Исследование роли транспорта макромолекул в бактериальном и вирусном патогенезе растений и создание биотехнологической платформы продукции фармацевтических белков тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, доктор биологических наук Комарова, Татьяна Валерьевна

• Комарова, Татьяна Валерьевна
• доктор биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации доктор биологических наук Комарова, Татьяна Валерьевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бактериальная инфекция и иммунитет растений

1.1. Модель зигзага, объясняющая взаимоотношение растения и патогена

1.2. Репертуар эффекторов и индукция ETI

1.3. Состояние растения-нехозяина по отношению к патогену

1.4. Ко-эволюция R-генов хозяина и эффекторов возбудителя

2. Роль устьиц в бактериальном патогенезе

3. «Переформатирование» ядра хозяйской клетки как неотъемлемая составляющая процесса бактериальной колонизации растения

3.1. Трансформация растительной клетки ДНК Agrobacterium с помощью системы IV типа секреции

3.2. Бактериальные белки, модифицирующие экспрессию генома клеток растения, и система III типа секреции

3.2.1. Нуклеомодулгшы Xanthomonas

3.2.2. Эффекторы Pseudomonas syringae

3.2.3. Белки T3SS Pantoea

3.3. Бактериальные ферменты, изменяющие экспрессию генов клеток хозяина за счет влияния на посттрансляционную модификацию

4. Роль плазмодесм в развитии бактериальной инфекции

4.1. Строение плазмодесм

4.2. Плазмодесма как поле битвы растения и бактерии

5. Роль летучих органических соединений растения в развитии вирусной инфекции

5.1. JIOC как продукты метаболических путей растения

5.2. Роль повреоіедения в эмиссии ЛОС и вирусной инфекции растений

5.3. Праймирование растений, вызванное ЛОС, и его роль в вирусной инфекции

5.4. ЛОС и переносчики вирусов

5.4.1. Неперсистентные вирусы

5.4.2. Персистентные вирусы

У

6. Система транзиентной экспрессии - патогены растений для целей

биотехнологии

6.1. Агроинъекция и бинарные векторы

6.2. Иереплгщирующиеся векторы

6.3. Реплицирующиеся векторы

6.3.1. Тобамовирусы

6.3.2. Пошексвирусы

6.3.3. Потивирусы

6.3.4. Бромовирусы

6.3.5. Комовирусы

6.3.6. Система MagnlCON

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Экспериментальная модель экспорта кнРНК из ядра растительной клетки

2. Эффект, оказываемый кнРНК на репродукцию фитовирусов

3. Влияние кмРНК на репродукцию геномной РНК вируса растений

4. Модель экспорта мРНК из ядра цитоплазму

5.1. Разработка метода количественного измерения газообразного метанола, испускаемого травмированным растением

5.2. Определение количественных параметров эмиссии метанола и

состава газов, испускаемых травмированным растением

5.3 . Идентификация в растении генов чувствительных к метанолу

6. Исследование участия метанола в межклеточном транспорте растений

7. Метанол вызывает повышение репродукции ВТМ в растении

8. Активизация межклеточного транспорта в растении связана с развитием антибактериальной устойчивости

8.1. Индукция антибактериальной устойчивости в листьях, обработанных газообразным метанолом и г(ис-3-гексен-1-олом в закрытой системе

8.2. Исследование роли метанола в развитии системной устойчивости растения к бактерии R. solanacearum на модели табака, трансгенного по ПМЭ

8.3. Индукция антибактериальной устойчивости в листьях растений, обработанных газообразным метанолом в проточной системе

8.4. Влияние метанола на число фокусов экспрессии GFP в листьях, агроинъецированных вирусным вектором KpBTM.GFP

9. Концепция участия межклеточного транспорта макромолекул в бактериальном и вирусном патогенезе растений

10. Исследование роли метанола и NCAPP в модификации ядерно-цитоплазматического транспорта клетки

11. Биотехнологические основы эффективной продукции вакцин и антител в растении

11.2. Вектор на основе транскрнщионной кассеты РНК-полимеразы 1

11.1. Разработка систем продукции вакцинных белков в растениях

11.2. Технологическая платформа продукции фармаі{евтических

препаратов в растении

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Avr - ген/белок авирулентности BG - р-1,3-глюканаза

CDK - calcium-dependent kinase, кальций-зависимая киназа dpi - дней после инъекции

ETI - effector-triggered immunity, вызываемый эффекторами иммунитет

ETS - effector-triggered susceptibility, чувствительность, вызванная эффектором

FPS - фарнезил пирофосфат-синтаза

GC - gas chromatography, газовая хроматография

GFP - green fluorescent protein, зеленый флуоресцирующий белок

HR - hypersensitive response, гиперчувствительный ответ

IgG - иммуноглобулин класса G

1RES - internal ribosome entry site, область внутренней посадки рибосом LOX - липоксигеназа

LRR - leucine-rich repeat, лейцин-богатый повтор

МАМР - микроб-ассоциированные молекулярные паттерны

МАРК - mitogen-activated kinase, митоген-активируемая киназа

МТ - метилтрансферазный домен репликазы

NB - nucleotide-binding, нуклеотид-связывающий домен белка

NCAP - non-cell authonomous protein, неклеточный автономный белок

NCAPP - non-cell authonomous pathway protein, рецептор неклеточного автономного белка

NLS - nuclear localization signal, сигнал ядерной локализации PAL - фенилаланин аммоний-лиаза

РАМР - патоген-ассоциированные молекулярные паттерны PI-II - proteinase inhibitor II, ингибитор протеаз II типа

PMEi - ингибитор ПМЭ

PR - pathogenesis-related, связанный с патогенезом белок/ген

PRR - pattern recognition receptor, рецептор, узнающий молекулярные паттерны

PTI - pathogen-triggered immunity, иммунитет, индуцируемый патогеном

RB и LB - right border, left border, последовательности, фланкирующие Т-ДНК

RLK - receptor-like kinase, рецептор-подобная киназа

RLP - receptor-like protein, рецептор-подобный белок

SAR - systemic acquired resistance, приобретенная системная устойчивость растения

SEL - size exclusion limit,пропускная способность (плазмодесм)

T3SS (или TTSS) - type III secretion system, система секреции III типа

T4SS - type IV secretion system, система секреции IV типа

TAL - transcription activator-like, белковые эффекторы, подобные транскрипционным активаторам

Y-BK - Y вирус картофеля

АБК - абсцизовая кислота

АФК - активные формы кислорода

БО - белок оболочки

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВЖКЯ - вирус желтой карликовости ячменя

ВККТ - вирус курчавой карликовости томатов

ВМК - вирус мозаики костра

ВМКГ - вирус мозаики коровьего горошка

BMJI - вирус мозаики люцерны

ВМЦК - вирус мозаики цветной капусты

ВОМ - вирус огуречной мозаики

ВСЛК - вирус скручивания листьев картофеля

ВТМ - вирус табачной мозаики

ГПГ - горизонтальный перенос генов

ДСН - додецилсульфат натрия

ЖК - жасмоновая кислота

кДНК - комплементраная ДНК

кмРНК - короткие мРНК

кнРНК - короткие некодирующие РНК

крВТМ - тобамовирус, заражающий растения сем. Крестоцветные

КС - клеточная стенка

ЛЗЛ - ДОС зеленых листьев

ЛОС - летучие органические соединения

ЛЦ - легкая цепь МА

МА - моноклональные антитела

МЖК - метилжасмоновая кислота

МИГ - метанол-индуцируемый ген

мРНК - матричная РНК

МСК - метилсалициловая кислота

нт - нуклеотид

НТО - нетранслируемая область ОРС - открытая рамка считывания

ОТ-РВ-ПЦР - количественная ПЦР в реальном времени с предварительным получением кДНК с помощью обратной транскрипции

ПААГ - полиакриламидный гель

ПД - плазмодесма

ПК - промежуточная конструкция

ПМ - плазматическая мембрана

ПМЭ - пектинметилэстераза

ПТМ - посттрансляционная модификация

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РЕП - репликаза

рРНК - рибосомальная РНК

сгПр - субгеномный промотор

сгРНК - субгеномная РНК

СК - салициловая кислота

ТБ - транспортный белок

ТБГ - тройной блок генов

тРНК - транспортная РНК

ТЦ - тяжелая цепь МА

УИС - участок инициации сборки вируса

УФ - ультрафиолет

ФТ - фитотрастузумаб

ХВК - X вирус картофеля

ХЕЛ - хеликазный домен репликазы

ЭР - эндоплазматический ретикулум

ЭТ - этилен

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование роли транспорта макромолекул в бактериальном и вирусном патогенезе растений и создание биотехнологической платформы продукции фармацевтических белков»

ВВЕДЕНИЕ

Произрастая в агробиоценозах, растения постоянно испытывают давление внешних факторов окружающей среды, как биотической, так и абиотической природы. Повреждающее воздействие ветра, осадков или фитофагов нарушают целостность покровных тканей растения, открывая путь для проникновения внутрь различных патогенов. Растения в ответ на вторжение вирусов и бактерий синтезируют макромолекулы (РНК и белки), транспортируемые в различные ткани и органы. Существует три уровня движения макромолекул по растению: (а) ядерно-цитоплазматический транспорт, включающий перемещение РНК из ядра в цитоплазму и движение белков, синтезированных в цитоплазме, в ядро; (б) межклеточное перемещение РНК и белка (ближний транспорт); (в) дальний транспорт по сосудистой системе растения белков и РНК, в том числе вирусных нуклеопротеидов. Вирусы и бактерии различаются между собой в способности эксплуатировать эти три уровня транспорта. Вирусы растений, большая часть из которых цитоплазматические РНК-содержащие вирусы, активно используют ближний и дальний транспорт для переноса генетического материала по растению. Бактерии, как внеклеточные патогены, не нуждаются в транспорте генетического материала по растению, однако при колонизации используют ядерно-цитоплазматический транспорт, вводя белковые факторы вирулентности в хозяйское ядро для его «переформатирования». Современное представление о вирусном и бактериальном патогенезе предполагает возможность конкурентных взаимоотношений между макромолекулами хозяина и патогена на уровне транспорта. Однако экспериментальных данных на этот счет недостаточно, что определяет актуальность исследования роли транспорта макромолекул в иммунитете растений.

При рассмотрении ядерно-цитоплазматического транспорта макромолекул в растении следует иметь в виду, что растения в ответ на внешнее воздействие и атаку патогена проявляют серию защитных реакций, включающих повышенную транскрипцию некодирующих и кодирующих участков генома, вовлеченных в адаптивные реакции растений. Ядро растительной клетки структурно и функционально отделено от цитоплазмы, поэтому ядерно-цитоплазматический экспорт

РНК через ядерную пору играет фундаментальную роль в регуляции генома. В последние годы установлена важная роль коротких некодирующих РНК (кнРНК) в иммунитете растений и в проявлении защитных реакций в ответ на вирусную и/или бактериальную инфекцию. В частности показана связь между вирулентностью вирусов и уровнем накопления в цитоплазме кнРНК (Bazzini и др., 2007, 2011). Более того, установлено, что суперэкспрессия кнРНК и увеличение их содержания в цитоплазме стимулирует репродукцию вируса табачной мозаики (ВТМ) (Dorokhov и др., 20066). Молекулярные механизмы этих явлений неясны и требуют дополнительных экспериментов для выяснения роли ядерного экспорта РНК в реакциях растений на бактериальную и вирусную атаку. Этим определяется необходимость создания экспериментальной модели экспорта мРНК, а также коротких некодирующих РНК из ядра растительной клетки. На подобной модели можно охарактеризовать молекулярные механизмы конкуренции РНК за экспорт из ядра в цитоплазму и изучить участие ядерного транспорта макромолекул в бактериальном и вирусном патогенезе растений.

На втором уровне транспорта клеточных макромолекул, когда через плазмодесмы происходит перенос клеточных белков, например, транскрипционных факторов хозяина и кодирующих их мРНК, также может происходить конкуренция с вирулентными факторами патогенов, а именно, с вирусными транспортными белками (ТБ) и эффекторными молекулами бактерий. Вероятность такой конкуренции до сих пор не исследовалась, прежде всего, из-за отсутствия адекватной экспериментальной модели, позволяющей изучать роль межклеточного транспорта в бактериальном и вирусном патогенезе в условиях, максимально приближенных к природным. В интактном растении табака только молодые (0,5-3,0 см) верхние быстрорастущие листья, являющиеся акцепторами (sink) фотоассимилятов, характеризуются наличием «открытых» плазмодесм и интенсивным межклеточным транспортом. Эти листья, однако, не представляют собой природных «ворот» инфекции и малопригодны для экспериментального заражения. С другой стороны, зрелые крупные (10-20 см) листья табака, являющиеся донорами (source) фотоассимилята и обычно использующиеся для экспериментального заражения ВТМ и бактериями, такими как Ralstonia

9

8о1апасеапип и А^гоЪас1ег'шт 1ите/асгет, содержат плазмодесмы, которые «закрыты» для крупных макромолекул. Пропускная способность плазмодесм «зоигсе»-листьев увеличивается при вирусной инфекции, например, с помощью транспортного белка вируса. Оптимальной экспериментальной системой могли бы быть растения, у которых плазмодесмы «зоигсе»-листьев «открываются» при воздействии газообразного вещества, не повреждающего листья и не вносящего в систему фактор травмы. Вообще, летучие органические вещества, которые могут играть роль сигналов коммуникации между растениями, известны достаточно давно. Среди них идентифицирован метанол, который образуются в реакции деметилирования пектина ферментом клеточной стенки табака, пектинметилэстеразой (ПМЭ). В нашей лаборатории этот фермент впервые был идентифицирован в качестве рецептора транспортного белка ВТМ (БогокЬоу и др., 1999).

Использование разработанной экспериментальной системы контролируемого межклеточного транспорта позволит проверить выдвинутую ранее гипотезу относительно участия ПМЭ и метанола в регуляции межклеточного транспорта и патогенезе растений (Дорохов, 2007). Кроме того, именно в условиях данной системы появляется возможность исследования роли ПМЭ и метанола как факторов мобилизации растительного сообщества в ответ на травму и проникновение вирусного или бактериального патогена.

В последние годы биотехнология рассматривает растения в первую очередь в качестве некоего «ферментера» рекомбинантных фармацевтических молекул, включая ферменты, вакцины и антитела. Поэтому другим направлением нашего исследования является определение молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействия растения и вируса в искусственных условиях растения-биофабрики. Наиболее эффективными оказались системы продукции, основанные на введении вирусного вектора, кодирующего целевой белок, с помощью бактерии Agrobacteril^m иипе/аЫет в клетки растения ЪИсойапа Ьешкттста. Этот подход позволяет получить временную экспрессию гена целевого белка с высоким выходом конечного продукта и в короткие сроки (до 7 дней). Таким образом, мы рассматриваем возможность практического применения выявленных закономерностей

10

переноса макромолекул хозяина и патогена в клетке и между клетками. Выяснение молекулярных механизмов, лежащих в основе подобных систем экспрессии, также представляется актуальным.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является расшифровка молекулярных механизмов участия ядерно-цитоплазматического и межклеточного транспорта макромолекул в бактериальном и вирусном патогенезе растений, а также создание на их основе биотехнологической платформы продукции фармацевтических белков.

Для достижения вышеописанной цели поставлены следующие задачи:

1. Создать экспериментальную модель экспорта РНК из ядра растительной клетки.

2. Изучить молекулярные механизмы и создать концепцию участия ядерного транспорта макромолекул в бактериальном и вирусном патогенезе растений.

3. Разработать экспериментальную модель модификации межклеточного транспорта макромолекул в листьях растений с использованием газообразного метанола.

4. Исследовать молекулярные механизмы и роль транспорта макромолекул в иммунитете растений и создать концепцию конкуренции макромолекул хозяина и патогена на уровне ядерно-цитоплазматического и межклеточного транспорта за общие рецепторы или белки переносчики.

5. Разработать биотехнологические основы эффективной продукции вакцин и антител в растении.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бактериальная инфекция и иммунитет растений

Вторжение фитопатогенных бактерий сопровождается индукцией иммунной системы растений (Jones и Dangl, 2006). При этом растение использует различные способы защиты. Патогенные бактерии размножаются в межклеточном пространстве (апопласт), попадая туда вместе с воздухом или водой (через устьица и гидатоды, соответственно), или через раневую поверхность растительной ткани. Растения, в отличие от млекопитающих, не имеют подвижных клеток-защитников и соматической адаптивной иммунной системы. Вместо этого они располагают врожденным иммунитетом отдельных клеток и системными сигналами, исходящими из места инфекции (Dangl и др., 2001; Ausubel и др., 2005; Chisholm и др., 2006).

1.1. Модель зигзага, объясняющая взаимоотношение растения и патогена

Антибактериальный иммунитет растений рассматривают как опосредованное взаимодействие хозяйской клетки и бактерии, т.е. взаимодействие хозяйских белков устойчивости (R-белков), кодируемых R-генами растения, и бактериальных белков-эффекторов. В рамках известной гипотезы «охранника» (guard hypothesis) (см. ниже) R-белки распознают возбудителя не напрямую, а через его эффекторы (Jones и Dangl, 2006; Chisholm и др., 2006), и затем передают сигнал, запуская защитные реакции. В настоящее время считается, что иммунная система растений является многоуровневой. Первый уровень, иммунитет, индуцируемый патогеном (PTI, от англ. pathogen-triggered immunity) представляет собой систему трансмембранных рецепторов (pattern recognition receptor, PRR), узнающих консервативные белковые и полисахаридные компоненты патогенов - молекулярные паттерны. Среди PRR есть рецептор-подобные киназы (RLK, от англ. receptor-like kinase) и рецептор-подобные белки (RLP, от англ. receptor-like protein).

Этот механизм индуцируется на первых стадиях инфекции в ответ на появление молекулярных паттернов патогенов (микроб- или патоген-ассоциированные молекулярные паттерны, MAMP/PAMP) (Albert и др., 2010; Segonzac и Zipfel, 2011). Одним из наиболее хорошо изученных РАМР является флагеллин (Zipfel и др., 2005). В течение нескольких минут после детекции рецепторами РАМР запускается защитный ответ, включающий в себя повышение концентрации внутриклеточного Са++ и образование реактивного кислорода, кроме того, активируются различные киназы, в том числе кальций-зависимые (CDK, от англ. calcium-dependent kinase) и митоген-активируемые (МАРК, от англ. mitogen-activated kinase), что приводит к фосфорилированию ряда клеточных белков, изменению экспрессии генов и синтезу различных антимикробных молекул (Dodds и др., 2010; Torres и др., 2010; Тепа и др., 2011). Активация PTI приводит к закрытию устьиц [при участии абсцизовой (АБК) и салициловой кислоты (СК)], отложению каллозы в районе плазмодесм и повышению экспрессии РАМР-индуцируемых генов (Сао и др., 2011). В целом, важную роль в защитных реакция против патогена играет баланс между системами, регулируемыми СК и этиленом/жасмонатом (ЭТ/ЖК). СК необходима для индукции гиперчувствительного ответа (HR, от англ. hypersensitive response) при детекции эффекторов, этим обеспечивается устойчивость против биотрофов. ЭТ и ЖК сдерживают отмирание тканей, предотвращая распространение некротрофов (Glazebrook и др., 2005).

Однако большинство адаптированных патогенов успешно преодолевают данный защитный барьер, избегая узнавания своих молекулярных паттернов или блокируя PTI с помощью эффекторов. В этом случае, растение-хозяин, устойчивое к патогену, детектирует наличие бактериальных эффекторов напрямую или опосредованно с помощью компонентов второго уровня защиты, обозначаемого как вызываемый эффекторами иммунитет (ETI, от англ., effector-triggered

immunity). Хотя известно множество неродственных семейств белков, которые участвуют в ETI, большинство из них принадлежит к крупнейшему классу полиморфных NB-LRR белков (от англ., nucleotide-binding leucine-rich repeat), кодируемых R-генами (Tameling и Takken, 2008). Эти белки содержат характерные домены: область связывания нуклеотидов (nucleotide-binding, NB) и участок лейцин-богатых повторов (leucine-rich region, LRR). LRR-домен нужен для поддержания NB-LRR белка в неактивном состоянии в отсутствие патогена, в то же время С-концевая часть домена содержит участок специфического узнавания эффекторов (Takken и Goverse, 2012). NB-LRR белки могут быть локализованы как в цитоплазме, так и в ядре в зависимости от того, в каком компартменте находится потенциальный эффектор, узнаваемый тем или иным NB-LRR белком (Elmore и др., 2011).

NB-LRR белки одновременно являются сенсорами, «переключателями» и факторами иммунного ответа растения. NB-LRR-опосредованная устойчивость к болезням эффективна против патогенных микроорганизмов, являющихся как биотрофами (паразитирующими на живых тканях), так и гемибиотрофами (заражающими живые ткани, но продолжающими жить и после их отмирания). Эта система не действует против патогенных микроорганизмов, которые убивают ткани хозяина во время колонизации (некротрофов) (Glazebrook и др., 2005).

Современное представление об иммунной системе растений хорошо иллюстрируется моделью пяти поэтапных «зигзагов» (рис. JI-1) (Jones и Dangl, 2006).

В фазе 1 РАМР (или МАМР), узнаются PRR, что приводит к PTI (pathogen-triggered immunity), и в ряде случаев к предотвращению дальнейшей колонизации. В фазе 2 успешное функционирование патогенных эффекторов способствует вирулентности возбудителя. Эффекторы могут нарушать PTI, ослабляя его, а это приводит к

чувствительность, вызванная эффектором (ETS, от англ. effector-triggered susceptibility).

высокая

Рисунок JI-1. Модель зигзага иллюстрирует градацию силы и эффективность иммунного ответа растения. В этой схеме интенсивность сопротивления или восприимчивости к болезни пропорциональна формуле [PTI-ETS+ETI]. В фазе 1 растение детектирует микроб-/патоген-ассоциированные молекулярные маркеры (МАМР/РАМР, красные ромбы) через PRR, чтобы вызвать РАМР-запускаемый иммунный ответ (PAMP-triggered immunity, PTI). В фазе 2 успешный патоген вводит эффекторы, которые снижают PTI и, таким образом, обеспечивают возбудителю питание и расселение (колонизацию), в результате чего происходит переход к фазе чувствительности, запускаемой эффектором (effector-triggered susceptibility, ETS). В фазе 3 эффектор (красный круг) напрямую или опосредованно узнается NB-LRR-белком (красные фигуры), активируя иммунность, запускаемую эффектором (effector-triggered immunity, ETI), которая представляет собой усиленную «версию» PTI. В результате зачастую достигается и преодолевается порог индукции гиперчувствительного ответа (HR), приводящего к отмиранию пораженной ткани. В фазе 4 появляются штаммы патогена, которые потеряли один из эффекторов (красный) и, возможно, приобрели новые эффекторы (сиреневые) через горизонтальный перенос генов. Подобное эволюционное приспособление может служить патогену для подавления ETI. Отбор благоприятствует появлению у растений новых NB-LRR-аллелей (соответствующие белки обозначены сиреневыми многоугольниками), которые могут распознать один из недавно приобретенных патогеном эффекторов, что приводит опять к ETI - фаза 5. {По Jones & Dangl, 2006.; с разрешения Nature Publishing Group №3034020418322 от 22 ноября 2012 года).

В фазе 3 эффектор может специфически распознаваться одним из NB-LRR белков, в результате чего активируется ETI. Подобное

узнавание может быть либо косвенным, либо прямым. ETI представляет собой ускоренный и усиленный PTI ответ, давая устойчивость к болезням и, как правило, приводящий к гиперчувствительному ответу (HR) и гибели клеток в месте инфекции. Фаза 4 отражает возможность преодоления ETI в результате того, что патогены теряют или диверсифицируют эффекторные гены или приобретают дополнительные новые эффекторы, подавляющие ETI. И также вследствие естественного отбора R-гены могут получать новую специфичность так, чтобы ETI снова вызывался в ответ на эффекторы патогена. Т.е. в природе существуют эволюционные «качели», подразумевающие постоянную адаптацию и совершенствование систем эффекторов патогена и иммунного ответа растения-хозяина.

1.2. Репертуар эффекторов и индукция ETI

Jones и Dangl (2006) определяют базовую устойчивость растений к болезням, как ту, которая активируется вирулентным возбудителем на восприимчивом хозяине. Таким образом, наиболее точное определение формулы базовой устойчивости должно быть [PTI+слабая ETI - ETS].

Основная функция цитоплазматических эффекторов патогенов заключается в подавлении PTI, который вызывается такими компонентами бактерий, как флагеллин, липополисахарид (LPS), пептидогликан и фактор элонгации Tu (Boller и др., 2009). Архетипическим элиситором, запускающим PTI, является бактериальный флагеллин, индуцирующий защитные реакции у различных растений (Gomez-Gomez и др., 2002). Синтетический 22-аминокислотный пептид (flg22) из консервативного домена флагеллина является достаточным, чтобы индуцировать многие клеточные реакции, включая быструю (в течение 1 ч) транскрипционную активацию более 1000 генов Arabodopsis (Zipfel и др., 2004). Генетическая селекция нечувствительных к flg22 мутантов выявила рецепторную LRR-киназу, FLS2, которая связывает flg22 (Chinchilla и др., 2006). Течение этапа PTI

зависит от системы сигнальных киназ, которые характеризуются ограниченным полиморфизмом и высокой избыточностью. Например, FLS2 является эволюционно древним PRR, узнающим флагеллин и широко распространенным у высших растений (Segonzac и Zipfel, 2011). Тем не менее, у РЬ82-дефицитных растений Arabidopsis только частично нарушен иммунитет (Zipfel и др., 2004) и они распознают несколько бактериальных РАМР. FLS2 является RLK, включающей сигнальный каскад, состоящий из МАР-киназы и CDPK. Таким образом, система реагирования растения представляется избыточной, a PTI многоуровневым, поэтому патогену, подобному P. syringae необходимо иметь несколько эффекторов для результативного заражения хозяина.

Итак, успешный (вирулентный) патоген способен подавить PTI. Что же для этого необходимо? Прежде всего, нужен разнообразный набор эффекторов, которые обеспечивают распространение патогена и его питание. Поэтому патогенные бактерии доставляют от 15 до 30 эффекторов в клетку хозяина с помощью подобного шприцу аппарата секреции III типа (T3SS) (подробнее см. ниже). Здесь важно подчеркнуть, что эффекторы, передаваемые T3SS, необходимы для ослабления PTI и обеспечения успешной колонизации растения (Nomura и др., 2005).

Репертуар эффекторов включает в себя и небольшие молекулы, которые имитируют растительные гормоны. Некоторые штаммы Р. syringae синтезируют коронатин, имитирующий жасмоновую кислоту и подавляющий механизм защиты биотрофных патогенов с участием системы закрытия устьиц, помогая бактериям получить доступ к апопласту (Zhao и др., 2003; Brooks и др., 2005) (подробнее см. ниже).

Эффекторы, которыми обладают патогены для преодоления PTI, узнаются определенными R-белками. Как уже упоминалось ранее, большинство R-генов кодируют NB-LRR-белки. В геноме Arabidopsis Col-0 идентифицировано 125 таких генов. Если хотя бы один эффектор будет узнан соответствующим NB-LRR белком, последует ETI.

Узнанный или выявленный эффектор обозначают как белок авирулентности (Avr). ETI является более быстрой и мощной версией PTI, часто завершающейся HR (Greenberg и др., 2004) (рис. J1-1). Считается, что HR, как правило, не выходит за рамки инфицированной клетки. С другой стороны, немногое известно о сигнальных событиях, необходимых для активации ETI, опосредованной NB-LRR. Эта активации включает в себя внутри- и межмолекулярные конформационные изменения NB-LRR, участие белка теплового шока 90, других шаперонов и напоминает механизм действия белка Apaf-1 в программируемой клеточной смерти у животных (Takken и др., 2004). Стоит отметить, что эффекторы возбудителей из разных царств узнаются родственными NB-LRR белками и активируют похожие системы защиты (Collier и Moffett, 2009), т.е. относительно небольшое число NB-LRR белков может узнавать тысячи различных эффекторов. Для объяснения этого феномена была предложена гипотеза «охранника» (Dangl и Jones, 2001; Nishimura и Dangl, 2010), которая подразумевает непрямое узнавание эффекторов, хотя известны случаи и непосредственного белок-белкового взаимодействия.

Основными утверждениями гипотезы «охранника» являются следующие: (1) эффекторные молекулы, выступая в качестве фактора вирулентности, имеют свои мишени в клетке хозяина; (2) модифицируя ту или иную мишень или используя ее, эффекторные молекулы способствуют успешной колонизации тканей хозяина, чувствительного к данному патогену, и (3) взаимодействие эффектора с мишенями хозяина и модификация последних приводит к запуску системы «патоген-индуцируемой самомодификации», активирующей соответствующий NB-LRR-белок и в конечном итоге ETI. Т.е. один NB-LRR-белок может распознавать результат действия множества неродственных эффекторов, но в то же время различные NB-LRR-белки «наблюдать» за одной и той же хозяйской мишенью эффекторов патогена. Важным следствием этой

модели, поддерживаемым современными экспериментальными данными (Nishimura и Dangl, 2010), является следующее: (1) разнообразные эффекторы могут независимо эволюционировать для того, чтобы приобрести способность воздействовать на одну и ту же мишень, что приводит к (2) возможности эволюции сразу нескольких связанных с данной мишенью NB-LRR-белков, которые (3) будут активироваться различными каскадами «патоген-индуцируемой самомодификации», запущенными воздействием вышеуказанных эффекторов (1) на мишень.

PTI и ETI различаются между собой по вызывающим их типам элиситоров, но возбудители во время инфекции синтезируют сложные смеси эффекторных молекул, что неизбежно создает перекрытие между PTI и ETI и делает затруднительной их четкое разделение (Katagiri и др., 2010; Thomma и др., 2011; Qi и др., 2011).

1.3. Состояние растения-нехозяина по отношению к патогену

На протяжении всего времени существования покрытосемянных и высших растений происходила ко-эволюция растения и патогена. Большинство растений способно противостоять инфекции болезнетворных микроорганизмов, и такие растения могут быть охарактеризованы как «нехозяева» В основе устойчивости растений-нехозяев, по-видимому, два механизма. Первый механизм основан на неэффективности эффектора патогена при его попытке заразить эволюционно дивергентного хозяина, в результате чего PTI срабатывает успешно, и дальнейшее развитие инфекции предотвращается. Следовательно, репродукции потенциального возбудителя не происходит. Второй, альтернативный механизм состоит в том, что одна или несколько эффекторных молекул узнается NB-LRR-белками, но другими, отличными от NB-LRR-белков ко-адаптированного и чувствительного хозяина. Это также приводит к ETI. В основе устойчивости «нехозяина» может быть сочетание параллельных ответов ETI. Например, даже четыре бактериальных эффектора Р. syringae pv.

tomato PT23 не обеспечивают способность колонизировать сою, поскольку запускают активность специфических R-генов (Takken и др., 2006). Удаление этих эффекторных генов из томатного штамма Р. syringae снижает его вирулентность на растениях томатов, но, тем не менее, не обеспечивает способность заражать сою (Kobayashi и др., 1989). Таким образом, очевидно, что существуют другие неизвестные нам факторы, требующиеся для колонизации. Это указывает на многообразие проявления ETI.

1.4. Ко-эволюция R-генов хозяина и эффекторов возбудителя

Исследования фитопатогенных бактерий свидетельствуют о том, что патогены способны обойти контроль хозяина и избежать ETI. Несмотря на то, что эффективность ETI повышается, а система защиты растения совершенствуется, эволюция микроба идет по пути усовершенствования эффекторов для предотвращения узнавания опосредованного NB-LRR-белками (Tian и др., 2003). Механизм этого явления напоминает гонку вооружений или вечную историю противостояния щита и меча. Для того чтобы понять эволюционную историю белков T3SS Р. syringae Rohmer с соавторами (Rohmer и др., 2004) искали гомологи для 44 известных или потенциальных эффекторов T3SS, а также двух эффекторных шаперонов. Было проанализировано 24 генных семейства, распределенных среди многочисленных штаммов Р. syringae, с точки зрения аминокислотной вариабельности, разнообразия последовательностей и других особенностей, указывающих на горизонтальный перенос генов. Оценка роли диверсификации генов дала возможность установить, что в то время как некоторые эффекторы T3SS были приобретены недавно, другие развивались преимущественно прямым наследованием генов. Большинство кодонов у этих генов были подвергнуты, по-видимому, «очищающей» селекции, т.е. позитивной селекции, приводящей к удалению вредных для выживания организма аллелей. Это предполагает избирательное давление на гены эффекторов

для поддержания вирулентности патогена. Тем не менее, у членов 7 семейств были домены, подвергнутые диверсифицирующей селекции. Таким образом, селекция и отбор генов, кодирующих эффекторы, позволяют возбудителю увернуться от строгого хозяйского контроля и ETI (см. рис. J1-1).

2. Роль устьиц в бактериальном патогенезе

Все патогенные микроорганизмы для своего собственного воспроизводства должны иметь доступ к питательным веществам, поставляемым хозяином и, следовательно, колонизируют его органы или клетки определенного типа. В растении фитопатогенные бактерии могут заражать листья, корни, плоды и клетки эпидермиса или флоэмы. Важно, что при инфекции растений бактериальные патогены проводят и завершают свой жизненный цикл, главным образом, в межклеточном пространстве между клеточными стенками и/или на поверхности растения. Устьица - это мелкие поры на поверхности листьев, которые позволяют растению осуществлять газообмен с окружающей средой. Они играют существенную роль в поглощении С02 для фотосинтеза, но в то же время через них происходит потеря растением воды при испарении. Расположение устьиц на границе между внутренними тканями растений и окружающей средой делает их удобными воротами для эндофитной колонизации фитобактериями (Dou и Zhou, 2012; Zeng и др., 2010; Gudesblat и др., 2009). Бактерия размножается внутри листа, формируя микроколонии в тесном контакте с клеточной стенкой клеток мезофилла (Рис. JI-2). Внеклеточное существование характерно для большинства фитопатогенных бактерий, что отличает их от типичной бактериальной инфекции у млекопитающих, у которых бактерии в основном проникают внутрь клеток хозяина и там размножаются (см. обзор Pizarro-Cerda и Cossart, 2006).

Рисунок JI-2 Роль устьиц в защите растений. Схематическое изображение листа в поперечном разрезе, демонстрирующее эпидермис и мезофилл. (Слева) Патоген растений Р. syringae и патоген человека Escherichia coli существуют как эпифиты на поверхности листа, концентрируясь около устьиц. Устьица закрываются, если растением детектируются бактериальные липополисахариды (LPS), флагеллин (flg22) и другие МАМР. В процессе закрытия устьиц задействованы сигнальные пути салициловой (SA) и абсцизовой (АВА) кислот, а также OST1 (OPEN STOMATA 1) протеинкиназа. (Справа) Коронатин (COR), вещество, выделяемое Р. syringae, вызывает открытие устьиц, воздействуя на ключевой компонент сигнального пути жасмоновой кислоты, ЕЗ-лигазу (COI1 - одна из субъединиц ЕЗ-лигазы). Бактерии проникают в ткани листа (эпидермис и мезофилл) через открытые устьица, а затем вводят эффекторные молекулы в цитоплазму посредством системы секреции 3-го типа (TTSS). Бактериальные эффекторы могут подавлять экспрессию генов защиты, регулируемую МАРК сигнальными каскадами и транскрипционными факторами семейства WRKY. Затем бактерии, закрепившиеся на клеточных стенках, формируют микроколонии, размножаются и вызывают заболевание. (.По Schulze-Lefert & Robatzek, 2006; с разрешения Elsevier Limited № 3031930056114 от 18 ноября 2012 года).

Важно отметить, что растения развили механизмы регуляции открывания устьичных отверстий не только в ответ на гормоны, такие как АБК, но и на разнообразные факторы окружающей среды, например свет, влажность воздуха и содержание углекислого газа. Что касается фитопатогенов, то многие из этих организмов в своем движении проявляют тропизм к устьицам (по-видимому, к веществам, выделяемым через устьица). После заражения, подобные микроорганизмы могут по-разному влиять на поведение устьиц в зависимости от действия секретируемых патогенами веществ (Wilmer и Fricker, 1996). Если

бактериальный токсин сирингомицин запускает процесс устьичного закрытия, то коронатин и сиринголин-А Р. syringae вызывает открытие устьиц (Mott и Takemoto, 1989; Mino и др., 1987; Schellenberg и др., 2010). Известно, что в ответ на флагеллин, липополисахарид (LPS) и другие МАМР растения способны запускать закрытие устьиц. В настоящее время модель А. thaliana - Р. syringae широко используется для изучения активации защитных реакций растения и большее понимание роли устьиц в бактериальном патогенезе дали недавние исследования именно в рамках этой системы хозяин-патоген. Бактерия попадает в листья через повреждение, гидатоды или устьица. В последние годы при использовании Р. syringae получены убедительные доказательства того, что устьица эффективно функционируют как часть врожденного иммунитета растений (Melotto и др., 2006). При атаке патогена замыкающие клетки индуцируют закрытие устьиц в ответ на РАМР в течение часа, при этом часть устьиц остается открытыми, обеспечивая фоновый уровень проникновения патогена (Underwood и др., 2007). Например, при инкубации эпидермиса Arabidopsis в присутствии суспензии Р. syringae или Escherichia coli уже через час количество открытых устьиц уменьшалось с 80% до 30% от общего числа. При этом через 3 часа наблюдается возвращение доли открытых устьиц к норме в случае Р. syringae, но не Е. coli, что говорит о наличии специфических эффекторов у Pseudomonas. Продуцируемый этой бактерией коронатин, химическая структура которого сходна с метилжасмонатом, может отменить индуцированное РАМР закрытие устьиц, что позволяет Р. syringae получить доступ в межклеточное пространство даже после первоначального смыкания «створок» устьиц (Melotto и др., 2006). Интересно, что у Arabidopsis обнаружена также лектин-рецепторная киназа L-типа (LecRK-V.5), которая негативно регулирует устьичный иммунитет к Р. syringae (Desclos-Theveniau и др., 2012). Установлено, что повышенная экспрессия LecRK-V.5 приводит к

чувствительности к Р. syringae за счет индукции открытия устьиц. Потеря функции данного белка вызывает устойчивость в связи с тем, что устьица находятся в закрытом состоянии. Desclos-Theveniau и соавторы (2012) предлагают модель, согласно которой LecRK-V.5 негативно регулирует индуцируемое РАМР закрытие устьиц, воздействуя на соответствующий сигнальный путь после АБК, но до стадии продукции активных форм кислорода (АФК). Возможно LecRK-V.5 принимает участие в поддержании гомеостаза АФК в замыкающих клетках. По-видимому, наличие такого белка необходимо для предотвращения долговременного негативного влияния на процессы газообмена и фотосинтеза, вызываемого закрытием устьиц в ответ на агрессию патогена.

7 R

Только бактерии в относительно высокой концентрации КОЕ/мл) вызывают закрытие устьиц (Melotto и др., 2006). Этим объясняется тот факт, что нормальная микробная флора, живущая на поверхностности листа, не индуцирует закрытие устьиц. Формирование биопленок и бактериальной агрегации не только улучшает выживаемость эпифитных бактерий, таких как Xanthomonas cixonopodis ру. citri (Rigano и др., 2007), но также является предпосылкой для колонизации эндофитами (Danhorn и Fuqua, 2007). Важно отметить, что передача сигнала в виде небольших диффундирующих молекул от одной бактерии к другой обеспечивает создание бактериального сообщества и контролирует плотность бактерий в биопленке (Vojnov и др., 2001; Eberl и Riedel, 2011).

Бактериальный возбудитель Xanthomonas campestris заражает растения семейства Brassicaceae через устьица. Обнаружено, что X. campestris способна влиять на закрытие устьиц Arabidopsis с помощью секретируемых небольших молекул, синтез которых находится под контролем генного кластера rpf/DSF (Gudesblat и др., 2009). Секретируемые молекулы играет важную роль в вирулентности

бактерии, поскольку супернатант культуры X. сатрезичБ повышает способность мутанта Р. яугищае по синтезу коронатина проникать в листья АгаЫйорь'ш. Химическая природа диффундирующего фактора X. сатрезичБ еще не выяснена, однако предварительная характеристика указывает на то, что он может быть сходен с коронатином, иметь небольшой размер (мол. вес <2000 Да), а также экстрагироваться из культуральной жидкости этилацетатом. Установлено, что еще одним фактором, регулирующим открытие устьиц, является киназа МРКЗ АгаЫс1ор515, чувствительная к активным формам кислорода.

3. «Переформатирование» ядра хозяйской клетки как неотъемлемая составляющая процесса бактериальной колонизации растения

Патогенные и симбиотические бактерии воздействуют на клетку хозяина и, в конечном итоге, эксплуатируют ее с помощью белковых факторов, локализованных в клеточной стенке бактерии, или секретируемых молекул. Причем бактерии используют различные стратегии воздействия на жизненный цикл клетки-хозяина, а также экспрессию генов. В течение долгого времени большинство исследований ограничивалось описанием влияния бактерий, например, на перегруппировку клеточного цитоскелета, пролиферацию клеток хозяина, а также продукцию компонентов, участвующих в иммунных реакциях. Бактериальные факторы также могут воздействовать и непосредственно на ядро клетки хозяина. Ядро, как сердцевина клетки, защищает ее генетический материал, регулирует экспрессию генов и физиологию клетки, включая деление. Растущее число исследований показывает, что патогенные факторы бактерий доставляются в ядро для подавления защитных реакции клетки путем прямого вмешательства в транскрипцию, ремоделирование хроматина, репликацию ДНК и синтез мРНК. Такие бактериальные молекулы, «переформатирующие» ядро клетки хозяина, получили название нуклеомодулины (В1егпе и СозБай,

2012). Нуклеомодулины используют различные стратегии для «перепрограммирования» ядерных процессов. Это бактериальное «ядерное вторжение» может иметь долговременное генетическое или эпигенетическое влияние на хозяина. Изучение нуклеомодулинов способствует появлению новых способов борьбы с бактериальными патогенами, а также созданию новых инструментов для биотехнологических приложений.

3.1. Трансформация растительной клетки ДНК Agrobacterium с помощью системы IV типа секреции

Наиболее яркий пример воздействия на экспрессию генов клетки-хозяина представляет Agrobacterium tumefaciens, которая вызывает генетическую трансформацию растительной клетки (Citovsky и др., 2007; Gelvin, 2010). Вирулентные штаммы этих почвенных патогенов содержат Ti-плазмиду (от англ. tumor-inducing, индуцирующая образование опухоли), в составе которой имеется участок, фланкированный 25-нт несовершенными повторами (LB и RB, от англ. left border и right border), обозначенный как Т-ДНК. Т-ДНК в виде мобильной одноцепочечной ДНК (Т-нить ДНК) вводится бактерией в цитоплазму клетки-хозяина с помощью аппарата IV типа секреции (T4SS, type IV secretion system) в комплексе с бактериальными белками. Вообще, T4SS эволюционно родственна системе конъюгации и в ее состав входит несколько типов Vir-белков (для Agrobacterium это VirBl-VirBll и VirD4). T4SS нужна для одностадийного переноса белков, нуклеиновых кислот или их комплексов из бактериальной в хозяйскую клетку (Regó и др., 2010). Vir-белки, ассоциированные с Т-нитью ДНК, взаимодействуют с белковыми факторами клетки-хозяина после доставки Т-ДНК в ядро и ее интеграции в геном. Экспрессия генов Т-ДНК в составе клеточного генома приводит к неконтролируемому росту тканей растения с образованием корончатых опухолей и производству

специальных аминокислот, опинов, которые используются в качестве источника питательных веществ бактерией (McCullen и Binns, 2006).

Многочисленные молекулы бактериального белка VirE2 «одевают» и защищают Т-нить, а также содержат сигнал ядерной локализации (NLS). VirE2 участвует в ядерном импорте Т-нити при взаимодействии с растительным белком VIP1, а также с бактериальным белком VirE3 (Citovsky и др., 2007; Magori и Citovsky, 2011). Кроме того, в состав Т-комплекса входит другой NLS-содержащий белок, VirD2, ковалентно присоединенный непосредственно к 5'-концу Т-нити ДНК, играет ключевую роль в ее ядерном импорте, взаимодействуя с клеточным импортином альфа (Howard и др., 1992; Tinland и др., 1995). Однако стоит отметить, что в настоящее время имеются противоречивые данные относительно функций VirE3 и VirD2, а также набора их клеточных белков-партнеров (Pitzschke и Hirt, 2010). В ответ на заражение в растении индуцируется иммунный ответ. Однако, Agrobacterium «использует» защитные реакции клетки-хозяина в своих целях. В ходе иммунного ответа происходит активация различных МАРК, в т.ч. МРКЗ, МРК4 и МРК6 (Djamei и др., 2007). Было показано, что клеточный белок VIP1, принимающий участие в ядерном импорте Т-комплекса, фосфорилируется МРКЗ. Стресс-индуцируемое фосфорилирование VIP1 приводит к его быстрому переносу из цитоплазмы в ядро. А ядерный импорт VirE2 происходит при участии импортина альфа и VIP1. Таким образом, агробактерия не только использует VIP1 для доставки комплекса У1гЕ2/Т-ДНК в ядро, но также вызывает изменение внутриклеточной локализации этого белка (Pitzschke и Hirt, 2010).

Рисунок JI-3. Схематическое изображение основных событий, происходящих при колонизации растительной клетки патогенными бактериями Agrobacterium. Черной линией обозначена клеточная ДНК, желтыми фигурами - бактериальные нуклеомодулины, розовой линией -Т-нить ДНК и Т-ДНК, оранжевыми ромбами - импортин альфа, синим цилиндром с литерой «Н» - гистоны, SCF - комплекс убиквитин-лигазы, VIP1 - белок растений, обеспечивающий взаимодействие Т-ДНК с хроматином {По Bierne и Cossart, 2012, с модификациями; с разрешения Elsevier Limited).

Оказавшись внутри ядра, нуклеопротеиновый Т-комплекс претерпевает различные изменения, в том числе взаимодействие с хроматином и/или хроматин-ассоциированными белками, процессу белкового раздевания, преобразованию в двухцепочечную (ds) ДНК (Т-ДНК) и интеграцию в ДНК хозяина (Рис. JI-3). Как эти различные шаги организованы во времени и пространстве до сих пор неясно, но все больше данных о том, что они связаны с клеточным процессом репарации ДНК и ремоделированием хроматина (Gelvin, 2010;Magori и Citovsky, 2011). Белок растительной клетки VIP1, связываясь с гистоном, способствует правильному размещению Т-комплекса на хроматине

(Lacroix и др., 2008). В процессе взаимодействия Т-ДНК с хроматином помимо VIP 1, по-видимому, принимают участие и другие ядерные белки, поскольку интеграция Т-ДНК агробактерии может происходить (хотя и с низкой эффективностью) в нехозяине (например, животной клетке), у которого VIP1 или его гомолог отсутствует.

Перед интеграцией в геном хозяина и синтезом второй цепи Т-нити должно произойти ее «раздевание» и освобождение от белка VirE2. Этот процесс осуществляется при взаимодействии с VirF, который образует комплекс с ЕЗ-убиквитин лигазой Skpl-Cullinl-F-Box (SCF) (Tzfira и др., 2004; Zaltsman и др., 2010). VirF является F-бокс-содержащим белком, который имитирует субстрат-узнающую субъединицу SCF и направляет VIP1 и VirE2 в протеасому через убиквитинилирование. Таким образом, с помощью VirF Agrobacterium использует клеточный SCF для удаления сопровождающих белков Т-комплекса.

Есть несколько линий доказательств в пользу того, что Agrobacterium для интеграции Т-ДНК в хромосому использует участки поврежденной ДНК. По-видимому, важным этапом является обнаружение двухнитевых разрывов ДНК. Показано, что одновременно с превращением одноцепочечной Т-ДНК в двуцепочечную происходит интеграция этой бактериальной ДНК в геном хозяина в участок двухнитевого разрыва, вероятно, с помощью процесса негомологичного соединения концов (Gelvin, 2010; Magori и Citovsky, 2011). Поддерживает эту идею тот факт, что белок Ки80, распознающий двухнитевые разрывы, связывается с двухнитевой Т-ДНК (Li и др., 2005).

В заключение следует указать на необходимость дополнительных экспериментов с целью дальнейшей детализации предложенной модели (Рис. JI-3) и, прежде всего, необходимо выяснить роль в этом процессе других бактериальных факторов, шаперонов и клеточных гистонов (Zhu и др., 2003; Сгапа и Gelvin, 2007).

3.2. Бактериальные белки, модифицирующие экспрессию генома клеток растения, и система III типа секреции

Другой эффективный способ контроля растения-хозяина с целью его колонизации - это ядерный импорт инъецируемых непосредственно в цитоплазму растительной клетки бактериальных белков, выполняющих (имитирующих) функцию клеточных факторов транскрипции, с помощью шприце-подобного аппарата секреции типа (T3SS, от англ. type III secretion system).

3.2.1. Нуклеомодулины Xanthomonas

Такая стратегия колонизации хорошо изучена для бактерий рода Xanthomonas. Известно, что эти фитопатогенные бактерии инъецируют в растительную клетку белковые эффекторы, подобные транскрипционным активаторам (Transcription Activator-Like, TAL) и принадлежащие к аппарату секреции III типа (Boch и Bonas, 2010; Bogdanove и др., 2010). Оказавшись внутри клетки, белки TAL связываются с TAL-специфическими последовательностями ДНК (UPA боксы) и обеспечивают включение транскрипции растительных генов. Типичным белком этого семейства является AvrBs3 бактерии X. campestris. Он был первым идентифицированным бактериальным фактором, связывающимся с элементом транскрипционного промотора эукариот. AvrBs3 активирует экспрессию регуляторного гена, ира20, вызывая гипертрофию клеток восприимчивого растения и способствуя его бактериальной колонизации (Кау и др., 2007). В растениях же, устойчивых к X. campestris, AvrBs3 активизирует ген BS3, ответственный за самоубийство клеток, т.е. в устойчивых растениях наблюдается гиперчувствительный ответ, предотвращающий распространение возбудителя (Romer и др., 2007). Таким образом, белки TAL могут либо способствовать бактериальной вирулентности, либо индуцировать иммунитет растения в зависимости от того, является ли растение чувствительным или устойчивым хозяином. Члены семейства TAL

имеют общую структурную организацию, включая N-концевую сигнальную последовательность, необходимую для T3SS секреции, домен тандемных повторов и С-концевой регион, включающий сигнал ядерной локализации (NLS) и кислый домен активации (AAD) (Boch и др., 2009). Стоит отметить, что ДНК-связывающий TAL-домен состоит из тандемных повторов, содержащих по 34 аминокислоты, причем пара соседних гипервариабельных аминокислотных остатков в положениях 12 и 13 каждого тандемного повтора определяют, какие именно нуклеотидные основания будет узнавать белок. Таким образом, благодаря этому уникальному механизму можно предсказать, исходя из аминоксилотного состава и числа повторов белкового домена TAL, последовательность ДНК, с которой TAL будет связываться. Кроме того, зная этот принцип, повторяющиеся модули TAL можно создать искусственно, учитывая специфическую последовательность ДНК-мишени. Эта сравнительно простая система кодирования находит широкое применение в биотехнологии (Geibler и др., 2011). Например, химеры между TAL-доменом и FokI рестриктазой связывают и расщепляют ДНК в определенном локусе, что позволяет вносить мутации не только в гены растения, но и млекопитающих, в том числе человека (Tesson и др., 2011; Christian и др., 2011; Hockemeyer и др., 2011; Li др., 2011).

3.2.2. Эффекторы Pseudomonas syringae

Pseudomonas syringae - грамотрицательная бактерия, которая может жить как на! поверхности листьев, так и в апопласте растения. Преодоление врожденного иммунитета растения осуществляется частично за счет производства экзополисахаридов в апопласте и образования таких соединений, как коронатин или сиринголин, которые интерферируют с защитной реакцией устьиц (Groll и др., 2008). Тем не менее, многие патогенные штаммы Р. syringae подавляют иммунитет растения с помощью компонентов, вводимых в клетку посредством T3SS

(Block и Alfano, 2011; Cunnac и др., 2009; Lindeberg и др., 2012). P. syringae является моделью изучения функциональной структуры T3SS, а также бактериальных факторов патогенеза. Пангеном P. syringae кодирует 57 семейств белков-эффекторов с общим названием hop (аббревиатура, расшифровка которой переводится на русский язык как поверхностный белок, связанный с гиперчувствительным ответом и вирулентностью; такое название указывает на способность соответствующих белков транспортироваться с помощью T3SS) (Cunnac и др., 2009; Lindeberg и др., 2012). На сегодняшний день нет никаких доказательств того, что эффекторы Р. syringae могут выступать непосредственно в качестве факторов транскрипции и модулировать экспрессию генов, как описано для TAL эффекторов от Xanthomonas (см. выше). Тем не менее, некоторые белки Р. syringae, по всей видимости, действуют пост-транскрипционно и, тем самым, модифицируют активность клеточного генома (Block и Alfano, 2011). Также у Р. syringae есть 15-35 белков, которые имеют различные ферментативные активности, направленные на пост-трансляционнуюю модификацию, включая цистеинпротеазы (например, AvrPphB и AvrRpt2), моно-АДФ-рибозилтрансферазы (НорШ и HopF2), лиазы фосфотреонина (HopAIl), ЕЗ-лигазы (AvrPtoB) и тирозин фосфатазы (HopAOl) (Block и др., 2008). Кроме того, эффекторы Р. syringae могут физически препятствовать нормальному функционированию клеточных белков. Например, N-концевой домен AvrPto содержит два киназа-связывающих домена, за счет которых AvrPto ингибирует киназы (Feng и Zhou, 2012). Среди белков, вводимых бактерией в клетку, есть и шапероны, например, ShcM, ShcV и ShcF, необходимые для функционирования эффекторов IIopPtoM, HopPtoV и HopPtoF, соответственно (Shan и др., 2004; Wehling и др., 2004).

3.2.3. Белки T3SS Pantoea

Эффекторы, действующие в качестве транскрипционных факторов, были выявлены также и у других фитопатогенов. Компоненты T3SS, HsvG и HsvB, бактерии Pantoea agglomeram, индуцирующей образование галл, являются ДНК-связывающими белками, которые вводятся в ядро растительной клетки с помощью двух неканонических функциональных последовательностей NLS (Weinthal и др., 2011). Хотя механизм их действия остается неизвестным, недавно был идентифицирован ген HSVGT, являющейся мишенью белка HsvG (Nissan и др., 2012). Таким образом, эффекторы HsvG и HsvB, судя по всему, действуют как транскрипционные факторы.

3.3. Бактериальные ферменты, изменяющие экспрессию генов клеток хозяина за счет влияния на посттрансляционную модификацию

Гистоны и другие компоненты аппарата ядерной транскрипции подвергаются посттрансляционным модификациям (ПТМ), чувствительным к различным внешним факторам, включая воздействие патогенных бактерий (Ribet и Cossart, 2010). Ниже приведены примеры TSSS-эффекторов грамм-отрицательных патогенных бактерий, выполняющих функцию модификаторов ПТМ и снижающих защитную реакции клетки растения. Одной из важных модификаций, на которую направлено бактериальное воздействие - это механизм, получивший название SUMOylation (Ribet и Cossart, 2010), т.е. обратимое ковалентное присоединение к лизину белковой мишени «малого убиквитин-подобного модификатора» (SUMO, от англ small ubiquitin-like modifier). Этот механизм регулирует многие ядерные процессы, включая ядерный транспорт, транскрипцию, сегрегацию хромосом и репарацию ДНК.

Протеаза XopD X. campestris является ТЗЗБ-эффектором и единственным бактериальным фактором, осуществляющим SUMO-илирование в ядре, т.е. эта протеаза удаляет остатки SUMO с поверхности модифицированного ядерного белка. Протеаза XopD

содержит ДНК-связывающий домен, NLS и С-концевой домен SUMO-протеазы (Chosed и др., 2007). В соответствии со своей структурой, XopD направляется в ядро клетки растения, связывается с ДНК и запускает процесс де-БЦМО-илирования ряда ядерных растительных белков (Hotson и др., 2003). XopD подавляет транскрипцию генов, ответственных за защитные реакции и старение, и таким образом способствует репродукции возбудителя в пораженных листьях (Kim и др., 2008). Недавно высказано другое предположение: патогенные эффекты, вызванные XopD, связаны как с де-БиМО-илированием факторов транскрипции, так и с транскрипционной репрессией (Ma и др., 2011). В соответствии с этой гипотезой, XopD воздействует на транскрипционный фактор, MYB30, в результате чего происходит ингибирование активации транскрипции генов, контролирующих защиту и синтез липидов во время инфекции Xanthomonas (Canonne и др., 2011).

Белок РорР2, содержащий сигнал ядерной локализации, Ralstonia sp. является другим примером бактериального нуклеомодулина, изменяющего экспрессию генов клеток хозяина. Ralstonia содержит ген рорР2, кодирующий ацетил-трансферазу (Tasset и др., 2010), которая имеет в своем составе NLS и, как полагают, может влиять на хозяйскую транскрипцию путем ацетилирования компонентов хроматина и/или транскрипционных регуляторов, ответственных за антибактериальную устойчивость (Rivas, 2012).

АДФ-рибозилтрансфераза 6b Agrobacterium начинает синтезироваться сразу после интеграции в геном растительной клетки Т-ДНК. Белок 6Ь влияет на экспрессию различных генов растений, пролиферацию и стимулирует образованию опухоли (Gelvin, 2010; Ma и др., 2011), 6Ь локализуется в ядре и связывается с несколькими ядерными белками, такими как гистон НЗ (Terakura и др., 2007). Предположительно белок 6Ь играет роль гистонового шаперона и транскрипционного регулятора, но последние исследования показывают, что 6Ь может

влиять на экспрессию генов через микроРНК. Оказалось, что 6Ь взаимодействует с двумя компонентами пути биосинтеза микроРНК, SERRATE и AGOl (Wang и др., 2011). Структурный анализ показывает, что 6Ь имеет структурное сходство с АДФ-рибозилирующими токсинами. В целом, эти данные свидетельствуют о том, что белок 6Ь, может функционировать как супрессор сайленсинга РНК у Arabidopsis через активацию АДФ-рибозилирования ядерных факторов, в том числе компонентов системы продукции микроРНК.

4. Роль плазмодесм в развитии бактериальной инфекции

4.1. Строение плазмодесм

Плазмодесмы (ПД) являются межклеточными структурами, которые устанавливают симпластные пути сообщения между соседними клетками растений. В своей эволюции патогенные микроорганизмы приспособились использовать плазмодесмы в качестве каналов распространения инфекции от клетки к клетке в пределах растения. Растения, в свою очередь, создали механизмы защиты, основанные на контроле пропускной способности плазмодесм, позволяющие блокировать репродукцию патогена. В этом разделе мы рассмотрим доказательства того, что плазмодесмы играют важную роль в антибактериальном иммунитете растений.

Полагают, что развитие плазмодесм является одним из самых важных событий в эволюции высших растений (Karol и др., 2001) Раньше считалось, что плазмодесмы - это простые отверстия в клеточных стенках растений, через которые осуществляется пассивная диффузия небольших молекул. Исследования последних двух десятилетий привели к полному изменению научного понимания этой важной структуры. В настоящее время известно, что плазмодесмы - это сложные структурированные образования, повышающие свою пропускную способность в случае необходимости перемещения через

них крупных макромолекул, таких как белки, РНК и РНК-белковые комплексы (Maule, 2008). Кроме того, ПД являются функционально-динамичными каналами, частота и плотность которых на единицу площади клеточной стенки изменяется в зависимости от потребностей растения и его тканей (Ehlers и Kollmann, 2001). Плазмодесмы представляют собой длинные цилиндрические мостики между клетками, выстланные плазмалеммой, или плазматической мембраной (ПМ) (рис. JI-4A).

Полагают, что небольшие растворимые молекулы могут переходить из клетки в клетку пассивно через цитоплазматические рукава плазмодесмы. Эти рукава содержат микроканалы по 3-4 нм в диаметре в пространстве между эндоплазматическим ретикулумом (ЭР) и ПМ (Robarás и Lucas, 1990). Плазмодесмы обеспечивают транспорт РНК различного типа и белков, называемых неклеточными автономными белками (non-cell authonomous protein, NCAP), т.е. белков, которые синтезируются в одной клетке, но функционируют в другой, иногда даже не являющейся соседней (Haywood и др., 2002). Многие NCAP, особенно те, которые выступают в качестве факторов транскрипции, участвуют в процессе развития растения, специализации и дифференцировки клеток (Gallagher и Benfey, 2005). Важным фактором, регулирующим просвет плазмодесмы, является каллоза, полимер Р-1,3-глюкана (рис. JI-4A), потому что его отложение в устье плазмодесм может физически сужать просвет, уменьшая пропускную способность (size exclusion limit, SEL) плазмодесмы, или даже «запечатать» ее полностью, блокировав транспорт (Radford и др., 1998).

сигнальные молекулы

цитоплазма 1-й клетки

ЭПР-

плазматическая мембрана V_*

десмотрубочка

первичная

КС каллоза

Рисунок JI-4. Роль плазмодесмы в системе коммуникации клеток растения. А. Схематическое изображение ультраструктуры плазмодесмы и процесса переноса сигнальных молекул из клетки в клетку. Оранжевые круги и соединяющие их линии представляют собой гипотетические белковые компоненты, расположенные внутри плазмодесмы. ЭПР, эндоплазматический ретикулум; КС, клеточная стенка; Я, ядро. Б. Перенос сигнала через плазмодесмы клеток, составляющих симпласт. Некоторые сигналы (красные стрелки) проходят только в соседние клетки, осуществляя, таким образом, межклеточную коммуникацию, в то время как дальний транспорт сигнальных молекул (черные стрелки) происходит через флоэму. В. Сигналы окружающей среды (например, длина светового дня и интенсивность освещения) или разного рода стрессовые воздействия (например, атака патогенов) обрабатываются в воспринимающих клетках растения (темно-зеленые или желтые области, соответственно) и передаются через плазмодесмы из клетки в клетку по всей ткани. Эти сигналы могут затем направляться через флоэму (красные пунктирные стрелки) к клеткам-мишеням, расположенным на расстоянии от зоны воздействия, для осуществления коммуникации между различными органами растения, что приводит к необходимым биохимическим и физиологическим изменениям. Ксилемный транспорт обозначен пунктирными синими стрелками. {По Lee uLu, 2011, с разрешения издательства Elsevier Limited, № лицензии 3027091308725 от 13 ноября 2012 года).

Накопление каллозы контролируется каллозасинтазой и ß-1,3 глюканазой (Brownfield и др., 2009). A.thaliana кодирует 12 членов глюкансинтазного семейства, которые, по оценкам, функционируют как каллозасинтазы (Dong и др., 2008) и более 40 членов семейств ß-1,3-глюканаз (Brownfield и др., 2009). Р-1,3-глюканаза разрушает каллозу (Levy и др., 2007), а каллозасинтаза ее синтезирует (Radford и др., 1998), т.е. оба фермента являются «приводными ремнями», регулирующими активность плазмодесмы, в составе которой каллоза выполняет функцию сфинктера (Guseman и др., 2010; Zavaliev и др., 2011). Образование каллозы обратимо и может являться клеточным ответом на различные стрессовые воздействия (Roberts и Oparka, 2003; Radford и др.,1998). В местах механического повреждения или проникновения патогена, каллоза, как полагают, выполняет функцию строительных лесов при восстановлении клеточной стенки. В регуляции синтеза каллозы важную роль играет сигнальный путь, включающий салициловую кислоту, участвующую в обеспечении антибактериального иммунитета растений. Сигнальный путь CK - это ключевой путь защиты не только от бактерий, но и вирусных патогенов и грибов (Vlot и др., 2009).

Растение с помощью плазмодесм создает области клеток, объединенных в симпласт, для обеспечения координации клеточных реакций на уровне целого организма (Lough и Lucas, 2006) в особенности при участии сосудистой системы. Сама сосудистая система включает в себя (а) ксилему, распределяющую во все ткани воду и минеральные вещества, всасываемые корнями, (б) флоэму, которая транспортирует продукты фотосинтеза, производимые в зрелых листьях растения (Рис. JI-4B) (Turgeon и Wolf, 2009). Зрелая ксилема лишена клеточных мембран и поэтому составляет апопластную систему транспорта, обеспечивающую однонаправленную передачу сигнал от корней к стеблю. В отличие от ксилемы, флоэма содержит живые клетки и,

следовательно, формирует симпластную систему транспорта с направлением потока от листьев, производящих фотоассимилят (source-листья), к маленьким верхушечным листьям размером 0,3-0,8 см, потребляющим фотоассимилят (sink-листья). Плазмодесмы, которые функционируют в качестве шлюзов для этого симпластного пути, необходимы для выхода молекул во флоэму и из нее, облегчая распределение питательных веществ и других важных факторов (рис. J1-4Б). В сущности, плазмодесмы обеспечивают интеграцию ближнего и дальнего транспорта молекул по растению (Lee и Lu, 2011; Lucas и Lee, 2004). Первичная плазмодесма образуется в процессе формирования клеточной пластинки во время деления клеток. В процессе формировании специализированных органов и тканей высшие растения приобрели механизмы динамического контроля организации симпластных областей путем изменения удельной плотности плазмодесм в клеточной стенке, а также за счет тонкой настройки плазмодесмального SEL для каждого межклеточном соединении на разных стадиях развития ткани (Rinne и van der Schoot, 2003). Растения могут модифицировать симпласт в ответ на сигналы окружающей среды, в частности, на атаку бактериального патогена. Контролируемая клеточная смерть при микробной атаке растения является одним из наиболее распространенных примеров защиты растения, направленным на предотвращение распространения инфекции и ограничение зоны заражения мертвыми клетками. Роль плазмодесм в этом процессе экспериментально не исследована, но можно предположить, что изоляция некроза является жизненно важной, поскольку позволяет блокировать распространение в соседние здоровые клетки любых токсичных молекул, выделяемых либо инфицированными клетками, либо микробами (Greenberg и Yao, 2004; Rinne и van der Schoot, 2003).

4.2. Плазмодесма как поле битвы растения и бактерии Учитывая, что ближний (плазмодесмальный) транспорт макромолекул является чрезвычайно важными в жизни растения, вполне естественно, что патогенные бактерии пытаются воспользоваться этой системой в своих целях, а растение препятствует им в этом (рис. Л-5).

Рисунок Л-5. Гипотетическая модель, иллюстрирующая потенциальную роль плазмодесмы (ПД) в защите от бактериальных патогенов. Бактерия может использовать плазмодесмы для перемещения своих эффекторных молекул из клетки в клетку. Для предотвращения данного процесса растение индуцирует «закрытие» плазмодесм, используя каллозу, которая начинает активно аккумулироваться в районе плазмодесм и может заблокировать межклеточный транспорт. (По Lee и Lu, 2011, с разрешения издательства Elsevier Limited, № лицензии 3027091308725 от 13 ноября 2012 года).

Полагают (Lamb и Dixon, 1997; Boller и Felix, 2009), что развитие бактериальной инфекции включает в себя также укрепление клеточной стенки изнутри через отложение каллозы и распространение окислительного взрыва, который помогает установить физический и химический барьер против бактериальных патогенов (Рис. Л-5). Тем не менее, этот процесс может быть подавлен патогенными микроорганизмами с помощью вводимых ими в растительную клетку эффекторных белков T3SS (Oh и др., 2010; DebRoy и др., 2004). У Р. syringae к сегодняшнему дню охарактеризовано более 200 эффекторов, многие из которых обладают ферментативной активностью, интерферирующей с биохимическими процессами хозяйской клетки (Lindeberg и др., 2012). В отличие от вирусов, бактериальные патогены

не пересекают границы клеточной стенки, потому что их среда обитания - межклеточное пространство. Однако, хотя бактериальные патогены напрямую не сталкиваются с плазмодесмами, они вполне могут контролировать PTI, распространяя различные эффекторы с помощью плазмодесм, как это предполагают для некоторых эффекторов патогенных грибов (Khang и др., 2010). Действительно, недавно опубликованные данные свидетельствуют о том, что компоненты плазмодесмы могут препятствовать движению эффекторов (Lucas и Lee, 2004). Также было показано, что эффектор HopWl-1 P. syringae способен взаимодействовать с тремя ферментами Arabidopsis (Lee и др., 2008). Эффектор вызывает защитную реакцию, сопровождающуюся накоплением CK и индукцией экспрессии гена HWI1 {HopWl-1-INDUCED GENE l). Примечательно, что белок, кодируемый HWI1 и известный как PDLP5, является членом семейства PDLP (plasmodesmata-located proteins, локализованные в плазмодесме белки) (Thomas и др., 2008; Lee и др., 2011) и его функциональные характеристики указывают на то, что он играет существенную роль в регуляции функции плазмодесм и иммунитете растения (Lee и др., 2011). Установлено, что PDLP5 локализуется в центральной области плазмодесмы и выступает в качестве ингибитора макромолекулярного плазмодесмального транспорта посредством регуляции отложения каллозы. При бактериальной инфекции, синтез PDLP5 резко стимулируется, а интенсивность межклеточного транспорта падает. Рост бактерий Р. syringae увеличивается более чем в 10 раз в растениях с мутированным PDLP5 (pdlp5-l) по сравнению с растением дикого типа. С другой стороны, в случае авирулентного штамма Р. syringae уровень размножения бактерий в pdlp5-l и растении дикого типа был практически одинаковым. В ходе дальнейшего изучения PDLP5 было показано, что его суперпродукция снижала эффективность роста бактерий в 10 раз, а также приводила к гибели клеток растения,

вызванной чрезмерным накоплением CK. Данные Lee и соавторов (2011)

подтверждают гипотезу о том, что контроль транспорта через плазмодесму, осуществляемый белком РБЬР5, является одним из факторов поддержания иммунитета. Предложенная ими модель (Рис. Л-6) иллюстрирует этот вывод.

Рисунок Л-6. Гипотетическая модель, иллюстрирующая роль плазмодесмы в антибактериальном иммунитете на примере Р. syringae. Клетки растений детектируют патоген через специальные рецепторы (PRR), узнающие отдельные компоненты и элиситоры бактерии (РАМР). Происходит индукция PTI - базового иммунного ответа растительной клетки. Однако бактериальный патоген (в данном случае Р. syringae) с помощью T3SS вводит в клетку эффекторы, ослабляющие PTI. В ответ на появление эффекторов в клетке запускается механизм ETI, который зачастую приводит к гиперчувствительному ответу (HR) и развитию системной устойчивости к широкому спектру патогенов (Durrant и Dong, 2004; Dangl и Jones, 2001; Zipfel и др., 2004; Zipfel и Felix, 2005). Активация сигнальных путей с участием салициловой кислоты (CK) или без нее (не-СК), так же, как и HR, являющихся частью защитных реакций клетки, может приводить к изменению пропускной способности плазмодесм, вызываемому отложением каллозы. PDLP5 индуцируется салициловой кислотой при бактериальной инфекции и направляется в плазмодесмы, запуская в них процесс отложения каллозы и закрытие. Кроме того, PDLP5 вызывает гиперпродукцию CK, приводящую к смерти клетки {По Lee и Lu, 2011; Lee и др., 2011, с разрешения издательства Elsevier Limited).

РАМР

о О

системная устойчивость

Важно определиться со следующим вопросом, какое состоянием ПД способствует успешной бактериальной инфекции, «открытое» или «закрытое»? Выше рассмотренные эксперименты Lee и соавторов (2011) показали, что инфекция P. syringae приводит к «закрытию» ПД, связанным с отложением в них каллозы (Рис. JI-6). Учитывая, что пропускная способность ПД регулируется редокс-гомеостазом (Benitez-Alfonso и Jackson, 2009), а среди защитных реакций растения в ответ на вторжение бактериального патогена неотъемлемым процессом является окислительный стресс (Torres, 2010), то закрытие ПД в ответ на бактериальную инфекцию можно считать закономерным явлением. По-видимому, это защитная реакция растения, препятствующая межклеточному транспорту бактериальных эффекторов и, следовательно, колонизации растения. Однако закрытие ПД может приводить к значительным негативным последствиям для растения-хозяина, как это происходит в случае инфекции цитрусовых деревьев флоэмно-ограниченной бактерией Candidatus Liberibacter. Бактериальная инфекция вызывает отложение каллозы в районе ситовидных пластинок клеток флоэмы, что приводит к значительному ухудшению флоэмного транспорта, в результате страдает само растение. Именно этим объясняется чрезмерное отложение крахмала в листьях и другие симптомы вызываемого Candidatus Liberibacter (Koh и др., 2012). Т.е. можно допустить, что бактерия, наоборот, «запирает» клетку, препятствуя межклеточной коммуникации и, следовательно, генерализованной и системной защитной реакции. Еще одно подтверждение получено в экспериментах на цитрусовых, которая страдают от язвы цитрусовых, заболевания, вызванного бактериальным фитопатогеном, Xanthomonas citri подвид citri (Хсс). Роль плазмодесмальной каллозы, как структурного элемента «закрытых» плазмодесм, изучили в экспериментах, когда обеспечивали умолкание генов, кодирующих цитрусовую фитоендесатуразу (PDS) и

каллозасинтазу (CalSl). Фенотипический и молекулярный анализ показал, что сайленсинг CalSl повышает чувствительность кХсс (Enrique и др., 2011). Однако, этот результат находится в противоречии с данными по мутанту A. íhaliana pmr4-l, недостаточному по синтезу каллозасинтазы, который оказался более устойчив к P. syringae (Forçat и др., 2010).

В заключение, интересная подробность: антибактериальный иммунитет возможно подвержен циркадному ритму растений. Недавно (Bhardwaj и др., 2011) было показано, что растения A. íhaliana проявляют изменения устойчивости к бактерии Р. syringae. Так, растения наименее восприимчивы к инфекции по утрам. Анализ с использованием общедоступных микрочипов показал, что большое количество транскриптов генов, участвующих в иммунитете, в том числе гены, вовлеченные в восприятие флагеллина, подвержено суточным колебаниям с пиком в утренние часы. Содержание каллозы в плазмодесмах также значительно выше по утрам в растениях, зараженных Р. syringae.

Суммируя все данные, можно сделать окончательный вывод, что плазмодесма - это место битвы между растением и бактерией.

5. Роль летучих органических соединений растения в развитии вирусной инфекции

Защитные системы растения включают в себя коммуникацию между растениями и разными частями одного и того же растения. Растения используют летучие органические соединения (ДОС) для взаимодействия друг с другом в отсутствие физического контакта (Baldwin, 2010; Holopainen, 2004; Holopainen и Blande, 2012). Помимо простых газов, таких как кислород, углекислый газ и пары воды, растения выделяют в атмосферу огромное количество различных терпеноидов, производных жирных кислот и аминокислот, бензоидов,

фенилпропаноидов (РюЬегеку и др., 2002, 2006). ЛОС растений обладают множеством функций. Например, этилен, метилжасмонат (МЖК) и метилсалицилат (МСК) выступают в качестве гормонов и принимают участие в коммуникации растений одного и того же или разных видом. Кроме того, ЛОС играют существенную роль во взаимодействии растений с организмами других трофических уровней, таких как опылители, растительноядные насекомые и их природные враги. В норме видоспецифические ЛОС отпугивают неспециализированных всеядных насекомых, одновременно привлекая определенных растительноядных насекомых и их природных врагов, которые используют ЛОС данного вида растения для его обнаружения. Привлечение хищников с помощью ЛОС считается одним из способов непрямой защиты растения и снижения давления биотического стресса, вызываемого повреждающими насекомыми (МсСогтюк и др., 2012). Состав смесей выделяемых растениями ЛОС в ответ на атаку растительноядных насекомых значительно отличается от ЛОС, эмитируемых только при механическом повреждении. Таким образом, для хищников/паразитов растительноядных насекомых именно определенная смесь ЛОС является индикатором того, что они могут найти свою жертву/хозяина на данном растении.

Воздействие грызущих насекомых (гусеницы) и сосущих насекомых (тли, цикадки и белокрылки) приводит к индукции различных сигнальных путей в растении и составу смеси выделяемых ЛОС. Кроме того, ЛОС эмитируются растением и в ответ на инфекцию вирусами, переносимыми тлями. Было высказано предположение, что вирусы, которые быстро попадают на ротовой аппарат тлей при кормлении, «вынуждают» растение испускать ЛОС, привлекающие мигрирующих тлей, но препятствующие долгосрочному их нахождению на растении (Бе Уоби 1апс1ег, 2010).

К настоящему моменту у исследователей есть относительно полное понимание метаболических процессов, в результате которых синтезируется большинство JTOC (Dudareva и Pichersky, 2008; Dudareva и др., 2004, 2006), однако представления о том, какую роль ДОС играют во взаимодействии вирус-хозяин, очень далеки от исчерпывающих.

ДОС, испускаемые поврежденным растением, воздействуют на другие части этого же растения, а также на соседние растения (Wenke и др., 2010). Модификация межклеточного транспорта оказывает существенное влияние на патогены. Успешность вирусов растений, в отличие от бактерий, грибов, оомицет и нематод, в значительной степени зависит от эффективности межклеточного транспорта, т.к. жизненный цикл вирусов включает в себя перемещение генетического материала вируса из одной клетки в другую, а затем по всему растению. 5.1. ЛОС как продукты метаболических путей растения Летучие соединения растений - это метаболиты, выделяемые в газообразном состоянии. Растения испускают огромные объемы ЛОС. Расчеты указывают на то, что 1/5 часть углерода, фиксируемого растениями, выделяется в атмосферу в виде ЛОС каждый день (Baldwin, 2010). К настоящему моменту идентифицировано более 1700 летучих соединений растительного происхождения, составляющих около 1% от всех вторичных метаболитов растения (Pichersky и Gershenzon, 2002; Pichersky и др., 2006). ЛОС обычно представляют собой смесь низкомолекулярных липофильных соединений - продуктов различных биосинтетических путей. Биохимия и молекулярная биология ЛОС растений достаточно сложна и представляет собой переплетение нескольких метаболических путей, в которых принимают участие сотни белков. С химической точки зрения среди ЛОС есть терпеноиды, продукты деградации жирных кислот, фенилпропаноиды, производные аминокислот, алканы, алкены, спирты, эфиры, альдегиды и кетоны различного биогенетического происхождения (Holopainen, 2004;

Оиёагеуа и др., 2006). Многие из этих веществ становятся более липофильными перед выбросом в атмосферу: их гидрофильные группы отщепляются или модифицируются путем окисления, метилирования или ацилирования. Т.к. ЛОС являются продуктами различных биохимических путей (Рис. Л-7), то метаболом летучих соединений несет информацию о состоянии растения. В настоящее время показано, что ряд ЛОС выполняет сигнальную функцию внутри одного растения и между особями. Среди таких ЛОС (а) ЛОС зеленых листьев (ЛЗЛ), (б) терпены, (в) фитогормоны, в т.ч. МЖК, МСК и этилен, и (г) метанол (МеОН).

метанол жк мжк

/пмэ *

салициловая кислота жасминовая кислота

терпеноиды метилкетоны альдегиды фсиилпропиииды бетспоиды

мспшмин

I окисление

II ндпокснлнповште

мегнлнрование

амнношнс-юнропан-юфГмшошш кислота

этилен

I , ,

хранение

Рисунок Л-7. Схематическое изображение процессов образования ЛОС в клетке растения. Большинство ЛОС растительного происхождения можно разделить на четыре класса: терпеноиды, катаболиты жирных кислот, ароматические вещества и производные аминокислот. ЛЗЛ образуются в результате окислительного расщепления жирных кислот. Метанол является продуктом деметилирования пектина. МСК и МЖК - метальные производные СК и ЖК. Путь синтеза этилена начинается с метионина. Цпл, цитоплазма; КС, клеточная стенка; Я, ядро; ТФ, транскрипционные факторы; Хл, хлоропласт; В, вакуоль; РЭ, рецептор этилена; ПМЭ, пектинметилэстераза; МСК, метилсалициловая кислота; МЖК, метилжасмоновая кислота. (По Baldwin, 2010 с модификациями).

JI3JI всем известны как аромат свежескошенной травы. Этот класс ДОС включает в себя Сб-соединения, а именно, альдегиды, спирты и эфиры, получаемые из освобождающихся в результате повреждения мембран С18-жирных кислот, которые затем окисляются липоксигеназами и расщепляются гидропероксид-лиазами. Эти соединения выделяются растением как при механическом повреждении, так и при атаке растительноядными насекомыми (Yan и Wang, 2006).

В отличие от терпеноидов, ЛЗЛ быстро, и скорее всего, пассивно высвобождаются из поврежденных листьев. Кроме того, выделение С6 ДОС происходит не только в месте повреждения, но и системно, интактными листьями (Kessler и Baldwin, 2002). То есть эти вещества являются индикаторами любого механического повреждения, и таким образом могут передать ранний предупреждающий сигнал соседним растениям.

Терпеноиды представляют собой наибольшую группу вторичных метаболитов, включающую в себя около 40 000 соединений, в том числе не менее 1000 монотерпенов и 6500 сесквитерпенов (Yu и Utsumi, 2009). Терпеноиды способны быстро передать соседним растениям сигнал о повреждении растительноядным насекомым. Эти вещества играют ключевую роль в обеспечении химического разнообразия летучих соединений растения. По-видимому, они находятся под сильным давлением дизруптивного (разрывающего) отбора, т.е. отбора на крайние значения признака.

МЖК является производным жасмоновой кислоты, которая представляет собой неотъемлемый компонент защитных реакций растения на насекомых и механическое повреждение листьев. Обработка растения МЖК в лабораторных условиях вызывает повышение уровня экспрессии ингибиторов протеаз (Farmer и Ryan, 1990) и эндо-(1,3; 1,4)-ß-глюканаз (Akiyama и др., 2009).

МСК синтезируется из салициловой кислоты (CK), нелетучей сигнальной молекулы, которая необходима для осуществления системной устойчивости растения (SAR, от англ. systemic acquired resistance) (Vlot и др., 2008). Роль растворенной в соке и газообразной МСК состоит в обеспечении патоген-индуцируемых защитных реакций, а также ответе на повреждения, наносимые тлями при кормлении (Mann и др., 2012). МСК эмитируется растениями табака при инфекции ВТМ, но не в ответ на механическое повреждение (Shulaev и др., 1997; Vlot и др., 2008). Недавно было показано, что МСК является ключевым мобильным сигналом, передающимся на дальние расстояния, для развития SAR (Carr и др., 2010; Liu и др., 2011; Park и др., 2007, 2009).

Этилен является одним из трех гормонов растения, который выделяется в воздух в биологически-активных количествах. Ключевым соединением для биосинтеза этилена в растениях является метионин, из которого через S-аденозилметионин образуется 1-аминоциклопропан-1-карбоновая кислота - непосредственный предшественник этилена в растениях. Затем АЦК в присутствии кислорода разлагается с образованием этилена. Этот гормон участвует в обеспечении устойчивости растений к некротрофным патогенам, и к таким абиотическим стрессам, как засуха и затопление. Этилен регулирует рост и развитие разных частей растения, в особенности цветков и плодов, контролируя привлечение опылителей и распространителей плодов (Pieterse и др., 2009). Этилен является единственным летучим соединением растения, для которого известен рецептор и описан процесс перцепции (Baldwin, 2010).

Метанол и изопрен являются наиболее значительными по количеству летучими соединениями после С02 (Seco и др., 2007).

Метанол - это продукт деметилирования пектина ферментом пектинметилэстеразой в процессе формирования клеточной стенки (Micheli, 2001; Pelloux и др., 2007). Метанол выделяется вулканами,

морями (Williams и др., 2011), а также в результате окисления биомассы, однако наиболее существенным его источником метанола являются растения и генерируемый ПМЭ метанол (Razavi и др., 2011).

Механическое повреждение растений приводит к значительному увеличению количества выделяемого метанола. Например, на поле, где произрастает люцерна, наблюдался мощный выброс метанола после того, как растения были скошены, кроме того, уровень эмиссии метанола повышался в течение последующих 3 дней (Warneke и др., 2002).

Таким образом, возникает вопрос, а действительно ли метанол можно рассматривать лишь как «биохимический мусор», каковым он считается (Nemecek-Marshall и др., 1995; Von Dahl и др., 2006)?

5.2. Роль повреждения в эмиссии ЛОС и вирусной инфекции растений

Вирусы растений - группа патогенов, которые могут перемещаться из клетки к клетку и от растения к растению. Ограниченный объем генетической информации, которую содержат вирусы, делает их практически полностью зависимыми от растения, в том числе от механизмов защиты от различных патогенов, выработанных растением. Т.к. ЛОС играют существенную роль в коммуникации растений, они также оказывают значительное влияние не только на жизненный цикл вируса, но и на взаимоотношения между вирусом, хозяином и переносчиком. Подобная точка зрения поддерживается исследованиями последствий повреждения растительных тканей, сопровождаемых эмиссией ЛОС. B-целом, растения постоянно выделяют ЛОС, и это считается адаптивным механизмом защиты против абиотических и биотических стрессов (Holopainen, 2004; Holopainen и Blande, 2012). Например, эмиссия изопренов участвует в защите системы фотосинтеза от постоянных температурных стрессов (Laothawornkitkul и др., 2009). Более того, изопреноиды играют роль антиоксидантов в листьях и помогают предотвратить 03-индуцируемый окислительный стресс, а

также накопление еинглетного кислорода в процессе фотосинтеза (Vickers и др., 2009). Метанол накапливается в межклетниках в растворенном или газообразном состоянии ночью, когда устьица закрыты. Утром же, когда устьица открываются, наблюдается значительная эмиссия метанола (Hüve и др., 2007; Nemecek-Marshall и др., 1995). Метаболизм метанола в растении может сопровождаться существенным увеличением биомассы, часто сопряженной с повышением эффективности фотосинтеза и скоростью развития, у некоторых СЗ-растений (Gout и др., 2000; Nonomura и Benson, 1992). Постоянно эмитируемые ЛОС также влияют на поведение и физиологию некоторых растительноядных организмов, играя роль репеллентов (Holopainen, 2004; Holopainen и Blande, 2012).

К настоящему времени нет данных относительно участия постоянно эмитируемых ЛОС в антивирусном иммунитете растения, т.к. клеточная стенка препятствуют прямому контакту клеток с вирусными частицами. Подобный физический барьер является наиболее существенной преградой, которую должен преодолеть вирус для осуществления перемещения из клетки в клетку и дальнейшего распространения в систему. Т.е. повреждение растительных тканей, а соответственно, клеточных стенок, является необходимым условием вирусного заражения. После проникновения в клетку через нарушенную КС, вирус «раздевается», начинается синтез вирусных белков и репликация (Show, 1999). В лабораторных условиях для заражения растения ВТМ экспериментатор должен нанести механическую микротравму тканям растения. В природе проникновение вируса в клетки листьев происходит через микроповреждения кутикулы, трихом или клеточных стенок, вызванные ветром, дождем, градом или растительноядными организмами. При заражении вирус попадает лишь в небольшое число клеток листа. В процессе исследования явления, названного «сублиминальная инфекция», когда рассматривались

взаимоотношения ВТМ и не-хозяина (Cheo, 1970), было показано, что доля первично зараженных клеток составляла 1 на 50 ООО - 150 ООО незараженных клеток (Sulzinski и Zaitlin, 1982). Частица ВТМ «раздевается» ко-трансляционно с участием рибосомы и формированием так называемой «стриптосомы» (Wilson, 1984).

Если вирус реплицировался в первично зараженной клетке, но не может перейти в соседние клетки, то и вся инфекция будет ограничена этой клеткой. Поэтому в геноме вирусов растений закодирован один или несколько транспортных белков (ТБ), которые необходимы для переноса генетической информации вируса из клетки в клетку. Геном вируса перемещается в соседние клетки в виде нуклеопротеидного комплекса (Dorokhov и др., 1983; Citovsky и др., 1990) или вирусных частиц (Van Lent и др., 1991), через плазмодесмы, соединяющие соседние клетки. Межклеточный транспорт вирусов происходит достаточно медленно (одна клетка в 2 часа), фронт инфекции продвигается на небольшое расстояние в течение суток (Gillespie и др., 2002). Для системной инфекции других частей растения вирус должен достигнуть сосудистой системы растения (Vuorinen и дре., 2011). Подобные пути используются самим растением для переноса эндогенных макромолекул, т.е. вирус использует уже имеющиеся системы транспорта растений в своих целях (Leisner и Turgeon, 1993). Как только вирус достигает флоэмы, скорость его движения становится равной довольно высокой скорости потока фотоассимилятов. Фотоассимиляты синтезируются в зрелых (source) листьях и достигают молодых верхних (sink) листьев в течение 60-100 мин (Thorpe и др., 2007). Направление и скорость такого перемещения зависит от нескольких факторов, в том числе расстояние между верхними и нижними листьями и состояние сосудистой системы растения (Turgeon, 1989). Флоэмный транспорт вируса включает в себя «загрузку» вируса во флоэму в souree-листьях, перенос по флоэме и «выгрузку» из флоэмы в sink-листья. Скорость такого перемещения в

сотни раз выше, чем скорость межклеточного транспорта. Ее оценивают для ВТМ и X вируса картофеля (ХВК) как 8 см/час (Сароог, 1949). Большинство вирусов осуществляет дальний транспорт по флоэме, однако, также известны случаи ксилемного транспорта для переносимых жуками вирусов рода Sobemovirus (Opalka и др., 1998; Brugidou и др., 2002). Но и в этой группе есть исключения - вирус крапчатости ежи сборной (Otsus и др., 2012).

В отличие от ДОС, в норме постоянно выделяемых в атмосферу интактными растениями, индуцируемые ДОС начинают эмитироваться в ответ на повреждение, кроме того, они производятся в больших количествах и другом соотношении (Holopainen, 2004; Holopainen и Blande, 2012). В природных условиях повреждение КС ведет к выделению ЛЗЛ (Heil, 2009), некоторых терпенов Piesik и др., 2011) и метанола (Von Dahl и др., 2006; Körner и др., 2009). Эмиссия этих соединений происходит сразу же после повреждения, что может указывать на наличие предсуществующих веществ. Метанол, выделяемый поврежденными листьями, продуцируется ПМЭ, расположенной в КС, что и позволяет осуществить столь быстрый выброс метанола в атмосферу (Von Dahl и др., 2006; Körner и др., 2009). Газообразный метанол привлекает насекомых, в т.ч. короедов (Hylurgops palliatus, Tomicus piniperda и Trypodendron domesticum), в то время как длинноцепочечные спирты не являются аттрактантами (Byers, 1992).

Атака растительноядными насекомыми представляет собой многокомпонентное событие, определяемое как минимум двумя аспектами - механическое повреждение и химические факторы. Только комбинация обоих факторов может активировать соответствующую защиту. Специфические элиситоры, присутствующие в слюне насекомых, являются важными индукторами ДОС в некоторых системах «насекомое-растение» (Wu и др., 2008).

Грызущие насекомые употребляют в пищу ткани листьев, откусывая небольшие кусочки. Этот процесс подразумевает нанесение множественных механических повреждений, сопровождаемых попаданием секрета слюнных желез и других веществ из пищеварительного тракта насекомого (Wu и др., 2008). Количество JIOC, выделяемых растением в ответ на кормление сосущих насекомых, гораздо ниже, а иногда и не отличается от нормального (Pareja и др., 2007, Joó и др., 2010). Это объясняется минимальными повреждениями растительных тканей сосущими насекомыми в отличие от грызущих. Исследования на системе «персиковая тля - персик» показывают, что даже незначительное воздействие насекомого может привести к повышению эмиссии ДОС растением. Происходит индукция МСК и терпеноидов, в то время, как простое механическое повреждение не вызывает выброса этих веществ, а приводит к эмиссии ЛЗЛ (Staudt и др., 2010). Любопытно, что даже откладывание яиц на растении может привести к активации специфического ответа растения, который может повлиять на других участников пищевой цепи (Fatourus и др., 2012). Разнообразные элиситоры растений представляют собой систему, с помощью которой растение распознает повреждение и стимулирует продукцию ЖК (Heil, 2009). Когда же растение подвергается воздействию сразу нескольких стрессовых факторов, то скоординированное взаимодействие сигнальных путей CK, этилена и ЖК может привести к синергетическому защитному ответу на повреждение (Pieterse и др., 2009).

5.3. Праймирование растений, вызванное ЛОС, н его роль в вирусной инфекции

Так как ЛОС свободно перемещаются по воздуху, они могут воздействовать на соседние растения и осуществлять коммуникативную функцию, в том числе между неродственными видами растений. ЛОС, выделяемые в атмосферу в результате механического повреждения или

атаке насекомых, переносятся не только к соседним частям того же растения, но и к растущим поблизости особям. Потенциально выброс ДОС, как индикатор повреждения, может привести к трем возможным вариантам развития событий. Первый, соседнее растение никак не отреагирует на сигнал. Второй, после получения сигнала растение создает условия, благоприятствующие вирусной инфекции (сенсибилизация). И третий, растение отвечает на сигнал, индуцируя антивирусную защиту. ДОС-опосредованная подготовка растения к возможной атаке может быть обозначена как «праймирование», т.е. запуск ответных реакций до воздействия патогена. Процесс праймирования связан с иммунитетом растения: растение запускает механизм защиты в ответ на сигнал или предыдущую атаку, т.е. реакция растения усиливается, повышается ее эффективность (Holopainen and Blande, 2012). Недавние исследования показали, что интактные листья, находящиеся в непосредственной близости от поврежденных, а также соседнее растение-«ресивер», могут детектировать ЛОС как сигнал тревоги и подготовиться к потенциальной атаке (Choudhary и др., 2008; Frost и др., 2008; Holopainen и Blande, 2012).

Праймирование через сигналы, передаваемые по воздуху от поврежденных насекомыми растений, наблюдалось при изучении кукурузы (Engelberth и др., 2004). Коммуникация растений с помощью ЛОС, по-видимому, является распространенным компонентом системы устойчивости к растительноядным организмам. Подобные летучие соединения могут также обеспечивать благоприятные эффекты, вызываемые ризобактериями, способствующими росту растений (Ryu и др., 2004). Более того, обработка такими ЛОС, как транс-2-гексеналь, цис-3-гексеналь или цис-3-гексенол, усиливала устойчивость Arabidopsis к грибу Botrytis cinerea (Kishimoto и др., 2005), что говорит о способности ЛОС индуцировать устойчивость к болезням. Растения лимской фасоли {Phaseolus lunatus) в природной популяции становились

более устойчивыми к бактериальному патогену P. syringae, если находились в непосредственной близости особей того же вида, у которых с помощью бензотиадиазола была индуцирована SAR (Yi и др., 2009).

Праймирование растений, ведущее к фенотипическим изменениям, а именно, появлению устойчивости, является лишь одним из множества аспектов данного процесса. Растения, несомненно, воспринимают сигналы, даже если это не влечет за собой внешних изменений. Обработанные УФ-С растения начинают выделять МСК и МЖК, воздействие которых приводит к повышению частоты гомологической рекомбинации у соседних, необлученных растений (Yao и др., 2011).

Сигнал от соседних растений может приводить к изменениям биохимических путей или транскрипционной активности генома растения-ресивера. Изменения профиля транскрипции генов, связанных с защитными реакциями, в ответ на воздействие JIOC были описаны в нескольких работах (Arimura и др., 2000; Bate и Rothstein, 1998; Frost и др., 2008; Farag и др., 2005; Paschold и др., 2006). В растении-ресивере может повышаться уровень экспрессии генов, связанных с патогенезом (PR, от англ pathogenesis-related), таких как PR-3 (хитиназа), PR-4 (тауматин-подобный белок), липоксигеназа (LOX), фенгшалашш алшоний-лиаза (PAL) и фарнезш пирофосфат-синтаза (FPS). Другие примеры праймирования включают в себя повышение продукции ингибиторов протеаз в растениях табака, инкубированных в napáx травмированных растений полыни (Kessler и др., 2006). Ингибиторы протеаз II типа {PI-Щ являются мощными ингибиторами сериновых эндопептидаз в животных и микроорганизмах (Turra и Lorito, 2011). Ген PI-II практически не экспрессируется в листьях интактных растений, но индуцируется в ответ на различные типы стресса, в том числе повреждение и бактериальную инфекцию (Balandin и др., 1995).

Имеющиеся к настоящему времени данные говорят в пользу того, что праймирование ЛОСами повышает устойчивость к бактериям,

насекомым, грибам и нематодам. Однако роль праймирования во взаимоотношениях вирус-растение пока представляется неоднозначной. Первое исследование, посвященное потенциальному влиянию ДОС на вирусную инфекцию, было проведено 16 лет назад (Shulaev и др., 1997). Шулаев с коллегами использовал растения табака (Nicoticina tabacum cv. Xanthi nc), несущие N- ген, связанный с проявлением гиперчувствительного ответа на ВТМ. Было обнаружено, что только растения, зараженные ВТМ, продуцировали газообразную МСК. В случае здоровых, поврежденных или шоск-инокулированных растений эмиссии МСК не наблюдалось. Для выяснения, может ли выделяемая растением МСК индуцировать в соседних зараженных растениях устойчивость к ВТМ, была использована проточная система, когда воздух из камеры с зараженным растением поступал к интактному. Была обнаружена слабая устойчивость обработанных растений, из чего авторы сделали вывод об индукции антивирусной устойчивости МСК. Deng с коллегами (2004) также подтвердил, что в отличие от здоровых контрольных растений, томаты, зараженные ВТМ, характеризовались повышенным накоплением МСК. Более того, обработка листьев газообразной МСК приводила к еще большему накоплению в них МСК. Однако Park и коллеги (2009) не подтвердили участие МСК в антивирусной защите. Они показали, что МСК-опосредованной передачи сигнала от растения к растению в условиях совместной инкубации не наблюдалось. Было высказано предположение, что подобные условия недостаточно оптимальные для передачи летучих сигналов, а растения в природе располагаются не так плотно. Кроме того, считается, что МСК продуцируется скорее в жидкой форме, чем в газообразной. Недавняя работа Attaran и коллег (2009) также демонстрирует, что в растениях А. thaliana МСК не является необходимым для системной передачи сигнала и что для запуска SAR используется синтез СК de novo в системных

неинфицированных листьях, праймированных мобильным метаболитом азелаиновой кислоты, С9-дикарбоновой кислотой.

Вообще, существует фундаментальное различие между бактериями и вирусами по отношению к клетке. Бактериальные патогены не пересекают границы КС, т.к. населяются межклеточное пространство (Lee и Lu, 2011). В то время, как вирусы являются внутриклеточными паразитами, более того, они обладают способностью перемещаться из клетки в клетку для распространения инфекции (Xu и Jackson, 2010). Таким образом, бактерия является апопластным «жильцом», а вирус -«симпластным».

Роль ЛОС в коммуникации растений в природных условиях не до конца изучена. Для более детального понимания экологической значимости и закономерностей систем «растительноядный организм -хищник - растение» необходимо подкрепление большинства существующих на данный момент работ полевыми исследованиями (Baldwin, 2010; Holopainen и Blande, 2012). Это же относится и к изучению переноса вирусов и влияния ЛОС на их жизненный цикл, т.к. в лабораторных условиях состав ЛОС может отличаться вот природного. В этой связи важно провести оценку расстояний, на которых ЛОС способны осуществлять сигнальную функцию. Полынь, Artemisia tridentate, была использована в качестве объекта ряда исследований, посвященных коммуникации растений в полевых условиях. Было показано, что расстояние, на котором возможна передача сигнала между растениями разного вида, составляло около 10 см (Karban и др., 2003). Внутривидовая коммуникация могла происходить на расстоянии до 60 см (Karban и др., 2006). Heil и Adame-Alvarez (2010) в своей работе использовали лимскую фасоль для оценки расстояний передачи летучих сигналов в полевых условиях, также они оценивали, где в первую очередь индуцируется устойчивость: в самом эмиттере или в ресивере. Независимые растения-ресиверы приобретали устойчивость к

растительноядным организмам или патогенам на максимальном расстоянии от эмиттера 50 см. Если же применить эти оценки к природной ситуации взаимоотношений вирус-растение, то получится, что ДОС будут действовать в основном на свое собственное растение, а не на соседние. Т.к. скорость перемещения ДОС гораздо выше, чем скорость флоэмного потока или сигнала SAR, газообразный сигнал, эмитируемый инфицированными листьями, будет праймировать преимущественно верхние незараженные листья.

5.4. JIOC и переносчики вирусов

Коммуникация с помощью летучих соединений играет важную роль во взаимодействии между растениями, вирусами и их переносчиками (De Vos и Jander, 2010).

Афиды представляют серьезную проблему для сельского хозяйства, несмотря на то, что это сравнительно небольшая группа насекомых по сравнению с другими. Однако именно тли являются основными переносчиками вирусов: около половины вирусов, распространяемых насекомыми (275 из 600) переносятся тлями. Многие из этих вирусов вызывают заболевания растений, наносящих серьезный вред сельскому хозяйству. Косвенный ущерб, вызываемый афидами через передачу вируса, зачастую намного превышают их прямое воздействие на сельскохозяйственные культуры. В ответ на атаку этих насекомых многие растения запускают механизмы непрямой защиты через выделение летучих соединений, которые также индуцируются и вирусами, переносимыми тлями.

С вирусоцентрической точки зрения вирусы растений полагаются на перенос тлями не только к другим частям того же растения, но и на более отдаленные растения (Dâder и др., 2012; Ng и Falk, 2006). Т.е. в интересах вируса заставить растение привлекать тлей, но не обязательно быть пригодным для долгосрочного кормления. Есть два типа поведения афид, которые влияют на скорость распространения вируса: (а) афиды

кормятся преимущественно на зараженных тканях или (б) афиды предпочитают зараженные растения (De Vos и Jander, 2010). В частности, характер взаимодействия «растение-афида-вирус» определяется тем, сколько времени нужно для передачи вируса. Вирусы растений могут быть разделены на две условные категории в зависимости от того, как долго они должны находится на/в своем переносчике и где локализованы: неперсистентные (сохраняются на ротовом аппарате переносчика недолгое время) и персистентные (вирус может находиться в организме насекомого длительное время и размножаться там).

5.4.1. Неперсистентные вирусы

Оптимальной схема поведения вектора для переноса подобных вирусов является следующая: насекомое привлекается, нарушает целостность тканей растения ротовым аппаратом и после краткого кормления быстро покидает растение. Такая схема является диаметрально противоположной относительно передачи персистентных вирусов. Именно не персистентные вирусы представляют собой наибольшую угрозу для сельского хозяйства (Ng и Falk, 2006). Такие вирусы локализуются на стилете афид. Они прикрепляются к определенным районам ротового аппарата с помощью консервативных белок-белковых взаимодействий во время краткого акта кормления. Затем в течение нескольких минут может произойти перенос вируса на новое интактное растение. Было высказано предположение, что неперсистентные вирусы, по-видимому, способны вызывать изменения в химическом составе сока растения, делая его «невкусным» и отталкивающим для афид после заражения (De Vos и Jander, 2010). Опираясь на _ имеющиеся данные, можно предположить, что рост популяции афид зачастую снижен на растениях, зараженных неперсистентными вирусами. Но к настоящему времени недостаточно информации относительно того, каким именно образом вирус индуцирует биохимические изменения в растении, приводящие к

сокращению времени кормления насекомых. Mauck с коллегами (2010а) провела исследования биохимических взаимодействий на системе, включающей неперсистентный вирус огуречной мозаики (ВОМ), его хозяина - тыкву (Cucurbita pepo cv. Dixie) и два вектора - Aphis gossypii и М. persicae. Как в полевых условиях, так и в теплице было проанализировано поведение тлей на здоровых и зараженных растениях. Стало ясно, что растения, зараженные ВОМ, являются неблагоприятными для обоих видов тли, рост популяции насекомых был ниже, чем на незараженных растениях. Показано, что крылатые тли быстро покидают зараженные растения. Хроматографический анализ летучих соединений, выделяемых интактными и зараженными ВОМ растениями тыквы, показал, что зараженные растения выделяют значительно больше JIOC на грамм зеленой массы, чем здоровые. В целом, 38 различных соединений было обнаружено в этой смеси JIOC. Однако качественный состав смеси эмитируемых ДОС не отличался между больными и здоровыми растениями. Авторы делают вывод, что зараженные растения привлекают тлей повышенным уровнем эмиссии ДОС.

Таким образом, в системе ВОМ-тыква-тля созданы наиболее благоприятные условия для переноса неперсистентного вируса: привлечение афиды на зараженное растение, попадание вируса на стилет афиды, а затем быстрое перемещение насекомого на другое растение. Концепция индуцируемых ВОМ изменений биохимии растения влияет на поведение вектора (тли) также распространяется и на «не-векторных» насекомых, например, клоп-ромбовик (Anasa tristis), который является насекомым-вредителем в данной системе. Mauck с коллегами (20106) обнаружила, что взрослые самки A. tristis предпочитают откладывать яйца на здоровых растениях, кроме того, именно незараженные растения более благоприятны для популяции личинок. Сопоставление схемы переноса ВМО и влияния на хозяйское растение с тем, насколько

привлекательно растение для переносчика, позволяет предположить, что существует некий единый механизм. Однако, необходимы исследования и других систем растение-вирус. Например, изучение растений картофеля, зараженного Y вирусом картофеля (Y-BK) и ХВК, не выявило какой-либо взаимосвязи между присутствием вируса и привлекательностью растения для переносчика. Зараженные Y-BK или ХВК растения не являлись более аттрактивными для М. persicae, основного переносчика персистентных вирусов, например, вируса скручивания листьев картофеля (BCJTK) (Castle и др., 1998). Y-BK является неперсистентным вирусом, переносимым несколькими видами тлей. ХВК не нуждается в векторе и переносится механически. М. persicae apterae предпочитает колонизировать растения, зараженные ВСЛК, здоровым растениям или зараженным Y-BK или ХВК (Eigenbrode и др., 2002), хотя качественной или количественной разницы в составе смеси ДОС, выделяемых этими растениями, не обнаружено.

Возможный механизм привлечения афид на растения, зараженные ВОМ, может задействовать вирусный белок 2Ь, который не только ингибирует антивирусный сайленсинг, но также подавляет транскрипционный ответ генов растения на ЖК, которая является ключевой сигнальной молекулой, участвующей в защите от насекомых. Ziebell с коллегами (2011) обнаружил, что заражение табака делеционным по гену 2Ь мутантом BOM (ВОМА2Ь) приводило к возникновению устойчивости к М. persicae, в то время как при инфекции ВОМ создавались благоприятные для этой афиды условия. Авторы обнаружили, что большая доля тлей эффективно питалась на зараженных ВОМ растениях, по сравнению с зараженными ВОМД2Ь, хотя это и не приводило к повышению скорости роста отдельных особей. Полученные данные свидетельствуют о том, что белок 2Ь может косвенно влиять на перенос ВОМ тлями.

5.4.2. Персистентные вирусы

В отличие от неперсистентных вирусов, персистентные (циркулирующие) вирусы попадают в пищеварительный тракт афид. Перенос таких вирусов в организм насекомого занимает больше времени, чем в случае неперсистентных, поэтому афида должна находится на зараженном растении от часа до нескольких дней. Подобная схема переноса подразумевает всасывание вируса с флоэмным соком тлей во время кормления с последующим движением вирионов из кишки насекомого к слюнным железам, где вирион может находиться длительное время. Афида, получившая вирус, может переносить его со слюной на новые растения постоянно, т.е. на протяжении долгого времени. Такой способ переноса вируса, по-видимому, поощряется вирус-индуцированными изменениями биохимии растения, приводящими к созданию более благоприятных условий для колонизации растения вектором и продолжительного кормления на зараженных растениях. Более того, качество инфицированного растения для кормящихся афид повышается, что приводит к повышению скорости роста популяции этих насекомых. В результате «перенаселения» растения покидают это растение и перемещаются на здоровые, заражая их вирусом. Последние данные подтверждают это предположение и указывают на то, что афиды способны менять свое поведение в ответ на летучие соединения, выделяемые зараженными или здоровыми растениями (Eigenbrode и др., 2002; Jiménez-Martínez и др., 2004).

Среди наиболее изученных примеров влияния патогенов на запахи, испускаемые растением, два вируса - BCJ1K и вирус желтой карликовости ячменя (ВЖКЯ), которые модифицируют паттерн ДОС, делая зараженное растение более аттрактивным для афид по сравнению с интактным (Ngumbi и др., 2007). Кроме того, эти два вируса вызывают биохимические изменения в растении, что приводит к повышению его качества для насекомых-переносчиков. Для основного вектора ВСЛК, М.

persicae, создаются более благоприятные условия на зараженном BCJIK картофеле. Афиды Rhopalosipham padi и Schizaphis gramimun способны более эффективно размножаться на растениях, зараженных ВЖКЯ (Jiménez-Martínez и др., 2004). При этом R. padi, уже содержащие вирус, предпочитают здоровые растения, а для свободных от вируса насекомых более привлекательными являются зараженные ВЖКЯ растения (Ingwell и др., 2012).

Таким образом, вирусы индуцируют изменения фенотипа растения-хозяина, которые приводят к повышению аттрактивности для вектора и благоприятствуют удлинению времени кормления насекомых. Однако механизм, согласно которому ЛОС зараженных вирусом растений вызывают изменения поведения афид остается недостаточно изученным. Возможно, одним или несколькими компонентами смеси ЛОС, эмиссия которых повышается при вирусной инфекции, является специфический аттрактант для насекомых. Или же вся смесь ЛОС, выделяемая растением, играет роль. Eigenbrode с коллегами (2002) выявил по крайней мере 11 ЛОС (г/г/с-2-гексен-1-ол, и-нонан, нонаналь, ундекан, p-мирцен, (Я)-(+)-лимонен, (-)-транскариофиллен, (+)-лонгифолен, а-пинен, р-пинен и а-хумулен), эмиссия которых повышалась при заражении растений BCJIK, но не в ответ на YBK или ХВК. Ngumbi с коллегами (2007) показал, что для привлечения и удержания М. persicae на растении важен состав смеси ЛОС, индуцируемых инфекцией BCJIK, и соотношение компонентов смеси ЛОС. Отдельные компоненты смеси не вызывают подобного эффекта. В этом исследовании впервые была проведена оценка значения компонентов смеси ЛОС и проанализировано влияние комплекса ЛОС по сравнению с отдельными компонентами на поведение афид.

Суммируя вышесказанное, можно заключить, что коммуникация с помощью ЛОС является неотъемлемым компонентом взаимоотношений между растением, вирусом и переносчиком.

6. Система транзиентной экспрессии - патогены растений для целей биотехнологии

Производство терапевтических белков в растениях - одно из последних достижений медицинской биотехнологии. Гены, кодирующие такие белки, могут быть экспрессированы в тканях растений с помощью метода стабильной трансформации растительной клетки, т.е. получения трансгенных растений. К настоящему времени продукты «зеленой» биотехнологии используются в ветеринарии (Hammond и Nemchinov, 2009) и первым препаратом, разрешенным министерством сельского хозяйства США, является вакцина против заболевания Ньюкасла кур (Metzler, 2006). Кроме того, в 2012 году получил одобрение Агентства по контролю за продуктами питания и лекарственными средствами США (FDA) орфанный (т.е. фармацевтический препарат для лечения редких заболеваний) препарат Elelyso (талиглюцераза альфа) для

заместительной терапии болезни Гоше. Вообще, это первый препарат на основе человеческого рекомбинантного белка, синтезированного в растительной клетке, а именно, в культуре клеток трансгенной моркови (Maxmen, 2012), который успешно прошел все клинические испытания и получил разрешение FDA.

Растения как «фабрики» для продукции подобных фармацевтически-значимых белков обладают множеством несомненных преимуществ: масштабируемость производства, снижение себестоимости по сравнению с традиционными способами, отсутствие риска контаминации продуктами и патогенами животного происхождения. Система транзиентной (временной) экспрессии представляет собой альтернативу трансгенным растениям и позволяет получить ряд важных фармацевтических белков, обладающих функциональной активностью, сходной с синтезированными в животных клетках аналогами. В этом случае получаемый результат не зависит ни от процесса интеграции в хромосому, ни от позиционных эффектов вставки. Более того, продукция

целевых генов наблюдается через 3 часа после доставки ДНК, а уже между 18 и 48 часами достигает максимума (Kim и др., 2009; Lee и Yang, 2006).

Ниже рассматриваются базовые составляющие системы транзиентной экспрессии, разработанные на основе растительных патогенов: вирусов растений и их элементов, а также штаммов Agrobacterium.

6.1. Агроинъгкция и бинарные векторы

Известно, что бактерия A tumefaciens способна заражать более 150 различных видов двудольных растений (De Cleene и De Ley, 1976). Механизм трансформации хорошо изучен, как уже говорилось выше. На первых этапах целевой ген встраивали в участок Т-ДНК Ti-плазмиды. Однако применение такого подхода осложнялось техническими трудностями, связанными с размерами плазмиды. Позднее было проведено усовершенствование системы: последовательность Т-ДНК (составляющая лишь 5-10% от всей Ti-плазмиды) и фрагмент, содержащий v//-гены, были разнесены на два отдельных репликона. Это привело к сокращению длины плазмиды, что упростило проведение различных манипуляций (Hoekema и др., 1983; de Framond и др., 1983). Оказалось, что ни один из генов Т-ДНК не является необходимым для переноса этого фрагмента, поэтому онкогены и гены опин-синтаз, расположенные в Т-ДНК, были удалены и могут быть замещены целевыми генами (Bevan и др., 1983; Fraley и др., 1983; Herrera-Estrella и др., 1983). Подобная система была названа «бинарной». Штаммы агробактерии, несущие репликон с у/У-генами и Т-ДНК-содержащий репликон, считаются безопасными, если они не имеют онкогенов, переносимых в растительную клетку. Таким образом, была создана бинарная система, получившая широкое применение в «зеленой» биотехнологии. Более того, за прошедшие годы проделана работа по усовершенствованию и оптимизации данной системы для разных целей и

задач. Создано несколько десятков штаммов «безопасной» агробактерии и множество бинарных векторов для клонирования целевых генов (Lee и Gelvin, 2008).

Бинарные векторы содержат специфические последовательности Т-ДНК - несовершенные 25-нт повторы, обозначаемыми RB и LB, необходимыми для переноса этого фрагмента ДНК. Вектор включает в себя элементы, необходимые для репликации в Е. coli и A. tumefaciens, селектирующие маркеры (гены устойчивости к антибиотикам) для бактериальных и растительных клеток (Komori и др., 2007; Lee и Gelvin, 2008). Подобные бинарные векторы используются для различных растений, таких как A. thaliana, Lactuca sativa, Medicago sativa, Nicotiana sp. (Schiermeyer и др., 2005). Очевидным преимуществом транзиентной экспрессии с помощью А. tumefaciens является скорость получения целевого белка. После введения бактерии в ткани листа (агроиъекции или агроинфильтрации) уже на 3-10 день (в зависимости от белка и вектора) достигается максимальный уровень экспрессии (Kim и др., 2009; Lee и Yang, 2006). Другим преимуществом данной системы перед трансгенными растениями является простота экспериментальной процедуры и культивирования растений. Листья растений, полученных в теплице, могут быть заражены с помощью вакуумной инфильтрации (Negrouk и др., 2005; Medrano и др., 2009; Simmons и др., 2009; Tague и Mantis, 2006) или методом «повреждение-распыление» (Azhakanandam и др., 2007). Эффективность последнего повышается в присутствии сурфактанта Triton Х-100, Tween-20 или Silwet L-77 (Kim и др., 2009; Tague и Mantis, 2006). Известно, что бактерия A. tumefaciens способна заражать более 90% клеток инфильтрированной ткани (Marillonnet и др., 2005), кроме того, с помощью такого способа можно обеспечить доставку нескольких генетических конструкций в одну и ту же клетку. Существует множество факторов, влияющих на количество и качество получаемого рекомбинантного белка: активность промотора,

используемые кодоны, стабильность белка и его внутриклеточная локализация. Т.к. система транзиентной экспрессии подразумевает появление чужеродной для растения ДНК и РНК, а также бактериальной инфекции, то в ответ запускаются защитные механизмы, например, посттранскрипционное умолкание генов (сайленсинг) (Voinnet и Baulcombe, 1997), который является одной из причин низкого уровня экспрессии целевого белка. Решением данной проблемы является совместная агроинфильтрация с конструкциями, кодирующими супрессоры сайлесинга, например, р19 вируса курчавой карликовости томатов (ВККТ) (Voinnet и др., 1999) или HcPro Y-BK (Brigneti и др., 1998).

Как правило, для продукции целевых белков в растении используются листья, однако и корни можно рассматривать в качестве альтернативной системы экспрессии. Генетическая конструкция вводится в клетки корня в составе вируса (Shadwick и Doran, 2007а, б) или же с помощью А. tumefaciens (Yang и др., 2008; Larsen и Curtis, 2012). Также для экспрессии целевых генов в корнях широкое применение нашла A. rhizogenes (Georgiev и др., 2012).

Существует два основных варианта генетических конструкций, используемых для продукции целевых белков в растительной клетке: нереплицирующиеся векторы и векторы, основанные на геномах вирусов растений.

6.2. Нереплицирующиеся векторы

Как упоминалось выше, агроинфильтрация дает возможность осуществлять одновременную доставку нескольких плазмид в одну и ту же клетку растения с высокой эффективностью. Это становится необходимым при продукции компонентов мультисубъединичных белков (таких как моноклональные антитела) или для ко-экспрессии различных вспомогательных генов (например, супрессоров сайленсинга). Для повышения эффективности продукции целевых белков

используются различные транскрипционные и трансляционные энхансеры, среди которых 5'- и/или З'-НТО из клеточных или вирусных РБК, например, 5-НТО ВТМ (омега), вируса штриховатости табака, РНК 4 вируса мозаики люцерны, S1 -лидер вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК) (Streatfield, 2007). Как правило, для двудольных растений ген целевого белка находится под контролем 358-промотора и терминатора транскрипции ВМЦК. Известны многочисленные примеры продукции функционально активных белков в растениях (см. обзоры Yusibov и др., 2011; Lico и др., 2012; Rybicki и др., 2012; Pogue и Holzberg, 2012). Однако, с расширением спектра видов растений, пригодных для продукции целевых белков, растет и список используемых транскрипционных кассет. В целях повышения выхода ведется поиск новых промоторов, модифицируются уже имеющиеся. Есть примеры успешного применения индуцируемого (OCS)3Mas промотора для продукции гуманизированных антител в L. sativa (Negrouk и др., 2005). Vezina с коллегами (2009) разработал векторы на основе промотора пластоцианина из М. sativa. Гены легкой и тяжелой цепей мышиного IgG (С5-1) были объединены в тандем под контролем этого промотора и соответствующих 5'- и З'-НТО в составе одного вектора. Для повышения уровня продукции была проведена ко-инфильтрация с супрессором сайленсинга HcPro Y-BK. В результате выход С5-1 антител достигал 750 мг на г листовой массы.

Другая стратегия была предложена Sainsbury и Lomonossoff (2008): реплицирующаяся система, основанная на геноме вируса мозаики коровьего горошка (ВМКГ) (см. ниже), может использоваться без РНК-1, которая отвечает за репликацию. В этом случае транскрипция находится под контролем 358-промотора, а высокий уровень экспрессии целевого гена достигается наличием последовательностей 5'- и З'-НТО вируса. В результате удаления дополнительного стартового ко дона (AUG-161) произошло значительное повышение трансляционной активности.

Полученный гипертранслнруемый лидер был использован для продукции человеческих антител против вируса иммунодефицита человека (2G12), выход которых в присутствии супрессора сайленсинга р19 ВККТ достигал 300 мг на г листовой массы.

Таким образом, даже в рамках нереплицирующейся системы можно получить достаточно высокий выход целевого белка в лабораторных условиях, но, как правило, для этого необходимо применять супрессоры сайленсинга.

6.3. Реплицирующиеся векторы

С момента синтеза кДНК вируса мозаики костра (ВМК) в 1984 году (Ahlquist и др., 1984) стало возможным использование полноразмерных кДНК копий (+)РНК-содержащих вирусов растений и животных для получения вирусных РНК in vitro и in vivo. Это послужило основой для создания технологии, подразумевающей доставку целевого гена в клетку растения с помощью вирусных инфекционных копий в составе вектора или, что предпочтительнее, в составе вирусных частиц (Lico и др., 2008). Главным преимуществом реплицирующихся векторов является именно их способность к мультипликации и увеличению количества мРНК, кодирующей целевой белок.

Ниже кратко рассматриваются различные типы векторных систем на основе (+)РНК-содержащих вирусов растений, используемых для продукции терапевтических белков в растении.

6.3.1. Тобамовирусы

Определение полной последовательности генома ВТМ и получение его инфекционной копии открыло массу возможностей для создания векторов «добавленного гена». Геном ВТМ, крВТМ (тобамовирус, заражающий растения семейства Brassicaceae) и вируса мозаики томатов (ВМТ) кодирует 4 белка. Репликаза транслируется с первой открытой рамки считывания (ОРС) геномной РНК. Транспортный белок (ТБ) и белок оболочки (БО) синтезируются с З'-котерминальных субгеномных

РНК (сгРНК). Репликаза является необходимым для репликации вирусного генома белком, в отличие от ТБ и БО. Трансляция мРНК БО ВТМ происходит согласно традиционному кэп-зависимому механизму, однако, в составе генома крВТМ есть сайт внутренней посадки рибосом (IRES, от англ. internal ribosome entry site). Инициация трансляции, обеспечиваемая IRES, гораздо менее эффективна в этом случае, но, тем не менее, позволяет экспрессировать гены с полицистронных матриц (Dorokhov и др., 2006а).

ТБ сгПр

вирусная РНК

РЕП

ТБ

БОсгПр

Ч>

БО

РНК вектора

РЕП

Ґ

БО сгПр БО сгПр

Ч>

шт

БО

ТБ

Ґ

РЕП * 1

\ ТБ

Рисунок Л-8. Схематическое изображение генома тобамовирусов и векторов на их основе. РЕП, ген репликазы; ТБ, ген транспортного белка; БО, ген белка оболочки, сгПр, субгеномный промотор. Гены целевых белков заштрихованы.

Концепция «добавленного гена» может быть реализована разными способами (Рис. Л-8). Целевой ген ставится в полную инфекционную кДНК-копию вируса под контроль дуплицированного субгеномного (сг) промотора БО (ЬіпсІЬо, 2007а) или дополнительного сг промотора из генома другого вируса (Науіу и др., 2006). Другая часто применяемая стратегия - замещение гена БО целевым (Магіїїоппеї и др., 2005; ЬіпсІЬо, 20076, БоЫ и др., 2008). Обе стратегии имеют свои преимущества и

ограничения: в первом случае основной проблемой является размер конечной конструкции и возможная рекомбинация, приводящая к делеции целевого гена, во втором случае - для получения вирусных частиц необходимо добавление компонентов in trans.

6.3.2. Потексвирусы

Потексвирусы относятся к (+)РНК-содержащим вирусам, геном которых кодирует пять открытых рамок считывания. При этом 5'-конец кэпирован, а З'-конец защищен поли-А последовательностью. Первая рамка считывания кодирует вирусную репликазу. Далее, расположены три перекрывающихся ОРС, известные, как тройной блок генов (ТБГ), кодирующий белки, необходимые вирусу для осуществления межклеточного транспорта (Verchot-Lubicz, 2005; Verchot-Lubicz и Bamunusinghe, 2007). Последняя ОРС кодирует вирусный БО.

вирусная РНК 25К сгПр БОсгПр

121сЩр [I-о

Sol

РЕП

тбг2

тбп

тбгз

РНК Бектора

РЕП

Ґ d— с^А

1 [W1 tera [БО

[тбп f ''

БОсгПр

г р

РЕП f ТБГ2

ТЪП ТБПЗ

25КыПр

РЕП

Рисунок Л-9. Схематическое изображение генома потексвирусов и векторов на их основе. РЕП, ген репликазы; ТБГ 1-3, компоненты тройного блока генов; БО, ген белка оболочки, сгПр, субгеномный промотор. Гены целевых белков заштрихованы.

Первый вектор на основе ХВК содержал репортерный ген (GFP) под контролем дуплицированного сг промотора БО (Рис. JI-9). Позже была создана конструкция pPVX201, в которой синтез вирусной РНК направляется 35Б-промотором из вируса мозаики цветной капусты (Baulcombe и др., 1995).

Именно по принципу pPVX201 строится большинство векторов на основе ХВК, используемых для продукции целевого белка (Azhakanandam и др., 2007; Mechtcheriakova и др., 2006). Вследствие этого было создано несколько конструкций, где целевой ген замещал вирусный: например, вирусные вектора, в которых ген БО заменен геном GFP или генами легкой/тяжелой цепи антитела (Giritch и др., 2006).

Другой вариант вирусного вектора на основе ХВК представляет PVXdt-GFP (Рис. J1-9, низ) - конструкция, в которой удалены гены БО и ТБГ, а синтез целевого белка GFP направляется с 25К сг промотора (Komarova и др., 2006). Такой вирусный вектор хоть и не может распространяться в растении, однако обеспечивает значительное повышение уровня получаемого целевого белка при использовании методов агроинъекции (вместе с супрессором сайлесинга PI9).

Еще одним подходом в создании векторов на основе ХВК является вставка последовательности целевого гена в рамке с геном БО, в итоге при трансляции образуется слитый белок. В этом случае существует два варианта: белок оказывается присоединенным непосредственно к N-концу БО (Uhde и др., 2005) либо через 2А каталитический пептид вируса ящура для последующего «разрезания» слитого белка (Santa Cruz и др., 1996).

6.3.3. Потивирусы

В векторах, основанных на геноме потивирусов, применяются различные стратегии экспрессии чужеродных белков. Геном потивирусов представляет собой одноцепочечную (+)РНК, при трансляции которой получается единый полипротеин, разрезаемый

впоследствии вирусными протеазами (Рис. Л-10). Для создания первого вектора на основе генома потивирусов был использован вирус гравировки табака (ВГТ), в кДНК которого была вставлена последовательность гена GUS перед геном вспомогательного компонента протеазы (НсРрго) и в одной ОРС с ним (Dolja и др., 1992). Также известен потивирусный вектор (сконструированный на основе генома вируса шарки сливы), который используется для экспрессии полноразмерных белков и вакцин. При этом последовательность целевого гена вставлена между участками, кодирующими РНК-зависимую вирусную полимеразу (Nib) и БО, а получаемый белок выщепляется из полипротеина, т.к. фланкирован сайтами узнавания протеазы Nia (Varrelmann и др., 2000).

вирусная РНК

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Комарова, Татьяна Валерьевна

выводы

1. Разработана экспериментальная модель экспорта РНК из ядра растительной клетки, позволяющая исследовать перемещение в цитоплазму молекул коротких некодирующих РНК, синтезированных в ядре ДНК-зависимыми РНК-полимеразами I, II и III.

2. С помощью разработанной системы, был открыт новый механизм конкуренции за ядерный экспорт между кнРНК и кмРНК, с одной стороны, и другими более длинными мРНК, с другой стороны, характеризующийся следующими свойствами: а) экспорт из ядра в цитоплазму молекул РНК, синтезируемых в ядре РНК-полимеразой I, II или III, самостоятелен и не зависит друг от друга; б) конкуренция приводит к подавлению синтеза в цитоплазме репортерного белка GFP и клеточного белка BiP; в) ингибирование экспрессии мРНК не связано с конкуренцией промоторов Pol II35S за РНК-полимеразу II, но напрямую зависит от длины транскрипта и «силы» транскрипционного промотора; г) молекулы кнРНК, синтез которых в ядре направляется РНК-полимеразами I или III, не оказывают влияния на экспрессию мРНК; д) синтез в ядре кнРНК или кмРНК создает благоприятные условия для репродукции в цитоплазме вирусного вектора.

3. Разработана концепция конкуренции макромолекул на этапе ядерного транспорта в бактериальном и вирусном патогенезе растений.

4. Создана новая экспериментальная функциональная модель межклеточного транспорта, основанная на открытии важной роли метанола в жизни растений и его участии в: а) контроле генов, регулирующих устойчивость растений к абиотическим и биотическим факторам; б) передаче сигнала от растения к растению, приводящего к мобилизации защитных реакций растения; в) межклеточном транспорте макромолекул; г) создании условий, благоприятных для репродукции вирусов; д) создании условий, препятствующих бактериальной колонизации.

5. Изучены молекулярные механизмы и определена роль транспорта макромолекул в иммунитете растений, создана концепция конкуренции макромолекул хозяина и патогена на уровне ядерно-цитоплазматического и межклеточного транспорта за общие рецепторы и/или белки переносчики.

6. Разработана технологическая основа эффективной продукции вакцин и антител в растении, основанная на выявленных закономерностях ядерно-цитоплазматического и межклеточного транспорта макромолекул в растении.

БЛАГОДАРНОСТИ

В первую очередь хочу выразить искреннюю благодарность своему научному консультанту, учителю и наставнику, Дорохову Юрию Леонидовичу, за чуткое руководство, вдохновение, поддержку, а также за неоценимую помощь в подготовке материалов для публикаций и диссертации.

Хочу поблагодарить коллег, внесших весомый вклад в данную работу, в том числе Фролову Ольгу Юрьевну за огромную помощь в проведении исследований и обработке полученных данных; Шеваля Евгения Валерьевича за техническую поддержку в экспериментах с использованием микроскопии; Зиновкина Романа Алексеевича и Савченко Ирину Михайловну за проведение ОТ-ПЦР-РВ; Скулачева Максима Владимировича, Звереву Анну Сергеевну, Шварца Антона Марковича, Шевелеву Анну Александровну, Макарова Александра Алексеевича, Иванова Петра Алексеевича за помощь в получении генноинженерных конструкций и рекомбинантных белков, а также проведении экспериментов; Ташлицкого Вадима Нероновича, Кирьянова Глеба Ивановича и Смирнову Екатерину Анатольевну за проведение измерений концентраций ЛОС; Крейга Пикарда, Хильдбург Бейер и Анну Саймон за предоставленные конструкции; Виталия Цитовского и Юрия Глебу за помощь в подготовке публикаций. Хочу выразить особую благодарность коллективу лаборатории трансгенных препаратов РОНЦ имени Н.Н.Блохина и ее руководителю, Косорукову Вячеславу Станиславовичу, за помощь в работе с моноклональными антителами. Хочу поблагодарить всех коллег и сотрудников кафедры вирусологии МГУ, а также заведующего кафедрой, Иосифа Григорьевича Атабекова.

И в заключение, выражаю огромную благодарность членам коллектива, Петруне Игорю Валерьевичу, Поздышеву Денису Валерьевичу, Шиндяпиной Анастасии Валерьевне, Фроловой Нине Николаевне и Шешуковой Екатерине Владимировне за ежедневную совместную плодотворную работу, теплую атмосферу, а также за помощь и поддержку.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Комарова, Татьяна Валерьевна, 2013 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ahlquist P, French R, Janda M, Loesch-Fries S. (1984) Multicomponent RNA plant virus infection derived from cloned viral cDNA. Proc. Natl Acad. Sci. USA 81, 7066-7070.

2. Akiyama, T., Jin, S., Yoshida, M., Hoshino, T., Opassiri, R., & Cairns, K. J. R. (2009). Expression of an endo-(l,3;l,4)-beta-glucanase in response to wounding, methyl jasmonate, abscisic acid and ethephon in rice seedlings. Journal of Plant Physiology, 166 (16), 1814-1825.

3. Albert M., Jehle A.K., Lipschis M., Mueller K., Zeng Y., Felix G. (2010) Regulation of cell behaviour by plant receptor kinases: Pattern recognition receptors as prototypical models. Eur. J. Cell Biol. 89: 200-207.

4. Arimura, G., Ozawa, R., Shimoda, T., Nishioka, T., Boland, W., & Takabayashi, J. (2000). Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in Lima bean leaves. Nature, 406 (6795), 512-515.

5. Attaran, E., Zeier, T. E., Griebel, T., & Zeier, J. (2009). Methyl salicylate production and jasmonate signaling are not essential for systemic acquired resistance in Arabidopsis. The Plant Cell, 21(3), 954-971.

6. Ausubel F. M. (2005) Are innate immune signaling pathways in plants and animals conserved? Nature Immunol. 6, 973-979.

7. Azhakanandam K, Weissinger SM, Nicholson JS, Qu R, Weissinger AK. (2007) Amplicon-plus targeting technology (APTT) for rapid production of a highly unstable vaccine protein in tobacco plants. Plant Mol. Biol. 63, 393-404.

8. Balandin, T., Van Der Does, C., Albert, J. M., Bol, J. F., & Linthorst, H. J. (1995). Structure and induction pattern of a novel proteinase inhibitor class II gene of tobacco. Plant Molecular Biology, 27(6), 1197-1204.

9. Baldwin, I. T. (2010). Plant volatiles. Current Biology, 20(9), 392-397.

10. Bate, N. J., & Rothstein, S. J. (1998). C6-volatiles derived from the lipoxygenase pathway induce a subset of defense-related genes. The Plant Journal, 16(5), 561-569.

11. Baulcombe DC, Chapman S, Santa Cruz S. (1995) Jellyfish green fluorescent protein as a reporter for virus infections. Plant J. 7, 1045-1053.

12. Bazzini AA, Hopp HE, Beachy RN, Asurmendi S. (2007) Infection and coaccumulation of tobacco mosaic virus proteins alter microRNA levels, correlating with symptom and plant development. Proc Natl Acad Sci USA 104: 12157-12162.

13. Bazzini AA, Manacorda CA, Tohge T, Conti G, Rodriguez MC, Nunes-Nesi A, Villanueva S, Fernie AR, Carrari F, Asurmendi S. (2011) Metabolic and miRNA profiling of TMV infected plants reveals biphasic temporal changes. PLoS One. 6 (12):e28466.

14. Beauchemin C, Bougie V, Laliberté JF. (2005)Simultaneous production of two foreign proteins from a potyvirus-based vector. Virus Res. 112, 1-8.

15. Benitez-Alfonso Y, Faulkner C, Ritzenthaler C, Maule AJ. (2010) Plasmodesmata: gateways to local and systemic virus infection. Mol Plant Microbe Interact. 23(11): 1403-1412.

16. Benitez-Alfonso Y., Jackson D. (2009) Redox homeostasis regulates plasmodesmal communication in Arabidopsis meristems. Plant Signal Behav. 4: 655-659.

17. Bennasser Y, Chable-Bessia C, Triboulet R, Gibbings D, Gwizdek C, Dargemont C, Kremer EJ, Voinnet O, Benkirane M. (2011) Competition for XP05 binding between Dicer mRNA, pre-miRNA and viral RNA regulates human Dicer levels. Nat Struct Mol Biol. 18(3):323-327.

18. Bertsch, C., M. Beuve, V.V. Dolja, M. Wirth, F. Pelsy, E. Herrbach & O. Lemaire. (2009) Retention of the virus-derived sequences in the nuclear genome of grapevine as a potential pathway to virus resistance. Biology Direct A:21 .

19. Bevan M.W., Flavell R.B., Chilton M.D. (1983) A chimeric antibiotic resistance gene as a selectable marker for plant cell transformation. Nature. 304: 184-187.

20. Bhardwaj V., Meier S., Petersen L.N., Ingle R.A., Roden L.C. (2011) Defence Responses of Arabidopsis thaliana to Infection by Pseudomonas syringae Are Regulated by the Circadian Clock. PLoS ONE. 6(10): e26968.

21. Bierne H., Cossart P. (2012) When bacteria target the nucleus: the emerging family of nucleomodulins. Cell Microbiol. 14(5): 622-633.

22. Blobel G. (1985) Gene gating: a hypothesis. Proc Natl Acad Sci USA. 82(24): 8527-8529.

23. Block A., Alfano J.R. (2011) Plant targets for Pseudomonas syringae type III effectors: virulence targets or guarded decoys. Curr Opin Microbiol. 14(1): 39-46.

24. Block A., Li G., Fu Z.Q., Alfano J.R. (2008) Phytopathogen type III effector weaponry and their Plant targets. Curr Opin Plant Biol 11: 396403.

25. Boch J. & Bonas U. (2010) Xanthomonas AvrBs3 family type III effectors: discovery and function. Annu Rev Phytopathol. 48: 419-436.

26. Boch J., Scholze H., Schornack S., Landgraf A., Hahn S., Kay S., Lahaye T., Nickstadt A., Bonas U. (2009) Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science. 326: 1509-1512.

27. Bogdanove A.J., Schornack S. & Lahaye T. (2010) TAL effectors: finding plant genes for disease and defense. Curr Opin Plant Biol. 13:394-401.

28. Boiler T. & Felix G. (2009) A renaissance of elicitors: perception of microbe-associated molecular patterns and danger signals by patternrecognition receptors. Annu. Rev. Plant Biol. 60: 379-406.

29. Boiler T. and Felix G. (2009) A renaissance of elicitors: perception of microbe-associated molecular patterns and danger signals by patternrecognition receptors. Annu. Rev. Plant Biol. 60: 379^406.

30. Brigneti, G., Voinnet, O., Li, W.-X., Ji, L.-PI., Ding, S.-W., & Baulcombe, D. C. (1998). Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana. EMBOJ. 17:6739-6746.

31. Brooks D. M., Bender C. L. & Kunkel B. N. (2005) The Pseudomonas syringae phytotoxin coronatine promotes virulence by overcoming salicylic acid-dependent defences in Arabidopsis thaliana. Mol. Plant Pathol. 6: 629-640.

32. Brownfield L., Doblin M., Fincher G.B. & Bacic A. (2009) Biochemical and molecular properties of biosynthetic enzymes for (l,3)-(3-glucans. In Chemistiy, Biochemistry, and Biology of 1-3 Beta Glucans and Related Polysaccharides (Bacic, A.et al., eds), 283-326, Elsevier

33. Brugidou, C., Opalka, N., Yeager, M., Beachy, R. N., & Fauquet, C. (2002). Stability of Rice yellow mottle virus and cellular compartmentalization during the infection process in Oryza sativa (L.). Virology, 297(1), 98-108.

34. Bucher GL, Tarina C, Heinlein M, Di Serio F, Meins F, Jr., Iglesias VA. (2001) Local expression of enzymatically active class I beta-1,3-glucanase enhances symptoms of TMV infection in tobacco. Plant J. 28: 361369.

35. Byers, J. A. (1992). Attraction of bark beetles, Tomicus piniperda, Hylurgops palliatus, and Ttypodendron domesticum and other insects to short-chain alcohols and monoterpenes. Journal of Chemical Ecology, 18(12), 2385-2402.

36. Canonne J., Marino D., Jauneau A., Pouzet C., Briere C., Roby D. & Rivas S. (2011) The Xanthomonas type III effector XopD targets the Arabidopsis transcription factor MYB30 to suppress plant defense. Plant Cell. 23: 3498-3511.

37. Cao F.Y., Yoshioka K., Desveaux D. J. (2011) The roles of ABA in plant-pathogen interactions. Plant Res. 124(4): 489-499.

38. Capelson M, Liang Y, Schulte R, Mair W, Wagner U, Hetzer MW. (2010) Chromatin-bound nuclear pore components regulate gene expression in higher eukaryotes. Cell. 140:372-383.

39. Capoor, S. P. (1949). The movement of tobacco mosaic viruses and potato virus X through tomato plants. Annals of Applied Biology, 36(3), 307-319.

40. Carr, J. P., Lewsey, M. G., & Palukaitis, P. (2010). Signaling in induced resistance. Advances in Virus Research, 76, 57-121.

41. Castle, S. J., Mowry, T. M., & Berger, P. H. (1998). Differential settling by Myzus persicae (Homoptera: Aphididae) on various virus infected host plants. Annals of the Entomological Society of America, 91(5), 661-667.

42. Chabner B.A., Longo D.L. (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principles and Practice.-3rd ed., Philadelphia: Lippincott.-Raven, 678-699.

43. Cheo, P. C. (1970). Subliminal infection of cotton by tobacco mosaic virus. Journal of Phytopathology, 60, 41^46.

44. Chinchilla D., Bauer Z., Regenass M., Boiler T. & Felix G. (2006) The Arabidopsis receptor kinase FLS2 binds flg22 and determines the specificity of flagellin perception. Plant Cell. 8: 465-476.

45. Chisholm S. T., Coaker G., Day B. & Staskawicz B. J. (2006) Host-microbe interactions: shaping the evolution of the plant immune response. Cell. 124: 803-814.

46. Chosed R., Tomchick D.R., Brautigam C.A., Mukherjee S., Negi V.S., Machius M. & Orth K. (2007) Structural analysis ofXanthomonas XopD provides insights nto substrate specificity of ubiquitin-like protein proteases. J Biol Chem. 282: 6773-6782.

47. Choudhary, D. K., Johri, B. N., & Prakash, A. (2008). Volatiles as priming agents that initiate plant growth and defence responses. Current Science, 94(5), 595-604.

48. Christian M., Cermak T., Doyle E.L., Schmidt C., Zhang F., Hummel A., Bogdanove A.J., Voytas D.F. (2010) Targeting DNA doublestrand breaks with TAL effector nucleases. Genetics. 186: 757-761.

49. Citovsky V., Kozlovsky S.V., Lacroix B., Zaltsman A., Dafny-Yelin M., Vyas S., Tovkach A., Tzfira T. (2007) Biological systems of the host cell involved in Agrobacterium infection. Cell Microbiol. 9: 9-20.

50. Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., & Zambryski, P. (1990). The P-30 protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein. Cell, 60(4), 637-647.

51. Collier S.M., Moffett P. (2009) NB-LRRs work a 'bait and switch' on pathogens. Trends Plant Sci. 14: 521-529.

52. Conti G, Rodriguez MC, Manacorda CA, Asurmendi S. (2012) Transgenic expression of Tobacco mosaic virus capsid and movement proteins modulate plant basal defense and biotic stress responses in Nicotiana tabacum. Mol Plant Microbe Interact. 25( 10): 1370-84.

53. Crane Y.M. & Gelvin S.B. (2007) RNAi-mediated gene silencing reveals involvement of Arabidopsis chromatinrelated genes in Agrobacterium-mediated root transformation. Proc Natl Acad Sci USA. 104: 15156-15161.

54. Crawford KM, Zambryski PC. (2000) Subcellular localization determines the availability of non-targeted proteins to plasmodesmatal transport. Curr Biol. 10:1032-1040.

55. Cremer T, Cremer M. (2010) Chromosome territories. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2(3):a003889.

56. Cunnac S., Lindeberg M., Collmer A. (2009) Pseudomonas syringae type III secretion system effectors: repertoires in search of functions. Curr Opin Microbiol. 12: 53-60.

57. D'Auria JC, Pichersky E, Schaub A, Hansel A, Gershenzon J. (2007) Characterization of a BAHD acyltransferase responsible for producing the green leaf volatile (Z)-3-hexen-l-yl acetate in Arabidopsis thaliana. Plant J. 49:194-207.

58. Dader, B., Moreno, A., Vinuela, E., & Fereres, A. (2012). Spatiotemporal dynamics of viruses are differentially affected by parasitoids depending on the mode of transmission. Viruses, 4(11), 3069-3089.

59. Dangl J.L. & Jones J.D. (2001) Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature. 411: 826-833.

60. Danhorn T., Fuqua C. (2007) Biofilm formation by plant associated bacteria. Annual Review of Microbiology. 61: 401-422.

61. De Cleene M., De Ley J. (1976) The host range of crown gall. Bot. Rev. 42: 389^166.

62. de Felipe P. (2002) Polycistronic viral vectors. Curr Gene Ther. 2(3):355-78.

63. de Framond A.J., Barton K.A., Chilton M.D. (1983) Mini-Ti: a new vector strategy for plant genetic engineering. Biotechnology (NY). 5: 262-269.

64. de Groot M.J.A., Bundock P., Hooykaas P.J.J., Beijersbergen A.G.M. (1998) Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nat. Biotechnol. 16: 839-842.

65. De Vos, M., & Jander, G. (2010). Volatile communication in plant-aphid interactions. Current Opinion in Plant Biology, 13(4), 366-371.

66. DebRoy S., Thilmony R., Kwack Y.B., Nomura K., He S.Y. (2004) A family of conserved bacterial effectors inhibits salicylic acid-mediated basal immunity and promotes disease necrosis in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101: 9927-9932.

67. Deng, C., Zhang, X., Zhu, W., & Qian, J. (2004). Gas chromatography-mass spectrometry with solid-phase microextraction method for determination of methyl salicylate and other volatile compounds in leaves

of Lycopersicon esculentum. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 378(2), 518-522.

68. Desclos-Theveniau M., Arnaud D., Huang T.Y., Lin G.J., Chen W.Y., Lin Y.C., Zimmerli L. (2012) The Arabidopsis lectin receptor kinase LecRK-V.5 represses stomatal immunity induced by Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. PLoSPathog. 8(2):el002513.

69. Deslandes L, Olivier J, Peeters N, Feng DX, Khounlotham M, Boucher C, Somssich I, Genin S, Marco Y. (2003) Physical interaction between RRS1-R, a protein conferring resistance to bacterial wilt, and PopP2, a type III effector targeted to the plant nucleus. Proc Natl Acad Sci USA. 100(13):8024-9.

70. Deslandes L, Rivas S. (2012) Catch me if you can: bacterial effectors and plant targets. Trends Plant Sci. 17(11):644-55.

71. Diachenko L, Lau YF, Campbell AP, Chenchik A, Mogadam F, Huang B, Lukyanov S, Lukyanov K, Gurskaya N, Sverdlov ED, Siebert D. (1996) Suppression Subtracive Hybridization: A method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(12): 6025-6030.

72. Djamei A., Pitzschke A., Nakagami H., Rajh I., Hirt H. (2007) Trojan horse strategy in Agrobacterium transformation: abusing MAPK defense signaling. Science. 318: 453-456.

73. Dodds P.N., Rathjen J.P. (2010) Plant immunity: Towards an integrated view of plant-pathogen interactions. Nat. Rev. Genet. 11: 539-548.

74. Doelling JH, Pikaard CS. (1996) Species-specificity of rRNA gene transcription in plants manifested as a switch in RNA polymerase specificity. Nucleic Acids Res. 24:4725^1732.

75. Dohi K, Tamai A, Mori M. (2008) Insertion in the coding region of the movement protein improves stability of the plasmid encoding a tomato mosaic virus-based expression vector. Arch Virol. 153(9): 1667-75.

76. Dolja W, McBride HJ, Carrington JC. (1992) Tagging of plant potyvirus replication and movement by insertion of b-glucuronidase into the viralpolyprotein. Proc. Natl Acad. Sci. USA 89, 10208-10212.

77. Dong X., Hong Z., Chatterjee J., Kim S., Verma D.P. (2008) Expression of callose synthase genes and its connection with Nprl signaling pathway during pathogen infection. Planta. 229: 87-98.

78. Dorokhov Y.L., Ivanov P.A., Komarova T.V., Skulachev M.V. & Atabekov J.G. (2006 a) An internal ribosome entry site located upstream of the crTMV coat protein (CP) gene can be used for CP synthesis in vivo. Journal of General Virology, 87: 2693-2697.

79. Dorokhov Y.L., Frolova O.Y., Skurat E.V., Gasanova P.A., Ravin N.V., Makinen K., Klimyuk V.I., Skryabin K.G., Gleba Y.Y., Atabekov J.G. (2006 6) A novel function for a ubiquitous plant enzyme pectin methylesterase: the enhancer of RNA silencing.. FEBSLett, 580, 3872-3878

80. Dorokhov Y.L., Makinen K.M., Frolova O.Yu, Merits A., Kalkkinen N., Saarinen J., Atabekov J.G., Saarma M. A novel function for a ubiquitous plant enzyme pectin methylesterase: the host-cell receptor for the tobacco mosaic virus movement protein. 1999. FEBS Lett. 461, 223-228

81. Dorokhov, Y. L., Alexandrova, N. M., Miroshnichenko, N. A., & Atabekov, J. G. (1983). Isolation and analysis of virus-specific ribonucleoprotein of tobacco mosaic virus-infected tobacco. Virology, 127(2), 237-252.

82. Dou D., Zhou J.M. (2012) Phytopathogen effectors subverting host immunity: different foes, similar battleground. Cell Host Microbe. 12(4): 484-495.

83. Dudareva, N., & Pichersky, E. (2008). Metabolic engineering of plant volatiles. Current Opinion in Biotechnology, 19(2), 181-189.

84. Dudareva, N., Negre, F., Nagegowda, D. A., & Orlova, I. (2006). Plant volatiles: recent advances and future perspectives. Critical Reviews in Plant Sciences, 25(5), 417-440.

85. Dudareva, N., Pichersky, E., & Gershenzon, J. (2004). Biochemistry of plant volatiles. Plant Physiology, 135(4), 1893-1902.

86. Durrant W.E. & Dong X. (2004) Systemic acquired resistance. Annu. Rev. Phytopathol. 42: 185-209.

87. Eberl L. & Riedel K. (2011) Mining quorum sensing regulated proteins - Role of bacterial cell-to-cell communication in global gene regulation as assessed by proteomics. Proteomics. 11: 3070-3085.

88. Ehlers K. & Kollmann R. (2001) Primary and secondary plasmodesmata: structure, origin, and functioning. Protoplasma. 216: 1-30.

89. Eigenbrode, S. D., Ding, H., Shiel, P., & Berger, P. H. (2002). Volatiles from potato plants infected with potato leafroll virus attract and arrest the virus vector, Myzus persicae (Homoptera: Aphididae). Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, 269(1490), 455-460.

90. Elmore J.M., Lin Z.J., Coaker G. (2011) Plant NB-LRR signaling: upstreams and downstreams. Curr Opin Plant Biol. 14: 365-371.

91. Engelberth, J., Alborn, H. T., Schmelz, E. A., & Tumlinson, J. H.

(2004). Airborne signals prime plants against insect herbivore attack. Proc Nat AcSci USA, 101(6), 1781-1785.

92. Engler C, Gruetzner R, Kandzia R, Marillonnet S. (2009) Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type lis restriction enzymes. PLoS One 4: e5553.

93. Enrique R., Siciliano F., Favaro M.A., Gerhardt N., Roeschlin R., Rigano L, Sendin L, Castagnaro A, Vojnov A, Marano MR. (2011) Novel demonstration of RNAi in citrus reveals importance of citrus callosesynthase in defence against Xanthomonas citri subsp. citri. Plant Biotechnol J. 9(3): 394-407.

94. Farag, M. A., Fokar, M., Zhang, H., Allen, R. D., & Pare, P. W.

(2005). (Z)-3-hexenol induces defense genes and downstream metabolites in maize. Planta, 220(6), 900-909.

95. Farmer, E. E., & Ryan, C. A. (1990). Interplant communication— airborne methyl jasmonate induces synthesis of proteinase-inhibitors in plant leaves. Proc Natl Acad Sci USA, 87(19), 7713-7716.

96. Fatouros, N. E., Lucas-Barbosa, D., Weldegergis, B. T., Pashalidou, F. G., Van Loon, J. J., Dicke, M., Harvey, J. A., Gols, R., & Huigens, M. E. (2012). Plant volátiles induced by herbivore egg deposition affect insects of different trophic levels. PLoS One, 7(8):e43607.

97. Feng F., Zhou J.M. (2012) Plant-bacterial pathogen interactions mediated by type III effectors. Curr Opin Plant Biol. 15(4): 469-476.

98. Fogh J., Fogh JM, Orfeo T. (1977) One hundred and twenty-seven cultured human tumor cell lines producing tumors in nude mice. J. Natl. Cancer Inst. 59: 221-226.

99. Forcat S., Bennett M., Grant M., Mansfield J.W. (2010) Rapid linkage of indole carboxylic acid to the plant cell wall identified as a component of basal defence in Arabidopsis against hrp mutant bacteria. Phytochemistry. 71(8-9): 870-876.

100. Fraile, A., & García-Arenal, F. (2010). The coevolution of plants and viruses: resistance and pathogenicity. Advances in Virus Research, 76, 132.

101. Fraley R.T, Rogers S.G., Horsch R.B., Sanders P.R., Flick J.S., Adams S.P., Bittner M.L., Brand L.A., Fink C.L., Fry J.S., et al. (1983) Expression of bacterial genes in plant cells. Proc Natl Acad Sci USA. 80: 4803-4807.

102. Frost, C. J., Mescher, M. C., Dervinis, C., Davis, J. M., Carlson, J. E., & De Moraes, C. M. (2008). Priming defense genes and metabolites in hybrid poplar by the green volatile cis-3-hexenyl acetate. The New Phytologist, 180(3), 722-734.

103. Gallagher K.L. & Benfey P.N. (2005) Not just another hole in the wall: understanding intercellular protein trafficking. Genes Dev. 19: 189-195.

104. Gallagher KL, Benfey PN. (2009) Both the conserved GRAS domain and nuclear localization are required for SHORT-ROOT movement. Plant J. 57(5):785-797.

105. Garcia-Rodriguez F.M., Schrammeijer B. & Hooykaas P.J. (2006) The Agrobacterium VirE3 effector protein: a potential plant transcriptional activator. Nucleic Acids Res. 34: 6496-6504.

106. Garrett JT, Rawale S, Allen SD, Phillips G, Forni G, Morris JC, Kaumaya PT. (2007) Novel engineered trastuzumab conformational epitopes demonstrate in vitro and in vivo antitumor properties against HER-2/neu. J Immunol 178: 7120-7131

107. Geibler R., Scholze H., Hahn S., Streubel J., Bonas U., Behrens S.-E. & Boch J. (2011) Transcriptional activators of human genes with programmable DNA-specificity. PLoS ONE. 6: el9509.

108. Gelvin S.B. (2010) Plant proteins involved in Agrobacterium mediated genetic transformation. Annu Rev Phytopathol. 48: 45-68.

109. Georgiev M.I., Agostini E., Ludwig-Muller J., Xu J. (2012) Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource. Trends Biotechnol. 30(10): 528-537.

110. Geyer PK, Vitalini MW, Wallrath LL. (2011) Nuclear organization: taking a position on gene expression. Curr Opin Cell Biol. 23(3):354-9.

111. Gibbs A J, Fargette D, Garcia- Arenal F, Gibbs MJ (2010) Time -the emergingdimension of plant virus studies. J Gen Virol. 91: 13-22

112. Gillespie, T., Boevink, P., Haupt, S., Roberts, A. G., Toth, R., Valentine, T., Chapman, S., & Oparka, K. J. (2002). Functional analysis of a DNA-shuffled movement protein reveals that microtubules are dispensable for the cell-to-cell movement of tobacco mosaic virus. The Plant Cell, 14(6), 1207-1222.

113. Giritch A, Marillonnet S, Engler C, van Eldik G, Botterman J, Klimyuk V. & Gleba Y. (2006) Rapid high-yield expression of full-size IgG

antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors. Proc. Natl Acad. Sei. USA 103, 14701-14706.

114. Glazebrook J. (2005) Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 43: 205-227.

115. Gieba Y, Klimyuk V, Marillonnet S. (2005) Magnifection - A new platform for expressing recombinant vaccines in plants. Vaccine 23, 2042-2048.

116. Gieba Y, Klimyuk V, Marillonnet S. (2007)Viral vectors for the expression of proteins in plants. Curr. Opin. Biotechnol. 18, 134-141.

117. Gomez-Gomez L. & Boller T. (2002) Flagellin perception: a paradigm for innate immunity. Trends Plant Sei. 7: 251-256.

118. Gopinath K, Wellink J, Porta C, Taylor KM, Lomonossoff GP, van Kämmen A. (2000) Engineering cowpea mosaic virus RNA-2 into a vector to express heterologous proteins in plants. Virology 267, 159-173.

119. Gout, E., Aubert, S., Bligny, R., Rebeille, F., & Nonomura, A. R. (2000). Metabolism of methanol in plant cells. Carbon-13 nuclear magnetic resonance studies. Plant Physiology. 123(1), 287-296.

120. Green BJ, Fujiki M, Mett V, Kaczmarczyk J, Shamloul M, Musiychuk K, Underkoffler S, Yusibov V, Mett V. (2009) Transient protein expression in three Pisum sativum (green pea) varieties. Biotechnol. J. 4, 230237.

121. Greenberg J. T. & Yao N. (2004) The role and regulation of programmed cell death in plant-pathogen interactions. Cell. Microbiol. 6: 201-211.

122. Greenberg J.T. & Yao N. (2004) The role and regulation of programmed cell death in plant-pathogen interactions. Cell Microbiol. 6: 201211.

123. Gregory P. Pogue and Steven Holzberg (2012) Transient Virus Expression Systems for Recombinant Protein Expression in Dicot- and

Monocotyledonous Plants, Plant Science, Dr. Nabin Kumar Dhal (Ed.), ISBN: 978-953-51-0905-1.

124. Groll M., Schellenberg B., Bachmann A.S., Archer C.R., Huber R., Powell T.K., Lindow S., Kaiser M., Dudler R. (2008) A plant pathogen virulence factor inhibits the eukaryotic proteasome by a novel mechanism. Nature. 452: 755-758.

125. Gudesblat G.E., Torres P.S., Vojnov A.A. (2009) Stomata and pathogens. Warfare at the gates. Plant Signal Behav. 4(12): 1114-1116.

126. Gudesblat G.E., Torres P.S., Vojnov A.A. (2009) Xanthomonas campestris overcomes Arabidopsis stomatal innate immunity through a DSF cell-to-cell signal-regulated virulence factor. Plant Physiol. 149: 1017-1027.

127. Gurskaya NG, Diachenko L, Chenchik A, Siebert PD, Khaspekov GL, Lukyanov K, Vagner LL, Ermolaeva OD, Lukyanov S, Sverdlov ED. (1996) The Equalizing cDNA Subtraction Based on Selective Suppression of Polymerase Chain Reaction: Cloning of the Jurkat Cells' Transcripts Induced by Phytohemaglutinin and Phorbol 12-myristate 13-acetate. Anal. Biochem. 240(1): 90-97.

128. Guseman J.M., Lee J.S., Bogenschutz N.L., Peterson K.M., Virata R.E., Xie B., Kanaoka M.M., Hong Z., Torii K.U. (2010) Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8). Development. 137: 1731-1741.

129. Hammond R.W., Nemchinov L.G. (2009) Plant production of veterinary vaccines and therapeutics. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 332: 79102.

130. Hanssen, I.M., Lapidot, M., & Thomma, B.P. (2010). Emerging viral diseases of tomato crops. Molecular Plant-Microbe Interactions. 23(5), 539-48.

131. I-Iauck P., Thilmony R., He S.Y. (2003) A Pseudomonas syringae type III effector suppresses cell wall-based extracellular defense in susceptible Arabidopsis plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100: 8577-8582.

132. Haviv S, Galiakparov N, Goszczynski DE, Batuman O, Czosnek H, Mawassi M. (2006) Engineering the genome of Grapevine virus A into a vector for expression of proteins in herbaceous plants. J Virol Methods. 132:227-231.

133. Haywood V., Kragler F., Lucas W.J. (2002) Plasmodesmata: pathways for protein and ribonucleoprotein signaling. Plant Cell. 14: S303-S325.

134. Heil, M. (2009). Damaged-self recognition in plant herbivore defence. Trends in Plant Science, 14(7), 356-63.

135. Heil, M., & Adame-Álvarez, R. M. (2010). Short signalling distances make plant communication a soliloquy. Biology Letters, 6(6), 843845.

136. Herrera-Estrella L., DeBlock M.,Messens E., Hernalsteens J.P., VanMontagu M., Schell J. (1983) Chimeric genes as dominant selectable markers in plantcells. EMBOJ. 2: 987-996.

137. Hiscox JA. (2007) RNA viruses: hijacking the dynamic nucleolus. Nat Rev Microbiol. 5(2): 119-27.

138. Flocine S, Singer RH, Grünwald D. (2010) RNA processing and export. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2(12):a000752.

139. Hockemeyer D., Wang H., Kiani S., Lai C.S., Gao Q., Cassady J.P., Cost G.J., Zhang L., Santiago Y., Miller J.C., Zeitler B., Cherone J.M., Meng X., Hinkley S.J., Rebar E.J., Gregory P.D., Urnov F.D., Jaenisch R. (2011) Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29: 731-734.

140. Hoekema A., Hirsch P. R., Hooykaas P. J. J. & Schilperoort R. A. (1983) A binary plant vector strategy based on separation of vir- and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Nature. 303: 179-180.

141. Holopainen, J .K., & Blande, J. D. (2012). Molecular plant volatile communication. Advances in Experimental Medicine and Biology, 739, 17-31.

142. Holopainen, J.K. (2004). Multiple functions of inducible plant volatiles. Trends in Plant Science, 9(11), 529-533.

143. Hotson A., Chosed R., Shu H., Orth K. & Mudgett M.B. (2003) Xanthomonas type III effector XopD targets SUMOconjugated proteins in planta. Mol Microbiol. 50: 377-389.

144. Howard E.A., Zupan J.R., Citovsky V. & Zambryski P.C. (1992) The VirD2 protein of A. tumefaciens contains a C-terminal bipartite nuclear localization signal: implications for nuclear uptake of DNA in plant cells. Cell. 68: 109-118.

145. Hüve, K., Christ, M. M., Kleist, E., Uerlings, R., Niinemets, Ü., Walter, A., & Wildt, J. (2007). Simultaneous growth and emission measurements demonstrate an interactive control of methanol release by leaf expansion and stomata. Journal of Experimental Botany, 58(7), 1783-1793.

146. Hyun IX, Uddin MN, Rim Y, Kim JY. (2011) Cell-to-cell trafficking of RNA and RNA silencing through plasmodesmata. Protoplasma. 248(1):101-16.

147. Ingwell, L. L., S. D. Eigenbrode, Nilsa A. Bosque-Perez (2012). Plant viruses alter insect behavior to enhance their spread. Sei. Rep. 2: 578.

148. Jimenez-Martinez, E. S., Bosque-Perez, N. A., Berger, P. H., Zementra, R. S., Ding, H., & Eigenbrode, S. D. (2004). Volatile cues influence the response of Rhopalosiphum padi (Homoptera: Aphididae) to Barley yellow dwarf virus-infected transgenic and untransformed wheat. Journal of Environmental Entomology, 33(5), 1207-1216.

149. Jones J.D., Dangl J.L. (2006) The plant immune system. Nature. 444: 323-329.

150. Joo, E., Van Langenhove, H., Simpraga, M., Steppe, K., Amelynck, C., Schoon, N., Müller, J.-F. & Dewulf, J. (2010). Variation in

biogenic volatile organic compound emission pattern of Fagus sylvatica L. due to aphid infection. Atmospheric Environment, 44, 227-234.

151. Karban, R., Maron, J., Felton, G. W., Ervin, G., & Eichenseer, H. (2003). Herbivore damage to sagebrush induces resistance in wild tobacco: evidence for eavesdropping between plants. Oikos, 100(2), 325-332.

152. Karban, R., Shiojiri, K., Huntzinger, M., & McCall, A. C. (2006). Damage-induced resistance in sagebrush: volatiles are key to intra- and interplant communication. Ecology, 87(4), 922-930.

153. Karger E.M., Frolova O.Yu, Fedorova N.V., Baratova L.A., Ovchinnikova T.V., Susi P., Makinen K., Dorokhov Y.L., Atabekov J.G. (2003) Disfunctionality of TMV movement protein mutant mimicking the threonin 104 phosphorylation. Journal of General Virology. 84, 727-732.

154. Katagiri F. & Tsuda K. (2010) Understanding the plant immune system. Mol. Plant Microbe Interact. 23: 1531-1536.

155. Kay S., Hahn S., Marois E., Hause G. & Bonas U. (2007) A bacterial effector acts as a plant transcription factor and induces a cell size regulator. Science. 318: 648-651.

156. Kelloniemi J, Makinen K, Valkonen JP. (2008) Three heterologous proteins simultaneously expressed from a chimeric potyvirus: infectivity, stability and the correlation of genome and virion lengths. Virus Res. 135, 282-291.

157. Kenneth G. Karoll, Richard M. McCourt2, Matthew T. Cimino, Charles F. Delwiche. (2001) The closest living relatives of land plants. Science. 294: 2351-2353.

158. Kessler, A., & Baldwin, I. T. (2002). Plant responses to insect herbivory: The emerging molecular analysis. Annual Review of Plant Biology, 53, 299-328.

159. Kessler, A., Halitschke, R., Diezel, C., & Baldwin, I. T. (2006). Priming of plant defense responses in nature by airborne signaling between Artemisia tridentate and Nicotiana attenuata. Oecologia, 148(2), 280-292.

160. Khang C.H., Berruyer R., Giraldo M.C., Kankanala P., Park S.Y., Czymmek K., Kang S., Valent B. (2010) Translocation of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. Plant Cell. 22: 1388-1403.

161. Kim J.-G., Taylor K.W., Hotson A., Keegan M., Schmelz E.A. & Mudgett M.B. (2008) XopD SUMO protease affects host transcription, promotes pathogen growth, and delays symptom development in xanthomonas-infected tomato leaves. Plant Cell.lQ: 1915-1929.

162. Kishimoto, K., Matsui, K., Ozawa R., & Takabayashi, J. (2005). Volatile C6-aldehydes and allo-ocimene activate defense genes and induce resistance against Botrytis cinerea in Arabidopsis thaliana. Plant and Cell Physiology, 46(7), 1093-1102.

163. Kobayashi D. Y., Tamaki S. J. & Keen N. T. (1989) Cloned avirulence genes from the tomato pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato confer cultivar specificity on soybean. Proc. Natl Acad. Sei. USA. 86: 157161.

164. Koh E.J., Zhou L., Williams D.S., Park J., Ding N., Duan Y.P., Kang B.H. (2012) Callóse deposition in the phloem plasmodesmata and inhibition of phloem transport in citrus leaves infected with "Candidatus Liberibacter asiaticus". Protoplasma. 249(3): 687-697.

165. Komarova TV, Skulachev MV, Zvereva AS, Schwartz AM, Dorokhov YL, Atabekov JG. (2006) New viral vector for efficient production of target proteins in plants. Biochemistty (Mose). 71(8):846-50.

166. Körner, E., Von Dahl, C. C., Bonaventure, G., & Baldwin, I. T. (2009). Pectin methylesterase NaPMEl contributes to the emission of methanol during insect herbivory and to the elicitation of defence responses in Nicotiana attenuata. Journal of Experimental Botany, 60(9), 2631-2640.

167. Kumar S, Ochoa W, Singh P, Hsu C, Schneemann A, Manchester M, Olson M, Reddy V. (2009) Tomato bushy stunt virus (TBSV), a versatile

platform for polyvalent display of antigenic epitopes and vaccine design. Virology 388, 185-190.

168. Lacroix B., Loyter A., and Citovsky V. (2008) Association of the Agrobacterium T-DNA-protein complex with plant nucleosomes. Proc Natl AcadSci USA. 105: 15429-15434.

169. Laemmli, U.R. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.

170. Lai H, Engle M, Fuchs A, Keller T, Johnson S, Gorlatov S, Diamond MS, Chen Q (2010) Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice. Proc Natl Acad Sci USA 107: 2419-2424.

171. Lamb C. & Dixon R.A. (1997) The oxidative burst in plant disease resistance. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 251-275.

172. Laothawornkitkul, J., Taylor, J. E., Paul, N. D., & Hewitt, C. N. (2009). Biogenic volatile organic compounds in the Earth system. The New Phytologist; 183(1), 27-51.

173. Larsen J.S., Curtis W.R. (2012) RNA viral vectors for improved Agrobacterium-mediated transient expression of heterologous proteins in Nicotiana benthamiana cell suspensions and hairy roots. BMC Biotechnol. 12:21.

174. Lee J.Y., Wang X., Cui W., Sager R., Modla S., Czymmek K., Zybaliov B., van Wijk K., Zhang C., Lu H., Lakshmanan V. (2011) A plasmodesmata-Iocalized protein mediates crosstalk between cell-to-cell communication and innate immunity in Arabidopsis. Plant Cell. 23(9): 33533373.

175. Lee L.Y., Gelvin S.B. (2008) T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146: 325-332.

176. Lee M.W., Jelenska J., Greenberg J.T. (2008) Arabidopsis proteins important for modulating defense responses to Pseudomonas syringae that secrete HopWl-1. Plant J. 54: 452-465.

177. Lee, J. Y., & Lu, H. (2011). Plasmodesmata: the battleground against intruders. Trends in Plant Science, 16(4), 201-210.

178. Lee, J. Y., Yoo, B. C., Rojas, M. R., Gomez-Ospina, N., Staehelin, L. A., & Lucas, W. J. (2003). Selective trafficking of non-cell-autonomous proteins mediated by NtNCAPPl. Science, 299(5605), 392-326.

179. Leisner, S. M., & Turgeon, R. (1993). Movement of virus and photoassimilate in the phloem: a comparative analysis. BioEssays, 15(11), 741-748.

180. Levy, A., Erlanger, M., Rosenthal, M., & Epel, B. L. (2007a). A plasmodesmata-associated beta-l,3-glucanase in Arabidopsis. The Plant Journal, 49(4), 669-682.

181. Levy, A., Guenoune-Gelbart, D., & Epel, B. L. (20076). Beta-1,3-Glucanases:plasmodesmal gate keepers for intracellular communication. Plant Signaling and Behavior, 2(5), 404-407.

182. Li J., Vaidya M., White C., Vainstein A., Citovsky V., and Tzfira T. (2005) Involvement of KU80 in T-DNA integration in plant cells. Proc Natl AcadSci USA. 102: 19231-19236.

183. Li T., Huang S., Jiang W.Z., Wright D., Spalding M.H., Weeks D.P. & Yang, B. (2011) TAL nucleases (TALNs): hybrid proteins composed of TAL effectors and Fokl DNAcleavage domain. Nucleic Acids Res. 39: 359372.

184. Lico C, Chen Q, Santi L. (2008) Viral vectors for production of recombinant proteins in plants. J. Cell Physiol. 216, 366-377.

185. Lico C., Santi L., Twyman R.M., Pezzotti M., Avesani L. (2012) The use of plants for the production of therapeutic human peptides. Plant Cell Rep. 31(3): 439-451.

186. Light WH, Brickner DG, Brand VR, Brickner JH. (2010) Interaction of a DNA zip code with the nuclear pore complex promotes H2A.Z. incorporation and INOl transcriptional memory. Mol Cell. 40:112125.

187. Lindbo JA. (2007a) High-efficiency protein expression in plants from agroinfection-compatible Tobacco mosaic virus expression vectors. BMC Biotechnol. 7:52.

188. Lindbo JA. TRBO: a high-efficiency tobacco mosaic virus RNA-based overexpression vector. Plant Physiol. (20076) 145(4): 1232-40.

189. Lindeberg M., Cunnac S., Collmer A. (2012) Pseudomonas syringae type III effector repertoires: last words in endless arguments. Trends Microbiol. 20(4): 199-208.

190. Liu W, Zou P, Chen YH. (2004) Monoclonal antibodies recognizing EVETPIRN epitope of influenza A virus M2 protein could protect mice from lethal influenza A virus challenge. Immunol Lett. 93(2-3): 131-6.

191. Liu, P. P., Von Dahl, C. C., & Klessig, D. F. (2011). The extent to which methyl salicylate is required for signaling systemic acquired resistance is dependent on exposure to light after infection. Plant Physiology, 157(4), 2216-2226.

192. Lorang J. M., Shen H., Kobayashi D., Cooksey D. & Keen N. T. (1994) avrA and avrE in Pseudomonas syringae pv. tomato PT23 play a role in virulence on tomato plants. Mol. Plant Microbe Interact. 7: 208-215.

193. Lough T.J. & Lucas W.J. (2006) Integrative plant biology: role of phloem long-distance macromolecular trafficking. Annu. Rev. Plant Biol. 57: 203-232.

194. Lucas W.J. & Lee J.Y. (2004) Plasmodesmata as a supracellular control network in plants. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5: 712-726.

195. Lukyanov SA, Gurskaya NG, Lukyanov KA, Tarabykin VS and Sverdlov ED (1994) Highly efficient subtractive hybridisation of cDNA. Russian Journal ofBioorganic Chemistiy. 20 (6):701-704.

196. Ma K.-W., Flores C. & Ma W. (2011) Chromatin configuration as a battlefield in plant-bacteria interactions. Plant Physiol. 157: 535-543.

197. Magori S., and Citovsky V. (2011) Epigenetic control of Agrobacteriam T-DNA integration. Biochim Biophys Acta. 1809: 388-394.

198. Mann, R. S., Ali, J. G., Hermann, S. L., Tiwari, S., Pelz-Stelinski, K. S., Alborn, H. T., & Stelinski, L. L. (2012). Induced release of a plant-defense volatile 'deceptively' attracts insect vectors to plants infected with a bacterial pathogen. Public Library of Science Pathogens, 8(3):el002610.

199. Marcello A. (2012) RNA polymerase II transcription on the fast lane. Transcription. 3(l):29-34.

200. Marillonnet S, Giritch A, Gils M, Kandzia R, Klimyuk V, Gleba Y. (2004) In planta engineering of viral RNA replicons: efficient assembly by recombination of DNA modules delivered by Agrobacterium. Proc. Natl Acad. Sci. USA m, 6852-6857.

201. Marillonnet S, Thoeringer C, Kandzia R, Klimyuk V, Gleba Y. (2005) Systemic Agrobacterium tumefac/era-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nat. Biotechnol. 23, 718723.

202. Mauck, K. E., De Moraes, C. M., & Mescher, M. C. (2010a). Deceptive chemical signals induced by a plant virus attract insect vectors to inferior hosts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 107(8), 3600-3605.

203. Mauck, K. E., De Moraes, C. M., & Mescher, M. C. (20106). Effects of Cucumber mosaic virus infection on vector and non-vector herbivores of squash. Communicative and Integrative Biology, 3(6), 579-582.

204. Maule, A.J. (2008) Plasmodesmata: structure, function and biogenesis. Curr. Opin. Plant Biol. 11, 680-686.

205. Maxmen A. (2012) Drug-Making Plant Blooms. Nature. 485:

160.

206. McCloskey A, Taniguchi I, Shinmyozu K, Ohno M. (2012) hnRNP C tetramer measures RNA length to classify RNA polymerase II transcripts for export. Science. 335(6076): 1643-1646.

207. McCormick, C. A., Unsicker, S. B., & Gershenzon, J. (2012). The specificity of herbivore-induced plant volátiles in attracting herbivore enemies. Trends in Plant Science, 17(5), 303-310.

208. McCullen C.A., Binns A.N. (2006) Agrobacterium tumefaciens and plant cell interactions and activities required for interkingdom macromolecular transfer. Annu Rev Cell Dev Biol. 22: 101-27.

209. Mechtcheriakova IA, Eldarov MA, Nicholson L, Shanks M, Skryabin KG, Lomonossoff GP. (2006) The use of viral vectors to produce hepatitis B virus core particles in plants. J. Virol. Methods 131, 10-15.

210. Melotto M., Underwood W., Koczan J., Nomura K., He SY. (2006) Plant stomata function in innate Immunity against bacterial invasion. Cell. 126: 969-980.

211. Micheli, F. (2001). Pectin methylesterases: cell wall enzymes with important roles in plant physiology. Trends in Plant Science, 6(9), 414419.

212. Mino Y., Matsuhita Y., Sakai R. (1987) Effect of coronatine on stomatal opening in leaves of braodbean and Italian ryegrass. Ann Phytopath Soc Japan. 53: 53-55.

213. Moore MJ, Proudfoot NJ. (2009) Pre-mRNA processing reaches back to transcription and ahead to translation. Cell. 136(4):688-700.

214. Mott K.A., Takemoto J.Y. (1989) Syringomycin, a bacterial phytotoxin, closes stomata. Plant Physiol 90: 1435-1439.

215. Moya, A., Holmes, E. C., & González-Candelas, F. (2004). The population genetics and evolutionary epidemiology of RNA viruses. Nature Reviews Microbiology, 2, 279-288.

216. Murad, L. , K. Y. Kim, V. Christopodulou, R. Matyasek, C. P. Lichtenstein A. Kovarik. (2002) The origin of tobacco's T genome is traced to a particular lineage within Nicotiana tomentosiformis (Solanaceae). American Journal of Botany. 89 : 921 - 928 .

217. Murad, L., J. P. Bielawski, R. Matyasek, A. Kovarik, R. A. Nichols, A. R. Leitch and C. P. Lichtenstein. (2004) The origin and evolution of geminivirus-related DNA sequences in Nicotiana. Heredity 92: 352 - 358.

218. Negrouk V, Eisner G, Lee H, Han K, Taylor D, Wong H.C. (2005) Highly efficient transient expression of functional recombinant antibodies in lettuce. Plant Sci. 169, 433-438.

219. Nemecek-Marshall, M., MacDonald, R. C., Franzen, J. J., Wojciechowski, C. L., & Fall, R. (1995). Methanol emission from leaves. Plant Physiology, 108, 1359-1368.

220. Ng, J. C., & Falk, B. W. (2006). Virus-vector interactions mediating nonpersistent and semipersistent transmission of plant viruses. Annual Review of Phytopathology, 44, 183-212.

221. Ngumbi, E., Eigenbrode, S. D., Bosque-Pérez, N. A., Ding, H., & Rodriguez, A. (2007). Myzus persicae is arrested more by blends than by individual compounds elevated in headspace of PLRV-infected potato. Journal of Chemical Ecology, 33(9), 1733-1747.

222. Nishimura M.T., Dangl J.L. (2010) Arabidopsis and the plant immune system. Plant J. 61: 1053-1066.

223. Nissan G., Manulis-Sasson S., Chalupowicz L., Teper D., Yeheskel A., Pasmanik-Chor M., Sessa G., Barash I. (2012) The type III effector HsvG of the gall-forming Pantoea Agglomerans mediates expression of the host gene HSVGT. Mol PlantMicrobe Interact. 25: 231-240.

224. Nomura K., Melotto M. & He S. Y. (2005) Suppression of host defense in compatible p\ant-Pseudomonas syringae interactions. Curr. Opin. Plant Biol. 8: 361-368.

225. Nonomura, A., & Benson, A. (1992). The path of carbon in photosynthesis: improved crop yields with methanol. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 89(20), 97949798.

226. Oh H.S., Park D.H., Collmer A. (2010) Components of the Pseudomonas syringae type III secretion system can suppress and may elicit plant innate immunity. Mol. Plant Microbe Interact. 23: 727-739.

227. Opalka, N., Brugidou, C., Bonneau, C., Nicole, M., Beachy, R. N, Yeager, M., & Fauquet, C. (1998). Movement of Rice yellow mottle virus between xylem cells through pit membranes. Proc Natl Acad Sci USA, 95(6), 3323-3328.

228. Otsus, M., Uffert, G., Sômera, M., Paves, H., Olspert, A., Islamov, B., & Truve, E. (2012). Cocksfoot mottle sobemovirus establishes infection through the phloem. Virus Research, 166(1-2), 125-129.

229. Pareja, M., Moraes, M. C., Clark, S. J., Birkett, M. A., & Powell, W. (2007). Response of the aphid parasitoid Aphidius funebris to volatiles from undamaged and aphid-infested Centaurea nigra. Journal of Chemical Ecology, 33(4), 695-710.

230. Park, S. W., Kaimoyo, E., Kumar, D., Mosher, S., & Klessig, D. F. (2007). Methyl salicylate is a critical mobile signal for plant systemic acquired resistance. Science, 318(5847), 113-116.

23 F Park, S. W., Liu, P. P., Forouhar, F., Vlot, A. C., Tong, L., Tietjen, K., & Klessig, D. F. (2009). Use of a synthetic salicylic acid analog to investigate the roles of methyl salicylate and its esterases in plant disease resistance. The Journal of Biological Chemistiy, 284(11), 7307-7317.

232. Paschold, A., Halitschke, R., & Baldwin, I. T. (2006). Using 'mute' plants to translate volatile signals. The Plant Journal, 45(2), 275-291.

233. Pelloux, J., Rusterucci, C., & Mellerowicz, E. J. (2007). New insights into pectin methylesterase structure and function. Trends in Plant Science, 12(6), 267-277.

234. Pichersky, E., & Gershenzon, J. (2002). The formation and function of plant volatiles: perfumes for pollinator attraction and defense. Current Opinion in Plant Biology, 5(3), 237-243.

235. Pichersky, E., Noel, J. P., & Dudareva, N. (2006). Biosynthesis of plant volátiles: nature's diversity and ingenuity. Science, 311(5762), 808-811.

236. Piesik, D., Pañka, D., Delaney, K. J., Skoczek, A., Lamparski, R., & Weaver, D. K. (2011). Cereal crop volatile organic compound induction after mechanical injury, beetle herbivory (Oulema spp.), or fungal infection (Fusarium spp.). Journal of Plant Physiology, 168(9), 878-886.

237. Pieterse, C.M.J, Leon-Reyes, A, Van der Ent, S, and Van Wees, S.C.M 2009, Networking by small molecule hormones in plant immunity. Nature Chemical Biology, 5(5), 308-316.

238. Pitzschke A., Hirt H. (2010) New insights into an old story: Agrobacterium-induced tumour formation in plants by plant transformation. EMBOJ. 29(6): 1021-1032.

239. Pizarro-Cerda J. & Cossart P. (2006) Bacterial Adhesion and Entry into Host Cells. Cell. 124: 715-727.

240. Qi Y., Tsuda K., Glazebrook J., Katagiri F. (2011) Physical association of pattern-triggered immunity (PTI) and effector-triggered immunity (ETI) immune receptors in Arabidopsis. Mol. Plant Pathol. 12: 702-708.

241. Radford J. E., Vesk M., Overall R. L. (1998) Callóse deposition at plasmodesmata. Protoplasma. 201: 30-37.

242. Razavi, A., Karagulian, F., Clarisse, L., Hurtmans, D., Coheur, P.F., Clerbaux, C., Muller, J. F., & Stavrakou, T. (2011). Global distributions of methanol and formic acid retrieved for the first time from the IASI/MetOp thermal infrared sounder. Atmos. Chem. Phys., 11, 857-872.

243. Rebrikov DV, Britanova OV, Gurskaya NG, Lukyanov KA, Tarabykin VS and Lukyanov SA (2000) Mirror orientation selection (MOS) -a method for eliminating false positive clones from libraries generated by suppression subtractive hybridization. Nucl Acid Res 28 (20): e90.

244. Régo A.T., Chandran V., Waksman G. (2010) Two-step and one-step secretion mechanisms in Gram-negative bacteria: contrasting the type IV

secretion system and the chaperone-usher pathway of pilus biogenesis. Biochem J. 425(3): 475-488.

245. Rigano L.A., Siciliano F., Enrique R., Sendin L., Filippone P., Torres P.S., Qüesta J., Dow J.M., Castagnaro A.P., Vojnov A.A., Marano M.R. (2007) Biofilm formation, epiphytic fitness and canker development in Xanthomonas axonopodis pv. citri. Mol Plant Microbe Interact. 20: 12221230.

246. Rinne P.L.H. & van der Schoot C. (2003) Plasmodesmata at the crossroads between development, dormancy, and defense. Can. J. Bot. 81: 1182-1197.

247. Rivas S. (2012) Nuclear dynamics during plant innate immunity. Plant Physiol 158: 87-94.

248. Robards A.W. & Lucas W.J. (1990) Plasmodesmata. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 41: 369-419.

249. Roberts A.G. & Oparka K.J. (2003) Plasmodesmata and the control of symplastic transport. Plant Cell Environ. 26: 103-124.

250. Rohmer L., Guttman D. S. & Dangl J. L. (2004) Diverse evolutionary mechanisms shape the type III effector virulence factor repertoire in the plant pathogen Pseudomonas syringae. Genetics. 167: 1341-1360.

251. Römer P., Hahn S., Jordan T., Strauss T., Bonas U. & Lahaye T. (2007) Plant pathogen recognition mediated by promoter activation of the pepper Bs3 resistance gene. Science. 318: 645-648.

252. Rybicki E.P., Chikwamba R., Koch M., Rhodes J.I., Groenewald J.H. (2012) Plant-made therapeutics: an emerging platform in South Africa. Biotechnol Adv. 30(2): 449-459.

253. Ryu, C. M., Farag, M. A., Hu, C. H., Reddy, M. S., Kloepper, J. W., & Pare, P. W. (2004). Bacterial volatiles induce systemic resistance in Arabidopsis. Plant Physiol, 134(3), 1017-1026.

254. Sainsbury F, Liu L, Lomonossoff GP. (2009) Cowpea mosaic virus-based systems for the expression of antigens and antibodies in plants. Methods Mol. Biol 483, 25-39.

255. Sainsbury F., Lomonossoff G.P. (2008) Extremely high-level and rapid transient protein production in plants without the use of viral replication. Plant Physiol. 148: 1212-1218.

256. Santa Cruz S, Chapman S, Roberts AG, Roberts IM, Prior DA, Oparka KJ. (1996) Assembly and movement of a plant virus carrying a green fluorescent protein overcoat. Proc. Natl Acad. Sci. USA 93, 6286-6290.

257. Schellenberg B., Ramel C., Dudler R. (2010) Pseudomonas syringae virulence factor syringolin A counteracts stomatal immunity by proteasome inhibition. Mol Plant Microbe Interact. 23(10): 1287-1293.

258. Schulze-Lefert P., Robatzek S. (2006) Plant Pathogenes Trick Guard Cells into Opening the Gates. Cell. 126: 831-834.

259. Seco, R., Penuelas, J., & Filella, I. (2007). Short-chain oxygenated VOCs: Emission and uptake by plants and atmospheric sources, sinks, and concentrations. Atmospheric Environment, 41(12), 2477-2499.

260. Segonzac C. & Zipfel C. (2011) Activation of plant pattern recognition receptors by bacteria. Curr. Opin. Microbiol. 14: 54-61.

261. Sels J, Mathys J, De Coninck BM, Cammue BP, De Bolle MF (2008) Plant pathogenesis-related (PR) proteins: a focus on PR peptides. Plant Physiol Biochem 46:941-950

262. Shadwick F.S., Doran P.M. (2007) Infection, propagation, distribution and stability of plant virus in hairy root cultures. J. Biotechnol. 131:318-329.

263. Shadwick F.S., Doran P.M. (2007) Propagation of plant viruses in hairy root cultures: a potential method for in vitro production of epitope vaccines and foreign proteins. Biotechnol. Bioeng. 96: 570-583.

264. Shan L., Oh H.S., Chen J., Guo M., Zhou J., Alfano J.R, Collmer A., Jia X., Tang X. (2004) The HopPtoF locus of Pseudomonas syringae pv.

tomato DC3000 encodes a type III chaperone and a cognate effector. Mol Plant Microbe Interact. 17(5): 447-455.

265. Shaw P, Brown J. (2012) Nucleoli: composition, function, and dynamics. Plant Physiol. 158(1):44-51.

266. Shulaev, V., Silverman, P., & Raskin, I. (1997). Airborne signalling by methyl salicylate in plant pathogen resistance. Nature, 385, 718721.

267. Siebrasse JP, Kaminski T, Kubitscheck U. (2012) Nuclear export of single native mRNA molecules observed by light sheet fluorescence microscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 109(24):9426-31.

268. Staudt, M., Jackson, B., El-Aouni, H., Buatois, B., Lacroze, J. P., Poëssel, J. L., & Sauge, M. H. (2010). Volatile organic compound emissions induced by the aphid Myzus persicae differ among resistant and susceptible peach cultivars and a wild relative. Tree Physiology, 30(10), 1320-1334.

269. Strange, R. N., & Scott, P. R. (2005). Plant disease: a threat to global food security. Annual Review of Phytopathology, 43, 83-116.

270. Streatfield S.J. (2007) Approaches to achieve high-level heterologous protein production in plants. Plant Biotechnol J. 5: 2-15.

271. Sudarshana MR, Plesha MA, Uratsu SL, Falk BW, Dandekar AM, Huang TK, McDonald KA. (2006) A chemically inducible cucumber mosaic virus amplicon system for expression of heterologous proteins in plant tissues. Plant Biotechnol. J. 4, 551-559.

272. Sulzinski, M. A., & Zaitlin, M. (1982). Tobacco mosaic virus replication in resistant and susceptible plants: in some resistant species virus is confined to a small number of initially infected cells. Virology, 121(1), 12-19.

273. Sun G. (2012) MicroRNAs and their diverse functions in plants. Plant Mol Biol. 80:17-36.

274. Takken F. L., Albrecht M. & Tameling W. I. (2006) Resistance proteins: molecular switches of plant defence. Curr. Opin. Plant Biol. 9: 383— 390.

275. Talianova M, Janousek B. (2011) What can we learn from tobacco and other Solanaceae about horizontal DNA transfer? Am J Bot. 98(8): 1231-42.

276. Taliansky ME, Brown JW, Rajamäki ML, Valkonen JP, Kalinina NO. (2010) Involvement of the plant nucleolus in virus and viroid infections: parallels with animal pathosystems. Adv Virus Res. 77:119-58.

277. Tameling W.I.L., Takken F.L.W. (2008) Resistance proteins: scouts of the plant innate immune system. Eur J Plant Pathol. 121: 243-255.

278. Tasset C., Bernoux M., Jauneau A., Pouzet C., Briere C., Kieffer-Jacquinod S., Rivas S., Marco Y., Deslandes L. (2010) Autoacetylation of the Ralstonia solanacearum effector PopP2 targets a lysine residue essential for RRS1 -R-mediated immunity in Arabidopsis. PLoSPathog. 6: el001202.

279. Tena G., Boudsocq M., Sheen J. (2011) Protein kinase signaling networks in plant innate immunity. Carr. Opin. Plant. Biol. 14: 519-529.

280. Terakura S., Ueno Y., Tagami PI., Kitakura S., Machida C., Wabiko I-I., Aiba H., Otten L., Tsukagoshi H., Nakamura K., Machida Y. (2007) An oncoprotein from the plant pathogen agrobacterium has histone chaperone-like activity. Plant Cell. 19: 2855-2865.

281. Tesson L., Usal C., Menoret S., Leung E., Niles B.J., Remy S., Santiago Y., Vincent A.I., Meng X., Zhang L., Gregory P.D., Anegon I., Cost G.J. (2011) Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs. Nat Biotechnol. 29: 695-696.

282. Thomas C.L., Bayer E.M., Ritzenthaler C., Fernandez-Calvino L., Maule A.J. (2008) Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLoS Biol. 6: 180-190.

283. Thomma B.P., Nürnberger T., Joosten M.H. (2011) Of PAMPs and effectors: the blurred PTIETI dichotomy. Plant Cell. 23: 4-15.

284. Thorpe, M. R., Ferried, A. P., Herth, M. M., & Ferrieri, R. A. (2007). llC-imaging: methyl jasmonate moves in both phloem and xylem,

promotes transport of jasmonate, and of photoassimilate even after proton transport is decoupled. Planta, 226(2), 541-551.

285. Tian, D., Traw, M. B., Chen, J. Q., Kreitman, M. & Bergelson, J. (2003) Fitness costs of R-gene-mediated resistance in Arabidopsis thaliana. Nature. 423: 74-77.

286. Tinland B., Schoumacher F., Gloeckler V., Bravo-Angel A.M., Hohn B. (1995) The Agrobacterium tumefaciens virulence D2 protein is responsible for precise integration of T-DNA into the plant genome. EMBO J. 14: 3585-3595.

287. Torres M.A. (2010) ROS in biotic interactions. Physiol Plant. 138: 414-429.

288. Trempe GL. (1976) Human breast cancer in culture. Resent Results Cancer Res. 57: 33-41

289. Turgeon R. & Wolf S. (2009) Phloem transport: cellular pathways and molecular trafficking. Annu. Rev. Plant Biol. 60: 207-221.

290. Turgeon, R. (1989). The sink-source transition in leaves. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 40, 119-138.

291. Turra, D., & Lorito, M. (2011). Potato type I and II proteinase inhibitors: modulating plant physiology and host resistance. Current Protein and Peptide Science, 12(5), 374-385.

292. Tzfira T., Vaidya M., and Citovsky V. (2004) Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium. Nature. 431: 87-92.

293. Uhde K, Fischer R, Commandeur U. (2005) Expression of multiple foreign epitopes presented as synthetic antigens on the surface of potato virus X particles. Arch. Virol 150, 327-340

294. Underwood W., Melotto M., He S.Y. (2007) Role of plant stomata in bacterial invasion. Cell Microbiol. 9(7): 1621-1629.

295. Van Lent, J., Storms, M., Van Der Meer, F., Wellink, J., & Goldbach, R. (1991). Tubular structures involved in movement of cowpea

mosaic virus are also formed in infected cowpea protoplasts. The Journal of General Virology, 72, 2615-2623.

296. Varrelmann M, Maiss E. (2000) Mutations in the coat protein gene of plum pox virus suppress particle assembly, heterologous encapsidation and complementation in transgenic plants of Nicotiana benthamiana. J. Gen. Virol. 81, 567-576.

297. Verchot-Lubicz J, Ye CM, Bamunusinghe D. (2007) Molecular biology of potexviruses: recent advances. J. Gen. Virol. 88, 1643-1655.

298. Verchot-Lubicz J. (2005) A new cell-to-cell transport model for Potexviruses. Mol. Plant Microbe Interact. 18, 283-290.

299. Vezina L.P., Faye L., Lerouge P., D'Aoust M.A., Marquet-Blouin E., Burel C., Lavoie P.O., Bardor M., Gomord V. (2009) Transient co-expression for fast and high-yield production of antibodies with human-like N-glycans in plants. Plant Biotechnol J. 7: 442-455.

300. Vickers, C. E., Possell, M. P., Cojocariu, C., Velikova, V., Laothawornkitkul, J., Ryan, A., Mullineaux, P. M., & Hewitt, C. N. (2009). Isoprene synthesis protects transgenic plants from oxidative stress. Plant, Cell and Environment, 32(5), 520-531.

301. Vlot A.C., Dempsey D.A., Klessig D.F. (2009) Salicylic acid, a multifaceted hormone to combat disease. Annu. Rev.Phytopathol. 47: 177— 206.

302. Vlot, A. C., Klessig, D. F., & Park, S. W. (2008). Systemic acquired resistance: the elusive signal's. Current Opinion in Plant Biology, 11(4), 436-442.

303. Voinnet O. & Baulcombe D.C. (1997) Systemic signaling in gene silencing. Nature. 389:553.

304. Voinnet, O., Pinto, Y. M., & Baulcombe, D. C. (1999). Suppression of gene silencing: A general strategy used by diverse DNA and RNA viruses of plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:14147-14152.

305. Vojnov A.A., Slater H., Newman M.A., Daniels M.J., Dow J.M. (2001) Regulation of the synthesis of cyclic glucan in Xanthomonas campestris by a diffusible signal molecule. Arch Microbiol 176: 415-420.

306. Volpi, C., Janni, M., Lionetti, V., Bellincampi, D., Favaron, F., & D'Ovidio, R. (2011). The ectopic expression of a pectin methyl esterase inhibitor increases pectin methyl esterification and limits fungal diseases in wheat. Mol Plant Microbe Interact, 24(9), 1012-1019.

307. Von Dahl, C. C., Hävecker, M., Schlögl, R., & Baldwin, I. T. (2006). Caterpillar-elicited methanol emission: a new signal in plant-herbivore interactions? The Plant Journal, 46(6), 948-960.

308. Vuorinen, A. L., Kelloniemi, J., & Valkonen, J. P. (2011). Why do viruses need phloem for systemic invasion of plants? Plant Sei, 181(4), 355-363.

309. Waigmann E, Chen MH, Bachmaier R, Ghoshroy S, Citovsky V. (2000) Regulation of plasmodesmal transport by phosphorylation of tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein. EMBO J. 19( 18):4875-4884.

310. Wang M., Soyano T., Machida S., Yang J.Y., Jung C., Chua N.H. & Yuan Y.A. (2011) Molecular insights into plant cell proliferation disturbance by Agrobacterium protein 6b. Genes Dev. 25: 64-76.

311. Warneke, C., Luxembourg, S. L., De Gouw, J. A., Rinne, H. J. I., Guenther, A. B., & Fall R. (2002). Disjunct eddy covariance measurements of oxygenated volatile organic compounds fluxes from an alfalfa field before and after cutting. Journal of geophysical research, 107(D8), 1-10.

312. Wehling M.D., Guo M., Fu Z.Q., Alfano J.R. (2004) The Pseudomonas syringae HopPtoV protein is secreted in culture and translocated into plant cells via the type III protein secretion system in a manner dependent on the ShcV type III chaperone. JBacteriol. 186(11): 3621-3630.

313. Weinthal D.M., Barash I., Tzfira T„ Gaba V., Teper D., Sessa G. & Manulis-Sasson S. (2011) Characterization of nuclear localization signals in

the type III effectors HsvG and HsvB of the gall-forming bacterium Pantoea agglomerans. Microbiology. 157: 1500-1508.

314. Wenke, K., Kai, M., & Piechulla, B. (2010). Belowground volatiles facilitate interactions between plant roots and soil organisms. Planta, 231(3), 499-506.

315. Williams, L. B., Holloway, J. R., Canfield, B., Glein, C. R., Dick, J. M., Hartnett, H. H., & Shock, E. L. (2011). Birth of Biomolecules from the Warm Wet Sheets of Clays Near Spreading Centers. Earliest Life on Earth, Habitats, Environmrnts and Methods of Detection, Part 1, 79-112.

316. Wilmer C., Fricker M. (1996) Stomata, Ed 2. London: Chapman and Hall. 135.

317. Wilson, T. M. (1984). Cotranslational disassembly of tobacco mosaic virus in vitro. Virology, 137(2), 255-265.

318. Wu, J., Hettenhausen, C., Schuman, M. C., & Baldwin, I. T. (2008). A comparison of two Nicotiana attenuate accessions reveals large differences in signaling induced by oral secretions of the specialist herbivore Manduca sexta. Plant Physiology, 146(3), 927-939.

319. Xu, X. M., & Jackson, D. (2010). Lights at the end of the tunnel: new views of plasmodesmal structure and function. Cur Opin Plant Biol, 13(6), 684-692.

320. Yan, Z. G, & Wang, C. Z. (2006). Wound-induced green leaf volatiles cause the release of acetylated derivatives and a terpenoid in maize. Phytochemistry, 67(1), 34-42.

321. Yang L., Wang H., Liu J., Li L., Fan Y., Wang X., Song Y., Sun S., Wang L., Zhu X., Wang X. (2008) A simple and effective system for foreign gene expression in plants via root absorption of agrobacterial suspension. J. Biotechnology 134: 320-324.

322. Yao Y, Sun Q. (2012) Exploration of small non coding RNAs in wheat (Triticum aestivum L.). Plant MolBiol. 80(l):67-73.

323. Yao, Y., Danna, C. H.; Zemp, F. J., Titov, V., Ciftci, O. N., Przybylski, R., Ausubel, F. M., & Kovalchuk, I. (2011). UV-C-irradiated Arabidopsis and tobacco emit volatiles that trigger genomic instability in neighboring plants. The Plant Cell, 23(10), 3842-3852.

324. Yi, H.-S., Heil, M., Adame-Alvarez , R. M., Ballhorn, D. J., & Ryu, C.-M. (2009). Airborne induction and priming of plant defenses against a bacterial pathogen. Plant Physiol, 151(4), 2152-2161.

325. Yu, F., & Utsumi, R. (2009). Diversity, regulation and genetic manipulation of plant mono- and sesquiterpenoid biosynthesis. Cell Мої Life Sci, 66(18), 3043-3052.

326. Yusibov V., Streatfield S.J., Kushnir N. (2011) Clinical development of plant-produced recombinant pharmaceuticals: vaccines, antibodies and beyond. Hum Vaccin. 7(3): 313-321.

327. Zaltsman A., Krichevsky A., Loyter A. & Citovsky V. (2010) Agrobacterium induces expression of a host F-box protein required for tumorigenicity. Cell Host Microbe. 7: 197-209.

328. Zavaliev R., Ueki S., Epel B.L., Citovsky V. (2011) Biology of callose (P-l,3-glucan) turnover at plasmodesmata. Protoplasma. 248: 117130.

329. Zeng W., Melotto M., He S.Y. (2010) Plant stomata: a checkpoint of host immunity and pathogen virulence. Curr Opin Biotechnol. 21(5): 599603.

330. Zhao Y., Thilmony R., Bender C.L., Schaller A., He S.Y., Howe G.A. (2003) Virulence systems of Pseudomonas syringae pv. tomato promote bacterial speck disease in tomato by targeting the jasmonate signaling pathway. Plant J. 36: 485-499.

331. Zhu Y., Nam J., Humara J.M., Mysore K.S., Lee L.Y., Cao H., Valentine L., Li J., Kaiser A.D., Kopecky A.L., Hwang H.H., Bhattacharjee S., Rao P.K., Tzfira T., Rajagopal J., Yi H., Veena, Yadav B.S., Crane Y.M., Lin K., Larcher Y., Gelvin M.J., Knue M., Ramos C., Zhao X., Davis S.J.,

Kim S.I., Ranjith-Kumar C.T., Choi Y.J., Hallan V.K., Chattopadhyay S., Sui X., Ziemienowicz A., Matthysse A.G., Citovsky V., Hohn В., Gelvin S.B. (2003) Identification of Arabidopsis rat mutants. Plant Physiol. 132: 494-505.

332. Zhu Y.Y., Machleder E.M., Chenchik A., Li R., Siebert P.D. (2001) Reverse transcriptase template switching, a SMART approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques 30, 892-897.

333. Ziebell, H., Murphy, A. M., Groen, S. C., Tungadi, Т., Westwood, J. H., Lewsey, M. G., Moulin, M., Kleczkowski, A., Smith, A. G., Stevens, M., Powell G., & Carr, J. P. (2011). Cucumber mosaic virus and its 2b RNA silencing suppressor modify plant-aphid interactions in tobacco. Sci Rep, 1, 187.

334. Zipfel C. & Felix G. (2005) Plants and animals: a different taste for microbes? Curr. Opin.Plant Biol. 8: 353-360.

335. Zipfel C. & Felix G. (2005) Plants and animals: a different taste for microbes. Curr. Opin. Plant Biol. 8: 353-360.

336. Zipfel C., Robatzek S., Navarro L., Oakeley E.J., Jones J.D., Felix G., Boiler T. (2004) Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428: 764-767.

337. Zupan J.,Muth T.R.,Draper O., Zambiyski P. (2000) The transfer of DNA from Agrobacterium tumefaciens into plants: A feast of fundamental insights. Plant J. 23:11-28.

338. Гасанова T.B., Скурат E.B., Фролова О.Ю., Семашко М.А., Дорохов Ю.Л. Пектинметилэстераза как фактор стабильности транскриптома. (2008) Молекулярная биология. 42, №3, 478-486

339. Дорохов Ю.Л. Умолкание генов растений. (2007) Молекулярная биология. 41, 579-592

340. Маниатис, Т., Фрич, Э., Сэмбрук, Дж. (1984). Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование. Москва. "Мир".

341. Трещалина Е.М., Жукова О.С., Герасимова Г.К., Андронова Н.В., Гарин A.M. (2005) Методические указания по изучению

противоопухолевой активности фармакологических веществ. В книге: Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под ред. Р.У.Хабриева.-2 изд., перераб. и доп.-М.:ОАО изд. «Медицина», 637-651.

342. Ханаан, Д. (1988) Методы трансформации Е. coli. В книге: Клонирование ДНК: Методы, под редакцией Д.Гловера. Москва, "Мир".