Разработка методов генетической модификации бифидобактерий с целью создания препаратов-пробиотиков нового поколения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат медицинских наук Шкопоров, Андрей Николаевич

• Шкопоров, Андрей Николаевич
• кандидат медицинских наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Шкопоров, Андрей Николаевич

Введение

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 Введение '

1.2 Роль и место бактерий рода

Bifidobacterium в микробиоценозе кишечника

1.3 Прикладное значение бифидобактерий

1.4 Плазмиды у бифидобактерий

1.5 Создание челночных клонирующих векторов для бифидобактерий

1.6 Направления прикладных генно-инженерных исследований с применением бифидобактерий

1.7 Регуляторные генетические элементы, необходимые для экспрессии гетерологичных генов в бифидобактериях

1.8 Изучение секретируемых белков и белковых адгезинов у бифидобактерий

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Культивирование штаммов бактерий

2.2 Молекулярно-биологические и биохимические методы

2.2.1 Выделение геномной ДНК из бактериальных и тканевых культур

2.2.2 Выделение плазмидных ДНК

2.2.3 Синтез ДНК-олигонуклеотидов

2.2.4 Полимеразная цепная реакция

2.2.5 Обработка ДНК ферментами нуклеинового обмена

2.2.6 Секвенирование плазмидных ДНК

2.2.7 Трансформация бактериальных штаммов

2.2.8 Выделение тотальной РНК из бифидобактерий

2.2.9 Обратная транскрипция и ОТ-ПЦР в режиме реального времени

2.2.10 Электрофорез нуклеиновых кислот

2.2.11 Выделение секретируемых белков бифидобактерий и иммуноблоттинг

2.3 Специальные биохимические методы

2.3.1 Видовая идентификация изолятов бифидобактерий методом секвенирования фрагмента гена 16S рРНК

2.3.2 Секвенирование плазмид, выделенных из штаммов бифидобактерий

2.4 Методы биоинформатики и компьютерной обработки данных

Глава 3. Собственные результаты

3.1 Поиск плазмидных ДНК в штаммах бифидобактерий

3.2 Определение полной нуклеотидной последовательности плазмид рВ80 и рВ21 а

3.3 Анализ нуклеотидных последовательностей плазмид рВ80 и рВ21а

3.4 Конструирование челночных клонирующих векторов

Е. coli - Bifidobacterium

3.5 Рекомбинантная экспрессия гена фактора роста фибробластов (FGF2) человека в клетках В. breve

3.6 Рекомбинантная экспрессия гена ос-амилазы

В. adolescentis в клетках В. breve

3.7 Рекомбинантная экспрессия гена интерлейкина-10 (ILI0) человека в клетках В. breve

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка методов генетической модификации бифидобактерий с целью создания препаратов-пробиотиков нового поколения»

Актуальность

Бифидобактерии - род грамположительных неспорообразуюпщх анаэробных бактерий, являющихся облигатными обитателями желудочно-кишечного тракта человека и многих видов животных, как позвоночных, так и беспозвоночных. В подавляющем большинстве случаев бифидобактерии находятся в тесных мутуалистических отношениях с организмом хозяина, а разрыв такой симбиотической связи грозит нарушением нормальной физиологии интестинального тракта последнего. Длительная симбиотическая коэволюция бифидобактерий и человека привела к формированию у данного рода микроорганизмов большого количества взаимовыгодных адаптаций, благотворно влияющих на жизнедеятельность макроорганизма хозяина. Среди таких свойств наиболее значимы: активная и пассивная колонизационная резистентность, направленная на предотвращение заселения желудочно-кишечного тракта условно-патогенными и патогенными микробами, участие в катаболических и биосинтетических процессах в кишечной трубке и иммуномодулирующее влияние [М.С. Collado и другие, 2005; A. Pompei и другие, 2007; Н. Tanaka и другие, 2000; F. Backhed и М. Hornef, 2003].

Позитивные пробиотические свойства бифидобактерий с успехом использует как медицииа, так и пищевая промышленность. В пашей стране был создан целый ряд биотерапевтических препаратов, имеющих в своем составе живые культуры бифидобактерий и широко применяющихся для лечения широкого круга гастроэнтерологических заболеваний [Г.И. Гончарова, 1982; Б.А. Ефимов и В.М. Коршунов, 1992; С.Н. Барзашка-Попова, 1990]. Бифидобактерии находят все большую популярность' как компоненты разнообразных кисломолочных продуктов и продуктов функционального питания.

Благодаря своему общепризнанному благотворному влиянию на физиологию как интестинального тракта, так и всего организма человека в целом бифидобактерии стали объектом многочисленных исследований. Однако до недавнего времени существовали лишь отрывочные сведения о молекулярной биологии и генетике данного рода бактерии. Значительный прогресс в изучении тонких молекулярных свойств бифидобактерий наметился на рубеже XX и XXI вв. Последние годы ознаменовались завершением секвенирования геномов нескольких видов бифидобактерий [М.А. Schell и другие, 2002] и публикацией значительного числа работ, посвященных вопросам их молекулярной физиологии и молекулярных механизмов взаимодействия с организмом хозяина [М. Ventura и другие. 2005;

A. Margolles и другие, 2006; J. De Dea Lindner и другие, 2007].

Отдельной важной темой является изучение плазмид и мобильных генетических элементов бифидобактерий [Б.А. Ефимов и другие, 2008]. Включение в инструментарий исследователя подобных генетических элементов позволяет от описательной генетики перейти к экспериментальной, базирующейся на методологии генетической инженерии. Вместе с тем, расширение наших знаний о генетике этого рода прокариот и разработка методов генетического манипулирования ими позволит уже в ближайшем будущем направленно создавать пробиотические и биотерапевтические штаммы с принципиально новыми свойствами. В частности, это сделает возможным получение рекомбинантных штаммов-продуцентов белковых, нуклеиновых или иных молекул с терапевтическими свойствами.

Цель настоящего исследования

Разработать оригинальный инструментарий и методологию, необходимые для осуществления простой и эффективной генетической модификации бифидобактерий и последующей продукции в них гетерологичпых белков с терапевтическими свойсгвами (цитокинов, ферментов, вакцинных антигенов и пр.).

Задачи исследования:

1. Провести поиск плазмидных ДНК в коллекции штаммов бифидобактерий, выделенных от здоровых детей раннего возраста;

2. Определить полные нуклеотидные последовательности избранных плазмид и проанализировать их методами биоинформатики;

3. На основе описанных плазмид создать челночные клонирующие вектора Bifidobacterium-E. coli, позволяющие доставлять гетерологичные гены в клетки бифидобактерий;

4. Разработать оптимальный протокол генетической трансформации перспективного хозяйского штамма бифидобактерий;

5. Подобрать необходимые генетические элементы (промоторные, терминаторные и лидерные последовательности), обеспечивающие оптимальную транскрипцию и трансляцию гетерологичного гена, а также эффективную секрецию рекомбинантных белков.

Научная новизна

В ходе настоящего исследования впервые было проведено изучение плазмидных профилей в индигенных штаммах бифидобактерий, выделенных от детей раннего возраста. Обнаружена существенная частота встречаемости плазмидных ДНК в бифидобактериях различных видов и выявлено доминирование ограниченного числа консервативных семейств таких плазмид в популяциях бифидобактерий. Определены и аннотированы полные нуклеотидные последовательности двух новых плазмид, в числе которых одна - первая полностью просеквенированная плазмида из бифидобактерий вида Bifidobacterium bifidum, вторая - плазмида с нетипичным для бифидобактерий генным составом, напоминающая некоторые конъюгативные плазмиды бактерий рода Streptomyces.

Продемонстрировано присутствие на описанных плазмидах генов, вовлеченных в процесс конъюгативного переноса данных молекул ДНК. Отдельный интерес представляет присутствие на одной из плазмид набора генов tra необходимых и достаточных, по всей видимости, для осуществления конъюгативного переноса данной плазмиды по уникальному схрептомицет-подобному механизму.

На основе изученных плазмид создана серия челночных клонирующих векторов Е. coli -Bifidobacterium, способных к автономной репликации в обоих типах хозяйских клеток и несущих соответствующие селективные маркерные гены для селекции в них. Продемонстрирована способность большей части полученных векторов к трансформации бифидобактерий вида Bifidobacterium breve с относительно высокой эффективностью.

Сконструированы экспрессирующие челночные вектора, несущие необходимые регуляторные элементы для обеспечения экспрессии гегерологичных генов в бифидобактериях. Функциональность полученных плазмидных векторов была подтверждена при помощи трех модельных генов - FGF2 человека, IL10 человека и атуВ Bifidobacterium adolescentis. Кроме того, в случае с генами FGF2 и IL10, впервые была осуществлена гетерологичная экспрессия человеческого гена в бактериях рода Bifidobacterium.

Практическая значимость работы

Полученные нами данные о высокой частоте встречаемости плазмидных ДНК в клетках бифидобактерий, индигенных для интестиналыюго тракта здоровых детей, а также данные об отсутствии каких-либо потенциально опасных маркеров на данных плазмидах могут внести существенные коррективы в распространенное мнение о недопустимости включения плазмидных штаммов бифидобактерий в состав препаратов-пробиотиков.

Разработанные в ходе настоящего исследования челночные клонирующие вектора Е. coli - Bifidobacterium, а также методы их доставки в клетки Bifidobacterium breve имеют высокую практическую значимость. Данный инструментарий может быть использован для доставки и экспрессии гетерологичных генов в клетках бифидобактерий как в рамках фундаментальных исследований, направленных на изучение биологии бифидобактерий, так и в рамках прикладных работ, имеющих целью получение пробиотических или биотерапевтических штаммов бифидобактерий с новыми полезными свойствами.

Полученные нами штаммы бифидобактерий, экспрессирующие и секретирующие основной фактор роста фибробластов человека (FGF-2) и интерлейкин-10 человека (ИЛ-10), имеют как демонстрационное, так и самостоятельное прикладное значение. С учетом последних данных о возможности использования белков FGF-2 и ИЛ-10 для лечения различных тяжелых заболеваний желудочно-кишечного тракта, указанные штаммы-продуценты могут стать прообразами принципиально новых биогерапевтических штаммов, полученных с использованием методов генетической инженерии.

Разработанные нами векторные системы, в комбинации с клонированным геном осамилазы атуВ Bifidobacterium adolescentis, могут лечь в основу нового поколения безопасных клонирующих векторов для бифидобактерий, соответствующих стандарту «food-grade», полностью лишенных потенциально-опасных фрагментов ДНК и пригодных для получения рекомбинантных пробиотических и биотерапевтических штаммов бифидобактерий.

Разработанные в ходе данного исследования векторные системы уже в настоящее время используются для фундаментальных и прикладных исследований бактерий рода Bifidobacterium как в нашей стране, так и в ряде лабораторий США и Европы.

Апробация работы

Основные положения работы были доложены на заседании научной конференции кафедры микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава 12 марта 2008 года, на заседаниях секции гнотобиологии Московского отделения Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И.И. Мечникова в 2006 и 2007 годах, а также на международном симпозиуме «Propionibacteria and Bifidobacteria: Dairy and Probiotic Applications» (Wadahl, 2007).

Положения выносимые на защиту:

1. Штаммы бифидобактерий, колонизирующие кишечник здоровых детей, часто являются носителями небольших кольцевых критических плазмидных ДНК, которые реплицируются по механизму «катящегося кольца», несут ряд генов, кодирующих консервативные белки с неизвестными функциями, а также обладают потенциальной способностью к коныогативному переносу;

2. Криптические плазмиды, выделенные из кишечных штаммов бифидобактерий, могут быть использованы для создания челночных клонирующих векторов Bifidobacterium — E.coli, обеспечивающих возможность проведения генетической трансформации бифидобактерий;

3. Полученные в ходе данного исследования челночные клонирующие вектора могут быть использованы для доставки в клетки бифидобактерий генетических конструкций, обеспечивающих продукцию в них гетерологичных белков с полезными свойствами, в том числе цитокинов (FGF-2, ИЛ-10) и ферментов (а-амилаза);

4. Гепетически-трансформированные штаммы бифидобактерий, полученные с использованием описанных челночных векторов, могут стать основой для создания принципиально нового поколения пробиотических и биотерапевтических агентов.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 8 статей в рецензируемых научных журналах (5 в отечественных и 3 в зарубежных).

Объем и структура диссертации

Работа изложена на русском языке, на 100 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, выводов и списка литературы. Библиография включает 189 наименований работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 17 рисунками и 4 таблицами.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Шкопоров, Андрей Николаевич

выводы

1. Бифидобактерии, колонизирующие толстый кишечник детей раннего возраста, с высокой частотой (17,6%) являются носителями плазмидных ДНК.

2. Значительная часть плазмид бифидобактерий представляют собой небольшие критические молекулы, реплицирующиеся по механизму катящегося кольца и относящиеся к двум консервативным семействам (рВ80/рЮ50 и рВ44/рЮ36).

3. Плазмиды рВ80 и рВ21а, выделенные из штаммов В. bifidum В80 и В. breve В21а потенциально способны к мобилизации или самостоятельному конъюгативному переносу, в том числе и по уникальному стрептомицет-подобному механизму.

4. Сконструированные челночные клонирующие вектора Е. coli - Bifidobacterium pEESH80, pCESH80 и pESH83 способны с относительно высокой эффективностью трансформировать реципиентный штамм бифидобактерий Bifidobacterium breve UCC2003.

5. Клонирование гетерологичных генов FGF2, IL10 и атуВ совместно с гомологичными регуляторными элементами бифидобактерий (промоторами Рhup и Рgap, терминатором Тhup, последовательностью сигнального пептида sec2) в разработанные нами векторные плазмиды позволяет получать штаммы бифидобактерий — продуценты рекомбинантных белков с ценными терапевтическими свойствами.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Шкопоров, Андрей Николаевич, 2008 год

1. Барзашка-Попова С.Н. Коррекция микрофлоры и местного иммунитета кишечника при дитсбактериозах с помощью лактобацилл. Автореф. дисс. на соискание уч. степени канд. мед. наук. М., 1990.- 24 с.

2. Бондарешсо В.М. Прикладные аспекты молекялярной биологии бифидо- и лактобактерий. Журнал Микробиологии Эпидемиологии и Иммунобиологии. 2006, Март-Апрель; (2):89-97.

3. Володин Н.Н., Коршунов В.М., Гладько И.А., Кафарская Л.И., Сидоров А.А., Ахметова Л.М. Влияние микрофлоры родовых путей беременных на течение периода новорожденности недоношенных детей. Вопросы охраны материнства и детства. 1986,- 31. 3. с. 53-56.

4. Гончарова Г.И. Бифидофлора человека, её защитная роль в организме и обоснование сфер применения препарата бифидумбактерин. Автореф. дисс. на соискание уч. степени докт. биол. наук. М., 1982.

5. Коршунов В.М., Смеянов В.В., Ефимов Б.А. Рациональные подходы к проблеме коррекции микрофлоры кишечника. Вестник Российской академии медицинских наук. 1996. № 2, с. 60-64.

6. Aires J., Doucet-Populaire F., Butel M.J. Tetracycline resistance mediated by tet(W), tet(M), and tet(O) genes of Bifidobacterium isolates from humans. Appl Environ Microbiol. 2007 Apr;73(8):2751-4. Epub 2007 Feb 16.

7. Altschul S., Madden Т., Schaffer A., Zhang J., Zhang Z„ Miller W„ and Lipman D. 1997, Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402

8. Altwegg M. La biotherapie dans la diarrhee. Der Informiete Arz. 1992.- 13. P. 1-16.

9. Alvarez-Martin P., Florez A.B., Mayo B. Screening for plasmids among human bifidobacteria species: Sequencing and analysis of pBCl from Bifidobacterium catenulatum L48. Plasmid. 2007 Mar,57(2): 165-74.

10. Argnani A., Leer R.J., van Luijk N., Pouwels P.H. A convenient and reproducible method to genetically transform bacteria of the genus Bifidobacterium. Microbiology. 1996 Jan;142 ( Pt 1): 109-14.

11. Backhed F., Ilornef M. Toll-like receptor 4-mediated signaling by epithelial surfaces: necessity or threat? Microbes Infect. 2003 Sep;5(ll):951-9.

12. Barbara G., Xing Z., Hogaboam C.M., Gauldie J., Collins S.M. Interleukin 10 gene transfer prevents experimental colitis in rats. Gut. 2000 Mar;46(3):344-9.

13. Bassam B.J., Caetano-Anolles G., Gresshoff P.M. DNA amplification fingerprinting of bacteria. Appl Microbiol Biotechnol. 1992 Oct;38(l):70-6.

14. Belury M.A. Inhibition of carcinogenesis by conjugated linoleic acid: potential mechanisms of action. J Nutr. 2002 Oct;132(10):2995-8.

15. Bernet M.F., Brassart D., Neeser J.R., Servin A.L. Adhesion of human bifidobacterial strains to cultured human intestinal epithelial cells and inhibition of enteropathogen-cell interactions. Appl Environ Microbiol. 1993 Dec;59(12):4121-8.

16. Birnboim H.C., Doly J., 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. Nov 24;7(6): 1513-23.

17. Blomberg L.A., Henriksson P.L. Conway. Inhibition of adhesion of Escherichia coli K88 to piglet ileal mucus by Lactobacillus spp. Appl Environ Microbiol. 1993. 59: 34-39.

18. Boom R., Sol C.J., Salimans M.M., Jansen C.L., Wertheim-van Dillen P.M., van der Noordaa J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol.1990 Маг;28(3):495-503.

19. Bourget N., Simonet J.M., Decaris B. Analysis of the genome of the five Bifidobacterium breve strains: plasmid content, pulsed-field gel electrophoresis genome size estimation and rrn loci number. FEMS Microbiol Lett. 1993 Jun l;110(l):ll-20.

20. Buck B.L., Altermann E., Svingerud Т., Klaenhammer T.R. Functional analysis of putative adhesion factors in Lactobacillus acidophilus NCFM. Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8344-51.

21. Chapman T.M., Plosker G.L., Figgitt D.P. VSL#3 probiotic mixture: a review of its use in chronic inflammatory bowel diseases. Drugs. 2006;66(10): 1371-87.

22. Cohen S.N., Chang A.C., Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. Proc Natl Acad Sci USA. 1972 Aug;69(8):2110-4.

23. Collado M.C., Hernandez M., Sanz Y. Production of bacteriocin-like inhibitory compounds by human fecal Bifidobacterium strains. J Food Prot. 2005 May;68(5): 1034-40.

24. Corneau N., Emond E., LaPointe G., 2004. Molecular characterization of three plasmids from Bifidobacterium longum. Plasmid. Mar;51(2):87-100.

25. Cronin M., Knobel M., O'Connell-Motherway M., Fitzgerald G.F., van Sinderen D. Molecular dissection of a bifidobacteria! replicon. Appl Environ Microbiol. 2007 Dec;73(24):7858-66.

26. Datta N., Hedges R.W., Shaw E.J., Sykes R.B., Richmond M.H. Properties of an R factor from Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 1971 Dec;108(3): 1244-9.

27. Davies J., Jacob F. Genetic mapping of the regulator and operator genes of the lac operon. J Mol Biol. 1968 Sep 28;36(3):413-7.

28. De Dea Lindner J, Canchaya C, Zhang Z, Neviani E, Fitzgerald GF, van Sinderen D, Ventura M. Exploiting Bifidobacterium genomes: the molecular basis of stress response. Int J Food Microbiol. 2007 Nov 30;120(l-2):13-24. Epub 2007 Jun 14.

29. Del Solar G., Giraldo R., Ruis-Echevarria M.J., Espinosa M., Dias-Orejas R. 1998.

30. Replication and control of circular bacterial plasmids. Microbiol Mol Biol Rev June, 62(2): 434-464

31. Dieye Y, Usai S, Clier F, Gruss A, Piard JC. Design of a protein-targeting system for lactic acid bacteria. J Bacteriol. 2001 Jul;183(14):4157-66.

32. Dower WJ, Miller JF, Ragsdale CW. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res. 1988 Jul ll;16(13):6127-45.

33. Ducote MJ, Prakash S, Pettis GS. Minimal and contributing sequence determinants of the cis-acting locus of transfer (clt) of streptomycete plasmid pUlOl occur within an intrinsically curved plasmid region. J Bacteriol. 2000 Dec;182(23):6834-41.

34. Ferrari FA, Nguyen A, Lang D, Hoch JA. Construction and properties of an integrable plasmid for Bacillus subtilis. J Bacteriol. 1983 Jun;154(3): 1513-5.

35. Fogh J, Wright WC, Loveless JD. Absence of HeLa cell contamination in 169 cell lines derived from human tumors. J Natl Cancer Inst. 1977 Feb;58(2):209-14.

36. Fu G.F., Li X., Hou Y.Y., Fan Y.R., Liu W.H., Xu G.X., 2005. Bifidobacterium longum as an oral delivery system of endostatin for gene therapy on solid liver cancer. Cancer Gene Ther. Feb;12(2): 133-40.

37. Fuller R. Probiotics in man and animals. J. Appl. Bacteriol. 1989. 66: 365-378.

38. Gionchetti P., Rizzello F., Venturi A., Campieri M. Probiotics in infective diarrhoea and inflammatory bowel diseases. J Gastroenterol Hepatol. 2000,15:5, 489-93.

39. Gospodarowicz D. Isolation and characterization of acidic and basic fibroblast growth factor. Methods Enzymol. 1987;147:106-19.

40. Grohmann, E., Muth, G., Espinosa, M., Conjugative plasmid transfer in gram-positive bacteria. Microbiol Mol Biol Rev. 2003. 67,277-301.

41. Guglielmetti, S., Karp, M., Mora, D., Tamagnini, I., Parini, C., Molecular characterization of Bifidobacterium longum biovar longum NAL8 plasmids and construction of a novel replicon screening system. Appl Microbiol Biotechnol. 2007. 74, 1053-61.

42. Gunncriusson E, Samuelson P, Uhlen M, Nygren PA, Stahl S. Surface display of a functional single-chain Fv antibody on staphylococci. J Bacteriol. 1996 Mar,178(5): 1341-6.

43. Ilaarman M, Knol J. Quantitative real-time PCR assays to identify and quantify fecal Bifidobacterium species in infants receiving a prcbiotic infant formula. Appl Environ Microbiol. 2005 May;71(5):2318-24.

44. Ilacia JG. Resequencing and mutational analysis using oligonucleotide microarrays. Nat Genet. 1999 Jan;21(l Suppl):42-7.

45. He F, Morita H, Ouwehand AC, Hosoda M, Hiramatsu M, Kurisaki J, Isolauri E, Benno Y, Salminen S. Stimulation of the secretion of pro-inflammatory cytokines by Bifidobacterium strains. Microbiol Immunol. 2002;46(ll):781-5.

46. Heyman M. Effect of a probiotic on the intestinal barrier in a model of allergy to milk proteins of the cow. Arch Pediatr 2000 May 7 Suppl 2: 249s-251s.

47. Hirayama K., Rafter J. The role of probiotic bacteria in cancer prevention. Microbes Infect 2000, 2:6, 681-6.

48. Horinouchi S., Weisblum В., 1982. Nucleotide sequence and functional map of pC194, a plasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance. J Bacteriol. May, 150(2):815-25

49. Horinouchi S., Weisblum В., 1982. Nucleotide sequence and functional map of pE194, a plasmid that specifies inducible resistance to macrolide, lincosamide, and streptogramin type В antibodies. J Bacteriol, May, 150(2):804-14

50. Ilyina TV, Koonin EV. Conserved sequence motifs in the initiator proteins for rolling circle DNA replication encoded by diverse replicons from eubacteria, eucaryotes and archaebacteria. Nucleic Acids Res. 1992 Jul ll;20(13):3279-85.

51. Isolauri E., Joensuu J., Suomalainen H., Luomala M., Vesikari T. Improved immunogenisity of oral D x RRV reasistant rotavirus vaccine by Lactobacillus casei GG. Vaccine. 1995 13,P. 313-312.

52. Ji GE, Han HK, Yun SW, Rhim SL Isolation of amylolytic Bifidobacterium sp. Int-57 and characterization of amylase. J. Microbiol. Biotechnol. (1992) 2: 85-91. ,

53. Kailasapathy K., J. Chin. Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp. Immunol. Cell Biol. 2000.78(l):80-88.

54. Khan SA. Plasmid rolling-circle replication: highlights of two decades of research. Plasmid. 2005 Mar;53(2): 126-36. Epub 2005 Jan 22.

55. Kimura NT, Taniguchi S, Aoki K, Baba T. Selective localization and growth of Bifidobacterium bifidum in mouse tumors following intravenous administration. Cancer Res. 1980 Jun;40(6):2061-8.

56. Kindberg С, Suttie JW, Uchida K, Hirauchi K, Nakao H. Menaquinone production and utilization in germ-free rats after inoculation with specific organisms. J Nutr. 1987 Jun;117(6): 1032-5.

57. Klijn A, Moine D, Delley M, Mercenier A, Arigoni F, Pridmore RD. Construction of a reporter vector for the analysis of Bifidobacterium longum promoters. Appl Environ Microbiol. 2006 Nov;72(ll):7401-5. Epub 2006 Sep 22.

58. Knoerzer W, Binder IIP, Schneider K, Gruss P, McCarthy JE, Risau W. Expression of synthetic genes encoding bovine and human basic fibroblast growth factors (bFGFs) in Escherichia coli. Gene. 1989 Jan 30;75(l):21-30.

59. Kojima T, Watanabe T, Hata K, Nagawa H. Basic fibroblast growth factor enema improves experimental colitis in rats. Hepatogastroenterology. 2007 Jul-Aug;54(77): 1373-7.

60. Kullen MJ, Klaenhammer TR. Genetic modification of intestinal lactobacilli and bifidobacteria. Curr Issues MolBiol. 2000 Apr;2(2):41-50.

61. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970 Aug 15;227(5259):680-5.

62. Le Loir Y, Nouaille S, Commissaire J, Bretigny L, Gruss A, Langella P. Signal peptide and propeptide optimization for heterologous protein secretion in Lactococcus lactis. Appl Environ Microbiol. 2001 Sep;67(9):4119-27.

63. Lee J.H., O'Sullivan D.J., 2006. Sequence analysis of two cryptic plasmids from Bifidobacterium longum DJOIOA and construction of a shuttle cloning vector. Appl Environ Microbiol. Jan;72(l):527-35.

64. Lee SK, Kim YB, Ji GE. Note: purification of amylase secreted from Bifidobacterium adolescentis. J Appl Microbiol. 1997 Sep;83(3):267-72.

65. Leenhouts, K.J., Kok, J. & Venema, G. 1990. Stability of intergrated plasmids in the chromosome of Lactococcus lactis. Appl Environ Microbiol 56: 2726-2735.

66. Lewin B. Genes УШ. 2004. Pearson Prentice Hall. New Jersey.

67. Li MC, He SH. IL-10 and its related cytokines for treatment of inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 2004 Mar l;10(5):620-5.

68. Lidbeck A, Edlund C, Gustafsson JA, Kager L, Nord CE. Impact of Lactobacillus acidophilus on the normal intestinal microflora after administration of two antimicrobial agents. Infection. 1988;16(6):329-36.

69. Maas RM, Gotz J, Wohlleben W, Muth G. The conjugative plasmid pSG5 from Streptomyces ghanaensis DSM 2932 differs in its transfer functions from other Streptomyces rolling-circle-type plasmids. Microbiology. 1998 Oct; 144 (Pt 10):2809-17.

70. MacConaill LE, Fitzgerald GF, Van Sinderen D. 2003. Investigation of protein export in Bifidobacterium breve UCC2003. Appl Environ Microbiol. Dec;69(12):6994-7001.

71. Maj JG, Paris F, Haimovitz-Friedman A, Venkatraman E, Kolesnick R, Fuks Z. Cancer Res. 2003 Aug 1;63(15):4338-41. Microvascular function regulates intestinal crypt response to radiation.

72. Margolles A, Florez AB, Moreno JA, van Sinderen D, de los Reyes-Gavilan CG. Two membrane proteins from Bifidobacterium breve UCC2003 constitute an ABC-type multidrug transporter. Microbiology. 2006 Dec;152(Pt 12):3497-505.

73. Martin MC, Alonso JC, Suarez JE, Alvarez MA. Generation of food-grade recombinant lactic acid bacterium strains by site-specific recombination. Appl Environ Microbiol. 2000 Jun;66(6):2599-604.

74. Masco L, Huys G, Gevers D, Verbrugghen L, Swings J. Identification of Bifidobacterium species using rep-PCR fingerprinting. Syst Appl Microbiol. 2003 Nov;26(4):557-63.

75. Mathys S, von Ah U, Lacroix C, Staub E, Mini R, Cereghetti T, Meile L. Detection of the pediocin gene pedA in strains from human faeces by real-time PCR and characterization of Pediococcus acidilactici UVA1. BMC Biotechnol. 2007 Sep 12;7:55.

76. Matsuki T, Watanabe K, Fujimoto J, Takada T, Tanaka R. Use of 16S rRNA gene-targetedgroup-specific primers for real-time PCR analysis of predominant bacteria in human feces. Appl Environ Microbiol. 2004 Dec;70(12):7220-8.

77. Matsuki Т., Watanabe K., Tanaka R., Fukuda M., Oyaizu H., 1999. Distribution of bifidobacterial species in human intestinal microflora examined with 16S rRNA-gene-targeted species-specific primers. Appl Environ Microbiol. 0ct;65(10):4506-12.

78. Matsumura H, Takeuchi A, Kano Y. Construction of Escherichia coli-Bifidobacterium longum shuttle vector transforming B. longum 105-A and 108-A. Biosci Biotechnol Biochem. 1997 Jul;61(7):12U-2.

79. Mattarelli P, Biavati B, Alessandrini A, Crociani F, Scardovi V. Characterization of the plasmid pVS809 from Bifidobacterium globosum. New Microbiol. 1994 Oct;17(4):327-31.

80. Mattarelli P, Biavati B, Crociani F, Scardovi V, Prati G. Bifidobacterial cell wall proteins (BIFOP) in Bifidobacterium globosum. Res Microbiol. 1993 Sep;144(7):581-90.

81. Mattarelli P, Biavati B, Pesenti M, Crociani F. Effect of growth temperature on the biosynthesis of cell wall proteins from Bifidobacterium globosum. Res Microbiol. 1999 Mar; 150(2): 117-27.

82. Matteuzzi D, Brigidi P, Rossi M, Di D. Characterization and molecular cloning of Bifidobacterium longum cryptic plasmid pMBl. Lett Appl Microbiol. 1990 Oct;ll(4):220-3.

83. Matteuzzi D, Crociani F, Brigidi P. Antimicrobial susceptibility of Bifidobacterium. Ann Microbiol (Paris). 1983 May-Jun;134A(3):339-49.

84. Matto J, Malinen E, Suihko ML, Alander M, Palva A, Saarela M. Genetic heterogeneity and functional properties of intestinal bifidobacteria. J Appl Microbiol. 2004;97(3):459-70.

85. Mazodier P., Petter R., Thompson C., 1989. Intergeneric conjugation between Escherichia coli and Streptomyces species. J Bacteriol. June, 171(6):3583-5.

86. Missich R, Sgorbati B, LeBlanc DJ. Plasmid. . Transformation of Bifidobacterium longum with pRM2, a constructed Escherichia coli-B. longum shuttle vector. 19941. Sep;32(2):208-ll

87. Mitsuoka, Т., 1990. Bifidobacteria and their role in human health. J. Ind. Microbiol. 6, 263-268.

88. Moon G.S., Pyun Y.R., Park M.S., Ji G.E., Kim W.J., 2005. Secretion of recombinant pediocin PA-1 by Bifidobacterium longum, using the signal seguense for bifidobacterial A-amylase. Appl Environ Microbiol. Sept;p.5630-5632.

89. Moreau M.C. Intestinal flora, probiotics and effects on the intestinal IgA immune response. Arch Pediatr. 2000,7 Suppl, 2: 247s-248s.

90. Morita H, He F, Fuse T, Ouwehand AC, Hashimoto H, Hosoda M, Mizumachi K, Kurisaki J. Adhesion of lactic acid bacteria to caco-2 cells and their effect on cytokine secretion. Microbiol Immunol. 2002;46(4):293-7.

91. Muth, G., Farr, M., Hartmann, V., Wohlleben, W., Streptomyces ghanaensis plasmid pSG5: nucleotide sequence analysis of the self-transmissible minimal replicon and characterization of the replication mode. Plasmid. 1995. 33,113-26.

92. Navarre WW, Schneewind O. Surface proteins of gram-positive bacteria and mechanisms of their targeting to the cell wall envelope. Microbiol Mol Biol Rev. 1999 Mar;63(1): 174-229.

93. Noda H, Akasaka N, Ohsugi M. Biotin production by bifidobacteria. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 1994 Apr,40(2): 181-8.

94. Orban JI, Patterson JA. Modification of the phosphoketolase assay for rapid identification of bifidobacteria. J Microbiol Methods. 2000 May;40(3):221-4

95. O'Riordan K., Fitzgerald G.F., 1999. Molecular characterisation of a 5.75-kb cryptic plasmid from Bifidobacterium breve NCFB 2258 and determination of mode of replication. FEMS Microbiol Lett. May 15;174(2):285-94.

96. Ornitz DM, Itoh N. Fibroblast growth factors. Genome Biol. 2001;2(3):REVIEWS3005. Epub 2001 Mar 9.

97. Ouwehand AC, Isolauri E, Kirjavainen PV, Salminen SJ. Adhesion of four Bifidobacterium strains to human intestinal mucus from subjects in different age groups.

98. FEMS Microbiol Lett. 1999 Mar l;172(l):61-4.

99. Paris F, Fuks Z, Kang A, Capodieci P, Juan G, Ehleiter D, Haimovitz-Friedman A, Cordon-Cardo C, Kolesnick R. Endothelial apoptosis as the primary lesion initiating intestinal radiation damage in mice. Science. 2001 Jul 13;293(5528):293-7.

100. Park KB, Ji GE, Park MS, Oh SH. Expression of rice glutamate decarboxylase in Bifidobacterium longum enhances gamma-aminobutyric acid production. Biotechnol Lett. 2005 Nov;27(21): 1681 -4.

101. Park M.S., Shin D.W., Lee K.H., Ji G.E., 1999. Sequence analysis of plasmid pKJ50 from Bifidobacterium longum. Microbiology. Mar;145 (Pt 3):585-92.

102. Park M.S., Shin D.W., Lee K.H., Ji G.E., 2000. Charactacterization of plasmid pKJ36 from Bifidobacterium longum and construction of an E. coli-Bifidobacterium shutlle vector. J Microbiol Biotechnol. 10:312-320.

103. Park MS, Kwon B, Shim JJ, Huh CS, Ji GE. Heterologous expression of cholesterol oxidase in Bifidobacterium longum under the control of 16S rRNA gene promoter of bifidobacteria. Biotechnol Lett. 2008 Jan;30(l): 165-72. Epub 2007 Sep 12.

104. Park MS, Kwon B, Shim JJ, Huh CS, Ji GE. Heterologous expression of cholesterol oxidase in Bifidobacterium longum under the control of 16S rRNA gene promoter of bifidobacteria. Biotechnol Lett. 2008 Jan;30(l): 165-72. Epub 2007 Sep 12.

105. Park MS, Lee KH, Ji GE. Isolation and characterization of two plasmids from Bifidobacterium longum. Lett Appl Microbiol. 1997 Jul;25(l):5-7.

106. Parke D. 1990. Construction of mobilizable vectors derived from plasmids RP4, pUC18 and pUC19. Gene. Sep l;93(l):135-7.

107. Perez PF, Minnaard Y, Disalvo EA, De Antoni GL. Surface properties of bifidobacterial strains of human origin. Appl Environ Microbiol. 1998 Jan;64(l):21-6.

108. Pettis GS, Cohen SN. Unraveling the essential role in conjugation of the Tra protein of Streptomyces lividans plasmid pIJlOl. Antonie Van Leeuwenhoek. 2001 Sep;79(3-4):247-50.

109. Platteeuw C, Simons G, de Vos WM. Use of the Escherichia coli beta-glucuronidase (gusA) gene as a reporter gene for analyzing promoters in lactic acid bacteria. Appl Environ Microbiol. 1994 Feb;60(2):587-93.

110. Pompei A, Cordisco L, Amaretti A, Zanoni S, Matteuzzi D, Rossi M. Folate production by bifidobacteria as a potential probiotic property. Appl Environ Microbiol. 2007

111. Jan;73(l): 179-85. Epub 2006 Oct 27.

112. Ravn P, Arnau J, Madsen SM, Vrang A, Israelsen H. Optimization of signal peptide SP310 for heterologous protein production in Lactococcus lactis. Microbiology. 2003 Aug;149(Pt 8):2193-201.

113. Reddy BS, Rivenson A. Inhibitory effect of Bifidobacterium longum on colon, mammary, and liver carcinogenesis induced by 2-amino-3-methylimidazo4,5-f.quinoline, a food mutagen. Cancer Res. 1993 Sep l;53(17):3914-8.

114. Reuther J, Wohlleben W, Muth G. Modular architecture of the conjugative plasmid pSVHl from Streptomyces venezuelae. Plasmid. 2006 May;55(3):201-9. Epub 2006 Jan 24.

115. Reyes Escogido ML, De Le6n Rodriguez A, Barba de la Rosa AP. A novel,binary expression vector for production of human IL-10 in Escherichia coli and Bifidobacterium longum. Biotechnol Lett. 2007 Aug;29(8): 1249-53. Epub 2007 May 9.

116. Rhim SL, Park MS, Ji GE. Expression and secretion of Bifidobacterium adolescentis amylase by Bifidobacterium longum. Biotechnol Lett. 2006 Feb;28(3): 163-8

117. Roberfroid M.B. Prebiotics and probiotics: are they functional foods? Am J Clin Nutr 2000,71:6, Suppl, 1682S-7S; discussion 1688S-90S

118. Roffe C. Biotherapy for antibiotic associated and other diarrhoeas. J.Infect. 1996.- 32. P. 1-10.

119. Rossi M, Brigidi P, Gonzalez Vara у Rodriguez A, Matteuzzi D. Characterization of the plasmid pMBl from Bifidobacterium longum and its use for shuttle vector construction. Res Microbiol. 1996 Mar-Apr;147(3): 133-43.

120. Rud I, Jensen PR, Naterstad K, Axelsson L. A synthetic promoter library for constitutive gene expression in Lactobacillus plantarum. Microbiology. 2006 Apr;152(Pt 4):1011-9.

121. Ryan SM, Fitzgerald GF, van Sinderen D. Screening for and identification of starch-,amylopectin-, and pullulan-degrading activities in bifidobacterial strains. Appl Environ Microbiol. 2006 Aug;72(8):5289-96.

122. Sakata S, Kitahara M, Sakamoto M, Hayashi H, Fukuyama M, Benno Y. Unification of Bifidobacterium infantis and Bifidobacterium suis as Bifidobacterium longum. Int J Syst Evol Microbiol. 2002 Nov;52(Pt 6):1945-51.

123. Sambrook J., Russell D.W. Molecular cloning: a laboratory manual. 2001. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

124. Sanders JW, Leenhouts K, Burghoorn J, Brands JR, Venema G, Kok J. A chloride-inducible acid resistance mechanism in Lactococcus lactis and its regulation. Mol Microbiol. 1998 Jan;27(2):299-310.

125. Satokari RM, Vaughan EE, Akkermans AD, Saarela M, de Vos WM. Bifidobacterial diversity in human feces detected by genus-specific PCR and denaturing gradient gel electrophoresis. Appl Environ Microbiol. 2001 Feb;67(2):504-13.

126. Schafer A., Kalinowski J., Simon R., Seep-Feldhaus A.H., Puhler A., 1990. High-Frequency conjugal plasmid transfer from Gram-negative Escherichia coli to various Gram-positive coryneform bacteria. J Bacteriol. Mar, 172(3): 1663-6.

127. Schurch C. 2002. Development of a novel DNA transformation system for bifidobacteria.

128. Ph.D. thesis. Swiss federal institute of technology, Zurich.

129. Servin-Gonzalez, L., Relationship between the replication functions of Streptomyces plasmids pJVl and pUlOl. Plasmid. 1993.30,131-40.

130. Sgorbati B, Scardovi V, Leblanc DJ. Related structures in the plasmid profiles of Bifidobacterium asteroides, B. indicum and B. globosum. Microbiologica. 1986 Oct;9(4):443-54.

131. Sgorbati B, Scardovi V, Leblanc DJ. Related structures in the plasmid profiles of Bifidobacterium longum. Microbiologica. 1986 Oct;9(4):415-22.

132. Sgorbati В., Scardovi V., Leblanc D.J., 1982. Plasmids in the genus Bifidobacterium. J Gen Microbiol. Sep;128(9):2121-31.

133. Simon GL, Gorbach SL. The human intestinal microflora. Dig Dis Sci. 1986 Sep;31(9 Suppl):147S-162S

134. Simon, R., M. O'Connell, M. Labes, and A. Pthler. 1986. Plasmid vectors for the genetic analysis and manipulation of Rhizobia and other gram-negative bacteria. Methods Enzymol. 118:640-659.

135. Smeianov VV, Efimov BA, Korschunov VM, and Steele JL. Construction of the Bifidobacterium-E. coli shuttle vectors based on two distinctive Bifidobacterium replicons. Материалы конференции ASM Meeting 2002.

136. Snyder L., Champness W. Molecular Genetics of Bacteria. 2002. ASM Press. Washington, DC.

137. Sridhar VR, Smeianov VV, Steele JL. Construction and evaluation of food-grade vectors for Lactococcus lactis using aspartate aminotransferase and alpha-galactosidase as selectable markers. J Appl Microbiol. 2006 Jul; 101(1): 161-71.

138. Steidler L, Hans W, Schotte L, Neirynck S, Obermeier F, Falk W, Fiers W, Remaut E. Treatment of murine colitis by Lactococcus lactis secreting interleukin-10. Science. 2000 Aug 25;289(5483):1352-5.

139. Steidler L, Viaene J, Fiers W, Remaut E. Functional display of a heterologous protein on the surface of Lactococcus lactis by means of the cell wall anchor of Staphylococcus aureus protein A. Appl Environ Microbiol. 1998 Jan;64(l):342-5.

140. Steidler L, Wells JM, Raeymaekers A, Vandekerckhove J, Fiers W, Remaut E. Secretion of biologically active murine interleukin-2 by Lactococcus lactis subsp. lactis. Appl Environ Microbiol. 1995 Apr;61 (4): 1627-9.

141. Suzuki I, Kataoka M, Seki T, Yoshida T. Three single-strand origins located on both strands of the Streptomyces rolling circle plasmid pSN22. Plasmid. 1997;37(l):51-64.

142. Takeuchi A, Matsumura H, Kano Y. Cloning and expression in Escherichia coli of a gene, hup, encoding the histone-like protein HU of Bifidobacterium longum. Biosci Biotechnol Biochem. 2002 Mar;66(3):598-603.

143. Takeuchi A, Matsumura H, Kano Y. Cloning and expression in Escherichia coli of a gene, hup, encoding the histone-like protein HU of Bifidobacterium longum. Biosci Biotechnol Biochem. 2002Mar;66(3):598-603.

144. Tanaka H, Hashiba H, Kok J, Mierau I. Bile salt hydrolase of Bifidobacterium longum-biochemical and genetic characterization. Appl Environ Microbiol. 2000 Jun;66(6):2502-12.

145. Tanaka K., Samura K., Kano Y., 2005. Structural and functional analysis of pTB6 from Bifidobacterium longum. Biosci Biotechnol Biochem. Feb;69(2):422-5.

146. Tannock GW. Identification of lactobacilli and bifidobacteria. Curr Issues Mol Biol. 1999;l(l-2):53-64.

147. Van der Werf MJ, Venema K. Bifidobacteria: genetic modification and the study of their role in the colon. J Agric Food Chem. 2001 Jan;49(l):378-83.

148. Ventura M, Canchaya C, Bernini V, Del Casale A, Dellaglio F, Neviani E, Fitzgerald GF, van Sinderen D. Genetic characterization of the Bifidobacterium breve UCC 2003 hrcA locus. Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8998-9007.

149. Ventura M, Fitzgerald GF, van Sinderen D. Genetic and transcriptional organization of the clpC locus in Bifidobacterium breve UCC 2003. Appl Environ Microbiol. 2005 0ct;71(10):6282-91.

150. Ventura M, Kenny JG, Zhang Z, Fitzgerald GF, van Sinderen D. The clpB gene of Bifidobacterium breve UCC 2003: transcriptional analysis and first insights into stress induction. Microbiology. 2005 Sep;151(Pt 9):2861-72.

151. Ventura M, Zhang Z, Cronin M, Canchaya C, Kenny JG, Fitzgerald GF, van Sinderen D. The ClgR protein regulates transcription of the clpP operon in Bifidobacterium breve UCC 2003. J Bacteriol. 2005 Dec;187(24):8411-26.

152. Vincent D, Roy D, Mondou F, Dery C. Characterization of bifidobacteria by random185.186.187.188. 189.

153. DNA amplification. Int J Food Microbiol. 1998 Sep 8;43(3):185-93.

154. Yanisch-Perron C., Vieira J., Messing J. 1985. Improved M13 phage cloning vectors andhost strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors Gene 33:103-119.

155. Yildirim Z, Johnson MG. Characterization and antimicrobial spectrum of bifidocin В, abacteriocin produced by Bifidobacterium bifidum NCFB 1454. J Food Prot. 19981. Jan;61(l):47-51.

156. Yildirim Z, Winters DK, Johnson MG. Purification, amino acid sequence and mode of action of bifidocin В produced by Bifidobacterium bifidum NCFB 1454. J Appl Microbiol. 1999 Jan;86(l):45-54.