Видовой состав бактерий порядка Bacteroidales в микрофлоре кишечника у здоровых людей и характеристика плазмиды, выделенной из B.uniformis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат медицинских наук Кулагина, Елена Валерьевна

• Кулагина, Елена Валерьевна
• кандидат медицинских наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Кулагина, Елена Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Введение.

1.2 Значение бактерий порядка Bacteroidales в микробноценозе кишечника.

1.3 Изучение видового состава бактерий порядка Bacteroidales в микрофлоре кишечника.

1.4 Плазмиды у бактероидов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Объекты исследования.

2.2 Бактериологические и молекулярно-генетические методы, примененные для изучения видового состава бактерий порядка Bacteroidales.

2.2.1 Культуральные методы.

2.2.2 Выделение тотальной ДНК из штаммов бактероидов.

2.2.3 Рестрикционный анализ амплифицированной рибосомальной ДНК (ARDRA, Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis).

2.2.4 Секвенирование фрагмента гена 16S рРНК.

2.3 Молекулярно-биологические и биохимические методы, примененные для выделения и изучения плазмид у бактероидов.

2.3.1 Культивирование бактерий.

2.3.2 Полимеразная цепная реакция.

2.3.3 Обработка ДНК ферментами нуклеинового обмена.

2.3.4 Синтез ДНК-олигонуклеотидов.

2.3.5 Трансформация бактериальных штаммов.

2.3.6 Конъюгация.

2.3.7 Выделение плазмидных ДНК.

2.3.8 Секвенирование плазмиды.

2.3.9 Выделение тотальной РНК.

2.3.10 ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

2.3.11 Определение антибиотикорезистентности методом бумажных дисков и поиск гена tetQ

2.4 Методы биоииформатики и компьютерной обработки данных.

2.4.1 Методы биоинформатики.

2.4.2 Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Изучение качественного и количественного состава микрофлоры кишечника.

3.2. Особенности видового состава представителей порядка Bacteroidales.

3.3. Поиск плазмидных ДНК в штаммах бактерий порядка Bacteroidales.

3.4 Определение полной нуклеотидной последовательности плазмиды pBUN24.

3.5 Анализ полной нуклеотидной последовательности плазмиды pBUN24.

3.6 Поиск открытых рамок считывания плазмиды pBUN24 среди других штаммов бактерий порядка Bacteroidales.

3.7 Повторое выделение плазмиды pBUN24.104

3.8 Экспрессия открытых рамок считывания плазмиды pBUN24 в штаммах Bacteroides vulgatus и Parabacteroides distasonis.

3.9 Определение чувствительности к антибактериальным препаратам.

3.10 Конструирование челночного клонирующего вектора E.coli-Bacteroides.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ:.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Видовой состав бактерий порядка Bacteroidales в микрофлоре кишечника у здоровых людей и характеристика плазмиды, выделенной из B.uniformis»

Актуальность. Дистальные отделы кишечника являются средой обитания для многочисленного и разнообразного сообщества микроорганизмов. Количество бактерий только в одном грамме

10 содержимого толстой кишки достигает 10 микробных клеток. Преобладающие в количественном отношении в этой экосистеме бактерии принадлежат к порядкам Bacteroidales (тип Bacteroidetes, класс Bacteroidia) и Clostridials (тип Firmicutes, класс Clostridia) и роду Bifidobacterium (тип Actinobacteria, класс Actinobacteria, порядок Bifidobacteriales) [Hayashi Н. et al., 2002, Qin J. et al., 2010]. К порядку Bacteroidales относятся строго анаэробные неспорообразующие грамотрицательные палочки. Исследования последнего времени показывают, что, колонизируя кишечник, эти бактерии участвуют в метаболизме сложных полисахаридов, модулируют местный иммунный ответ и препятствуют заселению кишечника патогенными микроорганизмами [Xu J. и Gordon J.I., 2003, Martens Е.С. et al., 2009]. С другой стороны, в случае транслокации из кишечника во внутренние, стерильные в норме, среды организма, бактерии этой таксономической группы могут вызывать тяжелые анаэробные инфекции [WexlerH.M., 2007].

Однако, несмотря на доминирующее положение занимаемое бактериями порядка Bacteroidales в кишечнике человека наши представления о их видовом составе остаются ограниченными. Это, в свою очередь, связано с недостаточной информативностью используемых для решения этой задачи конвенциональных микробиологических методов, которые основаны, прежде всего, на изучении относительно небольшого спектра фенотипических свойств бактериальных штаммов, изолируемых из биологического материала [Song Y.et al., 2005].

Активное внедрение молекулярно-генетических методов в практику микробиологических исследований позволило получить новую информацию о составе и свойствах микроорганизмов колонизирующих различные анатомические области тела человека [Eckburg Р.В. et al., 2005, Tringe S.G. et al., 2008, Woo P.C. et al., 2008, Karlsson F.H. et al., 2011]. Так, в последние годы была разработана целая палитра методов, основанных на сравнительном анализе видоспецифичных нуклеотидных последовательностей геномной ДНК бактерий, позволяющих быстро и достоверно определять таксономическую принадлежность выделяемых микроорганизмов [Olsen G.J. et al., 1993, Stubbs S.L. et al., 2000, Deng W. et al., 2007].

В этой связи, очевидна актуальность привлечения методов молекулярно-генетической идентификации для выяснения таксономической принадлежности бактерии порядка Bacteroidales кишечного происхождения.

Отдельным важным направлением исследований бактерий порядка Bacteroidales является изучение их генетических свойств [Salyers S.L. et al., 2000]. В частности большой интерес представляют широко распространенные среди Bacteroides spp. разнообразные мобильные генетические элементы (инсерционные последовательности, транспозоны) и плазмиды [Smith C.J. et al., 1998, Soki J. et al., 2010]. Поиск и физическое картирование таких элементов на уровне определения нуклеотидных последовательностей с их последующим сравнительным анализом и идентификацией генов и cw-элементов, ответственных за автономную репликацию, а затем и конструирование на их основе клонирующих векторов позволит создать инструментальную базу, необходимую для дальнейшего изучения генетики бактероидов и манипулирования их свойствами при помощи генно-инженерных методов.

Цель настоящего исследования: изучить видовой состав бактерий порядка Bacteroidales в микрофлоре кишечника у здоровых людей разного возраста, а также провести поиск и анализ плазмидных ДНК у выделенных штаммов бактерий этого порядка.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ качественного и количественного состава бактерий порядка Bacteroidales, колонизирующих кишечник здоровых людей разных возрастных групп с использованием молекулярно-генетических методов.

2. Провести поиск плазмидных ДНК в штаммах бактерий порядка Bacteroidales, выделенных из кишечника здоровых людей.

3. Определить полную нуклеотидную последовательность избранной плазмиды и проанализировать ее методами биоинформатики.

4. Провести поиск генов, гомологичных обнаруженным на изученной плазмиде, среди других штаммов бактерий порядка Bacteroidales, выделенных у здоровых людей.

5. Создать челночный клонирующий вектор E.coli-Bacteroides и оценить его способность к конъюгативному переносу из штамма E.coli в штамм Bacteroides sp.

Научная новизна. Впервые показано, что кишечник здоровых людей в высокой концентрации колонизируют не4 только бактерии рода Bacteroides, но и представители других родов порядка Bacteroidales, таких как Alistipes, Parabacteroides, Barnesiella, Odoribacter и Prevotella.

Впервые показано, что, бактерии недавно охарактеризованного вида Bacteroides xylanisolvens являются доминирующими в кишечнике людей разного возраста. Впервые установлено, что представители рода Alistipes чаще колонизируют кишечник взрослых людей, чем детей раннего возраста.

Впервые показано, что 40,5% штаммов бактерий порядка Bacteroidales, выделенных из кишечника клинически здоровых детей, являются носителями плазмидных ДНК. Определена и аннотирована полная нуклеотидная последовательность новой плазмиды рВЦЫ24, выделенной из штамма Вас1его1с1е$ ит/огтгз, которая является первой полностью просеквенированной плазмидой этого вида бактероидов. На основе рВ1Ж24 создан челночный клонирующий вектор Е соН— Вас1егогс1ез, способный к автономной репликации в обоих типах хозяйских клеток.

Личный вклад Кулагиной Е.В. в получение научных результатов. Кулагина Е.В. непосредственно участвовала в выполнении всех этапов настоящей работы, в том числе проводила посев исследуемого материала, выделение и идентификацию штаммов бактерий порядка ВаМего1с1а1е$, выделение и анализ плазмидных ДНК, создание челночного клонирующего вектора Е.соИ—Bacteroid.es, а также обработку полученных данных при помощи статистических методов и методов биоинформатики.

Практическая значимость работы. Создана коллекция, содержащая 119 штаммов бактерий порядка Ва&егос1а1е8, выделенных из кишечника здоровых людей, включающая 21 вид микроорганизмов этого порядка. Видовая принадлежность полученных штаммов определена при помощи достоверных молекулярно-генетических методов.

Полученные сведения о возрастных особенностях видового состава бактерий порядка Ва&его\(1а1е8 в кишечнике у человека могут быть использованы в различных областях здравоохранения для оценки микробиологического статуса здоровых людей или пациентов с различной патологией.

Примененный для видовой идентификации бактерий порядка Вас1егос1а1е8 оригинальный протокол метода АМЖА может быть использован в рутинной практике идентификации анаэробных грамотрицательных споронеобразующих палочковидных бактерий.

Созданный в ходе настоящего исследования челночный клонирующий вектор E.coli-Bacteroides может быть использован в рамках фундаментальных и прикладных исследований, направленных на изучение генетики бактероидов и получение штаммов с заданными свойствами.

Положения, выносимые на защиту:

1. Наиболее часто в микрофлоре кишечника у здоровых людей разных возрастных групп среди представителей порядка Bacteroidales встречаются бактерии видов Bacteroides xylanisolvens, B.vulgatus и B.uniformis. Однако наряду с ними в высокой концентрации выделяются также представители родов Alistipes, Parabacteroides, Barnesiella, Odoribacter и Prevotella.

2. Штаммы бактерий порядка Bacteroidales, колонизирующие кишечник здоровых людей, с частотой 40,5% являются носителями плазмидных ДНК.

3. Плазмида pBUN24, выделенная из B.uniformis, не имеет охарактеризованных гомологов среди плазмид бактерий порядка Bacteroidales и несет ряд генов, кодирующих белки, обеспечивающие репликацию и мобилизацию плазмиды, а также белки системы токсин-антитоксин.

4. Челночный клонирующий вектор E.coli —Bacteroides, обладает способностью к репликации в обоих типах хозяйских клеток и может быть использован для генетической трансформации B.vulgatus.

Внедрение результатов исследования. Предложенный в настоящей работе протокол метода ARDRA применяется в практической работе на кафедре микробиологии и вирусологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова для видовой идентификации анаэробнь1х бактерий. Штаммы, выделенные в ходе настоящей работы, используются сотрудниками кафедры микробиологии и вирусологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова для изучения биологических свойств бактерий порядка Bacteroidales. Сконструированный в ходе настоящей работы челночный клонирующий вектор E.coli-Bacteroides применяется в работе кафедры микробиологии и вирусологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова для изучения генетики бактероидов.

Результаты исследования включены в материалы лекционного курса и практических занятий для студентов 2-3 курсов лечебного и педиатрического факультетов на кафедре микробиологии и вирусологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены на заседании научной конференции кафедры микробиологии и вирусологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова 21 апреля 2011 г. протокол №10, на заседаниях секции гнотобиологии Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в 2009 и 2010 гг., а также на VI международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на русском языке, на 147 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Библиография включает 170 наименований работ, 7 отечественных и 163 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 24 рисунками и 12 таблицами.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Кулагина, Елена Валерьевна

ВЫВОДЫ:

1 .В микрофлоре кишечника у здоровых людей наиболее часто встречающимися видами бактерий порядка Bacteroidales являются Bacteroides xylanisolvens, Bacteroides vulgatus и Bacteroides uniformis. Кроме того, в высокой концентрации выделяются представители родов Alistipes, Parabacteroides, Barnesiella, Odoribacter и Prevotella. Бактерии рода Alistipes чаще колонизируют кишечник взрослых людей по сравнению с детьми раннего возраста.

2.Штаммы бактерий порядка Bacteroidales с частотой 40,5% являются носителями плазмидных ДНК.

3.Плазмида pBUN24, выделенная из штамма В.uniformis, не имеет охарактеризованных гомологов среди плазмид бактерий порядка Bacteroidales и предположительно несет 12 открытых рамок считывания, в том числе кодирующих синтез белков репликации и мобилизации, а также белков системы токсин-антитоксин.

4.Штаммы других видов бактерий порядка Bacteroidales могут являться носителями генов, гомологичных обнаруженным на плазмиде pBUN24.

5.Сконструированный челночный клонирующий вектор pKSH24 обладает способностью реплицироваться в штаммах Е. coli и Bacteroides vulgatus и может быть использован для генетической трансформации В. vulgatus.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные данные о составе анаэробной грамотрицательной кишечной микрофлоры у здоровых людей свидетельствуют о необходимости внедрения в практику микробиологических исследований микробиоценоза кишечника молекулярно-генетических методов для определения видового состава бактерий порядка Ва&его1с1а1е$. При этом идентификация бактерий порядка Вас1его\с1а1е$ может быть осуществлена с использованием методов АЗДОКА и секвенирования фрагментов гена 168 рРНК быстро и прецизионно, обеспечивая экономичность исследования.

Обнаружение в кишечнике здоровых людей бактерий порядка Ва&его1с1а1ез, которые ранее не выделялись с применением исключительно классических культуральных методов, а также выявление отличий в видовом составе этих бактерий в различные периоды жизни человека, позволяет в будущем развивать научно-практическое направление исследований, целью которого должно стать дальнейшее изучение грамотрицательной анаэробной микрофлоры кишечника и ее возрастных отличий с целью понимания значения этих микроорганизмов для здоровья человека.

Челночный клонирующий вектор рК8Н24 может быть использован в рамках прикладных исследованиях, направленных на изучение биологии бактероидов и получение штаммов с необходимыми свойствами.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Кулагина, Елена Валерьевна, 2011 год

1. Гланц С. Медико-биологическая статистика. — Практика — 1998, С.459.

2. Дурбин Р., Эдди Ш., Крог А., Митчисон Г. Анализ биологических последовательностей. РХД - 2006, С.600.

3. Ефимов Б.А. Микроэкология кишечника человека, коррекция микрофлоры при дисбиотических состояниях. — Дисс. докт. мед. наук. Москва, 2005.

4. Коршунов В. М., Смеянов В. В., Ефимов Б. А. Рациональные подходы к проблеме коррекции микрофлоры кишечника. Вестник Российской академии медицинских наук. 1996, № 2, 60-64.

5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Мир-1984. С. 479.

6. Altschul S.F., Gish W., Myers E.W., Lipman DJ. Basic Local Alignment Search Tool. J. Mol. Biol. 1990. 215: 403-410.

7. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 1997. 25: 33893402.

8. Aman R. I., Ludwig W. et al.W., Schleifer K.H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol Rev. 1995. Mar;59l.: 143-69.

9. Aravind L., Anantharaman V., Balaji S., Babu M.M., Iyer L.M. The many faces of the helix-turn-helix domain: transcription regulation and beyond. FEMS Microbiol Rev. 2005 Apr;292.:231-62.

10. Backhed F., Ley R.E et al.R.E., Sonnenburg J.L., Peterson D.A., Gordon J.I. Host-bacterial mutualism in the human1 intestine. Science. -2005. 307571-7., 1915-1920.

11. Bakir M.A., Kitahara M. et al. M., Sakamoto Mi, Matsumoto M., Benno Y. Bacteroides finegoldii sp. nov., isolated from human faeces. Int J Syst Evol Microbiol. 2006. May;56Pt 5.:931-5.

12. Bakir M.A., Sakamoto M., Kitahara M. et al. M., Matsumoto M., Benno Y. Bacteroides dorei sp. nov., isolated from human faeces. Int J Syst Evöl Microbiol. 2006. Jul;56Pt 7.:1639-43.

13. Balamurugan R., Janardhan H.P., George S., Chittaranjan S.P., Ramakrishna B.S. Bacterial succession in the colon during childhood and adolescence: molecular studies in a southern Indian village. Am J' Clin Nutr. 2008. Dec;886.:1643-7.

14. Bamba T., Matsuda H., Endo M., and Fujiyama Y. The pathogenic role of Bacteroides vulgatus in patients with ulcerative colitis. J. Gastroenterol. 1995. 30Suppl. 8.:45-47.

15. Bennion R. S., Baron E. J., Thompson J. E., Downes Jr. J., Summanen P., Talan D. A., and Finegold S. M. The bacteriology of gangrenous and perforated appendicitis—revisited. Ann. Surg. 1990. 211:165-171.

16. Benson D.A., Karsch-Mizrachi I., D. J. Lipman D. J., Ostell J., Rapp B. A., and Wheeler D. L. 2002. GenBank. Nucleic Acids Res. 30:17-20.

17. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res.- 1979, Nov 24;76.:1513-23.

18. Bocci V. The neglected organ: bacterial flora has a crucial immunostimulatory role. Perspect. Biol. Med. - 1992. 35, 251-260.

19. Brook I. Microbiology and management of post-surgical wounds infection in children. Pediatr. Rehabil. 2002. 5:171-176.

20. Bruce J., Paster J., Floyd E. Dewhirst, Ingar Olsen, Gayle J. Fraster. Phylogeny of Bacteroides, Prevotella, and Porphyromonas spp. and related bacteria. J. Bacteriol. 1994. Feb, 725-732.

21. Callihan D.R., Young F.E., Clark V.L. Identification of three homology classes of small, cryptic plasmids in intestinal Bacteroides species. Plasmid. 1983 Jan;9l.:17-30.

22. Carlier J.P., Bedora-Faure M., K'ouas G., Alauzet C., Mory F. Proposal to unify Clostridium orbiscindens Winter et al. 1991 and

23. Carter B., Jones C., Alter R., Creadick R., Thomas W. Bacteriodes infections in obstetrics and gynecology. Obstet Gynecol. 1953. May;l5.:491-510.

24. Cash H.L., Whitham C.V., Behrendt C.L., Hooper L.V. et al.L.V. Symbiotic bacteria direct expression of an intestinal bactericidal lectin. Science. 2006 .Aug 25;3135790.: 1126-30.

25. Chassard C., Delmas E., Lawson P.A., Bernalier-Donadille A. Bacteroides xylanisolvens sp. nov., a xylan-degrading bacterium isolated from human faeces.- Int J Syst Evol Microbiol. -2008. Apr;58Pt 4.:1008-13.

26. Christensen S.K., Gerdes K. et al. K. RelE toxins from bacteria and Archaea cleave mRNAs on translating ribosomes, which are rescued by tmRNA. Mol Microbiol. 2003. Jun;485.:1389-400.

27. Cohen S.N., Chang A.C., Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. Proc Natl Acad Sci USA. 1972. Aug;698.:2110-4.

28. Davies J., Jacob F. Genetic mapping of the regulator and operator genes of the lac operon. J Mol Biol. 1968. Sep 28;363.:413-7.

29. Del Solar G., Giraldo R., Ruis-Echevarria M.J., Espinosa M., Dias-Orejas R. 1998. Replication and control of circular bacterial plasmids. Microbiol Mol Biol Rev June, 622.: 434-464

30. Deng W., Xi D., Mao H., Wanapat M. The use of molecular techniques based on ribosomal RNA and DNA for rumen microbial ecosystem studies: a review. Mol Biol Rep. 2008 Jun;352.:265-74. Epub 2007. May 5.

31. Eckburg P.B., Bik E.M., Bernstein C.N., Purdom E., Sargent M., Gill S.R. et al. S.R., Nelson K.E., Relman D.A. Divercity of the human intestinal microbial flora. Science. 2005. 308, 1635-1638.

32. Eggerth A.H., Gagnon B.H. The Bacteroides of Human Feces. J Bacteriol. 1933. Apr;254.:389-413.

33. Enck P., Zimmermann K., Rusch K., Schwiertz A., Klosterhalfen S., Frick J.S. The effects of maturation on the colonic microflora in infancy and childhood. Gastroenterol Res Pract. 2009;2 009:752401. Epub 2009. Sep 16.

34. Fenner L., Roux V., Ananian P., Raoult D. Alistipes finegoldii in blood cultures from colon cancer patients. Emerg Infect Dis. 2007. Aug; 13 8.: 1260-2.

35. Franco A.A. The Bacteroides fragilis pathogenicity island is contained in a putative novel conjugative transposon. J Bacteriol. 2004. Sep;18618.:6077-92.

36. Freitas M., Tavan E., Cayuela C., Diop L., Sapin C., Trugnan G. Host-pathogens cross-talk. Indigenous bacteria and probiotics also play the game. Biol Cell. 2003. Nov;958.:503-6.

37. Gajiwala K.S., BurLey R.E et al.S.K. Winged helix proteins. Curr Opin Struct Biol. 2000 Feb;10l.:l 10-6.

38. Gerdes K., Christensen S.K. et al. S.K., L0bner-Olesen A. Prokaryotic toxin-antitoxin stress response loci. Nat Rev Microbiol. 2005. May;35.:371-82.

39. Gill S.R., Pop M., Deboy R.T., Eckburg P.B. et al. P.B., Turnbaugh P.J., Samuel B.S., Gordon J.I., Relman D.A., Fraser-Liggett C.M., Nelson K.E. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science. 2006. Jun 2;3125778.:1355-9.

40. Gilmore M.S., Ferretti J.J. Microbiology. The thin line between gut commensal and pathogen. Science. 2003. Mar 28;2995615.¡1999-2002.

41. Goodacre R. Metabolomics of a superorganism. J Nutr. 2007. Jan;137l Suppl.:259S-266S.

42. Grimont F. et al. F., Grimont F. et al. P.A. Ribosomal ribonucleic acid gene restriction patterns as potential taxonomic tools. Ann Inst Pasteur Microbiol. 1986. Sep-Oct;137B2.: 165-75.

43. Gronlung M.M., Arvilommi H., Kero P. Importance of intestinal colonisation in the maturation of humoral immunity in early infancy: a prospective follow up study of healthy infants aged O 6 months. Arch. Dis Child Fetal Neonatal Ed. - 2000 83, 186-192.

44. Gunn A.A. Bacteroides infection in the surgery of childhood. Arch Dis Child. 1957. Dec;32166.:523-9.

45. Gurtler V., Wilson V.A., Mayall B.C. Classification of medically important Clostridia using restriction endonuclease site differences of PCR-amplified 16S rDNA. J Gen Microbiol. 1991. Nov;137l l.:2673-9.

46. Haggoud A.A., Trinh S., Moumni M., Reysset G. Genetic analysis of the minimal replicon of plasmid pIP417 and comparison with the other encoding 5-nitroimidazole resistance plasmids from Bacteroides spp. Plasmid. 1995. Sep;342.:132-43.

47. Hayashi H., Sakamoto M., Benno Y. Phylogenetic analysis of the human gut microbiota using 16S rDNA clone libraries and strictly anaerobic culturebased methods. — 2002. 46, 535-538.

48. Hayashi H., Shibata K., Sakamoto M., Tomita S., Benno Y. Prevotella copri sp. nov. and Prevotella stercorea sp. nov., isolated from human faeces. Int J Syst Evol Microbiol. 2007. May;57Pt 5.:941-6.

49. Hooper L.V., Wong M.H., Thelin A., Hansson L., Falk P.G., Gordon J.I. Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine. Science. 2001 Feb 2;291 5505.:881-4.

50. Hopkins M.J., Macfarlane G.T. Changes in predominant bacterial populations in human faeces with age and with Clostridium difficile infection. J Med Microbiol. 2002. May;515.:448-54.

51. Hopkins M.J., Macfarlane G.T., Furrie E., Fite A., Macfarlane S. Characterisation of intestinal bacteria in infant stools using real-time PCR and northern hybridisation analyses. FEMS Microbiol Ecol. 2005. Sep l;54l.:77-85

52. Hopkins M.J., Sharp R., Macfarlane G.T. Age and disease related changes in intestinal bacterial populations assessed by cell culture, 16S rRNA abundance, and community cellular fatty acid profiles. Gut. 2001. Feb;48 2.: 198-205.

53. Igarashi E., Kamaguchi A., Fujita M., Miyakawa H., Nakazawa F. Identification of oral species of the genus Veillonella by polymerase chain reaction. Oral Microbiol Immunol. 2009. Aug;244.:310-3.

54. Johnson J.L., Harich B. Ribosomal riboucleic acid homology amoung species of the genus Bacteroides. Int. J. of syst. Bacteriology, Jan. 1986, p. 71-79

55. Karlsson F.H., Ussery D.W., Nielsen J., Nookaew I. A Closer Look at Bacteroides: Phylogenetic Relationship and Genomic Implications of a Life in the Human Gut. Microb Ecol. 2011. Jan 11. Epub ahead of print.

56. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J MolEvol. 1980. Dec;162.:l 11-20.

57. Kitahara M., Sakamoto M., Ike M., Sakata S., Benno Y. Bacteroides plebeius sp. nov. and Bacteroides coprocola sp. nov., isolated from human faeces. Int J SystEvol Microbiol. 2005. Sep;55Pt 5.:2143-7.

58. Kling J.J., Wright R.L., Moncrief J.S., Wilkins T.D. Cloning .and characterization of the gene for the metalloprotease enterotoxin of Bacteroides fragilis. FEMS Microbiol Lett. 1997. Jan 15;1462.:279-84.

59. Korch S.B., Contreras H., Clark-Curtiss J.E. Three Mycobacterium tuberculosis Rel toxin-antitoxin modules inhibit mycobacterial growth and are expressed in infected human macrophages. J Bacteriol. 2009. Mar; 191 5.: 1618-30. Epub 2008. Dec 29.

60. Krinos C.M., Coyne M.J., Weinacht K.G., Tzianabos A.O., Kasper D.L., Comstock L.E. Extensive surface diversity of a commensal microorganism by multiple DNA inversions. Nature. 2001 Nov 29;4146863.:555-8.

61. Lassman B., Gustafson D.R., Wood C. M., and Rosenblatt J. E. Reemergence of anaerobic bacteremia. Clin. Infect. Dis. 2007. 44:895-900.

62. Ley R.E. Obesity and the human microbiome. Curr Opin Gastroenterol. 2010. Jan;26l.:5-11.

63. Lofmark S., Edlund C., Nord C.E. Metronidazole is still the drug of choice for treatment of anaerobic infections. Clin Infect Dis. 2010. Jan 1;50 Suppl l:S16-23.

64. Lofmark S., Jernberg C., Jansson J.K., Edlund C. Clindamycin-induced enrichment and long-term persistence of resistant Bacteroides spp. and resistance genes. J Antimicrob Chemother. 2006 Dec;586.:l 160-7. Epub 2006 Oct 17.

65. Ludwig W., Schleifer K.H. Bacterial phylogeny based on 16S and 23S rRNA sequence analysis. FEMS Microbiol Rev. 1994. Oct; 15 2-3.:155-73.

66. Manson J.M., Rauch M., Gilmore M.S. et al. M.S. The commensal microbiology of the gastrointestinal tract. Adv Exp Med Biol. 2008. 635:15-28.

67. Mariat D., Firmesse O., Levenez F., Guimaráes V., Sokol H., Doré J., Corthier G., Furet J.P. The Firmicutes/Bacteroidetes ratio of the human microbiota changes with age. BMC Microbiol. 2009. Jun 9;9:123.

68. Martens E.C., Roth R., Heuser J.E., Gordon J.I. Coordinate regulation of glycan degradation and polysaccharide capsule biosynthesis by a prominent human gut symbiont. J Biol Chem. 2009 Jul 3;28427.: 18445-57. Epub 2009 Apr 29.

69. Matsuki T., Watanabe K., Fujimoto J., Takada T., Tanaka R. Use of 16S rRNA gene-targeted group-specific primers for real-time PCR analysis of predominant bacteria in human feces. Appl. Environ. Microbiol. — 2004. 7012., 7220-7228.

70. Mazmanian S.K., Liu C.H., Tzianabos A.O., Kasper D.L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 2005. Jul 15; 1221.: 107-18.

71. Moon K., Shoemaker N.B., Gardner J.F., Salyers A.A. Regulation of excision genes of the Bacteroides conjugative transposon CTnDOT. J Bacteriol. 2005. Aug;18716.:5732-41.

72. Morgan R.M., Macrina F.L. bet A: a novel pBF4 gene necessary for conjugal transfer in Bacteroides spp. Microbiology. 1997 Jul; 143 Pt 7.:2155-65.

73. Morotomi M., Nagai F., Sakon H., Tanaka R. Dialister succinatiphilus sp. nov. and Barnesiella intestinihominis sp. nov., isolated from human faeces. Int J Syst Evol Microbiol. 2008. Dec;58Pt 12.:2716-20.

74. Novicki T.J., Hecht D.W. et al. D.W. Characterization and DNA sequence of the mobilization region of pLV22a from Bacteroides fragilis. J Bacteriol. 1995. Aug;17715.:4466-73.

75. O'Hara A.M, Shanahan F. The gut flora as a forgotten organ. EMBO Rep. 2006. Jul;77.:688-93.

76. Olsen G.J., Woese C.R. Ribosomal RNA: a key to phylogeny. FASEB J. 1993. Jan;7l.: 113-23

77. O'Sullivan D.J. Methods for analysis of the intestinal microflora. Curr Issues Intest Microbiol. 2000 Sep;l2.:39-50.

78. Overgaard M., Borch J., Gerdes K. et al. K. RelB and RelE of Escherichia coli form a tight complex that represses transcription via the ribbon-helix-helix motif in RelB. J Mol Biol. 2009 Nov 27;3942.:183-96. Epub 2009 Sep 8.

79. Palys T., Nakamura L.K., Cohan F.M. Discovery and classification of ecological diversity in the bacterial world: the role of DNA sequence data. Int J Syst Bacteriol. 1997. Oct;474.:l 145-56.

80. Pantosti A., Tzianabos A.O., Reinap B.G., Onderdonk A.B., Kasper D.L. Bacteroides fragilis strains express multiple capsular polysaccharides. J Clin Microbiol. 1993. Jul;317.:1850-5.

81. Paster B.J., Dewhirst F.E., Olsen I., Fräser G.J. Phylogeny of Bacteroides, Prevotella and Porphyromonas spp. and related bacteria. J Bacteriol. 1994. Feb;1763.:725-32

82. Penders J., Thijs C., Vink C., Stelma F.F., Snijders B., Kummeling I., van den Brandt P.A., Stobberingh E.E. Factors influencing the composition of the intestinal microbiota in early infancy. Pediatrics. 2006. Aug;l 182.:511-21

83. Pumbwe L., Wareham D.W., Aduse-Opoku J., Brazier J.S., Wexler H.M. H.M. Genetic analysis of mechanisms of multidrug resistance in a clinical isolate of Bacteroid.es fragilis. Clin Microbiol Infect. 2007. Feb;132.:183-9.

84. Raghavan V., Groisman EA. Orphan and hybrid two-component system proteins in health and disease. Curr Opin Microbiol. 2010 Apr;132.:226-31. Epub 2010 Jan 19.

85. Rasmussen B.A., Bush K., Tally F.P. Antimicrobial resistance in Bacteroides. Clin Infect Dis. 1993. Suppl 4:S390-400.

86. Reid G., Burton J., Hammond J.A., Bruce J. et al. A.W. Nucleic acid-based diagnosis of bacterial vaginosis and improved management using probiotic lactobacilli. J Med Food. 2004. Summer;72.:223-8.

87. Reysset G., Haggoud A. et al. A., Su W.J., Sebald M. Genetic and molecular analysis of pIP417 and pIP419: Bacteroides plasmids encoding 5-nitroimidazole resistance. Plasmid. 1992. May;273.:181-90.

88. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 1987. 4, 406-425.

89. Sakamoto M., Lan P.T., Benno Y. Barnesiella viscericola gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Porphyromonadaceae isolated from chicken caecum. Int J Syst Evol Microbiol. 2007. Feb;57Pt 2.:342-6.

90. Saldanha A.J. Java Treeview-extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 2004. Nov 22;2017.:3246-8. Epub 2004 Jun 4.

91. Salyers A. A., Gupta A., and Wang Y. Human intestinal bacteria as reservoirs for antibiotic resistance genes. Trends Microbiol. 2004. 12:412416.

92. Salyers A.A., and C. F. Amabile-Cuevas. Why are antibiotic resistance genes so resistant to elimination? Antimicrob. Agents Chemother. 1997.41:2321-2325.

93. Salyers A.A., Bonheyo G., Shoemaker N.B. Starting a new genetic system: lessons from bacteroides. Methods. 2000. Jan;20l.:35-46.

94. Salyers A.A., Shoemaker N.B. Resistance gene transfer in anaerobes: new insights, new problems. Clin Infect Dis. 1996. Suppl l:S36-43.

95. Salyers A.A., Shoemaker N.B., Stevens A.M. and Lhing-Yew. Conjugative Transposons: an Unusual and Diverse Set of Integrated Gene Transfer Elements. Microbiological reviewes, Dec. 1995, p. 579-590 Vol. 59, No. 4

96. SamBrook I. et al. J., Russell D.W. Molecular cloning: a laboratory manual. 2001. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

97. San Joaquin V., Griffis J. C., Lee C., and Sears C. L. Association of Bacteroides fragilis with childhood diarrhea. Scand. J. Infect. Dis. 1995. 27:211-215.

98. Sasaki E., Osawa R., Nishitani Y., WhiLey R.E et al.R.A. ARDRA and RAPD analyses of human and animal isolates of Streptococcus gallolyticus. J Vet Med Sei. 2004. Nov;66l 1.: 1467-70.

99. Sears C.L. Enterotoxigenic Bacteroides fragilis: a rogue among symbiotes. Clin Microbiol Rev. 2009. Apr;222.:349-69.

100. Sears C.L. The toxins of Bacteroides fragilis. Toxicon. 2001 Nov;39l 1.: 1737-46.

101. Shah H. N. & Collins M. D. Prevotella, a new genus to include Bacteroides melaninogenicus and related species formerly classified in the genus Bacteroides. Inf J Syst Bacteriol. 1990. 40, 205-20

102. Shah H. N. & Collins M. D. Proposal to restrict the genus Bacteroides Castellani and Chalmers. to Bacteroides fragilis and closely related species. Int J Syst Bacteriol. 1989. 39, 85-87.

103. Shah H.N. & Collins M.D. Proposal for reclassification of Bacteroides asaccharolyticus, Bacteroides gingivalis, and Bacteroides endodontalis in a new genus, Porphyromonas. 1988. Int J Syst Bacteriol 38, 128-131.

104. Shah H.N., Olsen I., Bernard K., Finegold S.M., Gharbia S., Gupta R.S. Approaches to the study of the systematics of anaerobic, gramnegative, non-sporeforming rods: current status and perspectives. Anaerobe. 2009. Oct; 155.: 179-94. Epub 2009 Aug 18.

105. Shanahan F. Gut microbes: from bugs to drugs. Am J Gastroenterol. 2010 Feb;1052.:275-9. Epub 2010. Jan 12.

106. Shoemaker N.B., Vlamakis H., Hayes K., Salyers A.A. Evidence for extensive resistance gene transfer among Bacteroides spp. and among Bacteroides and other genera in the human colon. Appl Environ Microbiol. 2001. Feb;672.:561-8.

107. Simon V., Schumann W. In vivo formation of gene fusions in Pseudomonas putida and construction of versatile broad-host-range vectors for direct subcloning of Mu dl and Mu d2 fusions. Appl Environ Microbiol. 1987. Jul;53(7):1649-54.

108. Sitailo L.A., Zagariya A.M., Arnold P.J., Vedantam G., Hecht D.W. et al. D.W. The Bacteroides fragilis BtgA mobilization protein binds to the oriT region of pBFTMlO. J Bacteriol. 1998. Sep;18018.:4922-8

109. Sklarz M.Y., Angel R., Gill S.R. et al.or O., Soares M.I. Evaluating amplified rDNA restriction analysis assay for identification of bacterial communities. Antonie Van Leeuwenhoek. 2009. Nov;964.:659-64.

110. Smith C.J. Development and use of cloning systems for Bacteroides fragilis: cloning of a plasmid-encoded clindamycin resistance determinant. J Bacteriol. 1985. 0ct;164l.:294-301.

111. Smith C.J., Rollins L.A., Parker A.C. Nucleotide sequence determination and genetic analysis of the Bacteroides plasmid, pBI143. Plasmid. 1995. Nov;343.:211-22

112. Smith C.J., Tribble G.D., BayLey R.E et al.D.P. Genetic elements of Bacteroides species: a moving story. Plasmid. 1998. Jul;40l.:12-29.

113. Sôki J., Gal M., Brazier J.S., Rotimi V.O., Urban E., Nagy E., Duerden B.I. Molecular investigation of genetic elements contributing to metronidazole resistance in Bacteroides strains. J Antimicrob Chemother. 2006. Feb;572.:212-20. Epub 2005 Dec 7.

114. Soki J., Szôke I., Nagy E. Characterisation of a 5.5-kb cryptic plasmid present in different isolates of Bacteroides spp. originating from Hungary. J Med Microbiol. 1999 Jan;48l.:25-31.

115. Song Y., Kônônen E., Rautio M., Liu C., Bryk A., Eerola E., Finegold S.M. Alistipes onderdonkii sp. nov. and Alistipes shahii sp. nov., of human origin. Int J Syst Evol Microbiol. 2006. Aug;56Pt 8.: 1985-90.

116. Song Y., Liu C., Bolanos M., Lee J., McTeague M. & Finegold S.M. Evaluation of 16S rRNA sequencing and réévaluation of a shortbiochemical scheme for identification of clinically significant Bacteroides species. J Clin Microbiol. 2005. 43, 1531-1537

117. Song Y., Liu C., Molitoris D., Tomzynski T.J., Mc Teague M., Read E., Finegold S.M. Use of 16S-23S rRNA spacer-region SR.-PCR for identification of intestinal Clostridia. Syst Appl Microbiol. 2002. Dec;25[4]:528-35.

118. Speer B.S., Shoemaker N.B., Salyers A.A. Bacterial resistance to tetracycline: mechanisms, transfer, and clinical significance. Clin Microbiol Rev. 1992. 5:387-99.

119. Stephen A., Cummings G. The microbial contribution to human fecal mass. J. Med. Microbiol. 1980.13, 45-51.

120. Stock A.M., Robinson V.L., Goudreau P.N. Two-component signal transduction. Annu Rev Biochem. 2000. 69:183-215.

121. Strober W., Fuss I., and Mannon P. The fundamental basis of inflammatory bowel disease. J. Clin. Investig. 2007.117:514-521.

122. Stubbs S.L., Brazier J.S., Talbot P.R., Duerden B.I. PCR-restriction fragment length polymorphism analysis for identification of Bacteroides spp. and characterization of nitroimidazole resistance genes. J Clin Microbiol. 2000. Sep;389.:3209-13.

123. Tannock G.W. Analysis of the intestinal microflora: a renaissance. Antonie Van Leeuwenhoek. 1999. Jul-Nov;76l-4.:265-78.

124. Tringe S.G., Hugenholtz P. A renaissance for the pioneering 16S rRNA gene. Curr Opin Microbiol. 2008 Oct;l l5.:442-6. Epub 2008 Oct 8.

125. Trinh S., Reysset G. Identification and DNA sequence of the mobilization region of the 5-nitroimidazole resistance plasmid pIP421 from Bacteroides fragilis. J Bacteriol. 1997. Jun; 17912. :4071-4.

126. Turnbaugh P.J., Ley R.E et al.R.E., Mahowald M.A., Magrini V., Mardis E.R., Gordon J.I. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 2006. Dec 21 ;4447122.: 1027-31.

127. Tzianabos A.O., Onderdonk A.B., Rosner B., Cisneros R.L., Kasper D.L. Structural features of polysaccharides that induce intra-abdominal abscesses. Science. 1993 Oct 15;2625132.:416-9.

128. Vaneechoutte M., De Beenhouwer H., Claeys G., Verschraegen G., De Rouck A., Paepe N., Elaichouni A., Portaels F. Identification of Mycobacterium species by using amplified ribosomal DNA restriction analysis. J Clin Microbiol. 1993. Aug; 318.:2061-5.

129. Ventura M., Casas I.A., Morelli L., Callegari M.L. Rapid amplified ribosomal DNA restriction analysis ARDRA. identification of Lactobacillus spp. isolated from fecal and vaginal samples. Syst Appl Microbiol. 2000. Dec;23[4]:504-9.

130. Wang X., Heazlewood S.P., Krause D.O., Florin T.H. Molecular characterization of the microbial species that colonize human ileal and colonic mucosa by using 16S rDNA sequence analysis. J Appl Microbiol. 2003. 953.:508-20

131. Wexler H.M. Bacteroides: the good, the bad, and the nitty-gritty. Clin Microbiol Rev. 2007. Oct; 204.:593-621.

132. Woo P.C., Lau S.K., Teng J.L., Tse H., Yuen K.Y. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clin Microbiol Infect. 2008 Oct; 1410.:908-34.

133. Woodmansey E.J. Intestinal bacteria and ageing. J Appl Microbiol. 2007. May;1025.:l 178-86.

134. Wu S., Lim K.C., Huang J., Saidi R.F., Sears C.L. Bacteroides fragilis enterotoxin cleaves the zonula adherens protein, E-cadherin. Proc Natl Acad Sci USA. 1998. Dec 8;9525.:14979-84.

135. Xu J., Bjursell M. K. et al. M.K., Himrod J., Deng W. et al. S., Carmichael L.K., Chiang H.C., Hooper L.V. et al.L.V., Gordon J.I. A genomic view of the hum&n-Bacteroides thetaiotaomicron symbiosis. -Science. 2003 Mar 28;299 5615.:2074-6.

136. Xu J., Gordon J.I. Honor thy symbionts. Proc Natl Acad Sci USA. 2003. Sep 2;10018.:10452-9. Epub 2003 Aug 15.

137. Yamaoka K., Watanabe K., Muto Y., Katoh N., Ueno K., Tally F.P. R-plasmid mediated transfer of beta-lactam resistance in Bacteroides fragilis. J Antibiot Tokyo. 1990. Qct;43[10]:1302-6.