Jedi и другие гены, участвующие в регуляции дифференцировки и самоподдержания стволовых и прогениторных клеток крови тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Розов, Федор Николаевич

• Розов, Федор Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Розов, Федор Николаевич

Оглавление.

Основные использованные обозначения и сокращения.

Введение.

1. Актуальность проблемы.

2. Цель работы.

3. Основные задачи.

4. Научная новизна и практическое значение работы.

5. Основные положения, выносимые на защиту.

6. Благодарности.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Современные представления о гемопоэзе.

1.2. Ниша стволовой клетки костного мозга.

1.2.1. Ниша стволовой клетки в эндостале.

1.2.2. Васкулярная ниша СКК.

1.3. Сигнальные пути, регулирующие самоподдержание и дифференцировку СКК и клеток-предшественников.

1.3.1. Передача сигнала через рецепторы Wnt.

1.3.2. Ангиопоэтины и передача сигнала через рецепторы Tie.

1.3.3. Транскрипционные факторы группы НОХ.

1.3.4. Молекулы Hedgehog и передача сигнала через рецепторы

1.3.5. Белок Kirre/NEPH2.

1.3.6. Рецепторы FGF.

1.3.7. Адгезионные взаимодействия гемопоэтических клеток со стромальным окружением.

1.4. Передача сигнала через рецепторы Notch и их роль в гемопоэзе.

1.4.1. Роль рецепторов Notch в дифференцировке клеток. Гомотипические и гетеротипические модели взаимодействия.

1.4.2. Молекулярный механизм передачи сигнала через рецепторы Notch.

1.4.3. CSL-независимый путь.

1.4.4. Рецепторы Notch в гемопоэзе.

1.4.5. Лиганды Notch в гемопоэзе.

1.4.6. Растворимые и иммобилизованные лиганды Notch.

1.5. Проблема экспансии стволовых клеток in vitro.

1.6. Анализ генной экспрессии микроокружения стволовой клетки.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Методы культуры клеток.

2.1.1. Клеточные линии.

2.1.2. Получение популяций гемопоэтических клеток костного мозга.

2.1.3. Получение культуры первичной стромы и прикрепленных клеточных линий из ДККМ мышей, дефицитных по ФНО-а.

2.1.4. Дифференцировка миобластов, мезенхимальных стволовых клеток и первичной культуры стромы костного мозга.

2.1.5. Ретровирусные конструкты и супернатанты.

2.1.6. Ретровирусная трансдукция клеток NIH ЗТЗ и MS5.

2.1.7. Совместное культивирование для анализа передачи сигнала через рецепторы Notch.

2.1.8. Анализ способности гемопоэтических клеток к колониебразованию.

2.1.9. Ретровирусная трансдукция моноядерных костного мозга.

2.1.10. Культивирование моноядерных клеток костного мозга с трансдуцированными ретровирусами клетками линии NIH ЗТЗ и MS5.

2.1.11. Окрашивание клеток и FACS анализ.

2.2. Молекулярные методы.

2.2.1. ПЦР амплификация.

2.2.2. Полуколичественная ОТ ПЦР.

2.2.3. Саузерн-блот гибридизация.

2.2.4. Нозерн-блот гибридизация.

2.2.5. Манипуляции с ДНК, клонирование ДНК.

2.2.6. Экспрессия и очистка белков.

2.2.7. Получение поликлональных антител к Jedi.

2.2.8. Получение амплифицированных библиотек кДНК из тканей мыши.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1 .Структурно-функциональный анализ нового гена Jedi.

3.1.1. Клонирование кДНК и анализ первичной структуры белка

Jedi.

3.1.2. Анализ экспрессии Jedi.

3.1.3. Выживание колониеобразующих клеток на монослое фибробластов, экспрессирующих Jedi.

3.1.4. Jedi и передача сигнала через рецепторы Notch.

3.1.5. Jedi и остеобластная дифференцировка.

3.2. Изучение экспрессии генов, влияющих на поддержание кроветворения, в клетках стромальных клеточных линий.

3.2.1. Гены адгезии и хоуминга.

3.2.2. Ростовые факторы и цитокины.

3.2.3. Прочие ростовые факторы.

3.3. Влияние экспрессии белка Jaggedl в стромальном подслое на поддержание кроветворных предшественников в системе ко-культивирования in vitro.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Jedi и другие гены, участвующие в регуляции дифференцировки и самоподдержания стволовых и прогениторных клеток крови»

Регуляция процессов дифференцировки и гомеостаза в клеточных системах является одной из ключевых проблем современной биологии. Механизмы, позволяющие клеткам сохранять свой фенотип и пролиферировать с необходимой скоростью, интенсивно изучаются, однако во многом по-прежнему остаются неизвестны. Особый интерес представляет гемопоэтическая система, являющаяся наглядной моделью того, как в течение всей жизни организма небольшое количество стволовых клеток обеспечивает организм всеми необходимыми элементами крови, адаптируясь к его потребностям.

Поддержание и размножение стволовых клеток крови (СКК) ex vivo представляет собой важную задачу при лечении многочисленных заболеваний системы кроветворения (Sauvageau et al., 2004). На протяжении многих лет делались попытки размножения СКК путем культивирования в присутствии коктейлей ростовых факторов, однако полученные таким образом культуры не содержали достаточного числа клеток, способных к долговременному восстановлению гемопоэза в организме (Robinson et al., 2005). Становится все более очевидным, что для достижения успеха в этой области необходимо учитывать данные последних лет о регуляции свойств СКК локальными стромальными факторами. Стволовые клетки находятся в тесном взаимодействии со своим микроокружением, образующим так называемую «нишу». Нишу для СКК образуют остеобластные, и, вероятно, эндотелиальные клетки (Calvi et al.,2003 Zhang et al., 2003, Kiel et al., 2005). В настоящее время идентифицированы многие белковые факторы и сигнальные пути, задействованные в поддержании СКК в недифференцированном состоянии. Вместе с тем, необходимость дальнейшего изучения молекулярных механизмов регуляции процесса само поддержания стволовой клетки очевидна,

Данная работа пополняет современные представления о молекулярных процессах, происходящих внутри ниши стволовых и прогениторных клеток, и открывает перспективы для создания оптимальных условий для in vitro культивирования и вирусной трансдукции СКК с использованием стромальных культур, несущих стимулирующие гемопоэз мембранносвязанные факторы.

2. Цель работы

Целью данной работы являлась идентификация новых генов, принимающих участие в регуляции самоподцержания стволовых клеток крови, а также детальное изучение роли в этих процессах отдельных охарактеризованных ранее белков

3. Основные задачи

1) Изучить роль гена Jedi в процессах поддержания гемопоэтических предшественников.

2) Произвести анализ экспрессии некоторых ключевых генов, ответственных за самоподцержание и дифференцировку СКК, в стромальных линиях, полученных из костного мозга мыши.

3) Оценить влияние оверэкспрессии белка Jagged 1 в линии фибробластов NIH3T3 на гемопоэз in vitro в системе совместного культивирования.

4. Научная новизна и практическое значение работы

Обнаружен новый ген Jedi, экспрессирующийся в ранних кроветворных предшественниках, и показано его участие в регуляции дифференцировки кроветворных предшественников и передаче сигнала через рецепторы Notch. Также продемонстрировано позитивное влияние оверэкспрессии белка Jagged1 в стромальном подслое на колониеобразующие предшественники в системе in vitro.

Проведенные исследования позволяют обогатить современные представления о молекулярных механизмах, лежащих в основе биологии стволовых и прогениторных клеток. Результаты представленной работы открывают перспективы для создания оптимальных условий для in vitro культивирования и вирусной трансдукции СКК с использованием стромальных культур, несущих стимулирующие гемопоэз мембранносвязанные факторы. Результаты работы демонстрируют возможность получения клеточных линий, поддерживающих кроветворные предшественники in vitro, из клеток, исходно такой активностью не обладающих, с помощью относительно простых генетических манипуляций.

5. Основные положения, выносимые на защиту

1 .Идентифицированный ген Jedi экспрессируется в гемопоэтических клетках с кратковременной репопулирующей активностью и в меньшей степени - в клетках с кратковременной репопулирующей активностью.

2.0верэкспрессия Jedi в фибробластах NIH ЗТЗ негативно влияет на выживание колониеобразующих гемопоэтических миелоидных предшественников в системе ко-культивирования клеток in vitro. Данный эффект требует непосредственного физического контакта гемопоэтических и стромальных клеток.

3.Jedi ингибирует активности мишеней Notch как при трансфекции конструктами, несущими полноразмерную кДНК Jedi, так и при инкубации клеток с растворимой формой белка.

4.Гены N-Cadherin, osteopontin, Kirre, ТРО, IL6, IL11 и Flt3L экспрессируются на высоком уровне в стромальных линиях, полученных из костного мозга мышей с инактивацией гена фактора некроза опухолей; наоборот, уровень экспрессии гена SCF снижен во всех линиях.

5.Стабильная экспрессия белка Jaggedl.B фибробластах NIH ЗТЗ приводит к более чем 100-кратному увеличению числа миелоидных колониеобразующих клеток при культивировании клеток костного мозга на одном из клеточных клонов, экспрессирующих Jagged 1. В то же время, высокий уровень экспрессии Jagged 1 в клетках подслоя сам по себе еще недостаточен для возникновения поддерживающей гемопоэз активности.

6. Благодарности

В первую очередь хочу выразить искреннюю благодарность своему научному руководителю, заведующему лабораторией Молекулярной биологии развития Александру Вадимовичу Белявскому, за чуткое руководство и постоянную помощь в освоении методик, проведении исследований, интерпретации полученных данных и оформлении работы; всем бывшим и настоящим сотрудникам лаборатории Молекулярной биологии развития за теплую атмосферу, постоянное внимание и поддержку; сотрудникам лаборатории Физиологии кроветворения Гематологического Научного Центра Российской Академии Медицинских Наук Нине Иосифовне Дризе, Максиму Александровичу Эршлеру, Ирине Николаевне Нифонтовой и Дарье Александровне Свинаревой за плодотворное сотрудничество и помощь в интерпретации и оформлении полученных результатов, а также всем коллегам и сотрудникам Института Молекулярной биологии РАН за постоянную поддержку и помощь на всех этапах работы. Также хочу выразить большую благодарность Центру медицинских исследований Университета Осло за финансовую поддержку научных исследований.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Розов, Федор Николаевич

Выводы

1. Идентифицирован новый ген Jedi, кодирующий белок, содержащий лидерный пептид, 14 повторов эпидермального фактора роста и DSL-подобный домен во внеклеточной части.

2. Jedi экспрессируется в гемопоэтических клетках с кратковременной репопулирующей активностью и в меньшей степени - в клетках с кратковременной репопулирующей активностью.

3. Оверэкспрессия Jedi в стромальных линиях NIH ЗТЗ и MS5 негативно влияет на выживание колониеобразующих гемопоэтических миелоидных предшественников в системе ко-культивирования in vitro. Данный эффект требует непосредственного физического контакта гемопоэтических и стромальных клеток.

4. Jedi оказывает ингибирующее действие на активности мишеней Notch как при трансфекции конструктами, несущими полноразмерную кДНК Jedi, так и при инкубации клеток с растворимым белком Jedi.

5. Показан высокий уровень экспрессии генов N-cadherin, osteopontin, Kirre, ТРО, IL6, IL11 и FltSL в стромальных линиях, полученных из костного мозга мышей с инактивацией гена фактора некроза опухолей, уровень экспрессии гена SCF, напротив, был снижен во всех линиях. Показаны большие различия в экспрессии исследованных генов между клеточными линиями, отличающимися сходными способностями к поддержанию гемопоэза.

6. Получены клеточные линии, стабильно экспрессирующие белок Jagged 1. Показано более чем 100-кратное увеличение числа миелоидных колоний при культивировании клеток костного мозга на одном из клеточных клонов, экспрессирующих Jagged 1, по сравнению с контролем. Высокий уровень экспрессии

Jagged 1 в клетках подслоя, однако, сам по себе еще недостаточен для возникновения поддерживающей гемопоэз активности.

Печатные работы Статьи

1. Розов ФН, Нифонтова ИН, Белявский АВ, Дризе НИ. Изучение экспрессии генов, влияющих на поддержание кроветворения, в клетках стромальных линий, полученных от мышей, дефицитных по ФНО. Доклады Академии Наук. 2006, Т.48. №2. с. 1-4.

2. Розов ФН, Белявский АВ. Влияние экспрессии белка Jaggedl в стромальном подслое на поддержание кроветворных предшественников в системе коку льтивирования in vitro. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2007, №2. с. 78-82.

3. Krivtsov AV, Rozov FN, Zinovyeva MV, Hendrikx PJ, Visser JW, Belyavski AV. Jedi-a novel transmembrane protein expressed in early hematopoietic cells. J. Cellular Biochem. 2007, V.101. P.767-784.

Тезисы

4. Розов ФН, Морина ГВ, Равчеева АБ, Зиновьеева MB, Белявский АВ. Поиск генов, эспрессирующихся на ранних стадиях гемопоэза мыши, при помощи анализа библиотек кДНК. XIII Зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва. 7-9 февраля 2001. С. 55.

5. Розов ФН, Кривцов АВ, Зиновьева MB, Белявский АВ. Jedi-новый белок, содержащий множественные повторы эпидермального фактора роста, экспрессирующийся в ранних гемопоэтических предшественниках. Научные труды Ш съезда физиологов СНГ, Сочи, Дагомыс. 19-23 сентября 2005. С.115.

6. Krivtsov AV, Rozov FN, Hendrikx PJ, Jiang Y, Visser JW, Belyavski AV. Jedi, a novel protein containing multiple EGF-like repeats and expressed in early hematopoietic cells. 7th international Engelhardt conference on molecular biology. Nov 28-Dec. 2,2004, Suzdal, Russia.

7. Nifontova IN, Rosov FN, Beliavsky AV, and Drize NJ. Properties of MSC Derived Stromal Cell Lines Developed from Bone Marrow of TNF Knockout Mice. 47 ASH Annual Meeting Abstracts. Dec. 10-13 2005, Atlanta, USA, 106: Abstract 4302.

Заключение.

Изучение биологии стволовых и прогениторных клеток крови, а также клеток их микроокружения, имеет огромный интерес, как с прикладной, так и с теоретической точек зрения. Молекулярные механизмы, регулирующие процессы самоподцержания и дифференцировки этих клеток, являются предметом пристального изучения. Культивирование СКК in vitro в присутствии коктейлей ростовых факторов обычно приводит к их быстрой потере, что выражается в значительном снижении числа клеток, способных к долговременному восстановлению гемопоэза в организме (Robinson et al., 2005). В то же время, СКК имеют большое значение для практической медицины, поскольку играют определяющую роль при трансплантациях костного мозга и могут быть использованы, при условии адекватного развития технологии, для коррекции врожденных и приобретенных заболеваний кроветворной и иммунной систем с помощью введения в эти клетки терапевтических генов (Sadelain et al., 2005). Для достижения успеха в этой области необходимо учитывать, что состояние и судьба СКК зависят в значительной степени от взаимодействия с компонентами их стромального окружения, формирующими «нишу» стволовой клетки.

Представленная работа посвящена клонированию и изучению функций одного из генов, вовлеченных в регуляцию состояния стволовых и прогениторных клеток костного мозга мыши. Приведенные нами данные позволяют сделать вывод об участии гена Jedi в регуляции состояния «ниши» стволовой клетки и тонкой настройки передачи сигнала через рецепторы Notch.

Возможности «усовершенствования» стромальных клеток с целью создания системы поддержания СКК in vitro и введения в них экспрессионных конструктов используются в настоящее время довольно слабо. Наша работа доказывает, что с помощью относительно простых генетических манипуляций можно получать клеточные линии, поддерживающие кроветворные предшественники in vitro, из клеток, исходно такой активностью не обладающих. Результаты представленной работы открывают перспективы создания оптимальных условий для in vitro культивирования и вирусной трансдукции СКК с использованием стромальных культур, несущих стимулирующие гемопоэз мембранносвязанные факторы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Розов, Федор Николаевич, 2007 год

1.Нифонтова ИН, Ольшанская ЮВ, Дризе НИ. Бюлл. эксп. биол. мед. 2004. Т.138. С. 284-289.

2. Abdallah ВА, Jensen СН, Gutierrez G, Leslie R, Jensen TG, Kassem M. Regulation of human skeletal stem cells differentiation by Dlkl/Pref-1. J Bone Miner Res. 2004.19 (5): 841-852.

3. Aiuti A, Tavian M, Cipponi A, Ficara F, Zappone E, Hoxie J, Peault B, Bordingnon C. Expression of CXCR4, the receptor for stromal cell-derived factor-1 on fetal and adult human lymphohematopoietic progenitors. Eur J Immunol. 1999. 29:18231831.

4. Amsellem S, Pflumio F, Bardinet D, Izac B, Charneau P, Romeo PH, Dubart-Kupperschmitt A, Fichelson S. Ex vivo expansion of human hematopoietic stem cells by direct delivery of the HOXB4 homeoprotein Nat Med. 2003. Nov 9(11):1423-1427.

5. Arai F, Hirao A, Ohmura M, Sato H, Matsuoka S, Takubo K, Ito K, Koh GY, Suda T. Tie2/Angiopoietin 1 signaling regulates HSC quiescence in a bone marrow niche Cell. 2004. 118:149-161.

6. Artavanis-Tsakonas S, Matsuno K, Fortini ME Notch signaling. Science. 1995. 268(5208): 225-232.

7. Audet J, Miller CL, Eaves CJ, Piret JM. Common and distinct features of cytokine effects on hematopoietic stem and progenitor cells revealed by dose-response surface analysis. Biotechnol Bioeng. 2002. 80(4): 393-404.

8. Audet J, Miller CL, Rose-John S, Piret JM, Eaves CJ. Distinct role of gpl30 activation in promoting self-renewal divisions by mitogenically stimulated murine hematopoietic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2001. 98(4): 1757-1762.

9. Baladron V, Ruiz-Hidalgo MJ, Nueda ML, Diaz-Guerra MJ, Garcia-Ramirez JJ, Bonvini E, Gubina E, Laborda J. dlk acts as a negative regulator of Notchl activation through interactions with specific EGF-like repeats. Exp Cell Res. 2005. 303(2):343-359.

10. Barletta GM, Kovari IA, Verma RK, Kerjaschki D, Holzman LB. Nephrin and Nephl co-localize at the podocyte foot process intercellular junction and form cis hetero-oligomers. J Biol Chem. 278 (21): 19266-19271.

11. Bennett CN, Longo KA, Wright WS, Suva LJ, Lane TF, Hankenson KD, MacDougald OA. Regulation of osteoblastogenesis and bone mass by WntlOb. Proc Natl Acad Sci USA. 2005.102: 3324-3329.

12. Beresten SF, Stan R, van Brabant AJ, Ye T, Naureckiene S, Ellis NA. Purification of overexpressed hexahistidine-tagged BLM N431 as oligomeric complexes. Protein Expr Purif. 1999. 17:239-248.

13. Bhardwaj G, Murdoch B, Wu D, Baker DP, Williams KP, Chadwick K, Ling LE, Karanu FN, Bhatia M. Sonic hedgehog induces the proliferation of primitive human hematopoietic cells via BMP regulation. Nat Immunol. 2001. 2(2): 172-180.

14. Bhatia R, McGlave P, Verfaille C. Treatment of marrow stroma with interferonalpha restores normal beta 1 integrin-dependent adhesion of chronic myelogenous leukemia hematopoietic progenitors: role of MIP-1 alpha. J Clin Invest. 1995. 96: 931-939.

15. Bi Y, Stuelten CH, Kilts T, Wadhwa S, Iozzo RV, Robey PG, Chen X. Extracellular Matrix Proteoglycans Control the Fate of Bone Marrow Stromal Cells J. Biol. Chem. 2000. 280 (34): 30481-30489.

16. Bigas A, Martin DI, Milner LA Notchl and Notch2 inhibit myeloid differentiation in response to different cytokines. Mo.l Cell. Biol. 1998. 18(4):2324-2333.

17. Bray S, Furriols M. Notch pathway: making sense of suppressor of hairless.Curr Biol. 2001.11(6): 217-221

18. Bush G, diSibio G, Myamoto A, Denault J-B, Leduc R, Weinmaster G. Ligand-induced signaling in the absence of furin processing of Notch. Dev. Biol. 2001. 229: 494-502

19. Calvi LM, Adams GB, Weibrecht KW, Weber JM, Olson DP, Knight MC, Martin RP, Schipani E, Divieti P, Bringhurst FR, Milner LA, Kronenberg HM, Scadden DT. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 2003. 425: 841-846.

20. Chomczynski P, Sacchi N Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal.Biochem. 1987. 162: 156-159.

21. Coombe DR, Watt SM, Rarish CR. Mac-1 (CDlib/CD 18) and CD45 mediate the adhesion of hematopoietic progenitor cells to stromal cell elements via recognition of stromal heparan sulfate. Blood. 1994. 84: 739-752.

22. Crean SM, Meneski JP, Hullinger TG. N-linked sialyted sugar receptors support haematopoietic cell-osteoblast adhesions. Br J. Haematology. 2004.124: 534-546.

23. Curry JL, Trentin JJ, Wolf N. Hemopoietic spleen colony studies. II. Erythropoiesis. J. Exp. Med. 1967. 125. 707-720.

24. Dallas MH, Varnum-Finney B, Delaney C, Kato K, Bernstein ID. Density of the Notch ligand Deltal determines generation of B and T cell precursors from hematopoietic stem cells. J. Exp. Med. 2005. 201 (9>: 1361-1366.

25. De Haan G, Weersing E, Dontje B, van Os R, Bystrykh LV, Vellenga E, Milner G. In vitro generation of long-term repopulating hematopoietic stem cells by fibroblast growth factor-1. Developmental Cell. 2003. 4; 241-251.

26. Deguchi Y, Moroney FM, Kehrl JH. Expresion of HOX2-3 homeobox gene in human lymphocytes and lymphoid tissues. Blood. 1991. 78. 445-450.

27. Delaney C, Varnum-Finney B, Aoyama K, Brashem-Stein C, Bernstein ID. Dose-dependent effects of the Notch ligand Deltal on ex vivo differentiation and in vivo marrow repopulating ability of cord blood cells. Blood. 2005. 106(8):2693-2699.

28. Delehanty LL, Mogass M, Gonias SL, Racke FK, Johnstone B, Goldfarb AN. Stromal inhibition ofmegakaryocytic differentiation is associated with blockade of sustained Rap 1 activation. Blood. 2003.101: 1744-1751.

29. Duncan AW, Rattis FM, DiMascio LN, Congdon KL, Pazianos G, Zhao C, Yoon K, Cook JM, Willert K, Gaiano N, Reya T. Integration of Notch and Wnt signaling in hematopoietic stem cell maintenance. Nat. Immunol. 2005. 6(3):314-22.

30. Ellisen LW, Bird J, West DC, Soreng AL, Reynolds TC, Smith SD, Sklar J. TAN-1, a human homolog of the Drososhila Notch gene, is broken by chromosomal translocations in T lymphoblastic neoplasms. Cell. 1991. 66(4): 649-661.

31. Ferrell CM, Dorsam ST, Ohta H, Humphries RK, Derynck MK, Haqq C, Largman C, Lawrence HJ. Activation of stem-cell specific genes by HOXA9 and HOXAIO homeodomain proteins in CD34+ human cord blood cells. Stem Cells. 2005. 23: 644-655.

32. Fitzgerald K, Greenwald I. Interchangeability of Caenorhabditis elegans DSL proteins and intrinsic signalling activity of their extracellular domains in vivo .Development. 1995. 121(12): 4275-82.

33. Fortini ME. Gamma-secretase-mediated proteolysis in cell-surface-receptor signalling. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2002. 3(9): 673-684.

34. Fortunel N, Hatzfeld J, Kisselev S. Release from quiescence of primitive human hematopoietic stem/progenitor cells by blocking their cell-surface TGF-beta type II receptor in a short-term in vitro assay. Stem Cells. 2000.18: 102-111.

35. Fraser CC, Eaves CJ, Szilvassy SJ, Humphries RK. Expansion in vitro of retrovirally marked totipotent hematopoietic stem cells. Blood. 1990. 76(6): 10711076.

36. Fraser CC, Szilvassy SJ, Eaves CJ, Humphries RK. Proliferation of totipotent hematopoietic stem cells in vitro with retention of long-term competitive in vivo reconstituting ability. Proc. Nat.l Acad. Sc.i USA. 1992. 89(5):1968-1972.

37. Gong, JK. 1978. Endosteal marrow: a rich source of hematopoietic stem cells. Science 199:1443-1445.

38. Graham A, Papalopulu N, Krumlauf R The murine and Drosophila homeobox clusters have common features of organization and expression. Cell. 1989. 57: 367-378.

39. Hardy C, Minguell J. Modulation of the adhesion of hemopoietic progenitor cells to the RGD site of fibronectin by interleukin 3. J. Cel.l Physiol. 1995.164: 315-323.

40. Hasserjian RP, Aster JC, Davi F, Weinberg DS, Sklar J. Modulated expression of Notchl during thymocyte development. Blood. 1996. 88 (3): 970-976.

41. Hicks C, Johnston SH, diSibio G, Collaso A, Vog TF, Weinmaster G. Fringe differentially modulates Jaggedl and Deltal signaling through Notchl and Notch2. Nature Cell. Biol. 2000. 2(8). 515-520.

42. Hsieh JJ, Henkel T, Salmon P, Robey E, Peterson MG, Hayward SD. Truncated mammalian Notchl activates CBFl/RBPJk-repressed genes by a mechanism resembling that of Epstein-Barr virus EBNA2. Mol. Cell. Biol. 1996. 16: 952-959.

43. Hukriede NA, Gu Y, Fleming RJ. A dominant-negative form of Serrate acts as a general antagonist of ligand-dependent Notch activation. Development. 1997. 124(17): 3427-3437.

44. Iscove NN, Nawa K. Hematopoietic stem cells expand during serial transplantation in vivo without apparent exhaustion. Curr .Biol. 1997. 7(10): 805-808.

45. Ivanova NB, Belyavsky AV. Identification of differentially expressed genes by restriction endonuclease-based gene expression fingerprinting. Nucleic Acids Res. 1995. 23: 2954-2958.

46. Jacobsen FW, Veiby OP, Stokke T, Jacobsen S J. TNF-alpha bidirectionally modulates the viability of primitive murine hematopoietic progenitor cells in vitro. J. Immunol. 1996. 157(3): 1193-1199.

47. Jones P, May G, Healy L, Brown J, Hoyne G, Delassus S, Enver T. Stromal expression of Jagged 1 promotes colony formation by fetal hematopoietic progenitor cells. Blood. 1998.92(5): 1505-1511

48. Kiel MJ, Yilmaz OH, Iwashita T, Yilmaz OH, Terhorst C, Morrison SJ. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 2005.121(7): 1109-1121.

49. Kiger AA, White-Cooper H, Fuller MT. Somatic support cells restrict germlone stem cell self-renewal and promote differentiation. Nature. 2000. 407: 750-754.

50. Koch U, Yuan JS, Harper JA, Guidos CJ. Fine-tuning Notchl activation by endocytosis and glycosylation. Seminars in Immunology. 2003.15: 99-106.

51. Kojika S and Griffin JD. Notch receptors and hematopoiesis. Exp. Hematol. 2001. 29:1041-1052.

52. Kongsuwan K, Webb E, Housiaux P, Adams JMExpression of multiple homeobox genes within diverse mammalian haematopoietic lineages. EMBO J. 1988. 7: 12311238.

53. Kopp HG, Avecilla ST, Hooper AT, Rafii S. The bone marrow vascular niche: home of HSC differentiation and mobilization. Physiology (Bethesda MD). 2005. 20: 349-356.

54. Krosl J, Austin P, Beslu N, Kroon E, Humphries RK, Sauvageau G. In vitro expansion of hematopoietic stem cells by recombinant TAT-HOXB4 protein. Nat. Med. 2003.9(11): 1428-1432.

55. LauringAS and Overbaugh J. Evidence that an IRES within the Notch2 coding region can direct expression of a nuclear form of the protein. Mol. Cell. 2000. 6: 939-945.

56. Lawrence HJ, Helgason CD, Sauvageau G, Fong S, Izon DJ, Humphries RK, Largman CI. Mice bearing a targeted interruption of the homeobox gene HOXA9 have defects in myeloid, erythoid and lymphoid hematopoiesis. Blood. 1997. 89: 1922-1930.

57. Lord BI, Testa NG and Hendry JH. The relative spatial distributions of CFUs and CFUc in the normal mouse femur. Blood. 1975.46:65-72.

58. Luo B, Aster JC, Hasserjian RP, Kuo F, Sklar J. Isolation and functional analysis of a cDNA for human Jagged2, a gene encoding a ligand for the Notch receptor. Mol. Cell. Biol. 1997. 17: 6057-6067

59. Magli MC, Langman C, Lawrence HJ. Effects of HOX homeobox genes in blood cell differentiation. J. Cell Physiology. 1997.173:168-177.

60. Maloney MA and Patt HM. On the origin of hematopoietic stem cells after local marrow extirpation. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1975. 149: 94-97.

61. Martin MA, Bhatia M. Analysis of the human fetal liver hematopoietic microenvironment. Stem Cells Dev. 2005. 14(5): 493-504.

62. Miller CL, Eaves CJ. Expansion in vitro of adult murine hematopoietic stem cells with transplantable lympho-myeloid reconstituting ability. Proc. Natl. Acad. Sci. U SA. 1997. 94(25): 13648-13653.

63. Milner LA, Bigas A. Notch as a mediator of cell fate determination: evidence and speculation. Blood. 1999. 93(8): 2431-2448.

64. Milner LA, Bigas A, Kopan R, Brashem-Stein C, Black M, Berstein ID, Martin DIK. Inhibition of granulocytic differentiation by mNotchl. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996. 93: 13014-13019.

65. Moloney DJ, Panin VM, Johnston SH. Fringe is a glycosyltransferase that modifies Notch. Nature. 2000. 406: 369-375.

66. Moore KA, Ema H, Lemischka IR. In vitro maintenance of highly purified, transplantable hematopoietic stem cells. Blood. 1997. 89(12): 4337-4347.

67. Moore KA, Pytowski B, Witte L, Hicklin D, Lemischka IR. Hematopoietic activity of a stromal cell transmembrane protein containing epidermal groth factor-like repeat motifs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997.94(8). 4011-4016.

68. Morrison SJ, Perez SE, Qiao Z, Verdi JM, Hicks C, Weinmaster G, Anderson DJ. Transient Notch activation initiates an irreversible switch from neurogenesis to gliogenesis by neural crest stem cells. Cell. 2000.101: 499-510.

69. Morrison SJ, Uchida N, Weissman IL. The biology of hematopoietic stem cells. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 1995. 11: 35-71.

70. Murdoch B, Chadwick K, Martin M, Shojaei F, Shah KV, Gallacher L, Moon RT, Bhatia M. Wnt-5A augments repopulating capacity and primitive hematopoietic development of human blood stem cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. 100: 3422-3427.

71. Nagasawa T, Hirota S, Tachibana K, Takakura N, Nishikawa S, Kitamura Y, YoshidaN, Kikutani H, Kishimoto T. Defects of B-cell lymphopoiesis and bonemarrow myelopoiesis in mice lacking the CXC chemokine PBSF/SDF-1. Nature. 1996.382: 635-638.

72. Nagase T, Nakayama M, Nakajima D, Kikuno R, Ohara 0. Prediction of the coding sequences of unidentified human genes. XX. The complete sequences of 100 new cDNA clones from brain which code for large proteins in vitro. DNA Res. 2001. 8: 85-95.

73. Nilsson SK, Dooner MS, Tiarks CY, Weier HU, Quesenberry PJ. Potential and distribution of transplanted hematopoietic stem cells in a nonablated mouse model. Blood. 1997. 89:4013-4020.

74. Nilsson SK, Dooner MS, Weier HU, Frenkel B, Lian JB, Stein GS, Quesenberry PJ. Cells capable of bone production engraft from whole bone marrow transplants in nonablated mice. J. Exp. Med. 1999. 189(4):729-34.

75. Nilsson SK, Johnston HM, and Coverdale JA. Spatial localization of transplanted hemopoietic stem cells: inferences for the localization of stem cell niches. Blood. 2001.97: 2293-2299.

76. Nye JS, Kopan R. Developmental signaling. Vertebrate ligands for Notch. Current Biology. 1995. Sep 1. 5(9). 966-969.

77. Ohno N, Izawa A, Hattori M, Kageyama R, Sudo T. dlk inhibits stem cell factor-induced colony formation of murine hematopoietic progenitors: Hes-1 -independent effect. Stem Cells. 2001. 19(1): 71-79.

78. Ordentlich P, Lin A, Shen C, Blaumueller C, Matsuno K, Artavanis-Tsakonas S, Kadesch T. Notch inhibition of E47 supports the evidence of a novel signaling pathway. Mol. Cell. Biol. 1998. 18(4): 2230-2239

79. Ornitz DM, Itoh N. Fibroblast growth factors. Genome biol. 2001. 2(3): 3001-3012.

80. Parks AL, Klueg KM, Stout JR, Muskavitch MAT. Ligand endocytosis drives receptor dissociation and activation in the Notch pathway. Development. 2000. 127:1373-1385.

81. Patt HM and Maloney MA. Bone formation and resorption as a requirement fro bone marrow development. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1972. 140: 205-207.

82. Peled A, Petit I, Kollet O, Magid M, Ponomaryov T, Byk T, Nagler A, Ben-Hur H, Many A, Shultz L, Lider O, Alon R, Zipori D, Lapidot T. Dependence of human stem cell engraftment and repopulation of NOD/SCID mice on CXCR4. Science. 1999.283:845-848.

83. Pineault N, Helgason CD, Lawrence HJ, Humphries RK. Differential expression of HOX, Miesl and Pbxl genes in primitive cells throughout murine hematopoietic ontogeny. Exp Hematol. 2002. 30: 49-57.

84. Pui JC, Allman D, Xu L Notch expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination. Immunity. 1999. 11: 299-308.

85. Puri MC and Bernstein A. requirement for the TIE family of receptor tyrosine kinases in adult but not fetal hematopoiesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003.100: 12753-12758.

86. Qi H, Rand MD, Wu X, Sestan N, Wang W, Rakic P, Xu T, Artavanis-Tsakonas S. Processing of Notch ligand Delta by the metal loprotease Kuzbanian. Science. 1999. 283(5398): 91-94.

87. Reya T, Duncan AW, Ailles L, Domen J, Scherer DC, Willert K, Hintz L, Nusse R, Weissman IL, A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 2003. 423(6938): 409-414.

88. Robey E, Chang D, Itano A, Cado D, Alexander H, Lans D, Weinmaster G, Salmon P. An activated form of Notch influences the choice between CD4 and CD8 T cell lineages. Cell. 1996. 87(3): 483-494.

89. Robinson S, Niu T, de Lima M, Ng J, Yang H, McMannis J, Karandish S, Sadeghi T, Fu P, del Angel M, O'Connor S, Champlin R, Shpall E. Ex vivo expansion of umbilical cord blood. Cytotherapy. 2005. 7(3): 243-250.

90. Roecklein BA, Torok-Storb B. Functionally distinct human marrow stromal cell lines immortalized by transduction with the human Papilloma virus E6/E7 genes. Blood. 1995. 85(4): 997-1005.

91. Rose DM, Cardarelli PM, Cobb RR, Ginsberg MH. Soluble VCAM-1binding to alpha4 integrins is cell-type specific and activation dependent and isdisrupted during apoptosis in T cells. Blood. 2000. 95(2): 602-609.

92. Sadelain M., Lisowski L., Samakoglu S. Rivella A, May C, Riviere I.

93. Progress toward the genetic treatment of the beta-thalassemias. Ann. N Y. Acad. Sci.2005. 1054:78-91.

94. Sambrook J., Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2001.

95. Sauvageau G, Iscove NN, Humphries RK. In vitro and in vivo expansion of hematopoietic stem cells.Oncogene. 2004. 23 (43):7223-7232.

96. Schrofleld R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the haemopoietic stem cell. Blood Cells. 1978. 4: 7-25.

97. Shawber C, Boulter J, Lindsell CE, Weinmaster G. Jagged2: A Serrate-like gene expressed during rat embryogenesis. Dev. Biol. 1996 a. 180(1): 370-376.

98. Shawber C, Nofziger D, Hsieh JJ, Lindsell C, Bogler O, Hay ward D, Weinmaster G. Notch signaling inhibits muscle cell differentiation through a CBF1-independent pathway. 1996b. 122(12):3765-3773.

99. Shen WF, Largman C, Lowney P, Corral J, Detmar K, Hauser CA, Simonovitch TA, Hack FM, Lawrence HJ Lineage-restricted expression of homeobox-containing genes in human hematopoietic cell lines. Procl. Nat. Acad. Sci USA. 1989. 86: 8536-8540.

100. Shimizu K, Chiba S, Kumano K, Hosoya N, Takahashi T, Kanda Y, Hamada Y, Yazaki Y, Hirai H. Mouse jaggedl physically interacts with notch2 and other notch receptors. Assessment by quantitative methods. J. Biol. Chem. 1999. 274(46):32961-32969.

101. Shmelkov SV, Visser JW, Belyavsky AV. Two-dimensional gene expression fingerprinting. Anal. Biochem. 2001.290(1): 26-35.

102. Shroeter EH, Kisslinger JA, Kopan R Notch-1 signalling requires ligand-induced proteolitic release of intracellular domain. Nature. 1998. 393(6683): 382-386

103. Simmons PJ, Zannettino A, Gronthos S, Leavesly D. Potential adhesion mechanisms for localization of hematopoietic progenitors to bone marrow stroma. Leuk. Lymphoma. 1994.12(5-6): 353-363.

104. Slanicka KM, Nissen C, Manz CY. The membrane-bound isoform of stemcell factor synergizes with soluble flt3 ligand in supporting early hematopoietic cellsin long-term cultures of normal and aplastic anemia bone marrow. Exp. Hematol. 1998.26: 365-373.

105. Staal FJ, Clevers HC. Regulation of lineage commitment during lymphocyte development. Int. Rev. Immunol. 2001. 20(l):45-64.

106. Stein MI, Zhu J, Emerson SG. Molecular pathways regulating the self-renewal of hematopoietic stem cell. Exp. Hematol. 2004. 32 (12): 1129-1136.

107. Stier S, Cheng T, Dombrowski D, Carlesso N and Scadden DT. Notchl activation increases hematopoietic stem cell self-renewal in vivo and favors lymphoid over myeloid lineage outcome. Blood. 2002. 99: 2369-2378.

108. Struhl G, Adachi A. Nuclear access and action of notch in vivo. Cell. 1998. 93:649-660.

109. Striinkelnberg M, Bonengel B, Moda LM, Hertenstein A, Gert de Couet H, Ramos RGP and Fischbach K-F. Rst and its paralogue kirre act redundantly during embryonic muscle development in Drosophila. Development. 2001.128. 4229-4239

110. Suda T, Arai F, Hirao A. Hematopoietic stem cells and their niche. Trends in immunology. 2005.26(8): 426-433.

111. Sun X and Artavanis-Tsakonas S. Secreted forms of Delta and Serrate define antagonists of Notch signaling in Drosophila. Development. 1997. 124(17): 3439-3448.

112. Taichman RS Blood and bone: two tissues whose fates are intertwined to create the hematopoietic stem-cell niche. Blood. 2005. 105 (7): 2631-2639.

113. Taichman, RS and Emerson SG. The role of osteoblasts in the hematopoietic microenvironment. Stem Cells. 1998.16: 7-15.

114. Tamura S, Morikawa Y, Hisaoka T, Ueno H, Kitamura T, Senba E. Expression of mKirre, a mammalian homolog of Drosophila kirre, in the developing and adult mouse brain. Neuroscience. 2005.133(3):615-624.

115. Teixido J, Hemler ME, Greenberger J, Anklesaria P. Role of betal and beta2 integrins in the adhesion of human CD34 hi stem cells to bone marrow stroma. J. Clin. Invest. 1992. 90:358-367.

116. Thorsteinsdottir U, Mamo A, Kroon E, Jerome L, Bijl J, Lawrence HJ, Humphries K, Sauvageau G. Overexpression of the myeloid leukemia-associated HoxA9 gene in bone marrow cells induced stem cell expansion. Blood. 2002. 99: 121-129.

117. Varnum Finney B, Xu L, Brashem-Stein C, Nourigt C, Flowers D, Bakkour S, Pear WS, Bernstein ID. Pluripotent, cytokine-dependent, hematopoietic stem cells are immortalized by constitutive Notchl signaling. Nature Medicine. 2000. 6: 12781281.

118. Varnum-Finney B, Brashem-Stein C, Bernstein ID. Combined effects of Notch signaling and cytokines induce a multiple log increase in precursors with lymphoid and myeloid reconstituting ability. Blood. 2003.101 (5): 1784-1789.

119. Varnum-Finney B, Purton LE, Yu M, Brashem-Stein C, Flowers D, Staats S, Moore KA, Le Roux I, Mann R, Gray G, Artavanis-Tsakonas S, Bernstein ID. Blood. 1998. .91(11): 4084-4091.

120. Verfaille CM. Adhesion receptors as regulators of the hematopoietic process. Blood. 1998. 92: 2609-2612.

121. Vielle-Grosjean I, Roullot V, Courtois G. Lineage and stage-specific expression of HOX1 genes in the human hematopoietic system. Biochem Biophys. Res. Commun. 1992. 183:1124-1130.

122. Visnjic D. Kalajzic I, Gronowicz G, Aguila HL, Clark SH, Lichtler AC, Rowe DW. Conditional ablation of the osteoblast ineage in Col2.38k transgenic mice. J. Bone Miner.Res. 2001.16:2222-2231.

123. Visnjic D, Kalajzic I, Rowe DW Katavic V, Lorenzo J, Aguila HL. Hematopoiesis is severely altered in mice with an induced osteoblast deficiency. • Blood. 2004. 103:3258-3264.

124. Walker L, Carlson A, Tan-Pertel HT, Weimaster G, Gasson J. The Notch receptor and its ligands are selectively expressed during hematopoietic development in the mouse. Stem Cells. 2001. 19: 543-552

125. Walker L, Lynch M, Silverman S. The Notch/Jagged pathway inhibits proliferation of human hematopoietic progenitors in vitro. Stem Cells. 1999. 17: 162171.

126. Washburn T, Schweighoffer E, Gridley T, Chang D, Fowlkes BJ, Cado D, Robey E. Notch activity influences the ab versus gd T cell lineage decision. Cell. 1997. 88: 833.

127. Weisel KC, Moore MA. Genetic and functional characterization of isolated stromal cell lines from the aorta-gonado-mesonephros region.Ann. N Y. Acad. Sci. 2005. 1044: 51-1049.

128. Wharton KA, Johansen KM, Xu T Nucleotide sequence from the neurogenic locus implies a gene product that shares homology with proteins containing EGF repeats. Cell. 1985.43 (3): 567-581.

129. Willert K, Brown JD, Danenberg F., Duncan AW., Weismann IL., Reya T., Yates JR., Nusse R. Wnt proteins are lipid-modified and can act as stem cell growth factors. 2003. 423(6938):448-452.

130. Wilson A and Trumpp A. Bone marrow haematopoietic stem-cell niches. Nature reviews. Immunology. 2006. 6: 93-106.

131. Wittenberger T, Steinbach OC, Authaler A, Kopan R, Rupp RAW. MyoD stimulates Delta-1 transcription and triggers Notch signaling in the Xenopus gastrula. The EMBO J. 1999. 18(7): 1915-1922.

132. Wsahburn T, Schweighoffer E, Gridley T Notch activity influences the alphabeta versus gammadelta T cell lineage decision. Cell. 1997. 88: 833-843

133. Xie T, Sprandling AC. A niche maintaining germ line stem cells in the Drosophila ovary. Science. 2000. 290: 328-330.

134. Yan XQ, Lacey DL, Saris C. Ectopic overexpression of c-mpl by retroviral-mediated gene transfer suppressed megakaryopoiesis but enhanced erythropoiesis in mice. Exp Hematol. 1999. 27:1409-1417.

135. Yun TJ, Bevan MJ. Notch-regulated ankyrin-repeat protein inhibits Notch 1 signaling: multiple Notchl signaling pathways involved in T cell development. J Immunol. 2003.170(12):5834-5841.

136. Zhang J, Niu C, Ye L, Huang H, He X, Tong WG, Ross J, Haug J, Johnson T, Feng JQ, Harris S, Weidemann LM, Mishina Y, Li L. Nature. 2003. 425:836-841.

137. Zhang X-B, Beard BC, Trobridge G, Hackman R, Bryant E, R. Humphries K., Kiem H-P. Development of Leukemia after HOXB4 Gene Transfer in the Canine Model.Blood (ASH Annual Meeting Abstracts), 2006. 108: 204.

138. Zinovyeva MV, Zijlmans JM, Fibbe WE, Visser JW, Belyavsky AV. Analysis of gene expression in subpopulations of murine hematopoietic stem and progenitor cells. Exp Hematol. 2000. 28:318-334

139. Zweifel ME, Leahy DJ, Barrick D Structure and Notch receptor binding of the tandem WWE domain of Deltex. Structure. 2005.13(11): 1599-1611.

140. Zhang X-B, Schwartz JL, Humphries RK, Kiem H-P. Effects of HOXB4 overexpression on ex vivo expansion and immortalization of hematopoietic cells from different species. Stem cells. 2007.25:2074-81.