Экспериментальное исследование клеточных механизмов кроветворения в онтогенезе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, доктор биологических наук Домарацкая, Елена Ивановна

• Домарацкая, Елена Ивановна
• доктор биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации доктор биологических наук Домарацкая, Елена Ивановна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2. ПОЛУЧЕНИЕ ЗАРОДЫШЕЙ МЫШЕЙ.

3. РЕНТГЕНОВСКОЕ ОБЛУЧЕНИЕ.

4. ГАММА-ОБЛУЧЕНИЕ.

5. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ КРОВЕТВОРНОЙ ТКАНИ И КРОВЕТВОРНЫЕ КОЛОНИИ В СЕЛЕЗЕНКЕ.

6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ САМООБНОВЛЕНИЯ КОЕ-С.

7. Н3-ТИМИДИНОВОЕ И Н3-УРИДИНОВОЕ «САМОУБИЙСТВО».

8. ОКСИМОЧЕВИНОВОЕ «САМОУБИЙСТВО».

9. ОБРАБОТКА АНТИБИОТИКАМИ.

10. ОБРАБОТКА 5-ФТОРУРАЦИЛОМ (5-ФУ).

11. ОБРАБОТКА ДИПИНОМ.

12. АНЕМИЯ.

13. ЭКТОПИЧЕСКАЯ ТРАНСПЛАНТАЦИЯ.

14. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА.

15. ПОЛУЧЕНИЕ КРОЛИЧЬЕЙ АНТИСЫВОРОТКИ К ГОЛОВНОМУ МОЗГУ МЫШИ (КАСММ) И ЭКСПОЗИЦИЯ С НЕЙ КРОВЕТВОРНЫХ КЛЕТОК.

16. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КРОВЕТВОРНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК.

2. ПРОЛИФЕРАТИВНЫЙ СТАТУС КРОВЕТВОРНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК.

2.1. Исследование кроветворных стволовых клеток с помощью мультипараметрического анализа.

2.2. Содержание РНК.

2.3. Фенотипические различия покоящихся и пролиферирующих КСК.

2.4. Положение КСК в клеточном цикле и способность к репопуляции.

2.5. Исследование пролиферативной активности КСК с помощью цитотоксических препаратов.

2. 6. Сочетанный эффект цитотоксических препаратов и цитокинов.

2.7. Кинетика клеточного цикла КСК.

3. РОДОНАЧАЛЬНЫЕ КРОВЕТВОРНЫЕ КЛЕТКИ, ОБРАЗУЮЩИЕ КРОВЕТВОРНЫЕ КОЛОНИИ В СЕЛЕЗЕНКЕ (КОЕ-С).

3.1. Метод селезеночных колоний и его применение для исследования популяции родоначальных клеток.

3.2. Фенотипическая характеристика КОЕ-С.

3.3. Сравнительная характеристика КОЕ-С, образующих ранние и поздние селезеночные колонии.

3.3.1. Экспрессия антигенов клеточной поверхности.

3.3.2. Пролиферативный статус КОЕ-С и регуляция их пролиферации.

3.3.3. Чувствительность к цитотоксическим агентам.

3.4. Положение КОЕ-С в гистогенетическом ряду кроветворных клеток.

4. КРОВЕТВОРНОЕ МИКРООКРУЖЕНИЕ И ГЕМОПОЭЗ.

4.1. Характеристика кроветворного микроокружения и его регуляторной функции.

4.2. Мезенхимные (стромальные) стволовые клетки.

4.2.1. Фенотипическая и функциональная характеристика мезенхимных (стромальных) стволовых клеток.

4.2.2. КОЕ-Ф - стромальная стволовая клетка.

4.2.3. Эктопическая трансплантация костного мозга в виде фрагмента.

4.2.4. Гистогенетические отношения МСК и КСК.

4.2.5. МСК и мезенхимные сосудистые гладкомышечные клетки (МСГК).

5. КРОВЕТВОРНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ В ПРЕНАТАЛЬНОМ РАЗВИТИИ.

5.1. Происхождение КСК в эмбриональном развитии млекопитающих.

5.2. Печень как основной кроветворный орган в пренатальном онтогенезе.

5.2.1. Развитие кроветворения в печени.

5.2.2. Кроветворное микроокружение эмбриональной печени и миграция кроветворных клеток в кроветворные органы в пренатальном развитии.

5.2.3. Характеристика КСК из фетальной печени.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. РОДОНАЧАЛЬНЫЕ КРОВЕТВОРНЫЕ КЛЕТКИ (КОЕ-С) В ПРЕ - И ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ МЫШИ.

1.1. Характеристика популяции КОЕ-С печени зародыша мыши.

1.1.1. Гетерогенность селезеночных колоний, образуемых клоногенными кроветворными клетками эмбриональной печени.

1.1.2. Морфологическое типирование колоний через 7 и 11 суток после трансплантации кроветворных клеток эмбриональной печени.

1.1.3. Характеристика свойств различных категорий эмбриональных кроветворных клеток, образующих колонии в селезенке.

1.2. Структура популяции клоногенных кроветворных клеток в пре - и постнатальном онтогенезе.

1.2.1. КОЕ-С, образующие крупные селезеночные колонии.

1.2.2. КОЕ-С-эп, ответственные за образование мелких селезеночных колоний.

1.2.3. Сравнительная характеристика КОЕ-С из разных кроветворных источников и происхождение КОЕ-С в печени в постнатальном онтогенезе.

1.3. Родоначальные кроветворные и стромальные клетки печени зародыша при эктопической трансплантации.

1.3.1. Кроветворные клоногенные клетки (КОЕ-С) печени зародышей мыши при кратковременном культивировании in vivo.

1.3.2. Дифференцировочные потенции мезенхимы печени зародышей мышей.

2. ИССЛЕДОВАНИЕ СИНТЕЗА РНК В РОДОНАЧАЛЬНЫХ КРОВЕТВОРНЫХ КЛЕТКАХ КОСТНОГО МОЗГА.

2.1. Синтез РНК в популяции КОЕ-С костного мозга интактных животных.

2.1.1. Пролиферативная активность КОЕ-С.

2.1.2. Действие ингибиторов ДНК-зависимого синтеза РНК — антибиотиков сиби-ромицина и актиномицина Д на КОЕ-С.

2.1.3. Действие радиотоксических доз ЗН- уридина на КОЕ-С.

2.1.4. Синтез РНК в КОЕ-С на разных этапах выделения кроветворных клеток ех vivo.

2.1.5. Колониеобразующая активность КОЕ-С после экспозиции с актиномицином Д в дозе 0,04 мкг/мл/г, блокирующей синтез рибосомальной РНК.

2.1.6. Специфичность действия низких доз актиномицина Д.

2.2. Синтез рРНК в родоначальных кроветворных клетках (КОЕ-С) при экспериментально вызванной анемии.

3. АНАЛИЗ НЕКОТОРЫХ ЭТАПОВ КРОВЕТВОРНОГО И СТРОМАЛЬНОГО РЯДОВ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ С ПОМОЩЬЮ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ.

3.1. Динамика содержание КОЕ-С в костном мозге и селезенке после однократного введения дипина.

3.2. Повреждение клеток стромы 5-фторурацилом и дипином и регенерация кроветворной ткани.

4. ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ КОСМИЧЕСКОГО ПОЛЕТА НА РОДОНАЧАЛЬНЫЕ КРОВЕТВОРНЫЕ КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ.

4.1. Содержание КОЕ-С в кроветворных органах половозрелых животных.

4.2. Динамика возрастных изменений содержания КОЕ-С в кроветворных органах крыс, экспонированных на борту биоспутника в плодном периоде развития.

5. ВЛИЯНИЕ НЕПРЕРЫВНОГО ГАММА- ОБЛУЧЕНИЯ В НИЗКИХ ДОЗАХ НА РОДОНАЧАЛЬНЫЕ КРОВЕТВОРНЫЕ (КОЕ-С) И СТРОМАЛЬНЫЕ (КОЕ-Ф) КЛЕТКИ.

5.1. Содержание кроветворных родоначальных клеток (КОЕ-С) в костном мозге.

5.2. Содержание родоначальных стромальных клеток (КОЕ-Ф) в костном мозге.

5.3. Величина эктопических трансплантатов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспериментальное исследование клеточных механизмов кроветворения в онтогенезе»

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема клеточной дифференцировки является крайне актуальной для современной биологии и медицины. Интерес к ней специалистов разнообразного профиля (молекулярных биологов, генетиков, цитологов, биологов развития, и т.п.) резко возрос в связи с последними успехами в изучении эмбриональных и тканеспецифи-ческих стволовых клеток и не в последнюю очередь связан с поиском методов клеточной терапии для восстановления поврежденных органов и тканей.

Кроветворная ткань представляет собой уникальную и наиболее экспериментально продвинутую модель для изучения механизмов дифференцировки и регенерации. Для нее характерно многообразие клеточных форм, различающихся по степени зрелости и специфике обменных процессов, а также линий (ростков) дифференцировки (эритроидная, гра-нулоцитарная, моноцитарная, мегакариоцитарная, лимфоидная). Клеточную основу, обеспечивающую восстановление зрелых клеток крови и кроветворной ткани в целом после естественной гибели терминально дифференцированных клеток, в ходе патологических процессов или действия различных повреждающих агентов, составляют кроветворные стволовые клетки (КСК). Основные их свойства - способность к самоподцержанию и по-липотентность. Благодаря самоподцержанию КСК, возникнув в эмбриогенезе, не исчезают из кроветворной ткани и служат источником пополнения зрелых клеток на протяжении жизни организма. Полипотентность, т.е. способность давать потомство клеток, дифференцирующихся по многим направлениям, обеспечивает многообразие форменных элементов крови. Другое отличительное свойство кроветворной ткани — способность менять место локализации. Перемещение кроветворной ткани происходит в эмбриональном развитии, когда циркулирующие клетки репопулируют (заселяют) закладки кроветворных органов, а также в экспериментальных условиях и патологии при формировании эктопических очагов гемопоэза. Непременным условием нормально протекающего кроветворения является взаимодействие кроветворных стволовых и родоначальных клеток с клетками стромы, составляющими основу так называемого кроветворного микроокружения (КМО) (Старостин, 1986). Распознавание и удержание кроветворных клеток, их миграция осуществляется клетками КМО при участии молекул клеточной адгезии. Клетки КМО обеспечивают не только пространственную организацию кроветворных органов, но, контактируя с кроветворными клетками, выделяют и аккумулируют разнообразные факторы роста, регулирующие процессы пролиферации и дифференцировку КСК.

Исследования последнего десятилетия показали, что популяция КСК гетерогенна и включает два подотдела (компартмента) клеток, различающихся по фенотипу (антигенным характеристикам), продолжительности жизни, способности к дифференцировке и степени самообновления (Morrison, Weissman, 1994; Randal, Weissman, 1998; Kondo et al., 2003). Первый компартмент составляют КСК с неопределенно длительным самоподцер-жанием; второй — КСК, самоподдерживающиеся не более 3-6 недель. Мультипотентные (родоначальные) клетки входят в компартмент, который следует в диффероне за стволовым, и не обладают экстенсивным самоподдержанием. Часть мультипотентных клеток (общие миелоидные предшественники) дифференцируются в эритроидном, мегакариоци-тарном и миелоидном направлениях, способны образовывать в селезенке облученного животного клоны кроветворных клеток (колонии), различимые визуально, и представляют собой так называемые колониеобразующие единицы селезенки — КОЕ-С, давшие название методу их количественного учета in vivo. Хотя КОЕ-С не идентичны КСК, метод селезеночных колоний, используется для анализа КСК и в настоящее время. Его модификация, предложенная японскими исследователями, позволила продемонстрировать, что истинные КСК также способны формировать визуально различимые кроветворные клоны-колонии в селезенке в более поздние сроки по сравнению с мультипотентными предшественниками (Liang et al., 1999; Ikehara, 2000; Yang et al., 2002). Таким образом, метод селезеночных колоний остается адекватной моделью исследования клоногенных кроветворных клеток разной степени зрелости и в зависимости от срока наблюдения позволяет вести дифференцированный учет как родоначальных клеток, так и КСК.

Принципиальная организация кроветворного дифферона, как последовательного ряда клеточных форм со специфическими для каждой потенциями к дифференцировке и размножению, не вызывает сомнений. Однако к началу нашего исследования были неясны некоторые вопросы организации компартмента родоначальных клеток, свойства отдельных их категорий, их цитофизиологические особенности, а также изменения, которые происходят в популяции КОЕ-С в индивидуальном развитии.

Прижизненное наблюдение кроветворных клонов-колоний в селезенке, образованных костномозговыми КОЕ-С показало, что колониеобразование является динамическим процессом появления и исчезновения клонов, образуемых клоногенными клетками, различающимися по степени зрелости и времени формирования клона (Magli et al., 1982; Priestley, Wolf, 1985; Molineux et al., 1986; Wolf, Priestley, 1986). Было обнаружено, что у половозрелых животных популяция КОЕ-С костного мозга гетерогенна, и в зависимости от срока регистрации колоний можно анализировать категории более «молодых» и более «старых» КОЕ-С (Magli et al., 1982). К началу нашего исследования немногочисленные 8 факты указывали на то, что эмбриональная кроветворная ткань отличается по содержанию клоногенных клеток от костного мозга взрослых животных (Micklem, 1972, Gaidul et al., 1984). Однако данные о составе популяции эмбриональных КОЕ-С были весьма скудны и касались, в основном, печени зародышей одного срока развития (Metcalf et al., 1983; Johnson, Nicola, 1984; Gaidul et al., 1986). Наиболее полный труд Меткалфа и Мура, посвященный эмбриональным аспектам кроветворения, был создан, когда КОЕ-С рассматривались как однородная популяция клеток (Metcalf, Moore, 1971). Поэтому весьма актуальным представляется детальное исследование изменений в составе родоначальных кроветворных клеток в кроветворных органах в разные сроки пренатального онтогенеза, завершающиеся формированием дефинитивной кроветворной ткани. В постнатальном периоде, однако, в печени - органе, утратившим кроветворную функцию, Хрущовым с соавторами были описаны КОЕ-С и получены данные, что по некоторым характеристикам КОЕ-С печени половозрелых животных близки таковым из периферической крови (Хрущов и др., 1977; Старостин, 1986). Окончательный ответ на этот вопрос могло дать сравнительное исследование цитофизиологических характеристик индивидуальных КОЕ-С из различных кроветворных источников.

Как известно, одним из важных показателей клеточной активности является интенсивность синтеза РНК, меняющаяся в зависимости от стадии дифференцировки клетки, потребностей в белковом синтезе, фазы митотического цикла и т.д. В норме КСК и КОЕ-С представляют собой покоящиеся популяции клеток (Hodgson, Bradley, 1979; van Zant, 1984; Lerner, Harrison, 1990; Berardi et al., 1995; Ross et al., 1982; Morrison et al., 1997). Предполагалось, что синтез РНК в митотически инертных КОЕ-С, находится на достаточно низком уровне и для вступления в пролиферацию необходима его активация. Однако эта цитофизиологическая особенность КОЕ-С оставалась практически не изученной, и ее исследование нуждалось в новых подходах, поскольку традиционная радиоавтография не может быть использована для анализа клоногенных кроветворных клеток, не имеющих характерных морфологических признаков в отличие от дифференцированных клеток таких, например, как малые лимфоциты.

Костный мозг половозрелых животных является источником наряду с КСК и других стволовых клеток, в частности мезенхимных (стромальных), которые тестируются in vitro по образованию колоний фибробластоподобных клеток (КОЕ-Ф) и обладают, как и кроветворные клетки, определенной иерархической организацией (Owen, 1988). В прена-тальном и раннем постнатальном развитии стволовые клетки стромы выявлены в печени и селезенке, причем их численность, оцененная по числу формируемых ими колоний in vitro, соответствует гемопоэтической активности кроветворного органа (Van Den Heuvel et 9 al., 1987). Другой методический прием - эктопическая пересадка — позволяет вывить ме-зеихимные стволовые клетки функционально по их способности к дифференцировке в несколько типов стромальных клеток и формированию КМО, поддерживающего гемопоэз. Этот метод может быть с успехом использован для определения дифференцировочных потенций мезенхимных клеток, имеющихся в печени зародыша.

В рамках общей проблемы стволовых клеток и их роли в восстановлении кроветворной ткани значительный интерес представляет исследование, помимо кроветворных, также и стволовых клеток стромы, которые также являются мишенью для различного рода повреждающих факторов. Проблема резистентности (или напротив) чувствительности к тому или иному повреждающему фактору и репаративных потенций кроветворной и соединительной тканей, в целом, не теряет своей актуальности и является основополагающей не только для экспериментальной биологии, но и практической медицины. Так, например, успех терапии злокачественных заболеваний крови определяется правильным выбором лекарственного препарата, введением его в чувствительной фазе клеточного цикла, учетом избирательности его действия на те или иные категории клеток. Знание цитофи-зиологических особенностей КСК, структуры их популяции, антигенных характеристик, пролиферативного статуса, времени обновления и т.д. позволяет выбрать стратегию применения тех или иных цитостатических веществ таким образом, чтобы сочетать максимальную чувствительность к препарату дефектных клеток с максимальной сохранностью стволовых элементов. Не менее остро проблема КСК стоит при трансплантации кроветворных клеток реципиенту с иммунодефицитом, разрушенной (поврежденной) облучением или токсическими агентами кроветворной тканью, поскольку положительный эффект трансплантации зависит от качества трансплантируемого материала, т.е. от присутствия в инокулуме достаточного числа клоногенных клеток, обладающих потенциями стволовых. Именно донорские КСК, репопулируя кроветворные органы, обеспечивают восстановление гемопоэза. Исследование дифференцировочных и пролиферативных потенций кроветворных и стромальных СК после действия тех или иных неблагоприятных факторов позволяет оценить полноту репаративной регенерации кроветворной ткани.

Помимо практического применения цитотоксические препараты могут использоваться в качестве адекватного инструмента для изучения иерархической организации клеточных популяций. Экспериментальное удаление клеток определенной стадии дифферен-цировки позволяет не только определить их роль в восстановлении ткани, но и установить положение той или иной клеточной категории в диффероне. Учитывая специфику действия таких цитотоксических препаратов как 5-фторурацил и дипин, представляется весьма продуктивным использовать их для определения принадлежности исследуемых клеток к

10 той или иной стадии развития, их места в ряду кроветворной дифференцировки, а также участия в регенераторном процессе.

Еще одной фундаментальной и практически значимой проблемой, связанной с функционированием кроветворной ткани, является адаптация организма к несвойственной ему среде обитания. Способность быстро отвечать на функциональные запросы, изменения окружающей среды, стрессовые и экстремальные воздействия позволяют считать кроветворную и соединительную ткани уникальными объектами и адекватными тест-системами и для изучения различных внешних воздействий. В частности, нормальное функционирование кроветворной системы является одним из непременных условий космических полетов. Результаты многочисленных исследований свидетельствуют, что пребывание в космическом полете вызывает изменения в периферической крови у человека и млекопитающих (Berry, 1970; Газенко и др., 1974; Johnson et al., 1975; Leon et al., 1978, 1980; Илюхин, Бурковская 1981; Udden et al., 1995). Некоторые изменения, зарегистрированные в наиболее зрелом, периферическом, звене кроветворной системы могут быть вторичными и являться результатом более глубоких процессов, происходящих в кроветворной системе под влиянием факторов космического полета. Поэтому актуальность приобретают исследования других отделов кроветворного дифферона и, в первую очередь, отделов стволовых и родоначальных клеток, обеспечивающих обновление кроветворной ткани и поддержание кроветворения на постоянном уровне. Модельные эксперименты на лабораторных животных дают уникальную возможность на обширном и однородном материале получить максимально полную картину изменений в кроветворной системе, связанных с действием факторов полета. В экспериментах на биоспутниках серии «Космос», выполненных нами совместно с учеными Чехословацкой академии наук, было оценено влияние космического полета на стволовые кроветворные клетки млекопитающих (крыс) и плодов, развитие которых частично проходило в условиях полета.

Одним из наиболее значимых для кроветворной системы и постоянных космических факторов, помимо микрогравитации, является ионизирующее космическое излучение. Однако его влияние на кроветворную и соединительную ткани до настоящего времени остается практически не изученным. Следует подчеркнуть, что исследование подобного рода выходит за рамки космической программы и имеет медико-биологический, в том числе и экологический, аспект, поскольку у- облучение малой интенсивности является одним из компонентов радиоактивного природного фона, под воздействием которого живые организмы находятся в наземных условиях (Гусаров, Иванов, 2001; Кузин, 2002).

Из сказанного следует, что для понимания закономерностей клеточной дифференцировки весьма актуально проведение многоплановых исследований кроветворной и со

11 единительной тканей, включающих характеристику составляющих их клеточных популяций, детализацию дифферона в пре - и постнатальном развитии, участие отдельных субпопуляций в регенераторном ответе на разнообразные внешние воздействия. Результаты подобных исследований позволят дать более точную картину гистогенеза кроветворной и соединительной тканей.

Цели и задачи исследования. Основной целью работы явилось исследование:

- структурной (иерархической) организации некоторых этапов кроветворного и стромаль-ного дифферонов в индивидуальном развитии млекопитающих (мышей);

- влияния воздействий различной химической и физической природы на родоначальные кроветворные и стромальные клетки.

Конкретными задачами работы были следующие:

1. Исследование состава популяции родоначальных кроветворных клеток - КОЕ-С - и свойств отдельных их категорий на разных сроках пре - и постнатального развития.

2. Характеристика уровня синтеза РНК в популяции КОЕ-С.

3. Исследование чувствительности отдельных категорий КОЕ-С зародышей и взрослых животных к цитотоксическим препаратам (5-фторурацилу и дипину).

4. Исследование чувствительности родоначальных стромальных клеток (КОЕ-Ф) к действию цитотоксических препаратов (5-фторурацилу и дипину).

5. Характеристика потенций к дифференцировке мезенхимы печени в зависимости от уровня ее гемопоэтической активности.

6. Исследование влияния факторов космического полета на родоначальные кроветворные клетки в плодном периоде развития и постнатальном онтогенезе млекопитающих (крыс).

7. Изучение влияния непрерывного у- облучения в низких дозах на родоначальные кроветворные и стромальные клетки.

Научная новизна исследования. В ходе работы получены новые данные об иерархической организации кроветворного дифферона в пре - и постнатальном онтогенезе, цитофи-зиологических особенностях родоначальных кроветворных и стромальных клеток, об участии отдельных их категорий в репаративном процессе и реакции на различные воздействия.

1. Впервые в кроветворной ткани зародышей мыши и особей раннего постнатального периода выявлены клоногенные клетки, отсутствующие в дефинитивной кроветворной ткани и образующие в селезенке мелкие колонии недифференцированных клеток в поздние после трансплантации сроки. Охарактеризованы свойства новой категории кло-ногенных клеток, названных по месту их обнаружения - эмбриональной печени - КОЕ-С

12 эп. Показано, что КОЕ-С-эп находятся вне пролиферативного цикла, не самоподдерживаются, резистентны к 5-фторурацилу и кроличьей антисыворотке к головному мозгу мыши и на основании математического анализа их распределения могут быть причислены к стадии дифференцировки, предшествующей КОЕ-С - пре-КОЕ-С.

2. Получены данные об особенностях состава компартмента родоначальных клеток (КОЕ-С) в кроветворных органах (желточном мешке, печени, селезенке и костном мозге) на разных этапах онтогенеза. Они касаются соотношения разных типов клоногенных клеток (КОЕ-С-эп, КОЕ-С-7, КОЕ-С-11), пролиферативного статуса и т.д. и отражают функциональное состояние кроветворной системы, свойственное тому или иному этапу индивидуального развития особи.

3. Установлено, что КОЕ-С-11, присутствующие в печени в постнатальном онтогенезе, представляют собой более зрелые клетки по сравнению с КОЕ-С-11 из костного мозга половозрелых животных или печени зародышей, и идентичными КОЕ-С-11 из периферической крови. Таким образом, очевидно, КОЕ-С поступают в печень из циркуляции и не являются «дремлющими» эмбриональными.

4. Исследован синтез РНК в морфологически неидентифицируемых родоначальных клетках, как один из важнейших показателей их готовности к вступлению в митоз и коло-ниеобразованию. Установлено, что популяция КОЕ-С характеризуется интенсивным синтезом РНК и способностью к его быстрой активации, что свидетельствует о соответствия состояния пролиферативного покоя КОЕ-С Gi- периоду клеточного цикла. В стационарных условиях популяция КОЕ-С гетерогенна по содержанию рРНК и содержит клетки, как с относительно низким, так и высоким уровнем синтеза рРНК. Обнаружена стимуляция колониеобразования под влиянием актиномицина Д в дозах, подавляющих синтез рРНК.

5. Выявлено, что однократное введение алкилирующего препарата дипина вызывает длительное нарушение стационарного состояния кроветворной ткани, проявляющееся в периодических (синусоидальных) изменениях содержания кроветворных родоначальных клеток (КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11) в костном мозге и селезенке. Происходящие на протяжении жизни мыши периодические спады и подъемы численности КОЕ-С - транзиторной популяции клеток - дают основание заключить, что, во-первых, КСК, которые их генерируют, неоднородны по чувствительности к дипину, во-вторых, дифференцировка КСК осуществляется на основе клональной сукцессии

6. В популяции стромальных клеток костного мозга выделены категории клеток, различающихся по устойчивости к цитотоксическим препаратам (5-фторурацилу и дипину) и участию в регенерации эктопических трансплантатов. Наиболее чувствительные к

13 дипину и резистентные к 5-фторурацилу клетки обладают высокими репаративными потенциями и, очевидно, могут быть отнесены к стволовым клеткам стромы.

7. Впервые показано, что мезенхима печени зародышей в период активного кроветворения обладает широкими дифференцировочными потенциями. При трансплантации печени 14-суточных зародышей мыши под капсулу почки или в подкожную соединительную ткань половозрелых реципиентов происходит последовательное новообразование гиалинового хряща, кости и кроветворных очагов.

8. Впервые установлено снижение уровня миелопоэза у крыс после кратковременного космического полета, выражающееся в значительном сокращении численности кроветворных родоначальных клеток (КОЕ-С). Впервые также исследовано содержание КОЕ-С в кроветворных органах в пре- и раннем постнатальном развитии после экспозиции на борту биоспутника в плодном периоде.

9. Впервые обнаружен феномен стимулирующего действия непрерывного у- облучения в малых дозах (радиационный гормезис) на стромальные родоначальные клетки костного мозга, который выражается в активации пролиферации, увеличении численности популяции КОЕ-Ф и усиление регенераторных потенций стромальных родоначальных клеток.

Теоретическая значимость работы. В данной работе проведено комплексное исследование родоначальных кроветворных и стромальных клеток, согласованная работа которых обеспечивает нормальное функционирование кроветворной ткани как единой системы.

В кроветворном ряду дифференцировки обнаружена ранее неописанная в литературе категория клоногенных кроветворных клеток, являющаяся стадией дифференцировки, предшествующей КОЕ-С, и характерная для кроветворной ткани пренатального и раннего постнатального периодов развития. Получены экспериментальные данные, объективно свидетельствующие в пользу концепции функционирования КСК на основе кло-нальной сукцессии. В стромальном диффероне выявлены категории клеток, различающихся по регенераторным потенциям и чувствительности к цитотоксическим агентам. Предложена гипотетическая модель стромального ряда дифференцировки.

Выявлено негативное воздействие факторов космического полета на миелопоэз, которое заключается в резком уменьшении численности родоначальных кроветворных клеток в кроветворных органах млекопитающих.

Обнаружен феномен радиационного гормезиса, проявляющийся в увеличении про-лиферативной активности и численности родоначальных клеток стромы, а также усиление их способности к регенерации. Установление этого факта кардинально меняет сложившееся представление о радиации в сверхмалых дозах, как незначимом для кроветворной и

14 соединительной тканях воздействии, и диктует необходимость расширения исследований в данном направлении.

Результаты углубляют и детализируют представления об организации стволового отдела, отдельных этапах дифференцировки кроветворных и стромальных клеток, цито-физиологических особенностях родоначальных кроветворных и стромальных клеток. Представленные в работе данные способствуют пониманию ведущей роли стволовых и родоначальных (мультипотентных) клеток в восстановительных процессах, связанных с действием разнообразных факторов. В практических целях кроветворную и стромальную ткани можно использовать как тест-системы для регистрации влияния разнообразных факторов внешней среды на организм животных и человека. Оценка резистентности клеточных популяций, входящих в их состав, позволяет определить репаративные возможности кроветворной и стромальной тканей, предвидеть и в перспективе предотвращать последствия неблагоприятных воздействий.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на следующих рабочих, Всесоюзных, Всероссийских и Международных конференциях, совещаниях и симпозиумах: 6-м Совещании европейской группы по изучению клеточной пролиферации (Москва, СССР, 1973), Республиканской конференции «Структурные и % функциональные изменения в клетках мезенхимы» (Киев, СССР, 1982), 5-м Ежегодном симпозиуме комиссии по гравитационной физиологии международного союза физиологических наук (Москва, СССР, 1983 г.), 17-м Совещании постоянно действующей рабочей группы соцстран по космической биологии и медицине программы «Интеркосмос» (Брно, Чехословакия, 1984 г.), 18-м Совещании постоянно действующей рабочей группы соцстран по космической биологии и медицине программы «Интеркосмос» (Гагра, СССР, 1985 г.), 7-м Всесоюзном совещании эмбриологов (Москва, СССР, 1986), Научной конференции «Методологические основы изучения и преподавания морфогенеза тканей и органов в адаптивных процессах» (Иркутск, СССР, 1987 г.), 1-й Республиканской научной конференции «Управление морфогенезом тканей и органов в процессе адаптации» (Иркутск, СССР, 1989 г.), Симпозиуме «Volga-Wilsede» (Москва, СССР, 1990), 33-м Международном конгрессе физиологических наук (Скт-Пб, Россия, 1997 г.), Международной конференции по регенерации (Кельн, Германия, 1997), Конференции «Клеточные и молекулярные аспекты регенерации и реконструкции тканей» (Москва, Россия, 1998 г.), 33-й Ассамблее COSPAR (Варшава, Польша, 2000), III Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (Москва, 2002), 34-й Ассамблее COSPAR (Хьюстон, США, 2002), 1-м съезде Общества клеточной биологии (С.-Пт., Россия, 2003 г.), 35-й Ассамблее COSPAR (Париж, Франция, 2004). Апробация диссертации проведена на семина

15 ре отдела цитологии и гистологии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 19 января 2004 года.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Домарацкая, Елена Ивановна

выводы

1. Выявлены отличия кроветворной ткани эмбрионального и раннего постнаталь-ного развития лабораторных мышей.

• Впервые в кроветворной ткани (желточном мешке, печени, селезенке и костном мозге) ранних этапов индивидуального развития (в пренатальном периоде и в первую неделю после рождения) обнаружена особая категория клоногенных кроветворных клеток - КОЕ-С-эп и охарактеризованы их свойства. КОЕ-С-эп образуют небольшие клоны клеток бластного типа, которые регистрируются на поверхности селезенки в поздние сроки после трансплантации (на 11 сутки). КОЕ-С-эп находятся вне пролифера-тивного цикла, резистентны к оксимочевине, 5-фторурацилу (5-ФУ) и к антисыворотке к головному мозгу мыши, что характеризует их как менее зрелые, по сравнению КОЕ-С, клетки. Математический анализ распределения числа мелких селезеночных колоний подтвердил, что клетки, ответственные за их образование - КОЕ-С-эп - представляют собой стадию дифференцировки, предшествующую КОЕ-С - пре-КОЕ-С.

• На разных этапах онтогенеза компартмент КОЕ-С характеризуется определенным соотношением входящих в него трех категорий клоногенных кроветворных клеток (КОЕ-С-7, КОЕ-С-11 и КОЕ-С-эп), что отражает функциональное состояние кроветворной системы, свойственное тому или иному периоду индивидуального развития особи.

2. Впервые показано, что мезенхима печени 14-суточных зародышей в период ее активного кроветворения обладает широкими дифференцировочными потенциями. При эктопической трансплантации половозрелым реципиентам среди мезенхимных клеток выявлены предшественники гиалинового хряща, кости и кроветворной стромы.

3. С помощью ретрансплантации индивидуальных селезеночных колоний показано, что КОЕ-С-11 из печени половозрелых животных по способности к самоподдержанию КОЕ-С-11 идентичны таковым из периферической крови, т.е. не являются исходно печеночными и, вероятнее всего, поступают в печень из циркуляции.

4. При анализе вступления родоначальных кроветворных клеток (КОЕ-С) костного мозга в клеточный цикл, проведенном с помощью ингибиторов ДНК-зависимого синтеза РНК и радиотоксических доз 3Н-уридина, выявлен интенсивный синтез РНК и способность к быстрой его активации у значительной части популяции КОЕ-С. Это подтверждает представление о том, что состояние пролиферативного покоя КОЕ-С соответствует Gi-периоду клеточного цикла.

5. При изучении синтеза рРНК в популяции КОЕ-С костного мозга интактных мышей и после стимуляции кроветворения кровопотерей установлено, что а) в стационарных условиях среди КОЕ-С имеются клетки, как синтезирующие, так и не синтезирующие рРНК, б) в популяции КОЕ-С, вступивших под воздействием кровопотери в пролиферацию, число клеток, синтезирующих рРНК, возрастает. В популяции КОЕ-С, сохранившей, несмотря на кровопотерю, состояние покоя, актиномицин Д в дозах, ингибирующих синтез рРНК, стимулирует колониеобразование.

6. Проведено сравнительное исследование цитотоксического действия 5-ФУ на способность различных категорий родоначальных кроветворных клеток (КОЕ-С-7, КОЕ-С-11, КОЕ-С-эп) из кроветворной ткани зародышей и половозрелых мышей к образованию кроветворных колоний. Показано, что целостность структурной организации кроветворной ткани повышает резистентность КОЕ-С-11 к цитотоксическому действию 5-ФУ. В условиях in vitro эмбриональные КОЕ-С-11 и КОЕ-С-7 одинаково чувствительны к 5-фторурацилу и не отличаются по этой характеристике от соответствующих категорий КОЕ-С костного мозга. КОЕ-С-эп - устойчивы к действию 5-ФУ.

7. Изучено действие алкилирующего препарата дипина на родоначальные кроветворные клетки костного мозга и селезенки взрослых мышей. Установлено, что дипин вызывает длительное нарушение стационарного состояния кроветворной ткани, которое проявляется в периодических изменениях содержания КОЕ-С-11 и КОЕ-С-7 в костном мозге и селезенке. Происходящие на протяжении жизни мыши спады и подъемы численности КОЕ-С - транзиторной популяции клеток, дает основание заключить, что, во-первых, кроветворные стволовые клетки неоднородны по чувствительности к дипину, во-вторых, их дифференцировка осуществляется на основе клональной сукцессии.

8. Исследованы содержание КОЕ-Ф в костном мозге и регенераторные потенции костномозговой кроветворной стромы после воздействия 5-ФУ и дипина - препаратов, избирательно токсичных для клеток разной степени зрелости. На основании различий в чувствительности (устойчивости) стромальных клеток к 5-ФУ и дипину, а также в характере восстановления кроветворной ткани после удаления той или иной субпопуляции дана ци-тофизиологическая характеристика стромальных клеток, обладающих разными потенциями, и предложена гипотетическая модель гистогенетического ряда стромальных (мезенхимных) клеток.

9. Изучено влияние космического полета на кроветворную ткань млекопитающих (крыс). У взрослых животных обнаружено снижение уровня миелопоэза, что выражается в значительном сокращении численности родоначальных кроветворных клеток (КОЕ-С) в костном мозге и селезенке. Кратковременное пребывание в невесомости в плодном периоде развития (13-18 суток) не влияет существенно на возрастную динамику этих клеток в кроветворных органах в постнатальном развитии.

10. Исследовано влияние сверхмалых доз непрерывного у- облучения низкой интенсивности на родоначальные кроветворные и стромальные клетки костного мозга. Впервые обнаружен феномен стимулирующего действия у- облучения в малых дозах (мощность дозы — 0,15 сГр, суммарная доза - 1,5 сГр) на стромальные клетки, который выражается в повышении пролиферативной активности и увеличении численности КОЕ-Ф в костном мозге, а также в усилении регенераторных потенций стромы, что проявляется в увеличении размеров создаваемой de novo кроветворной территории. Родоначальные кроветворные клетки устойчивы к у- облучению в использованных дозах. Пролиферативная активность и содержание как более «молодых» (КОЕ-С-11), так и более «зрелых» (КОЕ-С-7) кроветворных клеток под влиянием облучения существенно не меняются.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В проведенном экспериментальном исследовании получены новые сведения о ци-тофизиологических особенностях и структуре популяции родоначальных кроветворных клетках в индивидуальном развитии, а также реакции родоначальных кроветворных и стромальных клеток на воздействия химической и физической природы (антибиотики, ци-тотоксические препараты, микрогравитацию, радиацию).

Наше исследование объединяет несколько направлений, связанных общей проблемой дифференцировки родоначальных кроветворных и стромальных клеток.

1. Впервые проведено подробное исследование популяции родоначальных кроветворных клеток в кроветворных органах в пре- и постнатальном онтогенезе. В кроветворной ткани зародышей (желточном мешке, печени и селезенке) и животных первых дней жизни (селезенке и костном мозге), помимо известных категорий родоначальных кроветворных клеток - КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11, характерных и для кроветворных органов половозрелых мышей, выявлен новый, не описанный ранее тип клеток - КОЕ-С-эп. Эти клетки образуют в селезенке мелкие колонии бластного типа в поздние сроки после трансплантации. В селезенке и костном мозге половозрелых животных КОЕ-С-эл практически отсутствуют. По своим свойствам КОЕ-С-эп относятся к стадии дифференцировки, предшествующей КОЕ-С. В отличие от эмбриональных КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11, они не пролифери-руют, устойчивы к 5-ФУ и антисыворотке против головного мозге мыши. Для КОЕ-С-эп характерна высокая вариабельность числа образуемых ими колоний по сравнению с колониями, формируемыми КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11. С помощью методов математической статистики показано, что распределение числа мелких колоний, в отличие от крупных колоний, I не подчиняется закону Пуассона. Это позволило заключить, что крупные колонии образованы непосредственно КОЕ-С, тогда как мелкие колонии — за счет пролиферации клеток предыдущих стадий, т.е. пре-КОЕ-С. Расчеты показали, что концентрация пре-КОЕ-С в печени зародыша составляет 2,67 на 105 клеток, а среднее число КОЕ-С, образованных из одной пре-КОЕ-С - около 260.

Структура компартмента родоначальных клеток, т.е. относительное содержание КОЕ-С различных категорий в кроветворных органах, отражает функциональное состояние кроветворной ткани той или иной стадии развития и меняется в соответствии с потребностями организма. Так, например, в период интенсивного роста зародыша и, в связи с этим, большой потребности тканей и органов в кислороде, в популяции КОЕ-С-7 печени преобладают, ближайшие предшественники коммутированных к эритроидной дифференцировке БОЕ-Э и КОЕ-Э. Перемещение гемопоэза в костный мозг также сопровождается активацией эритропоэза. Когда формирование и рост кроветворной ткани (печени зародыша или костного мозга взрослого животного) заканчивается, в популяции возрастает относительное содержание более потентных КОЕ-С-11, а доля более дифференцированных КОЕ-С-7 уменьшается. Присутствие КОЕ-С-эп является отличительным свойством кроветворной ткани ранних этапов развития и, по всей видимости, КОЕ-С-эп представляют собой транзиторную популяцию клеток, исчезающую из кроветворных органов вскоре после рождения.

Сохраняется ли популяция КОЕ-С в печени после перемещения гемопоэза в костный мозг? Сравнение КОЕ-С-11 из различных источников (костного мозга, периферической крови, печени зародышей и половозрелых животных), а также эксперименты по эктопической трансплантации печени дают отрицательный ответ на этот вопрос. Во-первых, уже в первые дни после рождения мезенхима печени утрачивает способность к созданию кроветворного микроокружения, эффективно поддерживающего кроветворение. Во-вторых, КОЕ-С-11 печени взрослых мышей по способности давать вторичные КОЕ-С соответствуют таковым из периферической крови. Таким образом, тестируемые в печени в постнатальный период КОЕ-С не могут быть признаны резидентными и, скорее всего, поступают в нее из циркуляции.

2. Изучены цитофизиологические особенности КОЕ-С - стадии дифференцировки, не идентифицируемой морфологически. Исследован синтез РНК, как одно из условий, необходимых для вступления в цикл покоящейся популяции КОЕ-С. Применив метод 3Н-уридинового «самоубийства» в сочетании с ингибиторами ДНК-зависимого синтеза РНК, мы оценили синтез РНК в КОЕ-С в зависимости от уровня пролиферативной активности и состояния кроветворения. Впервые КОЕ-С были охарактеризованы как неоднородная по уровню синтеза РНК (в том числе и рРНК) популяция. В ней содержатся клетки, интенсивно синтезирующие РНК, и клетки, способные быстро активировать этот синтез. Высокий уровень синтеза РНК и способность к быстрой его активации в покоящейся популяции КОЕ-С подтверждает представление о соответствии состояния покоя КОЕ-С Gi- периоду клеточного цикла.

Вступление КОЕ-С в пролиферацию под влиянием экспериментально вызванной анемии сопровождается активацией синтеза рРНК и, как следствие, значительным повышением доли КОЕ-С, чувствительных к актиномицину Д. В ряде случаев в кроветворной ткани, получившей сигнал к регенерации, КОЕ-С сохраняют состояние цитокинетическо-го покоя, но реагируют на актиномицин увеличением колониеобразования. Этот ответ на антибиотик-ингибитор синтеза РНК мы рассматриваем, как экспериментальную демонстрацию на примере КОЕ-С механизма, регулирующего численность клеток в популяции и защищающего ее от истощения при функциональном стрессе. Не исключено, что актиномицин Д выступает, как ингибитор синтеза РНК белков, блокирующих переход клетки из Gi в S-фазу (возможно, белка р53 и/или р21).

3. Другое направление нашей работы было посвящено исследованию некоторых этапов дифференцировки кроветворных и стромальных клеток. С этой целью мы использовали цитотоксические препараты, обладающие избирательным действием на клетки разной степени зрелости, а именно, 5-ФУ и дипин, поражающие соответственно более зрелые и более молодые клетки.

В стромальном ряду с помощью этого подхода выявлено несколько категорий клеток, различающихся по степени зрелости и участию в восстановлении кроветворной ткани костного мозга. Критерием дифференцировочных и регенераторных потенций стромальных клеток служило построение de novo полноценного кроветворного микроокружения, завершающегося образованием кроветворного органа.

Установлено, что стромальные клетки, ответственные за регенерацию трансплантата в полном объеме, чрезвычайно чувствительны к дипину, но относительно резистентны к 5-ФУ. Высокий репаративный потенциал позволяет отнести их к категории наиболее молодых мезенхимных (вероятнее всего, стволовых) клеток. Напротив, стромальные клетки с ограниченными репаративными потенциями устойчивы к дипину; они, хотя и создают кроветворную территорию, но не способны восстановить ее размер до контрольного уровня. Среди популяции стромальных клеток обнаружены клетки, участвующие в построении кроветворной территории в ранние сроки после трансплантации. Они чувствительны к 5-ФУ, однако, их отсутствие не влияет на восстановление трансплантата. Полученные результаты послужили основой для построения гипотетической модели гистогене-тического ряда мезенхимных клеток.

Весьма продуктивным оказалось исследование с помощью дипина кроветворного дифферона. Однократное воздействие дипином вызывает длительное нарушение стационарного состояния кроветворной ткани, что выражается в периодических спадах-подъемах численности исследованных категорий КОЕ-С в костном мозге и селезенке. Характер изменений содержания КОЕ-С, клеток с ограниченным самоподдержанием, свидетельствует о чрезвычайно высокой токсичности дипина в отношении наиболее молодых и потентных клеток кроветворного ряда и отражает клоногенную активность последовательно выходящих в дифференцировку выживших стволовых кроветворных клеток. Мы расцениваем подобную динамику численности КОЕ-С, как экспериментальное подтверждение того, что функционирование кроветворного дифферона осуществляется на основе клональной сукцессии.

4. Впервые в модельных экспериментах на млекопитающих оценено влияние факторов космического полета на морфологически неидентифицируемые кроветворные родо-начальные клетки. Показано, что краткосрочный космический полет приводит к достоверному уменьшению содержания КОЕ-С в кроветворных органах. В костном мозге это вызвано действием специфических, тогда как в селезенке - неспецифических факторов полета. Вместе с тем, кратковременная экспозиция в невесомости в плодном периоде не влияет существенно на возрастную динамику содержания КОЕ-С в кроветворных органах, свойственную животным, пренатальное развитие которых прошло в наземных условиях.

5. Установлено, что непрерывное у- облучение в низких дозах (мощность дозы 0,15 сГр/сут, суммарная доза - 1,5 сГр) обладает стимулирующим действием на стромальные родоначальные клетки (КОЕ-Ф). Оно проявляется в усилении пролиферативной активности и увеличении численности КОЕ-Ф в костном мозге. Регенераторная способность стромы костного мозга, оцененная методом эктопической трансплантации по размеру вновь создаваемой кроветворной территории, существенно увеличивается под влиянием непрерывного гамма-излучения низкой мощности. Поскольку за рост эктопических трансплантатов, как было показано в наших экспериментах с цитотоксическими препаратами дипином и 5-ФУ, ответственны, очевидно, стволовые клетки стромы, с большой долей уверенности можно утверждать, что мы обнаружили эффект радиационного гормезиса именно для этой популяции клеток. В отличие от стромальных, кроветворные родоначальные клетки не чувствительны к использованным дозам радиации: изменения числа КОЕ-С в S-фазе и их содержания в костном мозге не происходит.

Безусловно, накопление фундаментальных знаний в области биологии стволовых и родоначальных клеток мезенхимного и кроветворного рядов дифференцировки может служить основой для понимания закономерностей функционирования стволовых клеток иной тканеспецифической природы. Обнаружение феномена радиационного гормезиса открывает новые перспективы в исследовании мезенхимных клеток, имеющих разнообразную тканевую локализацию. Активация клеток, способных к миграции и обладающих гистогенетической пластичностью, может представлять серьезную медико-биологическую проблему. Наша работа открывает перспективы для этого направления исследований, которое потребует более детального изучения с помощью привлечения адекватных модельных систем и методов анализа, специфичных для клеток того или иного гистогенетиче-ского ряда.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Домарацкая, Елена Ивановна, 2004 год

1. Ахмадиева А.Х., Тяжелова В.Г. Изменение способности КОЕ-С образовывать макроколонии при длительном хроническом облучении. Радиобиология, 1989, т. 29, №. 2, стр. 211-214.

2. Бондаренко В.А., Митрикас В.Г., Цетлин В.В. Радиационная обстановка на ОК "Мир" на фазе минимума 22-го цикла солнечной активности (1994-1996 гг.). Авиакосм. биология и эколог, медицина. 2000, т. 34, №1, стр. 21-25.

3. Бутомо Н.В., Иванов В.Б. Некоторые характеристики стволовых кроветворных клеток мышей в фазе повышенной радиорезистентности после сублетального облучения. Радиобиология, 1989, т. 29, № 2, стр. 266- 268.

4. Газарян Л.Г., Шуппе Н.Г., Кульминская А.С. Синтез РНК в присутствии малых доз актиномицина. ДАН СССР, 1965, т. 160, № 6, стр. 1411-1413.

5. Газенко О.Г., Ильин Е.А., Парфенов Г.П. Биологические исследования в космосе (некоторые итоги и перспективы). Изв. АН СССР (серия биол.), 1974, № 4, стр. 461475.

6. Газенко О.Г., Генин A.M., Ильин Е.А. и др. Адаптация к невесомости и ее физиологические механизмы (по материалам экспериментов с животными на биологических спутниках Земли). Изв. АН СССР, серия биол., 1980, № 1, стр. 5-18.

7. Гаузе Г.Г., Дудник Ю.В., Долгилевич С.М. Подавление синтеза нуклеиновых кислот противоопухолевым антибиотиком сибиромицином. Антибиотики, 1972, т. 17, № 5, стр. 413-419.

8. Гусаров И.И., Иванов С.И. О защитных эффектах действия малых доз ионизирующего излучения. АНРИ, 2001, № 4 (27), стр. 8-17.

9. Декстер Т.М. Кроветворные ростовые факторы: их биологическое действие и возможности клинического использования. Онтогенез, 1991, т. 22, № 4, стр. 341-364.

10. Домарацкая Е.И., Мичурина Т.В., Никонова Т.А., Хрущов Н.Г. Влияние факторов космического полета на периферическую кровь тритона Pleurodeles waltlii. Изв. Академии наук, серия биологическая, 1994, № 4, стр. 644-649.

11. Дризе Н.И., Гуревич О. А., Удалов Г.А., Чертков И.Л. Иерархия ранних кроветворных предшественников: пре-КОЕ-С и родоначальная кроветворная клетка. Онтогенез, 1987, т. 18, № 1, стр. 42-50.

12. Дурнова Г.Н., Капланский А.С., Португалов В.В. Влияние 22-суточногокосмического полета на лимфоидные органы крыс. Косм. биол. и авиакосм. мед., 1977, т. 11, № 2, стр. 53-57.

13. Епихина С.Ю, Лациник Н.В. Пролиферативная активность стромальных клеток-предшественников костного мозга, обладающих клоногенными свойствами. Бюлл. эксперим. биол., 1976, № 1, с.55.

14. Зотин А.А. Иммунологические маркеры в исследованиях гистогенеза кроветворной ткани. Успехи совр. биол., 1985, т. 100, №4, стр. 145-159.

15. Зотин А.А., Домарацкая Е.И., Прянишникова О.Д. О существовании пре-КОЕ-С в печени зародышей мыши. Онтогенез, 1988, т. 19, стр. 21.

16. Илюхин А.В., Бурковская Т.Е. Цитокинетическая оценка эритропоэза при длительных орбитальных полетах. Косм. биол. и авиакосм, мед., 1981, т. 6, стр. 42-46.

17. Кейлис-Борок И.В., Лациник Н.В., Епихина С.Ю., Фриденштейн А.Я. Динамика образования колоний фибробластов в монослойных культурах костного мозга по данным включения 3Н-тимидина. Цитология, 1971, т. 13, стр. 1402-1411.

18. Кузин A.M. Роль природного радиоактивного фона и вторичного биогенного излучения в явлениях жизни. М, «Наука», 2002, 79 стр.

19. Лациник Н.В., Епихина С.Ю. Адгезивные свойства клеток кроветворной и лимфоид-ной ткани, образующих колонии фибробластов в монослойных культурах. Бюлл. эксперим. биол., 1973, № 12, стр. 86-90.

20. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М., «МИР», 1969,645 стр.

21. Макеева В.Ф., Комолова Г.С., Серова Л.В. и др. Активность деполимераз ДНК в селезенке крыс после полета на спутнике «Космос-605». Космич. биол. авиакосм, мед., 1976, т. 17, №3, стр. 32-36.

22. Макеева В.Ф., Комолова Г.С., Егоров И.А. Биосинтез нуклеиновых кислот. В кн.: Онтогенез млекопитающих в невесомости. М. «Наука», 1988, стр. 51-53.

23. Малыжев В.А., Пелевина И.И., Афанасьев Г.Г. и др. Состояние иммунной системы при воздействии малых уровней ионизирующей радиации: исследования в 16-километровой зоне аварии на ЧАЭС. Радиац. биол. радиоэкол. 1993, т. 33, вып. 1(4), стр. 470-478.

24. Митрикас В.Г., Цетлин В.В. Проблемы обеспечения радиационного контроля на ОПС «МИР» в 22-м цикле солнечной активности. Косм, исслед. 2000, №2, стр. 113118.

25. Оганов В.С, Бакулин А.В., Ильин Е.А. и др. Структура и механические свойства костной ткани. В кн.: Онтогенез млекопитающих в невесомости. М., «Наука», 1988, стр.56-60.26.