Криптические миниплазмиды азоспирилл: разработка эффективных методов выделения и характеристика репликонов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Голубев, Сергей Николаевич

• Голубев, Сергей Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Голубев, Сергей Николаевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Бактериальные плазмиды.

1.1. Структура и организация плазмид.

1.2. Плазмиды и биология бактерий.

1.2.1. Понятие о существенных и несущественных генах.

1.2.2. Значение плазмид для жизнедеятельности бактерий.

1.2.3. Эволюционные аспекты плазмидо-бактериального сосуществования

1.2.3.1. Эволюция плазмид.

1.2.3.2. Эволюция бактерий.

1.3. Изучение плазмид: теоретическая и практическая значимость.

1.3.1. Плазмиды почвенных ассоциативных азотофиксирующих бактерий рода АгозртИит.

1.3.1.1. Плазмидный состав азоспирилл.

1.3.1.2. Свойства плазмид азоспирилл.

1.3.2. Плазмиды клинических штаммов бактерий.

1.4. Выделение и очистка плазмидной ДНК бактерий.

Глава 2. Распределение в водных полимерных двухфазных системах и очистка ДНК.

2.1. Водные полимерные фазовые системы.

2.2. Феномены водных полимерных двухфазных систем.

2.2.1. Фазовое разделение.

2.2.2. Межфазное распределение.

2.3. Распределение ДНК.

2.4. Применение водных полимерных двухфазных систем для выделения и очистки ДНК.

2.4.1. Стратегии распределения.

2.4.2. Удаление фазообразующих полимеров.

2.4.3. Методы выделения и очистки ДНК.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 3. Материалы и методы исследования.

3.1. Штаммы бактерий и их культивирование.

3.2. Определение антибиотикоустойчивости бактерий.

3.3. Приготовление лизатов.

3.4. Стандартные приемы работы с нуклеиновыми кислотами и белками

3.5. Общие методы работы с плазмидами.

3.6. Построение физических карт, клонирование и секвенирование плазмид.

3.7. Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.

3.8. Приготовление растворов полимеров.

3.9. Оценка растворимости полиэтиленгликоля и декстрана в изопропаноле.

3.10. Экспериментальное определение бинодальной кривой и соединительных линий. Анализ фаз.

3.11. Оценка качества фазообразующих полимеров.

3.12. Анализ распределения высокомолекулярной ДНК в системе полиэтиленгликоль 6000 - декстран

3.13. Определение условий осаждения ДНК и РНК из полиэтиленгликоль-обогащенных растворов.

3.14. Удаление фазообразующих полимеров из экстракта ДНК.

3.15. Оценка эффективности использования системы полиэтиленгликоль

6000 - декстран 500 для выделения и очистки ДНК.

3.15.1. Выявление характера экстрагирования веществ в ходе многоступенчатого распределения.

3.15.2. Сравнение спектрофотометрической чистоты препаратов ДНК, полученных разными способами.

3.15.3. Исследование возможностей фракционирования нуклеиновых кислот с помощью различных стратегий межфазного распределения.

3.15.3.1. Градиентная экстракция.

3.15.3.2. Противоточное распределение.

3.15.3.3. Распределительная хроматография на колонке.

3.16. Определение условий избирательной денатурации хромосомной

ДНК в сахарозо-щелочных растворах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 4. Очистка ДНК распределением в системе полиэтиленгликоль - декстран.

4.1. Фазообразующие полимеры.

4.2. Фазовые диаграммы и составы фаз полиэтиленгликоль -декстрановых систем.

4.3. Распределение ДНК в системе полиэтиленгликоль 6000 - декстран

4.4. Оптимизированная схема удаления фазообразующих полимеров из экстракта ДНК.

4.5. Эффективность использования системы полиэтиленгликоль 6000 -декстран 500 для выделения и очистки ДНК.

4.5.1. Экстракция различных веществ в двухфазной системе в ходе очистки ДНК многоступенчатым распределением.

4.5.2. Спектрофотометрическая чистота препаратов ДНК, полученных разными способами.

4.5.3. Фракционирование нуклеиновых кислот различными стратегиями межфазного распределения.

4.6. Новые методы выделения ДНК, основанные на использовании системы полиэтиленгликоль - декстран.

4.6.1. Метод скрининга бактерий на содержание в них плазмидной ДНК

4.6.2. Препаративный метод выделения плазмидной ДНК.

4.6.3. Препаративный метод выделения тотальной ДНК бактерий.

4.6.4. Препаративный метод выделения ДНК бактериофага X.

Глава 5. Криптические миниплазмиды азоспирилл.

5.1. Выявление малых плазмид у азоспирилл, выделенных в Саратовской области.

5.2. Количество и размер исследуемых репликонов.

5.3. Физическое картирование миниплазмид.

5.4. Клонирование миниплазмид и идентификация рекомбинантов.

5.5. Частичное секвенирование 2,9-тпн плазмиды и анализ прочитанных нуклеотидных последовательностей.

5.6. Антибиотикоустойчивость и миниплазмиды.

Глава 6. Выявление и сравнение плазмид из клинических штаммов бактерий.

6.1. Соотношения плазмидосодержащих и бесплазмидных штаммов в пространственно-таксономической структуре бактериоценоза стационара.

6.2. Сравнение плазмидных профилей клинических штаммов бактерий.

6.3. Горизонтальный генетический перенос, опосредованный плазмидами.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Криптические миниплазмиды азоспирилл: разработка эффективных методов выделения и характеристика репликонов»

Интерес к изучению плазмид, согласно данным литературы, по-прежнему очень высок [87, 98, 1 13, 134, 175, 187, 212, 285]. Плазмиды обнаружены практически у всех видов бактерий. Широко распространены они и среди представителей рода Azospirillum, оказывающих благоприятное влияние на развитие и продуктивность колонизируемых ими растений, среди которых много сельскохозяйственных культур [4, 35, 38, 122, 130, 135, 137, 151, 173, 189, 190, 205, 244, 271, 273, 311]. Повсеместность распространения и высокая адаптивность азос-пирилл к условиям окружающей среды объясняются, в определенной степени, разнообразием их плазмидного состава. Достигнуты значительные успехи в изучении крупных плазмид этих бактерий [22, 23, 28, 172]. Однако по-прежнему отсутствуют данные о структуре, функциях и родственных взаимоотношениях содержащихся в них миниплазмид. Обычно миниплазмиды несут информацию высокой значимости, оперативно применяемую бактерией в критических условиях. Своеобразие репликативного аппарата малых плазмид, с одной стороны, обеспечивает специализацию этой группы "природных векторов", оказывающих влияние на эволюцию бактерий, с другой, является необходимым условием для эволюции плазмидных геномов путем их коинтеграции. В практическом отношении малые плазмиды представляют интерес как основы для создания векторных систем.

Вместе с тем, малые плазмиды азоспирилл классическими методами, не использующими ультрацентрифугирование в градиенте плотности, выделяются плохо. В связи с этим наше внимание привлекла методология межфазного распределения в водных полимерных двухфазных системах, обладающая, согласно данным литературы, высокой степенью избирательности [2, 74]. Эта методология отличается высокой экономичностью, эффективностью при любом масштабировании, простотой аппаратурного оформления, возможностью тонкой регуляции процесса межфазного распределения, экологичностью, то есть соответствует всем основным требованиям, предъявляемым современной наукой [2, 58]. В настоящее время фракционирование в водных полимерных двухфазных системах широко используется для очистки самых разных биологических частиц и макромолекул. Несмотря на это, известны лишь два метода очистки плаз-мидной ДНК: R. Ohlsson с соавторами (1978) [228] и K.D. Cole (1991) [104], основанные далеко не на самых эффективных стратегиях межфазного распределения и апробированные только на штаммах Escherichia coli. Следует отметить, что применение распределения в водных полимерных двухфазных системах исключительно удобно как для получения макроколичеств плазмидной ДНК, так и для скрининга большого числа бактериальных культур на содержание плазмид. Поэтому методы выделения плазмид, основанные на указанном способе фракционирования, могут быть полезны при решении многих фундаментальных и практических задач, среди которых отнюдь не последнее место занимают соответственно изучение криптических плазмид бактерий [21-23, 46, 59, 66, 128, 174, 251] или сравнение плазмидных составов госпитальных штаммов микроорганизмов в эпидемиологическом анализе лечебно-профилактических учреждений [1, 11, 12, 31, 203, 282, 295].

Таким образом, на фоне интенсивно развивающихся генетических исследований, требующих создания более эффективных и доступных методов очистки плазмид по сравнению с традиционными, перспективны разработки, использующие водные полимерные двухфазные системы.

Цель и задачи исследования

Цель работы - выявление и первичная характеристка миниплазмид азоспирилл с применением очистки ДНК межфазным распределением в системе полиэти-ленгликоль-декстран.

Для достижения этой цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Разработать аналитический и препаративный методы выделения плазмидной ДНК азоспирилл, основанные на использовании полиэтиленгликоль-декстрановой системы.

2. Провести скрининг штаммов региональной коллекции азоспирилл, выделенных в Саратовской области, на содержание в них миниплазмид.

3. Выделить препаративные количества миниплазмид, провести их анализ с помощью гидролиза различными эндонуклеазами рестрикции и построить физические карты не менее чем для 3 ферментов. Плазмиды клонировать в Е. coli для последующего проведения секвенирования.

4. Определить и проанализировать нуклеотидную последовательность фрагмента одной из миниплазмид для установления гипотетических продуктов экспрессии этого репликона.

5. Экспериментально проверить наличие у бактерий-хозяев свойств, прогнозируемых с помощью компьютерного анализа секвенированного фрагмента исследуемой плазмиды, и локализацию их детерминант.

6. Апробировать разработанные методы выделения плазмидной ДНК для бактерий других родов.

Научная новизна работы

Впервые и исследовано поведение ДНК в системе PEG 6000 - DEX 500 (M^peg = 5000-7000; M^dex = 180000) в зависимости от изменений полимерного и ионного составов фаз. Установлено, что с ростом pH возрастает величина коэффициента распределения ДНК, тогда как увеличение концентраций Tris, SDS, EDTA оказывает противоположный эффект, сила которого уменьшается в следующем ряду: SDS > EDTA > Tris.

Впервые продемонстрирована применимость градиентной экстракции, противоточного распределения и распределительной хроматографии в системе PEG-DEX для очистки плазмид. Показано, что очистка ДНК в системе PEG 6000 - DEX 500, согласно спектрофотометрическим показателям, сравнима с очисткой ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы, а также с двукратной очисткой гель-фильтрацией на Sephacryl S-1000. Впервые посредством межфазного распределения осуществлено разделение плазмидной и на-тивной хромосомной ДНК, конформационных форм плазмид.

Скрининг штаммов региональной коллекции азоспирилл, выделенных в Саратовской области, позволил впервые обнаружить у представителей рода Azospirillum плазмиды размером менее 5,3 тпн (от 2,9 до 4 тпн). Выявлено два штамма A. lipoferum со сходным плазмидным составом: 2,9; 3,3 и 3,6 тпн. Построены рестрикционные карты плазмид размером 2,9 и 3,6 тпн. Определены нуклеотидные последовательности двух фрагментов 2,9-тпн плазмиды. Показано, что плазмида размером 2,9 тпн может детерминировать впервые обнаруженную у азоспирилл высокую устойчивость к тетрациклину (минимальная ин-гибирующая концентрация 100 мкг/мл) рибосом-протекторного механизма действия.

Практическая значимость работы

На основе полученных нами данных относительно фазовых свойств PEG-DEX систем, поведения ДНК в системе PEG 6000 - DEX 500, эффективности ее очистки межфазным распределением, удаления фазообразующих полимеров из экстракта целевого вещества разработаны методы скрининга плазмид и препаративного выделения плазмидной ДНК, тотальной ДНК бактерий и ДНК бактериофага X.

Разработанные методы выделения плазмид были использованы для выявления и сравнения плазмид из клинических штаммов грамотрицательных бактерий при оценке эпидемиологического состояния стационара Саратовского научно-исследовательского института травматологии и ортопедии (СарНИИ-ТО).

Материалы исследований, изложенные в диссертации, нашли применение в учебном процессе на кафедре органической и биоорганической химии химического факультета Саратовского государственного университета при выполнении курсовых и дипломных работ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Фазовая диаграмма системы PEG 6000 - DEX 500, диаграммы распределения ДНК в этой двухфазной системе, данные по эффективности очистки ДНК межфазным распределением и оптимизированная схема удаления фазообра-зующих полимеров из экстракта целевого вещества позволяют разрабатывать новые методы выделения различных ДНК, модифицировать и адаптировать их в соответствии с поставленной задачей.

2. Разработанные методы выделения ДНК, основанные на использовании системы PEG 6000 - DEX 500, эффективны и хорошо воспроизводимы для широкого круга микроорганизмов.

3. Распространенность миниплазмид среди штаммов региональной коллекции азоспирилл, выделенных в Саратовской области, относительно низкая: 7 (13,2 %) штаммов коллекции, из которых 4 (7,5 %) содержат стабильно поддерживаемые репликоны.

4. В исследованных штаммах азоспирилл выявлены самые маленькие из всех когда-либо обнаруженных у бактерий этого рода плазмиды (от 2,9 до 4 тпн).

5. Плазмиды размером 2,9; 3,3 и 3,6 тпн из Azospirillum lipoferum SR43 обладают, согласно рестрикционным профилям, высокой степенью сходства с плазмидами соответствующего размера из Azospirillum lipoferum SR62, и те и другие стабильно наследуются в бактериях-хозяевах.

6. Искусственно индуцированная элиминация 2,9-; 3,3- и 3,6-тпн плазмид коррелирует с потерей бактериями устойчивости к ампициллину и тетрациклину. Предполагаемый фенотип 2,9-тпн плазмиды - устойчивость к тетрациклину.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на 1-й Европейской конференции по азотофиксации (Сегед, Венгрия, 1994), на 6-м рабочем совещании NATO "Азоспириллы и родственные микроорганизмы" (Шарвар, Венгрия, 1994), на 16-м Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Нью-Дели, Индия, 1994), на 9-м Баховском коллоквиуме по азотофиксации (Москва, 1995), на конференциях по итогам научных исследований ИБФРМ РАН, выполненных в 1995 году (Саратов, апрель 1996 г.) и в 1996-1997 годах (Саратов, ноябрь 1997 г.), на 3-й Европейской конференции по азотофиксации (Люнтерен, Голландия, 1998), на Международной летней школе по молекулярной и клеточной биологии (Септсай, Греция, 1998), на Юбилейной научной конференции молодых ученых и студентов Саратовского государственного медицинского университета (Саратов, 1999), на 1-й региональной конференции молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой" (Саратов, 2002).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 4 - в зарубежных изданиях.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из 8 разделов: "Введение", "Обзор литературы" (2 главы), "Материалы и методы", "Результаты и их обсуждение" (3 главы), "Заключение", "Выводы", "Список литературы" и "Приложения". Работа изложена на 209 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц и 41 рисунок. Список литературы включает 324 источника, состоящих из 69 работ отечественных и 255 зарубежных авторов.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Голубев, Сергей Николаевич

ВЫВОДЫ

1. Получены фазовая диаграмма системы PEG 6000 - DEX 500 (M^peg = 5000-7000, M^dex = 180000), диаграммы распределения ДНК в этой двухфазной системе, данные по эффективности очистки ДНК многоступенчатым межфазным распределением и оптимизированная схема удаления фазообразующих полимеров из экстракта целевого вещества, представляющие собой информационную базу, на основе которой можно разрабатывать методы выделения ДЕПС, модифицировать и адаптировать их в соответствии с поставленной задачей.

2. Разработаны хорошо воспроизводимые методы: скрининга плазмид, препаративного выделения плазмидной ДНК, тотальной ДЕПС бактерий, ДНК бактериофага X, обеспечивающие выход ДЕПС не меньший, чем по соответствующим классическим методам, и ее пригодность для основных молекулярно-генетических процедур. Показано, что первые три метода эффективны для широкого круга грамотрицательных бактерий: Azospirillum, Citrobacter, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Serratia - в случае методов выделения плазмидной ДЬЖ, Agrobacterium, Azospirillum, Escherichia, Herbaspirillum - в случае метода выделения тотальной ДНК.

3. В результате скрининга 53 штаммов региональной коллекции азоспирилл, выделенных в Саратовской области, миниплазмиды обнаружены в 6 штаммах Azospirillum lipoferum и 1 штамме Azospirillum brasilense. Размер этих плазмид варьировал от 2,9 до 13 тпн, при этом репликоны от 2,9 до 4 тпн -это самые маленькие плазмиды из всех ранее выявленных у бактерий этого рода.

4. Миниплазмиды стабильно наследовались в 4 штаммах Azospirillum lipoferum при хранении и периодических пересевах последних на полноценные искусственные питательные среды.

5. Среди штаммов Azospirillum lipoferum, содержавших стабильно поддерживаемые миниплазмиды, два штамма имели сходный плазмидный состав: 2,9; 3,3 и 3,6 тпн. Элиминация этих плазмид коррелировала с потерей бактериями устойчивости к ампициллину и тетрациклину, что свидетельствует о плазмидной локализации указанных признаков.

6. В результате рестрикционного анализа плазмид размером 2,9; 3,3 и 3,6 тпн построены физические карты меньшей и большей из них. В 2,9-тпн плазмиде определено положение 4 уникальных сайтов узнавания рестриктаз: Bgll, BstEll, ЕсоШ и Sali; 2 сайтов рестриктазы Accl. В 3,6-тпн плазмиде - 3 уникальных сайтов узнавания рестриктаз: Accl, ÄstEII и Sali; 2 сайтов узнавания рестриктазы Pvull.

7. Определена нуклеотидная последовательность двух фрагментов 2,9-тпн плазмиды общей протяженностью 0,772 тпн, на одном из которых выявлен участок с существенным кодирующим потенциалом. На основании данных анализа аминокислотных последовательностей гипотетического продукта экспрессии этого участка плазмиды и обнаруженных белков-гомологов, а также наличия корреляции между утратой плазмид и потерей бактериями устойчивости к тетрациклину сделано предположение о том, что исследуемая плазмида содержит ген белка, обеспечивающего устойчивость к этому антибиотику по рибосом-протекторному механизму действия.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение криптических миниплазмид азоспирилл - одно из исследовательских направлений, позволяющих полнее понять адаптационные возможности этих бактерий в изменяющихся условиях окружающей среды. Несомненный интерес также представляет информация о структурно-функциональной организации таких репликонов, что важно для их идентификации и классификации.

Поскольку выявление и выделение препаративных количеств миниплазмид азоспирилл доступными нам общепринятыми методами: Eckhardt, Ish-Horowicz, Holmes и Quigley, Birnboim и Doly [44], включая применение дополнительных способов фракционирования, оказалось проблематичным, мы исследовали возможности их очистки межфазным распределением в одной из самых изученных водных полимерных двухфазных систем - PEG-DEX. К очевидным достоинствам указанного способа фракционирования относятся быстрота, простота, экономичность, безопасность, неограниченные возможности масштабирования, гибкость манипулирования распределением веществ в указанной системе посредством изменения Дф между фазами, защитное действие фазообра-зующих полимеров против деградации лабильных молекул [2, 58, 164]. Перечисленные характеристики межфазного распределения в системе PEG-DEX определяют перспективность его использования при разработке новых методов получения биологически активной ДНК. Следует подчеркнуть, что разработка доступных и высокоэффективных методов выделения плазмид по-прежнему актуальна [105, 125, 126, 168, 202, 224, 246, 258, 319]. Это связано с интенсификацией генетических исследований, развитием генной инженерии и биотехнологии [50].

На этапе разработки аналитического и препаративного методов выделения плазмидной ДНК нами были проанализированы фазовые свойства PEG-DEX системы, поведение в ней ДНК, эффективность использования многоступенчатого межфазного распределения при выделении и очистке различных ДНК.

В результате получены фазовая диаграмма системы PEG 6000 - DEX 500, диаграммы распределения ДНК в этой системе в зависимости от полимерного и ионного составов фаз. Примечательно, что поведение ДНК в водных полимерных двухфазных системах, согласно [2, 74, 91, 115, 162, 240], было исследовано в основном на системе с тем же названием, но другими физико-химическими характеристиками. Данные же о влиянии Tris, EDTA, SDS и pH на распределение ДНК вообще отсутствовали. Между тем, указанные вещества - одни из самых широко используемых при работе с нуклеиновыми кислотами [29, 36], а pH - фактор, воздействующий на структуру ДНК [62] и позволяющий манипулировать распределением белков в водных полимерных двухфазных системах [2, 104].

Нами выявлена динамика очистки ДНК азоспирилл в ходе многоступенчатого распределения в PEG-DEX системе. Показано, что основная масса примесных веществ: белки, РНК (предположительно низкомолекулярная) и ряд других, удаляется с верхней фазой за несколько отмывочных ступеней распределения, при этом после экстракции ДНК значительная часть РНК (предположительно высокомолекулярная) остается в нижней фазе. Характер экстрагирования веществ в целом соответствует таковому при выделении ДНК из клеток Е. coli и В. subtilis [2]. Результаты количественной оценки экстрагированных белков и нуклеиновых кислот из A. brasilense представляются достаточно адекватными, так как согласуются с данными литературы относительно содержания указанных биополимеров в бактериальной клетке [53, 67].

Нами также установлено, что степень очистки ДНК в PEG-DEX системе, согласно данным спектрофотометрии и электрофоретического разделения, сравнима со степенью очистки ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы и выше, чем при гель-фильтрации на колонках с Sephacryl S-1000 и Toyopearl HW-75-S. Кроме того, показана применимость градиентной экстракции, противоточного распределения, распределительной хроматографии в этой двухфазной системе для очистки плазмид. В литературе данных об указанном использовании этих стратегий распределения в системе РЕО-БЕХ мы не обнаружили. Важным результатом проведенных нами исследований явилось также впервые осуществленное посредством межфазного распределения разделение плазмидной и нативной хромосомной ДНК, конформационных форм плазмид.

Наконец, нами предложена оптимизированная схема удаления фазообра-зующих полимеров из экстракта ДНК с использованием ранее не применявшейся в этих целях процедуры осаждения ДНК РЕв-ом. Помимо удаления полимеров, данная процедура позволяет одновременно концентрировать ДНК и проводить ее дополнительную очистку.

Все вышеперечисленное дополнило современные данные относительно характера распределения и эффективности разделения различных нуклеиновых кислот в двухфазных системах.

Представляется целесообразным дальнейшее изучение поведения ДНК в РЕО-ЭЕХ системе с привлечением для этого математических моделей, способных адекватно описывать межфазное распределение высокомолекулярных веществ [119, 147, 164, 210, 266, 324]. Работа в этом направлении может перерасти в самостоятельное исследование и способствовать развитию теории феномена распределения в водных полимерных двухфазных системах.

На основе проведенного анализа подходов очистки ДНК распределением в системе РЕО-ЭЕХ нами были разработаны один аналитический - метод скрининга плазмид и три препаративных метода выделения: плазмидной ДНК, тотальной ДНК бактерий и ДНК бактериофага X. Показано, что использование этих методов обеспечивает выход ДНК не меньший, чем по соответствующим классическим методам [16, 36, 201], и пригодность последней для основных молекулярно-генетических процедур (рестрикционный анализ, трансформация, секвенирование). Наряду с этим, такие характеристики разработанных методов как экономичность, безопасность, экологичность, простота исполнения и аппаратурного оформления, возможность контроля выхода и степени очистки ДНК придают им значительные преимущества перед традиционно используемыми.

Полученный методический арсенал был применен нами при изучении миниплазмид азоспирилл. Скрининг региональной коллекции азоспирилл, выделенных в Саратовской области, выявил малые плазмиды размером от 2,9 до 13 тпн в 13,2 % штаммов. Данные об относительно низкой распространенности миниплазмид в природных штаммах данного рода бактерий нашли подтверждение в ряде работ отечественных и зарубежных авторов [4, 137, 244, 273]. В связи с чем представляется вполне вероятным, что это свойство является характерным для рода АгозртИит. Заслуживает внимания факт обнаружения в исследованных штаммах самых маленьких из всех когда-либо выявленных в азоспириллах плазмид: от 2,9 до 4 тпн. По имеющимся сведениям [121, 130, 137, 271, 273], до настоящего времени наименьшими по размеру считались 5,3-тпн плазмиды.

Все региональные штаммы азоспирилл, отличавшиеся стабильным наследованием малых плазмид, принадлежали к одному виду (А. Нро/егит) и составляли лишь 7,6 % от общего числа штаммов коллекции. Два из них, А. Иро/егит 8Я43 и 8Я62, характеризовались очень похожими рестрикционными профилями плазмид и содержали по три репликона: 2,9; 3,3 и 3,6 тпн. Рестрикционный анализ указанных репликонов позволил построить физические карты 2,9- и 3,6-тпн плазмид. Следует отметить, что в литературе нами найдено только две работы [130, 271], в которых сообщалось о рестрикционном анализе миниплазмид азоспирилл, и не найдено ни одной - проливающей свет на их функции.

С целью установления возможного фенотипа 2,9-тпн плазмиды нами осуществлено ее частичное секвенирование в двух противоположных направлениях от точки клонирования. В итоге определены нуклеотидные последовательности участков этой плазмиды размером 455 и 317 пн. На прочитанных последовательностях не обнаружены кодирующие открытые рамки считывания, хотя на более протяженной из них выявлена область с существенным кодирующим потенциалом. Размер гипотетического продукта экспрессии этой области плазмиды составил 150 аминокислотных остатков. Компьютерный анализ гипотетической аминокислотной последовательности не позволил достоверно судить о ее функциональном значении. Тем не менее, обнаружение среди гомологов последней фрагментов белков устойчивости к тетрациклину рибосом-протекторного механизма действия Те! 32 и Те! М (24 и 25 % идентичности соответственно) способствовало возникновению предположения о наличии указанного свойства у бактерий-хозяев и его плазмидной детерминации. При этом следует подчеркнуть, что, согласно данным литературы, идентичность аминокислотного состава различных рибосом-протекторных белков варьирует в очень широких пределах [193, 284], а детерминанты этого типа устойчивости к тетрациклину обычно находятся на конъюгативных транспозонах и плазмидах [256, 257, 276]. Более того, обнаружение новых детерминант устойчивости к этому антибиотику - не такое уж редкое явление [193, 256].

Определение спектров антибиотикоустойчивости (Те!, Ар, Сш, вт, Ег, Кт, 8т) у штаммов А. Нро/егит 81143 и 8Я62 показало их резистентность к Те! и Ар. Минимальная ингибирующая концентрация Те! для этих бактерий составила 100 мкг/мл. Примечательно, что данные литературы, за исключением работы, в которой сообщалось о нескольких штаммах азоспирилл, включая типовые, устойчивых к 20 мкг/мл Те! [273], свидетельствуют в пользу нехарактерности для бактерий данного рода резистентности к указанному антибиотику [18, 75, 100, 130, 256, 273]. Между тем, в выборке из 8 штаммов азоспирилл, выделенных в Саратовской области, 7 были устойчивы к Те! - минимальная ингибирующая концентрация варьировала в диапазоне от 30 до 100 мкг/мл.

Сравнение бесплазмидных вариантов А. Иро/егит 8Я43, полученных обработкой акридиновым оранжевым, с исходным по признакам устойчивости к Те! и Ар позволило нам выявить корреляцию между исчезновением устойчивости к указанным антибиотикам и утратой бактериями резидентных плазмид.

Нами также отмечен факт более быстрого роста Tet- и Ар-чувствительных клонов в неселективных условиях по сравнению с Tet- и Ар-устойчивыми.

Представленные данные свидетельствуют о плазмидной локализации детерминант антибиотикоустойчивости у штаммов A. lipoferum SR43 и SR62 и поддерживают наше предположение о присутствии на 2,9-тпн плазмиде гена, определяющего рибосом-протекторную устойчивость к Tet.

Итак, нами осуществлена первичная характеристика выявленных мини-плазмид: распространенность среди штаммов азоспирилл, выделенных в Саратовской области, стабильность наследования, размер, данные о структуре и возможных функциях отдельных репликонов. Полученные результаты могут служить основой для проведения дальнейших генетических и молекулярно-биологических исследований, посвященных изучению структуры и свойств обнаруженных нами миниплазмид, их родственных взаимоотношений как друг с другом, так и с плазмидными репликонами из других родов бактерий. Стабильно наследуемые миниплазмиды могут быть использованы при конструировании векторов для A. lipoferum. Кроме того, наблюдаемый у бактерий-хозяев высокий уровень устойчивости к Tet (МИК 30-100 мкг/мл), не описанный ранее у азоспирилл, и возможность детерминирования этого признака малыми плазми-дами открывает перед нами интересное и актуальное направление исследований - изучение генетической природы устойчивости этих ассоциативных азо-тофиксирующих бактерий к данному антибиотику.

Результаты апробации разработанных нами методов скрининга и препаративного выделения плазмидной ДНК на госпитальных штаммах грамотрица-тельных бактерий со множественной антибиотикоустойчивостью продемонстрировали их пригодность для представителей всех обнаруженных в стационаре родов: Citrobacter, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Serratia. Проведенные исследования показали неравномерность распределения плазмидосо-держащих бактерий в пространственно-таксономической структуре бактерио-ценоза травматологического стационара, позволили выявить доминирующие в

174 стационаре типы плазмид, обнаружить идентичные по размеру и рестрикцион-ным профилям плазмиды у бактерий, принадлежащих к различным родам. Согласно данным литературы [1, 11, 12, 31, 203, 295], значимость этих данных немаловажна для достоверной оценки эпидемиологического состояния лечебно-профилактических учреждений.

Благодаря эффективности разработанных методов обнаружения и препаративного выделения плазмидной ДНК, мы получили возможность изучать криптические плазмиды размером от 2 до 130 тпн в широком круге грамотри-цательных бактерий.

Таким образом, основными достижениями нашей работы стали, во-первых, разработка эффективных методов выделения и очистки различных ДНК и, во-вторых, выявление и первичная характеристика самых маленьких криптических плазмид бактерий рода АгояртИит.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Голубев, Сергей Николаевич, 2002 год

1. Акимкин В.Г. Характерные эпидемиологические черты нозокомиального сальмонеллеза в лечебно-профилактических учреждениях для взрослых // Журнал микробиологии. 1998. - № 3. - С. 27-31.

2. Альбертсон П.-О. Разделение клеточных частиц и макромолекул: Пер. с англ. -М: Мир, 1974.-383 с.

3. Астафьев Б.А., Петров O.E. Эволюционно-генетическая теория паразитизма // Успехи соврем, биол. 1992. - Т. 112, № 2. - С. 163-175.

4. Баканчикова Т.И., Климачева В.А., Боровок И.А., Майсурян А.Н. Плазмиды Azospirillum brasilense // Молек. генет., микробиол. и вирусол. 1985. - № 1. — С. 12-17.

5. Белокрысенко С.С., Парфенюк Р.Л. Микробиологический контроль за лекарственной устойчивостью возбудителей гнойно-септических инфекций новорожденных детей // Антибиотики и химиотерапия. 1990. - Т. 35, № 5. - С. 21-24.

6. Боев Б.В., Бондаренко В.М, Valencia С.Р. Математическая модель оперативного анализа и прогноза вспышек госпитальных инфекций среди новорожденных (на примере клебсиеллезной инфекции) // Журнал микробиологии. 1996. - № 3. - С. 106-110.

7. Воронин A.M. Биология плазмид // Успехи микробиологии. 1983. - № 18. — С. 143-163.

8. Воейкова Т.А. Конъюгационный перенос плазмид из Escherichia coli в различные штаммы порядка Actinomycetales // Генетика. 1999. - Т. 35, № 12. -С. 1626-1633.

9. Воробьева И.П., Богданова СЛ., Хмель И.А. Молекулярная структура и репликация бактериальных плазмид // Успехи соврем, биол. 1977. - Т. 83, № 3. - С. 323-339.

10. Воропаева С.Д., Анкирская A.C. Абрамова З.Н., Миронова Т.Г. Антибактериальная терапия и госпитальная инфекция // Антибиотики. 1980. -Т. 25, № 8.-С. 619-622.

11. Габисония Т.Г., Галушка Ф.П.,Чанишвилли Т.Г. Изучение конъюгативных R-плазмид, выделенных из госпитальных штаммов синегнойной палочки // Антибиотики и химиотерапия. 1992. - Т. 37, № 12,- С. 39-41.

12. Габрилович И.М., Габрилович М.И., Гукасова А.Г., Жетишев P.A., Усаева Я.С. Идентификация госпитальных штаммов Enterobacter cloacae II Журнал микробиологии. 1997. - № 2. - С. 69-71.

13. Гельфанд М.С. Компьютерный анализ последовательностей ДНК // Мол. биол,- 1998.-Т. 32, № 1.-С. 103-120.

14. Девис Р., Бодстайн Д., Рот Дж. Методы генетической инженерии. Генетика бактерий: Пер. с англ. М.: Мир, 1984. - 176 с.

15. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У. Справочник биохимика: Пер. с англ. М.: Мир, 1991.-544 с.

16. Забаровский Е.Р., Турина О.В. Быстрое выделение ДНК фага лямбда // Мол. биол, 1988.-Т. 22, вып. 6.-С. 1451-1455.

17. Завильгельский Г.Б. Антирестрикция // Мол. биол. 2000. - Т. 34, № 5. -С. 854-862.

18. Калинин К.В., Глатман Л.И., Бондаренко В.М. и др. Плазмида резистентности Klebsiella pneumoniae, контролирующая цитотоксическую активность //ЖМЭИ. 1992. -№ 2. -С. 12-14.

19. Каменева C.B., Муронец Е.М. Генетический контроль процессов взаимодействия бактерий с растениями в ассоциациях // Генетика. 1999. -Т. 35, № 11.-С. 1480-1494.

20. Канапина А.Ш., Канапин A.A., Прозоров A.A. Определение и сравнительный анализ нуклеотидной последовательности фрагментов минирепликона криптической плазмиды р1414 из почвенного штамма Bacillus subtilis II Генетика. 1995. - Т. 31, № 9. - С. 1201-1209.

21. Кацы Е.И. Изучение плазмид азотофиксирующих ассоциированных со злаками бактерий Azospirilium brasilense: Дис. . канд. биол. наук. Саратов,1991.- 170 с.

22. Кацы Е.И. Генетика азотофиксации и взаимодействия с растениями бактерий рода Azospirillum (Tarrand, Krirg and Dobereiner, 1979) // Генетика.1992.-Т. 28, № 7.-С. 5-18.

23. Кацы Е.И. Плазмида р85 Azospirillum brasilense Sp245: изучение круга возможных хозяев и несовместимости с плазмидами Azospirillum brasilense Sp7 II Молек. генет., микробиол. и вирусол. 1992. - № 9-10. - С. 8-11.

24. Кацы Е.И. Характеристика генов, выявленных в ДНК 120-МДа плазмиды у мутанта бактерии Azospirillum brasilense Sp245, дефектного по продукции полярного жгутика и роения // Молекул, генетика. 2002. - Т. 38, № 1. - С. 2232.

25. Кацы Е.И., Борисов И.В., Машкина А.Б., Панасенко В.И. Влияние плазмидного состава на реакции хемотаксиса ассоциированных со злаками бактерий Azospirillum brasilense Sp245 II Молек. генет., микробиол. и вирусол. -1994.-№2.- С. 29-32.

26. Кацы Е.И., Журавлева Е.А., Панасенко В.И. Транспозонный мутагенез, элиминация и мобилизация плазмид азотофиксирующей бактерии Azospirillum brasilense Sp245 II Молек. генет., микробиол. и вирусол. 1990. - № 2. - С. 2932.

27. Кацы Е.И., Шелудько A.B. Картирование fla локуса в плазмиде с молекулярной массой 120 МДа у бактерии Azospirillum brasilense Sp245 II Генетика. 1999. - Т. 35, № 10.-С. 1367-1372.

28. Клонирование ДНК. Методы: Пер. с англ. / Под ред. Д. Гловера. М.: Мир, 1988.- 538с.

29. Коротяев А.И., Малышева Т.В. Плазмиды антибиотикорезистентности бактерий // Успехи современной биологии. 1988. - Т. 105, № 1. - С. 50-66.

30. Куракин Э.С. Межбольничное распространение Shigella ßexneri 2А II Журнал микробиологии. 1998. -№ 31. - С. 31-35.

31. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др.; Под ред. В.В. Меньшикова -М.: Медицина, 1987. 368 с.

32. Ленинджер А.Л. Основы биохимии: В 3-х т. Пер. с англ. М.: Мир, 1985. Т. 3.-320 с.

33. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии.- М.: Химия, 1979. -480 с.

34. Майсурян А.Н., Баканчикова Т.П., Погосов В.З., Климачева В.А., Боровок И.А. Генетические свойства Azospirillum brasilense II Бюллетень ВНИИСХМ. -1985.-№42. -С. 51-54.

35. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. М.: Мир, 1984. - 480 с.

36. Матвеев В., Петрова Л., Журавлева Е., Панасенко В. Особенности диссоциации в культурах Azospirillum brasilense Sp7 II Молекул, генетика. -1987. -№ 8.-С. 16-19.

37. Матвеев В.Ю., Сень А.Н., Панасенко В.И. Плазмидный состав штаммов Azospirillum spp., выделенных из-под пшениц Саратовской селекции // Всесоюз. Совещание "Плазмида-XI": Тез. докл. М., 1986. С. 38.

38. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике: Пер. с англ. М.: Мир, 1976.-436 с.

39. Нечаева A.A., Калинина H.A., Суходолец В.В. Изучение плазмидных профилей и стабильности производственных штаммов лактококков // Генетика. 1995.-Т. 31, № 9. - С. 1210-1217.

40. Остерман JI.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука, 1981.-288 с.

41. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985.- 536 с.

42. Пехов А.П. Плазмиды бактерий. М.: Медицина, 1986. - 224 с.

43. Плазмиды. Методы: Пер. с англ. / Под ред. К. Харди. М.: Мир, 1990. -267 с.

44. Позднякова Л.И., Каневская C.B., Леванова Г.Ф., Барышева H.H., Пилипенко Т.Ю., Богатырев В.А., Федорова Л.С. Таксономическое изучение азоспирилл, выделенных из злаков Саратовской области // Микробиология. -1988.-Т. 57, №2.-С. 275-278.

45. Полуэктова Е.У., Карандашова И.В., Сапогова Е.Ю., Прозоров A.A. Изучение гомологии природных криптических плазмид Bacillus subtilis // Генетика. 1996.-T. 32, № 11.-С. 1498-1503.

46. Прозоров A.A. Строение генома бактерий: единство или многообразие? // Генетика. 1995. - Т. 31, № 6. - С. 741-752.

47. Прозоров A.A. Горизонтальный перенос генов у бактерий: лабораторное моделирование, природные популяции, данные геномики // Микробиология. -1999.-Т. 68, № 5. С. 632-646.

48. Рачинский Ф.Ю., Рачинская М.Ф. Техника лабораторных работ. Л.: Химия, 1982.-432 с.

49. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии. 2-е изд., перераб. и доп. -СПб.: Изд-во СПбГТУ, 1999. 522 с.

50. Скоупс Р. Методы очистки белков: Пер. с англ. -М.: Мир, 1985. 358 с.

51. Смирнов Г.Б. Роль плазмид и мигрирующих генетических элементов в эволюции бактерий // Успехи микробиологии. 1984. - № 19. - С. 35-74.

52. Справочник по биологии / Под ред. K.M. Сытника. Киев: Наукова Думка, 1985.- 568 с.

53. Суходолец В.В. Принципы организации прокариотического генома // Генетика. 1992. - Т. 28, № 1. - С. 28-37.

54. Суходолец В.В. Естественный отбор в контексте теории вертикальной эволюции // Генетика. 1995. - Т. 31, № 1. - С. 5-14.

55. Суходолец В.В. Механизмы вертикальной эволюции // Успехи соврем, биол.- 1997.-Т. 37, №5.-С. 517-533.

56. Суходолец В.В. Природа адаптивных эволюционных изменений: приспособленность и экологический потенциал // Генетика. 1998. - Т. 34, № 12. - С. 1589-1596.

57. Тикнюс В.И., Марцишаускас Р.П. Использование водных двухфазных систем для очистки ферментов // Биотехнология. 1988. - Т. 4, № 1. - С. 60-68.

58. Товкач Ф.И. Выделение и предварительная характеристика криптических плазмид Erwinia caratovora 11 Микробиология. 2001. - Т. 70, № 6. - С. 804810.

59. Уильяме В., Уильяме X. Физическая химия для биологов: Пер. с англ. М.: Мир, 1976.-589 с.

60. Филонов А.Е., Боронин A.M. Стабильность плазмид и конкуренция плазмидосодержащих и бесплазмидных штаммов в условиях непрерывного культивирования // Антибиотики и химиотерапия. 1990. - Т. 35, № 5. - С. 4649.

61. Фрайфельдер Д. Физическая биохимия. Применение физико-химических методов в биохимии и молекулярной биологии: Пер. с англ. М.: Мир, 1980. -582 с.

62. Хмель И.А. Плазмиды и эволюция микроорганизмов // Успехи соврем, биол.- 1985. Т. 99, № 3. - С. 323-337.

63. Хроматография. Практическое приложение метода: В 2-х т. Пер. с англ. / Под ред. Э. Хефтмана. М.: Мир, 1986. Т. 1.-336 с.

64. Чанг Р. Физическая химия с приложениями к биологическим системам: Пер. с англ. М.: Мир, 1980. - 646 с.

65. Чичян В.Г., Амбарцумян Н.С., Акопян Ж.И., Африкян Э.К. Исследование спектра экстрахромосомных ДНК Bacillus thuringiensis Berliner и Bacillus sphaericus Meyer et Neide II Генетика. 1997. - Т. 33, № 3. - С. 308-313.

66. Шлегель Г. Общая микробиология: Пер. с нем. М.: Мир, 1987. - 567 с.

67. Яковлев С.В. Клиническая химиотерапия бактериальных инфекций. 2-е изд., перераб. и доп. М.: Нью-Диамед, 1997. - 148 с.

68. Яфаев Р.Х., Зуева Л.П. Эпидемиология внутрибольничной инфекции. Л.: Медицина, 1989.- 168 с.

69. Abeyasekara G., Rickwood D. A centrifugation method for the isolation of plasmid DNA without the use of an ultracentrifuge // Biotechniques. 1991. -Vol. 10, № 4. - P. 460, 462, 464-465.

70. Aguilar-Cordova E., Fontes J. Rapid isolation of substrate-quality plasmid DNA without CsCl-dye density gradients // Biotechniques. 1990. - Vol. 9, № 5. - P. 538540.

71. Akella R., Porter R. Rapid isolation and sequecing of double-stranded plasmid DNA // Biotechniques. 1993. - Vol. 14, № 5. P. 726, 728, 730.

72. Alberts B.M. Efficient separation of single-stranded and double-stranded deoxyribonucleic acid in a dextran-polyethylene glycol two-phase system // Biochemistry. 1967. Vol. 6, № 8. P. 2527-2532.

73. Albertsson P.-A. Partition of Cell Particles and Macromolecules. 3rd edn. New York: John Wiley and Sons, 1986. - 346 p.

74. Alonso M., Giraudo A., Calzolari A. Resistance to antibiotics in strains of Azospirillum sp. II Rev. Argent. Microbiol. 1987. - Vol. 19, № 1. - P. 27-31.

75. Alpert A.J. Hydrophilic interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds // J.Chromatogr. 1990. -Vol. 499, № l.-P. 177-196.

76. Anderson R.J., Delgado C., Fisher D., Cunningham J.M., Francis G.E. A Method for the Purification of DNA/Protein Complexes Applied to DNA Topoisomerase II Cleavage Sites//Anal. Biochem. 1991.-Vol. 193, № 1. - P. 101-111.

77. Armstrong B., Garner H.R. Analysis of protocol variations on DNA yield // Genet. Anal. Tech. Appl. 1992. - Vol. 9, № 5-6. - p. 127-133.

78. Attal J., Puissant C., Houdebine L.M. An improvement of a rapid method using Qiagen columns to purify plasmids // Biotechniques. 1990. - Vol. 8, № 3. - P. 269271.

79. Azad A.K., Coote J.G., Parton R. An improved method for rapid purification of covalently closed circular plasmid DNA over a wide size range // Lett. Appl. Microbiol. 1992. - Vol. 14, № 6. - P. 250-254.

80. Bally R., Givaudan A. Mobilization and transfer of Azospirillum lipoferum plasmid by the Tn5-Mob transposon into a plasmid-free Agrobacterium tumefaciens strain // Can. J. Microbiol. 1988. - Vol. 34, № 12. - P. 1354-1357.

81. Bansal O., Das R. A simple and rapid method for the isolation of plasmid and lambda phage DNAs // Nucl. Acids Res. 1989. - Vol. 17, № 23. - P. 10129.

82. Baskir J.N., Hatton T.A., Suter U.W. Thermodynamics of the separation of biomaterials in two-phase aqueous polymer systems: Effect of the phase-forming polymers // Macromolecules. 1987. - Vol. 20. - P. 1300-1311.

83. Bennett P.M. and Richmond M.H. Plasmids and Their Possible Influence on Bacterial Evolution // The Bacteria. Vol. VI. New York: Academic Press, 1978. P. 2-62.

84. Bergey's manual of systemic bacteriology. Baltimore, London: Williams and Wilkins, 1984-1986.- 1599 p.

85. Bergstrom C.T., Lipsitsh M., Levin B.R. Natural selection, infectious transfer and existens conditions for bacteral plasmids // Genetics. 2000. - Vol. 155. - P. 15051519.

86. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucl. Acids Res. 1979. - Vol. 7, № 6. - P. 15131523.

87. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M., Jansen C.L., Wertheim van Dillen P.M.E., van der Noordaa J. Rapid and simple method of purification of nucleic acids // J.Clin.Microbiol. 1990. - Vol. 28, № 3. - P. 495-503.

88. Brenner V., Holubova I., Hubacek J. An efficient method for isolation of plasmid DNA from methylotrophic bacteria // Folia-Microbiol. 1990. - Vol. 35, № 5. -P. 454-455.

89. Brooks D.E., Sharp K.A., Fisher D. Theoretical Aspects of Partitioning // Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems. Theory, Methods, Uses, and Application to Biotechnology / Eds. H. Walter, D.E. Brooks, D. Fisher. Orlando, 1985. P. 11-84.

90. Brun Y.V., Breton R., Lapointe J. Large scale sequencing projects using rapidly prepared double-stranded plasmid DNA // DNA Seq. 1991. - Vol. 1, № 5. - P. 285289.

91. Cabezas H. Jr. Theory of phase formation in aqueous two-phase systems // J. Chromatogr. B Biomed. Appl. 1996. - Vol. 680, № 1-2. - P. 3-30.

92. Cabezas H., Evans J.D., Szlag D.C. A statistical mechanical model of aqueous two-phase systems // Fluid Phase Equilibria. 1989. - Vol. 53. - P. 453-462.

93. Cabezas H. Jr., Kabiri-Badr M., Szlag D.C. Statistical thermodynamics of phase separation and ion partitioning in aqueous two-phase systems // Bioseparation. -1990. Vol. 1, № 3-4. - P. 227-233.

94. Campbell A.M. Genome organization in prokaryotes // Curr. Opin. Genet. Dev. -1993. Vol. 3, № 6. - P. 837-844.

95. Carter M.J., Milton I.D. An inexpensive and simple method for DNA purifications on silica particles // Nucl. Acids Res. 1993. - Vol. 21, № 4. - P. 1044.

96. Chattoraj D.K. Control of plasmid DNA replication by iterons: no longer paradoxical // Mol. Microbiol. 2000. - Vol. 37, № 3. - P. 467-476.

97. Chemika-Biochemika 1993/94: Catalog / Fluka, 1992. 1528 p.

98. Chopra I., Roberts M.C. Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2001. - Vol. 65, № 2. - P. 232-260.

99. Chowdhury K. One step 'miniprep' method for the isolation of plasmid DNA // Nucl.-Acids-Res. 1991. -Vol. 19, № 10.-P. 2792.

100. Cohen L.M., Eiteman M.A., Gainer J.L. A model to predict the partition coefficients of amino acids in PEG/salt aqueous two-phase systems // Sep. Sci. Technol. 1995. - Vol. 30. - P. 225-237.

101. Cole K.D. Purification of plasmid and high molecular mass DNA using PEG-salt two-phase extraction //Biotechniques. 1991. -Vol. 11, № l.-P. 18,20, 22-24.

102. Cole K.D. Preparative separation of plasmid and bacterial artificial chromosome DNA by density gradient electrophoresis in the presence of linear polymers // Electrophoresis. 1998. - Vol. 19, № 18. - P. 3062-3068.

103. Colman A., Byers M.J., Primrose S.B., Lyons A. Rapid purification of plasmid DNAs by hydroxyapatite chromatography // Europ. J. Biochem. 1978. - Vol. 91, № l.-P. 303-310.

104. Connemann M., Gaube J., Leffrang U., Miiller S., Pfennig A. Phase Equilibria in the System Poly(ethyleneglycol) + Dextran + Water // Chem. Eng. Data. 1991. -Vol. 36, № 4. - P. 446.

105. Davison J. Genetic exchange between bacteria in the environment // Plasmid. -1999.-Vol. 42, №2.-P. 73-91.

106. De Troch P., Keijers V., Vanderleyden J. Sequence analysis of the Azospirillum brasilense exoB gene, encoding UDP-glucose 4'-epimerase // Gene. 1994. -Vol. 144, № l.-P. 143-144.

107. De Troch P., Petersen D.J., Vanderleyden J. Polysaccharide synthesis in Azospirillum brasilense II Azospirillum VI and Related Microorganisms / Eds. I. Fendrik, M. Del Gallo, M. de Zamaroczy, J. Vanderleyden. Berlin, 1995. P. 97103.

108. Del Sal G., Manfioletti G., Schneider C. The CT AB-DNA precipitation method: a common mini-scale preparation of template DNA from phagemids, phages or plasmids suitable for sequencing // Biotechniques. 1989. - Vol. 7, № 5. - P. 514520.

109. Del Solar G., Espinosa M. Plasmid copy number control: an ever-growing story // Mol. Microbiol. 2000. - Vol. 37, № 3. - P. 492-500.

110. Diamond A.D., Hsu J.T. Fundamental studies of biomolecule partitioning in aqueous two-phase systems // Biotechnol. Bioeng. 1989. - Vol. 34. - P. 1000-1014.

111. Diamond A.D., Hsu J.T. Aqueous two-phase systems for biomolecule separation // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 1992. - Vol. 47. - P. 89-135.

112. Dunn I.S., Blattner F.R. Charons 36 to 40: multi enzyme, high capacity, recombination deficient replacement vectors with polylinkers and polystuffers // Nucl. Acids Res. 1987. - Vol. 15, № 6. - P. 2677-2698.

113. Eckhardt T. A rapid method for the identification of plasmid desoxyribonucleic acid in bacteria//Plasmid. 1978.-Vol. 1,№4.-P. 584-588.

114. Edwardson P.A., Atkinson T., Lowe C.R., Small D.A. A new rapid procedure for the preparation of plasmid DNA // Anal. Biochem. 1986. - Vol. 152, № 2. -P. 215-220.

115. Eiteman M.A., Gainer J.L. A model for the prediction of partition coefficients in aqueous two-phase systems // Bioseparation. 1991. - Vol. 2, № 1. - P. 31-41.

116. Eiteman M.A., Hassinen C., Veide A. A mathematical model to predict the partitioning of peptides and peptide-modified proteins in aqueous two-phase systems // Biotechnol. Prog. 1994. - Vol. 10, № 5. - P. 513-519.

117. Elmerich C. Azospirillum II Nitrogen fixation. Molecular biology / Eds. E.F. Broutghon, A. Puler. Oxford, 1986. Vol. 4. P. 106-126.

118. Elmerich, C., Franche C. Azospirillum genetics: plasmids, bacteriophages and chromosome mobilisation // Azospirillum genetics, physiology, ecology / Ed. W. Klingmuller. Basel, 1982. P. 9-17.

119. Elmerich C., Quiviger B., Rosenberg C., Franche C., Laurent P., Dobereiner J. Characterization of a temperate bacteriophage for Azospirillum // Virology. 1982. -Vol. 122, № l.-P. 29-37.

120. Feliciello L, Chinali G. A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli II Anal.Biochem. 1993. -Vol. 212, №2.-P. 394-401.

121. Ferreira G.N., Cabral J.M., Prazeres D.M. Purification of supercoiled plasmid DNA using chromatographic processes // J. Mol. Recognit. 1998. - Vol. 11, № 1-6. -P. 250-251.

122. Ferreira G.N., Cabral J.M., Prazeres D.M. Development of process flow sheets for the purification of supercoiled plasmids for gene therapy applications // Biotechnol. Prog. 1999.-Vol. 15, №4.-P. 725-731.

123. Fisher J.A., Favreau M.B.R. Plasmid purification by phenol extraction from guanidinium thiocyanate solution: development of an automated protocol // Anal.Biochem. 1991.-Vol. 194, №2.-P. 309-315.

124. Fliegerova K., Benada O., Flint H.J. Large plasmids in ruminal strains of Selenomonas ruminantium II Lett. Appl. Microbiol. 1998. - Vol. 26, № 4. - P. 265269.

125. Forciniti D., Hall C.K. Theoretical treatment of aqueous two-phase extraction by using virial expansions // Downstream Processing and Bioseparations: Recovery and

126. Purification of Biological Products / Eds. J.-F.P. Hamel, J.B. Hunter, S.K. Sikdar. -Washington, 1990. Vol. 419. P. 53-70.

127. Franche C., Elmerich C. Physiological properties and plasmid content of several strains of Azospirillum brasilense and A. lipoferum II Ann. Microbiol. 1981. -A 132, № i.p. 3-18.

128. Gamper H., Lehman N. Piette J., Hearst J.E. Purification of circular DNA using benzoylated naphthoylated DEAE-cellulose // DNA. 1985. - Vol. 4, № 2. - P. 157164.

129. Garger S.J., Griffith O.M., Grill L.K. Rapid purification of plasmid DNA by a single centrifugation in a two-step cesium chloride-ethidium bromide gradient // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1983. - Vol. 117, № 3. - P. 835-842.

130. Gaube J., Pfennig A., Stumpf M. Vapor-Liquid Equilibrium in Binaryand Ternary Aqueous Solutions of Poly(ethylene glycol) and Dextran // J. Chem. Eng. Data. 1993.-Vol. 38, № i.p. 163-166.

131. Gerdes K., Moller-Jensen J., Bugge Jensen R. Plasmid and chromosome partitioning: surprises from phylogeny // Mol. Microbiol. 2000. - Vol. 37, № 3. -P. 455-466.

132. Giraudo A., Alonso M., Calzolari A. Plasmid content in strains of Azospirillum sp. II Rev. Argent. Microbiol. 1986. - Vol. 18, № 3-4. - P. 97-103.

133. Givaudan A., Bally R. Melanin production by Azospirillum lipoferum strains 11 5th Intern. Sympos. N2 Fixation with Non-Legumes: Abstr. Florence, 1990. P. 115.

134. Givaudan A., Bally R. Similarities between large plasmids of Azospirillum lipoferum IIFEMS Microbiol. Lett. 1991. - Vol. 78. - P. 245-252.

135. Goldberg G.S., Lau A.F. Transfection of mammalian cells with PEG-purified plasmid DNA // Biotechniques. 1993. - Vol. 14, № 4. - P. 548, 550.

136. Graber T.A., Andrews B.A., Asenjo J. A. Model for the partition of metal ions in aqueous two-phase systems // J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 2000. -Vol. 743, № 1-2.-P. 57-64.

137. Groflmann C., Maurer G. On the calculation of potential differences in aqueous two- phase systems // Fluid Phase Equilibria. 1995. - Vol. 106. - P. 17-25.

138. Groflmann C., Zhu J., Maurer G. Phase equilibrium studies on aqueous two-phase systems containing amino acids and peptides // Fluid Phase Equilibria. -1993. -Vol. 82.-P. 275-282.

139. Guan Y., Lilley T.H., Treffry T.E. Theory of phase equilibria for multicomponent aqueous solutions: Applications to aqueous polymer two-phase systems // J. Chem. Soc,, Faraday Trans. 1993. - Vol. 89. - P. 4283-4298

140. Guan Y., Lilley T.H., Treffry T.E. A new excluded volume theory and its application to the coexistence curves of aqueous polymer two-phase systems // Macromolecules. 1993. - Vol. 26. - P. 3971-3979.

141. Hammer S., Pfennig A., Stumpf M. Liquid-liquid and vapor-liquid equilibria in water + poly(ethylene glycol) + sodium sulfate // J. Chem. Eng. Data. 1994. -Vol. 39.-P. 409-413.

142. Hardy K. Bacterial Plasmids. Second edition. Wokingham: Van Nostrand Reinhold, 1986.- 114 p.

143. Haurat J., Faure D., Bally R., Normand P. Molecular relationship of an atypical Azospirillum strain 4T to other Azospirillum species // Res. Microbiol. 1994. -Vol. 145, № 8.-P. 633-640.

144. Haynes C.A., Benitez F.J., Blanch H.W., Prausnitz J.M. Application of integral-equation theory to the description of aqueous two-phase partitioning systems // AIChE J. 1993. - Vol. 39.-P. 1539-1557.

145. Haynes C.A., Beynon R.A., King R.S., Blanch H.W., Prausnitz J.M. Thermodynamic properties of aqueous polymer solutions: Poly(ethylene glycol)/dextran // J. Phys. Chem. 1989. - Vol. 93. - P. 5612-5617.

146. Haynes C.A., Blanch H.W., Prausnitz J.M. Separation of protein mixtures by extraction: Thermodynamic properties of aqueous two-phase polymer systems containing salts and proteins // Fluid Phase Equilibria. 1989. - Vol. 53. - P. 463474.

147. Hediger M.A. High resolution preparative gel electrophoresis of DNA fragments and plasmid DNA using a continuous elution apparatus // Anal. Biochem. 1986. -Vol. 159, №2.-P. 280-286.

148. Heulin T., Bally R., Balandreau J. Isolation of a very efficient N2 -fixing bacteria from the rhizosphere of rice // Azospirillum genetics, physiology, ecology / Ed. W. Klingmuller. Basel, 1982. P. 92-99.

149. Holmes D.S., Quigley M. A rapid boiling method for the preparation of bacterial Plasmids//Anal. Biochem. 1981. - Vol. 114,№1.-P. 193-197.

150. Hou Y., Lin Y.-P., Sharer J.D., March P.E. In Vivo Selection of Condicional-Lethal Mutations in the Gene Encoding Elongation Factor G of Escherichia coli II J. Bacteriol.- 1994.-Vol. 176, № i.p. 123-129.

151. Hultner M.L., Cleaver J.E. A bacterial plasmid DNA miniprep using microwave lysis // Biotechniques. 1994. - Vol. 16, № 6. - P. 990-992, 994.

152. Humphreys G.O., Willshaw G.A., Anderson E.S. A simple method for the preparation of large quantities of pure plasmid DNA // Biochim. Biophys. Acta. -1975.-Vol. 383, №4.-P. 457-463.

153. Hyman E.D. Preparation of plasmid DNA by sequential enzymatic digestion // Biotechniques. 1992. - Vol. 13, № 4. - P. 550-554.

154. Ishaq M., Wolf B., Ritter C. Large-scale isolation of plasmid DNA using cetyltrimethylammonium bromide // Biotechniques. 1990. - Vol. 9, № 1. - P. 1920, 22, 24.

155. Jacob R.K., Zealey G.R. One-step procedure for the purification of high molecular weight chromosomal DNA // Nucl. Acids Res. 1988. - Vol. 16, № 4. -P. 1639.

156. Jaschke A., Furste J.P., Erdmann V.A., Cech D. Hybridization-based affinity partitioning of nucleic acids using PEG-coupled oligonucleotides // Nucl. Acids Res. 1994.-Vol. 22, № 10.-P. 1880-1884.

157. Ji H., Smith L.M. Rapid purification of double-stranded DNA by triple helix-mediated affinity capture // Anal.Chem. 1993. - Vol. 65, № 10. - P. 1323-1328.

158. Johansson G., Tjerneld F. Separation processes in biotechnology. Aqueous two-phase separations // Bioprocess Technol. 1990. - Vol. 9. - P. 287-327.

159. Johansson G., Walter H. Partitioning and concentrating biomaterials in aqueous phase systems // Int. Rev. Cytol. 2000. - Vol. 192. - P. 33-60.

160. Johansson H.O., Brooks D.E., Haynes C.A. Macromolecular crowding and its consequences//Int. Rev. Cytol. 2000. - Vol. 192.-P. 155-170.

161. Johansson H.O., Karlstrom G., Tjerneld F., Haynes C.A. Driving forces for phase separation and partitioning in aqueous two-phase systems // J. Chromatogr. B Biomed Sci. Appl. 1998. - Vol. 711, № 1-2. - P. 3-17.

162. Johnson J.T. DNA Reassociation and RNA Hybridisation of Bacterial Nucleic Acids // J. Methods in microbiology. 1985. - Vol. 18. - P. 33-74.

163. Kabiri-Badr M., Cabezas, H.J. A thermodynamic model for the phase behavior of salt-polymer aqueous two-phase systems // Fluid Phase Equilib. 1996. -Vol. 115.-P. 39-58.

164. Kado C.I., Liu S.T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids//J. Bacteriol. 1981. -Vol. 145, №3.-P. 1365-1373.

165. Kahn D.W., Butler M.D., Cohen D.L., Gordon M., Kahn J.W., Winkler M.E. Purification of plasmid DNA by tangential flow filtration // Biotechnol. Bioeng. -2000.-Vol. 69, № l.-P. 101-106.

166. Katzy E.I., losipenco A.D., Egorenkov D.A., Zhuravleva E.A., Panasenco V.l., Ignatov V.V. Involvement of the Azospirillum brasilense plasmid DNA in indole acetic acid production // FEMS Microbiol. Lett. 1990. - Vol. 72, № 1. - P. 1-4.

167. Katzy E.I., Matora L.Yu., Serebrennicova O.B., Scheludko A.V. Involvement of a 120-MDa plasmid of Azospirillum brasilense Sp245 in the production of lipopolysaccharides // Plasmid. 1998. - Vol. 40, № 1. - P. 73-83.

168. Kerpal R., Tauro P. Plasmids in Azospirillum. 1. Detection and partial characterization // Indian J. Microbiol. - 1988. - Vol. 28, № 3. - P. 206-208.

169. Khan S.A. Plasmid rolling-circle replication: recent developments // Mol. Microbiol. 2000. - Vol. 37, № 3. - P. 477-484.

170. King C.H., Plikaytis B.B., Shinnick T.M. Isolation of plasmid DNA from mycobacteria using a resin-based alkaline lysis kit // Biotechniques. 1995. -Vol. 19, №3,-P. 326-330.

171. King R.S., Blanch H.W., Prausnitz J.M. Molecular thermodynamics of aqueous two-phase systems for bioseparations // AIChE J. 1988. - Vol. 34. - P. 1585-1593.

172. Klein R.D., Seising E, Wells R.D. A rapid microscale technique for isolation of recombinant plasmid DNA suitable for restriction enzyme analysis // Plasmid. -1980.-Vol. 3, № 1. P. 88-91.

173. Kondo T., Mukai M., Kondo Y. Rapid isolation of plasmid DNA by LiCl-ethidium bromide treatment and gel filtration // Anal. Biochem. 1991. - Vol. 198, № 1.-P. 30-35.

174. Kopperschlager G. Effects of specific binding reactions on the partitioning behavior of biomaterials // Int. Rev. Cytol. 2000. - Vol. 192. - P. 61-97.

175. Kovalenko S.A., Tanaka M., Ozawa T. Simple methods for preparation of plasmid DNA yielding long and accurate sequence data // Nucl. Acids Res. 1994. -Vol. 22, №25.-P. 5771-5772.

176. Kurien B.T., Broyles R.H. Plasmid DNA preparation by heat treatment of Escherichia coli lysates // Anal.Biochem. 1993. - Vol. 213, № 1. - P. 174-176.

177. Laitinen J., Samarut J., Holtta E. A nontoxic and versatile protein salting-out method for isolation of DNA // Biotechniques. 1994. - Vol. 17, № 2. - P. 316, 318, 320-322.

178. Lau R., Reeves P.R. Gene transfer is major factor in bacterial evolution // Molec. Biol. Evol.- 1996. -Vol. 13, № l.-P. 47-55.

179. Le Brun J.J., Rentier-Delrue F., Mercier L. A simple method for the preparation of the covalently closed circular form of plasmid DNA // Biotechniques. 1988. -Vol. 6, №9.-P. 834, 837-838.

180. Lebaron Ph., Batailler N., Baleux B. Mobilization of recombinant nonconjugative plasmid at the interface between wastewater and the marine coastal environment // FEMS Microbiol. Ecol. 1994. - Vol. 15, № 1-2. - P. 61-70.

181. Lederberg J. Plasmid (1952-1997) // Plasmid. 1998. - Vol. 39, № 1. - P. 1-9.

182. Lee S.Y., Rasheed S. A simple procedure for maximum yield of high-quality plasmid DNA // Biotechniques. 1990. - Vol. 9, № 6. - P. 676-679.

183. Lemos M.V.F., Santos D.S., Trabulsi L.R., Azevedo J.L. Possible role of plasmid deoxyribonucleic acid in nitrogen fixation in Azospirillum brasilense. II Int. Workshop on associative N2-fixation: Abstr. West Palm Beach, 1979. P. 7.

184. Lemos M.V.F., Santos D.S., Trabulsi L.R., Azevedo J.L. Possible role of plasmid deoxyribonucleic acid in nitrogen fixation in Azospirillum brasilense II Assoc. Nitrogen fixation. Boca Raton, 1981. - P. 63-68.

185. Lev Z. A procedure for large-scale isolation of RNA-free plasmid and phage DNA without the use of Rnase // Anal. Biochem. 1987. - Vol. 160, № 2. - P. 332336.

186. Levy S.B. The Challenge of Antibiotic Resistance // Sci. Am. 1998. -Vol. 278, №3,- P. 46-53.

187. Levy S.B., McMurrey L.M., Barbosa T.M., Burdett V., Courvalin P., Hillen W., Roberts M.C. Nomenclature for new tetracycline resistance determinants // Antimicrob. Agents Chemother. 1999. - Vol. 43, № 6. - P. 1523-1524.

188. Li M., Zhu Z.Q., Wu Y.T., Lin D.Q. Measurement of phase diagrams for new aqueous two-phase systems and prediction by a generalized multicomponent osmotic virial equation // Chem.Eng.Sci. 1998. - Vol. 53. - P. 2755-2767.

189. Life Science Catalog 1999 / Promega, 1998. 522 p.

190. Liou J.T., Shieh B.H., Chen S.W., Li C. An improved alkaline lysis method for minipreparation of plasmid DNA // Prep. Biochem. Biotechnol. 1999. - Vol. 29, № 1. - P. 49-54.

191. Lu M., Johansson G., Albertsson P.-A., Tjerneld F. Partitioning of proteins in dextran/hydrophobically modified dextran aqueous two-phase systems // Bioseparation. 1995. - Vol. 5, № 6. - P. 351-358.

192. Majumdar M.K., McAndrews-Hill M., Wiliams D.A. A rapid protocol for the purification of plasmid DNA template suitable for DNA sequencinq // Anal.Biochem. 1993. -Vol. 208, № 2. - P. 403-404.

193. Maki D.G. Nosocomial bacteremia // Am. J. Med. 1981. - Vol. 70, № 3. -P. 719-732.

194. Marmur J.A. A procedure for isolation of Deoxyribonucleic Acid from Microorganisms//J. Mol. Biol. 1961. - Vol. 3,№2.-P. 208-218.

195. Marra M.A., Kucaba T.A., Hillier L.W., Waterston R.H. High-throughput plasmid DNA purification for 3 cents per sample // Nucl. Acids Res. 1999. -Vol. 27, № 24. - P. e37.

196. Massad E., Lundberg S., Yang H.M. Modeling and simulating the evolution of resistance against antibiotics // Int. J. Biomed. Comput. 1993. - Vol. 33. - P. 65-81.

197. Matveev V.Yu., Sen A.N., Panasenko V.I. Plasmid content of Azospirillum strains from cereals // Folia Microbiol. 1988. - Vol. 33. - P. 273-276.

198. Merion M., Warren W. Purification of supercoiled plasmids from crude cell lysates using high performance anion exchange hromatography // Biotechniques. -1989.-Vol. 7, № 1. P. 60-67.

199. Meyers J.A., Sanchez D., Elwell L.P., Falkow S. Simple agarose gel electrophoretic method for the identification and characterization of plasmid deoxyribonucleic acid // J. Bacteriol. 1976. - Vol. 127, № 3. - P. 1529-1537.

200. Michiels K., de Troch P., Onyeocha I., Van Gool A., Vanderleyden J. Plasmid localization and mapping of two Azospirillum brasilense locy that affect exopolysacharide synthesis // Plasmid. 1989. - Vol. 21, № 1. - P. 142-146.

201. Michiels K., Vanderleyden J., Elmerich C. Genetics and molecular biology of Azospirillum // Azospirillum Plant Assotiations / Ed. Y. Okon. Boca Raton, 1994. P. 41-56.

202. Mistry S.L., Asenjo J.A., Zaror C.A. Mathematical modelling and simulation of aqueous two-phase continuous protein extraction // Bioseparation. 1992-93. -Vol.3, №6.-P. 343-358.

203. Molecular Biologicals. Chemicals and Equipment for Molecular Biology: Catalog / Pharmacia, 1986. 184 p.

204. Moller-Jensen J., Jensen R.B., Gerdes K. Plasmid and chromosome segregation in prokaryotes // Trends Microbiol. 2000. - Vol. 8, № 7. - P. 313-320.

205. Monstein H.J., Geijer T. A rapid and inexpensive method for preparing E. coli plasmid-DNA // Biochem. Int. 1986. - Vol. 12, № 6. - P. 889-896.

206. Motora L.Yu., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Katzy E.I., Schwartsburd B.I. Effect of plasmid content on cell-surface antigens of Azospirillum brasilense Sp245 // 5th Intern. Sympos. N2 Fixation with Non-Legumes: Abstr. Florence, 1990. P. 97.

207. Mukhopadhyay M., Mandal N.C. A simple procedure for large-scale preparation of pure plasmid DNA free from chromosomal DNA from bacteria // Anal. Biochem.- 1983. Vol. 133, № 2. - P. 265-270.

208. Muller W. Liquid-liquid partition chromatography of biopolymers in aqueous two-phase systems // Bioseparation. 1990. - Vol. 1, № 3-4. - P. 265-282.

209. Muller W., Eigel A. DNA fractionation by two-phase partition with aid of a base-specific macroligand // Anal. Biochem. 1981. - Vol. 118, № 2. - P. 269-277.

210. Muller W., Kutemeier G. Size fractionation of DNA fragments ranging from 20 to 30 000 base pairs by liquid/liquid chromatography // Eur. J. Biochem. 1982. -Vol. 128, № l.-P. 231-238.

211. Muller W., Schuetz H.J., Guerrier-Takada C., Cole P.E., Potts R. Size fractionation of DNA fragments by liquid-liquid chromatography // Nucl. Acids Res.- 1979. Vol. 7, № 8. - P. 483-499.

212. Musich P.R., Chu W. A hot alkaline plasmid DNA miniprep method for automated DNA sequencing protocols // Biotechniques. 1993. - Vol. 14, № 6. -P. 958-960.

213. Nakamura Y., Gojobori T., Ikemura T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000 // Nucl. Acids Res. 2000. -Vol. 28, № l.-P. 292.

214. Neudecker F., Grimm S. High-throughput method for isolating plasmid DNA with reduced lipopolysaccharide content // Biotechniques. 2000. - Vol. 28, № 1. -P. 107-109.

215. Nicoletti V.G., Condorelli D.F. Optimized PEG method for rapid plasmid DNA purification: high yield from 'midi-prep' // Biotechniques. 1993. - Vol. 14, № 4. -P. 532, 534, 536.

216. Novick R.P., Clowes R.C., Cohen S.N., Curtiss R. III, Datta N., Falkow S. Uniform Nomenclature for Bacterial Plasmids: a Proposal // Bacteriol. Rev. 1976. -Vol. 40, № l.-P. 168-189.

217. O'-Connor K.C., Vella G., Warren W., Hines R. Large scale purification of plasmids from crude cell lyzates by anion-exchange HPLC // FASEB-J. 1990. -Vol. 4, № 7. - P. A2289.

218. Ohlsson R., Hentschel C.C., Williams J.G. A rapid method for the isolation of circular DNA using an aqueous two-phase partition system // Nucl. Acids Res. -1978. Vol. 5, № 2. - P. 583-590.

219. Oikawa Y., Yoshizawa K., Taniyama T. Rapid and simple DNA isolation from Escherichia coli by a modified boiling method using bivalent metal ion chelate // Agric.Biol.Chem. 1989.- Vol. 53, №4.-P. 1151-1152.

220. Olsen J.E. An improved method for rapid isolation of plasmid DNA from wildtype Gram-negative acteria for plasmid restriction profile analysis // Lett. Appl. Microbiol. 1990. - Vol. 10. - P. 209-212.

221. Olsen D.B., Eckstein F. High-efficiency oligonucleotide directed plasmid mutagenesis // Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 1990. - Vol. 87, № 4. - P. 1451-1455.

222. Onyeocha I., Vieille C., Zimmer W., Baca B., Flores M., Palacios R., Elmerich C. Physical map and properties of 90-MDa plasmid of Azospirillum brasilense Sp7 // Plasmid. 1990. - Vol. 23. - P. 169-182.

223. Ortlepp S.A. An improved boiling method for the preparation of bacterial plasmid and phage DNA // Gene-Anal.Tech. 1989. - Vol. 6, № 5. - P. 93-96.

224. Paithankar K.R., Prosad K.S.N. Precipitation of DNA by polyethylene glycol and ethanol //Nucl. Acids Res. 1991. - Vol. 19, № 6. - P. 1346.

225. Paulsen I.T., Brown M.H., Skurray R.A. Proton-Dependent Multidrug Efflux Systems // Microbiol. Rev. 1996. - Vol. 60, № 4. - P. 575-608.

226. Perbal B. A practical guide to molecular cloning. New York: John Wiley and Sons, 1984.-554 p.

227. Persson J., Johansson H.O., Galaev I., Mattiasson B., Tjerneld F. Aqueous polymer two-phase systems formed by new thermoseparating polymers // Bioseparation. 2000. - Vol. 9, № 2. - P. 105-116.

228. Petersen G.B., Stockwell P.A., Hill D.F. Messenger RNA recognition in Escherichia coli: a possible second site of interaction with 16S ribosomal RNA // EMBO J. 1988. - Vol. 7, № 12. - P. 3957-3962.

229. Pettijon D. A study of DNA, partially denaturated DNA and protein-DNA complexes in the polyehtylene glycol-dextran phase system // Eur. J. Biochem. -1967,-Vol. 3, № 1. P. 25-32.

230. Pfennig A., Schwerin A., Gaube J. Consistent view of electrolytes in aqueous two-phase systems // J. Chromatogr. B Biomed. Sei. Appl. 1998. - Vol. 711, № 1-2.-P 45-52.

231. Pietruszka N., Galaev I.Y., Kumar A., Brzozowski Z.K., Mattiasson B. New polymers forming aqueous two-phase polymer systems // Biotechnol. Prog. 2000. -Vol. 16, №3,-P. 408-415.

232. Pitcher D., Saunders N., Owen R. Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate // Lett. Appl. Microbiol. 1989. - Vol. 8, № 4. - P. 151156.

233. Plasinski J., Dart P.J., Rolfe B.G. Plasmid visualization and nif-gene location in nitrogen-fixing Azospirillum strains // J. Bacteriol. 1983. - Vol. 155, № 3. -P. 1429-1433.

234. Plazinski J., Rolfe B.G. Azospirillum-Rhizobium interaction leading to a plant-grouth stimulation without nodule formation // Can. J. Microbiol. 1985. - Vol. 31, № 11.-P. 1026-1030.

235. Prazeres D.M., Schluep T., Cooney C. Preparative purification of supercoiled plasmid DNA using anion-exchange chromatography // J. Chromatogr. A. 1998. -Vol. 806, № l.-P. 31-45.

236. Pritchard D.G., Halpern R.M., Smith R.A. Mucopolysaccharide contamination of DNA prepared by the aqueous polymer two-phase procedure // Biochim. Biophys. Acta. 1971.-Vol. 228.-P. 127-134.

237. Pulleyblank D., Michalak M., Daisley S.L., Glick R. A method for the purification of E. coli plasmid DNA by homogeneous lysis and polyethylene glycol precipitation//Mol. Biol. Rep. 1983. - Vol. 9, № 3. - P. 191-195.

238. Radloff R., Bauer W., Vinograd J. A dye-buoyant-density method for the detection and isolation of closed circular duplex DNA; The closed circular DNA in HeLa cells //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1967. - Vol. 57, № 5. - P. 1514-1521.

239. Raghavarao K.S.M.S., Guinn M.R., Todd P. Recent developments in aqueous two-phase extraction in bioprocessing // Sep. Purif. Methods. 1998. - Vol. 27. -P. 1-49.

240. Raven N.D.H., Williams R.A.D. Isolation and characterization of plasmids present in Thermus strains from Yellowstone National Park // FEMS-Symp. 1989. -Vol. 49.-P. 44-61.

241. Raymond G.J., Bryant P.K. 3d, Nelson A., Johnson J.D. Large-scale isolation of covalently closed circular DNA using gel filtration chromatography // Anal. Biochem. 1988. -Vol. 173, № i.p. 125-133.

242. Reddy S.V., Hamsabhushanam K., Jagadeeswaran P. A rapid method for large-scale isolation of plasmid DNA by boiling in a plastic bag // Biotechniques. 1989. -Vol. 7, № 8.-P. 820-822.

243. Rimler R.B. Restriction endonuclease analysis using Hhal and Hpall to discriminate among group B Pasteurella multocida associated with haemorrhagic septicaemia // J. Med. Microbiol. 2000. - Vol. 49, № 1. - P. 81-87.

244. Rito-Palomares M., Cueto L. Effect of biological suspensions on the position of the binodal curve in aqueous two-phase systems // J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 2000. - Vol. 743, № 1-2. - P. 5-12.

245. Roberts M.C. Tetracycline resistance determinants: mechanisms of action, regulation of expression, genetic mobility, and distribution // FEMS Microbiol. Rev.- 1996.-Vol. 19, № l.-P. 1-24.

246. Roberts M.C. Genetic mobility and distribution of tetracycline resistance determinants // Ciba Found. Symp. 1997. - Vol. 207. - P. 206-218.

247. Roeder T., Gorich D., Roeder N.P., Bruchhaus I. Isolation of ultrapure supercoiled plasmid-DNA using preparative electrophoresis // Electrophoresis. -1998.-Vol. 19, № 10.-P. 1575-1576.

248. Rudin L., Albertsson P.-A. A new method for isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms // Biochim. Biophys. Acta. 1967. - Vol. 134. - P. 37-44.

249. Russell A.D. Plasmids and bacterial resistance to biocides // J. Appl. Microbiol.- 1997. Vol. 83, № 2. - P. 155-165.

250. Saha B., Saha D., Niyogi S., Bal M. A new method of plasmid DNA preparation by sucrose-mediated detergent lysis from Escherichia coli (Gram-negative) and Staphylococcus aureus (Gram-positive) // Anal.Biochem. 1989. - Vol. 176, № 2. -P. 344-349.

251. Salamanca M.H., Merchuk J.C., Andrews B.A., Asenjo J.A. On the kinetics of phase separation in aqueous two-phase systems // J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 1998. - Vol. 711, № 1-2. - P. 319-329.

252. Salyers A.A., Shoemaker N.B. Broad host range gene transfer: plasmids and conjugative transposons // FEMS Microbiol. Ecol. 1994. - Vol. 15, № 1-2. - P. 1522.

253. Selber K., Nellen F., Steffen B., Thommes J., Kula M.R. Investigation of mathematical methods for efficient optimisation of aqueous two-phase extraction // J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 2000. - Vol. 743, № 1-2. - P. 21-30.

254. Semin Y.A., Poverennyi A.M. Fractionation of partially denatured DNA in the polyethylene glycol-dextran system // Mol. Biol. 1973. - Vol. 7, № 3 - P. 299-303.

255. Serghini M.A., Ritzenthaler C., Pinck L. A rapid and efficient 'miniprep' for isolation of plasmid DNA // Nucl.-Acids-Res. 1989. - Vol. 17, № 9. - P. 3604.

256. Shepherd J.C.W. Method to determine the reading frame of a protein from the purine/pyrimidine genome sequence and its possible evolutionary justification // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1981. - Vol. 78, № 3. - P. 1596-1600.

257. Shine J., Dalgarno L. The 3'-terminal sequense of Escherichia coli 16S ribosomal RNA: Complementarity to nonsense triplets and ribosome binding sites // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. - Vol. 71, № 4. - P. 1341-1346.

258. Singh M., Wenzel W. Detection and characterization of plasmids in Azospirillum II Azospirillum genetics, physiology, ecology / Ed. W. Klingmuller. -Basel, 1982. P. 44-51.

259. Skingle D.C., Mclnnes J.L., Symons R.H. An improved method for eliminating RNA contamination of plasmid DNA preparations // Biotechniques. 1990. - Vol. 9, №3.-P. 314-317.

260. Skorupska A., Brzezinska M., Choma A., Kulinska D., Lorkiewicz Z. Physiological characterization, plasmids and bacteriocinogenicity of Azospirillum II Microbios. 1985.-Vol. 44, № 181S.-P. 243-251.

261. Solano-Castillo C., Rito-Palomares M. Kinetics of phase separation under different process and design parameters in aqueous two-phase systems // J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 2000. - Vol. 743, № 1-2. - P. 195-201.

262. Sparks R.B., Elder J.H. A simple and rapid procedure for the purification of plasmid DNA using reverse-phase C18 silica beads // Anal. Biochem. 1983. - Vol. 135, №2.-P. 345-348.

263. Speer B.S., Shoemaker N.B., Salyers A.A. Bacterial resistance to tetracycline: mechanisms, transfer, and clinical significance // Clin. Microbiol. Rev. 1992. -Vol. 5, №4.-P. 387-399.

264. Steenhoudt O., Vanderleyden J. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects // FEMS Microbiol. Rev. 2000. - Vol. 24, № 4. - P. 487-506.

265. Stefani S., Agodi A. Molecular epidemiology of antibiotic resistance // Int. J. Antimicrob. Agents. 2000. - Vol. 13, № 3. -P. 143-153.

266. Sturesson S., Tjerneld F.T., Johansson G. Partition of macromolecules and cell particles in aqueous two-phase systems based on hydroxypropyl starch and polyethylene glycol) // Appl.Biochem.Biotechnol. 1990. - Vol. 26, № 3. - P. 281295.

267. Summerton J., Atkins T., Bestwick R. A rapid method for preparation of bacterial plasmids//Anal. Biochem. 1983. - Vol. 133, № l.-P. 79-84.

268. Sykora P. Macroevolution of plasmids: a model for plasmid speciation // J. Theor. Biol. 1992. - Vol. 159, № 1. - P. 53-65.

269. Takanashi S., Nagano Y. Rapid procedure for isolation of plasmid DNA and application to epidemiological analysis // J. Clin. Microbiol. 1984. - Vol. 20, № 4. -P. 608-613.

270. Tarczynski M.C., Meyer W.J., Min J.J., Wood K.A., Hellwig R.J. Two-minute miniprep method for plasmid DNA isolation // Biotechniques. 1994. - Vol. 16, № 3. - P. 514-519.

271. Taylor D.E., Chau A. Tetracycline resistance mediated by ribosomal protection // Antimicrob. Agents Chemother. 1996. - Vol. 40, № 1. - P. 1-5.

272. Thomas C.M. Paradigms of pasmid organization // Mol. Microbiol. 2000. -Vol. 37, №3.-P. 485-491.

273. Tiesman J., Rizzino A. A rapid and reliable method for the purification of high-quality plasmid DNA for double-stranded sequencing // Biotechniques. 1991. -Voll. 10, №3. -P. 319, 326-328.

274. Tiurin M.V. Optimization of the method of isolation of microamounts of plasmid DNA from lactobacilli // Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol. 1990. - № 3. - P. 29-31.

275. Tjerneld F., Johansson G. Aqueous two-phase systems for biotechnical use // Bioseparation. 1990. - Vol. 1, № 3-4. - P. 255-263.

276. Trevors J.T. Bacterial plasmids isolation and purification // J. Microbiol. Methods. 1985.-Vol. 3.-P. 259-271.

277. Trevors J.T. DNA extraction from soil // Microbial Releases. 1992. - Vol. 1, № 1. - P. 3-9.

278. Tschape H. The spread of plasmids as a function of bacterial adaptability // FEMS Microbiol. Ecol. 1994. - Vol. 15. - P. 23-32.

279. Tu J., Charng Y. Microlysate: a method for screening cloned fragments using single colonies//Nucl. Acids Res. 1989.-Vol. 17,№ 8.-P. 3321.

280. Vande Broek A, Okon Y, Vanderleyden J. Isolation and sequence analysis of repA from the incurable 90 MDa plasmid of Azospirillum brasilense II DNA Seq. -2000.-Vol. 11, № 1-2. P.101-107.

281. Van-Huynh N., Decleire M., De-Backer O., Colson C. Extraction of plasmid and genomic DNAs from bateria without the use of cell-lytic enzymes // Downstrtam-Processing-in-Biotechnol. II. 1989. - P. 2.25-2.27.

282. Van Rhijn P., Vanstockem M., Vanderleyden J., De Mot R. Isolation of behavioral mutants of Azospirillum brasilense by using Tn5 lacZ // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - Vol. 56, № 4. - P. 990-996.

283. Vanstokem M., MichielsK., Vanderleyden J., Van Gool A.P. Transposon mutagenesis of Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum: Physical analysis of Tn5 and Tn5-Mob insertion mutants // Appl. Environ. Microbiol. 1987. -Vol. 53, №2.-P. 410-415.

284. Verma V., Qazi G.N., Parshad R., Chopra C.L. An economical large-scale procedure to purify Micrococcus plasmid DNA // Biotechniques. 1988. - Vol. 6, № 10.-P. 936, 938, 940.

285. Vieille C., Elmerich C. Nodulation genes in Azospirillum II 8th Intern. Congr. Nitrogen Fixation: Abstr. Knoxville, 1990. P. E88.

286. Vieille C., Elmerich C. Characterization of two Azospirillum brasilense Sp7 plasmid genes gomologous to Rhizobium meliloti nodPQ // Mol. Plant-Microbe Interact. 1990. - Vol. 3, № 6. - P. 389-400.

287. Walter H., Johansson G. Partitioning in aqueous two-phase systems: an overview//Anal. Biochem. 1986. - Vol. 155, №2.-P. 215-242.

288. Walter H., Johansson G., Brooks D.E. Partitioning in aqueous two-phase systems: recent results //Anal. Biochem. 1991. - Vol. 197, № 1. - P. 1-18.

289. Wang L.F., Voysey R., Yu M. Simplified large-scale alkaline lysis preparation of plasmid DNA with minimal use of phenol // Biotechniques. 1994. - Vol. 17, № 1. - P. 26,28.

290. Wang Z., Rossman T.G. Large-scale supercoiled plasmid preparation by acidic phenol extraction // Biotechniques. 1994. - Vol. 16, № 3. - P. 460-463.

291. Womble D.D., Taylor D.P., Rownd R.H. Method for obtaining more-accurate covalently closed circular plasmid-to-chromosome ratios from bacterial lysates by dye-buoyant density centrifugation // J. Bacteriol. 1977. - Vol. 130, № 1. - P. 148153.

292. Wong W.M., Au D.M.Y., Lam V.M.S., Tam J.W.O., Cheng L.Y.L. A simplified and improved method for the efficient double-stranded sequencing of mini-prep plasmid DNA //Nucl. Acids Res. 1990. - Vol. 18, № 18. - P. 5573.

293. Wood A.G., Menezes E.M., Dykstra C., Duggan D.E. Methods to demonstrate the megaplasmids (or minichromosomes) in Azospirillum II Azospirillum genetics, physiology, ecology / Ed. W. Klingmuller. Basel, 1982. P. 18-34;

294. Wu G.J., Cannon R.E. An economical large scale procedure to purify E. coli amplifiable plasmids for DNA sequencing, in vitro transcription and in vitro mutagenesis // Experientia. 1985. - Vol. 41, № 11.-P. 1488-1490.

295. Wu Y.T., Lin D.Q., Zhu Z.Q., Mei L.H. Prediction of liquid-liquid equilibria of polymer-salt aqueous two-phase systems by a modified Pitzer's virial equation // Fluid Phase Equilib. 1996. - Vol. 124. - P. 67-79.

296. Yang W.K., Henley D.C. A simple and economical procedure for large-scale plasmid DNA isolation // Nucl. Acids Res. 1991. - Vol. 19, № 9. - P. 2507-2508.

297. Yeung M.C., Lau A.S. Fast and economical large-scale preparation of high-quality plasmid DNA//Biotechniques. 1993. - Vol. 15, №3.-P. 381-382.

298. Zasloff M., Ginder G.D., Felsenfeld G. A new method for the purification and identification of covalently closed circular DNA molcules // Nucl. Acids Res. 1978. -Vol. 5, №4.-P. 1139-1152.

299. Zervos P.H., Moms L.M., Hellwig R.J. A novel method for rapid isolation of plasmid DNA // Biotechniques. 1988. - Vol. 6, № 3. p. 238-242.

300. Zhang L., Kerr A. Rapid purification of Ti plasmids from Agrobacterium by ethidium bromide treatment and phenol extraction // Lett. Appl. Microbiol. 1993. -Vol. 16, №5.-P. :265-268.

301. Zhou A., Jiang X., Xu X. Improved alkaline lysis method for rapid isolation of plasmid DNA // Biotechniques. 1997. - Vol. 23, № 4. - P. 592-594.

302. Zhou C., Yang Y., Jong A.Y. Mini-prep in ten minutes // Biotechniques. 1990. -Vol. 8, №2.-P. 172-173.

303. Ziai M.R., Hamby C.B., Reddy R., Hayashibe K., Ferrone S. Rapid purification of plasmid DNA following acid precipitation of bacterial proteins // Biotechniques. -1989.-Vol. 7, №2.-P. 147.

304. Zimmerman S.B., Murphy L.D. Excluded volume effects on the partition of single- and double-stranded oligodeoxynucleotides between two liquid phases // Biopolymers. 1992. - Vol. 32, № 10. - P. 1365-1373.

305. Zimmerman S.B., Trach S.O. Excluded volume effects on the partition of macromolecules between two liquid phases // Biopolymers. 1990. - Vol. 30, № 7-8. -P. 703-718.1. АКТ О ВНЕДРЕНИИ• ■ ■ • ■ '

306. Источ1Ж1с пнформлцни (методт ,*кне рскомендлшш, информационное письмо, отчет о НИР, диссертации, монографии, съезды, конференции, семинары и др. //о/^^Ь ■¿'/гC/MJ ,

307. Где н когдл пислпсно г^и/^СЧ М^О^/ГО^СО-£¿¿¿4 И -¿/¿¿о?у наим^нон.ише лечебного учреждоЛт '/ дата начала' писдрсмия у (/ ^

308. Общее количество наблюдений

309. Результаты применения метода за периодположительные (количество наблюдений)неопределенные (количество наблюдений) „ 7отрицательные (колв^Г-.'во наблюдений)£ ■

310. Замечания, предложения • '■

311. Дата У 3 е^ф^^ • у: Д : ~ Подпись-^5Ъ^--1^н i . '• 1- • от». ул писассн'и'

312. ПРИМЕЧАНИЕ:*1) пн. 1— 2 —^^аиолняс^^пз^ботчнком

313. Н11.3—7 —.заполняет! организацией, внедрившей разработку.* I • . ■. ~• • » ' I, »• »■••:■:■■ .* ■ • .1/ >• i

314. Зав. кафедрой органической и биоорганической химии СГУпрофессор, Д.Х.Н.1. АП Кривенько

315. Зав. филиалом кафедры органической и биоорганической химии СГУ, зав. лабораторией физической хими* структур ИБФРМ