Контроль трансляции РНК нуклеопротеидных комплексов, участвующих в межклеточной транслокации вирусного генома тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Козловский, Станислав Владимирович

• Козловский, Станислав Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Козловский, Станислав Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Дальний транспорт вирусов

Межклеточный транспорт вирусов

МЕЖКЛЕТОЧНЫЙ ТРАНСПОРТ ВТМ

Транспортный белок ВТМ: общие 21 представления

Внутриклеточная локализация ТБ ВТМ

Транспортный белок ВТМ модифицирует 23 плазмодесмы инфицированных клеток

Взаимодействие ТБ ВТМ с нуклеиновыми 26 кислотами

Фосфорилирование ТБ ВТМ

Взаимодействие ТБ с цитоскелетом; гипотеза 32 внутриклеточного транспорта.

Функциональные домены ТБ ВТМ

МЕЖКЛЕТОЧНЫЙ ТРАНСПОРТ ТГБ - 35 СОДЕРЖАЩИХ ВИРУСОВ

Тройной блок генов

Внутриклеточная локализация белков, 37 кодируемых первой ОРТ ТГБ

Взаимодействие белков, кодируемых первой ОРТ 39 ТГБ, с плазмодесмами

Связывание и гидролиз НТФ белками продуктами первой ОРТ ТГБ (ТБ1)

РНК-связывающая активность белков продуктов первой ОРТ ТГБ (ТБ 1)

Сравнение белков, кодируемых первой ОРТ ТГБ 43 у различных групп вирусов; функциональные домены ТБ1 -белков

Белки, кодируемые второй и третьей ОРТ ТГБ

Роль белка оболочки в межклеточном транспорте 47 ТГБ-содержащих вирусов; транспортная форма потексвирусов

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение плазмидной ДНК

Рестрикция ДНК

Транскрипция in vitro

Выделение препарата Х-вируса картофеля

Экспрессия рекомбинантных белков

Хроматографическая очистка (Тис V- 55 рекомбинантных белков на Ni2+-нитрилотриацетатной агарозе

Выделение препаратов различных фракций из 56 гомогената листьев N.tabacum и N. glutinosa

1. Получение препарата фракции клеточных стенок

2. Получение препарата растворимой 56 (цитоплазматической) фракции

Фосфорилирование in vitro

Электрофорез РНК в агарозном геле

Электрофорез РНК в ПААГ

Трансляция в бесклеточной белоксинтезирующей 59 системе

Трансляция in vitro в лизате ретикулоцитов 59 кролика

Трансляция in vitro в экстракте зародышей 59 пшеницы

Электрофоретический анализ белков в 60 денатурирующем полиакриламидном геле

Получение РНП-комплексов

Анализ РНП на нитроцеллюлозных фильтрах

Обработка РНКазами РНП-комплексов

Выделение и заражение протопластов

Определение вируса в протопластах методом 63 иммуноферментного анализа.

Заражение растений вирусными РНК и РНП- 64 комплексами.

Иммунопреципитация

Иммуноэлектронная микроскопия комплексов

ХВК-ТБ1 ХВК

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Фосфорилирование ТБ ВТМ переводит комплекс РНК ВТМ-ТБ ВТМ в транслируемую форму

2. Транспортный белок ТБ1 Х-вируса картофеля 75 активирует трансляцию РНК ХВК в составе вирусных частиц in vitro

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Контроль трансляции РНК нуклеопротеидных комплексов, участвующих в межклеточной транслокации вирусного генома»

Одной из интересных проблем современной вирусологии растений является механизм межклеточного транспорта вирусной инфекции. В момент заражения растения вирусом только небольшое число клеток оказывается инфицированным. Для развития инфекции необходимо, чтобы вирус перемещался от пораженных клеток к здоровым. Межклеточный (ближний) транспорт вирусной инфекции в растениях осуществляется преимущественно через плазмодесмы (ПД), а перенос вирусного инфекционного материала на большие расстояния (т. н. дальний транспорт) происходит по клеткам флоэмы.

Долгое время считалось, что межклеточный транспорт вирусов - это генетически пассивный процесс, теперь совершенно очевидно, что он обусловлен транспортной функцией вирусного генома и осуществляется при помощи одного или нескольких вирусспецифических транспортных белков (ТБ). Именно транспортные белки играют ключевую роль в переносе вирусного генома внутри инфицированной клетки к плазмодесмам, далее в распространении вирусной инфекции через ПД по клеткам паренхимы и, в случае некоторых вирусов, в транспорте вирусного генома по сосудам флоэмы (Саггш^оп е1. а1., 1996). Таким образом, функционирование транспортных белков является необходимым условием развития инфекционного процесса. Очевидно, что прогресс в исследовании вирусных ТБ, их взаимодействий с вирусными нуклеиновыми кислотами и различными вирусными и клеточными белками открывает широкие перспективы для создания новых методов борьбы с вирусными инфекциями растений.

Одним из объектов настоящей работы является ТБ вируса табачной мозаики (ВТМ) массой 30 кДа. Предполагается, что межклеточный транспорт ВТМ через плазмодесмы происходит в форме рибонуклеопротеидных комплексов (РНП), в состав которых входят РНК ВТМ и ТБ ВТМ (Citovsky & Zambryski, 1991).

В нашей лаборатории было показано, что комплекс РНК ВТМ-ТБ ВТМ является нетранслируем ым in vitro и неинфекционным в изолированных протопластах, будучи, однако, инфекционным по отношению к целому растению (in planta) (Karpova et. al., 1997). Это позволяет предположить, что именно в процессе транслокации через плазмодесмы (в изолированных протопластах этот этап отсутствует) происходит конверсия РНП-комплексов из нетранслируемой формы в транслируемую. Было высказано предположение (Karpova et. al., 1997), что переход РНП-комплексов в транслируемое состояние может быть связан с фосфорилированием транспортного белка.

В отличие от ВТМ, межклеточный транспорт Х-вируса картофеля осуществляется тремя неструктурными белками, кодируемыми тройным блоком частично перекрывающихся генов (ТБГ) (Morozov et al., 1989). Кроме того, межклеточный транспорт ХВК и других потексвирусов зависит от белка оболочки, т. е. в реализации транспортной функции ХВК участвуют четыре вирусспецифических белка.

Геномная РНК потексвирусов транспортируется через плазмодесмы в виде вирионов (Santa Cruz et. al., 1998) или рибонуклеопротеидов, содержащих как белок оболочки, так и ТБ1 белок, кодируемый первым геном ТБГ (Lough et. al., 1998, 2000). Можно предположить, что РНК ХВК в составе вирусных частиц (подобно РНК ВТМ в комплексе с ТБ ВТМ) нетранслируема in vitro.

В то же время очевидно, что транспортная форма ХВК должна быть доступна для рибосом в процессе развития вирусной инфекции. Однако до настоящего времени отсутствовала информация о возможных механизмах перехода нетранслируемой инкапсидированной РНК ХВК в транслируемую форму.

Целью настоящей работы являлось изучение механизмов конверсии вирусных РНК в составе а) нетранслируемых вирионов ХВК б) нетранслируемых комплексов РНК ВТМ с ТБ ВТМ в транслируемую форму.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Клетки высших растений дифференцированы и организованы в ткани: меристематическую, покровную (эпидерма), основную (паренхима) и проводящую (Эзау, 1980). Межклеточные взаимодействия и транспорт различных веществ осуществляется при помощи плазмодесм, цитоплазматических мостиков, которые пронизывают клеточные стенки, соединяя клетки в единую трехмерную сеть (Lucas et al., 1993).

В момент заражения растения вирусом только небольшое число клеток оказывается инфицированным. Для развития системной инфекции необходимо, чтобы вирус перемещался от пораженных клеток к здоровым. Процесс передачи вирусной инфекции из клетки в клетку носит название вирусного транспорта. Стратегия транспорта, используемая большинством вирусов растений, в корне отличается от таковой у вирусов животных. Существующие различия связаны с особенностями в строении животной и растительной клеток; у первой отсутствует жесткая клеточная стенка, что делает возможным выход целых вирионов путём отпочковывания либо в результате лизиса клетки. В растениях вирусный транспорт осуществляется преимущественно через плазмодесмы. Медленное распространение вируса по клеткам паренхимы носит название ближнего транспорта; быстрое перемещение по проводящим тканям, в основном по флоэме, -дальний транспорт. Весь процесс распространения системной инфекции протекает в четыре этапа:

1) Путем ближнего транспорта вирус распространяется в паренхиме и эпидерме зараженного листа;

2) Выход вируса в проводящие ткани - переключение с ближнего на дальний транспорт;

3) Дальний транспорт по тканям проводящих путей;

4) Проникновение из проводящей системы в клетки паренхимы вторично инфицируемых листьев и его распространение там (А1аЬекоу & ТаНашку, 1990).

Долгое время считалось, что вирусный транспорт - это генетически пассивный процесс, теперь совершенно очевидно, что он обусловлен транспортной функцией вирусного генома и осуществляется при помощи одного или нескольких вирусспецифических транспортных белков (ТБ). Транспортная функция того или иного вируса может быть выражена только в определенных видах растений (Тальянский, 1984). Иногда системное распространение данного вируса не может быть осуществлено даже в таких растениях, клетки которых потенциально восприимчивы к нему. В зтой ситуации репликация вируса ограничена первично инфицированными клетками вследствие блокады вирусной транспортной системы. Растение в таком случае можно рассматривать как устойчивое к данному вирусу. Успех или неуспех вирусной инфекции зависит от многих факторов: как вирусных, так и хозяйских, которые, в основном, неизвестны. Часто развитие всей вирусной инфекции строится на переключении между клеточными и вирусными функциями. Вирусные транспортные системы также зависят от взаимодействия вирусных и хозяйских факторов.

ДАЛЬНИЙ ТРАНСПОРТ ВИРУСОВ.

Дальний транспорт по проводящим тканям растения изучен намного хуже, чем ближний. Многие вирусы, в том числе и ВТМ, передвигаются по флоэме. В случае тобамо- (Бако й а!., 1990), потисм. Schaad et al., 1996) и потексвирусов (Santa Cruz et al., 1998) наличие белка оболочки (БО) является необходимым условием для дальнего транспорта; мутанты с нарушениями в гене БО не способны инфицировать части растения, удалённые от точки первичного заражения. По-видимому, ВТМ перемещается по флоэме в виде вирионов, так как мутации в участке инициации реконструкции ВТМ также подавляют дальний транспорт вируса. Но нельзя исключить и вероятность того, что вирус может транспортироваться по флоэме в виде неких других РНП-комплексов, для образования которых необходимы участок инициации реконструкции и белок оболочки (Saito et al., 1990). Интересно, что в случае потивируса гравировки табака (ВГТ) N- и С-концевые области БО, экспонированные на поверхности вириона ВГТ, не участвуют в межклеточном транспорте ВГТ, но являются необходимыми для дальнего транспорта вируса (Dolja et al., 1995). В любом случае, белковый компонент РНП играет здесь двойную роль: он обеспечивает специфическое взаимодействие с хозяйскими факторами и защищает РНК от нуклеаз.

Для транспорта по флоэме вирусу необходимо проникнуть из клеток мезофилла листа в клетки проводящих путей, пронизывающих весь лист. Сосудистые пучки, окруженные клетками обкладки, состоят из нескольких элементов: паренхимальных элементов ксилемы, сосудистой паренхимы флоэмы, клеток - спутниц и ситовидных клеток. В работе Ding et. al. (1995) было показано, что в случае проводящих пучков, в отличие от транспорта из клетки в клетку, ТБ ВТМ не способен изменять пропускную способность плазмодесм. Следовательно, плазмодесмы проводящих путей отличаются от таковых в остальных тканях.

Основываясь на этом и учитывая необходимость белка оболочки в процессе дальнего транспорта, можно предположить, что белок оболочки является одним из факторов, нужных вирусу для проникновения из клеток обкладки в клетки сосудистой паренхимы. Эксперименты с использованием мутантов, дефектных по гену белка оболочки, и мутантов, неспособных формировать капсид, показали, что для проникновения в клетки сосудов, т.е. для осуществления первого шага на пути к дальнему транспорту, не нужен ни полноценный вирион, ни присутствие нормального белка оболочки (Ding et al., 1995). По-видимому, для этого требуются какие-то другие вирусные, а может быть, и хозяйские факторы. Например, для дальнего транспорта вируса гравировки табака (ВГТ) необходим компонент-помощник - НС-Pro, мультифункциональный белок, имеющий протеиназную активность (см. Shaad et al., 1996).

МЕЖКЛЕТОЧНЫЙ ТРАНСПОРТ ВИРУСОВ.

Как уже упоминалось, для перемещения из клетки в клетку вирусы используют плазмодесмы. Плазмодесмы (ПД) представляют собой поры, состоящие из одного или нескольких сквозных микроканальцев, через которые осуществляется сообщение между клетками. Через центральную часть канальца проходит десмотубула, мембраноизолированная структура, соединяющая эндоплазматические сети соседних клеток. И десмотубула, и цитоплазматическая мембрана, выстилающая внутреннюю полость канальца, связаны с белковыми глобулами. В ходе развития растения плазмодесмы претерпевают ряд изменений: так, в мезофилле Nicotiana tabacum на ранних стадиях развития растения преобладают простые, или первичные плазмодесмы, содержащие только один каналец и образующиеся при делении клетки (Ding et al., 1992). В процессе роста и развития ткани значительная часть - до 80% (Oparka et al., 1999) первичных плазмодесм подвергается структурным изменениям, превращаясь во вторичные, или разветвленные плазмодесмы (Ding et al., 1992; Ding & Lucas, 1996; см. Pickard & Beachy, 1999). В ходе этого процесса первичные плазмодесмы объединяются центральными частями своих канальцев, формируя так называемую центральную полость; возможно также, что часть канальцев вторичной ПД формируется de novo (Carrington et al., 1996).

Рис. 1. Схема строения первичных (А) и вторичных (Б) плазмодесм (по Орагка е! а1., 1999). ЭР - эндоплазматический ретикулум; ДТ - десмотубула; ЦП - цетральная полость; КС -клеточная стенка.

Ранее предполагалось, что через плазмодесмы транспортируются преимущественно низкомолекулярные соединения с молекулярной массой, не превышающей 1 кДа (Тепу & ЯоЬагёБ, 1987; ^^тапп & гатЬгузИ, 1995). Однако в последние годы было показано структурное и функциональное разнообразие плазмодесм в различных тканях растений и обнаружены существенные различия в пропускной способности различных ПД. В

ЭР частности, продемонстрирована существенно большая, нежели в других тканях, пропускная способность плазмодесм, соединяющих ситовидные клетки и клетки-спутницы (Van Bel & Kempers, 1997), а также плазмодесм между клетками трихом (Waigmann & Zambryski, 1995) (около 10 кДа и 7 кДа, соответственно). Еще более удивительный результат был получен Oparka et al. (1999). Авторы показали, что в молодых листьях N.tabacum и N.clevelandii через первичные плазмодесмы способны свободно проходить белки массой до 50 кДа. После преобразования первичных плазмодесм в разветвленные пропускная способность ПД резко уменьшалась (Oparka et al., 1999).

Так или иначе, для вторичных ПД, преобладающих в зрелом растении, SEL (size exclusion limit — параметр, определяющий пропускную способность плазмодесмы) каждого канальца, определяемый при помощи инертных флуоресцирующих декстранов, не превышает 0.9-1 нм (Terry & Robards, 1987), тогда как диаметр вириона у разных фитовирусов составляет 12-80 нм, а диаметр свободной РНК — около 10 нм (Citovsky et al., 1990). Несмотря на эти ограничения, вирусы способны использовать плазмодесмы для транспорта, модифицируя их. У многих вирусов эту функцию осуществляет закодированный в вирусном геноме транспортный белок, увеличивающий пропускную способность плазмодесм (Wolf et al., 1989; Waigmann et al., 1994; Waigmann & Zambryski, 1995; Derrick et al., 1992; Angell et al., 1996). Кроме того, ТБ способен влиять на плазмодесмы клеток, лежащих на некотором расстоянии от инфицированных, быстро распространяясь по соседним клеткам или передавая сигнал посредством каких-то клеточных факторов (Waigmann et al., 1994).

Было высказано предположение о том, что в процессе распространения инфекции вирусы используют механизм, предусмотренный в здоровой растительной клетке для транспорта макромолекул (Waigmann & Zambryski, 1994). Это предположение получило в дальнейшем подтверждение. Так, в работе Lucas et al. (1995) было показано, что транскрипционный фактор кукурузы KNOTTED 1 (KN1) способен перемещаться из клетки в клетку, увеличивая SEL плазмодесм, подобно вирусным транспортным белкам. Интересно, что KN1 также способствует транспорту своей собственной мРНК (Lucas et al., 1995). По всей видимости, к транспорту через плазмодесмы в здоровом растении способны не только белки, но и нуклеиновые кислоты. Обладающий РНК-связывающими свойствами белок тыквы Cmpplö способен перемещаться из клеток-спутниц в ситовидные элементы; при этом он способствует межклеточному транспорту различных РНК, в том числе и своей собственной (Xoconostle-Cazares et al., 1999). Эти и другие примеры транспорта белков и нуклеиновых кислот через плазмодесмы указывают на то, что транспортные системы фитовирусов не являются уникальными и, скорее всего, представляют собой производные аналогичных клеточных систем (Crawford & Zambryski, 1999).

Существует по крайней мере три механизма, используемых вирусами для перемещения из клетки в клетку.

Во-первых, вирусная инфекция может распространяться по клеткам при помощи трубчатых структур, формирующихся при участии ТБ и проходящих сквозь утратившие десмотубулы плазмодесмы (см. Carrington et al., 1996). Такую стратегию используют, например, вирус крапчатости томатов (Wieszorek &

Sanfacon, 1993), вирус мозаики коровьего горошка (ВМКГ) (Wellink et al., 1993), вирус мозаики цветной капусты (Thomas & Maule, 1995), вирус пятнистой вялости томатов (ВПВТ) (Storms et al., 1995). Для для комовирусов (ВМКГ) был описан следующий механизм перемещения (Atabekov & Taliansky, 1990). Геном ВМКГ состоит из двух РНК: B-РНК (кодирует все функции, необходимые для репликации) и М-РНК, кодирующей два ТБ (48 и 58 кДа) и два белка оболочки. В зараженных клетках ВМКГ на ранних стадиях инфекции формирует трубчатые структуры, идущие к плазмодесмам и содержащие оба ТБ; внутри структур обнаруживаются икосаэдрические вирионы ВМКГ. Этот факт, а также необходимость белка оболочки для транспорта ВМКГ доказывают, что вирус перемещается из клетки в клетку через тубулярные структуры и в виде вирионов (Atabekov & Taliansky, 1990).

Второй способ межклеточного транспорта предполагает транспортировку вирусной РНК в комплексе с транспортным белком, т.е. вирус распространяется в виде рибонуклеопротеидного комплекса (РНП), отличного, однако, от вирусных частиц. Подобный тип транспорта характерен для вируса табачной мозаики ВТМ (Waigmann et al., 1994), вируса некротической мозаики красного клевера ВНМКК (см. Carrington et al., 1996), вируса мозаики огурца ВМО (Ding et al., 1995). В отличие от ВТМ, межклеточный транспорт ВМО осуществляется только в присутствии белка оболочки. Интересно, что делеции N-концевого района БО ВМО, подавляющие сборку вирионов, не препятствуют транспорту вирусной РНК ВМО (Schmitz and Rao, 1998, Kaplan et al., 1998). Очевидно, что ВМО, как и ВТМ, транспортируется через плазмодесмы не в виде вирионов; роль БО в межклеточном транспорте ВМО остается неясной. Ниже механизм транспорта вирусной РНК в комплексе с транспортным белком будет подробно рассмотрен на примере ВТМ.

В третьем случае вирусспецифическая транспортная функция представлена блоком трех частично перекрывающихся открытых рамок считывания - тройным генетическим блоком, или ТГБ, обнаруженным в геномах потеке-, карла-, гордеи- и фуровирусов (Forster et al., 1988; Morozov et al., 1989). Несмотря на разницу в размерах, аминокислотных последовательностях и свойствах, белки ТГБ1, ТГБ2 и ТГБЗ разных групп вирусов имеют много общих черт. ТГБ1, во всех описанных случаях являющий самым большим из трех продуктов ТГБ, обладает нуклеотид- и РНК-связывающими, а также НТФазными свойствами (Rouleau et al., 1994; Bleykasten et al., 1996; Kalinina et al., 1996; Morozov et al., 1999). Кроме того, в составе ТГБ1 обнаружены последовательности, характерные для НТФ-зависимых хеликаз (Gorbalenya et. al., 1988). В тоже время экспериментальное подтверждение хеликазных свойств ТГБ1 отсутствует. Два других белка тройного генетического блока - ТГБ2 и ТГБЗ представляют собой небольшие гидрофобные белки, по всей видимости, in vivo связанные с мембранами (Donald et al., 1993; Hefferon et al., 1997).

С другой стороны, было бы ошибкой говорить о существовании единого механизма межклеточного транспорта для всех вирусов, в геноме которых закодирован ТГБ. Так, например, белок оболочки необходим для межклеточного транспорта потексвирусов (Chapman et al., 1992; Forster et al., 1992), но не требуется для ближнего транспорта фуровирусов (Gilmer et al., 1992) и гордеивирусов (Petty & Jackson, 1990). Кроме того, ТГБ1 гордеи- и фуровирусов имеют N-концевое удлинение, отсутствующее у меньших по размерам ТГБ1 потексвирусов (Solovyev et al., 1996). Nконцевое удлинение содержит группы положительно заряженных аминокислот, возможно, принимающих участие в связываниии РНК (Solovyev et al., 1996). Эти данные, а также тот факт, что 58 кДа ТГБ1 гордеивируса in vivo связан с неинкапсидированной вирусной РНК (Brakke et al., 1988), наводят на мысль о том, что межклеточный транспорт гордеивирусов сочетает в себе черты ближнего транспорта тобамо- и потексвирусов.

В то же время механизмы ближнего транспорта различных вирусов имеют много общего. Об этом свидетельствуют различные примеры комплементации транспортной функции одного вируса другим в растении, в принципе, нечувствительном к первому вирусу (Malyshenko et al., 1989; Okada et al., 1988). Так, например, вирус табачной мозаики не поражает Triticum v.; в растениях же, одновременно инфицированных ВТМ и ВШМЯ, ВТМ развивает системную инфекцию. Аналогичным образом Х-вирус картофеля комплементирует транспортную функцию ВТМ в растениях Lycopersicon esculentum линии Tm2 (Taliansky et al., 1982,с). Не менее интересным является тот факт, что температурочувствительные мутанты по транспортному белку ВТМ LSI и NÍ2519 способны развивать системную инфекцию в растениях Amaranthus caudatus L. даже при непермиссивной температуре — видимо, в результате стабилизации мутантных ТБ некими хозяйскими факторами (Atabekov & Taliansky, 1990). Всё это свидетельствует о том, что механизмы ближнего транспорта различных фитовирусов, наряду с существенными различиями, имеют немало общих черт.

МЕЖКЛЕТОЧНЫЙ ТРАНСПОРТ ВТМ.

Транспортный белок ВТМ: общие представления.

Наиболее хорошо изученным ТБ является ТБ вируса табачной мозаики, видимо, это связано с тем, что среди всех вирусов растений ВТМ являлся одним из излюбленных объектов. Структура, выражение генома, а также функции белков ВТМ изучены довольно хорошо. Геном ВТМ представлен "плюс" - РНК длиной 6395 нуклеотидов и кодирует по крайней мере четыре белка: белки 126 кДа и 183 кДа (являются компонентами вирусной репликазы) транслируются непосредственно с геномной РНК. Два других белка -30 к Да, необходимый для транспорта, и 17.5 кДа, белок оболочки, -транслируются с субгеномных РНК (Meshi et al., 1982; Lehto et al., 1990).

КЭП

Рис. 2. Схема организации генома ВТМ.

В определении функций ТБ ВТМ существенную роль сыграли исследования с использованием температурочувствительных мутантов ВТМ LSI (Nishiguchi et al., 1978) и №2519 (Jockusch, 1968). Мутанты не способны перемещаться из клетки в клетку при непермиссивной температуре (+32°С), но при этой же температуре могут реплицироваться в изолированных протопластах или первично инфицированных клетках (Atabekov & Taliansky, 1990). Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей белков японского томатного штамма ВТМ L и его температурочувствительной формы LSI (Leonard & Zaitlin, 1982) выявил различия лишь между 30 кДа-белками штаммов L и LS 1, что явилось первым указанием на участие белка 30 кДа (ниже также именуемого ТБ ВТМ) в межклеточном транспорте. При сравнении нуклеотидных последовательностей РНК штаммов L и LSI было обнаружено единственное различие в аминокислотных составах белков 30 кДа: замена пролина на серин в 154 положении (Ohno et al., 1983; Meshi et al., 1987). Подобным образом (при замене аргинина на глицин в 144 положении) формируется и фенотип №2519 (Zimmern & Hunter, 1983).

Зависимость межклеточного транспорта ВТМ от 30 кДа-белка была показана при помощи комплементационного анализа с использованием мутантных штаммов ВТМ LSI и N¡2519 и нормального штамма (дикого типа) ВТМ U1. При смешанной инфекции типа M2519+U1 (Taliansky et al., 1982,а) и LS1+U1 (Taiiansky et al., 1982,b,c) при непермиссивной температуре вирус U1 предоставлял 30 кДа-белок вирусу - мутанту, позволяя ему перемещаться из клетки в клетку. Аналогичные результаты (комплементация мутации в ТБ ВТМ) были получены при заражении штаммом LSI в непермиссивных условиях трансгенных растений N.tabacum, экспрессирующих нормальный ТБ вируса табачной мозаики (Deom et al., 1987).

Внутриклеточная локализация ТБ ВТМ.

Дальнейшее изучение функций и свойств ТБ ВТМ требовало выяснения его локализации в клетках, поражённых вирусом. Сообщалось (Watanabe et al., 1986), что в инфицированных ВТМ протопластах основная часть ТБ ВТМ была связана с ядерной фракцией; это породило предположения о подавлении клеточных защитных механизмов транспортным белком ВТМ в результате его воздействия на транскрипционную систему клетки-хозяина.

В дальнейшем информация о ядерной локализации ТБ ВТМ не была подтверждена. С использованием иммунохимических методов было показано (Tomenius et al., 1987), что ТБ ВТМ в зараженной клетке взаимодействует с плазмодесмами: через несколько часов после заражения белок обнаруживался вблизи плазмодесм или внутри них (Tomenius et al., 1987). Эти данные были подтверждены опытами с трансгенными растениями, экспрессирующими ТБ ВТМ; при анализе их клеток белок обнаруживался преимущественно во фракции клеточных стенок (Deom et al., 1990) и был связан с плазмодесмами (Atkins et al., 1991). Локализация ТБ ВТМ в плазмодесмах инфицированных клеток была также подтверждена результатами экспериментов с зеленым флуоресцирующим белком (ЗФБ), выделенным из медузы Аецыогеа victoria. Этот белок оказался очень удобным для исследований, т.к. при возбуждении ультрафиолетом (395 нм) испускает зеленое свечение и, следовательно, может быть использован для выяснения местонахождения ТБ в клетке. Был сконструирован ген, продуктом которого являлся рекомбинантный белок ТБ ВТМ-ЗФБ. Этот белок, максимальная экспрессия которого наблюдалась через 24 часа после заражения, полностью обеспечивал транспорт вируса и обнаруживался преимущественно в районах плазмодесм (Epel et al., 1996).

Транспортный белок ВТМ модифицирует плазмодесмы инфицированных клеток.

Таким образом, стало ясно, что в клетке ТБ ВТМ взаимодействует с плазмодесмами, поскольку всегда локализуется вблизи них. Но действительно ли он модифицирует их? Для выяснения этого в клетки мезофилла листьев табака одновременно вводились ТБ ВТМ и флуоресцирующие декстраны (Waigmann et al., 1994). Эта экспериментальная система позволила определять непосредственную функцию ТБ ВТМ. Оказалось, что через 3-5 минут после введения смеси плазмодесмы приобретают способность пропускать декстраны массой до 20 кДа. Значит, ТБ модифицирует плазмодесмы, причем делает это довольно быстро. Такая быстрота еще раз подтверждает тот факт, что в клетке существует система регулировки размера плазмодесм, а ТБ лишь помогает вирусу использовать ее. Во время полноценной вирусной инфекции увеличение пропускной способности плазмодесм наблюдается через 2-5 часов после начального заражения. Разница в скорости действия чистого ТБ и вируса объясняется тем, что последнему необходимо время для того, чтобы сбросить оболочку, провести репликацию и накопить нужное для дальнейшего распространения количество белка. Интересно, что действие экзогенного ТБ ВТМ на плазмодесмы оказывается иным, нежели в растениях, трансгенных по ТБ ВТМ: если в первом случае инъекция ТБ ВТМ вызывала увеличение SEL до 3.2—4.3 нм, то в трансгенных растениях SEL плазмодесм не превышал 2.3—3.1 нм (Wolf et al., 1989). Также интересным, но пока не объяснённым является тот факт, что в трансгенных по ТБ ВТМ растениях SEL отличается от обычного (0.75 нм) только в старых листьях; плазмодесмы молодых листьев до определённого момента остаются неизменёнными, несмотря на то, что и в этих листьях экспрессируется ТБ ВТМ (Waigmann et al., 1994; Deom étal, 1990).

Одной из интересных моделей для изучения воздействия ТБ на плазмодесмы послужили трихомы - волоски на поверхности листа, состоящие из 4-8 линейно расположенных клеток. Такое их строение существенно облегчает обнаружение нуклеопротеидных частиц в клетке. Известно, что в трихомах вирусы успешно перемещаются (Derrick et al., 1992), но их плазмодесмы существенно отличаются от плазмодесм клеток мезофилла, так как пропускная способность первых составляет около 7 кДа (Waigmann & Zambryski, 1995), и эта величина не может быть изменена ТБ ВТМ. Кроме того, время прохода через плазмодесмы трихом даже очень маленьких молекул намного больше (1-2 минуты), чем в клетках мезофилла листа, где этот процесс занимает всего несколько секунд. Через 30 минут после введения ТБ в концевую клетку, а может быть, и раньше, белок распространился по всем клеткам трихомы. В это время увеличения пропускной способности плазмодесм не наблюдалось, но совершенно ясно, что взаимодействие между ними и ТБ ВТМ все равно происходило (Waigmann & Zambryski, 1995). Эти данные следует учитывать при рассмотрении проблемы транспорта, так как в зависимости от типа плазмодесм вирус может вести себя по-разному: в трихомах пропускная способность плазмодесм больше, чем в нормальных клетках мезофилла, но меньше, чем в инфицированных. Возможно, что пропускная способность плазмодесм, соединяющих клетки трихом, является достаточной для транслокации комплекса ТБ ВТМ с вирусной РНК и ТБ ничего не модифицирует, в то время как декстраны массой 10 кДа не проходят через эти плазмодесмы. С другой стороны, транспорт декстранов может и не отражать ТБ-зависимого увеличения размеров канальцев. Возможно, РНП-комплекс движется довольно быстро и изменяет плазмодесмы только на тот момент, пока проходит сам (Waigmann & Zambryski, 1995).

Таким образом, механизм модификации плазмодесм транспортным белком ВТМ остается неясным. На данный момент известен по крайней мере один белок клеточных стенок N.tabacum, взаимодействующий с ТБ ВТМ. Пектинметилэстераза (ПМЭ), важный структурный компонент КС, взаимодействует с ТБ ВТМ (Dorokhov et ah, 1999; Chen et ah, 2000), а также с ТБ каулимовируса (Chen et ah, 2000). Делеция взаимодействующего с ПМЭ района ТБ ВТМ (аминокислоты 130-185) делает невозможным межклеточный транспорт вируса (Chen et ah, 2000). Интересно, что делеции в пределах данной области также лишают ТБ ВТМ способности увеличивать SEL плазмодесм (Waigmann et ah, 1994). Это позволяет предположить, что ПМЭ участвует в заякоривании ТБ ВТМ в районе плазмодесм или в самом процессе модификации плазмодесм.

Взаимодействие ТБ ВТМ с нуклеиновыми кислотами.

Другим важным функциональным свойством транспортного белка является его способность связываться с одноцепочечными нуклеиновыми кислотами (Citovsky et ah, 1990), причем в равной степени и с РНК, и с ДНК. ТБ ВТМ связывается прочно (согласно Citovsky et. ah (1990) и Li & Palukaitis (1996), для разрушения этой связи требуется концентрация NaCl не менее 0.8М), кооперативно и неспецифично относительно последовательности. Минимальный размер сайта связывания нуклеиновой кислоты и ТБ ВТМ составляет 4-7 нуклеотидов на один мономер белка (Citovsky et ah, 1990). Отсюда следует, что способность ТБ ВТМ взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами играет двойную роль в распространении вируса:

Во-первых, функция ТБ состоит в создании пула "транспортабельных" вирусных РНК. ВТМ реплицируется и находится в цитоплазме клетки—хозяина в виде частично двуцепочечных РНК (Palukaitis & Zaitlin, 1986). Для распространения вируса необходимо, чтобы часть молекул РНК не была задействована в процесс удвоения генетического материала. Кроме того, фатальным для развития инфекции было бы быстрое связывание новосинтезированных РНК белком оболочки ВТМ — в этом случае РНК в виде вирионов оказалась бы неспособной к межклеточному транспорту. Белок ТБ ВТМ, который, как известно, начинает синтезироваться уже на самых ранних стадиях развития инфекции (Lehto et al., 1990; Meshi et al., 1987), связывается с новосинтезированной РНК. Показано, что комплекс РНК ВТМ - ТБ ВТМ является нетранслируемым in vitro (Дорохов с соавт., 1996; Karpova et al., 1997). Таким образом, в результате связывания РНК белком ТБ ВТМ образуется предназначенный для транспорта в соседние клетки стабильный "информационный РНП", недоступный для рибосом и поэтому временно исключенный из процесса накопления вирусных структурных компонентов. Следует добавить, что участок связывания РНК с белком оболочки состоит из трех шпилек, а ТБ ВТМ способен связываться только с одноцепочечными нуклеиновыми кислотами, не взаимодействуя со шпильками. В таком случае участки узнавания белком оболочки на РНК будут свободны. Именно из-за возможности конкуренции между ТБ ВТМ и белком оболочки ранняя экспрессия ТБ является чрезвычайно важной для распространения вируса.

Во-вторых, связывание ТБ с РНК приводит к формированию тонкого, протяженного РНП - комплекса диаметром <2 нм (Citovsky et. al, 1992). Такой комплекс, по всей видимости, способен проходить через модифицированные ТБ ВТМ и имеющие SEL порядка 3 - 4 нм плазмодесмы. Иными словами, функция ТБ ВТМ заключается не только, в воздействии на проводящие каналы, но и в придании молекуле РНК нужной для транспорта формы.

Таким образом, основываясь на результатах работ С^оуБку е1. а1. (1992), и Кагроуа е!:. а1. (1997), можно сделать вывод о том, что транспортной формой ВТМ является протяженный рибонуклеопротеид (С^оуэку е1 а1., 1992), в состав которого входят геномная вирусная РНК и транспортный белок ВТМ, причем РНК ВТМ в составе подобного рибонуклеопротеида нетранслируема (Кагроуа е1 а1., 1997).

В самой структуре транспортного вирусного РНП существует некая двойственность: с одной стороны, РНК в составе подобного РНП должна быть в достаточной степени защищена белковым компонентом от неблагоприятных внешних воздействий; кроме того, как отмечалось выше, транспортируемая форма РНК должна быть временно исключена из процесса накопления вирусных структурных компонентов, то есть транспортный РНП должен быть достаточно стабилен. В то же время очевидно, что проникшая в клетку транспортная форма вируса должна быть доступной для рибосом. С подобной проблемой не сталкиваются "родительские" вирусные частицы ВТМ: вирионная РНК ВТМ освобождается от белка оболочки в процессе "котрансляционного раздевания" (Мипёгу йаЬ, 1991).

Все вышесказанное позволяет предположить, что на одном из этапов внутриклеточного транспорта (возможно, на стадии транслокации через плазмодесмы) транспортный РНП неким образом модифицируется. Результатом подобной модификации может являться либо дестабилизация, либо полная или частичная диссоциация РНП-комплекса. Было высказано предположение (Karpova et al., 1997), что переход РНП-комплексов в транслируемое состояние может быть связан с фосфорилированием транспортного белка. фосфорилирование ТБ ВТМ.

Фосфорилирование белков является одним из основных способов регуляции процессов, происходящих в живых клетках. Предполагается, что на разных стадиях развития эукариотической клетки фосфорилированию подвергается примерно треть всех клеточных белков (Zolnierowicz & Bollen, 2000). Биологическое значение фосфорилирования трудно переоценить. Энергетический обмен, деление и дифференцировка клеток, внутриклеточный транспорт и компартментализация макромолекул, передача межклеточных сигналов, апоптоз — в регуляции всех этих (и множества других) процессов важнейшую роль играют системы фосфорилирования-дефосфорилирования белков. Не являются исключением и клетки растений. Системы фосфорилирования-дефосфорилирования белков являются своеобразным "центральным процессором" растительной клетки (Hardie, 1999), воспринимающим "входящие сигналы" и преобразующим их в соответствующие изменения в метаболизме, экспрессии генов, росте и делении клеток. За последнее десятилетие было описано около 600 кодирующих протеинкиназы генов растений; только для A.thaliana охарактеризовано больше 150 протеинкиназ (Hardie, 1999), и это число продолжает увеличиваться.

Почти все вирусы (в особенности это относится к РНК-содержащим вирусам, размер генома у которых не превышает 30 тыс. нуклеотидов) находятся в значительной зависимости от клеточных систем жизнеобеспечения. Так, например, обладая известной автономией репликации и транскрипции (вирусспецифические РНК- и ДНК-полимеразы и т.п.), все известные вирусы используют трансляционный аппарат клетки-хозяина. Неудивительно, что активность белков (как клеточных, так и вирусспецифических), участвующих в развитии вирусной инфекции, находится под контролем стандартных регуляторных клеточных механизмов, в том числе фосфорилирования. Так, например, фосфорилированию подвергаются различные белки ретровирусов (Hauber et al., 1988), флавивирусов (Reed et al., 1998), парвовирусов (Corbau et al., 1999), парамиксовирусов (Hu et al.,

1999), буньявирусов (Kohl et al., 1999), рабдовирусов (Gupta et al.,

2000) и многих других вирусов. Не являются исключением и транспортные белки фитовирусов: фосфорилирование продемонстрировано для ТБ вируса желтой мозаики турнепса (Seron et al., 1996) и ТБ лютеовируса (Sokolova et al., 1997).

Впервые возможность фосфорилирования ТБ ВТМ была обнаружена при экспрессии рекомбинантного ТБ в клетках насекомого Spodoptera frugiperda (Atkins et al., 1991). Впоследствии было продемонстрировано, что ТБ фосфорилируется в изолированных протопластах табака (Watanabe et al., 1992; Haley et al., 1995), а также протеинкиназами, ассоциированными с фракцией клеточных стенок N.tabacum (Citovsky et al., 1993).

Показано также, что ТБ вируса мозаики томата (ВМТ), близкого к ВТМ тобамовируса, фосфорилируется в инфицированных ВМТ протопластах (Kawakami et al., 1999) и протеинкиназами клеточных экстрактов N.tabacum (Matsushita et al., 2000).

Предметом дискуссий остаются сайты фосфорилирования ТБ тобамовирусов. Так, сообщалось, что фосфорилированию подвергаются остатки Ser-37 и Ser-238 (Kawakami et al., 1999) или внутренние области (в районе аминокислот 61-114 и 212-231) белка (Haley et al., 1995). Тем не менее большинство авторов (Watanabe et al., 1992; Citovsky et al., 1993; Haley et al., 1995; Matsushita et al., 2000) сходится во мнении, что клеточные протеинкиназы фосфорилируют С-концевую область ТБ. Так, в работе Citovsky et. al. (1993) продемонстрировано фосфорилирование в составе ТБ остатков Ser-258, Thr-261 и Ser-265; это вполне согласуется с данными о фосфорилировании соответствующих аминокислот Thr-256, Ser-257, Ser-261 и Ser-263 в составе ТБ ВМТ (Matsushita et al., 2000).

Было высказано предположение, что фосфорилирование ТБ ВТМ может участвовать в регуляции транспорта генетического материала ВТМ в соседние клетки (Seron et al., 1996). На основании данных о способности ТБ ВТМ подавлять трансляцию РНК in vitro Karpova et. al. (1997) предположили, что фосфорилирование ТБ ВТМ может оказаться механизмом трансляционной активации РНК ВТМ, входящей в состав гипотетического транспортного рибонуклеопротеида состава РНК ВТМ-ТБ ВТМ. Можно предположить, что фосфорилирование ТБ в районе плазмодесм протеинкиназами клеточных стенок (Citovsky et al., 1993) дестабилизирует комплекс РНК с белком (возможно, вследствие электростатического взаимодействия фосфатных групп РНК и фосфорилированного ТБ, либо в результате конформационных изменений в ТБ ВТМ). Известно, что фосфорилирование белков может приводить к снижению их РНК-связывающей активности (Ratka et al., 1989; Danon & Mayfield, 1994; Руре et al., 1994; Lisitsky et al., 1995). В результате через плазмодесмы будут транспортироваться освобожденные от ТБ молекулы РНК либо дестабилизированный рибонуклеопротеид, способный к трансляции (Karpova et al., 1997). В соответствии с другой гипотезой, фосфорилирование ТБ ВТМ в клетках инфицированного растения может быть компонентом клеточной защитной системы. Предполагается, что фосфорилирование является механизмом инактивации ТБ ВТМ (Citovsky et al., 1993; Trunyeva et al., 2000; Waigmann et al., 2000).

Взаимодействие ТБ с цитоскелетом; гипотеза внутриклеточного транспорта.

Итак, механизм перемещения через плазмодесмы проясняется, но остается неясным, каким образом комплекс ТБ с РНК транспортируется из районов синтеза вирусных РНК и белков в область клеточной стенки. Вирусы животных часто используют для внутриклеточного транспорта элементы цитоскелета клетки -хозяина, (см. McLean et al., 1995). Логично предположить, что и фитовирусы в подобной ситуации используют цитоскелет растительных клеток, состоящий из актина, тубулина и промежуточных филаментов.

Эксперименты, проведенные на протопластах табака, показали, что рекомбинантный белок ТБ-ЗФБ способен формировать волокнистую сеть, колокализованную с цитоскелетом (McLean et al., 1995). При этом ТБ ВТМ взаимодействует в клетке с микротрубочками (Heinlein et al., 1995; McLean et al., 1995; Mas & Beachy, 1998, Lazarovitz & Beachy, 1999) и, в меньшей степени, с актиновыми филаментами (McLean et al., 1995). Показано, что скорость и эффективность межклеточного (и, видимо, внутриклеточного) транспорта ВТМ определяется, в частности, эффективностью взаимодействия транспортного белка с микротрубочками (Boyko et ah, 2000); таким образом, взаимодействие ТБ с элементами цитоскелета действительно является функциональным. На основании соображений, изложенных в вышеназванных работах, можно построить следующую примерную схему внутриклеточного транспорта ВТМ.

Как и в случае многих других вирусов, репликация вирусной РНК ВТМ и синтез вирусных белков происходят в районах эндоплазматического ретикулума (Heinlein et al., 1998; Reichel & Beachy, 1998). Таким образом, "стартовой точкой" новосинтезированных ТБ и вирусной РНК является поверхнос ть ЭР. Дальнейшая судьба ТБ является предметом дискуссий: одни авторы полагают, что взаимодействие ТБ с ЭР является поверхностным и осуществляется за счет элементов цитоскелета, выстилающих наружную поверхность ЭР (Heinlein et al., 1998). По мнению других, ТБ ВТМ является интегральным белком мембран ЭР (Reichel & Beachy, 1998; Brill et al., 2000); это предположение подтверждается данными о прочной связи ТБ ВТМ с мембранами ЭР, нарушаемой только в присутствии неионных детергентов (Reichel & Beachy, 1998); построена топологическая модель ТБ ВТМ, предполагающая наличие двух трансмембранных доменов в составе белка (Brill et al., 2000).

Так или иначе, следующим этапом вирусного транспорта является связывание ТБ ВТМ (свободного или заякоренного в мембране ЭР) с вирусной РНК. При этом формируется протяженный РНП-комплекс, ассоциированный с цитоскелетом клетки. Для направленного движения в цитоплазме комплекс ТБ с РНК использует микротрубочки; возможно, одновременно находясь в контакте с ЭР. Важно отметить, что по микротрубочкам транспортируется не только свободный ТБ, но и его комплекс с РНК ВТМ: в опытах по гибридизации in situ Mas & Beachy (1999) продемонстрировали, что в инфицированных ВТМ клетках вирусная РНК колокализована с микротрубочками. Предполагается, что в дальнейшем комплекс ТБ-РНК соединяется с актиновыми филаментами, которые осуществляют его транспорт непосредственно к плазмодесмам, а может быть, и сквозь них -актиновые филаменты были обнаружены внутри плазмодесм (White et al., 1994). По мнению Mas & Beachy, (1999), в процессе транслокации через плазмодесму РНП-комплекс может также взаимодействовать с десмотубулой - компонентом ЭР, пронизывающим плазмодесменный каналец.

Кроме того, важно заметить, что сам факт изменения ТБ пропускной способности плазмодесм также может быть связан с актином, проходящим через устья проводящих канальцев плазмодесм, т.е. то место, где, собственно, и должна осуществляться регуляция размера поры. Показано, что микроинъекции цитохалазина D или профилина (агентов, дестабилизирующих актиновые филаменты) приводят к увеличению SEL плазмодесм от 1 до 20 кДа; при этом фаллоидин, стабилизирующий актиновые филаменты, делает плазмодесмы нечувствительными к воздействию профилина (Ding et al., 1996).

Функциональные домены ТБ ВТМ.

При помощи анализа делеционных мутантов была установлена структура ТБ ВТМ. Это основный белок, состоящий из 267 аминокислот (Meshi et al., 1982). Выделяют несколько функциональных (поскольку данные о пространственной организации ТБ ВТМ отсутствуют) доменов ТБ ВТМ (Waigmann et al., 1994).

Рис. 3. Схематическое изображение доменной структуры ТБ ВТМ (согласно Waigmann et al., 1994).

Домен А (112-185 аминокислотные остатки) и домен В(185-268 аминокислотные остатки) ответственны за взаимодействие с РНК; домен С (65-86 аминокислотные остатки) необходим для поддержания правильной конформации белка; домен D, частично перекрывающийся с В, представляет собой фосфорилируемый участок белка; домен Е (126-224 аминокислотные остатки) перекрывается с А и В и участвует непосредственно в модификации плазмодесм. Скорее всего, увеличение пропускной способности канала - это сложный, многоступенчатый процесс, и большой домен Е сочетает в себе сразу несколько функций. На основании этого можно утверждать, что существуют две функционально важных области в первичной структуре ТБ ВТМ. Одна ответственна за связь с РНК, а другая за взаимодействие с плазмодесмами.

МЕЖКЛЕТОЧНЫЙ ТРАНСПОРТ ТГБ - СОДЕРЖАЩИХ

ВИРУСОВ.

Как отмечалось выше, существуют принципиальные различия в механизмах межклеточного транспорта тобамо- и потексвирусов. В случае ВТМ необходимым и достаточным условием межклеточного транспорта геномной вирусной РНК является наличие в клетке функционального ТБ ВТМ; для ближнего транспорта потексвирусов необходимы три неструктурных белка, кодируемых генами тройного генетического блока (Beck et al., 1991), и белок оболочки (Chapman et al., 1992; Forster et al., 1992).

Тройной блок генов.

Известно, что геномы некоторых групп РНК-содержащих фитовирусов содержат так называемый "тройной генетический блок", или ТГБ (Morozov et al., 1988, 1989). ТГБ, представляющий собой три частично перекрывающихся открытые рамки трансляции (ОРТ), был обнаружен в геномах потеке- (Morozov et al., 1987; Forster et al., 1988), карла- (Rupasov et. al. 1989), гордеи- (Morozov et al., 1989) и фуровирусов (Gilmer et al., 1992). Открытые рамки трансляции, расположенные в 5'-области ТГБ у всех упомянутых вирусов кодируют РНК-связывающие белки ТБ 1, обладющие также НТФазными свойствами. Продуктами трансляции двух других ОРТ являются два сравнительно небольших гидрофобных белка ТБ2 и ТБЗ. На примере потексвируса мозаики белого клевера (ВМБК) была продемонстрирована необходимость продуктов ТГБ для вирусного транспорта. Делеционный анализ ТГБ ВМБК показал, что все три продукта ТГБ необходимы для развития инфекции; при этом мутации в белках ТГБ не отражаются на репликации вирусной РНК (Beck et al., 1991). Продукты трансляции ТГБ также необходимы для межклеточного транспорта гордеи- (Petty & Jackson, 1990) и фуровирусов (Gilmer et al., 1992).

Геном Х-вируса картофеля (ХВК), типового представителя группы потексвирусов, представлен одноцепочечной "плюс" РНК длиной 6435 нуклеотидов (Huisman et al., 1988). РНК ХВК кодирует пять белков: белок массой 166 кДа, предполагаемая вирусная репликаза, транслируется непосредственно с геномной РНК. Три неструктурных белка ТГБ и белок оболочки транслируются с субгеномных РНК (Могогоу е1 а1., 1991). Из трех продуктов ТГБ ХВК наиболее хорошо изученным является белковый продукт первой ОРТ ТГБ массой 25 кДа (ниже именуемый "ТБ1 ХВК").

Рис. 4. Схема организации генома Х-вируса картофеля.

Внутриклеточная локализация белков, кодируемых первой ОРТ ТГБ.

Согласно результатам Вау1ез е1 а1. (1993), в зараженной клетке ТБ1 ХВК связан с цитоплазматическими тельцами включения, характерными для ХВК. При этом ТБ1 ХВК не обнаруживался в районах клеточных стенок или плазмодесм инфицированных клеток. По данным КаНшпа е1 а1., (1998), ТБ1 ХВК все же присутствует во фракции клеточных стенок, хотя количество белка в этой фракции на порядок меньше, чем в цитоплазматической фракции. Кроме того, показано, что экспрессируемый в клетках N. ЬеШкатгапа рекомбинантный белок ТБ1-ЗФБ локализуется в районах клеточных стенок (Могогоу е1 а1., 1999).

В случае потексвируса мозаики лисохвоста (ВМЛ) ТБ1 находится преимущественно в цитоплазматической фракции. Иммунологическими методами ТБ1 ВМЛ был локализован в районах скоплений вирионов BMJ1 (Rouleau et al., 1994), при этом ТБ1 BMJI не обнаруживался в области клеточных стенок или плазмодесм.

ТБ1 потексвируса мозаики бамбука (ВМБ) был обнаружен в различных фракциях растительного гомогената, в том числе и во фракции клеточных стенок (Chang et al., 1997). Методом иммуноэлектронной микроскопии показано, что ТБ1 ВМБ связан с т. н. электронноплотными кристаллическими тельцами, обнаруживаемыми как в цитоплазме, так и в ядрах ВМБ-инфицированных клеток. Структура телец неясна; возможно, они представляют собой скопления вирусных частиц ВМБ (Chang et al., 1997).

ТБ1 гордеивируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) обнаруживается как во фракции клеточных стенок, так и в растворимой фракции экстрактов тканей пораженного растения (Donald et al., 1993). В случае фуровируса некротического пожелтения жилок свеклы (ВНПЖС) ТБ1 выделялся в мембраноассоциированной форме (Niesbach-Kloesgen et al., 1990). По последним данным, ТБ1 ВНПЖС в инфицированных вирусом клетках обнаруживается в области плазмодесм, причем подобная локализация ТБ1-белка определяется двумя другими продуктами ТГБ - гидрофобными белками ТБ2 и ТБЗ (Erhardt et al., 1999; Erhardt et al., 2000).

Таким образом, данные о внутриклеточной локализации ТБ1-белков различных таксономических групп весьма неоднозначны, а в случае потексвирусов - отчасти противоречивы. Маловероятно, что близкородственные (Rouleau et al., 1994) ТБ1-белки ХВК, ВМБ и BMJI по-разному взаимодействуют с компонентами инфицированных клеток.

Взаимодействие белков, кодируемых первой ОРТ ТГБ, с плазмодесмами.

Хотя ТБ1 ХВК в инфицированных клеках локализован преимущественно в цитоплазме (Davies et al., 1993; Kalinina et al., 1998), белок взаимодействует и с плазмодесмами. Возможно, в подобных взаимодействиях участвует лишь незначительная часть эспрессируемого в клетке ТБ1; так Erhardt et al. (1999) склонны объяснять отсутствие данных о локализации ТБ1-белков потексвирусов в области плазмодесм. В опытах с микроинъекциями флуоресцеирующих декстранов было продемонстрировано, что ТБ1 ХВК, подобно транспортным белкам ВТМ и ряда других вирусов, способен модифицировать плазмодесмы (Angell et al., 1996). Интересно, что SEL модифицированных ТБ1 плазмодесм не превышал 3 нм (Angell et al., 1996), в то время как диаметр вирусных частиц ХВК составляет 13 нм (см. Santa Cruz et al., 1998). Авторы также допускают, что и другие белки ХВК, в частности, ТБ2 и ТБЗ, участвуют в модификации плазмодесм (Angell et al., 1996). С другой стороны, ТБ1 ХВК способен модифицировать плазмодесмы и в отсутствие ТБ2 и ТБЗ (Lough et al., 1998; Morozov et al., 1999).

ТБ1-белки потексвирусов не только способны к увеличению SEL плазмодесм, но также могут транспортироваться через плазмодесмы, причем в отсутствие других вирусспецифических белков (Lough et al., 1998; Yang et al., 2000). Более того, из данных Yang et al. (2000) следует, что в присутствии БО ХВК или двух белков ТБ2 + ТБЗ собственный транспорт ТБ1 через плазмодесмы подавлен. Неясно, является ли собственный транспорт ТБ1 ХВК через плазмодесмы необходимым для межклеточного транспорта вируса.

Связывание и гидролиз НТФ белками - продуктами первой ОРТ ТГБ (ТБ1).

В структуре ТБ1-белков Х-вируса картофеля и других ТГБ-содержащих фитовирусов обнаружены шесть консервативных последовательностей, характерных для НТФ-зависимых хеликаз (Gorbalenya et. al., 1988). Показано, что мутации в каждом из этих консервативных районов полностью блокируют межклеточный транспорт гордеивируса ВШМЯ (см. Solovyev et al., 1996); также продемонстрирована значимость данных последовательностей для межклеточного транспорта потексвируса ВМБК (Beck et al., 1991). Неясно, однако, обладают ли ТБ1-белки хеликазной активностью.

ТБ1 ХВК является Mg -зависимой НТФазой, при этом в качестве субстрата может использоваться как АТФ, так и ГТФ; при этом белок не связывает и не гидролизует УТФ (Kalinina et al., 1996). АТФазная активность ТБ1 ХВК возрастала в присутствии РНК ХВК и РНК ВТМ (Kalinina et al., 1996), что может являться косвенным указанием на наличие у ТБ1 ХВК АТФ-зависимой хеликазной активности. Подобно ТБ1 Х-вируса картофеля, НТФ-связывающими свойствами обладает и ТБ1 потексвируса BMJ1 (Rouleau et al., 1994). Этот белок также является Mg" -зависимой АТФазой. Необходимо отметить, что присутствие различных РНК не стимулировало АТФазную активность ТБ1 ВМЛ (Rouleau et al., 1994).

АТФ-связывающая и АТФазная активности также присущи ТБ1 гордеивируса ВШМЯ; как и в случае с ТБ1 ВМЛ, гидролиз АТФ не стимулировался в присутствии полирибонуклеотидов (Donald et al., 1997).

Значение НТФазной активности ТБ1-белков различных вирусов остается неясным. Трудно говорить о роли НТФазных доменов в обеспечении хеликазной активности ТБ1, поскольку сам факт наличия подобной активности у тех или иных ТБ1-белков не является доказанным. Высказано предположение, что хеликазная активность ТБ1 -белков может проявляться лишь в присутствии некоего неидентифицированного белка (Donald et al., 1997); неясно, однако, какой из белков в этом случае можно считать хеликазой. Однако очевидно, что НТФазная активность так или иначе задействуется на каком-то этапе межклеточного транспорта ХВК. Это подтверждается тем фактом, что мутации ТБ1 ХВК, подавляющие АТФазную активность белка, являются также фатальными для межклеточного транспорта ХВК (Morozov et al., 1999).

Известно, что в норме через плазмодесмы здорового растения могут транспортироваться молекулы мРНК (Lucas et al., 1995; Xoconostle-Cazares et al., 1999). Необходимо, однако, учесть, что обычно размер клеточных мРНК не превышает 2-3 тыс. нукл., в го время как геномы многих РНК-содержащих фитовирусов достигают 6-20 тыс. нукл. Высказано предположение о том, что фитовирусы с большими РНК-геномами выработали собственную систему энергообеспечения транслокации своих геномных РНК через плазмодесмы (Morozov et al., 1999); возможно, что АТФазная активность ТБ1-белков является компонентом подобной системы (Morozov et al., 1999).

РНК-связывающая активность белков - продуктов первой ОРТ ТГБ (ТБ1).

Подобно транспортным белкам многих других вирусов, ТБ1-белки потексвирусов обладают РНК-связывающей активностью. Так, ТБ1 ХВК связывает одноцепочечную РНК, однако связывание наблюдается только в буферах со слабой ионной силой (Kalinina et al., 1996); в физиологических условиях РНК связывающая активность ТБ1 ХВК очень низка (Kalinina et al., 1996; Kaipova et al., 1997) Аналогичные результаты получены в экспериментах с ТБ1 потексвируса мозаики бамбука; авторы также локализовали РНК-связывающуий сайт ТБ1 ВМБ в пределах аминокислот 3-24 (Wung et al., 1999). В то же время по данным Rouleau et al. (1994), ТБ1 другого потексвируса (BMJI) образует с одноцепочечной РНК стабильные комплексы in vitro, причем связывание не специфично относительно нуклеотидной последовательности РНК. Образуемые ТБ1 BMJ1 РНП-комппексы менее стабильны в условиях возрастающей концентрации NaCl по сравнению с комплексами РНК ВТМ-ТБ ВТМ: если для разрушения последних требуется 0.8 M NaCl (Citovsky et al., 1990), то комплексы ТБ1 BMJI с РНК диссоциируют уже при 0.3 M NaCl (Rouleau et al., 1994).

Ярко выраженные РНК-связывающие свойства обнаружены также у ТБ1-белков гордеи- и фуровирусов (Donald et al., 1997; Bleycasten et al., 1996). ТБ1 фуровируса ВНПЖС прочно связывает in vitro как одно-, так и двухцепочечные РНК и ДНК, причем связывание не специфично относительно нуклеотидной последовательности (Bleykasten et al., 1996). Подобная неспецифичность характерна и для ТБ1 гордеивируса В111МЯ; однако этот белок, связывающий одноцепочечые и двухцепочечные

РНК, неспособен образовывать комплексы с ДНК (Donald et al., 1997). РНК-связывающие свойства ТБ1 ВШМЯ проявляются также in vivo: показано, что из зараженных ВШМЯ растений ТБ1 -белок выделяется вместе с вирусной РНК (Brakke et al., 1988).

Неясно, в какой степени неспецифичность связывания относительно нуклеотидной последовательности характерна для ТБ1-белков (как, впрочем, и для транспортных белков ВТМ и многих других вирусов) в ходе инфекции. Rouleau et al. (1994) полагают, что специфичность узнавания вирусных РНК транспортными белками in vivo может обеспечиваться (i) сходной компартментализацией процессов репликации вирусных РНК и синтеза вирусных белков; (ii) участием в РНК-связывании других белков, например ТБ2, ТБЗ и БО в случае потексвируса (Rouleau et al., 1994). Так, присоединение а-субъединицы РНК-полимеразы E.coli к "кор-ферменту" предотвращает прочное и неспецифическое связывание фермента с ДНК, не затрагивая при этом способность фермента взаимодействовать с промоторными участками (см. Сингер и Берг, 1998).

Сравнение белков, кодируемых первой ОРТ ТГБ у различных групп вирусов; функциональные домены ТБ1-белков.

Как уже отмечалось выше, тройной генетический блок представлен в геномах различных групп вирусов. Сходство между различными белками, кодируемыми первыми ОРТ ТГБ, очевидно: наличие в составе всех ТБ1-белков консервативных последовательностей, характерных для НТФ-зависимых хеликаз (Gorbalenya et. al., 1988), НТФ- и РНК-связывающие свойства (Rouleau et al., 1994; Bleykasten et al., 1996; Kalinina et al., 1996; Donald et al., 1997). В то же время все ТБ1-белки могут быть

разделены на две группы: белки массой порядка 25 кДа в случае потеке- и карлавирусов, с одной стороны, и примерно в два раза превосходящие их по массе ТБ1-белки гордеи- и фуровирусов (Bleykasten et al., 1996). Анализ аминокислотных последовательностей ТБ1 -белков показывает значительное сходство их С-концевых областей (Solovyev et al., 1996). Вариабельный N-концевой район ТБ1 фуро-и гордеивирусов, т. н. "N-концевое удлинение" (Bleykasten et al., 1996; Solovyev et al., 1996), не имеет аналога в структуре ТБ1 потеке- и карлавирусов. Solovyev et al. (1996) отметили, что N-концевое удлинение ТБ1 гордеивируса ВШМЯ содержит кластеры положительно заряженных аминокислот, и предположили, что эти последовательности участвуют в РНК-связывании. Это предположение не противоречит результатам Donald et al., (1997), согласно которым множественные РНК-связывающие сайты распределены по всей молекуле ТБ1 ВШМЯ, в том числе в пределах N-концевого удлинения. В случае ТБ1 фуровируса ВНПЖС единственный РНК-связывающий сайт также расположен в пределах N-концевого удлинения (аминокислоты 224), причем удаление 75% С-концевых аминокислот не оказывает влияние на РНК-связывающие свойства мутантного белка (Bleykasten et al., 1996). Это позволяет предположить, что N-концевое удлинение ТБ1-белков представляет собой самостоятельный функциональный домен, ответственный за прочное взаимодействие белка с РНК.

У ТБ1 ХВК можно выделить два функциональных домена (Morozov et al., 1999). N-концевой (не являющийся аналогом N-концевого удлинения гордеи- и фуровирусов) домен отвечает за гидролиз НТФ и связывание РНК (Morozov et al., 1999), причем эти функции не только не подавляются, но даже стимулируются делециями С-концевых областей ТБ1. С-концевые делеции также не влияют на внутриклеточное распределение ТБ1 ХВК (Morozov et al., 1999) и на межклеточный транспорт ТБ1 ВМБК (Lough et al., 1998). По мнению Morozov et al. (1999), основная роль С-концевой области ТБ1 ХВК - взаимодействие с другими вирусными белками, например со вторым и третьим белками ТБГ.

Белки, кодируемые второй и третьей ОРТ ТГБ.

Как упоминалось выше, для осуществления межклеточного транспорта всех ТГБ-содержащих вирусов необходимы также белки ТБ2 и ТБЗ (Beck et al., 1991; Gilmer et al., 1992; Lough et al., 1998; Erhardt et al., 1999). Эти белки содержат кластеры гидрофобных аминокислот, характерные для трансмембранных белков (Morozov et al., 1987, 1989). ТБ2-белки гордеи-, фуро-, потеке- и карлавирусов содержат два блока гидрофобных аминокислот, разделенных центральным высококонсервативным гидрофильным районом (Morozov et al., 1989; Solovyev et al., 1996). ТБЗ-белки распадаются на две группы: в случае потеке- и карлавирусов ТБЗ-белки содержат один, а у гордеивирусов - два трансмембранных домена (см. Solovyev et. al., 2000), ТБЗ-белок фуровируса ВНПЖС не может быть отнесен ни к одной из этих групп (Solovyev et. al., 2000).

Показано, что ТБ2 и ТБЗ из зараженных растений выделяются вместе с фракциями мембран и клеточных стенок (Niesbach-Klosgen et al., 1990; Donald et al., 1993; Hefferon et al., 1997; см. Solovyev et al., 2000). Интересно, что ТБЗ гордеивируса, локализующийся в мембранных структурах в области клеточной стенки, способствует также транспорту в эти районы белка ТБ2 (Solovyev et al., 2000). Аналогичные результаты были получены в системах ТБЗ гордеивируса + ТБ2 потексвируса или наоборот, ТБЗ потексвируса + ТБ2 гордеивируса. Это говорит о том, что специфические белок-белковые взаимодействия не требуются для совместного транспорта ТБ2 и ТБЗ. По—видимому, в структуре ТБЗ есть сигнал транспорта в плазматическую мембрану. В результате совместной трансляции, а следовательно, встраивания новосинтезированных белков ТБ2 и ТБЗ в одни и те же участки эндоплазматических мембран транспортные везикулы, содержащие ТБЗ белок, будут неизбежно содержать также и ТБ2. Авторы предполагают, что совместный транспорт ТБ2 и ТБЗ в область цитоплазматической мембраны является следствием подобного "соседства" двух белков (Solovyev et al., 2000). Необходимо также отметить, что, в отличие от ТБ1-белков и ТБ ВТМ, белки ТБ2 и ТБЗ не транслоцируются в соседние клетки в ходе межклеточного транспорта (Lough et al., 1998, 2000).

В то же время успех межклеточного вирусного транспорта зависит ОТ' неких специфических взаимодействий между всеми тремя белками ТГБ. На это указывают результаты экспериментов по комплементации ТБ-белков одного вируса соответствующими белками другого (Lauber et al., 1998; Morozov et al., 1999; Solovyev et al., 1999). Так, замена всего комплекса ТГБ гордеивируса ВШМЯ на ТГБ другого гордеивируса не лишала гибридный вирус инфекционности (Solovyev et al., 1999); аналогичным образом сохранял инфекционность химерный фуровирус ВНПЖС, несущий все три гена ТГБ другого фуровируса (Lauber et al., 1998). С другой стороны, "смешанные" ТГБ во многих случаях оказываются нефункциональными, видимо, из-за того, что ТГБ-белки различных (зачастую близкородственных) вирусов не способны к специфическим взаимодействиям друг с другом (Lauber et al., 1998; Morozov et al., 1999; Solovyev et al., 1999).

Роль белка оболочки в межклеточном транспорте ТГБ-содержащих вирусов; транспортная форма потексвирусов.

Все вирусы с ТГБ могут быть условно разделены на две группы (Lough et al., 2000). В первую группу входят вирусы гордеи-и фуровирусы, межклеточный транспорт которых не зависит от белка оболочки. Показано, что гордеивирус ВШМЯ с дефектным БО по инфекционности не отличается от дикого типа (Petty & Jackson, 1990). Также не требуется белок оболочки для межклеточного транспорта фуровируса ВНПЖС (Gilmer et al., 1992; Schmitt et al., 1992). Нетрудно заметить, что БО-независимым является ближний транспорт ТГБ-содержащих вирусов, обладающих крупными ТБ1-белками с N-концевым удлинением. Известно, что ТГБ1 гордеивируса ВШМЯ in vivo связан с неинкапсидированной вирусной РНК (Brakke et al., 1988); это позволяет предположить, что транспортной формой гордеивируса является именно комплекс РНК с ТБ1. Подобная транспортная форма предполагается и для фуровируса (Lauber et al., 1998). Любопытно, что транспортная форма, отличная от вирионов, по-видимому, существует у большинства палочковидных вирусов (Saito et al., 1990; Petty & Jackson, 1990; Schmitt et al., 1992). Их вирусные частицы, в силу собственной жесткости, скорее всего, не способны транспортироваться через плазмодесменные канальцы, не отличающиеся идеальной прямизной (см. рис. 1).

Представителями второй группы являются потексвирусы, межклеточный транспорт которых полностью ингибируется в отсутствие белка оболочки (Chapman et al., 1992; Forster et al., 1992). Роль белка оболочки в транспорте потексвирусов остается предметом дискуссий. Известно, что БО потексвирусов в ходе вирусной инфекции обнаруживаются в области плазмодесм инфицированных клеток (Rouleau et al., 1995). Однако в трансгенных по БО ХВК (т.е. в отсутствие других вирусспецифических белков) растениях белок оболочки не проявляет сродства к плазмодесмам (Oparka et al., 1996); показано также, что БО ХВК не способен влиять на SEL плазмодесм (Santa Cruz et al., 1998). Охарактеризованы мутации белков оболочки ХВК и ВМБК, блокирующие межклеточный транспорт вирусов, но не влияющие на сборку вирионов (Rouleau et al., 1995; Lough et al., 2000); по-видимому, образование вирусных частиц является не единственной функцией БО потексвирусов. Предполагается, что в ходе инфекции белок оболочки ХВК взаимодействует с другими вирусспецифическими белками, в частности, с ТБ1 ХВК. Так, экспериментально показано взаимодействие ТБ1 ХВК с БО ХВК in vitro (Калинина, неопубликованные данные).

Существуют две точки зрения на природу транспортной формы потексвирусов. По мнению Lough et al. (1998, 2000), в межклеточном транспорте потексвируса ВМБК участвуют отличные от вирионов вирусные рибонуклеопротеидные комплексы (вРППК), в состав которых входят вирусная РНК, белок оболочки и ТБ1-белок. В пользу этой гипотезы свидетельствуют данные о том, что в трансгенных по ТБ-белкам и белку оболочки растениях транспорт соответствующего мутанта ВМБК эффективно комплементируется, несмотря на очень низкий уровень аккумуляции в клетках вирусных частиц (Lough et al., 2000). В соответствии с альтернативной точкой зрения, транспортной формой потексвирусов являются именно вирусные частицы (Santa Cruz et al., 1998). Известно, например, что мутации БО ХВК, подавляющие сборку вирионов, ингибируют и транспорт инфекции в соседние клетки (Chapman et al., 1992). Santa

Cruz et al. (1998) продемонстрировали, что специфические фибриллярные структуры, обнаруживаемые в плазмодесмах инфицированных ХВК растений, реагируют с антисывороткой, специфичной по отношению к вирусным частицам ХВК (но не к БО ХВК) (Santa Cruz et al., 1998). Нельзя, однако, исключить вероятность того, что в при сборке гипотетических вРНПК (Lough et al., 1998) формируются те же антигенные детерминанты, что и на поверхности вирусных частиц. Возможно также, что разные представители рода Potexvirus (в данном случае - ВМБК и ХВК) используют различные транспортные РНП для транслокации собственных геномов через плазмодесмы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали следующие химические реактивы: бромистый этидий, бромфеноловый синий производства фирмы "Serva", (ФРГ). Агароза, легкоплавкая агароза, акриламид, N,N'-метиленбисакриламид, дитиотреитол, ß-меркаптоэтанол, глицин, кумасси бриллиантовый синий, додецилсульфат натрия (ДСН), мочевина, гуанидин-HCl, Ы^К'^'-тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), RbCl, СаС12, LiCl, Трис, - фирм "Promega", "Sigma", (США). ИПТГ, канамицин, ампициллин - фирмы "ICN" (США). MgCl2, Na2HP04, NaH2P04, NaCl и NaOH - фирмы "Merck", (ФРГ). Бактоагар, бактотриптон и дрожжевой экстракт - фирмы "Difco", (США). NTPs, dNTPs, "Pharmacia", (Швеция). Ni21-нитрилотриацетатная (Ni-HTA) агароза - фирмы "QIAGEN" (Германия/США). Прочие реактивы использовались только квалификации "осч". В работе использовали буферы для рестрикции и транскрипции фирм "Promega", (США) и "Ферментас", (Литва).

В работе также использовали следующие радиоактивные соединения: [Ь-14С]-белковый гидролизат фирмы "OVVR" (Чехословакия) с удельной активностью 40-50 Ки/мМ; [а-32Р]-УТФ (удельная активность

3000 Ки/мМ), [у- Р]-АТФ (удельная активность 1000 Ки/мМ) производства г. Обнинск, а также [у-ЛР]-АТФ (удельная активность 5000 Ки/мМ) и [Ь-ъ8]-метионин (1200 Ки/мМ) фирмы "Amersham", (Великобритания).

В работе использовали следующие ферменты: РНК полимераза фага Т7, ингибитор РНКаз (RNasin), РНКаза А, Т4-ДНК-лигаза производства фирмы "Promega", (США); рестриктазы EcoRI, HindIII, Pstl, BamHI - производства "Ферментас" (Литва), и Сибэнзим (Россия).

Выделение плазмидной ДНК.

Бактериальный клон высевали в 2-3 мл бульона 2xYT, содержавшего ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, и выращивали в течение ночи при 37°С в режиме 180 качаний/мин. Клетки осаждали центрифугированием на максимальной скорости в настольной центрифуге Eppendorf (30", 14000 об/мин); при последующих манипуляциях использовали эту же центрифугу. Осадок ресуспендировали в 200 мкл раствора I (50 мМ глюкоза, 10 мМ ЭДТА, 25 мМ Трис-HCl, pH 8.0), инкубировали на столе 5 мин. и добавляли 400 мкл охлажденного во льду раствора II (0.2 М NaOH, 1% ДСН), осторожно перемешивали и выдерживали 5 мин. во льду. К лизату клеток добавляли 250 мкл раствора III (3 М ацетат калия, pH 4.8), инкубировали во льду 5-10 мин. и центрифугировали (5 мин., 14000 об/мин). Супернатант переносили в новые пробирки, добавляли 400 мкл 40% (вес/вес) ПЭГа (Мг=6000}, инкубировали во льду 30 мин и центрифугировали (5 мин., 14000 об/мин). Осадок растворяли в 100 мкл воды, добавляли 100 мкл насыщенного раствора ацетата аммония, инкубировали 15 мин при -70°С и центрифугировали (5 мин., 14000 об/мин). Супернатант переносили в новые пробирки, добавляли 200 мкл изопропилового спирта и центрифугировали (10 мин., 14000 об/мин). Осадок ДНК дважды промывали 75% этанолом, подсушивали при +37°С и растворяли в 20 мкл тридистиллированной воды.

Рестрикция ДНК.

Рестрикцию проводили при +37°С в течение 1.5-2 часов в 20100 мкл реакционной смеси, содержащей 1-10 мкг ДНК.

Транскрипция in vitro.

Реакцию транскрипции проводили с применением реактивов и ферментов производства компании "Promega", США. В качестве матрицы использовали плазмиду со вставкой, находящейся под контролем промотора транскрипции бактериофага Т7. Для получения транскрипта нужной длины, плазмидную ДНК расщепляли соответствующими рестриктазами. Стандартная проба содержала: 4 мкл 5-кратного реакционного буфера (Promega), 2 мкл раствора рибонуклеозидтрифосфатов (25 мМ каждого из НТФ), от 0.2 до 1 мкг линеаризованной плазмидной ДНК, 20 ед. активности РНКазина и 20 ед. активности Т7-РНК-полимеразы. Объем доводили до 20 мкл тридистиллированной или milli-Q водой. Реакционную смесь инкубировали при +37°С в течение 1-3 часов. Транскрипт выделяли из реакционной смеси осаждением 2 М LiCl при 4°С, осадок промывали 70% этанолом и растворяли в тридистиллированной воде.

Другая методика предусматривала использование свободной от РНКазной активности ДНКазы (Promega). После 60-минутной инкубации (см. выше) в реакционную смесь добавляли ДНКазу из расчета 1 ед. фермента на 1 мкг плазмидной ДНК и дополнительно инкубировали 15-20 минут при +37°С. Далее смесь обрабатывали равным объемом раствора фенола в хлороформе и переосаждали 3 объемами этанола и 1/10 объема 3 М ацетата натрия.

32 Р]-меченные РНК-транскрипты получали по аналогичной методике, добавляя в транскрипционную смесь 50 мкКи (а-'2Р]-УТФ (при недостатке "холодного" УТФ). Затем меченые транскрипты очищали от рибонуклеозидтрифосфатов гель-фильтрацией на сорбенте Sephadex G-50 ("Pharmacia", Швеция) или на колонках "Micro Bio-Spin" ("Bio-Rad"). Размер и гомогенность полученных транскриптом анализировали в агарозном геле с последующей радиоавтографией.

Выделение препарата Х-вируса картофеля.

Листья зараженных ХВК (спустя 25-30 дней после заражения) растений Datura stramonium замороживали на -20°С, после чего гомогенизировали с помощью ножевого гомогенизатора в буфере, содержащем 0.3 М глицин-КОН, 1% Na2S03, рН 7.5. После гомогенизации отжатый через марлю сок осветляли при 12000 об./мин., 30 мин. (роторы JA-20, 17). К осветленному соку добавляли тритон Х-100 до конечной концентрации 1% и выдерживали в течение 20 мин., после чего добавляли ПЭГ (Мг 6000) до конечной концентрации 5% и NaCI до конечной концентрации 0.2 М, после растворения компонентов раствор выдерживали в течение 2 час. при +4°С. Образовавшийся осадок вируса отделяли центрифугированием при 10 TbIC.g.

В течение 15 мин. осадок экстрагировали дважды - 0.2 М цитратным буфером, рН 7.5 и 0.025 М Трис-HCl, рН 8.0. Полученный экстракт осветляли центрифугированием при 10 тыс. g в течение 20 мин. Осветленный раствор вируса ультрацентрифугировали в роторе Ti-60 при 35000 об./мин. в течение 90 мин. Полученный осадок растворяли в 0.025 М Трис-HCl рН 8.0. Второй цикл дифференциального центрифугирования проводили с использованием составной сахарозно-цезиевой подушки (20 и 22% соответственно по 2 мл) в роторе Ti 50 при 40000 об./мин. в течение 2.5 часов. Вирусный осадок растворяли в 0.025 Трис-HCl буфере, рН 8.0. Выделенный таким образом препарат вируса при электрофорезе в денатурирующем Г1ААГ содержал преимущественно полноразмерную Реформу (Koenig et al., 1978) белка оболочки ХВК.

Альтернативный метод с использованием в качестве экстрагирующего буфера 0.1 M фосфатного буфера, рН 7.5 с 1% Na2S03 и осветлением сока эмульгированием с хлороформом показал худшие результаты (увеличение доли процессированных Pi и Ргформ БО ХВК (Koenig et al., 1978)) по сравнению с первым методом.

Экспрессия рекомбинантных белков.

В работе использовали клоны E.coli штамма M15, экспрессирующих рекомбинантные (Гис)6 белки ТБ ВТМ и ТБ1 ХВК. Штамм-суперпродуцент рекомбинантного ТБ ВТМ был предоставлен лабораторией Ю.Л. Дорохова; штамм, экспрессирующий рекомбинантный ТБ1 ХВК, был получен в лаборатории С.Ю. Морозова. Каждый клон содержал высококопийную репрессорную плазмиду pREP-4, несущую ген устойчивости к канамицину, и экспрессирующую конструкцию на основе плазмидного вектора pQE, содержащую ген устойчивости к ампициллину. Каждая конструкция содержала полную копию гена транспортного белка, находящуюся под контролем промотора бактериофага Т5 E.coli. К 5'-концам открытых рамок считывания всех трех генов были присоединены последовательности (САТСАС)з, кодирующие 6 гистидиновых остатков.

Клоны выращивали в течение ночи в небольшом объеме (3 мл) культуральной среды 2xYT, содержащей 100 м кг/мл ампициллина и 25 мкг/мл канамицина, при +37°С. Часть ночной культуры переносили в стерильную колбу с большим объемом культуральной среды (100-200 мл) и выращивали при +37°С до OD6oo 0.8-0.9. Индукцию экспрессии клонированных генов проводили с помощью ИПТГ (конечная концентрация 1-2 мМ). Культуру растили дополнительно 3-5 часов при +37 С. Клетки о отделяли от культуральной среды центрифугированием при +4 С (5000 об./мин, 10 мин., ротор J-20).

Хроматографическая очистка (Гис)б-рекомбинантных белков на №2+-нитрилотриацетатной агарозе

Хроматографию (Гис)6-белков проводили согласно протоколу "The QIAexpressionist" фирмы "QIAGEN" с некоторыми изменениями. Осажденные центрифугированием клетки ресуспендировали в лизис-буфере А (6 М гуанидин-НС1; 0.1 М NaH2P04; 0.01 М трис-НС1 - рН 8.0). Брали 5 мл буфера А на 1 г клеток E.coli. Клетки лизировали, встряхивая суспензию при комнатной температуре в течение 1 часа. Клеточные лизаты центрифугировали (10000 об./мин., 15 мин., ротор J-20) и наносили супернатант на предварительно уравновешенную буфером А колонку с Ni-HTA агарозой (1.6x8.5 см, V=17 мл). Далее колонку промывали последовательно (по 10 мл) буфером А, затем буфером В (8М мочевина; 0.1 М NaH2P04; 0.01 М трис-НС1 - рН 8.0), буфером С (аналогичного состава, рН 6.3), буфером D (аналогичного состава, рН 5.9) и буфером Е (аналогичного состава, рН 4.0), собирая фракции по 0.5-1.5 мл. Наиболее прочно связанные с сорбентом белки элюировали буфером F (8 М мочевина, 0.2 М уксусная кислота). Состав полученных фракций анализировали в денатурирующем ПААГ по Лэммли (Laemmly, 1970).

Выделение препаратов различных фракций из гомогената листьев NЛаЬасит и N.яЫйпоБа.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Козловский, Станислав Владимирович

выводы

1. Методом иммуноэлектронной микроскопии показано, что молекулы ТБ1 Х-вируса картофеля взаимодействуют селективно с одним из концов нитевидной частицы ХВК (предположительно соответствующим 5'- концу РНК).

2. Взаимодействие ТБ1 ХВК с вирионами in vitro сопровождается конверсией РНК ХВК в полностью транслируемую форму; при этом эффективность трансляции инкапсидированной РНК ХВК зависит от молярного соотношения ХВК:ТБ 1 и максимальна при соотношении 1:100.

3. Результаты опытов по трансляции вирионной РНК ХВК при низких молярных соотношениях вирус : ТБ1 ив течение разного времени свидетельствуют о том, что: (i) взаимодействие ТБ1 с ХВК является обратимым; (ii) некий компонент ББС участвует в трансляционной активации ХВК молекулами ТБ1.

4. Альтернативным методом трансляционной активации инкапсидированной РНК ХВК является фосфорилирование БО ХВК. Продемонстрировано, что фосфорилирование БО ХВК влияет на антигенные свойства белка, по-видимому, вследствие происходящих в молекулах БО конформационных изменений.

5. Установлено, что фосфорилирование транспортного белка вируса табачной мозаики делает ТБ ВТМ неспособным подавлять трансляцию in vitro, несмотря на сохранение у фосфорилированного белка РНК-связывающей активности.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Козловский, Станислав Владимирович, 2000 год

1. Сингер, М., Берг, П. Гены и геномы. М., Мир, 1998, т. 1.

2. Тальянский, М.Э. (1984). Молекулярно-биологические основы взаимодействий между вирусами растений. Докторская диссертация.

3. Эзау, К. Анатомия семенных растений. М., Мир, 1980, т. 1.

4. Angell, S.M., Davies, C., Baulcombe, D.C. (1996). Cell-to-cell movement of potato virus X is associated with a change in the size-exclusion limit of plasmodesmata in trichome cells of Nicotiana clevelandii. Virology, 216, 197-201.

5. Atkins, D., Hull, R., Wells, B., Roberts, K., Moore, P., Beachy, R.N. (1991a). The tobacco mosaic virus 30K movement in transgenic tobacco plants is localized to plasmodesmata. Journal of General Virology, 72,209-211.

6. Atkins, D., Roberts, K., Hull, R., Prehaud, C., Bishop, D.H. (1991b). Expression of the tobacco mosaic virus movement protein using a baculovirus expression vector. Journal of General Virology, 72, 2831-2835.

7. Beck, D.L., Guilford, P.J., Voot, D.M., Andersen, M.T., Forster, R.L. (1991). Triple gene block proteins of white clover mosaic potexvirus are required for transport. Virology, 183, 695-702.

8. Bleycasten, C., Gilmer, D., Richards, K.E., Jonard, G. (1996). Beet necrotic yellow vein virus 42kDa triple gene block protein binds nucleic acid in vitro. Journal of General Virology, 77, 889-897.

9. Boyko, V., Ferralli, J., Heinlein, M. (2000). Cell-to-cell movement of TMV RNA is temperature-dependent and corresponds to the association of movement protein with microtubules. Plant Journal, 22, 315-325.

10. Brakke, M.K., Ball, E.M., Langenberg, W.G. (1988). A non-capsid protein associated with unencapsidated virus RNA in barley infected with barley stripe mosaic virus. Journal of General Virology, 69, 481-491.

11. Brill, L.M., Nunn, R.S., Kahn, T.W., Yeager, M., Beachy, R.N. (2000). Recombinant tobacco mosaic virus movement protein is an

12. RNA-binding, alpha-helical membrane protein. PNAS USA, 97, 7112-7117.

13. Carrington, J., Kasschau, K., Mahajan, S., Schaad, M. (1996). Cell-to-cell and long distance transport of viruses in plants. Plant Cell, 8, 1669-1681.

14. Corbau, R., Salom, N., Rommelaere, J., Nuesch, J.P. (1999). Phosphorylation of the viral nonstructural protein NS1 during MVMp infection of A9 cells. Virology, 259, 402-415.

15. Chang, B.Y., Lin, N.S., Liou, D.Y., Chen, J.P., Liou, G.G., Hsu, Y.H. (1997). Subcellular localization of the 28 kDa protein of the triple-gene-block of bamboo mosaic potexvirus. Journal of General Virology, 78, 1175-1179.

16. Chapman, S., Hills, G., Watts, J., Baulcombe, D. (1992). Mutational analysis of the coat protein gene of potato virus X: effects on virion morphology and viral pathogenicity. Virology, 191, 223-230.

17. Chen, M.H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A.K., Citovsky, V. (2000). Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement. EMBO Journal, 19, 913-920.

18. Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., Zambryski, P. (1990). The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein. Cell, 60, 637-647.

19. Citovsky, V., Wong, M.L., Shaw, A., Venkataram Prasad, B.V., Zambryski, P. (1992). Visualization and characterization of tobacco mosaic virus movement protein binding to single-strandednucleic acids. Plant Cell, 4, 397-411.

20. Citovsky, V., McLean, B.G., Zupan, J.R., Zambryski, P. (1993). Phosphorylation of tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein by a developmentally regulated plant cell wall-associated protein kinase. Genes Dev., 7, 904-910.

21. Crawford, K.M, and Zambryski, P.C. (1999). Plasmodesmata signaling: many roles, sophisticated statutes. Curr. Opin. in Plant Biol., 2, 382-387.

22. Cronin, S., Verchot, J., Halderman-Cahill, R., Schaad, M.C., Carrington, J.C. (1995). Long-distance movement factor: a transport function of the potyvirus helper component proteinase. Plant Cell, 7, 549-559.

23. Culver, J.N., Lehto, K., Close, S.M., Hilf, M.E., Dawson, W.O. (1993). Genomic position affects the expression of tobacco mosaic virus movement and coat protein genes. PNAS USA, 90, 20552059.

24. Danon, A., and Mayfield, S.P. (1994). ADP-dependent phosphorylation regulates RNA-binding in vitro: implications in light-modulated translation. EMBO Journal, 13, 2227-2235.

25. Davies, C., Hills, G., Baulcombe, D.C. (1993). Subcellular localization of the 25-kDa protein encoded in the triple gene block of potato virus X. Virology, 197, 166-175.

26. Deom, C.M., Oliver, M.I., Beachy, R.N. (1987). The 30KDa gene product of tobacco mosaic virus potentiates virus movement. Science, 237, 389-394.

27. Deom, C.M., Shubert, K.R., Wolf, S., Holt, C.A., Lucas, W.J., Beachy, R.N. (1990). Molecular characterisation and biological function of the movement protein of tobacco mosaic virus in trasgenic plants. Biochemistry, 87, 3284-3288.

28. Derrick, P.M., Barker, H., Oparka, K.J. (1992). Increase in plasmodesmal permability during cell-to-cell spread of tobacco rattle tobravirus from individually inoculated cells. Plant Cell, 4, 915-928.

29. Ding, B., Haudenshield, J.S., Hull, R.J., Wolf, S., Beachy, R.N., Lucas, W.J. (1992). Secondary plasmodesmata are specific sites of localisation of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants. Plant Cell, 4, 915-928.

30. Ding, B., Li, Q., Nguyen, L., Palukaitis, P., Lucas, W.J. (1995). Cucumber mosaic virus 3 a protein potentiates cell-to-cell trafficking of CMV RNA in tobacco plants. Virology, 207, 345353.

31. Ding, B., and Lucas, W.J. (1996). Secondary plasmodesmata: biogenesis special functions and evolution. In M Smallwood, P Knox, D Bowles, eds, Membranes: Specialised Functions in Plants. BIOS Scientific Publishers Inc., Oxford, UK, 489-506.

32. Ding, B., Kwon, M.O., Warnberg, L. (1996). Evidence that actin filaments are involved in controlling the permeability of plasmodesmata in tobacco mesophyll. Plant Journal, 10, 157-164.

33. Dolja, V.V., Haldeman-Cahill, R., Montgomery, A.E., Vandenbosch, K.A., Carrington, J.C. (1995). Capsid proteindeterminants involved in cell-to-cell and long distance movement of tobacco etch poty virus. Virology, 206, 1007-1016.

34. Donald, R.G., Zhou, H., Jackson, A.O. (1993). Serological analysis of barley stripe mosaic virus-encoded proteins in infected barley. Virology, 195, 659-668.

35. Donald, R.G.K., Lawrence, D.M., Jackson, A.O. (1997). The barley stripe mosaic virus 58-kilodalton pb protein is a multifunctional RNA binding protein. Journal of Virology, 71, 1538-1546.

36. Dunigan, D.D., Madlener, J.C. (1995). Serine/threonine protein phosphatase is required for tobacco mosaic virus-mediated programmed cell death. Virology, 207, 460-466.

37. Epel, B.L., Padgett, H.S., Heinlein, M., Beachy, R.N. (1996). Plant virus movement protein dynamics probed with a GFP-protein fusion. Gene, 173, 75-79.

38. Erhardt, M., Stussi-Garaud, C., Guilley, H., Richards, K.E., Jonard, G., Bouzoubaa, S. (1999). The first triple gene block protein of peanut clump virus localizes to the plasmodesmata during virus infection. Virology, 264, 220-229.

39. Erhardt, M., Morant, M., Ritzenthaler, C., Stussi-Garaud, C.,

40. Forster, R.L.S., Bevan, M.W., Harbison, S.-A., Gardner, R.C. (1988). The complete nucleotide sequence of the potexvirus white clover mosaic virus. Nucleic Acids Res. 16, 291-303.

41. Forster, R.L., Beck, D.L., Guilford, P.J., Voot, D.M., Van Dolleweerd, C.J., Andersen, M.T. (1992). The coat protein of white clover mosaic potexvirus has a role in facilitating cell-to-cell transport in plants. Virology, 797,480-484.

42. Gilmer, D., Bouzoubaa, S., Hehn, A., Guilley, H., Richards, K., Jonard, G. (1992). Efficient cell-to-cell movement of beet necrotic yellow vein virus requires 3' proximal genes located on RNA 2. Virology, 189, 40-47.

43. Gupta, A.K., Blondel, D., Choudhary, S., Banerjee, A.K. (2000). The phosphoprotein of rabies virus is phosphorylated by a unique cellular protein kinase and specific isomers of protein kinase C. Journal of Virology, 74, 91-98.

44. Haley, A., Hunter, T., Kiberstis, P., Zimmern, D. (1995). Multiple serine phosphorylation sites on the 30 kDa TMV cell-to-cell movement protein synthesized in tobacco protoplasts. Plant Journal, 8, 715-724.

45. Hauber, J., Bouvier, M., Malim, M.H., Cullen, B.R. (1988). Phosphorylation of the rev gene product of human immunodeficiency virus type 1. Journal of Virology, 62, 48014804.

46. Hardie, D.G. (1999). Plant protein serine/threonine kinases: classification and functions. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol, 50, 97-131.

47. Hefferon, K. L., Doyle, S., AbouHaidar, M. G. (1997). Immunological detection of the 8K protein of potato virus X (PVX) in cell walls of PVX-infected tobacco and transgenic potato. Arch. Virol., 142, 425-433.

48. Heinlein, M., Epel, B.L., Padgett, H.S., Beachy, R.N. (1995). Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science, 270, 1983-1985.

49. Hu, C.J., Kato, A., Bowman, M.C., Kiyotani, K., Yoshida, T., Moyer, S.A., Nagai, Y., Gupta, K.C. (1999). Role of primaryconstitutive phosphorylation of Sendai virus P and V proteins in viral replication and pathogenesis. Virology, 263, 195-208.

50. Hughes, R., Perbal, M.-C., Maule, M., Hull, R. (1995). Evidence for proteolytic processing of tobacco mosaic virus movement protein in Arabidopsis thaliana. Mol. Plant-Micr. Int., 8, 658-665.

51. Huisman, M.J., Linthorst, H.J., Bol, J.F., Cornelissen, J.C. (1988). The complete nucleotide sequence of potato virus X and its homologies at the amino acid level with various plus-stranded RNA viruses. Journal of General Virology, 69, 1789-1798.

52. Jockush, H. (1968). Two mutants of tobacco mosaic virus temperature sensitive in two different functions. Virology, 35, 94101.

53. Kadare, G., David, C., Haenni, A., (1996). ATPase, GTPase, and RNA binding activities associated with the 206 Kda protein of turnip yellow mosaic virus. Journal of Virology, 70, 8169-8174.

54. Kaplan, I.B., Shintaku, M.H., Li, Q., Zhang, L., Marsh, L.E., Palukaitis, P (1995). Complementation of movement defective mutants in transgenic tobacco expressing the cucumber mosaic virus movement gene. Virology, 209, 188-199.

55. Kalinina, N.O., Fedorkin, O.N., Samuilova, O.V., Maiss, E., Korpela, T., Morozov, S.Yu., Atabekov, J.G. (1996). Expression and biochemical analyses of the recombinant potato virus X 25K movement protein. FEBS Letters, 397, 75-78.

56. Kaplan, I., Zhang, L, Palukaitis, P. (1998). Characterization of cucumber mosaic virus. V. Cell-to-cell movement requires capsidprotein but not virions. Virology, 246, 221-231.

57. Karpova, O.V., Ivanov, K.I., Rodionova, N.P., Dorokhov, Yu.L., Atabekov, I.G. (1997). Nontranslatability and dissimilar behavior in plants and protoplasts of viral RNA and movement protein complexes formed in vitro. Virology, 230, 11-21.

58. Koenig, R., Stegemann, H., Francksen, H., Paul, H.L. (1970). Protein subunits in the potato virus X group. Determination of the molecular weights by polyacrylamide electrophoresis. Biochim. Biophys. Acta, 207, 184-189.

59. Koenig, R, Tremaine, J.H., Shepard, J.F. (1978). In situ degradation of the protein chain of potato virus X at the N- and C-termini. Journal of General Virology, 38, 329-337.

60. Kohl, A., di Bartolo, V., Bouloy, M. (1999). The Rift Valley fever virus nonstructural protein NSs is phosphorylated at serine residues located in casein kinase II consensus motifs in the carboxy-terminus. Virology, 263, 517-525.

61. Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 277, 680-685.

62. Lehto, K., Bubric, P., Dawson, W.O. (1990) Time course of TMV 30K protein accumulation in intact leaves. Virology, 174, 290-293.

63. Leis, J., Johnson, S., Collins, L.S., Traugh, J.A. (1984). Effects of phosphorylation of avian retrovirus nucleocapsid protein ppl2 on binding of viral RNA. J. Biol. Chem., 259, 7726-7732.

64. Leonard, D.L.; Zaitlin, M (1982). A temperature-sensitive strain of tobacco mosaic virus defective in cell-to-cell movement generates an altered viral-coded protein. Virology, 117, 416-424.

65. Li, Q., Palukaitis, P. (1996) Comparison of the nucleic acid- and NTP-binding properties of the movement protein of cucumber mosaic cucumovirus and tobacco mosaic tobamovirus. Virology, 216, 71-79.

66. Lisitsky, I., and Schuster, G. (1995). Phosphorylation of a chloroplast RNA-binding protein changes its affinity to RNA. Nucl. Acids Res., 23, 2506-2511.

67. Lucas, W., Ding, B., Van der Schoot, C. (1993). Plasmodesmata and the supracellulas nature of plants. New Phytol, 125, 435-476.

68. Lucas, W., Bousche-Pillon, S., Jackson, D.P., Nguyen, L., Baker, L., Ding, B., Hake, S. (1995). Selective trafficking of KNOTTED 1 homeodomain protein and its mRNA through plasmodesmata. Science, 270, 1980-1983.

69. Malyshenko, S.I., Kondakova, O.A., Taliansky, M.E., Atabekov, I.G. (1989). Plant virus transport function: complementation by helper virus is non-specific. Journal of General Virology, 70, 2751 -2757.

70. Mas, P., and Beachy, R.N. (1998). Distribution of TMV movement protein in single living protoplasts immobilized in agarose. Plant Journal, 15, 835-842.

71. Mas, P., and Beachy, R.N. (1999). Replication of tobacco mosaic virus on endoplasmic reticulum and role of the cytoskeleton and virus movement protein in intracellular distribution of viral RNA. J. Cell Biol, 147, 945-958.

72. McLean, B., Zupan, J., Zambryski, P. (1995). Tobacco mosaic virus movement protein associates with cyto skeleton in tobacco cells. Plant Cell, 7, 2101-2114.

73. Meshi, T., Ohno, T., Okada, Y. (1982). Nucleotide sequence and its character of cistron coding for the 30K protein of tobacco mosaicvirus. J. Biochemistry, 91, 1441-1444.

74. Meshi, T., Watanabe, Y., Saito, T., Maeda, T., Okada, Y. (1987). Function of the 30Kd protein of tobacco mosaic virus :involvment into cell-to-cell movement and dispensability for replication. EMBO Journal, 6, 9, 2557-2563.

75. Morozov, S.Y., Lukasheva, L.I., Chernov, B.K., Skryabin, K.G., Atabekov, J.G. (1987). Nucleotide sequence of the open reading frames adjacent to the coat protein cistron in potato virus X genome. FEBSLetters, 213, 438-442.

76. Morozov, S.Yu., Dolja, V.V., Atabekov, J.G. (1989). Probable reassortment of genomic elements among elongated RNA-containing plant viruses. J. Mol. EvoL, 29, 52-62.

77. Morozov, S.Y., Solovyev, A.G., Kalinina, N.O., Fedorkin, O.N., Samuilova, O.V., Schiemann, J., Atabekov, J.G. (1999). Evidence for two nonoverlapping functional domains in the potato virus X 25 K movement protein. Virology, 260, 55-63.

78. Napuli, A.J., Falk, B.W., Dolja, V.V. (2000). Interaction between HSP70 homolog and filamentous virions of the Beet yellows virus.1. Virology, 274, 232-239.

79. Nguen, L., Lucas, W.J., Ding, B., Zaitlin, M. (1996). Viral RNA trafficing is inhibited in replicase-mediated resistant transgenic tobacco plants. Plant virology, 93, 12643-12647.

80. Niesbach-Kloesgen, U., Guilley, H., Jonard, G., Richards, K. (1990). Immunodetection in vivo of beet necrotic yellow vein virus-encoded proteins. Virology 178, 52-61.

81. Nishiguchi, M., Motoyoshi, F., Oshima, N. (1978). Behaviour of a temperature sensitive strain of tobacco mosaic virus in tomato leaves and protoplasts. Journal of General Virology ,39, 53-61.

82. Ohno, T., Takamatsu, N., Okada, Y., Nishiguchi, M., Kino, Y. (1983). Single amino acid substitution in 30K protein of TMV defective in virus transport function. Virology, 131, 255-258.

83. Okada, K., Nagata, T., Takebe, I. (1988). Co-electroporation of rice protoplasts with RNA of cucumber mosaic and tobacco mosaic viruses. Plant cell reports, 7, 333-336.

84. Oparka, K.J., Roberts, A.G., Roberts, I.M., Prior, D.A.M., Santa Cruz, S. (1996). Viral coat protein is targeted to, but does not gate, plasmodesmata during cell-to-cell movement of potato virus X. Plant Journal, 10, 805-813.

85. Palukaitis, P., Zaitlin, M., (1986). Tobacco mosaic virus: infectivity and replication. The plant viruses, 2, 105-131.

86. Permyslov, V.V., Hagiwara, Y., Dolja, V.V. (1999). HSP70 homolog functions in cell-to cell movement of a plant virus. PNAS USA, 96, 14771- 14776.

87. Petty, I.T.D., and Jackson, A.O. (1990). Mutational analysis of barley stripe mosaic virus RNA p. Virology, 179, 712-718.

88. Pickard, В., and Beachy, R. (1999). Intercellular connections are developmentally controlled to help move molecules through the plant. Cell, 98, 5-8.

89. Pype, S., Siegers, H., Moens, L., Merlevede, W., Goris, J. (1994). Tyrosine phosphorylation of a M(r) 38,000 A/B type hnRNP protein selectively modulates its RNA binding. J. Biol. Chem., 269, 31457-31465.

90. Ratka, M., Lackmann, M., Ueckermarm, C., Karlins, U., Koch, G. (1989). Poliovirus-associated protein kinase: destabilization of the virus capsid and stimulation of the phosphorylation reaction by Zn2+. Journal of General Virology, 63, 3954-3960.

91. Reed, K.E., Gorbalenya, A.E., Rice, C.M. (1998). The NS5A/NS5 proteins of viruses from three genera of the family flaviviridae are phosphorylated by associated serine/threonine kinases. Journal of Virology, 72, 6199-6206.

92. Reichel, C., and Beachy, R. (1998). Tobacco mosaic virus infection induces severe morphological changes of the endoplasmic reticulum. PNAS USA, 95, 11169-11174.

93. Rouleau, M., Smith, R.J., Bancroft, J.B., Mackie, G.A. (1994). Purification, properties, and subcellular localization of foxtail mosaic potexvirus 26-kDa protein. Virology, 204, 254-265.

94. Rouleau, M., Smith, R.J., Bancroft, J.B., Mackie, G.A. (1995). Subcellular immunolocalization of the coat protein of two potexviruses in infected Chenopodium quinoa. Virology, 214, 314318.

95. Saito, T., Yamanaka, K., Okada, Y. (1990). Long-distance movement and viral assembly of tobacco mosaic virus mutants. Virology, 176,329-336.

96. Santa Cruz, S., Chapman, S., Roberts, A.G., Roberts, I.M., Prior, D.A.M., Oparka, K. (1996). Assembly and movement of a plant virus earring a green fluorescent protein overcoat. Plant biology, 93, 6286-6290.

97. Santa Cruz, S., Roberts, A.G., Prior, D.A.M., Chapman, S., Oparka, K.J. (1998). Cell-to-cell and phloem-mediated transport of potato virus X: the role of virions. Plant Cell, 10, 495-510.

98. Schaad, M.C., Carrington, G.C. (1996). Suppression of longdistance movement of tobacco etch virus in a nonsusceptible host. Journal of Virology, 70, 2556-2561.

99. Schmitz, I., Rao, A. (1998). Deletions in the conserved amino-terminal basic arm of cucumber mosaic virus coat protein disrupt virion assembly but do not abolish infectivity and cell-to-cell movement. Virology, 248, 323-331.

100. Seron, K., Bernasconi, L., Allet, B., Haenni, A.L. (1996). Expression of the 69K movement protein of turnip yellow mosaic virus in insect cells. Virology, 219, 274-278.

101. Skryabin, K.G., Kraev, A.S., Morozov, S.Yu., Rozanov, M.N., Chernov, B.K., Lukasheva, L.I., Atabekov, J.G. (1988). The nucleotide sequence of potato virus X RNA. Nucleic Acids Res., 16, 10929-10930.

102. Solovyev, A.G., Savenkov, E.I., Grdzelishvili, V.Z., Kalinina, N.O., Morozov, S.Yu., Schiemann, J., Atabekov, J.G. (1999).

103. Movement of hordeivirus hybrids with exchanges in the triple gene block. Virology, 253, 278-287.

104. Solovyev, A.G., Stroganova, T.A., Zamyatnin Jr., A.A., Fedorkin,

105. N., Shiemann, J., Morozov, S.Yu. (2000). Subcellular sorting of small membrane-associated triple gene block proteins: TGBp3-assistedtargeting ofTGBp2. Virology, 269, 113-127.

106. Storms, M., Kormelink, R., Peters, D., van Leht, J., Goldbach, R., (1995). The nonstructural NSm protein of tomato spotted wilt virus induces tubular structures in plant and insect cells. Virology, 214, 485-493.

107. Takebe, I., Otsuki, Y. (1969). Infection of tobacco mesophyll protoplasts by tobacco mosaic virus. PNAS USA, 64, 843-848.

108. Taliansky, M.E., Atabekova, T.I., Kaplan, I.B., Morozov, S.Yu., Malyshenko, S.I., Atabekov, I.G. (1982, a). A study of TMV ts mutant Ni2519. I. Complementation studies. Virology, 118, 301308.

109. Taliansky, M.E., Malyshenko, S.I., Pshennikova, E.S., Kaplan,

110. B., Ulanova, E.F., Atabekov, I.G. (1982, b). Plant virus specific transport function. I. Virus genetic control required for systemic spread. Virology, /22,318-326.

111. Taliansky, M.E., Malyshenko, S.I., Pshennikova, E.S., Atabekov, I.G. (1982, c). Plant virus specific transport function. II. A factor controlling virus host range. Virology, 122, 327-331.

112. Terry, B.R., Robards, A.W. (1987). Hydrodynamic radius alone governs the mobility of molecules through plasmodesmata. Planta,171, 145-157.

113. Thomas, C.L., Maule, A.J. (1995). Identification of structural domains within the cauliflower mosaic virus movement protein by scanning deletion mutagenesis and epitope tagging. Plant Cell, 7, 561-572.

114. Tomenius, K., Clapham, D., Meshi, T. (1987). Localisation of immunogold cytochemistry of the virus-coded 30K protein in plasmodesmata of leaves infected with tobacco mosaic virus. Virology, 160, 363-371.

115. Van Bel, A.J.E., and Kempers, R. (1997). The pore-plasmodesm unit: Key element in the interplay between sieve element and companion cell. Prog. Bot., 58, 277-291.

116. Waigmann, E., and Zambryski, P. (1994). Plasmodesmata: gateway for rapid informatin transfer. Curr. Biology, 4, 713-716.

117. Waigmann, E., Lucas, W. J., Citovsky, V., Zambryski, P. (1994). Direct functional assay for tobacco mosaic virus cell to cell movement protein and identification of a domain involved in increasing plasmodesmal permeability. Cell Biology, 91, 14331437.

118. Waigmann, E., Zambryski, P.(1995). Tobacco mosaic virusmovement protein-mediated protein transport between trichome cells. Plant Cell, 7, 2069-2079.

119. Waigmann, E., Chen, M.-H., Bachmaier, R., Ghoshroy, S., Citovsky, V., (2000). Regulation of plasmodesmal transport by phosphorylation of tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein. EMBO Journal, 19, 4875-4884.

120. Watanabe, Y., Ooshika, I., Meshi, T., Okada, Y. (1986). Subcellular localization of the 30K protein in TMV-inoculated tobacco protoplasts. Virology, 133, 18-24.

121. Watanabe, Y., Ogawa, T., Okada, Y. (1992). In vivo phosphorylation of the 30-kDa protein of tobacco mosaic virus. FEBS Letters, 313, 181-184.

122. Wellink, J., van Lent, J.W.M., Verver, J., Sijen, T., Goldbach, R.W., Kämmen, A. (1993). The cowpea mosaic virus M RNA-encoded 48-kilodalton protein is responsible for induction of tubular structures in protoplasts. Journal of Virology, 67, 36603664.

123. White, R.G., Badelt, K, Overall, R.L., Vesk, M. (1994). Actin associated with plasmodesmata. Protoplasma, 180, 169-184.

124. Wieszorek, A., Sanfacon, H. (1993). Characterisation and submolecular localisation of tomato ringspot nepovirus putative movement protein. Virology, 194, 734-742.

125. Wolf, S., Deom, C.M., Beachy, R.N., Lucas, W.L. (1989). Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit. Science, 246, 337-339.

126. Wong, I., Lohman, T.M. (1993). A double-filter method for nitrocellulose binding. Application to protein-nucleic acid interactions. PNAS USA, 90, 5428-5432.

127. Wung, C.-H., Hsu, Y.-H., Liou, D.-Y., Huang, W.-C., Lin, N.-S., Chang B.-Y. (1999). Identification of the RNA-binding sites of the triple gene block protein 1 of bamboo mosaic potexvirus. Journal of General Virology, 80, 1119-1126.

128. Yang, Y., Ding, B., Baulcombe, D.C., Verchot, J. (2000). Cell-to-cell movement of the 25K protein of potato virus X is regulated by three other viral proteins. Mol. Plant-Microbe Interact, 13, 599605.

129. Zimmern, D., Hunter, T. (1983). Point mutation in the 30 kD open reading frame of TMV implicated in temperature sensitive assembly and local lesion spreading of mutant Ni2519. EMBO Journal, 2, 1893-1990.

130. Zolnierowicz, S., and Bollen, M., (2000). EMBO conferense report. Protein phosphorylation and protein phosphatases. De Panne, Belgium, September 19-24, 1999. EMBO Journal, 19, 483488.