. ГУМОРАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДЙФФЕ

РЕНЦИРОЕКИ КЯЕТОК-ПРВДШЕСТВЕБНИКОВ В ДЛИ

ТЕЛЬНЫХ ОРГАННЫХ КУЛЬТУРАХ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ

ПЕЧЕНИ МЫШИ.

1) Влияние колониестимулирующей активности на гемопоэз в органных культурах эмбриональной печени.

2) Влияние неспецифического ингибитора грану-ломоноцитопоэза (куриного эмбрионального экстракта) на кроветворение в органных культурах эмбриональной печени.

А. Ингибирующее воздействие куриного эмбрионального экстракта (КЭЭ) на рост гранулоцитарных и макрофагальдах колоний в агаровых культурах клеток костного мозга и эмбриональной печени.

Б. Воздействие куриного эмбрионального экстракта (КЭЭ) на кроветворение в органных культурах эмбриональной печени.

3) Эндогенные регуляторы грануломоноцитопоэза в органных культурах эмбриональной печени.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Кроветворные клетки-предшественники в культуре печени мыши»

В течение последних десятилетий достигнуты значительные успехи в изучении клеточных основ гемопоэза. В настоящее время считается доказанным, что кроветворные и лимфоидные алементы организма млекопитающих имеют общую клетку-предшественнипу, так называемую стволовую кроветворную клетку. Последняя обладает не только способностью к самовозобновлению и поддержанию стабильного общего числа в организме, но и к продукции так называемых коммитированных клеток-предшественников, способных к дифференцировке лишь в определенном направлении. Коммитирован-ные клетки-предшественники выявляются как клоногенные элементы, образующие колонии в разнообразных исследованиях in vitro (в полутвердых средах) и in vivo (например, в диффузионных камерах) К компартменту стволовых кроветворных клеток принадлежат так называемые колоние о бра зующие единицы селезенки (КОЕс). Последние выявляются при инъекции суспензий кроветворных клеток облученным мышам-реципиентам, через определенное время после которой на поверхности селезенок появляются колонии - клоны кроветворных клеток (261). Недавно было показано (165), что среди КОЕс из взрослого костного мозга лишь часть принадлежит к компартменту стволовых клеток, в то время как определенная доля колоний происходит из клеток, коммитированных лишь к эрит-роидному пути дифференцировки. Вопросы взаимоотношения стволовых и коммитированных элементов гемопоэза, регуляции их пролиферации и дифференцировки являются в настоящее время центральными в гематологии и смежных с ней науках.

Проблема онтогенеза кроветворной ткани в современной гематологии занимает важное место. Для понимания функционирования гемопоэтических тканей во взрослом организме, необходимо звание путей их развития. Известно, что эмбриональные кроветворные ткани могут быть альтернативным источником клеток при трансплантации, в связи с чем возникает проблема накопления клеток, подходящих для пересадки.

Органная культура пока является единственной системой, в которой в течение длительного времени не только поддерживается пролиферация эмбриональных кроветворных клеток, но и происходит их амплификация. По сравнению с клеточными, органные культуры имеют ряд преимуществ: так, в последних в большей степени сохраняется морфофункциональная структура исходного органа, поэтому эти культуры во многих аспектах могут быть подходящими моделями изучения цроцессов кроветворения и их регуляции.

Для столь важного органа эмбрионального кроветворения млекопитающих, как печень, органная культура - единственный метод, позволяющий длительно его культивировать. Показано, что поддержание кроветворных клеток в этой культуре осуществляется благодаря присутствию в ней пролиферирующих стволовых кроветворных клеток. Длительное поддержание линии стволовых клеток в органной культуре является важным практическим достижением.

Поскольку преимущественно эритроидное кроветворение, свойственное нативной эмбриональной печени, в органной культуре сменяется на грануломоноцитопоэз, представляет интерес изучение в длительной культуре клеток-предшественников гранулоци-тов и макрофагов.

Вопросы гуморальной регуляции пролиферации и дифференци-ровки клеток-предшественников всех классов гемопоэза далеки от разрешения. Изучение воздействия стимуляторов и ингибиторов грануломоноцитопоэза in vitro на кроветворение в условиях органного культивирования представляет подходящую модель для решения проблем регуляции кроветворения как со стороны гуморальных факторов, так и со стороны факторов кроветворного микроокружения.

Цель и задачи исследования.

Целью работы являлось изучение свойств клеток-предшественников гемопоэза в печени эмбрионов мышей, а также в длительной культуре этого органа для получения данных о механизмах регуляции кроветворения.

В работе поставлены следующие конкретные задачи:

- Изучение свойств субпопуляций КОЕс и клеток-цредшест-венников гранулоцитов и макрофагов из печени эмбрионов мышей разных сроков развития с определением их содержания в кроветворном органе, потенций к дифференцировке в различных направлениях; чувствительности к ионизирующему облучению и действию цитостатиков.

- Изучение клеток-предшественников грануломоноцитопоэза и КОЕс в длительных органных культурах эмбриональной печени мышей с характеристикой кинетики их содержания, цролифератив-ной активности и взаимоотношений между различными категориями колониеобразующих клеток.

- Изучение гуморальных воздействий на гемопоэз в органных культурах эмбриональной печени мышей.

Научная новизна.

В работе впервые показано существование в печени эмбрионов разных стадий онтогенеза двух популяций КОЕс (7-8-сут и 11-сут КОЕс), различающихся по своим дифференцировочным свойствам, содержанию в нативном кроветворном органе и чувствительности к ионизирующему облучению.

Установлено, что обе категории КОЕс длительное время поддерживаются в органных культурах эмбриональной печени мышей. Показано, что гранулоцитарно-макрофагальные клетки-предшественники, выявляемые методами in vivo (в диффузионных камерах) и in vitro (в полутвердых средах), также длительное время поддерживаются в органных культурах и активно пролифе-рируют, как это свойственно этому классу колониеобразующих единиц нативного кроветворного органа.

Показано, что в органных культурах вырабатывается колонне стимулирующая активность. Добавление экзогенной колоние-стимулирущей активности в культуру сдвигает гемопоэз в ней в сторону более интенсивной продукции зрелых клеток при сниженном уровне поддержания клеток-предшественников. Добавление ингибитора грануломоноцитопоэза in vitro в органную культуру эмбриональной печени оказывает стимулирующее действие на гемопоэз в культурах.

Практическое значение.

Настоящая работа углубляет понимание механизмов, лежащих в основе функционирования кроветворной ткани.

Выявленные закономерности грануломоноцитопоэза в длительной культуре имеют важное значение для выяснения дифференци-ровочных потенций кроветворных клеток.

Полученные на органной культуре эмбриональной печени грызунов данные являются полезными и для расшифровки механизмов кроветворения в длительных культурах эмбриональных тканей человека. Они могут быть использованы при разработке методов культивирования эмбриональных кроветворных клеток человека с целью клинической трансплантации при различных гемо-поэтических заболеваниях.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

I. Кроветворные клетки-предшественнжки в нормальной гемопоэтической ткани.

Современные представления о процессах кроветворения основаны не только и не столько на данных описательного, морфологического характера, которыми оперировали гистологи прошюго, сколько на результатах клональных исследований, позволяющих выявить различные категории клеток-цредшественников 1фови. В современной гематологии и гистологии под родоначальными клетками крови, или клетками-цредшественниками кроветворной ткани, понимают стадии гистогенетического ряда, на которых пролифе-рирующие клетки могут давать потомство либо идентичных им клеток, либо клеток, переходящих на иную ступень дифференциров-ки (34).

Клетки-предшественники крови можно условно разделить на три компартмента: компартмент стволовых клеток, компартмент клеток-цредшественников различных ростков кроветворения и компартмент морфологически распознаваемых клеток, с которым и имели дело гистологи первой половины XX века. Стволовые клетки шпорипотентны, способны к поддержанию стабильного общего числа в организме, к самоподдержанию (37) и продуцированию клеток различных ростков кроветворения, входящих в следующий компартмент - коммитированных клеток-предшественников, способных лишь к ограниченному самовозобновлению. Пролиферация этих клеток ведет к возникновению морфологически распознаваемых клеток, пролиферация которых, в свою очередь, приводит к возникновению зрелых клеток крови и лимфоидных органов.

Metcalf (176) отмечает следующие важные характеристики трехступенчатой структуры гемопоэтического рада: I) Внутри каждого компартмента клеток-предшественников проявляется их способность к пролиферации и амплификации; 2) Происходит последовательная специализация при переходе от вышестоящего компартмента к нижестоящему; 3) Клетки не способны к переходу из более "зрелого" компартмента в менее "зрвлый"; 4) Клетки не способны передвигаться из одного коммитированного компартмента в другой, специализированный по иной линии дифференци-ровки.

В последние годы на смену представлениям о компартмен-тах клеток-предшественников приходят представления об их континуумах - внутри каждого континуума клетки обладают гетерогенностью по многим параметрам - способности к самоподдержанию, пролиферативным и дифференцировочным потенциям, чувствительности к разнообразным стимулам. В начале каждого континуума стоит клетка :е наибольшей способностью к амплификации и наименее чувствительная к внешним факторам регуляции их числа; в конце континуума - клетка с наименьшими пролиферативны-ми потенциями, наиболее чувствительная к регуляции (см.»например, 191).

С помощью методов, позволяющих получать колонии - клоны, состоящие из потомков одной колониеобразующей клетки какого-либо компартмента-континуума, могут быть получены доказательства реального существования различных категорий клеток-предшественников.

К стволовым кроветворным клеткам (СКК) могут быть отнесены кроветворные клетки, образующие колонии в селезенке летально облученных мышей (261) - так называемые колониеобразую-щие единицы селезенки (КОЕс). В 1963 году Becker с соавторами (44) показали клональную природу селезеночных колоний с помощью метода радиационных хромосомных маркеров. Плюрипотент-ность КОЕс, определяемых на 9 сут после введения клеток костного мозга облученному реципиенту (сроки регистрации колоний важны в свете данных, которые будут изложены ниже), была доказана методом переноса колоний той или иной морфологии вторичному реципиенту (158,84) и в культуру in vitro (84).

В течение долгого времени термины СКК и КОЕс использовались как синонимы, хотя строгих доказательств тождества получено не было и, наоборот, имелось множество косвенных данных о различиях, хотя бы частичных, между КОЕс и СКК (34).

В 1982 году на основании данных по картированию (зарисовке) селезеночных колоний в различные сроки после введения клеток костного мозга облученным животным, цитологического анализа и изучения клеток-предшественников, образующих колонии in vitro из клеток первичных (селезеночных) колоний, Magii и соавторы показали, что существуют две популяции КОЕс (165). Одна из них содержит КОЕс, которые, быстро амшгафицируясь, образуют к 7 сут макроскопические колонии, состоящие из эритро-идннх клеток разных стадий созревания и не содержащие "ран--них" клеток-предшественников крови (за исключением предшественников, которые в культуре проделывают лишь 3-6 митозов).К 10-11 суткам колонии, образованные этими КОЕс, с поверхности селезенки исчезают. Вторая популяция КОЕс дает медленно растущие клоны (лишь немногие колонии - 1/3 - достигают макроскопических размеров к 7 сут.); 3/4 II-сут колоний содержит ранние клетки-предшественники, коммитированные как к грануло-, так и к эритропоэзу, а также мультипотентные клетки-предшественники. Таким образом, лишь IO-II-сут колонии образуются из шпорипотентных клеток-предшественников, в то время как колонии, выявляемые в более ранние сроки (7-8 сут) происходят отчасти из клеток, коммитированных к эритровдному пути развития и не способных к самоподдержанию.

Все вышеприведенные данные в ближайшее время, вероятно, приведут к переосмыслению многих результатов, полученных при анализе 7-8-сут КОЕс, в частности, результатов, касающихся регуляции пролиферации и дифференцировки СКК.

Однако гетерогенность популяции СКК в аспекте их способности к пролиферации и самоподдержанию не ограничиваются выявленными двумя популяциями КОЕс. СКК с более высоким самоподдержанием могут быть обнаружены по их способности восстанавливать и "излечивать" (поддерживать) кроветворение у мутантных мышей, страдающих макроцитарной анемией, - гетерозигот фенотипа w/wv , костномозговые клетки которых не способны образовывать колонии в селезенках летально облученных реципиентов. При инъекции мутантным мышам нормальный конгенный костный мозг имеет селективное преимущество перед костным мозгом реципиента, и в таких мышах происходит постепенное замещение 1фове-творения на донорское (34). Методом лимитирующих разведений инокудумов нормального костного мозга, введенных мутантным реципиентам, было показано, что среди 100 КОЕс содержится лишь I СКК с таким высоким пролиферативным потенциалом, который позволяет поддерживать кроветворение в м/чГ мышах (126). Здесь следует отметить тот факт, что в длительных культурах костного мозга интактных w/wv мышей поддерживаются разнообразные классы коммитированных клеток-предшественников на уровне, даже более высоком, чем в культуре костного мозга мышей "дикого типа", однако, в последних КОЕс есть, а в "мутантных культурах" - нет. Это доказывает, что и в мутантных мышах есть популяции СКК, отличная от КОЕс (212),

И наконец, с помощью метода анализа изоэнзимов мышей-гетерозигот по ферменту фосфоглицерат-киназе Burton с соавторами (41) выявили еще одну субпопуляцию СКК с очень высоким пролиферативным потенциалом. В раннем онтогенезе особей женского пола, как известно, происходит инактивация одной из Х-хромосом, а следовательно, и всех ее генов. В любой ткани, в том числе кроветворной, у мышей-гетерозигот по ферменту, кодированному в Х-хромосоме, будет, очевидно, около половины клеток, содержащих ген, кодирующий тот или иной вариант изо-фермента. Изучение изоферментов эритроцитов после периодических кровопотерь и соответствующие вычисления показали,что -для обеспечения кроветворения в течение 14 дней необходимо g всего три клона. В каждом клоне содержится около 2x10 клеток, т.е. СКК должна проделать 31 митоз для поддержания нормального количества эритроцитов в организме. Для продукции эритроцитов из КОЕс необходимо 12-14 делений, таким образом, КОЕс на 12-14 (!) делений отстоит от клетки, продуцирующей клон (41), Континуум СКК, следовательно, можно представить как расширяющийся клон, в начале которого стоит СКК, выявленная Burton с соавторами, продуцирующая 1-5 тысяч СКК с высоким пролиферативным потенциалом, обнаруживаемых при инъекции yy/wv мышам и 100-500 тысяч КОЕс (37). Напомним, что среди последних, вероятно, лишь половина принадлежит к СКК-конти-нууму. В конце ряда СКК находится, по всей видимости, и еще одна популяция кроветворных клеток-предшестенников, выявляемая при культивировании in vitro- так называемые "смешанные" колоннеобразующие единицы (КОЕсмеш.).

При исследовании в агаровых или метилцеллулозных культурах, содержащих среду, кондиционированную клетками селезенки при стимуляции митогеном лаконоса, клеток эмбриональной печени (142), взрослого костного мозга (120), селезенки и периферической крови мыши (197) образуются макроскопические колонии, состоящие из 2000-20 ООО клеток (185), принадлежащих к различным росткам миелопоэза (эритроидному, нейтрофильному, эозинофиль-ному, моноцитарно-макрофагальному и мегакариоцитарному). В пользу клональной природы этих колоний свидетельствует линейная зависимость между числом посаженных клеток и числом колоний (120,142); прямые доказательства получены в опытах по культивированию единичных клеток (121). Колонии образованы мульти-потентными клетками-предшественниками, способность к самоподдержанию которых, однако, невелика. При реклонировании смешанных колоний, полученных из клеток эмбриональной печени (ЭП), лишь немногие дают вторичные колонии (183). Экспериментами по переносу первичных смешанных колоний, полученных при культивировании клеток из длительных культур костного мозга, показана их большая способность к самоподдержанию (133-135). Содержание КОЕс в смешанных колониях, как правило, невелико, широко варьирует, и зависит, в частности, от источника кроветворных клеток (ЭП, селезенка, костный мозг или длительная культура костного мозга - 61, 149, 183). Пролиферативная активность, измеренная с помощью "3Н-тимидинового самоубийства" (45) и показывающая долю клеток в s -фазе клеточного цикла во время инкубации с фазовоспецифическим агентом, для КОЕсмеш. взрослого костного мозга невелика (от 3,5$ (197) до 12,5$ (148)) и сравнима с таковой у КОЕс костного мозга (около 10$ - 181). Схожи КОЕс и КОЕсмеш. по скорости седиментации (т.е. по размерам клеток) (120, 147), по распределению в кроветворных органах (267), в частности, после стимуляции и супрессии эритро-поэза (119), по плотности (267). Однако нельзя отождествлять эти две популяции мультипотентных клеток (180). Во-первых, КОЕсмеш. составляют лишь десятую часть популяции КОЕс (135). Во-вторых, в экспериментах по связыванию клеток с экстрактом лаконоса и флуоресцентным красителем, с последующим разделением их по интенсивности флуоресценции и светорассеянию в клеточном "сортировщике", было выявлено два пика КОЕс, в то время как КОЕсмеш.образовывали лишь один пик, перекрывающийся с одной из популяций КОЕс (139). Таким образом, КОЕсмеш. представляют лишь часть популяции КОЕс, вероятно, наиболее продвинутую в ряду СКК в сторону экстенсивной дифференцировки.

В 1982 году появились две работы, описывающие культураль-ные системы, в которых выявляются колонии, состоящие из 401000 (198) или 1-1,5 тысяч бластных клеток jp[5I). Клетки этих колоний обладают высоким самоподдержанием, образуют как аналогичные колонии, так и смешанные колонии во вторичных культурах и содержат КОЕс. В некоторых колониях все клетки были ко-лониеобразующими (198). Таким образом, in vitro можно выявить и клонообразующие клетки - члены континуума СКК, обладающие высоким пролиферативным потенциалом и гораздо менее продвинутые в сторону дифференцировки, чем КОЕс.

Разработка метода получения КОЕсмеш. дает уникальную возможность изучения мультипотентных клеток-предшественников костного мозга и крови человека (95). За последние несколько лет накоплен материал по содержанию и свойствам этого класса клеток-предшественников у здоровых лиц (96, 172, 216) и у больных апластической анемией (214), хроническим миелолейко-зом (213), болезнью Ходжкина (70), истинной полицитемией (188).

Разработка клональных методов in vitro , впервые примененных для получения гранулоцитарных и макрофагальных колоний, в настоящее время привела к возможности культивирования клеток-предшественников практически всех линий гемо- и лимфопоэза, а также стромальных клеток-предшественников. Так, применяя различные полутвердые среды (агар, метилцеллулозу, фибриновый или плазменный сгусток), а также различные стимуляторы, были изучены клетки-предшественники Т- и B-лимфоцитов мыши и человека (176), две популяций эозинофильных колонне образующих единиц (КОЕэоз.) мышй (103, 147) и человека (71), базофильно-тучнокле-точные КОЕ человека (39, 257), мегакариоцитарные клетки-предшественники (115, 169), а также несколько классов эритроидных клеток-предшественников (см.обзор 199). Последние подразделяются на эритроидные бурст-образующие единицы (БОЕ-Э), выявляемые на 7-15 день, БОЕ-Э - 3-дневные и КОЕ эритроидные (КОЕ-Э), образующиеся на 2 день культивирования. Размер эритроидных колоний уменьшается в этом ряду; доказано, что все они образованы разными клетками-предшественниками, а не просто разрастанием, например, 2-сут колоний к 7-15 сут (267).

В 1965-66 годах независимо две группы исследователей предложили метод культивирования кроветворных клеток в полутвердом агаре, выявляющий клетки-предшественники гранулоцитов и макрофагов. Pluznik и Sachs (215) применили двухслойную систему, в которой в нижнем слое в.0,5$ агаре культивировали клетки мышиного эмбриона, служащие источником специфической колоние-стимулирующей активности (КСА) для клеток селезенки или ЭП, культивируемых в верхнем слое в 0,3$ агаре. Поскольку макрофаги в образовавшихся колония^активно фагоцитировали окрудающий их агар, они содержали большое количество метахроматически красящихся гранул и поэтому первоначально были описаны как тучные клетки. Bradley и Metcalf (56) в качестве подложки (так называемого "фидерного слоя") использовали почечные клетки 8-дневных мышат и в верхнем слое культивировали костномозговые клетки.

Колонии гранулоцитов и макрофагов, получаемые в агаровой системе in vitro , представляют собой клоны. Косвенным доказательством этому служит линейная зависимость числа культивируемых клеток и количества образовавшихся колоний; прямым - то, что изолированные единичные клетки в культурах способны давать рост гранулоцитарным, макрофагальным или смешанным гранулоцитарно-макрофатальным колониям (176).

В общих чертах рост гранулоцитарно-макрофагальных колоний характеризуется следующими особенностями. В культурах происходит гибель большинства высаживаемых клеток в первые 1-2 сут культивирования. Клетки, вступающие в пролиферацию, претерпевают 16-час lag-период, однако, многие клетки начинают пролифе-рировать и в более поздние сроки (173). Асинхронность вступления клеток-предшественников в пролиферацию может отчасти объяснить значительную вариабельность размеров колоний.

В большинстве культур первые несколько делений КОЕ и их потомков ведут к образованию плотных агрегатов, а после 3-4 сут культивирования часть агрегатов остается плотными, часть же становится рыхлыми. При культивировании костного мозга мыши рост колоний пре1фащается на 7-14 сут. Это может объясняться созреванием клеток колоний и их неспособностью к дальнейшим делениям, а, возможно, и "обеднением" культуральной среды питательными компонентами (176). В основном колонии имеют округлую форму. Впрочем, при применении высоких концентраций колоннестимулирушцего фактора (КСФ) (176) или коллагенового геля вместо агара (156) потомки колониеобразующих клеток (КОК) разделяются пространственно на очень ранних сроках культивирования, после чего начинают делиться, что ведет за собой образование грану-лоцитарных (156, 176) или гранулоцитарно-макрофагальных (156) многоцентровых колоний.

В агаровой культуре in vitro , стимулированной КСФ,встречаются три клеточных типа колоний: макрофагальные, гранулоци-тарные и гранулоцитарно-макрофагальные. В колониях присутствуют такие морфологически различимые клетки, как миелобласты, миелоциты, метамиелоциты, полиморфноядерные гранулоциты, про-моноциты, моноциты и макрофаги (178). Существование смешанных (гранулоцитрано-макрофагальных) колоний указывает на общность предшественника этих двух рядов миелопоэза. Соотношение типов колоний зависит от применяемого КСФ; в частности, существуют КСФ, стимулирующие как гранулоцитарные, так и макрофагальные колонии, - так называемые ГМ-КСФ, а есть КСФ, применение которых в агаровых культурах ведет к образованию в основном макрофаг альных колоний (М-КСФ) (176). Культивируя единичные клетки в культурах с ГМ-КСФ или М-КСФ, а затем перенося клоны из двух клеток в культуры с другим стимулятором Metcalf (179,186) показал, что 2/3 КОЕ-ГМ костного мозга чувствительны к обоим видам КСФ, т.е. не коммитированы только к гранулоцитарной или макрофагальной дифференцировке. Среди остальных предшественников есть КОК, чувствительные только к М-КСФ( т.е. коммитиро-ванные к макрофагальной дифференцировке), однако их меньше,чем клеток-предшественников гранулоцитарной линии. В этих же работах было показано, что коммитирование к тому или иному пути дифференцировки происходит между 2 и 3 делением общей клеткипредшественницы грануломоноцитопоэза.

В агаровой культуре in vitro образуются не только колонии (агрегаты, содержащие более 50 клеток), но и кластеры, содержащие от 2 до 50 клеток, Кластеробразующие клетки (КлОК) отличаются от КОЕ-ГМ по пролиферативной активности, могут быть отделены от последних по скорости седиментации (их размеры больше), они более чувствительны к КСФ и являются, по всей видимости, потомками КОЕ-ГМ (143, 176, 202). В большинстве культуральных систем in vitro отношение числа кластеров к количеству колоний колеблется от 5:1 до 10:1 (176). В детальном исследовании Metcalf (173), посвященном процессу клас-теробразования, показано, что первые кластеры в культуре образуются через 12 часов после начала инкубации, что доказывает, что продолжительность клеточного цикла КлОК - 12 час и менее. При наблкщении за образованием кластеров и колоний, состоящих из макрофагов, автор указывает на трансформацию грану-лоцитарных кластеров в первые дни культивирования в макрофа-гальные кластеры или колонии (173,174), из чего делает вывод о том, что, по крайней мере, некоторые макрофаги в смешанных шш макрофагальных колониях возникают путем трансформации грануло-цитов, причем эта трансформация происходит, скорее всего на стадии промиелоцитов (71). Однако дальнейшего развития подобного рода работы не получили.

Колонии, продуцируемые КОЕ-ГМ, состоят из 50-2000 клеток (176), что указывает на гетерогенность популяции КОК по проли-феративному потенциалу. За последние годы появилось немало работ, указывающих на существование разнообразных субпопуляций внутри класса КОЕ-ГМ, отличающихся по многим признакам, в частности, по ответу на различные КСФ, а также дифференцировочные факторы (ДФ). Williams с соавторами (271) выделил две субпопуляции КОЕ-ГМ: одна из них отвечала на КСФ, другая - на КСФ и эритроцитарный гемолизат. Затем было выделено 3 субпопуляции КОЕ-ГМ, различающихся по плавучей плотности и по ответу на КСФ или КСФ и гемолизат (52, 53, 249). Вероятно, эти 3 субпопуляции -члены континуума КОЕ-ГМ, представляющие собой "созревающую" плотности, образующие самые крупные колонии, - наименее дифференцированные представители ряда (53). Было выяснено также,что КОЕ-ГМ, отвечающие на 2 субкласса КСФ из сыворотки мышей, которым был введен эндотоксин (постэццотоксиновая сыворотка), имеют различную скорость седиментации (241). КОК, отвечающие на ГМ-КСФ, обладают низкой плотностью и сравнительно небольшая их часть (17%) находится в Б -фазе клеточного цикла, в то время как клетки, отвечающие на М-КСФ, обладают более высокой плотностью и пролиферативной активностью (41%) (59). В последнем случае различные КСФ стимулируют к пролиферации в культуре субпопуляции, возможно, уже в организме различающиеся по своим дифференцировочным потенциям (сравни - 186). Два подкласса КОЕ-ГМ, отличающиеся по скорости седиментации, времени созревания колоний, ответу на КСФ, были найдены также в костном мозге человека (195).

Субпопуляции КОЕ-ГМ различаются и по чувствительности к ультрафиолетовым лучам после инкубации клеток с бровдезоксиури-дином (117), и по поверхностной антигенной структуре (167). Гетерогенность КОЕ-М и КОЕ-ГМ выявляется и с помощью моноклональ-ных антител, направленных против антигенов различных популяций миелоидных клеток (72, 231). Показано, что некоторые антигены на поверхности КОЕ-ГМ мыши (113) или человека (210) вырасерию клеток, при этом КОЕ-ГМ наименьшей жены, в основном, в течение s -фазы клеточного цикла.

КОЕ-ГМ в целом - активно пролиферирувдие клетки. Процент КОК, элиминируемых фазоспецифическим агентом, колеблется от 1Ь% до 44$ и составляет в среднем 31,4^8,0$ (140). Однако Ре-tursson с соавторами (212) указывает на тот факт, что про-лиферативная активность КОЕ-ГМ из разных гемопоэтических органов отличается (в селезенке - 35$, в костном мозге - 21,4$), и наиболее выражены эти отличия в мутантных w/wv мышах. Разница в пролиферативном статусе КОЕ-ГМ может отражать различные индуктивные влияния со стороны стромы на эти клетки-предшественники. КОЕ-ГМ более радиорезистентны, чем КОЕс. По данным Nakeff с соавторами (226) Д0Х^ для КОЕ-ГМ составляет 128 рад, КОЕс - 86 рад, мегакариоцитарных КОЕ (КОБ-Мег.) -128 рад и КОЕ-Э - 66 рад.

Концентрация КОЕ-ГМ в костном мозге мыши колеблется в зависимости от линии мышей, условий культивирования и применяемого КСФ, от 80до 200 клеток-предшественников на 10 ядерных клеток (114, 120, 144).

Таким образом, КОЕ-ГМ, выявляемые в культуре in vitro, представляют собой гетерогенную популяцию клеток, являющихся континуумом клеточных форм, различающихся по своим пролифера-тивным свойствам, размеру клеток, чувствительности к стимулирующим факторам, антигенным детерминантам и в основной своей массе коммитированных к обоим направлениям дифференцировки.

В 1970 году была предложена система культивирования кроветворных клеток-предшественников in vivo в диффузионных камерах (ДК), помещаемых в брюшную полость мышей. В такой системе осуществлялась пролиферация и дифференцировка КОК грану-ломоноцитопоэза (46). В ДК пролифериругот члены компартмента СКК (60), в фибриновом или плазменном сгустке в камерах обра— х)- доза, вызывающая такое поражение изучаемых объектов, которое приводит к их снижению в е раз на экспоненциальной части КГИГОПЙ "ТТПДЯ — QñfYThowm" зуются гранулоцитарно-макрофагальные или эритроидные колонии (245). При краткосрочной инкубации кроветворных клеток с фазо-воспецифическим агентом было выяснено, что КОЕщ^ находятся вне пролиферативного цикла (259); по этому цризнаку и некоторым другим свойствам, считается, что КОЕдд - более ранние предшественники, чем КОЕ-ГМ, выявляемые in vitro (54,67, 74,259).

В ДК кроветворные клетки можно культивировать и в агаровой питательной среде (107). Через 7-9 сут культивирования в агаровых диффузионных камерах (АДК) образуются колонии грану-лоцитов и макрофагов, близкие по морфологии к получаемым in vitro . Система культивирования в ДЦК имеет преимущество перед агаровой системой in vitro : культуральная среда постоянна (эксудат перитонеальной полости) и нет вариаций в приготовлении КСФ. Меньшая вариабельность числа колоний, получаемых в АДК (ошибка метода составляет 4$) по сравнению с агаровой системой in vitro (около 13$) показывает, что исследования in vivo обеспечивают более стабильные культуральные условия (237).

Были показаны линейные взаимоотношения между числом культивируемых клеток костного мозга и селезенки мышей и количеством образовавшихся в АДК колоний (107). Колониеобразующие единицы агаровых диффузионных камер (КОЕадк) по многим параметрам близки к КОЕ-ГМ, выявляемым in vitro . Сходство в морфологии колоний, пролиферативной активности (46$ КОЕадк находится в s -фазе клеточного цикла) (107), радиочувствительности (Д0=137 рад) (108) позволяет говорить об идентичности предшественников, .выявляемых в агаровых культурах in vivo и in vitro.

Рост колоний в АДК зависит от КСФ, присутствующего в пери-тонеальной полости мышей-реципиентов. Обработка последних ци-клофосфаном или их облучение увеличивает уровень КСФ, а, следовательно, и число колоний в АДК (109). Прямая зависимость дозы облучения мышей-реципиентов и количества образующихся в камерах колоний сообщалась для КОК костного мозга человека (НО), мыши (2,108) и собаки (2).

Клетки костного мозга мыши по данным Gordon (107) и к

И.А.Горбуновой (2), содержат около 100 КОЕадк на 10 ядерных клеток. В АДК пролиферируют и КлОК. Эффективность колонне- и кластеробразования зависит не только от обработки мышей-реципиентов, но и от их линии (107).

Суспензия клеток, полученная после культивирования в АДК, может содержать КОЕс (109). При культивировании клеток костного мозга крысы в АДК, помещенных в мышей, обработанных цикло-фосфаном, образуются эритроидные бурсты (47), а помещая в АДК клетки костного мозга собаки, можно получить колонии фиброблас-топодобных клеток (2). Таким образом, культивирование в АДК представляется весьма удобным методом изучения не только гра-нулоцитарно-макрофагальных клеток-предшественников, но и эри-троидных, и даже стромальных КОК.

2. Регуляция диФФепенгошовки и пролиферации кроветворных клеток-тэешдественников

Вопросы регуляции дифференцировки и пролиферации стволовых и коммитированных клеток-предшественников являются центральными в экспериментальной гематологии.

В настоящее время существуют две основные гипотезы регуляции процессов самоподдержания и дифференцировки СКК. Первая из них - так называемая "стохастическая модель" Till (260), а вторая - гипотеза "индуктивного микроокружения" (69). Согласно первой из них, случайность ведет к потере способности СКК к са-моподцержанию, и, следовательно, к ее дальнейшему коммитирова-нито. Эта гипотеза, однако, полностью не отрицает роли внешних воздействий на СКК. Так, стимулы окружающей среды действуют на уровне СКК только влиянием на вероятность самоподдержания или коммитирования СКК, так что только популяция СКК в целом может быть чувствительна к стимулу окружения. Такой "экологический" (популяционный) подход к проблеме регуляции пролиферации СКК дает возможность примирить эту модель с фактами, говорящими в пользу второй модели, или же в пользу данных о гуморальных влияниях на процессы пролиферации и дифференцировки СКК. Till (260) предлагает простув молекулярную модель дифференцировки СКК, согласно которой на ДНК расположено два комплекса генов: ответственных за самоподдержание и ответственных за дифферен-цировку. Существует еще и регуляторный ген (или генный комплекс) , транспозиция которого от "самоподдерживающего" гена к "дифференцировочному" ведет к коммутированию СКК. Обратная транспозиция в нормальном организме невозможна. Очевидно, на уровне популяции СКК внешний стимул может влиять на перемещение регуляторного гена.

Согласно модели индуктивного микроокружения (69) внешние стимулы действуют непосредственно на СКК и инициируют ее переход с уровня "самоподдержания" на уровень "коммитирования". Goidwaseer (106) полагает, что уни- или бипотентных клеток-предшественников, отвечающих на определенные гуморальные стимулы (КСФ, эритропоэтин - ЭПО) не существует, напротив, оба эти стимулятора конкурентно воздействуют на СКК через рецепторы, накапливающиеся на ней, и таким образом сдвигают ее на тот или иной путь дифференцировки. Гипотеза конкурентных воздействий находит как экспериментальные подтверждения, так и опровержения.

Известно, что СКК (КОЕс) во взрослом организме, а также в онтогенезе, обладают различной способностью к самоподцержа-нию (37, 55). Так, например, КОЕс крови взрослых животных обладают меньшим самоподдержанием и другой антигенной структурой, чем КОЕс костного мозга и селезенки (190, 191). Учитывая многочисленные данные о различиях КОЕс в кроветворных органах, sChofi eld (229) предложил так называемую гипотезу "кроветворных ниш", согласно которой взаимодействие элементов кроветворного микроокружения с СКК ведет к блокированию ее дальнейшей диф-ференцировки в нише. Если для разделившейся СКК (в норме СКК находятся в цикле со временем генерации около 5 дней, что было показано с помощью метода непрерывных инъекций in vivo бром-дезоксиуридина с последующей элиминацией включивших его клеток ультрафиолетовыми лучами - 209) не находится места в "нише", она выходит из нее и приобретает способность к регуляции дифференцировочными стимулами - именно таким способом образуется континуум СКК. И.Л.Чертков и О.А.Гуревич (37), разрабатывая эту гипотезу, указывают, что возраст СКК (способность к самоподдержанию) определяется не числом проделанных ею митозов, как считают многие исследователи (55, 162, 191), а временем, проведенным вне "ниши". При попадании СКК в "нишу" извне, она "консервируется" в том возрасте, который приобрела вне "ниши. Развивая гипотезу "ниш", Maloney с соавторами (208) показывают, что костный мозг мыши содержит около 5000 "доменов" ("ниш") для СКК, однако Brecher с соавторами (239), основываясь на своих экспериментальных данных, считают, что специальные места ("ниши") для пролиферации СКК не нужны.

В эмбриогенезе способность к самоподдержанию СКК уменьшается по мере взросления (55,181); это, вероятно, связано с тем, что транзиторные органы эмбрионального кроветворения (желточный мешок, ЭП) не обладают свойствами "ниш". Одинаковая способность к самоподдержанию "оседлых" КОЕс эмбриональных кроветворных органов и циркулирующих КОЕс говорит в пользу этого предположения (37).

Регуляция способности СКК к регенерации носит локальный характер и обусловлена кооперативными взаимодействиями СКК, введенных в облученного реципиента, со стромальным микроокружением (35,170),при этом для обеспечения полноценных контактов на поверхности СКК должны присутствовать все антигены H-2-ком-плекса, входящие в ее фенотип (36).

В настоящее время накоплен достаточный материал,указывающий на то, что многие гуморальные и клеточные факторы могут воздействовать на цроцессы дифференцировки и пролиферации СКК (КОЕс). Так, например, костномозговые клетки при инкубации с арабинозидом выделяют некий фактор, влияющий на дифференци-ровку нормальных КОЕс в облученном реципиенте (84,244). Возможно, также существование обратной связи,контролщ>увдей выход КОЕс в КОЕ-ГМ компартмент (43). Под влиянием клеток тимуса изменяется плотность КОЕс (254), клеточная линия преадипо-цитов посредством межклеточных контактов влияет на пролиферацию КОЕс »увеличивая ее (40), фибробластоподобдае клетки костного мозга человека выделяют фактор (или факторы), увеличивающий переживание и пролиферацию КОЕс (50), а из лектин-стиму-лировэнных культур клеток селезенки выделена специфическая активность - гликоцротеин с молекулярным весом (MB) около 20 бД, не стимулирующая пролиферацию коммитированных предшественников, но увеличивающая процент КОЕс,находящихся в Б - фазе клеточного цикла

268). И, наконец, из регенерирующего и нормального костного мозга выделено два фактора, стимулирующих и ингибирующих, соответственно, пролиферацию КОЕс (155). Аналогичные факторы получены и из длительных культур костного мозга (258). Уровень пролиферативной активности КОЕс, таким образом, может быть модулирован балансом ингибитора и стимулятора.

Однако согласно современным представлениям, гуморальным воздействиям могут быть подвержены лишь члены континуума СКК, наиболее продвинутые в ряду дифференцировки. К последним,как уже указывалось выше, принадлежат КОЕсмеш.»выявляемые в культуре in vitro , в которую добавляется среда, кондиционированная клетками селезенки (СКС), стимулированными экстрактом лаконоса.

Впервые эта среда была применена для получения гранулоци-тарно-макрофагальных и эозинофильных колоний (103), позже было показано, что в ее присутствии растут также и мегакариоцитар-ные колонии (115); при культивировании кроветворных клеток с СКС и ЭПО появляются чисто эритроидные и смешанные (эритроид-но-гранулоцитарные или эритроидно-мегакариоцитарные) бурсты, т.е. она обладает так называемой бурст-промоторной активностью (ША) (189), а также в присутствии или отсутствии ЭПО стимулирует рост КОЕсмеш. (смешанные эритроидные бурсты принадлежат к субклассу КОЕсмеш.). Было показано также, что СКС стимулирует рост КОЕ-Э костного мозга (94), хотя принято считать, что для стимуляции этого класса клеток-предшественников необходим ЭПО (267), а для стимуляции пролиферации БОЕ-Э необходимы высокие дозы ЭПО или ЕПА, при этом более продвинутые этапы дифференцировки клеток в бурстах также зависят от ЭПО (199, 273). Было показано, что СКС не содержит ЭПО (142). В выработке факторов роста в селезеночных культурах участвуют как Т- и В-лимфоциты, так и макрофаги (182, 207). До сих пор неясен вопрос о том, является ли активность СКС, действующая на КОЕсмеш. и коммутированные предшественники единичной молекулой, линейно неспецифичной, или же имеется ряд активностей, которые "соединяясь" стимулируют к пролиферации КОЕсмеш., а по отдельности действуют на коммитированные КОК. После применения биохимических методов высокой разрешающей способности разделить активности (во всяком случае полностью ) не удалось (184,185,189), однако, возможность того, что активность - это набор разных молекул остается. Молекулярный вес активности - 23 кД (184,185). iscove с соавторами (189) на основе опытов по разделению активности СКС и среды, кондиционированной клетками миеломоноци-тарной линии wehi-з , также обладающей ела., предлагают еле- , дующую модель дифференцировки СКК. Плюрипотентная клетка имеет рецепторы к ела., ее потомство также имеет эти рецепторы, но постепенно начинает синтезировать рецепторы к "позднодействую-щим" линейноспецифичным факторам (ЭПО, КСФ). Так, КОЕ-ГМ имеют рецепторы к ела и ГМ-КСФ, а ранние эритроидные предшественники - только к ела. По этой модели СКК и ее потомки могут быть чувствительны к одному линейноспецифическому фактору. При этом,если в работах iscove с соавторами этот фактор - ела, то в работах группы Met calf этим фактором является ГМ-КСФ.

Этот вывод основан на наблюдениях, показывающих, что при культивировании клеток ЭП в среде, содержащей КСФ и ЭПО, появляются смешанные колонии. Очищенный препарат КСФ поддерживает несколько первых делений КОЕсмеш. (182), при этом пролиферация этих клеток-предшественников не приводит к их коммитированшо на гранулоцитарно-макрофагальный путь. Однако, хотя ГМ-КСФ поддерживает несколько делений КОЕсмеш., для дальнейшего роста колоний необходимо присутствие СКС (184,185). Из вышеизложенного ясно, что ГМ-КСФ не индуцирует вхождение клеток на путь гранулоцитарно-макрофагальной дифференцировки, но стимулирует дифференцировку и пролиферацию уже коммитированных в этом направлении клеток. Кроме различных стимуляторных активностей СКС обладает и ингибирующим эритропоэз действием (263).

При культивировании кроветворных клеток мыши в полутвердой среде применение какого-либо КСФ необходимо для получения гранулоцитарно-макрофагальных колоний. Источниками КСА могут быть практически все ткани организма (176). (В современной литературе термин КСФ, как правило, применяется для обозначения очищенного препарата, а КСА - для неочищенного). КСА могут быть выделены из сыворотки эмбрионов мыши (181), из экстракта ткани маток беременных мышей (43), из нормальной сыворотки взрослых мышей (175); она вырабатывается в культуре эмбриональных фибробластов (90, 242), выделяется клетками эн-доста (97), Т-лимфоцитами (81, 103), эндотелиальными клетками (163), моноцитами и макрофагами (154, 176, 211). Источником КСА в агаровой культуре клеток мыши служит и моча человека (242). КСА-вырабатывается в смешанной культуре лейкоцитов (171), при этом степень стимуляции клеток в культуре может быть измерена уровнем выработки КСА (132). КСА выделяется линиями фибробластов ( l -клетки - 42), многочисленными линиями, полученными из прилипающих слоев длительных культур костного мозга (218), в том числе фибробластоидными линиями (105), преадипоцитарными (157, 196), активированными Т-клеточными линиями (104), Т-клеточными гибридомами (III) и гибрикдомами с трансформированными макрофагалъными клетками (204). Клетки длительных культур костного мозга, в том числе фибробласты способны вырабатывать КСФ (125, 203, 275); различные опухолевые клетки тоже выделяют КСА (82).

После внутривенного введения эндотоксина во многих тканях мыши значительно увеличивается продукция КСА (200), в качестве источника КСФ чаще всего употребляется среда, кондиционированная клетками легких мышей, подвергшихся такой обработке (232), а также сыворотка, уровень КСА в которой возрастает в 20-30 раз через 3-9 час после инъекции эндотоксина (174, 175). При стимуляции постэндотоксиновой сывороткой в разведении 1:2 культур костного мозга образуется 21% гранулоцитарных, 43% гранулоцитарно-макрофагальных и 30% макрофагальных колонии. При дальнейших разведениях растет процент макрофагальных колоний (175), что указывает на сходство КСА из постэндотоксиновой сыворотки с другими КСА, в том числе с той, которая обнаруживается в СКС (103, 177). По своим биохимическим свойствам КСФ из постэндотоксиновой сыворотки схож со многими ГМ-КСФ (57), и после удаления остатков сиаловых кислот имеет MB 23 кД (200). В постэндотоксиновой сыворотке содержится и так называемая "колониеусиливающая" активность (она вызывает образование дополнительных колоний при добавлении к культурам, содержащим КСФ, но сама по себе не обладает колониестимулирующим действием), однако ее концентрация достигает максимума лишь через 12-15 час после введения эндотоксина (91). Существуют указания и на то, что кроме относительно низкомолекулярного ГМ-КСФ, в постэндотоксиновой сыворотке имеется и М-КСФ с MB около 100-330 вД (241), при этом клетки-предшественники, -отвечающие на разные субклассы КСФ, имеют различный размер.

В огромном количестве работ по биохимической очистке КСФ из различных источников отмечена гетерогенность этих регуляторных гликопротеиновых молекул, однако, в настоящее время считается, что ГМ-КСФ имеет МБ около 23 кД, а М-КСФ -около 70 кД (177, 179, 186). Различия в определении МБ стимулирующих молекул зависят от содержания углеводных остатков, остатков сиаловых кислот, от количества субъединиц в молекуле и т.д. (223, 243, 269).

КСФ обладает разнообразным действием на клетки-предшественники грануломоноцитопоэза: обеспечивает переживание и индуцирует дифференцировку и пролиферацию, а также индуцирует синтез иРНК в созревающих гранулоцитах. Аналогичным образом действует ЭПО, обеспечивая пролиферацию КОЕ-Э и индуцируя -синтез глобиновой иРНК (63,178). Рецепторы для КСФ на ранних миелоидных клеток, возможно, остаются функционировать в развивающихся гранулоцитах. Показано, что значительное количество КСФ может связываться с клетками-предшественниками или находиться в них - такие клетки могут проделывать I или 2 деления в среде, не содержащей КСФ (187).

Ряд данных указывает на существование рецепторов к КСФ на поверхности клеток-предшественников. Так, например, благодаря связыванию КОЕ-ГМ с КСФ удалось почти в 100 раз обогатить эту клеточную популяцию в клеточном "сортировщике" (220). Мембранные ганглиозиды (160) или полипептиды (64) -возможные места связывания клеток с КСФ.

Как уже указывалось выше, при снижении концентрации ГМ-КСФ в культуре наблвдается возрастание доли макрофагальных колоний (192). Глюкокортикоиды, добавленные в агаровые культуры, напротив, повышают процент гранулоцитарных колоний и ингибируют пролиферацию клеток моноцитарно-макрофагального ряда (137,256). Более того, добавление гидрокортизона в длительные культуры костного мозга ведет не только к увеличению соотношения гранулоцитов и макрофагов, но и к продукции большего числа гранулоцитарных колоний при посеве клеток из длительных культур в полутвердую среду (255). Это может говорить о том, что регуляторные активности, подобные глюкокор-тикоидам, могут быть ответственны за модуляцию генной экспрессии бигпотентных КОЕ-ГМ. Ряд веществ, например, 12-о-тетра-деканоилфорбол-13-ацетат, увеличивает чувствительность КОЕ-ГМ к КСФ (58). Литий и его соли увеличивают продукцию КСФ в культуре легких (131), а его введение in vivo ведет к увеличению числа КОЕ-ГМ и продукции КСА многими тканями (159).

КСФ - не единственный регулятор грануломоноцитопоэза. Из различных тканей выделены "усиливающие" рост активности, такие как гемолизат (271, 272), гемин (127).

В настоящее время активно разрабатываются вопросы, связанные с дифференцировкой миеломоноцитарных трансформированных линий. Nicola с соавторами (201) показал, что ГМ-КСФ в некоторой степени индуцирует дифференцировку клеток таких линий, как М I, WEHI-3 , однако, имеются среды, кондиционированные, например, гранулоцитами или клетками целого эмбриона, не содержащие КСА, но обладающие активностью,способствующей дифференцировке клеток трансформированных линий, т.е. обладающие ДФ. Показано, что ДФ в высоких концентрациях содержится в постэндотоксиновой сыворотке. По MB он неотделим от ГМ-КСФ, но может быть сепарирован только методом гидрофобной хроматографии. Интересно, что с ДФ всегда связана некоторая КСА, стиглулирующая рост небольших гранулоцитарных колоний.

Sachs-, (227), суммируя работы своей группы, указывает, что в процессе пролиферации нормальных клеток существуют две контрольные точки, одна из них ответственна за продукцию большего числа клеток, которые уже затем могут дифференцироваться, а вторая осуществляет контроль за терминальной диф-ференцировкой клеток. Различные факторы осуществляют индукцию процессов пролиферации (индуктивный фактор I, аналогичный КСФ) или дифференцировки (индуктивный фактор 2, аналогичный ДФ). Интересно, что первый фактор индуцирует также выработку второго (ДФ) и именно таким образом происходит взаимодействие процессов пролиферации и дифференцировки нормальных клеток. Экспрессия этих двух факторов находится, очевидно, под контролем различных генов (160, 227).

Кроме различных стимулирующих грануломоноцитопоэз факторов, есть и ингибирующие субстанции. Существуют тканевоспе-цифичные ауторегуляторы клеточного роста, продуцируемые зрелыми клетками, инъекция которых животным ведет к снижению костномозгового гемопоэза (63). Вышеописанные факторы (так называемые кейлоны) функционально и биохимически отличаются от ингибиторной активности, продуцируемой полиморфноядер-ными нейтрофилами, которая редуцирует продукцию ГМ-КСФ моно-цитарно-макрофагальными клетками (63, 210). Эта активность содержит, в частности, лактоферрин - гликопротеин, связанный с железом, обнаруживаемый в нейтрофилах, эпителиальных секретаух и молоке (63, 102, 210). В связи с высвобождением ингибиторных активностей нейтрофилами считается, что таким образом осуществляется обратная связь между продукцией зрелых клеток и пролиферацией их предшественников.

Ингибируют колониеобразование in vitro такие вещества, как интерферон и простогландин Е (118, 192). При этом простогландин вырабатывается активированными макрофагами и считается, что он является антагонистом КСФ (63). Кроме того, нормальная сыворотка и плазма крови содержат низкомолекулярные ингибиторы гранулопоэза, физиологическая роль которых неясна. Введение эндотоксина не влияет на уровень сывороточного ингибитора (63).

В настоящее время окончательно не доказано, что КСФ является гранулопоэтином in vivo . Показано, что у радиационных химер восстановление числе клеток-предшественников связано с возрастающей продукцией КСФ (97). При циклической ней-тропении людей и собак флуктуации уровня нейтрофилов параллельны таковым КСФ (177). Введение антител к КСФ ведет к уменьшению гранулопоэза в ДК, однако уменьшения клеточности костного мозга, селезенки и числа лейкоцитов в крови не наблвдает-ся (230). Введение эндотоксина мышам линии сзнеЪ вызывает -значительное увеличение КСФ в сыворотке крови, уменьшение числа КОЕ-ГМ в костном мозге и увеличение клеточности периферической крови. Однако у мутантных мышей сзн/csf , несмотря на схожую динамику числа гранулоцитов и их предшественников в крови и кроветворных органах, уровень КСА сыворотки не повышается (164). Вероятно, контроль пролиферации и дифференци-ровки гранулоцитарно-макрофагальных клеток-предшественников осуществляется многими факторами в организме, и не последнюю роль играют межклеточные взаимодействия, которые могут обеспечивать перенос КСФ в специфические рецепторные места клеток-мишеней (219).

3. Кроветворные клетки-предшественники в эмбриогенезе млекопитающих

Проблема взаимосвязи эмбрионального и постнатального кроветворения в настоящее время активно разрабатывается в связи с возникшим интересом к трансплантации пренатальных кроветворных органов. К преимуществам такой пересадки можно отнести отсутствие вторичной болезни у реципиента (99), с полным восстановлением его гемо- и лимфопоэза (62). Необходимость в пересадках такого рода особенно ощутима в отсутствии совместимого донора костного мозга.

Впервые кроветворные островки у мышей с 19-сут периодом беременности появляются в висцеральном листке мезодермы желточного мешка (Ж) на 7 сут развития. Гемопоэз в печени начинается на 10-11 сут, в костном мозге и селезенке - на 15 сут. К 7,5 сут в Ш развиваются кровяные островки, состоящие из недифференцированных мезобластных клеток, затем появляются базофильные, а позже - полихроматофильные эритробласты примитивной линии эритропоэза. Начиная с 9 сут развития кровяные островки контактируют с капиллярами, которые к 10 сут развиваются в синусоиды, к этому же периоду устанавливается свободная циркуляция крови между ЗЕМ и собственно зародышем (181). КОЕс впервые обнаруживаются в Ж начиная с 8 сут развития, а КОЕ-ГМ - с 7 сут. Более позднее обнаружение КОЕс в этом вне-зародышевом органе гемопоэза связано, вероятно, с очень низкой их концентрацией (1,4/10^ ядерных клеток). Максимум кроветворной активности наблюдается в 1 на 10-11 сут развития, в это же время в нем содержится наибольшее количество КОЕс и КОЕ-ГМ. К 13 сут кроветворение в ЗЩ прекращается, а стволовые и коммитированные КОК не '/.обнаруживаются (181).

Интересна проблема происхождения внутризародышевых кроветворных клеток. Гемопоэз в печени (одном из главных интра-эмбриональных органов) начинается лишь с 10 сут развития, а в 9-сут зародыше кроветворные клетки-предшественники не определяготся. В периферической крови эмбриона на 9 сут развития наблюдается такая же концентрация КОЕс и КОЕ-ГМ, так в ЕМ; затем относительное содержание клеток-предшественников в крови падает, но значительно возрастает к II сут в печени. По мере возрастания числа клеток-предшественников в печени падает их число в Ж, Основываясь на этих данных, а также на результатах экспериментов по органному культивированию зародышей 7-8 сут развития, Ш того же возраста или Ш и зародыша вместе, Metealf и Moore (181) предложили гипотезу внезародышевого происхождения кроветворной ткани. Так, СКК и КОЕ-ГМ, возникая в Ж, затем включаются в циркуляцию, заселяют ЭП, аккумулируясь и пролиферируя в ней. Из ЭП клетки-предшественники через кровеносное русло заселяют дефинитивные кроветворные органы (костный мозг и селезенку).

Имеются доказательства и в пользу другой теории - теории внутризародышевого происхождения кроветворных клеток-предшественников, веские подтверждения в пользу которой получены для амфибий и ПТИЦ (247). В работах групп Dieterlen-Lievre и Лациса Р.В. на птицах показано, что в ходе эмбриогенеза образуется несколько внутризародышевых источников СКК (зачаток сердца, почки конечностей и др.), возникших, возможно, в результате разобщения зачатка крови, первоначально локализованного в боковой пластинке висцеральной мезодермы. В области зачатка сердца и почек конечностей (до замыкания круга кровообращения и начала циркуляции клеток между собственно зародышем и Ж) находятся клетки, способные образовывать эритро-идные, гранулоцитарные и смешанные (эритроидно-гранулоцитар-ные) колонии в костном мозге сублетально облученных ксеноген-ных реципиентов (4, 5, II, 12). В1 образуются лишь "транзиторные стволовые клетки эритропоэза", тогда как внутризародышевые СКК вовлечены в продуцирование дефинитивных эритроцитов и Т- и В-лимфоцитов (92). Kellmen с соавторами (152) на основе изучения гистологических срезов ЭП человека и дифференциального подсчета числа различных клеточных элементов в печени и Ш, предполагают, что хотя бы часть макрофагов ЭП-внутризародышевого происхождения.

С проблемой становления гемопоэза у зародыша тесно связана проблема взаимоотношения примитивных и дефинитивных СКК, однако, прежде чем перейти к ее рассмотрению, необходимо остановиться на свойствах мультипотентных и коммитированных клеток-предшественников главного органа гемопоэза плода - печени.

Печень закладывается как дивертикул зачатка 12-перстной кишки на 7 сут развития зародыша мыши, затем в зачатке развивается паренхиматозная ткань с синусами. Первые кроветворные клетки появляются в печени на стадии 28 сомитов (на 10,5 сут) (141), на 10-11 сут начинается эритро-, а позже - и грануло-моноцитопоэз (181). Дифференциальный подсчет гемопоэтических клеток ЭП указывает на явное преобладание эритроидного ростка кроветворения во все сроки функционирования органа. На 12 день эмбрионального развития клетки эритроидного ряда составляют 83$ от всей популяции гемопоэтических клеток, а клетки гранулоцитарного ряда - 5$ (остальные 12$ приходятся на макрофаги, моноциты, мононуклеарные и бластные клетки, мегакариоци-ты). К 17-18 сут беременности эритроидные клетки составляют около 80$, а доля гранулоцитарных клеток - от 5$ (10) до 18$ (144). Доля гранулоцитарных элементов возрастает до 50$ через неделю после рождения (181). Гемопоэз в печени в основном экстраваокулярный, при этом наблюдаются контакты между кроветворными элементами и клетками эцтодермального происхождения. (181).

Появление мультипотентных и коммитированных клеток-предшественников в ЭП совпадает со временем завершения формирования циркуляторного русла между Ш и этим органом и со временем начала гемопоэза в нем (10 сут - 181). Динамика возрастания числа КОЕс в ЭП такова: в период с 10 по 12 сут развития число КОЕс увеличивается в 150-200 раз (193), затем темп их нарастания снижается, а максимальное количество наблюдается к моменту рождения, после которого резко падает (193, 233). Концентрация КОЕс в 12-14-сут ЭП - 2-13 КОЕс/Ю5 ядерных клеток (181). КОЕс ЭП различных сроков развития формируют все типы колоний в селезенках летально облученных реципиентов (эритроидные, гранулоцитарные, смешанные и мегакариоцитарные). Данные о процентном составе тех или иных колоний противоречивы и, по всей видимости, зависят как от сроков эмбрионального развития, так и от дня забоя реципиентов. Число эритроидных колоний, образующихся в результате пролиферации эмбриональных КОЕс, при исследовании селезенок с 6 по 9 сут имеет тенденцию к уменьшению (по данным сводной таблицы № 3.2 в книге Metcalf, Moore (181), что согласуется с данными Magii с соавторами (165) о формировании части 7-8-сут селезеночных колоний клетками, коммитированными к эритропоэзу. Возможно, что появление этой работы заставит исследователей вновь проанализировать различия в таком свойстве КОЕс взрослого костного мозга и ЭП, как формирование эритроидных колоний в селезенках облученных мышей с полицитемией. В самом деле, небольшая супрессия формирования 7-8-сут эритроидных колоний при инъекции полиците-мическим реципиентам клеток Ю- (122) или 12-сут (51) ЭП по сравнению со значительной или полной редукцией эритроидного колониеобразования при трансплантации 19-сут ЭП или взрослого костного мозга, соответственно (51) может отражать разницу в свойствах не столько эмбриональных и взрослых мультипотентных клеток, но их более продвинутых по эритровдному пути дифферен-цировки потомков, возможно, чувствительных к уровню эритропоэ-тина в организме.

СКК ЭП обладают свойством полипотентности. Так, при введении небольшого числа клеток 13-сут ЭП в П-сут эмбрионы му-тантных анемичных мышей через плацентарное кровообращение, в печени последних появляются очаги гемопоэза, а затем в мышах-реципиентах восстанавливается гемо- и лимфопоэз, при этом происходит замещение эритроцитов, гранулоцитов и Т- и В-лим-фоцитов на донорские. Малый размер инокулума позволяет сделать вывод о том, что восстановление идет за счет немногих (единичных?) полипотентных СКК (101).

В способности к самоподдержанию КОЕс" ЭП разных сроков развития наблюдаются различия. Так, при серийных переносах с 14г-сут интервалом селезеночных колоний, изначально полученных при введении в облученных реципиентов клеток 10-сут ЭП, СКК выдерживают 6-7 пассажей, в то время как КОЕс взрослого костного мозга переносят лишь 3 пассажа, а клетки 15-сут или неонатальной печени - 4 пассажа (181). По данным Воtnick с соавторами (55) способность к самоподдержанию СКК 13-16-сут ЭП, измеренная с помощью серийных пассажей, не отличается от таковой взрослого костного мозга, однако наблюдается уменьшение этой способности по мере взросления зародыша при другом методе измерения самоподдержания (по числу вторичных КОЕс/ первичную селезеночную колонию).

Данные по культивированию клеток ЭП и взрослого костного в диффузионных камерах также говорят о большей пролиферативной активности клеток ЭП. Так, I КОЕс ЭП дает в 2,6 раза больше дифференцированных клеток, чем КОЕс взрослого костного мозга (98, 251).

Измерения ггролиферативной активности КОЕс говорят о том, что значительный процент эмбриональных 9-П-сут КОЕс находится в фазе синтеза ДНК (42$), в то время как среди костномозговых КОЕс элиминируется лишь около 10$ (45, 181).

Различаются эмбриональные и взрослые КОЕс и по радичув-ствительности. Так, цри облучении костного мозга in vivo JZ-ллучами Д0 для КОЕс составляет около 95 рад (168 , 236), а цри облучении ЭП - 146 рад (236). Silini с соавторами также показали, что клетки ЭП более радиорезистентны (при облучении in vivo Д0 = 164 рад, a in vitro - 126 рад (234,235).

При разделении клеток ЭП и взрослого костного мозга по плотности было показано, что все типы КОЕ печени легче, чем костного мозга (139). По мере развития плода наблвдается возрастание плотности КОЕс и КОЕ-ГМ (181). При разделении клеток 18-сут ЭП было выявлено три популяции КОЕс, из которых одна -самая легкая - соответствовала КОЕс 10-сут ЭП (122); небольшой процент популяции костномозговых КОЕс также перерывается по этому параметру с наиболее легкими КОЕс ранней ЭП.Однако популяции наименьшей плотности из 10,5-сут ЭП и из костного мозга обладают совершенно различными коэффициентами оседания в селезенке (0,05 и 0,12, соответственно)(181).Данные по скорости седиментации КОЕс эмбриональной и взрослой популяции показали, что КОЕс ЭП больше по размеру,чем костномозговые(123).Все эти данные в совокупности привели к многочисленным спекуляциям относительно смены клонов СКК в ходе эмбриогенеза.

КОЕсмеш. »представляющие собой субпопуляцию СКК, также присутствуют во всех роветворных органах зародыша(Ш, периферическая кровь и ЭП). Динамика изменения числа КОЕсмеш. в этих кроветворных органах схожа с таковой КОЕс: наибольшая концентрация этих клеток-предшественников в Ш наблюдается на 10 сут развития, в периферической крови - на 10-11 сут и в ЭП -на II-I2 сут (в 17-18-сут ЭП число предшественников мало) (146). Важным отличием кроветворения в ЭП и во взрослом костном мозге является то, что соотношение КОЕсмеш. и КОЕс в ЭП значительно Выше, чем в костном мозге (140, 180). Это может отражать способность к усиленной пролиферации и дифференциров-ке, свойственной СКК ЭП. КОЕсмеш. ЭП обладают гораздо меньшей способностью к самоподдержанию, чем КОЕсмеш. взрослого костного мозга, что явно отличает субпопуляции мультипотентных предшественников, выявляемых методом in vitro и in vivo последние, как указывалось выше, обладают значительно более высоким самоподдержанием в ЭП. Способность к самоподдержанию КОЕсмеш. может быть под контролем как внутренних, так и внешних факторов. Выделение двух субпопуляций КОЕсмеш. из 13-14-сут ЭП,-с высоким и низким самоподдержанием,- говорит о том,что внутренние и внешние факторы взаимодействуют: микроокружение пре-детерминирует способность КОЕсмеш. давать вторичные колонии, а каждая КОЕсмеш.(согласно стохастической модели) случайным образом "выбирает" путь между самоподдержанием и дифференци-ровкой (149).

Так же, как и КОЕс, большая часть КОЕсмеш. ЭП находится в пролиферативном цикле. КОЕсмеш. взрослого костного мозга больше по плотности и меньше по размеру, чем таковые ЭП; по мере "взросления" последней размер КОЕсмеш. уменьшается. Как и КОЕс ЭП, КОЕсмеш. обладают большей радиорезистентностью, чем их аналоги во взрослом костном мозге. (146, 148).

Предшественники эритропоэза в ЭП отличаются по многим свойствам от кооптированных в этом направлении клеток взрослого :костного мозга. Например, КОЕ-Э могут расти в отсутствие

ЭПСХ277) и более чувствительны к меньшим его дозам (264).

Как уже указывалось выше, КОЕ-ГМ появляются в ЭП на 10 сут развития. В период между 10 и 12 сут беременности общее содержание КОЕ-ГМ по данным Moore с соавторами (193) возрастает почти в 200 раз, а концентрация - в 5 раз (181). Максимальная концентрация КОЕ-ГМ в ЭП наблюдается на 12 (144) или 13 сут развития, затем к 15 сут резко падает до 10-сут уровня; далее количество КОЕ-ГМ на 10 ядерных клеток практически не изменяется (181) или продолжает незначительно уменьшаться (144) до момента рождения, снижаясь практически до 0 к II сут постнатального развития (X8I). По данным Metealf, Moore (181) концентрация КОЕ-ГМ в 15-18-сут ЭП составляет около 40/10^ ядерных клеток (источник КСА не указан); при оптимальной стимуля--ции КОЕ-ГМ КСА из постэндотоксиновой сыворотки в -18-сут ЭП это число - около 150/10^ клеток и близко к таковому костного маз-^ га (144).

Пролиферативная активность КОЕ-ГМ высока: около 30-50$ из них находится в s -фазе клеточного цикла (176). Однако у животных с длительным периодом беременности КОЕ-ГМ находятся ; вне пролиферативного цикла. Эта ситуация сохраняется до начала развития селезенки и костного мозга,которые подвергаются активной экспансии гранулоцитарно-макрофагальными элементами (194).

КОЕ-ГМ ранней ЭП обладают меньшей плавучей плотностью,чем таковые ЭП поздних сроков развития и взрослого костного мозга (176). При разделении клеток 12-сут ЭП по-скорости седиментации было выяснено, что КОЕ-ГМседиментируют быстрее (пики седиментации 9,4 и 7,7 мм/час), чем основные популяции клеток-предшественников 18-сут ЭП и взрослого костного мозга. Однако среди КОЕ-ГМ 18-сут ЭП присутствует минорная популяция с пиком седиментации 7,2 мм/час (144,176). Наиболее быстро седиментиру-ющие клетки (т.е. основная популяция КОЕ-ГМ 12-сут ЭП и минорная - 18-сут) оказываются более чувствительны к низким концентрациям КСА, чем меньшие по размеру КОЕ-ГМ (144).

Большой интерес представляет вопрос об источнике ГМ-КСФ в развивающемся эмбрионе. На ранних стадиях печеночного гемо-поэза и при завершении кроветворения в IM (10-13 сут развития) именно SM является главным, по-видимому, продуцентом КСФ. С увеличением срока беременности КСФ обнаруживают во все большем количестве тканей, что не удивительно, так как почти все ткани взрослого организма являются источниками этой активности (145). Следует отметить, что в исследовании Johnson с соавторами (145) ни фидерные слои, ни среда, кондиционированная клетками ЭП, не стимулировали рост взрослых или эмбриональных КОЕ-ГМ. Однако в супернатанте жидких культур кусочков 13-19-сут ЭП через несколько недель культивирования обнаруживается эритропоэ-тическая активность и КСФ; какие клетки ответственны за выработку этих активностей - окончательно не выяснено (93, 264,265), хотя было показано, что купферовские клетки взрослой печени (217) и макрофаги костного мозга и селезенки (153) продуцируют ЭПО; макрофаги также могут активно синтезировать ГМ-КСФ(176).

Многие исследователи отмечали парадоксальную ситуацию, складывающуюся в ЭП: несмотря на высокое содержание гранулоци-тарно-макрофагальных предшественников, особенно на ранних стадиях развития печени, в ней наблюдается явный недостаток более или менее дифференцированных клеток гранулоцитарного ряда. Слабую интенсивность гранулопоэза в ЭП можно объяснить некоторой предрасположенностью КОЕ-ГМ к дифференцировке в сторону образования макрофагов (194). Johnson с соавторами (144) показал, что при культивировании 12-сут ЭП образуется 65-75% макрофаг аль-ных колоний; при культивировании в присутствии одного и того же источника КСФ клетки-предшественники из взрослого костного мозга образуют 28% макрофагальных колоний, а клетки ЭП - 68#(III). Metealf (176) также отмечает, что КОЕ-ГМ ранней ЭП образуют больше' макрофагальных колоний вне зависимости от употребляемого источника КСФ. В более позднем периоде развития зародыша I

КОЕ-ГМ образуют больше гранулоцитарных колоний, чем КОЕ-ГМ ранней ЭП.

Вопрос о механизмах подобного рода сдвига в сторону макро-фагальной дифференцировки еще окончательно не решен, однако,показано, что КСФ из Ш способствует образованию большего процента макрофагальных колоний при культивировании и взрослого костного мозга, и ЭП (145).

На основании всего вышесказанного можно сделать вывод о том, что эмбриональные и взрослые КОК различаются по многим параметрам - способности к самоподдержанию, пролиферативной активности, чувствительности к стимуляторам, радиочувствительности, равмеру, плотности и проч. Более того, среди эмбриональных клеток-предшественников можно выделить 2(3?) субпопуляции с разными свойствами. Остается неясным, развивается ли в эмбрионе одна линия КОЕс и КОЕ-ГМ, по мере "взросления" изменяющаяся по свойствам, или же в онтогенезе происходит смена клонов СКК, связанная, возможно, со сменами плацдармов кроветворения. В этем отношении очень полезным оказался подход, позволяющий сочетать методы получения клонов - потомков ранних (БОЕ-Э) или поздних (КОЕ-Э) клеток-предшественников и биохимические методы, определяющие тип гемоглобина (эмбриональный, фетальный, взрослый) в образовавшихся клонах, В настоящее время получены многочисленные данные в пользу того, что переключение синтеза гемоглобина в онтогенезе мыши и человека происходит не за счет смены линий СКК. Было показано, например, что в кровотоке зародыша ранних стадий развития и в M (9-сут) присутствуют клетки, коммитиро-ванные к синтезу взрослого гемоглобина (38), а гуморальные факторы, присутствующие в эмбрионе после стадии 28 сомитов (инициация гемопоэза в печени) индуцируют в гемопоэтических клетках "включение" синтеза взрослого гемоглобина (68).

В работах с эмбриональной и неонатальной печенью человека, со взрослой периферической кровью и костным мозгсж.труппой Papayannopouiou было показано, что переключение синтеза гемоглобина с фетального на взрослый происходит на уровне комми-тированных предшественников, а, возможно, и мультипотентных предшественников; маловероятно, что это переключение происходит благодаря замещению линий СКК, скорее происходит репрограм-мирование дифференцировки клеток-предшественников благодаря внутренним или внешним факторам. По мере развития клетки-предшественники могут приобретать способность взаимодействия с регуляторами синтеза гемоглобина (128, 205). Эти и другие работы открывают возможность на молекулярном уровне решать вопросы клеточной дифференцировки. Так, Smithies (238) на основании изучения экспрессии глобиновых генов в эмбриональном и дефинитивном периоде развития (см.также-23) и на основании кло-нальных опытов выдвинул гипотезу, согласно которой переключение синтеза гемоглобинов в онтогенезе происходит в результате перемещения точки начала репликации вдоль р> -глобинового генного кластера. .

При соотнесении вышеизложенных данных с гипотезами внутри-и внезародышевого происхождения клеток-предшественников эмбриональной кроветворной ткани, можно заключить, что они говорят скорее в пользу последней.

• 4. Органные культуры гемопоэтических органов.

В настоящее время единственной культуральнок системой, позволяющей; длительное время поддерживать:кроветворение in vitro в эмбриональной печени является органная культура. Метод был модифицирован для этой кроветворной ткани Лурия Е.А. " в 1966 году (13).

Культивщювание на мшшшоровом фильтре по методу множественных органных культур позволяет одновременно на одной питательной среде выращивать большое количество эксплантатов (14).

Одним из важнейших факторов поддержания гемопоэза в культуре ЭП является помещение эксплантата на границу раздела двух фаз: газовой фазы и жидкой питательной среды (14). При помещении кусочков печени в жидкие культуры в них разрастается печеночная паренхима, эндотелиальные и эпителиальные клетки; несмотря на то, что uiatowski с соавторами (265) указывают на присутствие кроветворных клеток и их предшественников в культурах, количественно эти культуры не охарактеризованы и о длительном кроветворении в них не сообщается. Однако было выяснено, что клетки в жидких культурах ЭП вырабатывают эритропоэтическую активность (264, 276, 277), ГМ-КСФ и тромбопоэтический фактор (93), однако, какие клетки ответственны за выработку вышеперечисленных активностей,окончательно не ясно (265).

В органных культурах ЭП по мере культивирования производят смену питательной среды, причем среда кондиционируется культивируемыми клетками, поэтому оказалось целесообразным не менять ее полностью (15),

Представляет интерес поведение в культуре как гемопоэти-ческих клеток различной степени дифференцировки, так и паренхиматозных элементов, поскольку вопросы регуляции процессов кроветворения со стороны стромы находятся в центре внимания современных гематологов. Метод органного культивирования дает возможность изучать процесс кроветворения in vitro не только во фрагментах кроветворных органов, но и в суспензиях клеток их составляющих, что позволяет судить о важности пространственных взаимодействий клеток в целостном органе (18).

Паренхиматозные и кроветворные элементы в процессе культивирования претерпевают значительные изменения. Так, в 3-сут культурах ЭП, полученной от 16-19-сут эмбрионов, в центре эксплантата наблвдается некоторая дегенерация ткани, однако гранулоци-тарные, эритроидные, мегакариоцитарные и эпителиальные элементы сохраняются в периферических участках эксплантатов. В дальнейшем наблвдается разрастание эпителиальных мембран вокруг высаженного кусочка ЭП, причем эпителий в середине второй недели культивирования образует характерные структуры - балки из клеток полигональной формы, формируются желчные протоки. Обширные очаги кроветворения, содержащие до нескольких десятков тысяч клеток, располагаются между эпителиальными балками, а также над эпителиальным пластом, покрывая большую часть поверхности эксплантата. Число кроветворных клеток начинает уменьшаться с 4-5 нед. культивирования, однако, гемопоэз в культуре поддерживается свыше 2 мес. (22, 26, 32). Было показано, что наиболее длительное и активное кроветворение в культурах наблюдается при эксплантации в них печени 17-сут эмбрионов (26). Печеночная паренхима в культурах сохраняет способность . синтезировать, а также секретировать в среду оС -фетопротеин (22), угасание кроветворения совпадает с прекращением его синтеза, однако доказательств того, что этот сывороточный белок принимает участие в регуляции гемопоэза, не получено (32).

Как уже указывалось выше, ЭП является органом активного эритропоэза. Однако в органной культуре ЭП доля незрелых клеток эритроидного ряда значительно падает уже к 10 сут культивирования (7%), а с 16 сут морфологически различимых клеток эритроидного ряда практически не наблюдается (27). На 4-7 нед. культи- -вирования их доля составляет не более 1% (30). Доля гранулоци-тарных клеток, напротив, повышается с 9% в исходной ЭП до 3087$ после двух недель культивирования (30).В культуре значительно возрастает процент базофилов, моноцитов и макрофагов.

Кроветворные клетки в эксплантатах.обладают высокой про-лиферативной активностью с 5 по 19 сут культивирования (14). В состав пролиферативного пула входят миелобласты, промиелоциты, миелоциты: эти клетки подвергаются импульсному мечению 3Н-тими-дином. С помощью метода радиоавтографии было выяснено, что продолжительность жизненного цикла миелобластов, промиелоцитов и миелоцитов составляет менее 19 час, а время дифференцировки метамиелоцита в сегментоядерный лейкоцит составляет менее 19 -и более 7,5 час (32).

В 1969 году было показано, что в органной культуре ЭП поддерживаются КОЕс (7, 66), при этом они активно пролифериру-ют (24), хотя темп пролиферации по мере увеличения срока культивирования снижается. КОЕс из культуры образуют те же типы колоний в селезенках, что и КОЕс из ЭП. СКК из 30-сут культур полностью сохраняют способность защищать сверхсмертельно облученных мышей и не обнаруживают признаков лейкемической трансформации, СКК из культур дают потомство не только в кроветвореных, но и в лимфоидных органах, т.е. сохраняют свою полипотент-ность (26).

Метод органного культивирования позволяет изучить поведение КОЕс в культуре, взаимоотношения клеток-предшественников с их микроокружением. Так, КОЕс ЭП, культивируемые в течение 1213 сут in vitro, оказались чувствительными к действию плеторы, подобно КОЕс взрослого костного мозга (10). Хотя и неясно,какие КОЕс (уни- или мультипотентные - 165) на самом деле угнетаются в полицитемических мышах, тем не менее очевидно, что без смены мест кроветворения, в условиях неизменного по своему про-исхоздению микроокружения КОЕс могут качественно меняться.

Изучение органной культуры неодноклеточной суспензии клеток ЭП (18) показало, что в течение первых двух недель эта культура по многим показателям не отличалась от культуры, в которую эксплантировали фрагменты органа. За первые три дня происходит резкое падение как общего числа клеток (в 8 раз), так и числа КОЕс (в 3-4 раза), продолжающееся в течение следующих 7 сут в более медленном темпе. На 10-15 сут в органной суспензионной культуре количество клеток и КОЕс остается на постоянном уровне (18), в то время как в культуре с кусочками стабильное кроветворение может наблвдаться более 5 нед. культивирования (26, 32). В конце третьей недели культивирования кроветворение в суспензии ЭП по всем показателям снижено по сравнению с кроветворением во фрагментах - свидетельство того, что нарушение взаимодействий кроветворных и стромальных клеток влечет за собой нарушение поддержания кроветворения (18).

Как известно, в организме кроветворная ткань обладает хорошо выраженными свойствами восстановления после поврездающих воздействий. С помощью применения методики смывов было изучено . восртановление органных культур после потери части клеток (27,„. 28). Наибольшее число клеток смывается с поверхности эксплантатов на 2 сут культивирования, затем это количество резко снижается, но в дальнейшем падение замедляется и долгое время (вплоть до 39 сут) число клеток остается значительным. Динамика содержания КОЕс в смываемом слое иная, чем в глубоком слое, но они могут поддерживаться в верхней части культуры, по крайней мере в течение 25 сут (27). Дифференцированное изучение верхнего, смываемого слоя культуры и остатка (глубокого слоя) показало, что снижение числа клеток в культуре обусловлено в большей степени опустошением верхнего слоя, а глубокий слой содержит то же количество КОЕс, что и в контрольных культурах,не подвергавшихся смывам. Кроме того, в культурах обнаруживается, гетерогенность структуры эксплантата: концентрация КОЕс в глубоких слоях обычно в 3 раза выше, чем в поверхностном. Смывы не приводят к необратимому повреждению культуры и возможность повторения этой операции в течение длительного времени свидетельствует о способности к регенерации смываемого слоя. С помощью смывов удается увеличить выход КОЕс из культур до величин, в . несколько раз превосходящих исходные. Это дает возможность использовать повторные смывы для накопления кроветворных клеток и их предшественников путем, например, их консервирования (28).

7-8-сут КОЕс в смываемых слоях культур пролиферируют только в ранние сроки культивирования (3-9 сут), в то время как в нижних слоях эти КОК пролиферируют в течение 3-4 нед, при этом процент клеток, находящихся в s -фазе клеточного цикла, в разные сроки культивирования, варьирует в пределах от 19$ до -89%, Восстановление числа КОЕс в смываемом слое культуры объясняется передвижением их из глубоких слоев, поскольку через две недели после начала культивирования КОЕс смывов не пролифе-рируют. Неясно, за счет чего происходит потеря пролиферативной активности КОЕс верхних слоев культур (29). Во всяком случае,-понятно, что гетерогенность свойств КОЕс смывов и остатков отражает гетерогенность их микроокружения, которое, вероятно, способно регулировать пролиферативную активность КОЕс.

Со стороны микроокружения, однако, не происходит регуляции такой важной функции КОЕс, как,способность к самоподдержанию. Самоподдержание КОЕс одинаково как в смывах, так и в остатках культур и достаточно высоко. В этом отношении органная культура моделирует ситуацию in vivo : если во взрослом организме -самоподдержание КОЕс в костном мозге значительно, выше такового в крови, то в эмбрионе, как в печени, так и в крови, самоподдержание КОЕс одинаково. Именно этот.факт указывает на неполноценность кроветворных "ниш" ЭП - они не способны "блокировать" старение СКК. Таким образом, эмбриональное микроокружение вы- -полняет лишь функцию регуляции пролиферации КОЕс, но "консервирования возраста" СКК в "нишах" транзиторных эмбриональных органов (равно как и в органных культурах) не происходит (37).

Как уже указывалось выше, морфологически распознаваемые эритроидные клетки в культуре после двух недель культивирования практически не выявляются. Прекращение эритропоэза, по-видимому, нельзя объяснить только тем, что в питательной среде отсутствует достаточное количество ЭПО. Во-первых, клетки ЭП способны продуцировать эритропоэтинподобную активность (264, 276,

277), а во-вторых, добавление в культуру сыворотки анемичных животных не сопровождается активацией эритропоэза (20)» Эри-троидные клетки присутствуют в низкой концентрации (максимум-3$ на 16 сут культивщэования), и только в культурах, которые росли в среде тйГаутои-Н1 МБ 752/1. Несмотря на это, практически во все сроки культивирования в культурах присутствуют два класса эритроидных КОК - эритропоэтиннезависимые КОЕ-Эн и БОЕ-Эн (5-сут). Эти клетки-предшественники выявляются в плазменном сгустке в присутствии 10$ нормальной мышиной сыворотки. Средняя концентрация и соотношение уровней БОЕ-Эн и КОЕ-Эн предшественников в органных культурах вплоть до 8 не д. культивирования сохранялись такими же,как во взрослом костном моз-ге(23,2 К0Б-Эц/Ю5 и 3,1 БОЕ-Эн/Ю5) и ЭП (47,5 КОБ-Эн/Ю5 и 4,75 БОЕ-Эн/Ю5). Эритроидные предшественники выявлялись как в верхних,так и в нижних слоях эксплантатов(ЗО). Таким образом, отсутствие клеток эритроидного ряда - веский аргумент в пользу стохастической модели дифференцировки СКК.Елок эритропоэза в культурах,следовательно,связан не с нарушением дифференциро-вочных потенций культивируемых СКК,а с явлениями,происходящими на уровне клеток более зрелых,чем КОЕ-Эн.Возможно,что их дифференщгровка не праисходит из-за отсутствия необходимых межклеточных контактов.Таким образом,несмотря на стохастичность процесса дифференцировки ранних кроветворных клеток-предшест-венников,именно микроокружение определяет конечные этапы ге-мопоэтической дифференцировки, и следовательно,содержание клеток того или иного ряда в данном нативном или культивируемом органе.

Успешно культивщэовать можно ЭП не только мышей,но и человека (16)» В органных культурах ЭП человека поддерживаются . длительное время КОЕ-ГМ.Так же, как с культур ЭП мыши, с культур ЭП человека можно производить смывы кроветворных клеток, при этом число клеток и КОЕ-ГМ в верхних слоях эксплантатов выше, чем в остатках. Восстановление клеточности верхних слоев культур после смыва идет, по-видимому, за счет предшественников, локализованных в остатках. Манипуляция смыва позволяет извлекать большее число кроветворных клеток, чем из интактных, не подвергающихся подобного рода воздействиям, культур (16).

В настоящее время подобраны среды для культивирования фрагментов ЭП человека, удалось длительно поддерживать КОЕ-ГМ в культурах при использовании только гомологичных добавок к средам. Выяснено, что экстракт тканей зародыша человека оказывает благотворное влияние на поддержание КОЕ-ГМ в культурах (17).

В целом эти исследования показывают, что метод органного культивирования ЭП человека позволяет получать кроветворные клетки и их предшественники, принципиально пригодные для введения человеку, а применение метода повторных смывов увеличивает их выход - таким образом, существует возможность криоконсерви-рования полученных из культур кроветворных клеток (16).

В отличие от культивирования ЭП мыши, в органных культурах костного мозга кроветворение наблкщается лишь несколько дней (14). Меньшая длительность кроветворения в культурах костного мозга может быть обусловлена тем, что, в отличие от эмбрионально-печеночных, КОЕс взрослого костного мозга практически не пролиферируют активно ни в момент эксплантации, ни в процессе культивирования. Однако, как указывает А.М.Ракчеев (25), это не единственная причина прекращения в культуре костного мозга. При облучении костного мозга в дозе 250 рад КОЕс пролиферируют даже более активно, чем в ЭП, однако длительность кроветворения в культурах активированного костного мозга все же намного меньше, чем при культивировании ЭП. Это дает основание полагать, что при культивировании взрослого костного мозга создаются такие условия, при которых вероятность дифференцировки КОЕс превышает вероятность их пролиферации.

Тем не менее, органные культуры костного мозга оказываются полезной системой при изучении процессов кроветворения в костном мозге.человека. При эксплантации костного мозга из плоских костей человека в культурах наблюдается относительно длительное кроветворение и выраженный процесс остеогенеза. Клетки грануло-цитарного ряда в культурах активно пролиферируют- Однако гемо-поэз в органных культурах затухает через 3 нед., хотя в культурах и наблюдается выраженный остеогенез. В культурах костного мозга кролика, несмотря на отсутствие развития.остеогенной ткани, длительность поддержания кроветворения такая же, как в культурах костного мозга человека, что показывает, что остеогенная ткань не является обязательным компонентом кроветворного микроокружения. Однако наблюдение процессов остеогенеза в органных-культурах многих видов млекопитающих (человека, хомячка, морской свинки, мыши) может дать полезную информацию о процессах взаимодействий стромальных элементов между собой и с кроветворными- клетками (32). С помощью метода органных культур оказалось возможным культивирование не только нормального костного мозга, но и костного мозга больных лейкозами (6), а также изучение влияния гуморальных факторов, в частности, сывороток больных различными видами лейкозов, на процессы кроветворения (33).Однако, для поддержания процессов кроветворения в культурах in -vitro гораздо более перспективными оказались жидкие культуры костного мозга, которые будут описаны ниже.

5. Длительная культура клеток костного мозга

Несколько лет тому назад Dexter с соавторами (77) сообщили о культуральной системе, в которой в течение длительного времени поддерживается гемопоэз. При посадке костного мозга мыши кусочками во флаконы с питательной средой, содержащей сыворотку, образуется подслой прилипающих клеток, на который через 2-3 нед. культивирования осуществляется вторая посадка костного мозга. Гемопоэз происходит как в прилипающей, так и в суспензионной фракциях культуры. Еженедельно из культуры-удаляется 1/2 суспензии (77) или вся суспензионная фракция (89) и добавляется эквивалентное количество свежей питательной* среды. Введение гидрокортизона в питательную среду улучшает свойства культуры (возможно, замещает определенный недостаток стероидных гормонов сыворотки - 75) и отменяет необходимость вторичной посадки костного мозга (37). В этих культурах осуществляется продукция функционально нормальных КОЕс, КОЕсмеш., КОЕ-ГМ, КОЕ-мег. и, несмотря на отсутствие эритро- и лимфопоэза, - БОЕ-Э и клеток- • предшественников Т- и В-лимфоцитов (75, 222). Длительность гемо-поэза в культурах зависит от применяемой сыворотки (166), ее концентрации и образца (86, 89), от используемой линии мышей -доноров костного мозга (112) и, прежде всего, опосредуется образованием в культуре так называемого "композитного" подслоя, состоящего из нескольких типов клеток (75). Продолжительность гемопоэза колеблется, таким образом, от 6 (124) до 15-30 (П4) и 20-41 недели (112). В культуре можно выделить три стадии ее функционирования: I) начальная стадия характеризуется образованием композитного подслоя с одновременным уменьшением числа КОК и общей клеточности культуры в течение' 2-3 недель; 2) возрастание числа кроветворных клеток-предшественников и стабилизация их уровня в течение последующих 6 и более недель; 3) спад гемопоэтической активности культуры (225), сопровождающийся увеличением в ней процента макрофагальных клеток (166,221,274). Несмотря на еженедельную демипопуляцию непршшпающего слоя, в культуре не уменьшается содержание клеток-предшественников, а, наоборот, на второй стадии развития культуры в ней происходит экстенсивный гемопоэз. Как уже указывалось выше, в длительных культурах, несмотря на присутствие БОЕ-Э, КОЕсмеш. и мак -Рэ-БОЕ-Э (61,133), отсутствуют более зрелые элементы эритроид-ного ряда, включая 4-сут. БОЕ-Э и КОЕ-Э (87). В культурах осуществляется в основном грануломоноцитопоэз, а мегакариоцитопоэз не заканчивается образованием тромбоцитов (222). Соотношение продукции КОЕс, КОЕ-ГМ и зрелых клеток близко к таковому in vivo: так, на I КОЕс приходится около 10 КОЕ-ГМ (76,78) (это соотношение колеблется от 1:8 до 1:30 - 253), а на каждую шет^ку-предшественнипу грануломоноцитопоэза приходится от 100 (78) до 1000 зрелых клеток (76). Число КОЕс, БОЕ-Э и КОЕ-ГМ изменяется, как правило, параллельно изменению клеточности культур, таким образом, концентрация клеток-предшественников остается постоянной (86). В неприлипающем слое культуры до 80$ клеток составляют гранулоциты всех стадий созревания (до 40$ приходится на незрелые гранулоциты - 274) и около 20$ клеток составляют Maiqpo-фаги. Среди гемопоэтических клеток прилипающего слоя более 50$ клеток - мононуклеары, основная масса клеток гранулоцитарного ряда представлена промиелоцитами и миеловдтами (221,225).

Длительная культура костного мозга оказалась в высшей степени полезной моделью для изучения гуморальных и клеточных воздействий на процессы пролиферации и дифференцировки различных КОК, а также для изучения взаимодействия стромальных и кроветворных элементов. Было показано, что вслед за сменой среды демипопуляция культуры) 40% КОЕс в обеих фракциях культуры находятся в фазе синтеза ДНК. Этот процесс падает со временем после "подкормки" культуры и через 5-7 сут достигает 10$. Следующая смена среды вновь стимулирует пролиферацию КОЕс (221). Оказалось, что после "подкормки" в культуре наблкщается высокий уровень стимулятора пролиферации КОЕс, аналогичного "фактору Ш", выделенному из регенерирующего костного мозга (его МБ около 30-50 кД), а через 8-10 сут после демипопуляция неприлипающеи фракции культуры (КОЕс - вне пролиферативного цикла) обнаруживается в высоких концентрациях "фактор 1У", ингибирующий синтез ДНК, аналогичный выделяемому костномозговыми клетками нормального организма (его МВ приблизительно 50-100 кД). Добавление стимулятора или ингибитора в культуру ведет к увеличению или, соответственно, уменьшению процента КОЕс, находящихся в Б -фазе клеточного цикла (258). Таким образом, пролиферация СКК в культуре находится под контролем специфических активное--тей, воздействующих только на КОЕс (пролиферативный статус КОБОЛ в культуре не менялся), и выделяемых, очевидно, клетками прилипающего слоя (76,80,258). Способность к самоподдержанию -КОЕс падает в течение первых трех недель культивирования, а затем остается практически неизменной в течение последующих 2,5 мес. Принимая во внимание гипотезу кроветворных "ниш" Ско-филда, можно, таким образом, сказать, что на первой стадии культивирования подслой не обеспечивает функцию "ниш" для СКК, однако сформированное микроокружение в течение недель "консервирует" самоподдерживающую способность СКК, несмотря на их высокую пролиферативную активность. Необходимо отметить, что самоподдержание КОЕс выше в прилипающем слое культуры, нежели в ее суспензионной фракции, таким образом, культура является моделью ситуации "КОЕс: костный мозг - кровь" (37).

Присутствие в культуре всех типов предшественников, несмотря на дифференцировку только клеток, коммитированных к гранул оцитопоэзу, говорит в пользу стохастической модели дифферен-цировки СКЕС. Эритропоэз в культурах может быть индуцирован несколькими способами. Добавление ЕЛА в бессывороточные культуры ведет к образованию 4-сут БОЕ-Э, но не КОЕ-Э (88). При добавлении ЭПО в культуру образуются эти два типа предшественников, однако морфологически распознаваемых эритроцитов нет. Механическое потряхивание культур, предотвращающее прилипание клеток-предшественников, ведет к законченному эритропоэзу (87). Образование зрелых эритроцитов вызывается также добавлением в-культуру сыворотки анемичных мышей. Эритроциты находятся в прилипающем слое культуры в ассоциации с центральным макрофагом (аналогично "островкам" Вевв1в. ). Интересен тот факт, что увеличение продукции эритроцитов сопровождается уменьшением грану-ломоноцитопоэза, при этом число КОЕ-ГМ остается на контрольном уровне. Этот эффект, вероятно, опосредован стромальными клетками, так как добавление сыворотки ведет к редукции липидов в адипоцитах и уменьшению количества последних, в то же время,в контрольных культурах места активного гранулопоэза ассоциированы именно с этими клетками (76,80). Отсюда следует важный вывод о том, что в культуре, как и в нативном костном мозге, микроокружение структурировано на дискретные области для разви— тия разных линий гемопоэза (76).

Относительно иммунологической компетентности клеток из длительных культур существуют противоречивые данные (37). Уже через неделю после посадки отсутствуют Т- и В-лимфоциты, однако, популяции их клеток-предшественников.и пре-Т-лимфоцитов персис-тируют в культурах. Клетки из культур полностью восстанавливают гемо- и лимфопоэз в облученных реципиентах (150) (вторичная болезнь не развивается - 75). Однако при введении мышам линии w/wv одинаковых количеств КОЕс свежего или культивируемого кон-генного нормального костного мозга, реципиенты во втором случае не "излечивались" полностью от анемии (250).

Подслой декстеровских культур составляет несколько типов клеток, относящихся как к стромальным, так и к гемопоэтическим линиям дифференцировки. Среди стромальных клеток выделяют эпи--телиовдные, фибробластоподобные и жировые клетки (77). В детальных исследованиях с помощью методов.иммунофлуopeсценции показано, что в культурах содержатся фибробласты и эпителиоид- . ные клетки (49, 203, 278). Доказательством того факта, что подслой культур образован клетками стромального, а не гемопоэтического происхождения, служат опыты Bentley с соавт.(48) по посадке в культуру костного мозга облученных мышей, восстановленных нормальным маркированным костным мозгом. Подслой .в таких культурах образован клетками реципиента. При посадке клеток костного мозга больных острым нелимфобластным лейкозом, гете- -розиготных по ферменту глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназе (Г6ЩДГ), стромальные клетки в культуре содержали оба изофермента, в то время как лейкозные клетки (моноклонального происхождения) содержали лишь один тип фермента (100)« В отличие от результатов--Bentley с соавт.(48) и Fiaikow (100), при посадке в.культуру костного мозга человека, которому осуществляли пересадку костного мозга от донора, противоположного по полу, стромальный подслой культур образовывался донорскими клетками. Это может означать, что I) существует единая стволовая клетка.для гемопоэ-тических и стромальных линий дифференцировки или 2). стромальные клетки-предшественники трансплантабельны (83). Вопрос о транс— плантабельности клеток-предшественников стромы и их связи с ге-мопоэтическими клетками в настоящее время далек от разрешения и активно разрабатывается.

Нормальное функционирование подслоя является необходимым условием для поддержания гемопоэза в культурах. Так, подслой, образованный костным мозгом мышей линии si/sid , характеризующихся дефектом стромальных клеток, не способен поддерживать ге-мопоэз в культурах. В то же время, при посадке в культуру костного мозга мышей w/wv (дефект КОЕс) подслой таких культур обеспечивает кроветворение, при условии, что для вторичной посадки использован костный мозг Sl/Sld (75,250). Таким образом, пролиферация СКК in vitro обеспечивается взаимодействием с кроветворным микроокружением.

Подслой, необходимый для поддержания гемопоэза в.культуре, может быть образован только стромальными элементами взрослого костного мозга. Так, при использовании клеток ЭП, селезенки, эмбриональных фибробластов в качестве подслоя, кроветворение в таких культурах не происходит. Напротив, при посадке клеток ЗП на костно-мозговой подслой в культурах идет активный гемопоэз. (224). В связи с этим необходимо отметить, что при посадке кусочков ЭП под капсулу почки очаг гемопоэза не образуется, что указывает на неполноценность микроокружения как в фетальном, так и во взрослом гемопоэтическом органе (37, 266).

Успешное длительное культивирование в "классических" культурах декстеровского типа удается лишь при посадке костного мозга кусочками. При. высевании в культуральные флаконы одноклеточной взвеси композитного подслоя не образуется. Вероятно, при такой посадке происходит самоубийственная дифференцировка стромальных предшественников, при этом не реализуется все многообразие их дифференцировочных потенций (3,65). Возможность того, что часть предшественников в такиух условиях погибает, маловероятна, так как в особых условиях (при посадке клеток взвесью в коллагеновый гель, служащий матриксом для стромаль-ных клеток) осуществляется не только пролиферация всех типов стромальных клеток, но и активный гемопоэз (156). Видимо,стро-мальные предшественники нуждаются в межклеточных контактах для полноценной реализации своих дифференцировочных потенций. Имеются, однако, свидетельства о том, что разобщенные клетки костного мозга (270) или суспензионной фракции длительных культур (248) также способны формировать подслой клеток, поддерживающий пролиферацию СКК.

При посадке подслоя культур декстеровского типа под капсулу почки мышей-реципиентов образуются эктопические очаги кроветворения, строма которых образована клетками донорского происхождения, а кроветворные клетки - реципиентского» Радиочувствительность стромальных предшественников подслоя культур незначительно отличается от таковой взрослого костного мозга (129).Однако облучение костного мозга дозой 5 Гр и посадка его в культуру не приводит к образованию композитного подслоя, что говорит, возможно, о большей "ранимости" стромальных клеток-предшественников, чем это принято считать (252), Подслой только, достаточно "молодых" культур способен к построению кости в эктопических очагах; в очагах, образованных подслоями из более длительных культур, несмотря на обширный гемопоэз, кости,как правило, нет. Отсюда следуют два важных вывода: I) кость - не обязательный компонент кроветворного микроокружения; 2) возможно, существуют два отдельных предшественника для костномозговой стромы и кости собственно (129).

Получены доказательства взаимовлияния стропильных и гемо-поэтических элементов в культурах. Наличие дефектного кроветворения серьезно отражалось на функционировании клеток-предшественников стромы (3,37). При изучении влияния стромы на кроветворные клетки было показано, что строма старых мышей хуже поддерживает СКК в культуре, а строма молодых мышей обеспечивает лучшее самоподдержание КОЕс (73).

Влияние на гемопоэтические элементы со стороны стромы может осуществляться как путем межклеточных взаимодействий, так и через гуморальные факторы. В связи с этим интересно, каким воздействиям подвергаются клетки-предшественники грануломоноцито— поэза в длительных культурах костного мозга.

В первой работе Dexter с соавт. (77) сообщалось, что в супернатанте длительных культур отсутствует ГМ-КСА, а добавление экзогенной КСА ведет к быстрому уменьшению числа гранулоцитов--и КОЕс и увеличению продукции макрофагов. Отсутствие КСА в культуре являлось веским аргументом в пользу гипотезы о том, что КСА (КСФ) не является гранулопоэтином in vivo. Однако через, несколько лет появились работы, показывающие, что в культурах КСА все же вырабатывается. Из прилипающего слоя культур были получены линии фибробластоподобных клеток, аккумулирующие жир,сходные по морфологии с костномозговыми адипоцитами (157) или отличающиеся от них (196); клетки этих линий продуцировали КСА в культуральные среды или служили эффективным фидером для колоний гранулоцитов и макрофагов в агаровом геле. Действие КСА таких культур полно.стью нейтрализовалось добавлением в агаровые культуры антисыворотки к . L-клеточному КСФ и, таким образом,было показано, что выделяемая пре- и адипоцитами субстанция иммуно--логически аналогична L-клеточному КСФ. (157, 218). Следует отметить, однако, что КСА из вышеописанных культур активна лишь в отношении КОЕ-ГМ взрослого костного мозга, но не ЭП (157). При посадке костного мозга в агаровой среде на слой прилипающих клеток длительных культур с неактивным гемопоэзом, в агаре образуется значительное число гранулоцитарно-макрофагальных колоний (эффективность колониеобразования сравнима с таковой при использовании в качестве КСА постэдцотоксиновой сыворотки). При этом уровень КСА был ниже в культурах с активным гемопоэзом, что указывает на взаимосвязь между выработкой КСА и интенсивностью грануломоноцитопоэза, В супернатантах культур, -активных в гемопоэтическом отношении, ингибитор колониеобразо^ вания не выявлялся, однако инкубирование в течение суток над прилипающим слоем этих культур экзогенной КСА, ведет к падению ее активности (125). Таким образом, в культурах обнаруживаются, по крайней мере короткодистантные регуляторы грануло-поэза.

При исследовании супернатантов декстеровских культур, ведущихся в трех лабораториях мира, с помощью радиоиммунологи- -ческого метода было показано, что все культуры содержат то или иное количество КСА (в среднем - 91 ед/мл). Выяснилось,что в некоторых культурах КСА можно определить "биологическим" путем, то есть при культивировании клеток костного мозга в присутствии среды из длительной культуры. "Биологическая" КСА, как правило, невелика. При удалении низкомолекулярных ингибиторов из супернатантов культур КСА в некоторых из них возрастала. Было показано также, что в некоторых культурах содержится высокомолекулярный ингибитор КОЕ-ГМ (219). Obion с соавт. (203) разделяли клетки прилипающего слоя культур по скорости седиментации и показали, что КСА продуцируется быстроседиментирующими клетками, среди которых более 65% составляли моноциты, менее 30% - фибробласты и около Ъ% приходилось на эндоте-лиальные клетки. Субпопуляция клеток неприлипающей фракции культуры выделяла ингибитор КОЕ-ГМ. Таким образом, в культурах осуществляется гуморальная регуляция грануломоноцитопоэза; какие именно клеточные элементы ответственны за выработку факторов регуляции и как осуществляется взаимосвязь между клетка-. ми-продуцентами и клетками-мишенями не достаточно ясно. Добавление этиламина (ингибитора эццоцитоза, концентрирующегося в лизосомах) в культуру ведет к редукции числа КОЕ-ГМ и появлению ингибиторной активности в культуральной среде (252). ТауаввоИ (252) связывает появление ингибитора грануломоноцитопоэза в культурах с изменениями в лизосомах-макрофагов.

В супернатантах длительных культур костного мозга содержится Мег-КСА (273). Вопрос о гуморальных регуляторах других ■ линий дифференцировки пока неясен. Клетки длительных культур, в принципе, способны к выработке БПА или ингибитора эритропоэ-за, неясно лишь, осуществляют ли-они синтез в условиях нормального культивирования (88).

Добавление в культуру таких ГМ-КСА, как сред, кондиционированных Ъ -клетками или клетками линии тиж-З ,ведет к за- -метным изменениям в структуре прилипающего слоя-, значительному сокращению длительности гемопоэза в культурах и к накоплению в них макрофагов (78, 274). Однако этот эффект не опосредован действием собственно КСФ; так, добавление в культуру КСА, ней- ■ трализованной антисывороткой к ь -клеточному КСФ, ведет к быстрому упадку кроветворения в культурах.(78). Добавление - очищенного КСФ или не влияет на культуру (78, 274), или же увеличивает клеточность и число КОЕ-ГМ в ней, не влияя на число

KOEc (274). При удалении неприлипающих клеток из культур и воздействии на них КСФ наблюдается значительное увеличение. -грануломоноцитопоэза в субкультурах, что говорит о том, что КСФ способен воздействовать на культивируемые клетки только в отсутствии клеток стромы (274). Добавление антисыворотки к КСФ в культуры также не влияло на грануломоноцитопоэз в них, лишь иногда увеличивалась общая клеточность культур (78). Таким образом, в культурах происходят интенсивные взаимодействия стромальных и гранулопоэтических клеток, на которые почти не влияют экзогенные стимуляторы или ингибиторы грануломоноцито-поэза.

Качество длительных культур костного мозга человека хуже, чем мыши (161). Длительность гемопоэза в культурах костного мозга человека относительно невелика и колеблется от 6 (124) до 9-10 недель (130, 262). В культурах поддерживается пролиферация КОЕсмеш. - до 4-5 недель (216), КОЕ-ГМ - до 6-9 недель (124, 130), БОЕ-Э - до 5 (130) - 16 недель (216) и КОЕ-Э - до 2-3 недель по данным Powell с соавт.(216) и до 4-9 недель по данным Hocking с соавт.ЦЗО). Культуры содержат также клетки-предшественники Т-лимфоцитов- (262), Е-розеткообразующие клетки (130, 262). Как и в культурах костного мозга мыши, в -человеческих культурах в течение нескольких недель находятся гранулоциты всех стадий созревания, а зрелых эритроцитов нет; стромальный подслой состоит из фибробластов, эндотелиальных и жировых клеток (100, 130). В супернатантах некоторых культур -обнаруживают низкий уровень КСА, определяемой биологическим методом (130).

Система длительного культивирования костного мозга оказалась очень удобной моделью для изучения воздействия на гемопоэз различных алкилирующих агентов (248), стимуляторов гемопо-эза (116, 240), химических лейкозогенов (75) и различных вирусов, вызывающих гемопоэтические дисплазии (79, 112). Из дексте-ровских культур были получены клеточные линии с различным: набором дифференцировок, включая клетки с би/потентными свойствами (79) или мультипотентными свойствами (228), причем рост всех линий зависел от фактора, присутствующего в среде, кондиционированной клетками линии кгаш-з, или клетками селезенки мыши, стимулированными митогеном лаксона (114). Изучение механизмов воздействия различных вирусов или их компонентов на клетки-мишени уже сейчас позволяет ответить на некоторые вопросы, касающиеся этиологии лейкозов (79, 112, 245).

Есть основания полагать, что сочетание метода длительного культивирования с другими методами современной гематологии, вирусологии и молекулярной биологии в течение ближайших лет . позволит решить многие принципиальные вопросы .нормального и патологического кроветворения. .

В отечественной и зарубежной литературе по экспериментальной гематологии мы не можем найти ответы на ряц важных вопросов, касающихся свойств кроветворных клеток-предшественников и регуляции;процессов их пролиферации и дифференцировки. Так, остается неясным, существуют ли в ходе пренатального развития субпопуляции КОЕе, различающиеся по своим дифференцировочным свойствам, аналогичные тем, существование которых было показано в костном мозге взрослых мышей (165). Если эти категории КОЕс выделяются и в главном органе внутризародышевого гемопоэ-за - эмбриональной печени, то различаются ли они по таким важным свойствам, как пролиферативная активность или чувствительность к радиационному воздействию. Возможно ли поддеркание обеих категорий КОЕс в органной культуре Э1Г- системе in vitro f в которой длительное время осуществляется кроветворение. Хотя было показано, что 7-8-суточные КОЕс долгое время содержатся в органной культуре, до сих пор не было известно о поддержании клеток-предшественников гранулоцитов и макрофагов в этих культурах, несмотря на данные о смене кроветворения'в них с эри-трфа грануломоноцитопо э з.

Для длительных культур костного мозга была выявлена существенная роль стромальных элементов культур в регуляции процессов пролиферации и дифференцировки КОЕс и гранулоцитарно-макрофагальных предшественников. Воздействие стимуляторов или ингибиторов КОЕ-ГМ не оказывало существенного влияния на кроветворение в жидких культурах костного мозга именно благодаря локальному (со стороны стромы) характеру регуляции грануломоноцитопо эза. Однако до сих пор подобного рода влияния не были изучены в другой системе, позволяющей в течение длительного времени поддерживать гемопоэз 'in vitro , а именно, в органных культурах ЗП мыши.

МАТЕРИМЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ •

I. Получение клеток

Для исследования колониеобразующей способности клеток-предшественников in vitro (в полутвердом агаре) и in vivo (в агаровых диффузионных камерах или в селезенках смертельно облученных мышей) использовали: а) костный мозг взрослых мышей; б) печень мышиных эмбрионов; в) органную культуру печени эмбрионов мыши.

При приготовлении клеточных суспензий использовали какую-либо из сред для культивирования клеток ( REMI 1640, Se-rumless, Waymouth 752/1 или среду Игла) с добавлением

5-10% эмбриональной телячьей или телячьей сыворотки, 1% IM буфера Hepes и 0,5% раствора гентамицина (10 мг/мл).

Костный мозг из бедренных костей 6-12-недельных мышей линии СВА или (овАхС57В1 ) Р1 вымывали 1-2 мл среды и суспендировали при помощи шприца и иглы.

Для получения мышиных эмбрионов, самцов линии СВА подсаживали к самкам СВА или С57В1 на 8-20 час, по истечении которых самцов отсаживали, считая этот день нулевым днем беременности.

Печень эмбрионов измельчали в стеклянном гомогенизаторе в среде (на льду или при комнатной температуре), а затем клеточную суспензию фильтровали через двойной слой марли.

Число ядерных клеток просчитывали в счетной камере, используя 3% уксусную кислоту с 0,1% генцианвиолета.

Методика извлечения клеток из органной культуры эмбриональной печени (ЭП) мышей описана ниже.

2. Органная культура 17-. 18-дневной эмбриональной печени мыши

Органную культуру вели по методу Лурия Е.А. (13), модификсированному Н.Л. Самойлиной (28).

Миллипоровый фильтр ( aawp, диаметр пор 0,8 мкм) помещали на сетку из капроновой лески, натянутую на пластмассовое кольцо. Кольцо вкладывали в пластиковую чашку Петри ( Plow , диаметр 5 см), содержащую 7-8 мл питательной среды таким образом, чтобы фильтр оказался на поверхности питательной смеси. Смену 1/2 объема среды производили 2-3 раза в неделю. Печень 17-, 18-сут эмбрионов^ мышей разрезали на 10-16 кусочков и по 8-12 фрагментов помещали на поверхность фильтра. Культивирование вели во влажных камерах с Ъ% COg при 37°С.

Питательные среды, используемые в органных культурах,состояли из следующих компонентов: среды WaymouthMB 752/1 или Serumless Medium (Gibco) с добавлением аскорбината натрия и глюкозы до конечной концентрации 75 мг% и 500 мг$, соответственно, 20% телячьей или лошадиной сыворотки, 1% L- глутами-на (200 мМ), 2% мышиной сыворотки, 0,5$ раствора гентамицина, 2 или 10$ куриного эмбрионального экстракта (КЭЭ).

При проверке воздействия на органные культуры неспецифического ингибитора грануломоноцитопоэза - КЭЭ, или колоние-стимулирующей активности (КСА), контрольные культуры не содержали КЭЭ, а в опытные культуры добавляли соответственно 2% КЭЭ или 5-10$ среды, кондиционированной клетками селезенки мышей.

Пятидесятипроцентный КЭЭ приготовляли по общепринятой методике (19), используя II-12-сут декапитированных куриных эмбрионов. Получение- среды, кондиционированной клетками селезенки описано ниже (раздел 4 "Материалов и методов").

Кроветворные клетки верхнего слоя эксплантатов смывали струей среды. В зависимости от задачи опыта, после смыва поверхностных клеток, "остатки" продолжали культивировать или же соскабливали с поверхности фильтра, измельчали в среде в стеклянном гомогенизаторе (на льду или при комнатной температуре) , а затем клеточную суспензию фильтровали через двойной слой марли. В ряде случаев культуры снимали целиком, производя над ними те же операции, что и для "остатков" культур.

В некоторых опытах клетки из культур центрифуговали на цитоцентрифуге (Sakura ); мазки фиксировали метиловым спиртом и окрашивали азур-эозином по Романовскому.

В суспензиях клеток, извлеченных из культур, число жизнеспособных клеток подсчитывали с трипановым синим в счетной камере.

3. Метод агаровых диффузионных камер

В опытах использовали диффузионные камеры в модификации Gordon (107). К пластиковому кольцу высотой 2,5 - 3 мм приклеивали прозрачное донышко из органического стекла, а на другую сторону кольца - миллипоровый фильтр (диаметр пор - 0,22 мкм). Камеры стерилизовали на ft -установке РПП-IOO, где ис

То7 точником излучения служил С а (мощность - 1,96 Гр/сек) в дозе Зх104 Гр.

Ростовая среда для клеток в агаровых диффузионных камерах (АДК) состояла из среды Игла, 20$ эмбриональной телячьей или лошадиной сыворотки, 2$ IM буфера Нерев Д$ L -глутамина (200 мМ), 5 мг$ канамицина и 0,6$ агара ( Difco ). Ростовую среду смешивали с равным количеством клеточной суспензии и шприцем вводили в камеры через небольшое отверстие в кольце -по 0,2-0,25 мл в каждую камеру. Отверстие в кольце заклеивали, а камеры до трансплантации держали в пластиковых чашках Петри с небольшим количеством питательной среды.

В качестве реципиентов диффузионных камер использовали

4-6-месячных мышей, сингенных донорам. За 4-5 час до введения камер, мышей-реципиентов облучали ^ -лучами в дозе 9 Гр на" цезиевой установке ИПК, состоящей из 4 радиально расположенных источников -^Св (мощность - 0,2 Гр/мин).

За 5-30 мин до трансплантации камер в брюшную полость мышам вводили внутрибрюшинно 0,3-0,4 мл 1% раствора гексена-ла на физиологическом растворе. Помещали по 2, иногда по I камере в мышь.

Длительность культивирования АДК - 7 сут, после чего мы-" шей забивали дислокацией шейных позвонков. С камер бритвой снимали миллипоровый фильтр и просчитывали число колоний и кластеров под инвертированным микроскопом.

4. Клонирование кроветворных клеток в полутвердой агаровой среде in vitro

Колоннеобразующие единицы гранулоцитов и макрофагов (КОЕ-ГМ) определяли методом агаровых культур (181) в модификации Н.Ф.Кондратенко, С.И.Шерешкова (9). Питательная среда" (на основе среды Dulbecco MEM) содержала""25$ эмбриональной телячьей сыворотки, 3$ бикарбоната натрия (5$ раствор), 0,4:% ЮОх заменимых аминокислот, 0,4$ L-глутамина, 0,4$ пи-рувата натрия (100 мМ), 0,6$ гентамицина (10 мг/мл), 2$ I М буфера нерев ,0.3$ агара ( Difco ) и 10$'КСА. Питательную среду смешивали с клеточной суспензией в■соотношении 10:1. Культивирование вели в закрытой системе (пробирки Лейтона) при 37°С в течение 7 сут. На кадцую экспериментальную точку сажали, как правило, 3-4 пробирки.

В качестве КСА в агаровых культурах использовали сыворотку мышей линий СБА или (СВАхС57В 1) Р1 , получивших за 3-4 часа до забора крови внутривенную инъекцию эндотоксина.

Мышам вводили по 2,5-3 МДЦ пирогенала (липополисахарида, полученного из культуры Salmonella typhi ), растворенного в 0,2-0,25 мл физиологического раствора.

Среду, кондиционированную клетками селезенки (селезеночная кондиционная среда - СКС (142)), использовали в качестве КСА в некоторых агаровых культурах, а также для изучения воздействия КСА на кроветворение в органных культурах ЭП. СКС получали следующим образом: селезенки мышей линии С57В 1 измельчали в стеклянном гомогенизаторе, отмывали и после подо счета клеток по 2x10 клеток добавляли на I мл среды RPMi 1640 со следующими добавками: 2,5% эмбриональной телячьей сыворотки, 2,5% инактивированной (56°С, 30 мин) сыворотки доноров 1У (AB) группы, 1% L-глутамина, 1% буфера Нереs , 0,5% раствора гентамицина, 10*"% 2-меркаптоэтанола и 5 мкл/мл растворенного в 5 мл воды экстракта лаконоса ( Pokeweed Mitogen, Gibco ). После 7 сут культивирования в закрытых флаконах при температуре 37°С, среду центрифугировали (1500 об/мин 30 мин или 15000 об/мин 10 мин). Супернатанты из культур хранили при -20°С. В некоторые агаровые культуры, а также в органные культуры добавляли сконцентрированные в 4-6 раз супернатанты. Концентрирование проводили на установке фирмы Amicon через фильтры Ш 10 (Amicon ). с целью выявления колоние-образующих клеток-предшественников различных классов из 7-и II-суточных селезеночных колоний (см.ниже) использовали метилцеллулозные культуры (опыты проводили совместно с Н.И. Дризе, И.Л.Чертковым). Культуральная среда (на основе среды Dulbecco MEv'l) содержала 25% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% L-глутамина, 0,5% антибиотиков, 12,5% бычьего сывороточного альбумина (10% раствор, sigma ), 25% СКС, 2,5% сыворотки анемичных мышей, 0,8$ метилцеллулозы. Колонии просчитывали на II сутки культивирования.

5. Подсчет клеточных агрегатов в диффузионных камерах и в агаровых культурах in vitro

Подсчет числа колоний (агрегатов, содержащих более 50 клеток) и кластеров (агрегатов, содержащих от 4 до 50 клеток) производили под инвертированным микроскопом. Результаты опытов выражали в числах колониеобразующих единиц ДДК (КОЕадк) и КОЕ-ГМ для агаровой системы in vitro.

В целях изучения клеточного состава колоний из агаровых диффузионных камер, их содержимое фиксировали в течение I часа в 2,5$ растворе глютаральдегида, промывали водой, и после извлечения под инвертированным микроскопом отдельных колоний окрашивали их азур-эозином или 0,6$ орсеином в 60$ уксусной кислоте. Эритроидные колонии в камерах выявляли при помощи окраски in situ бензидином (0,2$ раствор бензидина в 0,5$ растворе уксусной кислоты с добавлением 0,4$ концентрированного раствора пергидроля).

Клеточный состав колоний агаровых культур in vitro изучали следующим образом: в пробирки Лейтона наливали около I мл 2,5$ раствора глютаральдегвда на 20-30 мин; после удаления фиксатора содержимое пробирок несколько раз промывали физиологическим раствором, помещали на предметное стекло и покрывали пленкой для электрофореза (для равномерного высыхания препарата). После высыхания пленку снимали, предварительно смачивая ее водой, препарат вновь подсушивали и окрашивали азур-эозином.

6. Определение колониеобразующих единиц селезенки (КОЕс)

КОЕс определяли по методу Till и McCulloch (261). Сингенных мышей облучали в дозе 12-13 Гр на цезиевой установке ИПК и через 2-5 час после облучения внутривенно вводили необходимое количество кроветворных клеток. Как правило, колонии подсчитывали на фиксированных в жидкости Буэна селезенках через 7-8 сут после введения клеток; в части случаев колонии в селезенках учитывали и на II. сут после введения клеток. На каждую экспериментальную точку приходилось 8-10 реципиентов. Среднее число эндогенных колоний по данным многих опытов составляет 0,24± 0,07 колоний/селезенку.

С целью доказательства транзиторной природы колоний, регистрируемых в ранние сроки (7-8 сут) после введения клеток -ЭП, проводили картирование расположения колоний на 7 и II сут. Для этого мышам линии (СВАхС57В1 )Р1 вводили 1-1,5x10 клеток 12-13-сут или 17-, 18-сут ЭП мышей линии (СВАхС57В1 Через 7 дней мышам внутрибрюшинно вводили 1% раствор гексе-нала в физиологическом растворе, вскрывали брюшную полость и под бинокулярной лупой зарисовывали расположение колоний на внешней поверхности селезенки (с целью повышения точности картирования в окуляр лупы была вставлена сетка). На II сут после введения кроветворных клеток мышей забивали дислокацией шейных позвонков, извлекали селезенки и вновь зарисовывали расположение колоний на нефиксированных и фиксированных в жидкости Буэна селезенках. Одновременно производили подсчет колоний.

7. Метод селективной элиминации in vitro клеток, находящихся в s -Фазе клеточного цикла. цитостатиками

Величину, пролиферативной активности различных классов клеток-предшественников гемопоэза (КОЕ-ГМ, 7- и И-сут.КОЕс) определяли методом "самоубийства" с оксимочевиной (85).

Суспензию кроветворных клеток делили на две равные части. 250 мМ раствор оксимочевины (ОМ) на физиологическом растворе фильтровали через миллипоровый фильтр (диаметр пор 0,22 мкм) и добавляли в соотношении 1:4 к части клеточной суспензии (конечная. концентрация ОМ - 50 мМ). К контрольным суспензиям в том же соотношении добавляли физиологический раствор. Пробирки с опытными и контрольными суспензиями инкубировали в течение 1,5 час при температуре 37°С, затем помещали на лед. Клетки -трижды отмывали и ресуспендировали.в среде. Контрольные и опытные клеточные суспензии смешивали с агаровой средой, либо вводили смертельно облученным реципиентам для регистрации КОЕс. Относительное содержание клеток-предшественников, находящихся в б -фазе клеточного цикла (величину пролифератквной активности - П) оценивали по следующей формуле: д =£ кол-во колоний при добавлении йа зов о спец.средства1 ^ кол-во колоний без добавления фазовоспец. средства-'

8. Определение радиочувствительности коло ни е о бра зувдих единиц селезенки (КОЕс) Клеточные суспензии 14-, 17-сут ЭП мышей или взрослого костного мозга мышей линии (СВАхС57В1 )р облучали в дозах -0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2,0 Гр или в дозах 1,0; 1,5;- 2,0; 2,5 Гр, а затем вводили смертельно облученным сингенным реципиентам (по 18-20 животных в группе),. Контролем служили-мыши, которым вводили необлученные клетки. Число колоний в селезенках ¿юдсчи-тывали на 7 и II сут после трансплантации кроветворных клеток.

Для расчетов параметров кривых выживаемости КОЕс использовали метод наименьших квадратов. Зависимость выживаемости КОЕс (б ) на экспоненциальном участке кривой от дозы облучения х) описывали с помощью уравнения линейной регрессии у=ах + ъ

0,4343 где у=1б б.Д высчитывали по Формуле Д -- , а N - по формуле N = ап^]^ ъ.

9. Статистическая обработка результатов Статистическую обработку производили для каждого опыта, вычисляя среднее арифметическое значение числа колоний (М) и стандартную ошибку среднего арифметического (т ), применяя формулу: т = ±|й?й=Т)', где сС - отклонение от среднего арифметического .значения М, п - число наблвдений (т.е. число селезенок, пробирок

Лейтона-шш ДЦК).

Достоверность различий оценивали по критерию Стьвдента: М1~И2 га = I у у т1 +т2 * где MJ -и М2 - средние арифметические значения первой и второй из сравниваемых величин, соответственно, ш1 ,т2 - стандартные ошибки средней арифметической. По вычисленному значению 1;<1 и соответствующему значению числа степеней свободны ( п^ п2- 2 ) определяли вероятность ошибки Р по таблице Стьвдента-Фишера. Разница считалась достоверно отличной, если уровень значимости не превышал Ъ% (Р/0,05).

• При, оценке зависимости числа получаемых в агаровых, культурах колоний от числа посеянных клеток использовали уравнение о о . , , линеинои регрессии у= ах+ъ,. где у - число колонии, а х - число посеянных клеток. Корреляционные связи в этих опытах выявляли, используя коэффициент корреляции г* У)

- - ш^штг где X и У - средние, вычисленные соответственно из всех показателей х и у. Достоверность коэффициентов корреляции оценивали по таблице Гт1п(1).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Заключение диссертации по теме «Гематология и переливание крови», Ган, Ольга Игоревна

выводы

1. Установлено, что среди кроветворных клеток печени мыши существуют две категории КОЕс. Мультипотентные КОЕс, определяемые на II-е сутки после введения кроветворных клеток облученному реципиенту, составляют 50-80$ от КОЕс, выявляемых на 7-8-е сутки после инъекции кроветворных клеток. 45-50$ 7-8-суточных КОЕс представлено унипотентными клетками-предшественниками.

2. Две категории КОЕс обнаруживают разную чувствительность к ионизирующему облучению. При развитии кроветворной системы возрастает радиочувствительность КОЕс, образующих колонии на 7-8-е сутки после введения кроветворных клеток, тогда как мультипотентные КОЕс как из печени мышей на 14-е сутки цренатального онтогенеза,так и из костного мозга взрослых мышей обладают одинаковой радиорезистентностью.

3. В органных культурах печени мыши длительное время (до 9-II недель) поддерживаются клетки-предшественники грануломо-ноцитопоэза, выявляемые методами клонирования в полутвердых средах in vitro и in vivo. В органных культурах поддерживаются также две популяции КОЕс: 7-8- и П-суточные КОЕс.

4. Клетки-цредшественники гранулоцитов и макрофагов активно пролиферируют в органных культурах в течение всего срока функционирования in vit го ; пролиферация 7-8-суточных КОЕс в верхних слоях культур и П-суточных КОЕс в цельных эксплантатах снижается после двух недель культивирования.

5. Выявлена функциональная гетерогенность эксплантатов в органных культурах печени мыши. В среднем в верхних слоях культур концентрация всех категорий клеток-предшественников ниже, нежели в глубоких слоях, причем в большей степени это выражено для коммитированных к грануломоноцитопоэзу колоние-образующих единиц.

6. В средах, кондиционированных I-9-недельными органными культурами печени, обнаруживается колониестимулирующая активность.

7. Добавление экзогенной колоннестимулирующей активности в органные культуры приводит к более интенсивной продукции дифференцированных клеток гранулоцитарно-макрофагального ряда при сниженном уровне поддержания полипотентных и коммитированных клеток-предшественников.

8. Добавление в органные культуры печени куриного эмбрионального экстракта (ингибитора грануломоноцитопоэза in vitro) оказывает стимулирующее влияние на кроветворение,повышая содержание как клеток-предшественников, так и зрелых элементов гранулоцитарного ряда.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ган, Ольга Игоревна, 1984 год

1. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методыв микробиологических исследованиях. Государственное изд-во медицинской литературыДенинград, 1961, стр.1-179.

2. Горбунова И. А. Клонирование кроветворных клеток мышей и собак in vivo в диффузионных камерах. Пробл.гематол., 1979, № 3, стр.55-57.

3. Гуревич O.A., Дризе Н.И., Чертков И. Л. Значение клеточных контактов для дифференцировки клеток-предшественников кроветвррной стромы в длительных культурах костного мозга.-Балл.экспер.биол.,1982, № 8, стр.97-100.

4. Дерюгина Е.И. Изучение свойств клеток-предшественников крови в зародышевом развитии японского перепела. Дисс. на соискание уч.степени канд.биол.наук, Москва,1982,стр.1-200.

5. Дризе Н.И. Изучение локализации очагов кроветворения на разных стадиях развития зародышей перепела и курицы. -Автореферат дисс.на соискание уч.степени канд.биол.наук, Москва,1980, стр.1-24.

6. Колесникова А.И., Лурия Е.А., Воробьев А. И. Кроветворение в органных культурах костного мозга человека в нормеи цри лейкозах. В сб. "Органные культуры как метод лабораторного исследования". Тбилиси,1976, стр.55-65.

7. Колониеобразующие клетки в органных культурах эмбриональной печени. (Лауник Н.В., Лурия Е.А., Самойлина Н.Л. и др.- Бкшл.экспер.биол. ,1969, J£ 7, стр.88-90.

8. Кондратенко НЛ\ Коммитированные клетки-предшественники гранулоцитов и макрофагов в кроветворных тканях мышейin vivo и in vit^ . Дисс. на соискание уч.степени канд.биол*наук,Москва,1975, стр.1-101.

9. Кондратенко Н.<Р., Шерешков С.И. Культивирование кроветворных тканей мышей в полутвердом агаровом геле. Пробл. ге-матол.,1974, № II, стр.18-23.

10. Лациник Н.Б., Самойлина Н.Л., Чертков Й.Л. Э.рй'Тгропоэ-тинчувствительность кроветворных клеток эмбриональной печени при культивировании in vitro . Пробл.гематол. ,1970, № 6, стр.31-36.

11. Лацис Р.В., Дризе Н.И., Дерюгина Е.И. Образование гемолитических колоний донорского типа в костном мозге облученных цыплят после трансплантации им клеток желточного мешкаи почки конечности перепела. Болл.экспер. биол. ,1979, № 10, стр. 432-434.

12. Лацис Р.В., Дерюгина Е.И., Дризе Н.И. Способность к ко-лониеобразованию клеток из различных гемопоэтических органов зародыша перепела. Ешл. экспер. биол. ,1980, № 8, стр.214215.

13. Лурия Е.А. Органные культуры тимуса и лимфатических узлов на среде с гетерологической сывороткой. Докл.АН СССР, 1966, т.171, № 6, стр.1431-1434.

14. Лурия Е.А. Кроветворная и лимфоидная ткань в культурах.-Москва, "Медицина",1972, стр.1-176.

15. Лурия Е.А. Методические принципы органного культивирования. В сб. "Органные культуры как метод лабораторного исследования". Тбилиси,1976, стр.7-22.

16. Макарцева Т.М. Кроветворение в длительной органотипическо. культуре печени человека. Автореф.дисс.на соискание ученой степени канд. биол.наук ,МоскваД982, ст.1-20.

17. Манакова Т.Е. Содержание стволовых кроветворных клеток в органных культурах суспензии эмбриональной печени мышей.-В сб. "Органные культуры как метод лабораторного исследования". Тбилиси,1976, стр.38-94.

18. Методы биологии развития. Москва, "Наука", 1974 , стр. I- 619.

19. Нефедов В.П., Прусевич Т.О., Ианасюк А.Ф., Лурия Е.А. Воздействие эритропоэтинактивной сыворотки на эритроидное кроветворение в органных культурах эмбриональной печени. Пробл. гематол., 1972, № 6, стр.32-34.

20. Органные культуры костного мозга человека из материала трепанатов./Колесникова А.й., Лурия Е.А., Воробьев А.И. и др. Пробл. гематол.,1978, № 3, стр.23-26.

21. Органные культуры эмбриональной печени, синтезирующие белки сыворотки./Лурия Е.А., Бакиров Р.Д., Абелев Г.И. и др.-Йсял.экспер.биол. ,1969, №3, стр.95-98.

22. Оркин С.Х., Натан Д.Дж. Молекулярная генетика талассе-мии. В кн. "Современная гематология и онкология", стр. 122145, Москва, "Медицина",1983.

23. Пролиферация СКК в культурах эмбриональной печени мышей. /Лурия Е.А., Самойлина Н.Л., Герасимов Ю.А. и др. Бюлл. экспер, биол.,1971, № 4, стр.103-105.

24. Ракчеев A.M. Кинетика и пролиферативная активность стволовых кроветворных клеток в органных культурах интактного и быстро пролиферирующего костного мозга взрослых мышей.-Пробл.гематол. ,1973, Ji 10, стр.38-44.

25. Руднева H.A. Кинетика кроветворных клеток в органной культуре эмбриональной печени мышей,- Автореферат дисо. на соискание уч.степени канд.биол.наук. Москва,1975,стр.1-24.

26. Самойлина Н.Л. Возможности воздействия на кроветворение в культуре. В сб. "Клетки-предшественники кроветворной ткани". Москва, 1977, стр.55-61.

27. Самойлина Н.Л. Продукция стволовых кроветворных клеток in vitro смывы с органных культур эмбриональной печени.

28. Бюлл.экспер.биол.,1979, № 3, стр. 281-282.

29. Самойлина Н.Л. Пролиферативная активность стволовых кроветворных клеток в длительных органотипиче ских культурах эмбриональной печени мышей.- Бюлл.экспер.биол.,1982, № 7, стр.94^95.

30. Самойлина Н.Л., Манакова Т.Е. Дифференцировка эритро-идных предшественников в органных культурах эмбриональной печени мышей.- Билл.экспер.биол.,1983, № 7, стр.109-112.

31. Смирнова И.Б., Донцова Г.В. Радиочувствительность КОЕ из печени эмбрионов мышей с 12 по 19 день развития.- Онтогенез, 1981, т.12, Jfc 2, стр.201-203.

32. Фриденштейн А.Я., Лурия Е.А. Клеточные основы кроветворного микроокружения. Москва, "Медицина", 1980, стр. I-2I6.

33. Характеристика кроветворения в органных культурах костного мозга человека. /Колесникова А.И., Лурия Е.А., Воробьев А.й. и др. Пробл. гематол.,1974, Jfe II, стр.7-12.

34. Чертков И.Л., Фриденштейн А.Я. Клеточные основы кроветворения. Москва, "Медицина",1977,стр.1-272.

35. Чертков И.Л.,Гуревич O.A., Удалов Г.А. Роль стромы костного мозга в феномене гибридной резистентности. Балл, экспер.биол.,1979, № 4, стр.337-340.

36. Чертков И.Л., Гуревич О.А. Роль антигенов В-2 клеточной поверхности в регуляции пролиферации стволовых кроветворных клеток. Бвдл.экспер.биол. ,1982, '№,2, стр.59-61.

37. Чертков И.Л., Гуревич О.А. Стволовая кроветворная клетка и ее микроокружение.

38. Москва, "Медицина", 1984, стр.1-248.

39. Becker A.J., McCulloch E.A., Siminovitch L., Till J.E. "Thymidine suicide" method.- Blood,1965, v.26,p.296-303

40. Benestad H.B. Fomation of granulocytes and macrophages in diffusion chamber culture of mouse blood leukocytes.-Scand.J.Haematol.,1970, v.7, n.4, p.279-288.

41. Ben-Ishay Z., Reichert P., Sharon S. Erythroid "burets" in semisolid agar diffusion chambers: effect of cyclophosphamide administration to host and of hydroxyurea to donor animals. Exp.Hematol.,1978, v,6vn.7,p.631-635.

42. Blackburn II.J., Goldman J.H. Increased survival of hematopoietic progenitor cells in vitro induced by human marrow stromal cells. Efcp.Hematol.Today,1981,p.77-83.

43. Bleiberg J., Perch 6., Feldman M. Effect of testosterone on the formation of erythroid spleen colonies from fetal liver precursor cells. Blood,1973, v.41, n.2,p.285-291.

44. Bradley T.R., Metealf D. The growth of mouse bone marrow cells in vitro.- Austr.J.Exp.Biol.Med.Sci.,1966,v.44, p.287-300.

45. Burgess A.W., Camakaris J., Metealf D. Purificationymouie^and properties of colony-stimulating factor fronTr5ung-condi-tioned medium.- J.Biol.Chem.,1977, v.252, n.6,p.1998-2003

46. Garsten A.L., Diffusion chamber culture system.-Exp.Hemat ol.Today,1980,p.225-230.

47. CPUs in individual erythroid colonies derived in vitro from adult bone marrow./Humphries R.K., Jacky P.B.,Dill P.J. e.a. Hature,1979, v.279, p.728-7201

48. Champlin R.E., Stitzel K.A., Gale R.P. Petal liver cells Transplantation (P-^CT) in dogs.- Elp.Hematol.,1982,v.10, suppl. n.11, p.31-31.

49. Chemical mediators of granulopoiesis: a reweiw./Bren-nan J.K., Lichtman M.A., DiFersio J.F.e.a. Exp.Hematol., 1980,v.8,n.4,p.441-464.

50. Chen D.-M.,Hsu S., Lin H.-S.Interaction of colony-stimulating factor (CSF-1) with murine peritoneal macrophages: binding, internalization and degradation.- Exp.Hematol.,1982, v.10, suppl. n.11, p.58-58.

51. Colony-forming cells in organ culture of embryonal liver./Latsinik H.V.,Luria E.A., Pridenstein A.J. e.a.

52. J.Cell.Physiol.,1970, v.75, n.2, p.163-166.

53. Cudennec C.A., Thiery J.-P.,be Douarin 1Г.М. In vitro induction of adult erythropoiesis in early mouse yolk sac.-Proc.Hatl.Acad.Sci. USA,1981, v.78, n.4, p.2412-2416.

54. Curry J.L., Trentin J.J.Hemopoietic spleen colony studies. I. Growth and differentiation.- Dev.Biol.,1967, v.15, n.5, p.395-413.

55. Davis J.M., Kubler A.-M.,Couscience J.-F. MBM-1, a differentiation marker of mouse hemopoietic cells defined by a rat monoclonal antibody.- Exp.Hematol.,1983, v.11, n.4,p.332-340.

56. Dexter T.M. Haemopoiesis in long-term bone marrow cultures (a rewiew). Acta Haemat.,1979, v.62, n.5-6,p.299-305.

57. Dexter T.M. Stromal cell associated haemopoiesis.-J.Cell.Physiol.,1982,suppl. n.1, p.87-94»

58. Dexter T.M., Allen T.D., Lajtha L.G. Conditions controlling the proliferation of haemopoietic stem cells in vitro.-J.Cell.Physiol.,1977, v.91, n.3, p.335-344.

59. Dexter T.M., Shadduck H.K. The regulation of haemopoiesis in long-term bone marrow cultures. I. Hole of L-cell CSF.- J.Cell.Physiol.,1980, v.102, n.3, p.279-266.

60. Dexter T.M.,Allen T.D., Teich B.M. Production of "normal" stem cell lines following treatment of long-texm marrow cultures with Friend murine leukemia virus.-Exp.Hematol.Today, 1980, p.145-156.

61. Dexter T.M., Lajtha L.G. Self-renewal factors for haemopoietic progenitor cells and their potential relevance in leukaemogenesis a possibility to consider.- Advances in Comparative Leukemia Research,1981, p.73.

62. Differences between placenta and T-cell colony conditioned media derived granulocyte-macrophage (GM) colony stimulating activity (CSA)./de Laforest E.G.»Distambou, Thomas P. e.a. Exp.Hematol.,1980, v.8, suppl.n.7, p.18-18.

63. Different colony stimulating activity by tumoral ascitic fluid and conditioned media./Garotta G., Burdick L., Porta C.e.a. Erp.Hematol.,1978, v.6,n.5, p.505-512.

64. Donor origin of the in vitro haematopoietic microenvironment after marrow transplantation in man. /Keating A., Singer J.W., Killen P.D.e.a.- Nature, 1982, v.298, p.280-283.

65. Eliason J.P. Studies of the role of serum in long-term bone marrow cell cultures.-Exp.Hematol.,1983,v.11,n.2, p.98-106.

66. Eliason J.P.,Testa H.Û.,Dexter T.M. Erythropoietin-stimulated erythropoiesis in long-term bone marrow culture.-Nature,1979, v.281, n.4, p.382-384.

67. Eliason J.P., Dexter T.M., Testa N.G. The regulation of hemopoiesis in long-teim bone marrow cultures. III. The role of burst forming activity.-Exp.Hematol. ,1982,v. 10,n.5, p. 444-450.

68. Eliason J.P., Blaw E. Defining the role of serum in long-term marrow cell culture.- Exp.Hematol.,1982, v.10,suppl. n.11, p.69-69.

69. Fagg B. Is erythropoietin the only factor wich regulates late erythroid differentiation? Hature,1981, v.289, p.184-186.

70. Fauser A.A., Messner H.A. Granuloexythropoietic colonies in human bone marrow peripheral blood and cord blood.-Blood,1978, v.52, n.6,p.1243-1248.

71. Fauser A.A.,Messner H.A. Proliferative state of human pluripotent hemopoietic progenitors (CFU-GEMM) in normal individuals and under regenerative conditiones after bone marrow transplantation.- Blood,1979, v.54, n.5,p.1197^1200.

72. Peiner R.H., Strober S., Greenberg P.L. Murine granulopoiesis after fractionated total lymphoid irradiation and allogeneic bone marrow transplantation.- Exp,Hematol., 1983,v.11,n.5, p.410-417.

73. Fialkow A.J. Cell lineages in hematopoietic neoplasia studied with glucose-6-phosphate dehydrogenase cell markers.-J.Cell.PhyBiol.,1982, suppl.n.1, p.37-43.

74. Fleishman R.A., Custer R.P., Mintz B. Totipotent hematopoietic Btem cells: normal self-renewal and differentiation after transplantation between mouse fetuses.- Cell,1982, v.30, p.351-359.

75. Fletcher J.,Philip M.A., Sharkey J.S. The role of lactoferiin as the neutrophil derived inhibitor of in vivo granulopoiesis.- Exp.Hematol.,1982, v.10,suppl. n.11,p.22-22.

76. Garnett H.M., Cronkite E.P., Harigaya K. Regulation of the colony-stimulatingiactivity produced by a murine marrow-derived cell line (H-1)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1982, v.79, n.5, p.1545-1548.

77. Gordon M.Y. A comparison of the radiosensitivity and o.e.r. of human and mouse marrow progenitor cells cultured in agarDC.-Int.J.Radiat.Res.,1975,v.28, n.3,p.285-290.

78. Gordon M.Y., Blackett H.M. Stimulation of granulocytic colony formation in agar diffusion chambers implanted in cyclophosphamide pretreated mice.- Brit.J.Cancer,1975»v.32, n. 1, p.51-59.

79. Gordon M.Y., Blackett K.M.,Douglas I.D. Colony foz*-mation by human haemopoietic precursor cells cultured in semisolid agar in diffusion chambers.- Brit.J.Haemat.,1975,v.31, n.1, p.103-110.

80. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor produced by an inducible murine T-cell hybridoma: molecular properties and cellular specifity./ Burgess A.W., Bartlett P.P., Metcalf D.e.a. Exp.Hematol.,1981, v.9, n.9,p.893-903.

81. Griffin J.D., Rit2 J., Beveridge R.P., Lipton J.M., Daley J.F., Schlossman S.F. Expression of MY7 an^tigen on myeloid precursor cells. Int.J.Cell.Cloning,1983, v.1, n.1, p.33-48.

82. Gualtiery R.J., Quesenberry P.J. Lithium stimulated hemopoiesis and the effect of adenine nucleotides in long texm murine bone marrow cultures.- Exp.Hematol., 1982,v.10, suppl.n.11, p.98-98.

83. Hagan M.P., Dodgen D.P. Use of 5-Brd.Urd/313 nm light tecknique for identification of cells in initial S-pha-se within GM-CFCc compartment.- Eacp.Hematol. ,1983, v.11,n.5, p.402-409.

84. Hale M.L., McCarthy K.P. Effecit of mouse type I interferon on mouse bone marrow cells and peritoneal exudate cells cultured in vitro.- Exp.Hematol.,1982, v.10, n.3,p.263-270.

85. Hara H. Kinetics of pluripotent hemopoietic precursors in vitro after erythropoietic stimulation or supression.-Exp.Hematol.,1980, v.3, p.345-350.

86. Hara H., Ogawa M. Murine hemopoietic colonies in culture containing normoblasts,macrophages and megakaryoeyres.-Am.J.Hematol.,1978, v.4, n.1, p.23-34.

87. Hara H., Hoguchi K. Clonal nature of pluripotent hemopoietic precursor in vitro (CPU-mix).- Stem Cells,1981, v.1, n.1, p.53-60.

88. Haskill J.S. Two-dimentional separation of embiyonic and adult colony foiraing units.A study of differentiation in hemopoiesis.-Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,1971, v.138,n.1 ,p.60-65.

89. Haskill J.S., Moore M.A.S. Two-dimentional cell separation: comparison of embryonic and adult haemopoietic stem cells.- Hature, 1970, v.226, p.853-854«

90. Hatzfeld J.A., Hatzfeld A., Maigne J. Fibrinogen and its fragment D stimulate proliferation of human hemopoietic cells in vitro.- Proc.ffatl.Acad.Sci.USA,1982, v.79, n.20, p.6280-6284.

91. Heard J.-M., Fichelson S., Varet B. Role of colony-stimulating activity in murine long-teira bone marrow cultures: evidence for its production and consumption by the adherent cells.- Blood,1982, v.59, n.4, p.761-767.

92. Hemoglobin switching in culture: evidence for a humoral factor that induced switching in adult and neonatal but not fetal erythroid cells./ Papayannopoulou Т., Kurachi S., Sakamoto B. e.a. Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1982, v.79,n.21,p.6579-6583.

93. Hocking W.G., Golde D.W. Long-tern human bone marrow cultures.- Blood, 1980, v.56, n.1, p.118-124.

94. Horak H., Turner A.R., Yau 0. Comparison of colony-stimulating activities secreted into mouse lung conditioned medium in the presence and absence of lithium chloride.- Exp. Hematol.,1982, v.10, n.1, p.123-129.

95. Humphries R.K., Eaves A.C., Eaves C.J. Self-renewal of hemopoietic stem sells during mixed colony formation in vitro.- Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1981, v.78, n.6, p.3629-3633.

96. Hybrid resistance to parental bone marrow transplantation: Adaptive modification of hemopoietic stem cell in a nonsyngeneic environmrnt./Cherttov J.L., Gelfand I.M., Gure-vitch O.A. e.a. Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1979, v.76,n.6,p.2955-2959.

97. IShii Y., Shinoda II., Shikita M. Specificity of the suppresive action of glucocorticoids on the proliferation of monocyte/macrophages in the CSF-stimulated cultures of mouse bone marrow. Exp.Hematol.,1983, ▼•11, n.3, p.178-186.

98. Johnson G.R. Colony formation in agar by adult bone marrow multipotential hemopoietic cells. J.Cell.Physiol., 1980, V.103, p.371-383.

99. Johnson G.K., Jones R.O. Differentiation of the mammalian hepatic primordium in vitro. I. Morphogenesis and the onset of haematopoiesis.- J.Embr^ol.Exp.Morph.,1973» V.30, part 1, p.83-96.

100. Johnson G.R., Metcalf D. Sources and nature of granulocyte-macrophage colony stimulating factor in fetal mice.-Exp.Hematol.,1978, v.6, n.3, p.327-335.

101. Johnson G.R., Metcalf D. Nature of cells from erythroi colonies in agar after stimulation by spleen conditioned medium. J.Cell.Physiol.,1978, v.94, n.3, p.243-252.

102. Johnson G.R., Metcalf D. Detection of a new type of mouse eosinophil colony by Luxol-fast-blue staining.-Exp.Hematol.,1980, v.8, n.5, p.549-556.

103. Johnson G.R., Metcalf D. Multipotential hemopoietic colony formation in agar cultures stimulated by spleen-conditioned medium. Exp.Hematol.Today,1980, p.29-37.

104. Johnson G.R., Keller G.M., Nicola N.A. Differentiation and "renewal" of multipotent cells in vitro. J.Cell. Physiol.,1982, suppl.n.1, p.23-30.

105. Jones-Villineuve E., Philips R.A. Potentials for lymphoid differentiation by cells from long tenn cultures of bone marrow.- Exp.Hematol.,1980, v.8, n.1,p.65-76.

106. Keller G.M., Philips R.A. Detection in vitro of a unique multipotent hemopoietic progenitor.- J.Cell.Physiol., 1982, suppl. n.1, p.31-36.

107. Kurland J., Moore M.A.S. The regulatory role of the macrophage in nozmal and neoplastic hemopoiesis."«* Exp.Hematol. Today, 1977, p.51-62.

108. Laitha L.G., Wright E.G. Regulation of stem cell production. Exp. Hematol.Today,1978, p.3-8.

109. Lanotte M., Schor S., Dexter T.M. Collagen gel as a matrix for haemopoiesis.- J.Cell.Physiol.,1981,v.106, n.2, p.269-277.

110. Lanotte M., Metcalf D., Dexter T.M. Production of monocyte/macrophage colony-stimulating factor by preadypocyte cell lines derived from murine marrow stroma.-J.Cell.Physiol.,1982, v.112, n.1, p.123-127.

111. Lewis J.P., Trobaugh P.E. Hemopoietic stem cells.-Nature,1964, v.204, p.589-590.

112. Lithium stimulated in vitro megakaxyocytopoiesis./ Gamba-Vitalo C., Gallicchio V.S., Watts T.D.e.a.- Exp.Hematol.,1983, v.11, n.5, p.382-388.

113. Lowenberg B., Touw I. Pat cells have no significant role in human long term marrow cultures.- Exp.Hematol. ,1982, v.10, suppl.n.11, p.97-97.

114. Magli M.C., Iscove ÏÏ.H., Odartchen/Ko IT. Transient nature of early haematopoietic spleen colonies.- Nature, 1982, v.295, p.527-529«

115. Metcalf D. Acute antigen-induced elevation of serum colony stimulation factor (CSF) levels.- Immunology,1971» v.21, n.3, p.427-436.

116. Metcalf D. Hemopoietic colonies. In vitro cloning of normal and leukemic cells. Springer-Verlag,1977,p.1-227.

117. Metcalf D. In vitro cloning of hemopoietic cells.-Bull.Cancer,1978, v.65, n.4, p.417-419.

118. Metcalf D. The control of neutrophilic and macrophage production at progenitor cell level.- Exp.Hematol.Today ,1978.

119. Metcalf D. Commitment of bipotential GM progenitor cells to granulocyte or macrophage formation by GM-CSP or M-CSF. Exp.Hematol.,1981, v.9, suppl.n.9, p.3-3.

120. Metcalf D. The clonal culture in vitro of multipotential hemopoietic cells: problems and interpretations.-Bouv.Rev.Fr.Hematol.,1981, v.23, n.3, p.165-169.

121. Metcalf D., Moore M.A.S. Hemopoietic stem cells.-Horth Holland Publishing Company, Amsterdam-London,1971,p.1-550.

122. Metcalf D., Johnson G.R. Interaction between purified Gl-CSF, purified erythropoietin and spleen conditioned medium on hemopoietic colony formation in vitro.- J.Cell.Physiol.,1979, v.99,n.2,p.159-174.

123. Metcalf D., Johnson G.H., Mandel Т.Е. Colony formation in agar by multipotential hemopoietic cells.- J.Cell.Ptys'ol-, 1979, v.99# n.2t p.401-420.

124. Metcalf D., Johnson G.R., Burgess A.W. Direct stimulation by purified GM-CSF of the proliferation of multipotential and erythroid precursor cells.- Blood,1980, v.55,n. 1, p.138-147.

125. Metcalf D., Burgess A.W., Johnson G.R. Stimulation of multipotential and erythroid precursor cells by GM-CSJ?.-Exp.Hematol.Today,1980, p.3-12.

126. Metcalf D., Burgess A.W. Clonal analysis of progenitor cell commitment to granulocyte or macrophage production.-J.Cell.Physiol.,1982, v.111, n.3, p.275-283.

127. Metcalf D., Merchav S. Effects of GM-CSP deprivation on precursors of granulocytes and macrophages.- J.Cell.Physiol.,1982, v.112, n.3, p.411-418.

128. Monette F.C., Stockel J.B. Blood-borne stem cells are immunologically distinct from thouse in other hematopoietic tissues.- Exp. Hematol.,1980, v.8, n.1, p.89-95.

129. Monette F.C., Stockel J.B. Immunological evidence foitv murine hematopoietic stem cell subpopulations differing in self-renewal capacity.- Stem Cells,1981, v.1, n.1, p.38-52.

130. Moore M.A.S., Williams N. Análisis of proliferation and differentiation of foetal granulocyte-macrophage progenitor cells in haemopoietic tissue.- Cell.Tissue Kinet., 1973, v.6, n.5, p.461-476.

131. Morstyn G., Nicola N.A., Metcalf D. Separate actions of different colony stimulating factors from human placental conditioned medium on human hemopoietic progenitor cell survival and proliferation.- J.Cell.Physiol.,1981, v.109, n.1,p.133-142.

132. Nakahata T., Ogawa M. Identification in culture of a class of hemopoietic colony-forming unit with extensive capability to self renew and generate multipontial hemopoietic colonies.- Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1982, v.79, n.12,p.3843-3847.

133. Neuwirt J. Erythropoietic precursor cells in culture.- Blut,1981, v.43, n.2, p.65-69.

134. Nicola N.A., Burgess A.W., Metcalf D. Similar molecular properties of granulocyte-macrophage colony-stimulating factors produced by different mouse organs in vitro and in vivo.- J.Biol.Chem.,1979, v.254, n.12, p.5290-5299

135. Nicola N.A.,Metcalf D. Biochemical properties of differentiation factors for murine myelomonocytes leukemic cells in organ conditioned media-separation from colony-stimulating factors.- J.Cell.Physiol.,1981, v.109, n.2,p. 253-264.

136. Nicola N.A.,Metcalf D. Analysis of purified fetal liver hemopoietic progenitor cellB in liquid culture.

137. J.Cell.Physiol.,1982, v.112, n.2, p.257-264.

138. Obion D., Broxmeyer H., Castro H. Colony-stimulating activity (CSA) production by monocyte enriched fractions from continuous bone marrow culture adherent layers.- Exp. Hematol.,1982, v.10, suppl. n.11, p. 68-68.

139. Ohki K., Nagayama A. Cell hybrids between SV 40-transfoxmed macrophage cell lines and a Chinese hamster cell line: growth responsiveness and induction of colony-stiraula-ting factor.- J.Cell.Physiol.,1983, v.114, n.3, p.291-301.

140. Papayannopoulou T., Stamatoyannopoulos G. Human hemoglobin switching: insight from studies erythroid cultures.-J.Cell.Physiol.,1982, suppl.n.1, p.145-149.

141. Parker R.C. Methods of tissue culture. 1961, London, p.1-358.

142. Parker J.W., Metcalf D. Production of colony-stimulating factor in mitogen-stimulated lymphocyte cultures.-J.Immunol.,1974, v.112, n.2, p.502-510.

143. Pelus L.M. Association between CFU-GM expression of la-Like (HLA-DR) antigen and control of granulocyte and macrophage production. A new role of prostoglandin B.- Exp. Hematol.,1982, v.10, suppl.n.11, p.62-62.

144. Pelus L.M., Broxmeyer H.E., Moore M.A.S. Monocyte-macrophage heterogeneity of myeloid colony-stimulating factor (GM-CSF) production, and responsiveness to regulation by lactoferrin.- Exp.Hematol.,1980, v.8, suppl.n.7, p.73-73.

145. Pluripotent hemopoietic precursors in vitro (CFUmix) in aplastic anemia./Hara H., Kai S., Fushimi M.e.a.-Exp.Hematol.,1980, v.8, n.9, p.1169-1171.

146. Pluznik D.H., Sachs L. The cloning of normal "mast" cells in tissue culture.- J.Cell.Comp.Physiol.,1965, v.66, n.3, p.319-324.

147. Production of colony-stimulating factor by murine bone marrow cells line derived from Dexter adherent layer./ Cronkite E.P., Harigaya K., Miller M.E. e.a. Exp.Hematol., 1981, v.9, suppl.n.9, p.3-3.

148. Production of colony stimulating factor in long-term bone marrow cultures./Shadduck R.K., ffaheed A., Green-berger J.S.e.a. J.Cell.Physiol.,1983, v.114, n.1,p.88-92.

149. Purification of human granulocyte-macrophage progenitor cells (CFUc) using undirect immunofluorescence and cell sorting./Miller A.M.,Wu M.-C., Piles N.e.a. Stem Cells, 1981, v.1, n.3, p.193-205.

150. Regulation of haemopoietic stem cell proliferation in long-term bone marrow cultures./Dexter T.M., Wright E.G., Krista P.e.a. Biomedicine,1977, v.27, p.344-349.

151. Regulation of megakaryopoiesis in long-term murine bone marrow cultures./Williams N., Jackson H.M., Sheridan

152. A.P.O.e.a. Blood,1978, v.51, n.2, p.245-255.

153. Regulation of mononuclear phagocyte production bya colony stimulating factor (CSF-1)./Gilbert L.J., Byrne P.V., Das S.e.a.- Exp.Hematol.,1982, v.10, suppl.n.11, p.12-12.

154. Reimann J., Burger H. In vitro proliferation of haemopoietic cells in the presence of adherent cell layers. 2. Differential effect of adherent cell layers derived from various organ. Exp.Hematol.,1979, v.7, n.1, p.52-58.

155. Reinke U., Hannon E.C., Hellman S. Residual radiation injury exibited in long-term bone marrow cultures.

156. J.Cell.Physiol.,1982, v.112, n.3, p.345-352.

157. Response of megakaryocyte, erythroid, and granulo-cyte-macrophage progenitor cells in mouse bone marrow to gamma-irradiation and cyclophosphamide./Nakeff A., McLellan W.L., Bryan J.e.a. Exp.Hematol.Today,1979, p.99-104.

158. Sachs L. Control of growth and normal differentiation in leukemic cells: regulation of the developmental program and restoration of the normal phenotype in myeloid leukemia.-J. Cell .Physiol. ,1982, suppl.n.1, p.151-164.

159. Sakakeeny M.A., Greenberger J.S. Granulopoiesis longevity in continuous bone marrow cultures and factor-dependent cell line generation: significant variation among 28 inbred mouse strains and outbred stocks.- JNCI,1982, v.68,n.2, p.305-317.

160. Schofield R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the haemopoietic stem cells: A hypothesis. Blood Cells,1978, v.4, n.1, p.7-25.

161. Shadduck R.K., Pigoli G., Waheed A. The effect of anti-CSP on in vivo hemopoiesis.- Exp.Hematol.,1980, v.8, suppl.n.7, p.3-3.

162. Segregation of mouse hemopoietic progenitor cells using the monoclonal antibody YBM/i42-/Watt s-M-> Gilmore D.J., Metcalf D.e.a. J.Cell.Physiol.,1983, v.115, nt1,p.37-45•

163. Sheridan J.W., Metcalf D. Purification of mouse lung-conditioned medium colony stimulating factor (CSFÎ.-Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,1974, v.146, n.1, p.218-221.

164. Silini G., Pozzi L.V., Pons S. Studies the haemopoietic stem cells of mouse fetal liver. J.Embriol.Exp.

165. Morph., 1967, v.17, n.2, p.303-318.

166. Silini G., Pozzi L.V. Valutazione della Tadiosen-sibilita di cellule staminali emopoietiche seconde la tecnica delle colonie spleniche.- Estratto da Minerva Bfucleare, 1965, v.9, n.6, p.372-376.

167. Silini G. The effects of various types of ionizing radiations from different sources on the haemopoietic tissue.-International Atomic Energy Agency, Vienna, 1966, p.1-7.

168. Spooner E., Gallagher J.T., Dexter T.M. The role of cellular matrix in haemopoiesis.- Exp.Hematol.,1982, v.10, suppl.n.11, p.68-68.

169. Staber F.G., Burgess A.W. Serum of lipopolysaccha-ride-treated mice containes two types of colony-stimulating factor, separable of affinity chromatography.-J.Cell.Physiol., 1980, v.102, n.1, p.1-10.

170. Statistical analysis of spleen colony histology: an attempt to confirm that external factors could affect the channeling of CFUs differentiation./Mary J.Y., Guiguet M., Saiteny F.e.a.- Exp.Hematol., 1983, v.11, n.4, p.284-297.

171. Steinberg H.H., Handler E.S., Handler E.E. Asses-ment of erythroid and granulocytic colony formation in anin vivo plasma clot diffusion chamber culture system.- Blood, 1976, v.47, n.6, p.1041-Ю51.

172. Steinberg Н.Ы., Paradise C.M., Robinson S.H. Interaction of HL-вО and K562 leukemic cell lines with human bone marrow stroma. Exp. Hematol.,1982, v.10, suppl.n.11,p.86-86.

173. Stuart R.K., Sharkis S.J. Erythroid repopulating activity of cells from long-term bone marrow cultures (LTMC).-Exp.Hematol.,1982, v.10, suppl.n.11, p.70-70.

174. Symann M., Anckaert M.A., Cordier A., Rodhain J. Murine yolk sac hemopoiesis studied with the diffusion chamber technique.- Exp.Hematol.,1978, v.6, n.10, p.749-759

175. Tavassoli M. Radiosensitivity of stromal cells responsible for in vitro maintenance of hemopoietic stem cells in continuous long-teim marrow culture.- Exp.Hematol.,1982, v.10, n.5, p.435-443.

176. The effect of hydrocortisone on the production and differentiation of granulocyte/macrophage progenitor cells in long-term bone marrow cultures./Motomura S., Katsuno M., Kaneko S.e.a. Exp.Hematol.,1983, v.11, n.1, p.56-62.

177. Till J.E. Stem cells in differentiation and neoplasia. J.Cell.Physiol.,1982, suppl.n.1, p.3-11.

178. Till J.E., McCulloch E.A. A direct measurement of the radiation sensitivity of noiraal mouse marrow cells. -Radiat. Res.,1961, v.14, n. 2, p. 213-222.

179. Touw I.P., Lowenberg B. Human long term marrow culture as an assay for immature T lymphocyte progenitors.-Exp.Hematol.,1982, v. 10, suppl. n.11, p. 71-71.

180. Udupa K.B., Lipschitz D.A. The effect of pokeweed mitogen stimulated spleen conditioned medium on erythropoie-sis in vitro.- Exp.Hematol.,1982, v.10, suppl. n. 11,p.134-134.

181. Ulatowski J.A., Zucali J.R., Mirand E.A. Stimulation of bone marrow and fetal liver erythroid and granulocyte-macrophage colony-forming cells by fetal mouse liver cell conditioned media. Exp.Hematol.,1980, v.8, suppl. n. 7,p.103-103.

182. Ulatowski J.A., Zucali J.R. Effects of silica on fetal mouse liver cultures.- Exp.Hematol.,1980, v.8, suppl. n. 7, p.108-108.

183. Vos 0., Luiten P., Ploemacher R.E. Lodging of CPUs under variouse circumstances in bone marrow, spleen and liver.- Exp.Hematol., 1980, v.8, n. 7, p.860-866.

184. Wagemaker G. Early erythropoietin-independent stage^ of in vitro erythropoiesis: relevance to stem cell differentiation. Exp.Hematol.Today, 1980, p.47-60.

185. Wagemaker G., Merchav S., Burger H. Multiplication of pluripotent hemopoietic stem cells induced by purified stem cell activating factor (SAP) in serum free suspension cultures. Exp. Hematol., 1982, v.10, suppl. n. 11,p.162-162.

186. Waheed A., Shadduck R.K., Purification of colony-stimulating factor by affinity chromatography. Blood, 1982, v.60, n.1, p.238-244.

187. Wiktor-Jedrzejczak IT., Ahmed A., Szczylik C. Conditions of adherent cell growth from murine bone marrow in liquid cultures and partial characterisation of function. — Exp.Hematol., 1981, v.9, n.8, p.835-848.

188. Williams N., van den Engh G.J. Separation of subpopulation of in vitro colony forming cells from mouse marrow by equilibrium density centrifugation. J.Cell.Physiol., 1975, v.86, n.2, p.237-246.

189. Williams N., Pluznik D.H. Differences in the buoyant density characteristics of murine granulocyte-macrophage progenitor cells cloned in the presence of serum and/or hemolysate. Exp.Hematol.,1978, v.8, n.4, p.383-390.

190. Williams N., Jackson H.M., Meyers P. Isolation of pluripotent hemopoietic stem cells and clonable precursor cells of erythrocytes, granulocytes, macrophagge and megakaryocytes from mouse bone marrow. Exp. Hematol. ,1979:$ v.7, n.10, p.524-534.

191. Williams N., Burgess A.W. The effect of mouse lung granulocyte-macrophage colony-stimulating activities on the proliferation and differentiation of murine bone marrow cells in long-teim cultures. J.Cell.Physiol., 1980, v.102, n.3, p.287-296.

192. Zipori D. Bone-marrow resident colony stimulating activity (CSA) produced by stromal cells. Exp.Hematol., 1981, v.9, suppl. n. 9» p. 7-7.

193. Zucali J.R., McGarry M.P., Mirand E.A. Stimulation of erythropoiesis in a grafted animal by mouse fetal liver culture media. Exp. Hematol., 1977, v.5, n.2, p.103-108.

194. Zucali J.R., Ulatowski J.A., Mirand E.A. Erythroidprogenitor cells and cells capable of producing erythropoie1. J980,tic activity from fetal mouse liver. Exp.Hematolr?^T8,n.8, p.971-979.

195. Zuckerman K.S., Wicha M.S. Extracellular matrix production by the adherent cells of long-term murine bone marrow cultures.- Blood, 1983, v.61, n.3, p.540-547.