Участок внутренней посадки рибосом гена белка оболочки вируса табачной мозаики крестоцветных тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Комарова, Татьяна Валерьевна

• Комарова, Татьяна Валерьевна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Комарова, Татьяна Валерьевна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ТОБАМОВИРУСЫ: СТРУКТУРА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИЯ.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГРУППЫ ТОБАМОВИРУСОВ.

КЛАССИФИКАЦИЯ ТОБАМОВИРУСОВ.

ИЕТРАИСЛИРУЕМЫЕ ОБЛАСТИ РНК ТОБАМОВИРУСОВ.

5 '-концевая нетранслируемая область геномной РНК тобамовирусов.

3 '-нетранслируемая область тобамовирусов.

РЕПЛИКА ТИВНЫЕ БЕЛКИ.

Участие 126 и 183К белков в репликации РНК и супрессия атЬег-кодона.

Метилтрансферазный домен.

NTP-связывающий хеликазный домен.

Домен РНК-зависимой РНК-полимеразы.

Предполагаемый 54К белок.

ТРАНСПОРТНЫЙ БЕЛОК.

ТБувеличивает пропускную способность плазмодесм.

ТБ неспецифически связывается с вирусной РНК in vitro и in vivo и ингибирует ее трансляцию.

ТБ связывается с компонентами цитоскелета,протеинкиназой клеточной стенки и пектжметилэстеразой.

ТБ подавляет «умолкание» генов.

БЕЛОК ОБОЛО ЧКИ.

Белок оболочки тобамовирусов необходим для дальнего транспорта по сосудистой системе растения.

Роль БО в образованиирепликативных комплексов.

ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ крВТМ.

Белки 122К и 178К.

29К- Транспортный белок.

18К-Белок оболочки.

5 '-концевая нетранслируемая область.

3 '-концеваянетранслируемая область.

МЕХАНИЗМ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОМА ТОБАМОВИРУСОВ. субгеномизация.

ВНУТРЕННЯЯ ИНИЦИАЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

IREScp.148 выполняет функцию сайта связывания рибосомы Escherichia coli.

Тестирование IREScp,m в новом вирусном векторе, созданном на основе гетерологичного репликона ХВК.

IRESCp,i48 вносит вклад в общий синтез белка оболочки во время вирусной инфекции.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Участок внутренней посадки рибосом гена белка оболочки вируса табачной мозаики крестоцветных»

В 1992 году на кафедре вирусологии МГУ им. М.В.Ломоносова из Alliaria officinalis Andrz. (чесночница лекарственная) был выделен новый тобамовирус с расширенным кругом хозяев (crTMV, или крВТМ; В.К. Новиков, неопубликованные результаты). КрВТМ заметно отличается от типового штамма ВТМ vulgare и других известных тобамовирусов. Помимо Nicotiana tabacum L. (сем. Пасленовых), крВТМ системно заражает растения семейства Крестоцветных: Brassica chinensis L., В. rapa L., В. napus L., В. compestris L., Arabidopsis thaliana L. Очевидно, что изучение структуры и экспрессии генома крВТМ поможет расширить современные представления о проблемах видоспецифичности вирусной инфекции и устойчивости растений к вирусам. Дополнительный интерес к крВТМ связан с одним из его растений-хозяев - Arabidopsis thaliana. Благодаря простоте организации геном A. thaliana стал популярным объектом генетики растений и уже достаточно хорошо изучен, поэтому крВТМ весьма перспективен для изучения взаимодействий в системе хозяин-патоген.

В настоящей работе продолжено изучение механизма экспрессии гена белка оболочки (БО) крВТМ in vivo, в условиях вирусной инфекции, т.е. приближенных к естественным.

Известно, что БО тобамовирусов не только участвует в сборке вирионов, но и необходим для дальнего транспорта вируса по сосудистой системе растения (Dorokhov et al., 1984; Takamatsu et al., 1987; Osbourn et al., 1990; Holt and Beachy, 1991; Hilf and Dawson, 1993), а также взаимодействует с хозяйскими клеточными факторами (Saito et al., 1987, 1989; Knorr and Dawson, 1988; Culver and Dawson, 1989, 1991; Berzal-Herranz et al, 1995). Мутации в БО видоизменяют симптомы инфекции (Dawson et al, 1988). Кроме того, БО участвует в образовании репликативных комплексов (Azurmendi et al., 2004). Таким образом, особенности экспрессии гена БО могут оказаться одной из причин возникновения феномена расширенного круга растений-хозяев у крВТМ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ТОБАМОВИРУСЫ: СТРУКТУРА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИЯ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГРУППЫ ТОБАМОВИРУСОВ Объектом настоящего исследования является тобамовирус крестоцветных - представитель семейства тобамовирусов. Эта группа вирусов растений довольно хорошо изучена. В данном обзоре приведена лишь общая характеристика тобамовирусов, включающая в себя их классификацию, описание строения генома и си-действующих последовательностей, контролирующих репликацию и экспрессию генома вирусов этой группы.

Тобамовирусы относятся к суперсемейству Синдбис-подобных вирусов. Однонитевая смысловая (+)-РНК размером около 6400 нуклеотидов кэппирована на 5'-конце, а в 3'-концевой области образует тРНК-подобную структуру. Вирионы имеют палочковидную форму, содержат одну молекулу РНК, примерно 2140 субъединиц капсидного белка и представляют собой полый цилиндр длиной около 300 нм. Внешний диаметр вирусных частиц -примерно 20 нм, а внутренний - приблизительно 4 нм.

Как показано на рис.1, геном BTM-U1, типового представителя группы, содержит 4 открытые рамки трансляции и кодирует, по крайней мере, 3 неструктурных белка (126-, 183-, 30-кДа белки) и белок оболочки. 126- и 183К белки транслируются с одной и той же открытой рамки считывания (ОРТ1/2), причем 183К образуется за счет проскока слабого терминирующего атЬег-кодона UAG (Pelham, 1978). Предполагается также возможность синтеза 54К белка, кодируемого расположенной за amber-кодоном С-концевой частью гена 183К-белка (Sulzinski et al., 1985): была обнаружена соответствующая субгеномная РНК (сгРНК), ассоциированная с полисомами в листьях табака (Zaitlin, 1999), однако в зараженных растениях данный белок обнаружить не удалось (Carr et al., 1992; Zaitlin, 1999). геномная РНК •—

КЭП

ОРТ1

ОРТ2

ОРТ4

ОРТЗ

А* тРНКн,,

I 2«>К шк сгРНК

ОРТ4 т

ОРТЗ тРНК он гь сгРНК i I 0РТ4 I—"— он КЭП I тРНКо

His

ЬО

Рис. 1. Схема генома BTM-U1. ОРТ - открытая рамка трансляции. ТБ -транспортный белок, БО - белок оболочки, сгРНК - субгеномная РНК, tPHKhis - тРНК-подобная структура.

ОРТЗ, кодирующая ЗОК транспортный белок (ТБ), может перекрываться с ОРТ 1/2 (ВТМ); иногда подобное перекрывание отсутствует (Ob, PMMV-S). ОРТ4 соответствует 17.5К белку оболочки (БО). ТБ и БО выражаются с З'-котерминальных сгРНК.

Геномная РНК (гРНК) тобамовирусов кэппирована, 5'-нетранслируемая область (5'-НТО) составляет около 70 нуклеотидов (нт). Для большинства вирусов группы характерно отсутствие остатков гуанозина в этом районе. 5'-НТО является эффективным трансляционным энхансером (Gallie and Walbot, 1992). З'-НТО гРНК содержит около 200 нт. Она образует тРНК-подобную структуру (Rietveld et al., 1984) и, как правило, аминоацилируется гистидином (Oberg and Philipson, 1972; Carriquiry and Litvak, 1974). Единственное исключение - вирус мозаики конопли индийской (SHMV, или TMV-Cc, Meshi et al, 1981), присоединяющий валин (Beachy et al., 1976). Непосредственно перед тРНК-подобной структурой находится область из трех псевдоузлов (van Belcum et al, 1985; Garcia-Arenal, 1988). И 5'-HTO, и З'-НТО содержат cis-действующие элементы, необходимые для репликации (обзоры Buck, 1996,1999; Chandrika et al, 2000, Takamatsu et al, 1990,1991).

Участок инициации сборки вирионов - OA (origin of assembly) -локализуется в гене ТБ (TMV, Ob) или в гене БО (SHMV, CGMMV (вирус зеленой крапчатой мозаики огурцов, Ugaki et al, 1991)) (Otsuki et al, 1977; Zimmem, 1977; Fukuda et al, 1980, 1981). Если РНК имеет в своем составе OA, то она может упаковываться белком оболочки in vivo и in vitro с образованием псевдовирусных частиц (Bruening et al., 1976; Beachy and Zaitlin, 1977; Fukuda et al, 1980; Sulzinski et al, 1985).

КЛАССИФИКАЦИЯ ТОБАМОВИРУСОВ

Род Tobamovirus включает в себя более 20 видов. Тобамовирусы изначально были разделены на две (Fukuda et al., 1981), затем на три группы. Первоначально важным признаком для классификации было неодинаковое содержание триптофана и метионина в белках оболочки различных тобамовирусов. Gibbs (1986) отметил серьезные отличия между аминокислотными последовательностями БО вируса мозаики подорожника (RMV, Ribgrass mosaic vims, или Holmes' ribgrass virus, Holmes, 1941; Oshima et al, 1974) и остальных тобамовирусов, применяя этот дополнительный аргумент для подтверждения правомерности выделения RMV-подобных вирусов в отдельную субгруппу. Кроме того, важной отличительной чертой вирусов этой субгруппы является широкий круг растений-хозяев: они заражают более 50 видов растений в 10 семействах (Oshima and Harrison, 1975).

Новый критерий систематики был предложен Fraile и Garcia-Arenal (1990), для сравнения были выбраны неструктурные 126К-белки. Авторы выделили 3 кластера тобамовирусов: группа ВТМ, группа RMV и отдельно вирусы CGMMV и SHMV.

55

ToMY-JL (6W)

TMV lil Ш95>

TMfJMV

6355}

60 ^

FMMV.4 —4

6357) L

Ob

46507*

6S

-r

60

CKMMVSH

6-121} sirniv

OKSV i'6oiS)

1116

Hid

1111 lit?

114?

111?; 501 }) -ffl-M

Cyfrpyim la

Cvfapyirua lb

Суетой.

Рис. 2. Классификация тобамовирусов. Прямоугольниками обозначены ОРТ; цифры внутри ОРТ показывают количество аминокислотных остатков, а остальные цифры -размер 5' и З'-некодирующих областей в нуклеотидах. Общая протяженность генома вирусов указана в скобках рядом с названиями. Оа - участок начала сборки вирионов. Вирус ORSV пока не отнесен ни к одной из субгрупп (по Ikeda et al., 1993; с изменениями и дополнениями). Нижний блок включает представителей HR-группы.

В работе Takamatsu et al. (1983) указано на важность расположения OA внутри тобамовирусного генома. Выделение субгрупп 1 и 2 у тобамовирусов на основе локализации OA (соответственно в генах ТБ и БО) можно найти у Mattews (1991). После работы Ikeda et al. (1993) появилось определение субгрупп la, lb и 2 (рис. 2). Дополнительным признаком для сравнения здесь служит, помимо местонахождения OA, наличие или отсутствие взаимного перекрывания ОРТ генов 183К-репликазы и ТБ, а также генов ТБ и БО.

Интересно отметить, что все варианты классификации хорошо согласуются между собой, несмотря на использование различных критериев систематики. Так, например, при любом способе сравнения HR-группа (рис. 2) занимает среди тобамовирусов обособленное положение.

НЕТРАНСЛИРУЕМЫЕ ОБЛАСТИ РНК ТОБАМОВИРУСОВ

5'-концевая нетранслируемая область геномной РНК тобамовирусов

Кэп-структура и котрансляционная депротеинизацш вирионов. Геномная РНК (гРНК) тобамовирусов имеет на 5'-конце кэп-структуру - 7п метилгуанозин (m GpppG). Хорошо известна важность кэпа для стабильности мРНК и ее эффективной трансляции. Вирусная РНК ВТМ с удаленной кэп-структурой была значительно менее инфекционна при сравнении с исходным препаратом РНК (Ohno et al., 1976). 5'-нетранслируемая область ВТМ получила название Q-последовательность после опытов по деградации вирусной РНК с помощью РНКазы Т1 (Mandeles, 1968). 70-нуклеотидный фрагмент РНК не содержал остатков гуанозина (G) и легко поддавался выделению и изучению. Q была одной из первых секвенированных вирусных последовательностей (Richards et al, 1978). Отсутствие гуанозина в 5'-НТО характерно для всех тобамовирусов, за исключением вируса мягкой зеленой мозаики табака (G в позициях 4, 13, 19) и Ob (G в позиции 53). Данная особенность Q обуславливает низкий уровень вторичной структуры РНК в этом районе и, следовательно, слабое взаимодействие РНК с капсидным белком, что облегчает депротеинизацию вирионов (Namba et al., 1989; Mundry et al, 1991). 5'-HTO обладает способностью связываться как с прокариотическими 70S, так и с эукариотическими 80S рибосомами (Filipowicz and Haenni, 1979; Konarska et al., 1981).

Подобное свойство Q-последовательности является предпосылкой для котрансляционной "разборки" вирусных частиц, начинающейся с 5'-конца геномной РНК (Wilson, 1984, 1986; Shaw et al, 1986; Mundry et al, 1991).

Феномен депротеинизации с участием транслирующей рибосомы продемонстрирован в опытах in vitro (Wilson, 1984) и in vivo (Shaw et al., 1986).

Q-последовательность как трансляционный энхансер. Наиболее характерны для ^-последовательности мотив (САА)П и прямой повтор ACAAUUAC. Прямо показано, что 5'-НТО ВТМ связывает две 80S-рибосомы в присутствии спарсомицина; с помощью картирования удалось выявить сайт узнавания для одной из рибосом - им оказался триплет AUU (нуклеотиды 15-17 у ВТМ) (Туе et al., 1984). Необходимо отметить, что AUU-триплет входит в состав 8-нуклеотидного прямого повтора (см. выше). По данным Schmitz et al, (1996), AUU-триплеты в 5'-нетранслируемой области генома ВТМ могут играть роль стартовых ко донов для синтеза белка по неканоническому механизму инициации трансляции. Опыты по экспрессии 17К-белка лютеовируса скручивания листьев картофеля (PLRV) под контролем П-лидера ВТМ показали, что второй AUU-кодон (нуклеотиды 63-65 ВТМ), наравне с AUG-кодоном гена 17К, инициирует синтез белка как in vitro, так и in planta (в трансгенных растениях). Первый AUU-триплет (в другой рамке считывания) также обеспечивал эффективную трансляцию, по крайней мере, in vitro (Schmitz et al., 1996).

Роль Q-последовательности в усилении трансляции 5'-проксимальных ОРТ 1 и 2 ВТМ тщательно исследовалась в серии экспериментов с различными репортерными генами (CAT, NPT II, GUS и др.). Трансляция in vitro проводилась в эукариотических системах лизата ретикулоцитов кролика (JIPK), экстракта зародышей пшеницы (ЭЗП) и прокариотической системе S-30 из Е. coli. Выяснилось, что Q в системе ЭЗП заметно более эффективный энхансер для химерных РНК, чем в системе JIPK (Sleat et al., 1987; Gallie et al., 1987a). Отсутствие кэпа снижало уровень экспрессии репортерных генов в эукариотических системах так же, как и дополнительные последовательности полилинкерного происхождения между Q и исследуемым геном или на 5'-конце мРНК (Sleat et al., 1988). В прокариотической системе Q успешно заменяла мотив Шайна-Дальгарно (SD-мотив) (Shine and Dalgarno, 1974), хотя и уступала ему в эффективности (Sleat et al., 1987). Как и следовало ожидать, наличие кэпа и "лишние" векторные последовательности не играли существенной роли при трансляции в системе S30; с другой стороны, дупликация Q-последовательности в 3 раза повышала уровень экспрессии репортерного гена (Sleat et al., 1988).

Эксперименты in vivo также продемонстрировали энхансерную функцию Q. В протопластах двудольных растений выход белка по сравнению с контролем повышался в 18-80 раз (Gallie et al., 1987а, b; 1989), а в протопластах однодольных (рис, кукуруза) наблюдалось 3-17-кратное увеличение (Gallie et al., 1989). После микроинъекции ооцитов шпорцевой лягушки Xenopus laevis отмечалось 3-4-кратное превышение уровня экспрессии гена CAT с Q-лидером по сравнению с контрольной мРНК (Gallie et al, 1987а, b, с). В опытах с Е. coli для транскрипции in vivo гена GUS использовался гтр-промотер. Во всех исследуемых плазмидах отсутствовал SD-мотив; несмотря на это, Q-последовательность обеспечивала трансляцию репортерного гена (Gallie et al, 1987b; Gallie and Kado, 1989). В конструкциях с SD добавление Q-лидера практически не влияло на эффективность синтеза белка. Было высказано предположение, что SD и Q-последовательности в прокариотах могут быть функционально аналогичны, хотя уровень экспрессии под контролем Q был ниже, чем при наличии SD (Gallie and Kado, 1989). Мутагенез Q-лидера показал, что для энхансерной функции принципиально важен мотив (CAA)n (Gallie et al, 1988; Gallie and Walbot, 1992).

Значение Q-последовательности для репликации вирусного генома. Считается, что при репликации вируса (-)-вариант 5'-НТО несет важную информацию для инициации синтеза (+)-цепи. При определении небходимых для репликации участков лидерной последовательности был проведен мутагенез Q-лидера (Talcamatsu et al, 1991), показано, что 10 5'проксимальных нуклеотидов имеют решающее значение для успешного воспроизводства вируса.

3 '-нетранслируемая область тобамовирусов Для большинства тобамовирусов характерно наличие З'-нетранслируемой области протяженностью около 200-250 нуклеотидов, имеющей сложную конформацию: на 3'-конце геномная РНК образует тРНК-подобную структуру, которой предшествует область из трех-шести псевдоузлов. Рис. 3 показывает предполагаемую структуру области псевдоузлов ВТМ. В результате мутагенеза этого участка было выявлено, что, по крайней мере, 3'-проксимальный псевдоузел необходим для нормального воспроизводства вируса (Takamatsu et al., 1990). тРНК-подобная структура большинства тобамовирусов присоединяет или может присоединять гистидин (SHMV - единственный тобамовирус, присоединяющий валин; Beachy et al., 1976) и способна формировать псевдоузлы; ее строение отличается от клеточной гистидин-тРНК (Avila-Rincon et al, 1989; Garcia-Arenal et al, 1988; Rietveld et al, 1984; Van Belcum et al, 1985). Консервативность первичной и вторичной структуры 3'-некодирующих областей у различных вирусов подтверждает важную роль 3'-НТО при взаимодействии геномной (+)-РНК с репликазой (Haenni et al., 1982).

Считается, что тРНК-подобная структура необходима для специфического узнавания РНК-репликазой и начала синтеза (-)-цепи РНК на матрице геномной (+)-РНК. Удаление тРНК-подобной структуры в кДНК-копии BTM-U1 блокировало репликацию вирусного генома (Dawson et al, 1986).

-AAAUAU-6200 rUUU-j

IJIfU-j— GUGU J

I 9 9 9 • rcaca— -tuu- г/

J Lama—I

UUU-r GUGUJ rGCAJ-UGCAUGJ I i 1 tt« I

-AAA J Г-САГА

4UAAAA бгго 6360 AU I A UCCC-G им • С AGGG-i UU

UU—i -ccg-Lg

6380

•CCGi ^GGGGCCCAau

•99 9999 lGGC-t-CCCC-J -GAA—I

6340 I r-ACGUAC

AUA-6240

-1 rGUAAAAAAA-,

6260 jI ruuuuu 6260 pucac - - c-uccc-J L-cacgga

-agugjrg xggg-ua-gugucu A l

6280 uaaaucj

GCG

• M

CGC

-I--CGC

I-r-UGGAG ga-g'c 6300—и »

A-U

U-A-6320 A.y П t=t guu

Рис. 3. Предполагаемая структура области псевдоузлов З'-НТО ВТМ (по Takamatsu etal., 1990).

З'-НТО тобамовирусов играет важную роль не только в репликации, но и в трансляции. Подобно по ли-А участку, она обеспечивает кэп-зависимое усиление трансляции РНК тобамовирусов (Gallie and Walbot 1992, Leathers et al,1993)

РЕПЛИКАТИВНЫЕ БЕЛКИ Участие 130 и 180K белков в репликации РНК и супрессия amber-кодона. Две ближайшие к 5'-концу тобамовирусного генома ОРТ имеют общий старт и кодируют полипептиды с молекулярной массой 130 и 180 кДа. Эти белки транслируются непосредственно с геномной РНК (Pelham and Jackson, 1976) и выявляются на ранних стадиях вирусной инфекции (Watanabe et al., 1984а). Известно, что 180К белок образуется при проскоке слабого терминирующего атЬег-кодона UAG. Beier et al. (1984a,b) показали, что синтез 180К белка связан с супрессией UAG-кодона двумя тирозин-тРНК из цитоплазмы клеток табака. Эти тРНК содержат псевдоуридин в антикодоне G^FA; обычная тирозин-тРНК с антикодоном GUA не обеспечивала супрессии (Zerfass and Beier, 1992). Весьма важен нуклеотидный контекст атЬег-кодона: последовательность геномной РНК тобамовирусов в данном районе консервативна и выглядит следующим образом - UAG-CAA-UUA. Мутагенез двух триплетов непосредственно за amber-кодоном доказал, что они представляют собой необходимую часть сигнала для супрессии: консенсус UAG-CAa/g-u/cu/cA помогает преодолеть терминирующий ко дон с включением в состав 180К белка тирозина (Skuzeski et al, 1991).

180К (1616 АК) UAG CAAUUA nh ? ---- cooh met hel i pol (500 ak)

Tyr

130K (1116 AK) nh 2 cooh met hel

54 К (?)

-------I

Рис. 4. Схематическое изображение доменов репликазы тобамовирусов. МЕТ -метилтрансферазный домен, HEL - хеликазный домен, POL - домен РНК-зависимой РНК-полимеразы. Пунктиром обозначен потенциально образующийся 54 К белок.

Видимо, для супрессии важен не столько сам amber-кодон, сколько его нуклеотидное окружение. Предполагается, что при обычной эффективной репликации необходим сбалансированный синтез 130 и 180К белков в соотношении приблизительно 10-20/1 (Ishikawa et al, 1986). Это хорошо согласуется с данными Skuzeski et al. (1990) о примерно 5% эффективности проскока атЬег-кодона у вирусов растений. Интересно, что замена amber-кодона с целью предотвращения экспрессии 130К не приводит к повышению уровня накопления 180К или эффективности репликации, кроме того, эти мутантные варианты были способны реплицироваться в протопластах, однако, в 5-10 раз менее эффективно (Ishikawa et al., 1991; Lewandowski and

18

Dawson, 2000). Мутанты с удаленными генами ТБ и/или БО успешно реплицировались в протопластах табака (Meshi et al, 1987).

Метилтрансферазный домен. Крупные репликативные белки тобамовирусов имеют несколько функциональных центров. Воспроизводство вирусов с кэппированной геномной (+)-РНК требует участия клеточных или вирусспецифических метилтрансфераз. Соответствующий домен обнаружен при сравнении аминокислотных последовательностей в различных вирусных репликативных белках, в том числе в N-концевой части 126К белка тобамовирусов (рис. 4) (Rozanov et al, 1992). В этом домене выявлены 3 уникальных консервативных мотива, отличные от мотивов клеточных метилтрансфераз (Rozanov et al, 1992; Koonin and Dolja, 1993; O'Reilly and Kao, 1998). 126K белок ВТМ обладает гуанилилтрансферазной активностью in vitro (Dunigan and Zaitlin, 1990) и участвует в метилировании ГТФ перед формированием комплекса, состоящего из 126К белка и 7т-ГМФ (Merits et al, 1999). Метилтрансферазы тобамовирусов относятся к т.н. первому типу и причислены к "тобамоподобной" группе (Koonin and Dolja, 1993).

NTP-связывающий хеликазный домен. Большинство вирусных геномов протяженностью более 6000 нуклеотидов кодируют собственную РНК-хеликазу; предполагается ее участие в расплетении РНК-дуплексов во время трансляции и репликации вирусного генома (Gorbalenya and Koonin, 1989). Хеликазы (+)-РНК содержащих вирусов классифицированы в 3 суперсемейства; в суперсемействе 1, куда отнесены тобамовирусы, обнаружены 7 консервативных мотивов (Hodgman, 1988; Gorbalenya and Koonin, 1989; Koonin and Dolja, 1993). Хеликазный домен тобамовирусов находится в С-концевой области 130К белка (рис. 4). Экспериментально показана важность NTP-связывающего мотива для репродукции вируса -мутации в соответствующем районе 2С-белка вируса полиомиелита заметно снижали уровень репликации вирусного генома (Mirzayan and Wimmer, 1992: Teterina et al, 1992). Мутации в этом участке генома ВТМ были летальными или приводили к образованию температурочувствительных дефектов репликации (Goregaoker et al., 2001).

Мети лтрансферазный и хеликазный домены разделены участком, который не является консервативным среди различных тобамовирусов. Однако были картированы несколько мутаций в этом районе, которые влияли на изменение симптомов (Bao et al, 1996; Lewandowski and Dawson, 1993; Shinraku et al, 1996).

Домен РНК-зависимой РНК-полимеразы. Расположенная непосредственно за amber-кодоном часть гена 180К кодирует домен РНК-зависимой РНК-полимеразы (рис. 4). Его аминокислотная последовательность у тобамовирусов похожа на последовательность аналогичных доменов других вирусов с (+)-РНК геномом. Koonin (1991) описал 8 консервативных мотивов в РНК-репликазах (см. также обзор Koonin and Dolja, 1993; O'Reilly and Kao, 1998). Из них наибольшим сходством среди различных групп вирусов обладают мотивы IV, V и VI, на примере вируса энцефаломиокардита (EMCV) подтверждена их важность для нормальной полимеразной активности (Sankar and Porter, 1992). Последовательность GDD (Gly-Asp-Asp, мотив VI; иногда вместо G присутствует S) окружена гидрофобными аминокислотными остатками и инвариантна у всех (+)-РНК-вирусов (Kamer and Argos, 1984; Haseloff et al, 1984; Koonin, 1991). По результатам филогенетического анализа РНК-зависимые РНК-полимеразы тобамовирусов отнесены к супергруппе 3 и причислены к ветви "тобамоподобных" РНК-репликаз вместе с тобра-, трикорна-, клостеро- и гордеивирусами (Koonin and Dolja, 1993).

Выделенные при помощи специфических антител репликативные комплексы содержали 130К и 180К белки в соотношении 1:1 (Watanabe et al., 1999). Результаты, полученные при помощи дрожжевой двугибридной системы, указывают на то, что NTP-связывающие домены участвуют во взаимодействии репликативных белков (Goregaoker et al., 2001). При этом есть данные, что 130К белок работает in cis (Lewandowski and Dawson, 2000).

Предполагаемый 54К белок. По некоторым данным (Sulzinski et al., 1985), при тобамовирусной инфекции может синтезироваться так называемый 54К белок, соответствующий С-концевой части белка 180К. Вероятный стартовый кодон для этого белка расположен за атЬег-триплетом и у BTM-U1 соответствует нуклеотидам 3495-3497. В зараженных растениях была обнаружена только субгеномная РНК с молекулярным весом приблизительно 1,1 х 10б Да, получившая название 1ГРНК (см. ниже) (Sulzinski et al., 1985; Zaitlin, 1999). 54К-белок же не выявляется в опытах in vivo в зараженных растениях (Carr et al., 1992; Zaitlin, 1999).

ТРАНСПОРТНЫЙ БЕЛОК Данный раздел литературного обзора посвящен исключительно структуре и функциям транспортных белков группы тобамовирусов и не ставит перед собой цели детально рассматривать такую большую и сложную проблему, как вирусный транспорт в растении. Подробное изложение вопросов распространения вирусной инфекции, роли плазмодесм, клеточных и вирусспецифических белков можно найти в обзоре Waigmann et al2004.

ТБ - это полипептид с молекулярной массой 30 кДа (рис. 1), который синтезируется на ранних стадиях вирусной инфекции с субгеномной РНК, получившей название 12-сгРНК (Bruening et al., 1976; Beachy and Zaitlin, 1977; см. также обзор Palukaitis and Zaitlin, 1986). Хотя ТБ не нужен для репликации вируса (Meshi et al., 1987), он необходим для транспорта из клетки в клетку. Возможно, часть (+)-РНК, связанная с ТБ, транспортируется в соседние клетки уже на ранних стадиях вирусного цикла, где цикл репликации и внутриклеточный транспорт геномной РНК повторяется снова. В отличие от репликативных белков и БО, синтез ТБ носит временный характер и прекращается на ранней стадии инфекции: в протопластах через 2-10 часов после заражения (Watanabe et al., 1984а), а в растениях в течение первых 24 часов инфекции (Lehto et al., 1990b). Сравнение аминокислотных последовательностей ТБ нескольких тобамовирусов позволило выделить 2 относительно консервативных области (I и II) в средней части ТБ и 3 участка (а, Ь, с) в вариабельной С-концевой части белков (Saito et al., 1988). С-конец ТБ (примерно 1/3 последовательности) обогащен кислыми и основными аминокислотами. Эта область богата аспарагином, аспартатом, пролином, глицином и серином, что способствует формированию спиральных структур (Saito et al., 1988). Было выдвинуто предположение, что высокое содержание заряженных аминокислот в этой области может обеспечивать взаимодействие с клеточными факторами растения-хозяина (Lucas and Gilbertson, 1994). С другой стороны, делеция С-концевых аминокислот: 31 у TMV-L (Okada et al., 1990) или 55 у ВТМ (Berna et al, 1991) не влияла на функцию межклеточного транспорта. За нее ответственны более консервативные N-конец и средняя часть белка. Одна из современных моделей ТБ предполагает, что домен А (112-185 аминокислотные остатки) и домен В (185-268 аминокислотные остатки) независимо взаимодействуют с РНК и одноцепочечной ДНК, а домен С (65-86 аминокислотные остатки) необходим для поддержания правильной конформации белка (Citovsky et al., 1992).

Эксперименты по совместной микроинъекции ТБ с декстранами разных молекулярных масс позволили определить участок, отвечающий за увеличение пропускной способности плазмодесм: он был назван доменом Е и охватывает аминокислотные остатки со 126 по 224 (Waigmann et al., 1994) (рис. 5).

В настоящее время определена нуклеотидная последовательность гена ТБ более 20 тобамовирусов. Сравнение их ТБ существенно не изменило заключений о структуре, сделанных ранее. Однако представление о функции ТБ значительно расширилось с момента выявления способности этого белка обеспечивать транспорт вирусной инфекции.

ЦИТОПЛАЗМА

МЕМБРАНА ЭР

ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКИИ КОМПАРТМЕНТ

112

- домен Е (Waigmann el al., 1994)

-----домены А и В (Citovsky et al., 1992)

- домен С (Citovsky et al., 1992)

Рис. 5. Модель ТБ ВТМ. Приведено по Brill et al. (2000).

В 1984 году Атабеков и Дорохов (Atabekov and Dorokhov, 1984) предположили существовании двух функций ТБ: (а) «открытие» плазмодесм и (б) подавление клеточной защитной реакции, препятствующей распространению вирусной инфекции. В последующие годы помимо этих функций обнаружено множество других свойств ТБ (см., например, обзор Waigmann et al., 2004), описанных ниже.

ТБ увеличивает пропускную способность плазмодесм. При перемещении из первично зараженной клетки в соседнюю вирусы проходят через растительную клеточную стенку, используя для проникновения плазмодесмы (ПД), представляющие собой поры, состоящие из одного или нескольких сквозных микроканальцев, через которые осуществляется сообщение между клетками. Электронные микрофотографии ПД показывают, что эндоплазматический ретикулум (ЭР) и плазматическая мембрана пронизывают пору, образуя непрерывную симпластическую связь между клетками (Ding et al., 1992). Важным параметром ПД является пропускная способность - SEL (size exclusion limit). SEL меняется в ходе развития ПД, уменьшаясь с созреванием листа (Imlau et al., 1999; Oparka et al., 1999). Если в верхних, молодых листьях ПД может пропускать молекулы размером до 50 кДа (Oparka et al, 1999), то SEL в нижних, зрелых листьях ограничена 1 кДа (Tucker, 1982; Barclay et al, 1982; Crawford and Zambrysky, 2000, 2001). Такая пропускная способность позволяет транспортировать только маленькие молекулы, такие как вода, ионы металлов, гормоны и т.д. При заражении табака вирусом табачной мозаики через ПД зрелых листьев проходят и такие огромные структуры как вирусные РЕП, однако для этого должно происходить повышение SEL плазмодесм (Wolf et al, 1989; Waigmann et al, 1994; Waigmann & Zambryski, 1995; Derrick et al, 1992; Angell et al, 1996).

Способность ТБ увеличивать SEL плазмодесм впервые была продемонстрирована в экспериментах Wolf et al. (1989). При инъекции флуоресцентно меченых декстранов различной массы в клетки мезофилла растений табака, трансгенных по гену ТБ ВТМ, было показано, что в таких растениях SEL увеличена до 10 кДа по сравнению с 0.75-1 кДа в нетрансгенных растениях. Микроинъекции рекомбинантного ТБ, выделенного из клеток E.coli, показали способность ТБ увеличивать SEL до 20 кДа. Причем такие изменения происходили в течение 3-5 минут после инъекции (Waigmann et al, 1994). Более того, молекулы декстранов, инъецированные вместе с ТБ, были способны транспортироваться на 20-50 клеток от места инъекции, позволяя предположить, что и сам ТБ может перемещаться из клетки в клетку, модифицируя ПД. Это предположение было впоследствии подтверждено иммунолокализацией инъецированного ТБ (Waigmann and Zambryski, 1995) и временной продукцией ТБ в эпидермальных клетках (Kotlizky et al, 2001).

ТБ неспецифически связывается с вирусной РНК in vitro и in vivo и ингибирует, ее трансляцию. ТБ связывается с РНК (и одноцепочечной ДНК) in vitro с образованием протяженного ТБ:РНК комплекса (Citovsky et al, 1990, 1992; Ivanov et al, 1994; Kiselyova et al, 2001). Диаметр таких комплексов был оценен в 2.0-3.5 нм. ТБ ВТМ обладает способностью неспецифически связывать РНК ВТМ, и на этом основании было высказано предположение, получившее широкое распространение, что комплекс вирусная РНК/ТБ является транспортной формой ВТМ (Citovsky et al, 1990), хотя прямых доказательств этого до сих пор не получено. Ранее в нашей лаборатории вирусные РНП были выделены из зараженных ВТМ растений (Dorokhov et al., 1983, 1984), однако присутствие ТБ в РНП выявить не удалось (Atabekov and Dorokhov, 1984). Известно, что при комплексообразовании ТБ с вирусной РНК происходит подавление ее трансляции в бесклеточной трансляционной системе и в протопластах (Karpova et al.,\991). Однако этого не происходит в растении, где, как полагают, РНП подвергаются фосфорилированию при прохождении через ПД (Karpova et al., 1999). В этой связи интересны последние эксперименты, проведенные в нашей лаборатории. При использовании метода совместной агроинокуляции листьев N.benthamiana векторами, кодирующими ТБ ВТМ и GFP, показана способность ТБ ВТМ подавлять экспрессию GFP в растительных клетках (А.Смирнов и др., неопубликованные результаты). Подавление синтеза GFP не было связано со снижением уровня мРНК GFP. Наоборот, показано, что в присутствии ТБ эта мРНК накапливается в большем количестве, что указывает на протективный эффект ТБ ВТМ по отношению к мРНК GFP. Наблюдаемое явление можно объяснить ингибирующим действием ТБ ВТМ на трансляцию или подавлением «умолкания» генов.

ТБ связывается с компонентами цитоскелета, протеинкиназой клеточной стенки и пектинметилэстеразой. В экспериментах на протопластах табака (трансфекция плазмидой с ЗОК-геном или инфекция ВТМ) ТБ появлялся в виде филаментов и был ко-локализован преимущественно вместе с микротрубочками и, в меньшей степени, с актиновыми филаментами. Опыты in vitro подтверждают, что ТБ может напрямую взаимодействовать с актином и тубулином (McLean et al., 1995). Факт ко-локализации ТБ с микротрубочками (МТ) (Heinlein et al., 1995) и микрофиламентами (McLean et al, 1995) позволил высказать предположение об участии цитоскелета во внутри- и межклеточном транспорте ТБ и вирусной РНК (Carrington et al., 1996). Однако более поздние исследования полностью изменили представление о роли МТ в межклеточном транспорте вируса. Gillespie et al. (2002) было показано, что разрушение микротрубочек с помощью химических агентов никак не влияло на способность вируса транспортироваться из клетки в клетку. Также было обнаружено, что мутант ТБ, характеризующийся повышенной способностью обеспечивать транспорт, имеет пониженное сродство к МТ. Сделан вывод, что взаимодействие ТБ с МТ является этапом пути деградации этого белка (Gillespie et al., 2002).

ТБ способен также взаимодействовать с кальретикулином (Chen et al., 2005) и протеинкиназами (Matsushita et al., 2002, 2003). О последнем свойстве несколько подробнее. Имеющиеся на сегодняшний день данные позволяют предположить существование нескольких сайтов фосфорилирования в составе ТБ. Так результаты, полученные в работе Haley et al. (1995), указывают на то, что сайты фосфорилирования лежат в областях 61-114 а.о. и 212-231 а.о. ТБ родственного ВТМ вируса мозаики томатов фосфорилируется по остаткам Ser-37, Ser-238 (Kawakami et al., 1999). В работах нескольких авторов показано фосфорилирование С-концевой области ТБ (Citovsky et al, 1993; Watanabe et al., 1992; Haley et al, 1995; Matsushita et al, 2000) no остаткам Ser-258, Thr-261, Ser-265 киназами, ассоциированными с клеточными стенками (Citovsky et al, 1993), что согласуется с данными о фосфорилировании 9 С-концевых аминокислот в составе ТБ ВМТ (Matsushita et al, 2000). В работе Karger et al. (2003) продемонстрировано фосфорилирование Thr-104 ТБ ВТМ киназами, ассоциированными с ЭР. Полагают, что фосфорилирование ТБ является частью ответа клетки, направленного на борьбу с распространением вирусной инфекции. С другой стороны, фосфорилирование ТБ киназами клеточных стенок может происходить в момент перемещения вирусного РНП (состоящего из ТБ и РНК вируса) через ПД в соседнюю клетку. Это ослабляет связь ТБ с РНК, что может быть необходимо для трансляционной активации последней в соседней клетке.

ТБ ВТМ, не имеющий сигнальной последовательности, может доставляться в клеточные стенки с помощью других белков-носителей. Возможно, таким белком является пектинметилэстераза (ПМЭ), взаимодействующая с ТБ (Dorokhov et al., 1999; Chen et al., 2000). Предложено три модели участия ПМЭ в ближнем транспорте ВТМ: (1) исследуемый белок доставляет ТБ от места его синтеза к ПД; (2) взаимодействие ТБ с ПМЭ влияет на ферментативную активность последней, что в свою очередь, приводит к изменению свойств клеточной стенки и, соответственно, к увеличению проницаемости ПД; (3) т.к. ПМЭ является индуктором вирус-индуцируемого «умолкания» генов (ВИУГ), ТБ, связываясь с ПМЭ, снимает ВИУГ, тем самым косвенно защищает вирусную РНК и способствует ее транспорту (подробнее см. ниже).

ТБ подавляет «умолкание» генов. В экспериментах, проведенных в нашей лаборатории (Тюлькина и др., 2006), было исследовано влияние ТБ ВТМ на репродукцию вирусного вектора KpBTM-GFP-TB(fs) (сдвинута рамка считывания ТБ - frame-shift) в листьях N.benthamiana в условиях, когда подавляющая часть клеток находится в латентно-инфицированном, но "молчащем" состоянии. Вектор KpBTM-GFP-TB(fs) сконструирован на основе генома крВТМ, у которого ген белка оболочки заменен на ген GFP в качестве маркера репродуктивной способности вируса, а ген ТБ инактивирован введением мутации сдвига рамки трансляции. Показано, что в этих условиях ТБ ВТМ, подобно известному вирусному супрессору ВИУГ - белку р19 (Voinnet et al., 1999), стимулирует репродукцию вируса. Сделан вывод, что ТБ ВТМ может выполнять функцию белка-супрессора ВИУГ. Этот механизм тесно связан со способностью ТБ взаимодействовать с ПМЭ. Повышение ферментативной активности ПМЭ в клеточной стенке, вызванное вирусной инфекцией, сопровождается индукцией «умолкания» РНК ВТМ (Dorokhov et al., 2006 a,b). Полагают, что, поскольку ПМЭ располагается на границе клетки и воспринимает внешний сигнал, ее можно рассматривать как хранителя клеточного транскриптома, генерирующего сигнал о вторжении в клетку чужеродного генетического материала. Возможно, одна из функций ТБ состоит в связывании ПМЭ, приводящему к снижению ее активности, а, следовательно, предотвращению ВИУГ, опосредованного ПМЭ.

БЕЛОК ОБОЛОЧКИ

Белок оболочки тобамовирусов необходим для дальнего транспорта по сосудистой системе растения. 3'-проксимальная ОРТ тобамовирусов кодирует капсидный белок, или белок оболочки (БО). Он транслируется с субгеномной РНК, получившей название LMC (от low molecular component; Siegel et al1976; см. также обзор Palukaitis and Zaitlin, 1986) и имеет молекулярную массу около 17-18 кДа. В отличие от сгРНК-12, LMC содержит на 5'-конце кэп-структуру; лидерная последовательность LMC невелика по размерам и богата остатками аденозина и уридина (Lehto et al., 1990а). Капсидный белок синтезируется в течение всего времени инфекции, достигая максимального уровня через 24-72 часа после заражения; количество БО может составлять до 10% от общего клеточного белка (Siegel et al., 1978).

Давно замечено: если мутанты ВТМ с дефектами БО не способны формировать вирусные частицы, они также не могут распространяться по сосудистой системе растения (так называемый дальний, или системный транспорт) (Siegel et al., 1962; Sarkar and Smitamana, 1981). Мутант с делецией большей части гена БО и заменой его на репортерный ген CAT терял способность к дальнему транспорту (отсутствие системных мозаичных симптомов (Takamatsu et al, 1987)). Saito et al (1990) провели делеционный мутагенез гена БО: удаление от 5 до 56 аминокислот на С-конце БО и делеция аминокислот 64-76, с сохранением рамки считывания. Все мутанты (за одним исключением) были дефектны по системному транспорту. Дальний транспорт дефектных по БО мутантов ВТМ может комплементироваться в трансгенных по БО растениях (Osbourn et al., 1990; Holt and Beachy, 1991).

Lucas and Gilbertson (1994) предположили, что БО может специфически взаимодействовать с клеточными факторами растения-хозяина в районе плазмодесм сосудистой системы, обеспечивая выход во флоэму; видимо, для дальнего транспорта тобамовирусов необходим специфический комплекс с точным взаимодействием БО, ТБ, вирусной РНК и хозяйских факторов. В пользу гипотезы о значении ТБ для системного транспорта говорят данные Hilf and Dawson (1993), а также эксперименты Fenczik et al. (1995), продемонстрировавшие значение С-концевых аминокислот ТБ ORSV для дальнего транспорта и изменения круга хозяев вируса.

Роль БО в образовании репликативных комплексов. Недавние исследования (Bendahmane et al., 2002; Asurmendi et al., 2004; Kawakami et al., 2004) расширили наши представления о роли БО в репродукции ВТМ.

ТА.1 Wf

Исследования лаборатории Р. Бичи с мутантом белка оболочки - CP показали его участие в репликации РНК ВТМ, образовании ТБ и процессе межклеточного транспорта. В основе - участие БО в формировании «вирусной фабрики», которая, по представлению Р. Бичи, является транспортной формой вируса.

Взаимодействие капсидного белка с кодируемыми хозяином факторами устойчивости. При заражении растений с геном устойчивости N' (Nicotiana sylvestris, N. tabacum L. cv. Bright Yellow) часто наблюдается гиперчувствительный (HR) ответ, который зависит от последовательности гена БО (Saito et al., 1987).

Как правило, BTM-U1 обеспечивает системную инфекцию растений с N'-геном. Culver et al. (1994) провели направленный мутагенез гена БО в полной инфекционной копии ВТМ. Аминокислотные замены, нарушавшие четвертичную структуру БО ВТМ и предотвращавшие образование агрегатов БО, вызывали гиперчувствительный ответ у Nicotiana sylvestris. При этом мутации, изменявшие только предполагаемую третичную структуру БО, не давали подобного эффекта. Возможно, разрушение агрегатов БО делает этот белок доступным для взаимодействия с клеточными факторами и приводит к

HR-реакции (Culver et al., 1994). Другой пример гиперчувствительности -устойчивость растений рода Capsicum (напр. перца), вызываемая хозяйским геном L3 - также связан с белком оболочки.

ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ крВТМ КрВТМ (crTMV), впервые выделенный из Alliaria officinalis Andrz, заметно отличается от типового штамма ВТМ vulgare и других известных тобамовирусов (Dorokhov et al., 1993, 1994). Помимо Nicotiana tabacum L. (сем. Пасленовых), крВТМ системно заражает растения семейства Крестоцветных: Brassica chinensis L., В. rapa L., В. napus L., В. compestris L., Arabidopsis thaliana L. геномная РНК

• I

КЭП Ш

Рис. 6. Схема генома крВТМ.

Геномная РНК крВТМ имеет длину 6312 нт. Геном крВТМ заметно короче, чем у других известных тобамовирусов, например ВТМ U1 или Ob (6395 и 6507 нуклеотидов соответственно). КрВТМ имеет 4 ОРТ, кодирующие белки с молекулярными массами 122К (ОРТ1), 178К (ОРТ2), 29К (ОРТЗ) и 18К (ОРТ4) (схема генома представлена на рис. 6). Первая ОРТ начинается с 69 нт (AUG-кодон - нуклеотиды 69-71) и заканчивается терминирующим amber-кодоном UAG (нуклеотиды 3381-3383), белок состоит из 1107 аминокислот. Непосредственно за amber-кодоном следуют триплеты САА и UUA, типичные и для других тобамовирусных последовательностей. Предполагается (Skuzeski et al., 1991), что этот мотив усиливает супрессию слабого UAG и облегчает синтез белка, кодируемого

ОРТ1 ! ОРТ2

I22K ~

ОРТ4

ОРТЗ

Jto„ тРНКя,

1

HL . 2'» К , Э

178 К

1 Кк'

0РТ2 (1601 аминокислота). ОРТ2 имеет общий с ОРТ1 старт и терминируется UAA-кодоном в положении 4873-4875.

ОРТЗ начинается через 2 нуклеотида после терминирующего кодона ОРТ2 и кодирует транспортный белок, состоящий из 267 аминокислот (29К). Данная ОРТ перекрывается на 77 нуклеотидов (включая терминирующий кодон) с ОРТ4 (18К), кодирующей белок оболочки, состоящий из 156 аминокислотных остатков. Это перекрывание значительно превосходит подобное у тобамовирусов субгруппы 2 (SHMV и CGMMV, 26 оснований в обоих случаях), а у тобамовирусов субгрупп 1а и lb и вовсе отсутствует (Ikeda et al, 1993).

Белки 122К и 178К

Белки с молекулярной массой 122 и 178К кодируются ОРТ1/2. В результате анализа аминокислотной последовательности 122К-белка выявлено 2 консервативных мотива, характерных для метилтрансферазного и NTP-связывающего (хеликазного) доменов, описанных у репликативных белков (+)-РНК-содержащих вирусов (см. выше). Эти домены локализуются соответственно в N- и С-концевых областях 122К-белка аналогично 126К белку ВТМ (рис. 4).

С-конец 178К-белка (область, непосредственно следующая за amber-кодоном) соответствует РНК-зависимой РНК-полимеразе. Этот домен содержит восемь аминокислотных мотивов, характерных для РНК-зависимых РНК-полимераз других тобамовирусов. Мотив VI включает последовательность GDD (Gly-Asp-Asp), фланкированную гидрофобными аминокислотными остатками и присутствующую (иногда как SDD) у репликаз всех без исключения вирусов, относящихся, как и тобамовирусы, к Синдбис-подобному суперсемейству (Kamer and Argos, 1984).

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Комарова, Татьяна Валерьевна

выводы рр

1. В составе IREScp,i48 были выявлены два полипуриновых фрагмента, потенциально способные взаимодействовать с прокариотической рРНК. рп

2. Проведен анализ трансляционной активности IREScp,i48 , его отдельных элементов, мутантных вариантов, а также ряда искусственных полипуриновых последовательностей в модельной прокариотической системе - кишечной палочке (Escherichia coli, штамм BL-21).

3. Показано, что IREScp,i48CR способен обеспечивать инициацию трансляции в E.coli, выполняя функции сайта связывания рибосомы. Полипуриновые блоки, входящие в состав IREScp,i48CR и искусственные полипуриновые последовательности также обеспечивают инициацию трансляции в прокариотической системе. Трансляционная активность IREScp,i4sCR в основном определяется структурным элементом pptll, а элемент pptl9 повышает эффективность инициации трансляции. рп

4. Проведено тестирование IRESCp,i48 в новом вирусном векторе, созданном на основе гетерологичного репликона ХВК. Показано, что IREScp,i48CR в составе бицистронной субгеномной РНК обеспечивает синтез 2-3% белка по сравнению с трансляцией первого цистрона.

5. Разработана система «визуализации» IRESCpj48СК-содержащих бицистронных мРНК в клетке при ее упаковке в псевдовирион белком рр оболочки ВТМ. Показана способность IRESCp,i48 обеспечивать внутреннюю инициацию трансляции с интактных матриц.

6. Создан бинарный вектор, содержащий инфекционную копию крВТМ, у которого промотор, контролирующий синтез субгеномной мРНК БО, был инактивирован введением нуклеотидных замен. Установлено, что вклад рп

IREScp, 148 в общий синтез БО во время вирусной инфекции составляет, по крайней мере, 3-4%. Сделан вывод, что внутренняя инициация трансляции важна для синтеза БО, предположительно обеспечивающего раннее формирование вирусного репликативного комплекса.

БЛАГОДАРНОСТИ

В первую очередь хочу выразить искреннюю благодарность своим научным руководителям, Дорохову Юрию Леонидовичу и Скулачеву Максиму Владимировичу за чуткое руководство, поддержку и постоянную помощь в освоении методик, проведении исследований, интерпретации полученных данных и написании работы, заведующему кафедрой вирусологии, академику РАН Атабекову Иосифу Григорьевичу за неизменное внимание и ценные рекомендации, а также хочу поблагодарить Полякова Владимира Юрьевича и Киселеву Ольгу Игоревну за содействие в проведении электронномикроскопических исследований и обработку полученных данных, Иванова Петра Алексеевича за неоценимую помощь в подготовке материалов для диссертации, участие в обсуждении результатов и ценные замечания, Скурата Евгения Владимировича за предоставленные плазмиды, Фролову Ольгу Юрьевну за помощь в освоении необходимых лабораторных методов, Звереву Анну Сергеевну и Шварца Антона Марковича за непосредственное участие в проведенных экспериментах, Клюшина Андрея Геннадьевича за помощь в конструировании вирусных векторов. Кроме того, хочу поблагодарить всех коллег и сотрудников лаборатории молекулярной биологии вирусов и кафедры вирусологии МГУ за теплую атмосферу, внимание, помощь и поддержку.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Комарова, Татьяна Валерьевна, 2006 год

1. Маниатис, Т., Фрич, Э., Сэмбрук, Дж. (1984). Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование. Москва. "Мир".

2. Скулачев М. В. (2005). Внутренняя инициация трансляции -разнообразие механизмов и возможная роль в жизнедеятельности клетки. Успехи биологической химии, 45, 123-172

3. Тюлысина Л.Г., Скурат Е.В., Зверева А.С., Дорохов Ю.Л., Атабеков И.Г. (2006). Транспортный белок стимулирует репродукцию вируса табачной мозаики в инфицированных клетках. Доклады Академии Наук, 409, 253-258.

4. Ханаан, Д. (1988) Методы трансформации Е. coli. В книге: Клонирование ДНК: Методы, под редакцией Д.Гловера. Москва, "Мир".

5. Adkins, S. and Као, С. С. (1998). Subgenomic RNA promoters dictate the mode of recognition by bromoviral RNA-dependent RNA polymerases. Virology, 252,1-8.

6. Angell, S.M., Davies, C., Baulcombe, D.C. (1996). Cell-to-cell movement of potato virus X is associated with a change in the size-exclusion limit of plasmodesmata in trichome cells of Nicotiana clevelandii. Virology, 216, 197-201.

7. Asurmendi, S., Berg, R. H., Koo, J. C., Beachy, R. N. (2004). Coat protein regulates formation of replication complexes during tobacco mosaic virus infection. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 101, 1415-1420.

8. Atabekov, J.G., and Dorokhov, Y.L. (1984). Plant vims-srecific transport function and resistance of plants to viruses. Adv. Virus Res., 29, 313-364.

9. Avila-Rincon, M.J., Ferrero, M.L., Alonso, E., Garcia-Luque, I., and Diaz-Ruiz, J.R. (1989). Nucleotide sequence of 5' and 3' non-coding regions of pepper mild mottle virus strain S RNA. J. Gen. Virol., 70, 3025-3031.

10. Barclay, G.F., Peterson, С.A., Tyree, M.T. (1982). Transport of fluorescein in trichomes of Lycopersicon esculentum. Can. J. Bot., 60, 397-402.

11. Beachy, R.N., Zaitlin, M., Bruening, G., and Israel, H.W. (1976) A genetic map for the cowpea strain of TMV. Virology, 73, 498.

12. Beachy, R.N. and Zaitlin, M. (1977). Characterization and in vitro translation of the RNAs from less-than-full-length, virus related, nucleoprotein rods present in tobacco mosaic virus preparations. Virology, 81, 160-169.

13. Beier, H., Barciszewska, M., Krupp, G., Mitnatch, R., and Gross, H.J. (1984a). UAG readthrough during TMV RNA translation: isolation and sequence of the two RNAstyi with suppressor activity from tobacco plants. EMBOJ., 3, 351-356.

14. Beier, H., Barciszewska, M., and Sickinger, H.-D. (1984b) The molecular basis for the differential translation of TMV RNA. in tobacco protoplasts and wheat germ extracts. EMBO J., 3,1091-1096.

15. Bendahmane, M., Szecsi, J., Chen, I., Berg, R.H., Beachy, R.N. (2002). Characterization of mutant tobacco mosaic virus coat protein that interferes with vims cell-to-cell movement. Proc Natl Acad Sci USA, 99, 3645-50.

16. Bema, A., Gafny, R., Wolf, S., Lucas, W.J., Holt, C.A., and Beachy, R.N. (1991). The TMV movement protein: Role of the C-terminal 73 amino acids in subcellular localization and function. Virology, 182, 682-689.

17. Bevan, M. (1984). Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucleic Acids Res. 12, 8711-21.

18. Brill, L.M., Nunn, R.S., Kahn, T.W., Yeager, M., Beachy, R.N. (2000). Recombinant tobacco mosaic vims movement protein is an RNA-binding, alpha-helical membrane protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 7112-7117.

19. Bruening, G., Beachy, R.N., Scalla, R., and Zaitlin, M. (1976). In vitro and in vivo translation of the ribonucleic acids of a cowpea strain of tobacco mosaic vims. Virology, 71, 498-517.

20. Buck, K.W. (1999). Replication of tobacco mosaic vims RNA. Phil. Trans. R. Soc. bond. 354, 613-627.

21. Canto, Т., MacFarlane, S.A., Palulcaitis P. (2004). ORF6 of tobacco mosaic vims is a determinant of viral pathogenicity in Nicotiana benthamicina. J. Gen. Virol., 85,3123-3133.

22. Carrington, J., Kasschau, K., Mahajan, S., Schaad, M. (1996). Cell-to-cell and long distance transport of viruses in plants. Plant Cell, 8, 1669-1681.

23. Carriquiry, E. and Litvak, S. (1974) Further studies on the enzymatic aminoacylation of TMV-RNA by histidine. FEBS Letters, 38, 287.

24. Champness, J.N., Bloomer, A.C., Bricogne, G., Butler, P.J.G., and Klug, A. (1976). The structure of the protein disk of tobacco mosaic vims to 5 A resolution. Nature (London), 259, 20-24.

25. Chandrika, R., Rabindran, S., Manjunath, K.L., Lewandowski, D.J., Dawson, W.O. (2000). Full-length tobacco mosaic virus RNAs and defective RNAs have different 3' replication signals. Virology, 273, 198— 209.

26. Chapman, S., Hills, G., Watts, J., Baulcombe, D. (1992). Mutational analysis of the coat protein gene of potato vims X: effects on virion morphology and viral pathogenicity. Virology, 191, 223-30.

27. Chen, M.H., Sheng, J, Hind, G., Handa, A.K., Citovsky, V. (2000). Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement. EMBO Journal, 19, 913-920.

28. Chen, M.H., Tian, G.W., Gafni, Y., Citovsky, V. (2005). Effects of calreticulin on viral cell-to-cell movement. Plant Physiol., 138, 1866-76.

29. Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G. and Zambryski, P. (1990). The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein. Cell, 60, 637-647.

30. Citovsky, V., Wong, M.L., Shaw, A., Prasad, B.V.V. and Zambryski, P. (1992). Visualization and characterization of tobacco mosaic vims movement protein binding to single- stranded nucleic acids. Plant Cell, 4, 397-411.

31. Citovsky, V., McLean, B.G., Zupan, J.R. and Zambryski, P. (1993) Phosphorylation of tobacco mosaic virus movement protein by a developmentally regulated plant cell wall-associated protein kinase. Genes ancl Development, 7, 904-910.

32. Crawford, K.M., Zambryski. P.C. (2000). Plasmodesmata: gatekeepers for cell-to-cell transport of developmental signals in plants. Annu Rev Cell Dev Biol., 16,393-421.

33. Crawford, K.M., Zambryski. P.C. (2001). Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol, 125, 1802-1812.

34. Culver J.N. and Dawson, W.O. (1989). Point mutations in the coat protein gene of tobacco mosaic virus induce hypersensitivity in Nicotiana sylvestris. Mol Plant-Microbe Interact., 2, 209-213.

35. Culver J.N. and Dawson, W.O. (1991). Tobacco mosaic virus elicitor coat protein genes produce a hypersensitive phenotype in transgenic Nicotiana sylvestris plants. Mol Plant-Microbe Interact., 4, 458-463.

36. Culver, J.N., Stubbs, G. and Dawson, W.O. (1994). Structure-function relationship between tobacco mosaic virus coat protein and hypersensitivity in Nicotiana sylvestris. J. Mol Biol, 242, 130-138.

37. Dawson, W.O, Beck, D.L, Knorr, D.A. and Grantham, G.L. (1986). cDNA cloning of the complete genome of tobacco mosaic virus andproduction of infectious transcripts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 18321836.

38. Dawson, W.O., Bubrick, P., and Grantham, G.L. (1988). Modifications of the tobacco mosaic virus coat protein gene affecting replication, movement, and symptomatology. Phytopathology, 78, 783-789.

39. Ding, В., Haudenshield, J.S., Hull, R.J., Wolf, S., Beachy, R.N., and Lucas, W.J. (1992) Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic vims movement protein in transgenic tobacco plants. The Plant Cell, 4, 915-928.

40. Dorokhov, Y.L., Alexandrova, N.M., Miroshnichenko, N.A. and Atabekov, J.G. (1983). Isolation and analysis of virus-specific ribonucleoprotein of tobacco mosaic virus-infected tobacco. Virology, 127, 237-252.

41. Dorokhov, Y.L., Alexandrova, N.M., Miroshnichenko, N.A. and Atabekov, J.G. (1984). The informosome-like virus-specific ribonucleoprotein (vRNP) may be involved in the transport of tobacco mosaic virus infection. Virology, 137, 127-134.

42. Dorokhov, Yu.L., Ivanov, P.A., Novilcov, V.K., Agranovsky, A.A., Morozov S.Yu., Efimov, V.A., Casper, R., Atabekov, J.G. (1994). Complete nucleotide sequence and genome organization of a tobamovirus infecting cruciferae plants. FEBSLett., 350, 5-8.

43. Dorokhov, Y.L., Frolova, O.Y., Skurat, E.V., Ivanov, P.A., Gasanova, T.V., Sheveleva, A.A., Ravin, N.V., Makinen, K.M., Klimyuk, V.I.,

44. Skryabin, K.G., Gleba, Y.Y., Atabekov, J.G. (2006b). A novel function for a ubiquitous plant enzyme pectin methylesterase: the enhancer of RNA silencing. FEBSLett., 580, 3872-8.

45. Dunigan, D.D. and Zaitlin, M. (1990). Capping of tobacco mosaic virus RNA. Analysis of viral-coded guanililtransferase-like activity. Journal of Biological Chemistry, 265, 7779-7786.

46. Fenczik, C., Padgett, H., Holt, C.A., Casper, S.J., and Beachy, R.N. (1995). Mutational analysis of the movement protein of odotoglossum ringspot virus to identify a host-range determinant. Molecular Plant-Microbe Interactions, 8,n.5,666-673.

47. Filipowicz, W. and Haenni, A-L. (1979). Binding of ribosomes to the 5'-terminal sequences of eucaryotic messenger RNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76,3111.

48. Fraile A. and Garcia-Arenal, F. (1990). A classification of tobamoviruses based on comparison among their 126K proteins. Journal of General Virology, 71, 2223-2228.

49. Fukuda, M., Okada, Y, Otsuki, Y., and Takebe, I. (1980). The site initiation of rod assembly on the RNA of a tomato and cowpea strain of tobacco mosaic virus. Virology, 101, 493-502.

50. Gallie, D.R., Sleat, D.E., Watts, J.W., Turner, P.C., and Wilson, T.M.A. (1987a). The 5'-leader sequence of tobacco mosaic viais RNA enhances the expression of foreign gene transcripts in vitro and in vivo. Nucl. Acids Res., 15,3257-3273.

51. Gallie, D.R., Sleat, D.E., Watts, J.W., Turner, P.C, and Wilson, T.M.A. (1987b). A comparison of eulcaryotic viral 5 -leader sequence as enhancers of mRNA expression in vivo. Nucl. Acids Res., 15, 8693-8711.

52. Gallie, D.R., Sleat, D.E, Watts, J.W., Turner, P.C., and Wilson, T.M.A. (1987c). In vivo uncoating and efficient expression of foreign lmRNAs packaged in TMV-like particles. Science, 236, 1122.

53. Gallie, D.R., Sleat, D.E., Watts, J.W., Turner, P.C, and Wilson, T.M.A., (1988). Mutational analysis of the tobacco mosaic virus 5'-leader for altered ability to enhance translation. Nucl. Acids Res., 16, 883.

54. Gallie, D.R. and Kado, C.I. (1989). A translational enhancer derived from tobacco mosaic vims is functionally equivalent to a Shine-Dalgarno sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 129.

55. Gallie, D.R, Lucas, W.J. and Walbot, V. (1989). Visualizing mRNA expression in plant protoplasts: factors influencing efficient mRNA uptake and translation. Plant Cell, 1, 301.

56. Gallie, D.R. and Walbot, V. (1992). Identification of the motifs within the tobacco mosaic virus 5'-leader responsible for enhancing translation, Nucl. Acids Res., 20, 4631-4638.

57. Garcia-Arenal, F. (1988). Sequence and structure at the genome 3 end of the U2-strain of tobacco mosaic vims, a histidine-accepting tobamovirus. Virology, 167,201-206.

58. Gibbs, A. (1986). Tobamovirus classification. In: van Regenmortel, M.H.V, Fraenkel-Conrat, H. ( ed. ), The plant vimses, vol 2, Plenum press, N.-Y, p.167-180.

59. Gorbalenya A.E. and Koonin, E.V. (1989). Viral proteins containing the purine NTP-binding sequence pattern. Nucl. Acids Res., 17, 8413-8440.

60. Goregaoker, S.P, Lewandowski, D.J., Culver, J.N. (2001). Identification and functional analysis of an interaction between domains of the 126/183lcDa replicase-associated proteins of tobacco mosaic virus. Virology, 282, 320-328.

61. Grdzelishvili, V.Z., Chapman, S.N., Dawson, W.O., Lewandowski, D.J. (2000). Mapping of the Tobacco mosaic virus movement protein and coat protein subgenomic RNA promoters in vivo. Virology, 275, 177-192.

62. Haenni, A.L., Joshi, S. and Chapeville, F. (1982). tRNA-like structures in the genomes of RNA viruses. Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology, 27, 85-104.

63. Haley, A., Hunter, Т., Kiberstis, P., and Zimmern, D. (1995) Multiple serine phosphorylation sites on the 30kDa TMV cell-to-cell movement protein synthesized in tobacco protoplasts. The Plant Journal, 8(5), 715-724.

64. Heinlein, M., Epel, B.L, Padgett, H.S. and Beachy, R.N. (1995). Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science, 270, 1983-1985.

65. Hilf, M.E. and Dawson, W.O. (1993). The tobamovirus capsid protein functions as a host-specific-determinant of long-distant movement. Virology, 193,106-114.

66. Hodgman, T.C., (1988), A new superfamily of replicative proteins. Nature, 333,22-23.

67. Holt, C.A. and Beachy, R.N. (1991). In vivo complementation of infectious transcripts from mutant tobacco mosaic virus cDNAs in transgenic plants. Virology, 181, 109-117.

68. Hunter, Т., Jackson, R. and Zimmern, D. (1983). Multiple proteins and subgenomic RNAs may be derived from a single open reading frame of tobacco mosaic virus. Nucl. Acids Res., 11, 801-821.

69. Ikeda, R., Watanabe, E., Watanabe, Y, and Okada,Y. (1993). Nucleotide sequence of tobamovirus Ob which can spread systemically in N gene tobacco. J. Gen. Virol., 74, 1939-1944.

70. Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. (1999). Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unl oading of the protein into sink tissues. Plant Cell, 11, 309-322.

71. Ishilcawa, M., Meshi, Т., Motoyoshi, F., Takamatsu, N., and Okada, Y. (1986). In vitro mutagenesis of the putative replicase genes of tobacco mosaic virus. Nucl. Acids Res., 14, 8291-8305.

72. Ishikava, Meshi, Ohno and Okada, (1991) Specific cessation of minus-strand RNA accumulation at an early stage of tobacco mosaic virus infection. J.Virol. 65 861-868

73. Ivanov K.I., Ivanov P.A., Timofeeva E.K., Dorokhov Yu.L. and Atabekov J.G. (1994). The immobilized movement proteins of two tobamoviruses form stable ribonucleoprotein complexes with full-length viral genomic RNA. FEBS Letters, 346, p.217-220.

74. Ivanov, P.A., Karpova, O.V., Skulachev, M.V., Tomashevskaya, O.L., Rodionova, N.P., Dorokhov, Yu.L., Atabekov, J.G. (1997). A tobamovirus genome that contains an internal ribosome entry site functional in vitro. Virology, 232, 32-43.

75. Joshi, S., Pleij, C.W.A., Haenni, A.L., Chapeville, F. And Bosch, L. (1983). Properties of the tobacco mosaic virus intermediate RNA-2 and its translation. Virology, 127, 100-111.

76. Kamer, G. and Argos, P. (1984). Primary structural comparison of RNA-dependent polymerases from plant, animal and bacteria viruses. Nucl. Acids Res., 12, 7269-7282.

77. Karpova, O.V, Ivanov, K.I, Rodionova, N.P, Dorokhov, Yu.L, Atabekov, J.G. (1997). Nontranslatability and dissimilar behavior in plants and protoplasts of viral RNA and movement protein complexes formed in vitro. Virology, 230, 11-21.

78. Karpova, O.V, Rodionova, N.P, Ivanov, K.I, Kozlovsky, S.V, Dorokhov, Y.L, Atabekov, J.G. (1999). Phosphorylation of tobacco mosaic virus movement protein abolishes its translation repressing ability. Virology, 261, 20-4.

79. Kawakami, S, Watanabe, Y, Beachy, R.N. (2004). Tobacco mosaic vims infection spreads cell to cell as intact replication complexes. Proc Natl Acad Sci USA, 101,6291-6.

80. Kiselyova, O.I, Yaminsky, I.V, Karger, E.M, Frolova, O.Y, Dorokhov, Y.L, Atabekov, J.G. (2001). Visualization by atomic force microscopy of tobacco mosaic vims movement protein-RNA complexes formed in vitro. J Gen Virol, 82, 1503-1508.

81. Knorr, D.A. and Dawson, W.O. (1988). A point mutation in the tobacco mosaic vims capsid protein gene induces hypersensitivity in Nicotiana sylvestris. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 85, 170-174.

82. Konarska, M, Filipowicz, W, Domdey, H, and Gross, H.J, (1981). Binding of ribosomes to circular forms of the 5'-terminal leader fragment of tobacco mosaic virus RNA. Eur. J. Biochem., 114, 221.

83. Koonin, E.V. (1991). The phylogeny of RNA-dependent RNA polymerases of positive-strand RNA viruses. J. Gen. Virol., 72, 2197-2206.

84. Koonin, E.V. and Dolja, V.V. (1993). Evolution and taxonomy of positive-strand RNA viruses: implications of comparative analysis of amino acid sequences. Critical Reviews in Biochemistry ancl Molecular Biology, 28, 375-430.

85. Kozak M. (1983). Comparison of initiation of protein synthesis in procaryotes, eucaryotes, and organells. Microbiol. Rev., 47, 1-45

86. Kozak, M. (1989). The scanning model for translation: an update. J.Mol.Biol., 108, 229-241.

87. Kozak M. (1999). Initiation of translation in prokaryotes and eukaryotes. Gene, 234, 187-208

88. Laemmli, U.R. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.

89. Lehto, K. and Dawson, W.O. (1990a). Changing the start codon context of the 30K gene of tobacco mosaic virus from "weak" to "strong" does not increase expression. Virology, 174, 169-176.

90. Lehto, K„ Bubrick, P. and Dawson, W.O. (1990b). Time course of TMV 30K protein accumulation in intact leaves. Virology, 174, 290-293.

91. Lewandowski, D.J. and Dawson, W.O. (1998). Deletion of internal sequences results in tobacco mosaic virus defective RNAs that accumulateto high levels without interfering with replication of the helper virus. Virology, 251,427-437.

92. Lewandowski, D.J., Dawson, W.O. (2000). Function of the 126-kDa and 183-kDa proteins of tobacco mosaic virus. Virology, 271, 90-98.

93. Loechel, S., Inamine, J.M., Ни, P.C. (1991). A novel translation initiation region from Mycoplasma genitalium that functions in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 19, 6905-11.

94. Lucas, W.J. and Gilbertson, R.L. (1994). Plasmodesmata in relation to viral movement within leaf tissues. Annu. Rev. Phytopathol., 32, 387-411.

95. Mandeles, S. (1968). Location of unique sequences in tobacco mosaic virus ribonucleic acid, J. Biol. Chern., 243, 367.

96. Mattews, R.E.F. (1991). Plant virology, 3rd. edn., N.-Y., Academic Press, 644-645.

97. Matsushita, Y., Hanazawa, K., Yoshioka, K., Oguchi, Т., Kawakami, S., Watanabe, Y., Nishiguchi, M., Nyonoya, H. (2000). In vitro phosphorylation of the movement protein of tomato mosaic tobamovirus by a cellular kinase. J. Gen. Virol., 81, 1824-1828.

98. McLean, B.G., Zupan, J. and Zambryski, P. (1995). Tobacco mosaic virus movement protein associates with the cy to skeleton in tobacco cells. The Plant Cell, 7,2101-2114.

99. Merits, A., Kettunen, R., Malcinen, K., Lampio, A., Auvinen, P., Kaariainen, L., Ahola, T. (1999). Virus-specific capping of tobacco mosaic virus RNA: methylation of GTP prior to formation of covalent complex pl26-m7GMP. FEBSLett., 455, 45-48.

100. Meshi, Т., Watanabe, Y., Saito, Т., Sugimoto, A., Maeda, Т., and Okada, Y. (1987). Function of the 30K protein of tobacco mosaic virus: involvment in cell-to-cell movement and dispensability for replication. EMBO J., 6, 2557-2563.

101. Mirzayan, C. and Wimmer, E. (1992). Genetic analysis of an NTP-binding motif in poliovirus polypeptide 2C. Virology, 189, 547-555.

102. Namba, К. and Stubbs, G. (1986). Structure of tobacco mosaic virus at 3,6 A resolution: implications for assembly. Science, 231, 1401-1406.

103. Namba, K, Pattenayek, R. and Stubbs, G. (1989). Visualization of protein-nucleic acid interactions in a virus. Refined structure of intact tobacco mosaic virus at 2,9 A resolution by X-ray fiber diffraction. J. Mol. Biol., 208, 307-325.

104. Napoli, C, Lemieux, C, Jorgensen, R. (1990). Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in-trcins. Plant Cell, 2, 279-289

105. Pelham, H.R.B. and Jackson, R.J. (1976). An efficient mlWA-dependent translation system from reticulocyte lysate. Eur. J. Biochem., 67, 247-256.

106. Pelham, H.R.B. (1978). Leaky UAG termination codon in tobacco mosaic vims RNA. Nature (London), 272, 469.

107. Pelletier J. and Sonenberg N. (1988). Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature, 334, 320-325

108. Richards, K.E, Guilley, H, Jonard, G, and Hirth, L. (1978). Nucleotide sequence at the 5'-extremity of tobacco mosaic virus RNA. Eur. J. Biochem., 84, 513.

109. Rietveld, 1С, Lmschooten, K, Pleij, C.W.A, and Bosch, L. (1984). The three-dimensional folding of the tRNA-like structure of tobacco mosaic vims RNA.A new building principle applied twice. EMBOJ., 3, 2613-2619.

110. Rozanov, M.N, Koonin, E.V, Gorbalenya, A.E. (1992). Conservation of the putative methyltransferase domain: a hallmark of the 'Sindbis-like' supergroup of positive-strand RNA viruses. J. Gen. Virol, 73, 2129-2134.

111. Saito, Т., Meshi, Т., Takamatsu, N., and Okada, Y. (1987). Coat protein gene sequence of tobacco mosaic virus encodes a host response determinant. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 6074-6077.

112. Saito, Т., Imai, Y., Meshi, Т., and Okada, Y. (1988). Interviral homologies of the 30K proteins of tobamoviruses. Virology, 167, 653-656.

113. Saito, Т., Yamanaka, K., Watanabe, Y., Takamatsu, N., Meshi, Т., and Okada, Y. (1989). Mutational analysis of the coat protein gene of tobacco mosaic virus in relation to hypersensitive response in tobacco plants with the Ngene. Virology, 173, 11-20.

114. Saito, Т., Yamanaka, K., and Okada, Y. (1990). Long-distance movement and viral assembly of tobacco mosaic virus mutants. Virology, 176, 329-336.

115. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edn. New York: Cold Spring Harbor Laboratory.

116. Sarkar, S. and Smitamana, P. (1981). A proteinless mutant of tobacco mosaic vims: evidence against the role of a viral coat protein for interference. Molecular and General Genetics, 184, 158.

117. Schmitz, J., Prufer, D., Rohde, W., Таске, E. (1996). Non-canonical translation mechanisms in plants: efficient in vitro and in planta initiation at AUU-codons of the tobacco mosaic virus enhancer sequence. Nucl. Acids Res., 24, 257-263.

118. Shaw, J.G., Plaskitt, K.A., and Wilson, T.M.A. (1986). Evidence that tobacco mosaic vims particles disassemble cotranslationally in vivo. Virology, 148, 326.

119. Shine, J. and Dalgarno, L. (1974). The З'-terminal sequence of Escherichia coli 16S ribosomal RNA: complementarity to nonsense triplets and ribosome binding sites. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 71, 1341.

120. Siegel, A., Zaitlin, M., and Sehgal, O.P. (1962). The isolation of defective tobacco mosaic virus strain. Proc. Natl. Acacl. Sci. USA, 48, 1845-1851.

121. Siegel, A., Montgomery, V.H.I., and Kolacz, K. (1976). A messenger RNA for coat protein isolated from tobacco mosaic virus infected tissue. Virology, 73,363-371.

122. Skuzeski, J.M, Nichols, L.M., Gesteland, R.F., and Atkins, J.F. (1991). The signal for a leaky UAG stop codon in several plant viruses includes the two downstream codons. J. Mol. Biol, 218, 365-373.

123. Sleat, D.E., Gallie, D.R., Jefferson, R.A., Bevan, M.W., Turner, P.C., and Wilson, T.M.A. (1987). Characterisation of the 5 -leader sequence of tobacco mosaic virus RNA as a general enhancer of translation in vitro. Gene, 60,217-225.

124. Sleat, D.E., Hull, R„ Turner, P.C., and Wilson, T.M.A. (1988). Studies on the mechanism of translational enhancement by the 5 -leader sequence of tobacco mosaic virus RNA. Eur. J. Biochem., 175, 75-86.

125. Stubbs, G. and Stauffacher, C. (1981). Structure of the RNA in tobacco mosaic virus. J. Mol. Biol., 152, 387-396.

126. Stubbs, G., Warren, S., and Holmes, K. (1977). Structure of RNA and RNA binding site in tobacco mosaic virus from 4 A map calculated from X-ray fibre diagrams. Nature (London), 267, 216-221.

127. Sulzinslci, M.A., Gabard, K.A., Palukaitis, P. and Zaitlm, M. (1985). Replication of tobacco mosaic virus. VIII. Characterization of a third subgenomic TMVRNA. Virology, 132-140.

128. Takamatsu, N., Ohno, Т., Meshi, T. and Okada, Y. (1987). Expression of bacterial chloramphenicol acetyltransferase gene in tobacco plants mediated by TMV RNA. EMBO J., 6, 307-311.

129. Takamatsu, N, Watanabe, Y., Meshi, T. and Okada, Y. (1990). Mutational analysis of the pseudoknot region in the 3 noncoding region of tobacco mosaic virus RNA. J. Virol., 64, 3686-3693.

130. Takamatsu, N., Watanabe, Y., Iwasaki, Т., Shiba, Т., Meshi, Т., and Okada, Y. (1991). Deletion analysis of the 5'-untranslated leader sequence of tobacco mosaic vims RNA. J. Virol., 65, 1619-1622.

131. Teterina, N.L., Kean, K.M., Gorbalenya, A.E., Agol, V.I., and Girard, M. (1992). Analysis of the functional significance of amino acid residues in the putative NTP-binding pattern of the poliovirus 2C protein. J. Gen. Virol., 73, 1977-1986.

132. Tucker, E.B. (1982). Translocation in the staminal hairs of Setcreasea purpurea. I. Study of cell ultrastructure and cell-to-cell passage of molecular probes. Protoplasma, 113, 193-201.

133. Tyc, K., Konarska, M., Gross, H.J., and Filipowicz, W. (1984). Multple ribosome binding to the 5 -terminal leader sequence of TMV RNA. Assembly of an 80S ribosome-mRNA complex at the AUU codon. Eur. J. Biochem., 140, 503-511.

134. Van Belkum, A., Abraham, J.P., Pleij, C.W.A., and Bosch, L. (1985). Five pseudoknots are present at the 204 nucleotides long 3 noncoding region of tobacco mosaic virus RNA. Nucl. Acids Res., 13, 7673-7686.

135. Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P. & Baulcombe, D. (2003). An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the pl9 protein of tomato bushy stunt virus. Plant J., 33, 949-956.

136. Waigmann, E. and Zambryski, P. (1995). Tobacco mosaic virus movement protein-mediated protein transport between trichome cells. The Plant Cell, 7, 2069-2079.

137. Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., and Citovsky, V. (2004). The ins and outs of nondestructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit. Rev. Plant Sci., 23, 195-250

138. Watanabe, Y., Meshi, T. and Okada, Y. (1984b). The initiation site for transcription of the TMV 30 kDa protein messenger RNA. FEBS Letters, 173,247-250.

139. Watanabe, Y., Ogawa, Т., and Okada, Y. (1992). In vivo phosphorylation of the 30-kDa protein of tobacco mosaic virus. FEBS Letters, 313, n.2, 181184.

140. Wilson, T.M.A. (1984) Cotranslational disassembly of tobacco mosaic virus in vitro. Virology, 137, 255.

141. Wilson, T.M.A. (1986). Expression of the large 5'-proximal cistron of tobacco mosaic virus by 70S ribosomes during cotranslational disassembly in a procaryotic cell-free system. Virology, 152, 277.

142. Wolf, S., Deom, C.M, Beachy, R.N. and Lucas, W.J. (1989). Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit. Science, 246, 377-379.

143. Wu, X. J., Shaw, J.G. (1997). Evidence that a viral replicase protein is involved in the disassembly of tobacco mosaic virus particles in vivo. Virology, 239, 426-434.

144. Zaitlin, M. (1999). Elucidation of the genome organization of tobacco mosaic virus. Phil Trans. R. Soc. bond. 354, 587-591

145. Zerfass, K. and Beier, H. (1992). Pseudouridine in the anticodon GlFA of plant cytoplasmic tRNATy' is required for UAG and UAA suppression in the TMV-specific context. Nucl. Acids Res., 20, 5911-5918.

146. Zimmern, D. (1977). The nucleotide sequence at the origin for assembly on tobacco mosaic virus RNA. Cell, 11, 463-482.

147. Zvereva, S.D., Ivanov, P.A., Skulachev, M.V., Klyushin, A.G., Dorokhov, Y.L., Atabekov, J.G. (2004). Evidence for contribution of an internal ribosome entry site to intercellular transport of a tobamovirus. J Gen Virol, 85, 1739-44.