Дифференцировочные потенции мезенхимальных стволовых клеток костного мозга у детей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.09, кандидат медицинских наук Пурбуева, Базарма Баяровна

• Пурбуева, Базарма Баяровна
• кандидат медицинских наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Пурбуева, Базарма Баяровна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материал исследования.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Клоногенное культивирование стромальных фибробластов.

2.2.2. Культивирование кроветворных клеток.

ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНОГО ПОТЕНЦИАЛА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК (МСК) в НОРМЕ.

3.1. Стандартизация условий клоногенного культивирования стромальных фибробластов.

3.2. Индукция дифференцировки стромальных предшественников фибробластов.

3.3. Оценка дифференцировочных потенций клоногенных фибробластов (МСК) в нормальном костном мозге.

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНОГО ПОТЕНЦИАЛА

МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПРИ ЛЕЙКОЗАХ.

4.1. Оценка дифференцировочных потенций клоногенных фибробластов (МСК) в костном мозге при ОМЛ.

4.2. Оценка дифференцировочных потенций клоногенных фибробластов (МСК) в костном мозге при ОЛЛ.

4.3. Сравнительная оценка дифференцировочных потенций клоногенных фибробластов (МСК) в костном мозге при OMJI и ОЛЛ с нормой.

4.4. Связь показателей клонирования стромальных фибробластов с длительностью медикаментозной аплазии костного мозга при программной полихимиотерапии первичных лейкозов.

ГЛАВА 5. СВЯЗЬ СТРОМАЛЬНОГО МИКРООКРУЖЕНИЯ КОСТНОГО

МОЗГА С КРОВЕТВОРЕНИЕМ.

5.1. Модель влияния МСК костного мозга на рост гранулоцитарномакрофагальных предшественников.

ГЛАВА 6. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ ДАННЫХ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Дифференцировочные потенции мезенхимальных стволовых клеток костного мозга у детей»

Существование в костном мозге, наряду со стволовыми кроветворными клетками, стволовых клеток стромы, образующих в культуре колонии фибробластоподобных клеток, было впервые доказано А.Я.Фриденштейном с соавт. [7,16,18,20,22,23]. Эти клетки получили название колониеобразующих предшественников фибробластов (КОЕ-ф). Стволовая природа этих клеток (способность к самообновлению и дифференцировке в различные мезенхимальные элементы) была подтверждена в многочисленных исследованиях [7,16,18,20,22,44,95,96,104,105,108]. Учитывая способность этих клеток трансформироваться в мезенхимальные элементы различных линий дифференцировки (остеоидные, хондрогенные, адипогенные, нериваскулярные, мышечные и др. клетки-предшественники), они позднее получили название костно-мозговых стромальных стволовых клеток (КМСК) [18,20,22], мезенхимальных стволовых клеток (МСК) [40,95,96] и мезенхимальных клеток предшественников (МПК) [39]. В последние годы в литературе чаще всего используется термин МСК. Независимо от используемой терминологии, во всех исследованиях имеются в виду прилипающие костно-мозговые клетки, при культивировании ex vivo образующие колонии веретенообразно-вытянутых клеток, по морфологии напоминающих фибробласты. Это дает основание при характеристике клонального роста МСК использовать термин КОЕф.

Способность КОЕф трансформироваться в остеогенные и хондрогенные предшественники впервые была показана АЛ.Фриденштейном с соавт.

Г Ъ

11,13,17,21], продемонстрировавшими в части первичных фибробластных колоний, выращенных из костного мозга мыши, наличие фрагментов кости или хряща. Дальнейшие исследования дифференцировочных потенций МСК позволили Muraglia с соавт. [100] сформулировать «детерминисткую» модель дифференцировки МСК. По этой модели, популяция КОЕф костного мозга человека гетерогенна: около 30% клонов КОЕф являются недифференцированными, дальнейшая их дифференцировка происходит в 2-х направлениях: адипогенном и остео-хондрогенном. Эти данные получены при экспансии в культуре клонов, выделенных из первичной культуры КОЕф. Неясным остается состав и иерархия первичной культуры КОЕф костного мозга человека, что могло бы служить функциональной характеристикой МСК и быть использовано в качестве референтных показателей для оценки стромального микроокружения костного мозга в клинических целях.

Зависимости кроветворения от стромального микроокружения посвящено много исследований, в основном, экспериментальных [7,10,12,15,27], продемонстрирована преимущественная связь отдельных элементов стромы (жировые клетки и остеобласты) с определенными ростками кроветворения [13,23,39,107]. Однако до сих пор отсутствует метод определения стимулирующих гемопоэз свойств костно-мозговой стромы у конкретного пациента и стандартные критерии их оценки.

Исходя из этого, настоящее исследование, посвященное изучеиию дифференцировочных потенций мезенхимальных стволовых клеток (МСК) костного мозга человека и связи их с кроветворением, представляется весьма актуальным.

Цель исследования:

Стандартизация методов и разработка критериев клинической оценки дифференцировочных потенций мезенхимальных стволовых клеток (МСК) костного мозга и их связей с кроветворением у пациентов.

Задачи исследования:

1. Стандартизировать условия индукции дифференцировки МСК в первичных культурах клоногенных фибробластов костного мозга человека.

2. Разработать критерии оценки дифференцировочных потенций МСК костного мозга в первичных культурах и получить референтные значения этих показателей для условно нормального костного мозга детей.

3. Проанализировать изменения дифференцировочного потенциала МСК при острых лейкозах у детей.

4. Создать культуральную модель, позволяющую оценивать индуктивную роль МСК в кроветворении у пациента.

5. Оценить колониестимулирующую активность различных видов МСК при культивировании гранулоцитарно-макрофагальных предшественников в агаровой культуре.

Научная новизна.

В настоящей работе впервые были рассмотрены дифференцировочные потенции МСК костного мозга детей в первичной культуре КОЕф и их влияние на кроветворение. С этой целью была разработана культуральная модель, позволяющая оценить индуктивное влияние МСК и их дифференцированных предшественников на пролиферацию гранулоцитарно-макрофагальных предшественников. Впервые предложены новые критерии количественной оценки дифференцировочных возможностей МСК, разработаны референтные значения этих показателей в норме и исследованы их изменения при острых лейкозах у детей.

Данные, полученные при индукции остеогенной и адипогенной дифференцировки клоногенных стромальных фибробластов условно нормального костного мозга позволяют утверждать, что МСК костного мозга не являются сборной группой клеток, состоящей из стромальных элементов различных линий дифференцировки, а построены по иерархическому принципу, характерному для пула стволовых клеток. Основная часть клеточных элементов МСК в стабильном состоянии (около 60%) представлена ранними недифференцированными предшественниками. Этот пул является источником предшественников адипогенной и остеогенной дифференцировки при действии иидуцирующих факторов. Было установлено также, что индукторы дифференцировки включают генетически детерминированную программу дифференцировки, приводящую к стабильному соотношению адипогенных и остеогенных предшественников, независимо от вида индукции. В результате действия индукторов дифференцировки изменяется состав популяции МСК, почти полностью исчезают ранние недифференцированные предшественники, I однако, изменения пролиферативного потенциала МСК не происходит.

Научное значение имеют и выявленные впервые особенности качественного состава МСК при острых лейкозах у детей. Так, установлено, что строма костного мозга при OMJ1 у детей до лечения не несет признаков выраженного повреждения, существенно не отличаясь от МСК условно нормального костного мозга, как в количественном, так и в качественном отношениях. При OJIJ1, напротив, отмечается значительное снижение общего количества клоногенных фибробластов, снижение их способности к дифференцировке с преимущественным подавлением адипогенной трансформации.

В разработанной нами культуральной модели взаимосвязи МСК и кроветворения показано, что МСК обладает колониестимулирующим воздействием на пролиферацию гранулоцитарно-макрофагальных предшественников, близким к таковому стандартного лейкоцитарного фидера. В данной модели это свойство не зависит от дифференцировочного потенциала МСК.

Практическое значение

Практическое значение работы заключается в разработке стандартных методов и способов оценки дифференцировочного потенциала МСК костного мозга. Разработанные нами индексы трансформации и референтные значения этих показателей дают возможность количественно оценить дифференцировочные потенции стромы костного мозга у больного и использовать эти тесты в клинических целях.

Разработанная в диссертации культуральная модель взаимосвязи МСК и кроветворения может быть полезна в дальнейшем для изучения механизмов поражения гемопоэза при заболеваниях крови и решения клинических задач.

Работа выполнена в лаборатории регуляции кроветворения (зав.-д.б.н. Осипова Е.Ю.) отдела молекулярной гематологии (руководитель-к.м.н. Румянцев С.А.) Федерального научно-клинического центра гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава (директор-член корр. РАМН, д.м.н., профессор Румянцев А.Г.) на базе клинических отделений общей гематологии (зав.- Масчан М.А.), онкогематологии и полиохимиотерапии (зав.-к.м.н. Литвинов Д.В.), онкогематологии (зав.-д.м.н. Мякова Н.В.) Российской детской клинической больницы Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ (гл.врач-д.м.н., профессор Ваганов Н.Н.); отделения гематологии (зав.-к.м.н. Кондратчик K.J1.) Морозовской детской клинической больницы (гл.врач-академик РАЕН, профессор Корнюшин М.А.); отделения гематологии (зав.-к.м.н. Сосков Г.И.) Измайловской детской городской клинической больницы (гл. врач-Жарков А.П.).

Заключение диссертации по теме «Педиатрия», Пурбуева, Базарма Баяровна

выводы

1. Стандартизированы условия культивирования МСК при применении индукторов дифференцировки в первичных культурах клоногенных фибробластов костного мозга человека.

2. Разработаны критерии оценки дифференцировочных потенций МСК костного мозга и получены референтные значения этих показателей для нормального костного мозга.

3. В первичной культуре МСК условно нормального костного мозга индукция дифференцировки, не влияя на общее число клоногенных фибробластов, приводит к исчезновению из этой популяции наиболее ранних недифференцированных предшественников; доля ранних недифференцированных предшественников в стабильном состоянии без применения индукторов дифференцировки составляла около 60%;

4. Адипогенная индукция в равной степени стимулирует как адипогенную, так и остеогенную дифференцировку клоногенных предшественников фибробластов, достоверно увеличивает число дифференцированных предшественников, не меняя их соотношения в популяции;

5. Применение индукторов остеогенной и адипогенной дифференцировки МСК при ОМЛ оказывает воздействие на популяцию в качественном и количественном отношениях, близкое к таковому в нормальном костном мозге;

6. Стромальное микроокружение при OJIJI страдает в большей степени, чем при OMJI не только в количественном (снижение ЭК и ПП клоногенных фибробластов), но и в качественном отношениях: МСК при OJ1JI оказались менее чувствительными к индукции дифференцировки. При этом в большей степени страдает дифференцировка МСК в сторону адипогенных предшественников, отмечается значительное уменьшение доли адипогенных предшественников в стабильном состоянии, без стимуляции;

7. МСК костного мозга в предложенной нами модели агаровой культуры оказывают стимулирующее влияние на колониеобразование гранулоцитарно-макрофагальных предшественников, по характеру и силе воздействия очень близкое к таковому стандартного фидера;

8. Адипогенная и остеогенная дифференцировка МСК не оказывает существенного влияния на их колониестимулирующую активность, отмечается лишь тенденция к увеличению пролиферативного потенциала КОЕ-ГМ;

9. При анализе клинического материала не удалось выявить взаимосвязи между эффективностью клонирования стромальных фибробластов костного мозга до начала терапии с длительностью периода медикаментозной аплазии при проведении индукционной терапии как при OMJ1, так и OJIJ1 у детей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Оценку количества и пролиферативного потенциала МСК костного мозга рекомендуется проводить при следующих условиях культивирования: мононуклеарные клетки, выделенные на градиенте плотности Фиколла 1,077 в концентрации 2х104/мл; использование 20% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, либо человеческой сыворотки AB(IV) группы крови при приготовлении среды для культивирования.

2. Для оценки дифференцировочных потенций МСК рекомендуется использование следующих индукторов дифференцировки: при остеогенной дифференцировке - /? -глицерофосфата, дексаметазона, аскорбиновой кислоты; при адипогенной дифференцировке -дексаметазона, инсулина.

3. Для количественной оценки дифференцировочных потенций стромы костного мозга у конкретного больного следует использовать индексы адипогенной и остеогенной трансформации стромальных предшественников. Полученные референтные значения этих показателей дают возможность использовать эти тесты в клинических целях.

4. Для изучения патогенетических механизмов поражения гемопоэза при острых лейкозах можно использовать разработанную нами культуральную модель взаимосвязи МСК и кроветворения.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Пурбуева, Базарма Баяровна, 2006 год

1. Афанасьев Б.В., Алмазов В.А. Родоначальные кроветворные клетки человека. Физиология и патология. Наука; 1985; 204

2. Афанасьев Б.В., Зубаровская Л.С. Роль стромы кроветворных органов в развитии некоторых гематологических заболеваний. Тер. Архив. 1985; 7; 27-33.

3. Афанасьев Б.В., Тиранова С.А., Кулибаба Т.Г. Клонирование кроветворных клеток человека в системе агаровая капля-жидкая среда. Тер.архив. 1983; 8: 114-121.

4. Владимирская Е.Б. Изучение колониеобразующей активности стромы костного мозга у детей больных острым лейкозом. Пробл. гематол.; 1977; т22; 11:28-31.

5. Владимирская Е.Б. Регуляция пролиферации стромальных фибробластов метилпреднизолоном в культурах in vitro. Гематология и трансфузиология 1994; 2: 11-14.

6. Владимирская Е.Б., Айманбетова А.М., Колосова Л.Ю., Цуря В.М. Зависимость пролиферации клоногенных фибробластов костного мозга человека от фидера. Экспериментальная онкология 1989; 25: 79.

7. Владимирская Е.Б., Кошель И.В. Стромальные фибробласты нормального костного мозга у детей. Гематология и трансфузиология 1990; 1:3-5.

8. Владимирская Е.Б., Майорова О.А., Румянцев С.А., Румянцев А.Г. Биологические основы и перспективы терапии стволовыми клетками. 2005; стр 74-82.

9. Владимирская Е.Б., Торубарова Н.А., Кошель И.В. Колониеобразующая активность стромальных предшественников мехапоцитов костного мозга при лейкозах и гипоплазиях кроветворения. Бюл. эксперим. биол. и мед.; 1981; т. 91; 3: 279-281.

10. Герасимов Ю.В., Фриденштейн А.Я., Чайлахян Р.К. Дифференцировочные потенции клональпых штаммов костно мозговых фибробластов. Бюл. эксперим. биол. и мед.; 1986; т. 101; 6: 717-719.

11. Гуревич О.А., Дризе Н.И., Удалов Г.А. Длительные культуры костного мозга как модель изучения клеток- предшественников кроветворной стромы. Пробл. гематол., 1982; т27; 7: 7-12.

12. Гуревич О.А., Дризе Н.И., Чертков И.Л. Пролиферация клеток предшественников кроветворного микроокружения в длительных культурах костного мозга мышей. Бюл. эксперим. биол. и мед.; 1984; т. 98; 11: 612-614.

13. Гуревич О.А., Чертков И.Л. Факторы влияющие на функционирование клеток, переносящих кроветворное микроокружение. Пробл. Гематологии. 1980. 25; 8: 43-48.

14. Колосова Л.Ю., Владимирская Е.Б., Ковалева Л.Г. Клоногенное культивирование предшественников костномозговых фибробластов при миелопролиферативных заболеваниях человека. Эксперимент, онкология.; т. 10; 2: 46-48.

15. Старостин В.И., Мичурина Т.В. Строма кроветворных органов и ее взаимоотношение со стволовой кроветворной клеткой.-В кн.: Морфолошя человека и животных. Антропология.-М.: Медицина, 1977; 59-110.

16. Фриденштейн А.Я., Дериглазова Ю.Ф., Кулагина H.II. Клонирование клеток-предшественников для фибробластов в монослойных культурах клеток. Бюллютень экспериментальной биологии и медицины. 1973; 76: 90-94.

17. Фриденштейн А.Я., Лалыкина К.С. Индукция костной ткани и остеогенные клетки предшественники.М.:Медицина 1973; 216.

18. Фриденштейн А.Я., Лурия Е.А. Клеточные основы гемопоэтического микроокружения. Терапевт, архив. 1980; Т. 52; 9: 67-71.

19. Фриденштейн А.Я., Лурия Е.А. Микроокружение лимфоидных органов как фактор иммунитета. В кн. Иммуногенез и клеточная дифференцировка. М.: Наука, 1978; 159-175.

20. Фриденштейн А.Я., Чайлахян Р.К. Стромальные клетки костного мозга и кроветворное микроокружение. Архив. Патолог. 1982; т.44; 10:3-11.

21. Фриденштейн А.Я., Чайлахян Р.К., Герасимов Ю.В. Пролиферативные и дифференцировочные потенции скелетогенных костномозговых колониеобразующих клеток. Цитология, 1986; 28: 341-349.

22. Фриденштейн А.Я., Чайлахян Р.К., Лалыкина К.С. О фибробластоподобных клетках в культурах кроветворных тканей морских свинок. Цитология 1970; 12: 1147-1155.

23. Фриденштейн А.Я., Чайлахян Р.К., Лациник Н.В. Стромальные клетки, ответственные за перенос микроокружения в кроветворной и лимфоидной ткани. Пробл. гематол., 1973; т 18; 10:14-22.

24. Фриденштейн А.Я., Чертков И.Л. Клеточные основы иммунитета.М.-Медицина, 1969; 256.

25. Цуря В.М. Функциональное состояние стромального микроокружения костного мозга в норме и при остром лимфобластном лейкозе у детей. Автореферат. 1988, стр.13.

26. Чертков И.Л., Гуревич О.А. Стволовая кроветворная клетка и ее микроокружение. М.: Медицина, 1984; 237.

27. Чертков И.Л., Фриденштейн А.Я. Клеточные основы кроветворного микроокружения. Москва; 1977 .

28. Aggarwal S., Pittenger М. Human mesenchymal stem cells modulate allogenic immune cell responses. Blood 2005; 105: 1815-1822.

29. Aizavva S., Tavassoli M. In vitro homing of hemopoietic stem cells is mediated by a recognition system with galactosyl and mannosyl specifies. Proc. Natl Acad; 84; 4485-4489

30. Angelopoulou M., Novelli E., Grove J.,E. Et al. Cotransplantation of human mesenchymal stem cells enhances human myelopoesis and megakaryocytopoiesis in NOD/SCID mice.- Exp Hematol.2003 .-31.-413-420.

31. Awaya N, Rupert K, Bryant E, Torok-Storb B. Failure of adult marrow-derived stem cells to generate marrow stroma after successful hematopoietic stem cell transplantation. Exp Hematol. 2002; 30:937-942.

32. Azizi S., Strokes D., Augelli B.,e.a. Engrafment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats: similarities to astrocyte grafts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 3908-3913.

33. Baserga A. Le nicchie di mitosi hemopoietiche. Hematologica (Pavia). 1976. Vol.61. N1. 1-8.

34. Bentley S.A., Bone marrow connective and the hemapoietic microenvironment. Brit. J. Hematol, 1982. Vol.50; 1: 1-6.

35. Bentley S.A. Myelofibrosis Pathophysiology and clinical management. Ed. S. M. Levis. Basel, 1985; 87-100.

36. Bentley S.A., Foidart J-M., Kleinman H.R Connective tissue elements in Rat Bone marrow. J. Histochemistry and cytochemistry. 1984; Vol.32; 1: 114-116.

37. Bentley S.A., Tralka T.S. Characterization of marrow-derived adgerent cells. Scand.J.Hematol., 1982; Vol.28; 5: 381-388.

38. Bentley S.A., Tralka T.S. Fibronektin-mediated attachment of hemopoietic cells to stromal elements in continuous bone marrow culture. Exp.hematol.,1983; Vol.11; 2: 129-138.

39. Bianco P., Robey P. Marrow stromal stem cells. J, Clin, Invest, 2000; 105: 1663-1668.

40. Bianco P. Ruminucci M., Gronthos S., Robey P. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology and potential applications. Stem cells,2001,19, 180-192.

41. Bjornson C., Rietze R.,Reynolds B.,e.a. Turning brain into blood: a hemopoietic fate adopted by adult neural stem cells in vivo. Science, 1999, 283, 534-537.

42. Brockbank K.G., Jong J.P., Piersma A.H. Hemopoiesis on purified bone marrow-derived reticular fibroblasts in vitro. Exp, Hematol, 1986; 14; 5: 386-394.

43. Burgio V.L., Magrini U. An Enzime- histochemical approach to the study of ihe human bone marrow strome. Acta hematol. Basel. 1984; Vol.71; 2: 73-80.

44. Castro-Malaspina H., Gay R., Resnick G., et al. Characterization of human bone marrow fibroblast colony-forming cells (CFU-F) and their progeny. Blood 1980; 56: 289-301.

45. Cilloni D., Carlo-Stella C., Falzetti F., et al. Limited engraftment of bone marrow-derived mesenchymal cells following T-cell-depleted hematopoietic stem cell transplantation. Blood 2000; 15: 3637-3643.

46. Colter D.C., Class R., Digirolamo C.M., Prockop D.J. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow. Proc. Nati. Acad. Sci USA.-2000; 97; 3213-3218.

47. Culombel L., Vuillet M., Leroy C. Lineage- and stade-specific adgesion of haemopoietic progenitor cells to extracellilar matrices from marrow fibroblasts. Blood; 1988; 71; 329-334.

48. Curri J.L., Trentin J.J. Hemopoietic spleen colony studies. Growth and differentiation. Develop. Biol. 967. Vol.15. 395-413.

49. De Kok I.J., Peter SJ., Artambault M., et.al.Investigation of allogeneic mesenchymal stem cell-based alveolar bone formation:preliminary findings.-CIin Oral Implants Res.-2003.-14. 481-489.

50. Deans RJ., Moseley AB. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Exp. Hematol.-2000.-28.-875-884.

51. Devine, S.M., C. Cobbs, M. Jennings, A. Bartholomew, and R. Hoffman. 2002. Mesenchymal stem cells distribute to a wide range of tissuesfollowing systemic infusion into non-human primates. Blood. 10.1182/blood-2002-06-1830. t

52. Dexter T.M. Stromal cell associated haemopoiesis. J. Cell phisiol. 1982; (suppl.l): 87-94.

53. Dexter T.M., Allen T.D., Lajtha L.G. Conditions controlling the proliferation of hemopoietic stem cells in vitro. J. Cell phisiol. 1977; Vol.91; 3:335-344.

54. Dexter T.M., Simons P. The regulation of hemopoietic cell development by the stromal cell environment in diffusible regulatory molecules. Prog. Clin. Biol. Res.1984; Vol.148; 1: 13-33.

55. Forbes S., Vig P., Poulsom R. e.a. Adult stem cell plasticity: new pathways of tissue regeneration become visible. Clinical Science, 2002, 103,355-369.

56. Fricdenstein A., Petrakova K., Kurolesova A., Frolova G/ Heterotopic transplants of bone marrow Analysis of precursors cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 1968; 6; 230-247.

57. Fuchs JR., Hannouche D., Terada S., Vacant JP., Fauza DO. Fetal tracheal augmentation with cartilage engineered from bone marrow-derived mesenchimal progenitor cells.-J.Pediatr Surg.-2003; 984-987.

58. Gazit D., Turgeman G., Kelley P., et.all.Engineered pluripotent mesenchymal cells integrate and differentiate in regenerating bone: a novel cell-mediated gene therapy. J. Gene Med.-1999; 1; 121-133.

59. Gordon Jl, Schmidt GH, Roth KA. Studies of intestinal stem cells using normal, chimeric, and transgenic mice. FASEB J. 1992;6:3039-3050.

60. Greenberg В., Wilson F., Woo 1. Cytogenetics of fibroblasts colonies in Ph-positive chronic myelogenous leykemia. Blood; 1987; 51; 1039-1044.

61. Hardeman EC, Chiu CP, Minty A, Blau HM. The pattern of actin expression in human fibroblast X mouse muscle heterokaryons suggests that human muscle regulatory factors are produced. Cell. 1986; 47: 123130.

62. Haynesworth SE, Barber MA, Caplan IA. Cell surface antigens on human marrow-derived mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodies. Bone. 1992; 13: 69-80.

63. Hirata H., Katsuno M., Kaneco S. Clinical significance of human bone marrow stromal cell colonies on acute leikemias. Leikemi Res 1986; 10; 1441-1446.

64. Horwitz EM, Prockop DJ, Fitzpatrick LA, et al. Transplantability and therapeutic effects of bone marrow-derived mesenchymal cells in children with osteogenesis imperfecta. Nat Med. 1999; 5:309-313

65. Ни M, Krause D, Greaves M, et al. Multilineage gene expression precedes commitment in the hemopoietic system. Genes Dev. 1997; 11: 774-785.

66. Iluang S.,Trstappen L. Formation of hematopoietic microenviroment and hematopoietic stem cclls from single human bone marrow stem cells. Naturem 1994, 368 ,664-667.

67. Ianus A, Holz GG, Theisc ND, Hussain MA. In vivo derivation of glucose-competent pancreatic endocrine cells from bone marrow without evidence of cell fusion. J. Clin. Invest. 2003; 111: 843-850.

68. Jaiswal N, Haynesworth SE, Caplan A I, Bruder SP. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem 1997; 64: 295-312.

69. Jaiswal RK, Jaiswal N, Bruder SP, Mbalaviele G, Marshak DR, Pittenger MF. Adult human mesenchymal stem cell differentiation to the osteogenic or adipogenic lineage is regulated by mitogen-activated protein kinase. J Bio! Chem. 2000; 275: 9645-9652.

70. Javazon E.N., Colter D.C., Schwarz E.J., Prockop D.J. Rat marrow stromal cclls are more sensitive to plating density and expand more rapidly from single-cell-derived colonies than human marrow stromal cells. Stem cells/ 2001; 19; 219-225.

71. Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL, et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 2002;418: 41-49.

72. Kobayashi M., Imamura M., Uede T. Expression of adhesion molecules on human hematopoietic progenitor cells at different maturation stages. Stem Cells Dayt. 1994; 12; 316-321.

73. Кос О., Day J., Nieder M., et al. Allogenic mesenchymal stem cells infusion for treatment of metachromatic leukodystrophy (MLD) and Hurler syndrome (MPS-IIi). Bone Marrow Trancplant 2002; 30: 215-222.

74. Krause DS, Theise ND, Collector MI, et al. Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell. Cell. 2001; 105: 369-377.

75. LaBarge MA, Blau HM. Biological progression from adult bone marrow to mononucleate muscle stem cell to multinucleate muscle fiber in response to injury. Cell. 2002; 111: 589-601.

76. Laflamme MA, Myerson D, Saffitz JE, Murry CE. Evidence for cardiomyocyte repopulation by extracardiac progenitors in transplanted human hearts. Circ Res. 2002; 90: 634-640.

77. Lagasse E, Connors H, Al-Dhalimy M, et al. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo. Nat Med. 2000; 6: 12291234.

78. Lazarus H., Curtin P., Devine S. Role of mesenchymal stem cells in allogeneic transplantation: early phase i clincial results (abstract).- Blood.-2000; 96; 392.

79. Lazarus II., Hayneswortg S., Gerson S., et al. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progrnitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Trancplant, 1995; 16: 557-564.

80. Le Blanc K. et al., Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the histocompatibility complex, 2003, Scandinavian J of Immunol.,57, 11-20.

81. Le Blanc K. et al., Mesenchymal stem cells inhibit the expression of CD25 and CD 38 on PHA-activated lymphocytes, 2004, Scandinavian J of Immunol.,60, 307-315.

82. Le Blanc K., Tammik C., Rosendahl K., et al. HLA expression and immunologic properties of diggerentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp, Hematol, 2003; 31: 890-896.

83. LeBlanc K., Rasmusson I., Sunberg В., et al. Treatment of severe acute graft-vcrsus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells. The Lancet 2004; 363: 1439-1441.

84. Maciejewski J. P. et al, Interferon-g constitutively expressed in the ctromal microenvironment of human marrow cultures mediates potent hematopoietic inhibition, 1996,Blood, 87,10, 4149-4157.

85. Maciejewski J. P. et al, Intracellular interferon-g in circulating and marrow t cells detected by flow cytometry and the response to immunosuppressive therapy in patients with AA, 2002,Blood, 100,4, 1185-1191.

86. Maciejewski J. P. et al, Recombinant humanized anti-IL-2 receptor antibody produces responses in patients with AA, 2003,Blood, 102,10, 3584-3586.

87. Martin D.R., Cox N.R., Hathcock T.L., Niemeyer G.P., Baker H.J. Isolation and characterization of multipotential mesenchymal stem cells from feline bone marrow. Exp. Hematol. 2002; 30; 879-886.

88. Martin-Rendon E., Watt S. Exploitation of stem cell plasticity. Transfusion Medicine, 2003, 13,325-349.

89. Masuya M., Drake C., Fleming P.e.a. Hemopoietic origin of glomerular mesangial cells. Blood, 2003,101,2215-2218.

90. Mertelsmann R., Lindermann A., Oster W. Hemopoietic growth factors in oncology. Cancer detect. Prev. 1990; 14; 613-616.

91. Mezey E, Chandross KJ, Harta G, Maki RA, McKercher SR. Turning blood inlo brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow. Science. 2000;290:1779-1782.

92. Minguell JJ, Conget P. Mesenchymal progenitor cell: Biology and clinical utilization. Br J Med Biol Res 33: 881-887,2000.

93. Minguell JJ, Mesenchymal stem cells: Exp Biol Med Vol.226(6): 507520,2001.

94. Moore M.A.S. "Turning brain into blood" clinical applications of stem ccll research in neurobiology and hematology. New Engl. J. Med.,1999,341, 605-607.

95. Morrison SJ, Prowse KR, Ho P, Weissman IL. Telomerase activity in hematopoietic cells is associated with self-renewal potential. Immunity. 1996;5: 207-216.

96. Muller P, Pfeiffer P, Koglin J, et al. Cardiomyocytes of noncardiac origin in myocardial biopsies of human transplanted hearts. Circulation. 2002;106:31-35.

97. Muraglia A., Cancedda R., Quarto R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. Jornal of Cell Science 2000: 113: 1161-1168.

98. Nakano К., Migita M., Mochizuki H., Shimada Т. Differentiation of transplanted bone marrow cells in the adult mouse brain. Transplantation,2001,71,1735-1740.

99. Odorico J., Kaufman D., Thomson J. Multilineage differentiation from human embryonic stem lines. Stem cells., 2001, 19, 193-204.

100. Okamoto R, Yajima T, Yamazaki M, et al. Damaged epithelia regenerated by bone marrow-derived cells in the human gastrointestinal tract. Nat Med. 2002;8:1011-1017.

101. Owen M., Fridenstain A. Stromal stem cells: marrow-derived osteogenic piogenitors. Ciba Found Symp, 1988; 136: 42-60.

102. Owen M.Marrow stromal stem cells. J.Cell Sci. 10, 63-76.

103. Pittenger M., Mackay A., Beck S., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999; 284: 143-147.

104. Prockop DJ. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 276: 71-74, 1997.

105. Quaini F, Urbanek K, Beltrami AP, Finato N, Beltrami CA, Nadal-Ginard B, Kajstura J, Leri A, Anversa P. Chimerism of the transplanted heart. N Engl J Med. 2002;346:5-15.

106. Quesenberry P., Colvin G., Lambert J., e.a. Marrow stem cell potential within a continuum. Ann.N.Y.Acad.Sci.,2003,996,209-221.

107. Rakic P. Pittenger M., Mackay A., Beck S., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999; 284: 143-147.

108. Roberts R., Gallaher J., Spooncer E., et al. Heparan sulfate bound growth factors a mechanism for stromal cell mediated haemopoiesis. Nature; 332; 376-378.

109. Rombouts W.J., Ploemacher R.E. Primary murine MSC show highly efficient homing to the bone marrow but lose homing ability following cu1ture.-Leukemia.-2003.17.-160-170.

110. Russell S. Taichman. Blood and bone: two tissues whose fates are intertwined to create the hematopoietic stem-cell nich. Blood, 2005;105:2631-2639.

111. Simmons P., Zannettino A., Gronthos S. Potential adhesion mechanisms for localization of haemopoietic progenitors to bone marrow stroma. Leucemia and Lymphoma. 1994; 12; 353-363.

112. Svendsen CN, Caldwell MA, Ostenfeld T. Human neural stem cells: Isolation, expansion and transplantation. Brain Path. 1999;9:499-513.

113. Szmitko P., Fedak P., Weisal R. e.a. Endothelial progenitor cells. New hope for a broken heart. Circulation, 2003,107,3093-3100.

114. Tanaka J., Kasai M., Imamura M. et al. Evaluation of mixed chimaerism and origin of bone marrow derived fibroblastoid cells after allogeneic bone marrow transplantation. -Br. J. IIaematcl.-1994.-86.-436-438.

115. Tavassoli M. Studies of hemopoietic microenvironment. Exp.Hemat. 1975; 3; 213-226.

116. Terada N, Hamazaki T, Oka M, et al. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion. Nature. 2002;416: 542-545.

117. Theise N, Henegariu O. Grove J, et al. Radiation pneumonitis in mice: a severe injury model for pneumocyte engraftment from bone marrow. Exp Hem. 2002;30: 1333-1338.

118. Theise N., Krause D. Toward a new paradigm of cell plasticity. Leukemia, 2002,16, 542-548.

119. Iheise ND, Badve S, Saxena R, et al. Derivation of hepatocytes from bone marrow cells in mice after radiation-induced myeloablation. Hepatology. 2000;31:235-240.

120. Theise ND, Krause DS, Sharkis S. Comment on 'Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells.' Science. 2003;2<>9: 1317.

121. Theise ND, Nimmakayalu M, Gardner R, et al. Liver from bone marrow in humans. Hepatology. 2000;32:11-16.

122. Till J., McCulloch E. Л Direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiation Research, 1961, 14, 213-222.

123. Till J. McCulloch E. A. Stem cells in differentiation and neoplasma. J. C;ll Physiol. 1982; 1; 3-11.

124. Trentin J. Hemopoietic microinveronment. Transplant. Proc.1978; 10; 1; 77-81.

125. Tsuchida H., Hashimoto J., Crawford E., Manske P., Lou J. Engineered allogeneic mesenchymal stem cells repair femoral segmental defect in rsts.-J. Orthop Res.-2003.-21.-44-53.

126. Turgernan G., Zilberman Y., Zhou S. et.al. Systematically administered rhBMP-2 promotes MSC activity and reverses bone and cartilage loss in osteopenic mice.- Cell Biochem.-2002.-86,- 461-474.

127. Uchida N, Buck DW, He D, et al. Direct isolation of human central nervoib system stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2000;97:14720-14725.

128. Van- den Berg H., Van-Tol M., Waaijer J. Studi of possible correltion between in vitro growth of bone marrow stromal and hematopoietic precursor cells early after allogeneic bone marrow transplantation. Exp. Hematol. 1992;20;184-191.

129. Verfaillie С., Pera M., Lansdorf P. Stem ctlls: hype and reality. Hematology, 2002, 369-391.

130. Vladimirskaya E., Zamaraeva N., Osipova E., et al. The effect of rncthyJcrednisolone on bone marrow and spleen clonogenic fibroblasts in humans. NATO ASI Series 1996; II 94: 91-97.

131. Wagers AJ, Sherwood RI. Christensen JL, Weissman IL. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science. 2002-.297: 2256-2259.

132. Watt FM. Epidermal stem cells: markers, patterning and the control of stem cell fate. Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci. 1998;353:831-837.

133. Welm BE, Tepera SB, Venezia T, Graubert ТА, Rosen JM, Goodell MA. Sca-l(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population. Dev Biol. 2002;245:42-56.

134. Wilmut I., Schnieke A., McWhir J.,e.a. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature,1997,386,200-203.

135. Wolf N.S. Reversibility of hematopoietic stem cell direction as influenced by the microenvironment. Blood cells. 1978; 4;37-51.

136. Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, Black IB. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res. 2000;61:364-370.

137. Ying QL, Nichols J, Evans EP, Smith AG. Changing potency by spontaneous fusion. Nature. 2002:416: 545-548.t

138. Yoko Tabe, Marina Konopleva, Rooha Contractor, Mark Munsell. Uprcgulation of MDR1 and induction of doxorubicin resistance by histone deacetylase inhibitor depsipeptide (FK228) and ATRA in acute promyelocyte leukemia cells. Blood. 2004;10:4126.

139. Zipori D. Stromal cell from the bone marrow. Evidence for a restrictive role in regulation of hemopoiesis. Eur. J. Hematol. 1989; 42; 225-232.