Структурно-функциональный анализ N-концевой половины белка ТБГ1 гордеивируса тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат биологических наук Макаров, Валентин Владимирович

• Макаров, Валентин Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Макаров, Валентин Владимирович

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.!.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. УЧАСТИЕ БЕЛКОВ ТРОЙНОГО БЛОКА ГЕНОВ В ПРОЦЕССАХ ТРАНСПОРТА ВИРУСОВ ПО РАСТЕНИЮ.

Общая характеристика процесса транспорта вирусов в растениях и роли транспортных белков.

Общая характеристика вирусов рода Hordeivirus.

Общая характеристика тройного блока генов.

Свойства белков ТБГ1.

Свойства белков ТБГ2.

Свойства белков ТБГЗ.

Белок-белковые взаимодействия между белками ТБГ.

Внутриклеточный и межклеточный транспорт у гордеивирусов.

II. ОСНОВНЫЕ ТИПЫ РНК-СВЯЗЫВАЮЩИХ ДОМЕНОВ.

OB домен (олигонуклеотид-связывающий домен).

КН домен (домен гомологичный белку К гяРНП).

RRM/RNP/RBD домен (мотив узнающий РНК).

Дополнительные домены, взаимодействующие с РНК.

Нативные частично или полностью неупорядоченные белки.

РНК-связывающие белки как РНК-шапероны.

Функции клеточных РНК-связывающих доменов, участвующих в образовании трансляционно неактивных мРНП (на примере CSD домена).

CSD белки как шапероны мРНК.

CSD белки как гистоны мРНК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. ДОМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКА ТБГ1 ПЛВМ.

1.1. Ограниченный протеолиз рекомбинантного белка ТБГ1 ПЛВМ в клетках Esherichia coli.

1.2. Предсказание упорядоченных и неупорядоченных участков для доменов белка ТБГ1.

1.3. Спектры кругового дихроизма делеционных мутантов белка ТБГ1.

1.4. Изучение вторичной структуры домена ID с помощью метода ИК-Фурье спектроскопии.

2. БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ДОМЕНОВ N-КОНЦЕВОЙ ПОЛОВИНЫ БЕЛКА ТБГ1.

2.1. Анализ РНК-связывающей активности NTD и ID.

2.2. Анализ олигомерных комплексов, образуемых доменами белка ТБГ1, методом ультрацентрифугирования в градиентах концентрации сахарозы.

3. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ДОМЕНОВ N-КОНЦЕВОЙ ПОЛОВИНЫ БЕЛКА ТБГ1 ПЛВМ.!.

3.1. Анализ поведения олигомерных комплексов доменов N-концевой половины белка 63К методом динамического лазерного светорассеяния (ДЛС).

3.2. Визуализация мультимерных комплексов, образуемых N63K, NTD и ID методом АСМ.

3.3. Роль РНК в формировании высокомолекулярных комплексов в препаратах внутреннего домена.

3.4. Поиск глобулярных участков в составе ID.

3.5. NTD и N63K как полностью внутренне неупорядоченные белки.

3.6. Структура ID в составе N-концевой половины ТБГ1 белка.

3.7. Изменение структуры внутреннего домена белка ТБГ1 при взаимодействии с нуклеиновыми кислотами.

3.8. Свойства ID не маскируются в составе полноразмерного белка ТБГ1.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональный анализ N-концевой половины белка ТБГ1 гордеивируса»

Процесс транспорта ряда вирусов в растениях тесно сопряжен со способностью специфических вирусных белков, обозначаемых как транспортные белки, формировать рибонуклеопротеидные (РНП) комплексы с геномными РНК. Образуемая транспортная форма взаимодействует с другими вирус-специфическими белками и белками растения-хозяина, участвующими во внутриклеточном, межклеточном, а в ряде случае и в дальнем (по проводящей системе растения) транспорте вирусного генома. РПК-связывающая активность транспорных белков является, в известном смысле, их ключевым свойством поскольку транспортные белки обеспечивают отбор специфической популяции РНК и правильную структурную организацию РНП-комплекса., определяющего его последующие функции: внутриклеточный транспорт трансляционно неактивного РНП-комплекса к плазмодесмам клеточных стенок и перенос РНП-комплексов через модифицированные плазмодесмы, сопровождающийся трансляционной активацией мРНК.

Несмотря на интенсивное изучение транспорта вирусов растений, принадлежащих к различным группам, в настоящее время практически ничего не известно о возможной структуре транспортной формы вирусного генома (вирус-специфического РНП-комплекса). Более того, мало что известно о пространственной структуре транспортных белков, формирующих невирионный РНП-комплекс. До настоящего времени нет данных рентгено-структурного анализа ни одного из изученных транспортных белков вирусов растений. Очевидно, что изучение пространственной структуры транспортных белков и транспортного РНП-комплекса приблизит нас к пониманию тонких механизмов, вовлеченных в процесс распространения вирусной инфекции в растениях.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что транспортный белок, кодируемый первым геном тройного блока транспортных генов гордеивируса полулатентного вируса мятлика (ПЛВМ), участвующий в образовании транспортного вирус-специфического РНП-комплекса, состоит из трех структурных доменов: N-концевого неструктурированного, центрального глобулярного и С-концевого хеликазного. Этот белок с молекулярной массой 63 кДа обладает in vitro ферментативной активностью НТФазы/хеликазы и РНК-связывающей активностью.

Целью настоящей работы было изучение доменной организации N-концевой половины белка ТБГ1 ПЛВМ, структурных и биохимических харатеристик доменов, а также их возможной роли в формировании транспортной формы вируса. В ходе работы решали следующие основные задачи: предсказание доменной организации белка ТБГ1 ПЛВМ с использованием компьютерных сервисов и стереохимического метода, получение делеционных мутантов, соответствующих предсказанным доменам; определение вторичной структуры этих доменов методами кругового дихроизма и ИК-Фурье спектроскопии; изучение РНК-связывающих свойств с использованием различных типов нуклеиновых кислот; изучение олигомеризации доменов с применением методов динамического лазерного светорассеяния и атомно-силовой микроскопии; изучение оптическими методами физико-химических свойств доменов, составляющих М-концевую половитт}' белка ТБГ1, и влияние на их структуру нуклеиновых кислот; исследование роли отдельных доменов в формировании невирионных нуклеопротеидных комплексов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ I. УЧАСТИЕ БЕЛКОВ ТРОЙНОГО БЛОКА ГЕНОВ В ПРОЦЕССАХ ТРАНСПОРТА ВИРУСОВ ПО РАСТЕНИЮ.

Общая характеристика процесса транспорта вирусов в растениях и роли транспортных белков

Вирусы растений при первичном заражении проникают в ограненное количество клеток при механических повреждениях или с помощью векторов-переносчиков (насекомых, нематод) и реплицируются в этих клетках. Из первично зараженных клеток вирус в виде вириона или специальной транспортной формы генома вначале проникает в соседние клетки (ближний транспорт), а затем и в проводящую систему растения, в дальнейшем оказываясь в других органах и тканях (дальний транспорт). Единственным путем межклеточного транспорта являются плазмодесмы — специальные плазматические каналы, пронизывающие клеточную стенку между соседними клетками и состоящие из плазматической мембраны, десмотубулы - видоизмененного тяжа эндоплазматического ретикулума и элементов цитоскелета (Citovsky, 1993: Overall and В lac km an, 1997). Обычно пропускная способность плазмодесм варьирует в зависимости от физиологического состояния и типа ткани и позволяет свободно проходить молекулам с молекулярной массой от 1 до 7 кДа (Wolf et al, 1989; Waigman and Zambrinski, 1995). Однако у растений существует система, позволяющая макромолекулам и их комплексам, значительно превышающим эти размеры, перемещаться между клетками (Ghoshroy et al, 1997; Lucas, 1995; Roberts and Oparka, 2003). Этот процесс сопровождается увеличением предельной пропускной способности плазмодесмы (ППСП), а также структурными перестройками транспортируемого комплекса, возможно, включая частичный рефолдинг белков (Kragler et al, 1998).

Предполагается, что вирусы используют и приспосабливают под собственные нужды систему межклеточного макромолекулярного транспорта растения. Известно, что некоторые клеточные белки могут транспортироваться как между соседними клетками, так и по проводящей системе (Haywood et al, 2002; Lee et al, 2000). К этим белкам, называемым NCAPs (non-cell autonomous acting proteins), относятся некоторые транскрипционные факторы и бейки, функционирующие во флоэме (Balachandran et al, 1997; Lucas, 1995). Также было обнаружено, что и мРНК транскрипционных факторов могут вовлекаться в межклеточный и дальний транспорт, по-видимому, в виде рибонуклеопротеиновых комплексов (Xoconostle-Cazares et al, 1999).

В данной работе изучается строение и функции транспортного белка одного из растительных вирусов, относящегося к роду Hordeivinis, и в связи с этим будет уместно уделить внимание характеристике этого рода вирусов, а также осветить некоторые особенности транспорта этих вирусов по растению.

Общая характеристика вирусов рода Hordeivirus.

Члены рода Hordeivirus живут в тесном контакте со своими растениями-хозяевами, что связано с отсутствием у них природного переносчика, и, как следствие, распространяются либо через семена, либо попадают в организм растения через механические повреждения (Jackson et al., 1989). Все члены этой группы имеют трехчастный геном, представленный тремя молекулами РНК, которые обозначаются ак а,Р и у. Каждая из трех молекул индивидуально инкапсидируется в короткую плотную палочковидную частицу, содержащую 96% белка и 4% РНК. Основываясь на морфологии частиц и серологическом анализе вирус латентной бледности душистого колоска (ВЛБДК). вирус штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ), вирус кольцевой пятнистости лихниса (ВКПЛ) и полулатентный вирус мятлика (ПЛВМ) были объединены в один род (Bragg et al., 2005). Эти вирусы легко переносятся механически и демонстрируют различные видоспецифичные симптомы во многих хозяевах. У некоторых хозяев, таких как некоторые виды рода Chenopodium (марь), развиваются характерные локальные очаги поражения, но у большинства хозяев развиваются симптомы слабой или умеренной мозаики. Белки оболочки ВШМЯ, ПЛВМ и ВКПЛ имеют сходный размер (23-25 кДа), но данные серологического анализа и молекулярной гибридизации свидетельствуют о том, что эти три вируса существенно различаются (Hunter et al., 1986; Hunter et al., 1989). Более детальное сравнение последовательностей геномных РНК ВШМЯ, ПЛВМ и ВКПЛ обнаружило несколько общих свойств, таких как сходная геномная организация и консервативный тройной блок генов, участвующих в транспорте, чго лишний раз подтверждает их таксономическое родство (Agranovsky et al., 1992; Morozov and Solovyev 2003; Savenkov et al., 1998; Solovyev et al., 1996).

Секвенирование нуклеотидной последовательности всех трех молекул РНК ВШМЯ позволил получить первые данные о геномной организации гордеивирусов и показал, что в геномных РНК закодированы семь основных белков, участвующих в инфекционном цикле вируса (Gustafson et al., 1986; Gustafson et al., 1987). Анализ последовательностей геномов ПЛВМ и ВКПЛ, проведенный чуть позже, позволил оценить родство этих вирусов с ВШМЯ и более детально изучить особенности 5'- и 3'- концевых некодирующих последовательностей, а также сходство и различие отдельных вирусных белков (Jackson et al., 1989; Morozov and Solovyev 2003) (рис. 1). Белки aa (субъединица репликазы с метилтрансферазной и хеликазной активностью), ра (белок оболочки) и уа каталитическая субъединица репликазы), кодируемые молекулами РНК а,(3, и у соответственно, транслируются прямо с геномных РНК. Экспрессия транспортных белков тройного блока генов происходит с двух субгеномных РНК, обозначаемых как сгрРНК ] и сг(ЗРНК 2. Белок ТБГ1 (рЬ) транслируется с сгрРНК 1, а два других белка ТБГ2 (рс) и ТБГЗ (|М) с сгрРНК 2. Белок уЬ, ответственный за патоген ность, экспрессируется с субгеномной уРНК. включающей вторую открытую рамку трансляции (ОРТ) бицистронной уРНК. Поскольку наша работа посвящена белку ТБГ1, рассмотрим более подробно белки тройного блока генов.

130К

Рис. 1. Строение генома гордеивирусов на примере вируса штриховатой мозаики ячменя. На рисунке обозначены три гордеивирусные геномные РНК и кодируемые ими белки (по Jackson et al., 2009).

Общая характеристика тройного блока генов.

Суперсемейство ТБГ представляет собой огромный класс вирусных транспортных белков (ТБ), отличных от транспортных белков тобамовирусного типа (Melcher, 2009). Хотя ТБ вируса табачной мозаики (ВТМ) может функционально заменять белки тройного блока генов в химерном вирусе ВШМЯ, сравнение последовательностей показало, что белки тройного блока эволюционировали независимо от ТБ ВТМ и что транспортные функции в случае ТБГ распределены между тремя различными белками (Melcher, 2009). Компьютерный и функциональный анализ показали существование двух различных типов ТБГ (так называемых «гордеивирусного» и «потексвирусного» типов) (Morozov and Solovyev, 2003). Вирусы с ТБГ гордеивирусного типа в отличие от вирусов с ТБГ потексвирусного типа не нуждаются в белке оболочки для межклеточного и флоэмного транспорта вируса по растению (Petty and Jackson. 1990: Morozov and Solovyev, 2003, Lim et al., 2008, Jackson et al., 2009). К вирусам с ТБГ гордеивирусного типа (класс I) относятся вирусы родов Benyvirus, Pecluvirus, Hordeivirus, и Pomovirus, а к вирусам с ТБГ потексвирусного типа (класс II) относятся вирусы таких родов как Allexivirus, Carlavirus, Foveavirus и Potexvirus (Morozov and Solovyev 2003; Faquet et al., 2005).

Три транспортных белка, кодируемых ТБГ обоих классов, кодируются перекрывающимися рамками считывания, однако, несмотря на то, что и гордеиподобные и потексподобные ТБ кодируются перекрывающимися рамками считывания, два класса белков ТБГ демонстрируют существенные различия в организации транспортных систем и некоторых биохимических функциях. Белок оболочки (БО) большинства ТБГ гордеивирусного типа не нужен для межклеточного транспорта (McGeachy and Barker, 2000; Petty et al., 1990; Jackson et al., 2009), а для некоторых из вирусов этой группы, например ВШМЯ, системная инфекция может развиваться в отсутствие экспрессии БО (Bragg et al., 2008; Lawrence and Jackson, 2001; Petty and Jackson, 1990). ). Вирусы с ТБГ гордеивирусного типа, образуют РНП-комплексы, способные как к ближнему, так и дальнему транспорту, и, состоящие только из белка ТБГ1 и вирусных геномных и субгеномных РНК (Lim et al., 2008). Для внутриклеточного транспорта к плазмодесмам белок ТБГ1 гордеивирусов (РНП-комплекс) нуждается в ассоциации с белками ТБГ2 и ТБГЗ (Lim et al., 2008). Напротив, флексивирусы, имеющие ТБГ потексвирусного типа, нуждаются в БО не только для системного, но и для межклеточного транспорта вируса (Forster et al., 1992; Verchot-Lubicz, 2005). В случае Х-вируса картофеля транспортной формой вируса являются или вирионы (Santa Cruz et al., 1999). или частично одетые БО «хвостатые» частицы (Karpova et al., 2006). Для ТБГ1 белка потексвирусов была показана способность к межклеточному транспорту в отсутствие белков ТБГ2 и ТБГЗ (Morozov and Solovyev, 2003; Verchot-Lubicz, 2005). В заключение стоит добавить, что белок ТБГ1 потексвирусного типа также способен выполнять роль супрессора сайленсинга, в то время как белок ТБГ1 гордеивируса не обладает такой активностью, несмотря на его способность связывать двухнитевую РНК (Jackson et al., 2009).

Свойства белков ТБГ1.

Белки ТБГ1 гордеивирусного типа имеют молекулярную массу от 35 до 63 кДа и существенно отличаются от значительно меньших (примерно 25 кДа) белков потексвирусного типа наличием большого N-концевого участка, предшествующего домену с активностями НТФазы/хеликазы (рис 2а). N-концевая половина белка ТБГ1 горедивирусов содержит два положительно заряженных аминокислотных кластера, богатых лизином и аргинином, и задействована в процессах дальнего транспорта вируса по растению (Morozov and Solovyev, 2003). С-концевая половина белков ТБГ1 гордеивирусного типа, как и полный белок ТБГ1 потексвирусного типа, охарактеризованы как хеликазный домен, имеют семь консервативных мотивов (I, IA, II, III, IV, V и VII) НТФаз/хеликаз суперсемейства I, сходных с доменом, который входит в состав репликазы альфа-подобных вирусов (Gorbalenya and Koonin, 1993; Koonin and Dolja, 1993.).

Белки ТБГ1 обоих классов имеют общие биохимические активности, такие как способность связывать РНК, НТФазная и РНК-хеликазная активности, а также

АТФаза а)

Белок ТБГ1 ВШМЯ (58 кДа)

Белок ТБГ1 BKA (51 кДа) ' gg

Белок ТБГ1 ВНПЖС (42 кДа)

Белок ТБГ1 потексвирусного типа (24 - 26 кДа) (б)

ТБГ потексвирусного типа Белок ТБГ2 (12-14 кДа)

Белок ТБГЗ (6-13 кДа)

С)

Люмен ЭР

Цитоплазма

Т\ te/ft

IV

V VI 1 t i

Участки отвественные за олигомеризацию

1 IA II III IV

IA II III IV

АТФаза

I IA II ill IV

V VI

V VI

V VI

ТБГ гордеивирусного типа

Белок ТБГ2 (14 кДа)

1S-31

1 G40R

Белок ТБГЗ (17 кДа) 1

75-90

60-77

131

124-150

I108R

15S

Люмен ЭР

Цитоплазма взаимодействие с плаэмодесмами ISO

124 взаимодействие с белком ТБГ2

Рис. 2. Сравнение белков ТБГ потексвирусного и гордеивирусного типа, (а)

Молекулярная организация белков ТБГ1. Цифрами отмечены семь консервативных мотивов НТФазы/хеликазы. Мотивы I, IA, II необходимы для наличия у белка АТФазной активности, (б) Молекулярная организация белков ТБГ2 и ТБГЗ. Черными полосками отмечены участки, необходимые для гетерологичных взаимодействий, (с) Предсказанная топология белков ТБГ и ТБГЗ в эндоплазматическом ретикулуме. Кружками отмечены участки, необходимые для гетерологчных взаимодействий (по Jackson et al., 2009). способность к гомологичным взаимодействиям (Morozov and Solovyev, 2003; Verchot-Lubicz, 2005). Оба класса белков ТБГ I способны связывать и двух цепочечную, и одноцепочеченую РНК, хотя гордеивирусные белки ТБГ1 демонстрируют более сильное, устойчивое к повышению ионной силы связывание, чем потексвирусные (Kalinina et al., 2001; Kalinina et al., 1996; Karpova et al., 2006). Специфичность РНК связывания не была детектирована ни в одном из исследований. Также для белков ТБГ1 была показана способность связывать одноцепочечную ДНК. В то время как, РНК-связывающая активность белков ТБГ1 потексвирусного типа обеспечивается положительно заряженными остатками на N-конце белка (Morozov et al., 1999; Wung et. al., 1999), гордеивирусные белки ТБГ1 имеют множественные сайты РНК свзяывания (Donald et al., 1997; Morozov and Solovyev, 2003), РНК-связывающая способность распределена между С-концевым регионом с хеликазной активностью, взаимодействующим с РНК кооперативно, и N-концевым участком, взаимодействующим с РНК некооперативно. Белки ТБГ1, как ПЛВМ, так и ХВК обладают АТФ-зависимой хеликазной активностью, что выражается в способности расплетать РНК-дуплексы, и, в случае ПЛВМ, данная активность полностью локализуется в районе С-концевой половины белка (Kalinina et al., 2002). Приведенные выше данные свидетельствуют, что белки ТБГ1 класса I являются главными участниками формирования невирионных рибонуклеопротеидных комплексов, вовлеченных в транспорт вирусной РНК по растению.

Свойства белков ТБГ2.

Белок ТБГ2 ВШМЯ транслируется с малочисленной субгеномной (3-РНК 2 вируса и в инфицируемых клетках соотношение белка ТБГ2 к белку ТБГ1 составляет 1:10 (Zhou and Jackson, 1996). Белки ТБГ2 имеют высокое сходство в нуклеотидной последовательности среди всех вирусов с ТБГ гордеивирусного типа, и это сходство распространяется и на ХВК и других представителей семейства Flexiviridae (Morozov and Solovyev, 2003). Белки ТБГ2 содержат два гидрофобных трансмембранных домена и центральную гидрофильную петлю, разделяющую гидрофобные регионы (рис 2 б,в). Предполагаемая топологическая модель предсказывает, что гидрофобные регионы интегрированы в мембрану, формируя U-образную структуру, концы которой расположены с циотплазматической части мембраны, а центральный консервативный регион экспонирован в люмен эндоплазматического ретикулюма (ЭР) (Morozov and Solovyev, 2003; Zamytatnin et al., 2006). В пользу этого предположения свидетельствуют биохимические эксперименты с вирусом мозаики бамбука (ВМБ) (Hsu et al., 2008) и результаты, полученные на вирусе курчавости верхушек картофеля (ВКВК) методом бимолекулярной флуоресцентной комплементации (БМФК) (Zamytatnin et al., 2006).

Свойства белков ТБГЗ.

Белок ТБГЗ кодируется 3' проксимальной открытой рамкой считывания (ОРС) субгеномной р-РНК 2 и транслируется в результате проскока 40S субъединицей рибосомы AUG кодона белка ТБГ2, имеющего неоптимальный контекст для инициации трансляции. В результате действия этого механизма соотношение белка ТБГЗ к белку ТБГ2 в процессе т vitro трансляции составляет 1 к 10, и подобный уровень экспрессии создаёт огромные трудности для детекции белка ТБГЗ в инфицированных клетках. Белки ТБГЗ имеют мало консервативных участков и, по всей видимости, представляют.собой полифилетическую группу белков, в отличие от высоко консервативных белков ТБГ2, произошедших от общего предка (Morozov and Solovyev, 2003). Белки ТБГЗ гордеивирусного типа имеют молекулярную массу от 18 до 24 кДа и содержат два домена, ассоциированных с мембранами, имеющих следующую топологию: N- и С-концы полипептида обращены в сторону люмена ЭР, а центральная петля экспонирована с циотплазматической стороны эндоплазматической сети (рис. 26,в). Белки ТБГЗ потексвирусного типа имеют меньшую молекулярную массу (от 6 до 13 кДа) и содержат один гидрофобный трансмембранный домен с коротким N-концевым участком, обращенным в люмен ЭР, и более длинную С-концевую половину, выступающую с цитоплазматической стороны мембраны ЭР (Morozov and Solovyev, 2003).

Белок-белковые взаимодействия между белками ТБГ.

Способность белка ТБГ1 связывать РНК кооперативно, позволяет преположить, что гомологичные белок-белковые взаимодействия необходимы для выполнения этой функции, и в настоящее время доказано, что оба класса белков ТБГ1 способны образовывать гомоолигомеры (Cowan et al., 2002; Leshchiner et al., 2006, Лещинер и др. 2008, Lim et al., 2008). В случае белка ТБГ1 ПЛВМ показано, что участок, необходимый для гомологичных взаимодействий между молекулами белка, включает консервативные мотивы 1,1а, и II (Leshchiner et al., 2006). В подтверждение этому аминокислотные замены, внесенные в мотивы I и II белка ТБГ1 ВШМЯ, отменяли образование гомоолигомеров, тогда как белки с мутированными С-концевыми мотивами IV и,VI сохраняли способность к гомологичным взаимодействиям (Lim et al., 2008). Несмотря на то, что обнаружить взаимодействие между белками ТБГ1 и ТБГ2 ВШМЯ не удалось, при помощи аффинной хроматографии было показано, что белок ТБГ1 вовлечен в гетерологичные взаимодействия с белком ТБГЗ, который необходим для доставки белка ТБГ1 к плазмодесмам, а также для межклеточного транспорта вируса по растению (Lim et al., 2008).

Данные о гомологичных взаимодействиях »между белками ТБГ2 и ТБГЗ ВКВК были получены в экспериментах с участием двугибридной дрожжевой системы, но к сожалению для остальных гордеивирусах данные о подобных взаимодействиях не были продемонстрированы (Cowan et al., 2002),. Так, например, сходные эксперименты по обнаружению гомологичных взаимодействий в случае белков ТБГ ВШМЯ были не опубликованы по техническим причинам (Jackson et al., 2009). Гетерологичные взаимодействия между белками ТБГ2 и ТБГЗ ВШМЯ были детектированы при помощи двугибридной дрожжевой системы (Cowan et al., 2002). Аффинная хроматография и эксперименты с двугибридной дрожжевой системой также показали, что на гетерологичные взаимодействия между белками ТБГ2 и ТБГЗ ВШМЯ влияют мутации консервативных регионов полноразмерных белков (Lim et al., 2008). Среди полученных мутантов, ТБГ2024оя с соответствующей заменой в гидрофильном регионе был не способен взаимодействовать и белком ТБГЗ, а мутант ТБГЗцохя терял способность взаимодействовать с белком ТБГ2.

Показано, что мутации, мешающие взаимодействию белков ТБГ2 и ТБГЗ между собой, нарушают правильную локализацию белков тройного блока генов в зараженной клетке (Lim et al., 2008). Однако чрезвычайно сложно представить, как происходит прямое взаимодействие этих белков в клетке, так как согласно правилам топологии и из экспериментальных данных по белку ТБГ2 следует, что гидрофильная петля, участвующая в связывании с ТБГЗ, находится в люмене ЭР, в то время как регион белка ТБГЗ, вовлеченный во взаимодействия с ТБГ2, расположен с цитоплазматической стороны мембраны ЭР (Morozov and Solovyev, 2003). Как же могу г белки ТБГ2 и ТБГЗ быть заякорены в мембране именно в той ориентации, в которой они могут взаимодействовать между собой? Одним из вариантов может служить предположение, что белки ТБГ2 и ТБГЗ взаимодействуют в течение их контрансляции с субгеномной рРНК 2, в результате которой количество белка ТБГЗ в 10 раз меньше, чем белка ТБГ2. Таким образом, взаимодействие белков ТБГ2 и ТБГЗ между собой в течение трансляции может привести к появлению небольшой популяции белка ТБГ2, находящейся в комплексе с ТБГЗ, топология которой будет существенно отличаться от топологии белка ТБГ2 большей популяции. Другим объяснением может служить то, что взаимодействие белка ТБГЗ с белком ТБГ1 (или же с еще не открытыми белками клетки-хозяина) может приводить к изменению топологии белка ТБГЗ, что позволит ему взаимодействовать с белком ТБГ2. Третьей возможностью может являться то, что ориентация белков может изменяться в течение транспорта комплекса белков ТБГ от цитоплазмы к клеточным стенкам. Хотя прямых доказательств, прямо подтверждающих один из трех вариантов, пока не получено, становится вполне очевидным тот факт, что на ориентацию белков в мембране может оказывать влияние сразу несколько факторов (von Heijne, 2006). В некоторых случаях, для белков с двойной топологией известны последовательности, которые могут встраиваться в мембраны в различных ориентациях. Также возможно, что трансмембранные спирали могут реориентироваться в мембранах ЭР в результате взаимодействия с другими белками или изменений в липидном окружении. Более того, эндомембранные структуры, участвующие в доставке нуклеопротеидов к местам их сборки в пламодесмах, чрезвычайно лабильны. Кроме того, топология белков ТБГ2 и ТБГЗ может представлять собой особый случай, в котором предсказанная мембранная ориентация может быть изменена при некоторых условиях. Итак, из всего вышесказанного становится ясно, что для дальнейшего решения вопросов топологии взаимодействующих белков ТБГ2 и ТБГЗ необходимы более чувствительные методы, которые позволят более полно охарактеризовать взаимодействия мембранных белков между собой, а также внедрять технологии, позволяющие с более высокой точностью различать мембранную ориентацию белков в живых клетках (Brach et al., 2009;).

Внутриклеточный и межклеточный транспорт у гордеивирусов.

В работах Бракке и его коллег впервые было показано, что из растений, инфицированных ВШМЯ, можно выделить белок ТБГ1 в виде нуклеопротеидного комплекса (Brakke et al., 1988). Недавно, эта работа была дополнена новыми данными (Lim et al., 2008). Так, например, удалось показать, что из зараженных модифицированным вирусом ВШМЯ, у которого делетирован ген белка оболочки для предотвращения накопления в растениях вирионов, а белок ТБГ1 слит с аминокислотной последовательностью из б гистидинов, методом аффинной хроматографии удается выделить РНК-белковый комплекс. Изолированный таким образом нуклеопротеид состоит из белка ТБГ1 и геномных и субгеномных РНК с положительной полярностью. При этом в составе этого комплекса не удалось обнаружить других гордеивирусных белков или же РНК с отрицательной полярностью, что свидетельствовало бы о том, что транспортируется репликативный комплекс. Однако, возможность гетерологичных взаимодействий между белками ТБГ1 и ТБГЗ, а также необходимость этих взаимодействий для межклеточного транспорта, свидетельствует в пользу модели, согласно которой нуклеопротеидный комплекс белка ТБГ1 с РНК ассоциирован in vivo с белком ТБГЗ, необходимого для доставки транспортной формы вируса к плазмодесмам.

Нарушение локализации комплекса в районе клеточных стенок при мутации консервативных мотивов IV и VI в хеликазном домене белка ТБГ1 говорит о том, что процесс внутриклеточного транспорта вируса является АТФ-зависимым (Morozov and Solovyev, 2003). Исследования также показали, что в стабилизации нуклеопротеида, формируемого белками ТБГ1 и ТБГЗ в районе плазмодесм, участвует ТБГ2, однако, механизм этого процесса остаётся пока неясным и требует дальнейшего изучения.

Общая для многих растительных вирусов модель внутриклеточного транспорта предполагает, что в этот процесс вовлечены эндоплазматический ретикулум и актиновые микрофиламенты. Эта точка зрения недавно была подтверждена в а) (6)

Клеточная стенка

---^.•^•^V f " '.а

Клеточная стенка хлоропласт

Аппарат Гольджи

Диффузия синтез субгеномных РНК

Сборка невирионного нуклеопротеида

Элементы цитоскелета

Участие системы эндоцитоза

Белки:

И» ТБГ1 ' везикулы системы эндоцитоза

ТБГ2 - субгеномные РНК ТБГЗ актиновые микрофиламенты

6 уВ ПД плазмодесмы е везикулы ЭР

Рис. 3. Модель межклеточного транспорта для вирусов с ТБГ гордеивирусного типа. После репликации геномных РНК и трансляции субгеномных РНК образуется транспортная форма вируса, содержащая белок ТБГ1 и позитивные геномные и субгеномные РНК, которая ассоциируется с белками ТБГЗ и ТБГ2 для межклеточного транспорта. Механизмы, вовлеченные в транспорт нуклеопротеида, к плазмодесмам неясны. Существует два возможных сценария доставки РНП-комплекса к клеточной стенке. Помимо классического механизма транспорта РНП-комплекса по актиновым микрофиламентам, была предложена модель, согласно которой доставка комплексов происходит путем обычной диффузии. Обе модели предполагают, что белок ТБГЗ обеспечивает доставку нуклеопротеида к плазмодесмам (по Jackson et al., 2009). экспериментах с вирусом табачной мозаики (ВТМ), в которых в присутствии ингибиторов актиновых филаментов (латрункулин Б и цитохалазин), прекращалась доставка транспортного белка ВТМ к плазмодесмам, в то время как ингибиторы микротрубочек (колхицин и оризалин) не оказывали на локализацию белка в районе плазмодесм никакого эффекта (Wraight et al., 2007). Эти результаты подтверждают тот факт, что для межклеточного транспорта ВТМ необходимы взаимодействия с ЭР и актиновыми филаментами.

В отличие от ВТМ, внутриклеточные механизмы транспорта у гордеивирусов изучены не так хорошо, но уже имеется много свидетельств тому, что различные варианты событий в мембранной системе клетки необходимы в течение вирусной инфекции, и что эти события различны для разных стадий инфекции (Lucas, 2006). Так например, сразу после внедрения в клетку, соответствующей экспрессионной плазмиды, белки ТБГ2 и ТБГЗ ВКВК находятся в ассоциации с ЭР, и появляются подвижные гранулы, для движения которых необходимо взаимодействие с ЭР-актиновой сетью (Haupt et al., 2005). Позже, оба белка появляются в везикулярных структурах, однако, если ТБГ2, экспрессируется и локализуется в них самостоятельно, то белку ТБГЗ для ассоциации с этими структурами необходимо наличие белка ТБГ2. FM4-64, химический маркер компонентов путей эндоцитоза, и ранний эндосомный маркер Ага7 колокализовались с белком ТБГ2. Выявленные взаимодействия указывают на то, что актин-зависимый эндоцитоз вовлечен во внутриклеточный транспорт белков ТБГ2 и ТБГЗ. Предполагается, что после доставки вирусного РНП-комплекса к десмотубуле плазмодесмы белки 'ГБГ2 и ТБГЗ возвращаются в клетку с помощью механизма эндоцитоза (Haupt et al., 2005). Итак, экспериментальные данные показывают вовлечение сети актиновых филаментов в некоторые аспекты внутриклеточного транспорта ТБГЗ (рис. 3).

Однако этот общий механизм был недавно оспорен для белка ТБГЗ как ПЛВМ, так и ХВК (Schepetilnikov et al., 2008). Основное возражение основывалось на том, что в экспериментах с применением ингибиторов актиновых микрофиламентов (латрункулин Б) и микротрубочек (оризалин) белок ТБГЗ, слитый с GFP, локализовался в районе клеточной стенки, и его локализация не зависела от стабильности микротрубочек и микрофиламентов (Schepetilnikov et al., 2008). Более того, взаимодействие аппарата Гольджи с брефельдином А не оказывало влияния на локализацию белка ТБГЗ или транспортного белка ВТМ, из чего следует, что для внутриклеточного транпорта белка

ТБГЗ к клеточным стенкам участие ЭР-Гольджи секреторного пути не обязательно. Основываясь на этих экспериментах, предлагется новый нестандартный механизм, в котором белок ТБГЗ, находящийся в комплексе с нуклеопротеидом, сформированном белком ТБГ1 (РНП-комплекс), взаимодействует с ЭР и отпочковывается вместе с мембранными везикулами, перемещающимися к плазмодесмам путем актин-тубу лип независимой цитоплазматической диффузии. При достижении плазмодесмы белок ТБГЗ заякоривает транспортную форму и облегчает ей прохождение через десмотубулу. Ввиду таких неоднозначных и явно противоречащих друг другу экспериментов, к обоим предполагаемым механизмам транспорта было бы больше доверия, если бы они базировались на положительных биохимических находках или генетическом анализе, чем на данных полученных методом введения в клетку химических ингибиторов. Так что очевидно, что для окончательного разрешения вопроса о механизме внутриклеточного транспорта гордеивирусов необходимо провести детальные исследования, основанные на иных методах, чем те, которые использовались до сих пор.

Объектом настоящей диссертации является белок ТБГ1 ПЛВМ. Ранее в нашей лаборатории было показано, что в состав белка ТБГ1 ПЛВМ, главной функцией которого является образование невирионного рибонуклепротеидного комплекса, входят, по крайней мере, два РНК-связывающих домена. N-концевая половина ТБГ1 белка гордеивируса ПЛВМ отвечает за некооперативное связывание с РНК in vitro и дальний транспорт вируса по проводящей системе растения in vivo, а С-концевая половина представляет собой хеликазный домен с семью консервативными мотивами, свойственными хеликазам суперсемейства 1 и обладает in vitro РНК-связывающей, НТФазной и РНК-хеликазной активностями. В составе многих клеточных РНК-связывающих белков, участвующих в различных этапах метаболизма РНК, обнаружены домены с РНК-связывающей активностью. В связи с этим во второй части обзора литературы приведены данные о структуре известных типов РНК-связывающих доменов клеточных белков и функциональных активностях РНК-связывающих доменов, которые участвуют в формировании трансляционно неактивных мРНП в эукариотеческих клетках.

И. ОСНОВНЫЕ ТИПЫ РНК-СВЯЗЫВАЮЩИХ ДОМЕНОВ

OB домен (олигонуклеотид-связывашщий домен)

OB домен (или домен с ОВ-укладкой) - маленький структурный домен, названный так за его олигонуклеотид/олигосахарид-связывающие свойства, хотя ему также свойственна способность и к белок-белковым взаимодействиям (Theobald et al., 2003). Число белков, связывающих нуклеиновые кислоты, и при этом, имеющих OB структуру в своем составе чрезвычайно велико, и полипептиды, содержащие этот домен, вовлечены в связывание одноцепочечной РНК или ДНК. OB домен чрезвычайно важен для таких процессов как репликация, рекомбинация, репарация, транскрипция, трансляция, стресс-ответ на холодовой шок и поддержание целостности теломер. Большое количество белков, содержащих OB домен, имеют известную трехмерную структуру, полученную методом рентгеноструктурного анализа, что позволяет сравнить и сопоставить их топологию, модульную организацию и узнавание лиганда.

OB домен имеет длину от. 70 до 150 аминокислотных остатков (Theobald et al., 2003). Хотя сильного сходства в последовательности аминокислот среди различных OB доменов не наблюдается, они легко узнаются из-за их своеобразной топологии (рис. 4). Большой разброс длины ОВ-доменов является результатом разницы в размерах вариабельных петель, которые располагаются среди высококонсервативных элементов вторичной структуры. OB домен часто выступает в качестве узнающих доменов в составе крупных белков; в том случае если ОВ-домены являются сами но себе самостоятельными белками, они часто олигомеризуются или находятся в составе мультикомпонентных ансамблей.

Сходный по топологии с мотивом "греческого ключа", OB домен состоит из двух трехтяжевых антипараллельных ß-слоев, где ßl-тяж принадлежит обоим слоям (Murzin,. 1993). ß-слои упакованы антипараллельно, формируя слегка сплюснутый пятитяжевой ß-баррель с топологией тяжей 1-2-3-5-4-1. Между ß3 и ß4 тяжами часто имеется а-спираль, расположенная напротив донышка ß-барреля. ß3 и ß5 тяжи могут закрывать ß-баррель путем образования водородных связей. Однако эти тяжи совпадают только частично, и в результате ß-баррель закрыт не полностью.

Глицин в первой половине и ß-выступ во второй половине ßl тяжа позволяют ему принадлежать сразу обоим ß-слоям и изгибаться вокруг ß-барреля (Theobald et al., 2003). Второй остаток глицина в начале ß4 тяжа в ai конформации, возможно, нужен для разрушения а-спирали между ß3 и ß4 тяжами. Интересно, что во всех случаях, когда сайт связывания известен, он локализуется на стыке ß2 и ß3 тяжей (Murzin, 1993). Канонические элементы вторичной структуры дополняются вариабельными петлями, расположенными между [31 и р2 тяжами, РЗ тяжом и а-спиралыо, а-спиралью и 04 тяжом, Р4 и р5 тяжами. Эти петли очерчивают границу «расщелины», проходящей через поверхность ОВ домена перпендикулярно оси Р-барреля. Большинство нуклеиновых кислот связываются именно с этой «расщелиной», причем 5'-конец цепи нуклеиновой кислоты локализуется в районе Р4 или Р5 тяжей, а 3'- конец располагается около Р2 тяжа. Согласно данным рентгеноструктурного анализа, петли, окаймляющие р-слои составляют идеальную поверхность для узнавания одноцепочечных нуклеиновых кислот, позволяющую формировать стеккинг-взаимодействия, электростатические, гидрофобные и водородные связи.

Рис. 4. Канонический ОВ домен, р-тяжи с первого по пятый показаны красным, оранжевым, желтым, синим и фиолетовым, соответственно, а-спираль между Р-тяжами 3 и 4 изображена зеленым (по Мигап, 1993).

ОВ домены встречаются в восьми разных суперсемействах белков (Murzin et al., 1995). Эти суперсемейства включают стафилококковые пуклеазы, бактериальные энтеротоксины, неорганические фосфатазы, нуклеотид-связывающие белки, среди которых ОВ домены встречаются наиболее часто. В настоящее время известны структуры 11 белковых комплексов с ОВ доменами, которые относятся к четырем из девяти семейств суперсемейства нуклеотид-связывающих белков. Эти структуры можно разделить на три категории согласна их функциональной организации: белки, которые связывают нуклеиновые кислоты без сильной специфичности к её последовательности, включающие репликационный белок А (hsRPA) человека, и белок, связывающий одноцепочную ДНК у Escherihia Coli (EcSSB); белки, узнающие специфический одноцепочечный регион нуклеиновой кислоты, такие как Rho транскрипционный терминатор (EcRho), аспартил-тРНК синтетаза Escherihia Coli, белок, взаимодействующий с концом теломеры Oxytricha nova (ОпТЕВР); и наконец белки, взаимодействующие с неспиральными структурными участками нуклеиновых кислот, например, фактор инициации 1 Thcrmus thermophlus (IF1), рибосомные белки L2, SI2 и SI7.

В OB комплексах азотистые основания часто находятся в закрытом контакте с белком, в то время как фосфодиэфирные группы обращены в сторону растворителя (Antson, 2000; Horvath et al ,1998). Нуклеотиды взаимодействуют с белком в основном за счет стеккинг-взаимоденствий с ароматическими группами боковых цепей аминокислотных остатков или гидрофобных взаимодействий с неполярными аминокислотами или алифатическими участками полярных аминокислотных остатков, таких как лизин или аргинин. В некоторые неполярные взаимодействия вовлекаются как кольцо рибозы, гак и азотистое основание нуклеиновой кислоты. Для некоторых случаев для специфического узнавания одноцепочечной нуклеиновой кислоты является важным формирование л-комплекса, возникающего в результате стеккинг-взаимодейсгвий азотистых оснований и боковой цепи аргинина. Кроме того, формирование водородных связей группами доноров и акцепторов боковых цепей полярных аминокислот также обеспечивает специфическое узнавание азотистых оснований.

В составе ОВ домена обычно выделяют три вариабельные петли, формирующие лиганд-узнающую поверхность: Lio, Ьзи или L34 в тех случаев, когда a-спираль в домене не представлена, и Lis (Murzin,. 1993) Однако, в SSB белке, транскрипционном терминаторе Rho, и некоторых других белках в связывании участвует также петля L23, значительно увеличивающая площадь связывающей лиганд поверхности. Размеры петель чрезвычайно различны, и вследствие этого их свойства ОВ домены способны формировать огромное количество непохожих друг на друга нуклеотид-связывающих поверхностей. Размер петель грубо коррелирует с числом нуклеотидов, узнаваемых каждым из ОВ доменов, которое варьирует от 2-11 оснований у белков, связывающих одноцепочные нуклеиновые кислоты, до 31 у рибосомального белКа S17,

Каноническая связывающая поверхность для ОВ доменов была вначале определена на основе анализа пяти белков с ОВ доменами: стафилококковой нуклеазы, аспартил-тРНК-синтетазы дрожжей и В-субъединиц трех бактериальных цитотоксинов (Murzin,. 1993). Главную роль в формировании связывающей поверхности у этих пяти белков играют Р2 и рЗ тяжи, дополнительное содействие оказывают С-концевые части pi и Р5 тяжей. Впоследствии была решена и проанализирована структура еще четырнадцати растворимых комплексов ОВ доменов и нуклеиновых кислот. В результате этих экспериментов было показано, что связывающая поверхность значительно больше и гораздо вариабельнее, чем предполагалось изначально. Однако главные ранее предсказанные позиции связывания оставались неизменными для различных членов этого семейства белков. Как видно из рис. 5, ДНК находится в левой половине ОВ-домена, окруженная вариабельными петлями, и укладывается напротив ß2 и ß3 тяжей. Иногда N-концевая часть ßl-тяжа, предшествующая повороту, который позволяет ßl-тяжу огибать ß-баррель, также может участвовать в связывании лиганда.

Различные OB домены проявляют огромное количество вариантов изменения конформации после связывания с лигандом. Спектр этих вариантов широк: от отсутствия видимых изменений до полной перестройки комплексов, включающей структуризацию и схлопывание петель, выпрямление одноцепочной нуклеиновой кислоты, поворота азотистых оснований и многое другое (Theobald et al., 2003).

Нуклеотид-связывающие OB домены известны отсутствием сходных консенсусных мотивов среди своих членов, но, несмотря на различные аминокислотные последовательности, существует заметное сходство вторичных структур этих белков. Пятнадцать ОВ-доменов были проанализированы на общее сходство при помощи алгоритма множественного выравнивания (Russell et al., 1992). После выравнивания стало видно, что среднее сходство последовательностей аминокислот в канонических вторичных структурах около 12%. Тем не менее, отдельные консервативные участки четко видны на выравнивании. Так гидрофобные остатки часто формируют короткие консервативные кластеры. Эти фрагменты соответствуют структурным частям ß-барреля, и также как и остальные его компоненты направлены внутрь. Консервативные гидрофобные кластеры расположены в основном в ß 1, ß2 и ß4 тяжах, и в меньшей степени ß5 тяже.

Внутренние остатки ß-барреля OB доменов расположены в три слоя. Гидрофобные последовательности среднего слоя более консервативны, чем соответствующие последовательности двух других слоев (Murzin, 1993). Верхний слой часто открывает вторичные структуры и более склонен к растворению, чем нижний слой, обычно закрывающий а-спираль, служащую мостиком между ß3 и ß4 тяжами. Глицины и пролины, обычно редкие в ß-тяжах, встречаются достаточно часто на краях тяжей, где могут искажать регулярную вторичную структуру, формируя внутритяжевые петли. Как уже обсуждалось выше, ßl тяж, опоясывающий ß-баррель, имеет наибольшую длину и входит в оба ортогональных ß-слоя. ß-изгиб или ß-выступ, обеспечивающие поворот ßl тяжа, обычно располагаются в его средней части, и глицин, формирующий эти структурные элементы весьма консервативен (Bycroft et al., 1997). Поворот присутствует и в начале ß4 тяжа. В составе этого поворота также найден консервативный остаток глицина, который обеспечивает начало [34 тяжа, прерывая каноническую а-спираль, находящуюся между (33 и (34 тяжами.

Рис. 5. Конформационные изменения белка после связывания с лигандом. Комплекс OB домена с нуклеиновой кислотой показан голубым, тогда как исходный белок изображен синим, а. OB домен человеческого репликационного белка А. b. OB домен транскрипционного терминатора Rho (по Murzin, 1993).

Два часто встречающихся гидрофобных остатка (один на N-конце ß2 тяжа, другой на С-конце ß5 тяжа) являются основой нижнего слоя внутренних остатков и обычно располагаются напротив а-спирали или вариабельных петель, формирующих дно ß-барреля. Интересно, что боковые радикалы, находящиеся между средним и нижним слоями внутренних аминокислотных остатков ß3 тяжа гидрофобны, но направлены не внутрь ß-барреля, а наружу. Подобное их расположение, возможно, указывает на наличие гидрофобных взаимодействий между этими остатками и нуклеиновой кислотой (Theobald et al., 2003). Действительно, во многих проанализированных комплексах эти гидрофобные аминокислотные остатки связывались с нуклеиновой кислотой, причем иногда взаимодействия играли большую роль (рис. 5). Примером этому может служить аспартил-тРНК-синтетаза, где фенилаланин ß3 тяжа взаимодействует с Q34 антикодоновой петли. И наконец, выравнивание показало, что у половины анализируемых ОВ-доменов присутствует расположенная около N-конца ßl тяжа дополнительная а-спираль, общий элемент, обнаруженный в недавних исследованиях.

Интересный аспект узнавания нуклеиновой кислоты ОВ-доменами заключается в экстраординарном постоянстве полярности связываемого лиганда (Theobald et al., 2003). В одиннадцати из тринадцати комплексов нуклеиновая кислота связана строго полярно: 5'-конец нуклеиновой кислоты располагается около ß4 и ß5 тяжей, а З'-конец около ß2 тяжа. Существуют два исключения из общего правила: ß-субьединица белка, связывающего теломеру, Oxytricha nova и SSB-связывающий белок Echerichia coli. В течение длительного времени велись споры: считать ли ОВ-домены независимо появившимися в течение эволюции, или же принять версию происхождения их от общего предка (Murzin, 1998; Suck, 1997). Полярное связывание нуклеиновой кислоты косвенно подтверждает вторую гипотезу. Отсутствие видимой биофизической причины, вследствие которой ОВ-домены могут связывать нуклеиновую кислоту только одной полярности, и наличие белков-исключений доказывает принципиальную возможность ОВ-доменов связывать ДНК и РНК разных полярностей. Маловероятно, что в ходе постепенной дивергенции произошло резкое изменение ориентации нуклеиновой кислоты в щели ОВ-домена, уже предпочитающего определенную полярность цепи. Если у ОВ-доменов существует возможность связывать цепи обеих полярностей, то случайный шанс того, что 11 из 13 ОВ-доменов появятся независимо, и будут иметь одинаковую полярность, равен 0.023%, что не является статистически значимым и свидетельствует против гипотезы о независимом происхождении.

КН домен (домен гомологичный белку К гяРНП)

КН домены чрезвычайно разнообразны и встречаются во многих белках, участвующих в регуляции экспрессии генов. КН домен имеет около семидесяти аминокислотных остатков в длину и характеризуется (I/L/V)-I-G-X-X-G-X-X-(I/L/V) мотивом в середине домена (Amarasinghe et al., 2000). Все КН домены, строение которых известно, имеют сходную структуру, состоящую из трехтяжевого ß-слоя, уложенного поверх трех a-спиралей (рис. 6). Но, несмотря на это, КН-домены могут быть подразделены на два различных типа: тип первый КН доменов имеет топологию ßaaßßa, при чем тяж ß3 центральный и антипараллелен двум другим ß-тяжам, в то время как второй тип КН доменов обладает топологией aßßaaß, а в ß-слое центральным является ß2 тяж, и он параллелен ß3 тяжу и антипараллелен ßl тяжу. Две последовательные a-спирали соединены так называемой «GXXG-петлей», являющейся частью консервативного мотива.

Рис. 6. КН домены. А. КН домен типа 1. В. КН домен типа 2. С. КН домен и <ЗиА2 домен в белке 8Р1. Б. Димер КН доменов. Белок обозначен серым, СХХв-петля показана красным, боковые радикалы, контактирующие с РНК, - зеленые. РНК нуклеотиды (N1, N2, N3, N4) показаны темносиним, фиолетовым, желтым и зеленым, соответственно (по Аи\\е1ег е1 а1., 2006).

В настоящее время определена структура двух комплексов с одноцепочечной РНК КН доменов типа 1 (Lewis et al., 2000) и таких же двух комплексов для доменов типа 2 (Beuth et al., 2005). Кроме того, разрешена структура пяти КН доменов типа 1 и двух типа 2 в комплексе с одноцепочечной ДНК (Auweter et al., 2006). Нуклеиновая кислота во всех изученных случаях связывалась с бороздкой, образуемой «GXXG-петлей», двумя последовательными а-спиралями, следующим за ними (3-тяжом ((32 тяжом для доменов первого типа или (33 тяжом для доменов второго типа) и так называемой вариабельной петлей ( (32(33-петля у первого типа доменов и (33а2 у второго типа). Каждый КН домен связывает четыре нуклеотида. Первые три нуклеотида располагаются на поверхности домена. Азотистое основание первого нуклеотида образует с'теккинг-взаимодействия с пептидной связью между консервативным глицином и следующим за ним остатком al спирали (а2 спираль у доменов второго типа), в то время как второй и третий нуклеотид лежат на гидрофобной поверхности, сформированной двумя боковыми цепями аминокислотных остатков, одного из al спирали, другого из (32 тяжа (у доменов второго типа а2 спираль и (33 тяж соответственно), вклинивающимися между двумя нуклеотидами (Du et al., 2005). Карбонильный остаток и амидная группа некоторых консервативных гидрофобных остатков (32 тяжа образуют водородные связи с третьим нуклеотидом. Эти две водородные связи предпочитают аденин или цитозин на месте третьего основания. Конформация также поддерживается контактом между сахаро-фосфатным остовом первого и второго нуклеотида и высококонсервативной GXXG-петлей. В частности, фосфатная группа между первым и вторым нуклеотидом образует водородную связь с амидной группой третьего остатка GXXG-петли. Наконец, четвертый нуклеотид формирует стеккинг-взаимодействия с третьим нуклеотидом и образует связь с боковыми группами аминокислотных остатков (32 тяжа (в случае доменов второго типа РЗ тяжа).

Помимо вышеописанного канонического связывания четырех нуклеотидов, связывание дополнительных нуклеотидов может осуществляться при помощи вариабельной петли или других доменов белка. Например, присутствие дополнительного маленького домена QUA2, расположенного С-терминально по отношению к КН домену, позволяет связать еще три дополнительных нуклеотида. В NusA соприкосновение двух КН доменов второго типа приводит к связыванию двух добавочных нуклеотидов (Beiith et al., 2005).

RRM/RNP/RBD домен (мотив узнающий РНК)

RRM домен (RNA recognition motif) имеет длину примерно 90 аминокислотных остатков и является наиболее распространенным РНК-связывающим доменом высших позвоночных. Более того, это наиболее интенсивно изучаемый РНК-связыватощий домен, как в аспекте структурной биологии, так и в аспекте биохимии (Maris et al., 2005). Структура 11 комплексов RRM-содержащих белков с РНК и ДНК определена при помощи методов рентгеноструктурного анализа и ЯМР-спектроскопии (Auweter et al., 2006). С учетом того, что некоторые из этих белков содержат более чем один RRM домен, в настоящее время известна структура двадцати комплексов RNP-доменов и нуклеиновых кислот. Первичная структура RRM-домена характеризуется двумя консервативными мотивами, известными как RNP1 (K/R-G-F/Y-G/A-F/Y-V/I/L-X-F/Y) и RNP2 (V/I/L-F/Y-V/I/L-X-N/L). Структурно RRM домены состоят из четырехтяжевого антипараллельного р-слоя, укрепленного с боков двумя а-спиралями. Топология RBD-домена следующая: РсфРаР (Nagai et al., 1990). Каждый RRM домен связывает различное количество нуклеотидов, разнящееся от двух (в случае белка СВР20) (Calero et al., 2002) до восьми для и2В-белка (Price et al., 1998). Четырехтяжевой р-слой является первичной РНК-связывающей поверхностью. Он обычно содержит три ароматических аминокислотных остатка в двух центральных р-тяжах, взаимодействующих с двумя нуклеотидами. При этом 5'-конец первого нуклеотида и З'-конец второго образуют стеккинг-взаимодействия с ароматическими кольцами аминокислотных остатков, расположенных на pi тяже (второе положение в RNP2 последовательности) и рЗ тяже (пятое положение в последовательности RNP1). Третье ароматическое кольцо, расположенное на РЗ тяже (третье положение в последовательности RNP1), часто встраивается между двумя остатками иеитозы в дииуклеотиде (рис. 7). Однако, имеются и отклонение от основного характера связывания. Например, в RRM-домене СВР20 (Calero et al., 2002) и во всех четырех RNP доменах РТВ не наблюдалось связывания с РЗ тяжом, то есть не имелось основания эквивалентного каноническому второму нуклеотиду.

Во многих RRM доменах в дополнение к выше описанному динуклеотиду в связывании участвуют еще один-два нуклеотида. Так нуклеотид, расположенный 5'-проксимально к первому нуклеотиду, взаимодействует с р4 тяжом или с кластером, образованным pial-петлей и р2рЗ-петлей. Нуклеотид, расположенный З'-проксимально ко второму нуклеотиду, часто находится в контакте с RRM доменом, но может взаимодействовать и с другими участками белка. Например, в пяти разных RRM доменах 3'-проксимальный нуклеотид взаимодействует с вторым нуклеотидом и узнается частью белка, расположенной С-терминально по отношению к RRM домену, в то время как в четырех других RRM доменах этот нуклеотид образует связи с Р2 тяжом. Следовательно, подобно КН домену и домену, связывающему цинк, стандартный RRM домен имеет 4 нуклеотид-связывающих сайта.

Рис. 7. RRM домены. A. RRM домен Fox-1. В. RRM3 домен РТВ. С. Димер RRM доменов белка LethaI-Sex.D.RRM3 и RRM4 РТВ. Белковые цепи обозначены серым, кроме С-концевого RRM Sex-Lethal и RRM4 РТВ, которые показаны голубым, р-тяж 5 и междоменный линкер изображены красным. Боковые радикалы аминокислотных остатков, взаимодействующих с РНК, показаны зеленым. Первый и второй нуклеотиды -желтый и фиолетовый, соответственно (по Auweter, 2006).

В дополнение к канонической РНК-связывающей поверхности сайты связывания еще для трех нуклеотидов, расположенных 5'-проксимально по отношению к вышеописанному динуклеотиду, найдены в RRM-доменах U1A, U2B, HuD RRM1 и Fox-1 белков(РНК). Во всех этих комплексах РНК связывается с петлями pial, р2рЗ и а2р4. Однако в результате разных стеккинг-взаимодействий этот тринуклеотид принимает три различные конформации, в зависимости от конкретного белка. В RRM мотиве HuD-белка за стеккинг-взаимодействия отвечает первый остаток тирозина в pial-петле, в Fox-1 эту же самую функцию выполняет остаток фенил ал анина той же петли, тогда как у U1A и U2B белков нет остатков ароматических аминокислот в петле pial. Интересно, что в случае Fox-1 р-слой и pial-петля связывают РНК независимо, и мутации ароматических аминокислот одного из этих структурных элементов приводят к нарушению РНК-связывающей способности только соответствующего сайта, в то время как второй продолжает отлично действовать (Auweter et al., 2006).

Связывание нуклеотидов 3'-проксимальных по отношению к каноническому динуклеотиду явление гораздо более редкое и наблюдалось только у U2B или RRM2 и RRM3 доменов РТВ белка (Auweter et al., 2006). Дополнительные нуклеотиды связываются с участком белка, расположенным недалеко от Р-тяжа2. При этом в связывании всегда участвует петля р2рЗ, но у U2B в связывании также участвует N-конец al спирали, а у RRM доменов РТВ белка петля между Р4 тяжом и уникальным, встречающимся только у этих двух доменов р5 тяжом. Наличие этих дополнительных сайтов стало возможным в результате удлинения соответствующих RRM доменов, вследствие увеличения длины al-спирали у U2B и наличия уникального Р-тяжа у RRM доменов РТВ белка.

Структуры некоторых RRM доменов, связывающих РНК тандемно, также известны. В большинстве случаев два RRM домена разделены маленьким линкером и связывают два соседних участка в пределах одной молекулы РНК. Подобная топология обеспечивает большую поверхность связывания. Однако имеются и исключения из правила, например, RRM3 и RRM4 РТВ белка (Vitali et al., 2006). Эти домены так взаимодействуют между собой, что их РНК-связывающие поверхности распознают участки РНК, находящиеся далеко друг от друга. Эта структура предотвращает независимое связывание соседних пиримидиновых трактов двумя RRM доменами.

Дополнительные домены, взаимодействующие с РНК.

Помимо трех вышеописанных основных РНК-связывающих доменов есть еще два менее изученных и известных: PUM-H домен и домен, связывающий цинк. Члены семейства белков PUF, названного так из-за того, что первыми найденными членами семейства были белки Pumilio дрозофилы и FBF Caenorhabditis elegans, играют важную роль в регуляции развития широкого числа видов. PUF белки влияют на стабильность и трансляцию мРНК путем специфичного связывания с её З'-нетранслируемой областью. PUF белки содержат С-терминальный РНК-связывающий домен, называемый домен гомологичный Pumilio (PUM-H домен). PUM-H домен человеческого Pumiliol состоит из

37 аминокислотных PUF повторов и с С- и N-концов фланкирован PUF-схожими последовательностями. Структура человеческого Pumiliol в комплексе с РНК определена при помощи рентгеноструктурного анализа (Wang et ah, 2002). PUF повторы, состоящие из трех а-спиралей каждый, уложены в изогнутую структуру, напоминающую половинку пончика, диаметром примерно 80 ангстрем (Wang et al., 2001). РНК связывается с внутренней поверхностью PUM-H домена, и каждый нуклеотид контактирует с двумя соседними повторами (Wang et al., 2002). Все фосфатные группы экспонированы в сторону растворителя, тогда как азотистые основания взаимодействуют с боковыми цепями аминокислотных остатков. Вторая спираль всех повторов участвует в РНК-связывании. Для каждого нуклеотида боковая группа четвертого аминокислотного остатка спирали формирует два стеккинг-взаимодействия с верхней стороной плоскости азотистого основания, тогда как радикалы третьей и седьмой аминокислоты образуют с ним водородные связи. Кроме того, четвертый аминокислотный остаток второй спирали следующего повтора также образует стеккинг-взаимодействияс азотистым основанием этого нуклеотида, связываясь с нижней стороной его плоскости. Таким образом, происходит непрерывное изменение стеккинг-взаимодействий между азотистыми основаниями РНК и боковыми радикалами аминокислотных остатков белка (Wang et al., 2002).

Структура другого домена была лишь недавно определена методом ЯМР-спектроскогши на примере двух белков: Tislld (Hudson et al., 2004) и нуклеокапсидного белка MMLV (Dey et al., 2005) в комплексе с одноцепочечной РНК. Tislld - белок, вовлеченный в регуляцию стабильности мРНК, состоит из двух тандемных доменов «цинковые пальцы» типа СХ8СХ5СХ3Н. Каждый домен связывает специфически UAUU участок одноцепочечной РНК, находящийся в пределах AU-богатого элемента класса II (ARE) 5'-UUAUUUAUU-3'. Сахаро-фосфатный остов РНК обращен в сторону от поверхности белка, в то время как каждое из четырех оснований помещено в специальный связывающий компартмент, образованный основной белковой цепью и двумя ароматическими боковыми радикалами. U6, А7 и U8 обиваются вокруг консервативного фенилаланина, являющегося частью петли между третьим цистеином и гистидином «цинкового пальца». U6 и А7 образуют стеккинг-взаимодействия с обеих сторон кольца фенилаланина, и U8 взаимодействует с одним из краёв этого кольца. U8 и U9 по типу «сэндвича» связываются с консервативным тирозином петли между вторым и третьим цистеинами домена. Специфическое узнавание РНК первоначально достигается вовлечением всех участвующих в связывании азотистых оснований в образование водородных связей с главной цепью белка и боковыми радикалами цистеинов, координируемых атомом цинка (Hudson et al., 2004).

Нуклеокапсидный белок MMLV состоит из цинкового шарнира длиной 28 аминокислотных остатков типа СХ2СХ3НХ4С. Некоторые структуры этого белка в комплексе с различными одноцепочечными РНК уже определены (Dey et al., 2005). Хотя цинковый шарнир с высокой аффиностью связывает последовательность CUCG, он также может связываться и с другими четырехнуклеотидными последовательностями, если они содержат гуанин на З'-конце. Как и в случае Tislid в связывании РНК участвуют два ароматических остатков цинкового шарнира. Тирозин 28 (между первым и вторым остатком цистеина) образует стеккинг-взаимодействия с U306 , а триптофан 35 (между гистидином и третьим цистеином) с G309 (D'Souza et al., 2004). Таким образом, специфическое связывание с азотистыми основаниями осуществляется при участии боковых радикалов, но в узнавании нуклеиновой кислоты также принимает участие и главная белковая цепь.

Таким образом, различные по своей структуре РНК-связывающие белки выполняют в клетках важные и чрезвычайно разнообразные функции. Однако для данного обзора наибольший интерес представляют те РНК-связывающие домены, которые участвуют в формировании в эукариотических клетках трансляционно неактивных мРНП, поскольку именно такие рибонуклеопротеиды функционально наиболее схожи с невирионной транспортной формой вирусов растений.

Нативные частично или полностью неупорядоченные белки

Помимо вышеперечисленных типов доменов, связывающих РНК. существует еще одна большая группа белков способная взаимодействовать с РНК и полиморфная по своему составу. В последнее время все чаще стали появляться работы (и таких работ с каждым годом становится все больше), свидетельствующие о том, что многие белки не способны образовывать в водном растворе уникальную пространственную структуру, присущую глобулярным белкам, но при этом способны выполнять присущие им функции. Такие белки называли «нативно-денатурированными», «нативно-развернутыми» и т.п. В настоящее время их все чаще.' называют «природно неупорядоченными белками» (intrinsically disordered proteins; Uversky et al., 2005), подчеркивая, что неспособность образовывать глобулярную структуру является природным (неотъемлемым) свойством конкретной полипептидной цепи, обусловленным ее аминокислотной последовательностью и аминокислотным составом, тем не менее, несмотря на отсутствие фиксированной глобулярной структуры, они нормально функционируют и играют важные роли во многих процессах жизнедеятельности клетки. Следует, отметить, что нативными стали считать также глобулярные белки в частично свернугых промежуточных состояниях типа расплавленной глобулы, предшественника расплавленной глобулы и т. п. (Сердюк, 2007). Признаками неупорядоченности нативной структуры белка могут служить невозможность получения кристаллов белка, отсутствие выраженной структуры спектров кругового дихроизма в ближней УФ-областях спектра, большие гидродинамические размеры макромолекулы, аномальная электрофоретическая подвижность и т.п. Основным признаком частичной неупорядоченности является невозможность определения координат атомов части аминокислот полипептидной цепи методом рентгеноструктурного анализа.

Сейчас известно более 450 белков, которые, исходя из вышеизложенных параметров, можно отнести к природно неструктурированным. Анализ аминокислот в составе этих белков показал, что наиболее часто в неупорядоченных белках встречаются такие аминокислоты как Glu. Lys и Pro, в то время как появлению у белка уникальной третичной структуры способствуют такие аминокислоты как Asn, Тгр, Туг и Leu. Таким образом, можно предположить, что внутренний беспорядок в белках кодируется их аминокислотной последовательностью.

Одно из наиболее реалистичных предположений состоит в том, что способность полипептидной цепи образовывать глобулярную структуру связана с величиной суммарного заряда (неважно какого знака) и числом гидрофобных остатков. Чем меньше удельный вес аминокислот с гидрофобными боковыми радикалами и чем больше суммарный заряд полипептидной цепи, тем меньше вероятность образования этой полипептидной цепью компактной глобулярной структуры (Uversky et al., 2000, 2007). Детальное сравнение частично или полностью неупорядоченных белков и глобулярных белков показало, что их аминокислотные последовательности существенно различаются по целому ряду признаков. Например, последовательности частично или полностью неупорядоченных белков, как правило, содержат меньшее количество таких остатков, как триптофан, фенилаланин, тирозин, цистеин, валин, лецин и гистидин. В то же время количество полярных и заряженных остатков (включая лизин, аргинин, глютамин, аспарагин, глютаминовую и аспарагиновую кислоты, серии и треонин), а также количество пролинов в таких белках заметно превосходит соответствующие значения для глобулярных белков (Romero et al., 1997; Dunker et al., 1998). Анализ первичной структуры большого числа белков показал, что аминокислотные последовательности, не способные свернуться в глобулярную структуру, распространены в природе очень широко (Romero et al., 1998; Dunker et al., 2000; Ward et al., 2004; Oldfield et al., 2005). Длина аминокислотной последовательности, не способной образовать упорядоченную структуру, может быть разной. Белок может быть полностью неструктурированным или содержать отдельные элементы вторичной структуры. В некоторых белках полностью неструктурированным может быть один из доменов. Таким образом, спектр структурных свойств частично или полностью неупорядоченных белков чрезвычайно широк. В литературе описаны как полностью неупорядоченные белки, так и белки, обладающие в нативном состоянии свойствами расплавленной глобулы или предшественника расплавленной глобулы (Dunker, Obradovic, 2001; Uversky, 2002, 2003а, 2003b; Daughdrill et al., 2005). Существование небольших отрезков полипептидной цепи, не участвующих в образовании элементов вторичной структуры, давно известно. У некоторых белков, которые принято считать глобулярными, неструктурированными являются N- и С-концевые участки полипептидной цепи и ее петлевые участки, шарнирные участки, связывающие два домена. Таким образом, поскольку степень неупорядоченности в белках может быть очень разной, граница между глобулярными и частично неупорядоченными нативными белками условна (рис 8).

Атомы аминокислотных остатков неструктурированных белков полипептидной цепи обладают высоким уровнем подвижности и поэтому не Moryi быть определены методом рентгеноструктурного анализа. В случае глобулярных белков большей подвижностью обладают атомы аминокислотных остатков, входящих в состав активного центра ферментов или в петлевые участки, которые также участвуют во взаимодействии с партнерами и таким образом несут функциональную нагрузку. Например, в полимеризации актина участвуют петлевые сегменты (Holmes et al., 1990). Из этого следует, что для функционирования глобулярных белков также необходим определенный уровень подвижности. Большинство "глобулярных белков — это ферменты, каждый из которых выполняет строго специализированную функцию. Поэтому понятно, что у ферментов высокой подвижностью должен обладать только активный центр, а вся молекула должна быгь жесткой. Неупорядоченные полипептидные цепи, не способные образовать компактную глобулярную структуру за счет самоорганизации, могут образовать компактную структуру при взаимодействии с партнерами, если свободная энергия возникающего при этом комплекса меньше свободной энергии белка и его партнера до взаимодействия. Потенциальная способность частично или полностью неупорядоченных белков к взаимодействию с различными партнерами является основой выполнения такими белками их функции, которая состоит в специфическом узнавании партнеров (лигандов, других белков, нуклеиновых кислот и т.д.), образования с ними комплексов и участии за счет этого в передаче сигналов, контроле и регуляции различных внутриклеточных процессов.

Рис. 8. Разнообразие структурной упорядоченности в белках.

О—полностью структурированная глобула белка, нет неупорядоченных участков полипептидной цепи; 1—не упорядочены К- и С-концевые участки полипептидной цепи; 2—не структурированы линкерные участки цепи; 3—не структурированы петли; 4—не структурирован один из двух доменов белка; 5—структурированы лишь небольшие участки полипептидной цепи белка; 6, 7— практически полностью неструктурированный белок (по Туроверов и др. 2009).

В настоящее время известно множество неупорядоченных белков, изменяющих свою структуру при взаимодействии с лигандом. Стоит отметить, что масштаб структурных перестроек в молекуле белка с неупорядоченными участками существенно выше, чем в молекуле белка с прочной третичной структурой. Изменения, происходящие с природно неупорядоченными белками под действием лиганда, разнообразны: от случая, когда один из партнеров обладает уникальной третичной структурой, а второй приобретает её только после взаимодействия, до случая, когда один из партнеров обладает уникальной третичной структурой с неупорядоченными элементами. Важно, что большинство неупорядоченных белков приобретает третичную структуру только после взаимодействия с партнером, что означает, что наличие природной неупорядоченности в белках определяется не только аминокислотной последовательностью, но и внешними условиями. Этот обстоятельство является необходимым для выполнения природно неупорядоченным белком его функции. Стоит также отметить, что конформация природно неупорядоченных белков в комплексе определяется партнером по взаимодействию, а не собственной аминокислотной последовательностью, как это характерно для структурированных глобулярных белков (Сердюк, 2007).

Анализ предсказаний по 159. протеомам показывает, что белки эукариот обладают более четко выраженной тенденцией к неупорядоченности, чем прокариоты (1е:йу, 1999). Зачем же эукариотической клетке нужны белки с внутренней неупорядоченностью? Причин может быть несколько. Одной из таких причин может способность неупорядоченных белков к быстрой деградации (Кп\уас1а & а1., 1996). Предполагается, что большую часть времени неупорядоченные белки проводят в комплексе в партнером, устойчивым к действию протеаз. Удаление партнера из комплекса приводит к протеосомной деградации белка, что может служить средством быстрой регуляции в процессах трансляции и транскрипции (Кп\уас1а е1 а1., 1996). Таким образом, наличие неупорядоченных белков в эукариотической клетке отражает необходимость наличия системы быстрого регулирования различных клеточных процессов.

Другая причина может заключаться в том, что неструктурированные белки за счет их полифункциональности позволяют эукариотической клетке обходиться фактически тем же количеством белков, что и клетке прокариот (Оипаэекагап е1 а1., 2003). Подобная экономность может отражать «бережливую изобретательность эволюции» (ЗиЬгаташап, 1983).

Еще одно объяснение этого любопытного факта связано с процессами молекулярного узнавания. Молекулярное узнавание является общей функцией структурированных белков и белков с внутренней неупорядоченностью. Однако, по аналогии с механизмом сворачивания белка внутри канала предположили, что белки с внутренней неупорядоченностью могут иметь радиус захвата партнера больше, чем компактные белки с ограниченной конформационной подвижностью. Участок белка, находящийся в развернутом состоянии имеет возможность образовывать начальные контакты с местом связывания на большем расстоянии из-за большего масштаба флуктуаций, тогда как тот же участок, находящийся в свернутом состоянии, такой возможности не имеет.

Ну и, наконец, существование белков с внутренней неупорядоченностью обеспечивает возможность проникновения некоторых белков через «мелкие» отверстия. Примерами этому может служить транспорт белков через плазмодесмы растений или транспорт флагеллина через крюк жгутика (Schuster and Khan, 1994).

РНК-связывающие белки как РНК-шапероны

Было отмечено, что структурная лабильность отдельных элементов системы является общей чертой для всех процессов распознавания РНК, поскольку такие изменения почти всегда сопровождаются конформационными изменениями в структуре белка, РНК или обоих партнеров сразу (Wright and Dyson, 1999; Williamson, 2000). Наиболее характерными примерами такого поведения являются такие белки, как транскрипционный белок N бактериофага X (Mogridge et al., 1998), ядерный La белок (Jacks et al., 2003), REV белок вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) (Battiste et al., 1996) и различные рибосомальные белки (Ban et al., 2000). Однако, не всех вышеперечисленных случаях белки имеют отношение к выполнению функции РНК-шаперона, так не все РНК-связывающие белки являются РНК-шаперонами, правильнее разделить эти белки на две различные группы: лигандов, стабилизирующих структуру РНК через специфическое связывание, и шаперонов, которые взаимодействуют с промежуточными вариантами структуры РНК в процессе её сворачивания, часто неспецифическим способом (Cristofari and Darlix, 2002; Jacks et al., 2003, Herschlag, 1995). В случае РНК шаперонов известны множество примеров, когда белок, обладающий РНК-шаперонной активностью, имел участки с природной неупорядоченностью.

Классическим примером такого белка является А-белок гетерогенного ядерного рибонуклеопротеида (гяРНП), который эффективно обеспечивает ренатурацию комплементарных цепей нуклеиновой кислоты. Этот белок имеет неструктурированный глицин-богатый С-концевой домен, обладающий высокой РНК-шаперонной активностью и участвующий в сборке РНП-комплекса (Pontius and Berg, 1990). Это наблюдение позволило предположить, что неструктурированные, лабильные участки белка способны ускорять реакции сборки, такие как ренатурация нуклеотидных цепей или сборка макромолекул (Pontius, 1993).

Другим подтверждающим эту идею примером может быть родственный дрожжевому ТуЗ ретотранспозон, который кодирует ревертазу и нуклеокапсиднын белок (NCp7/9). Нуклеокапсидный белок имеет два мотива «цинковых пальца» и неструктурированные участки с N- и С-концов, которые участвуют в реакции переноса цепи в процессе обратной транскрипции (Gabus et al., 2001). РНК-шаперонный эффект описан также для рибосомальных белков, таких как L5 и S12, которые помогают правильному сворачиванию рибосомальных РНК (DiNitto and Huber. 2003; Clodi et al., 1999). Другим примером моде г служить прионный белок, для которого недавно была показана NCp7/9-подобная шаперонная активность, локализованная в неструктурированной N-концевой области (Gabus et al., 2001).

На основании этих примеров была проведена оценка числа белков с природно неупорядоченными участками внутри класса белков с РНК-шаперонной функцией (Тотра and Csermely, 2004). В результате 27 белков с РНК-шаперонной активностью при помощи компьютерного сервиса PONDR были проанализированы на предмет наличия у них неструктурированных участков. Оказалось, что среди РНК-шаперонов число белков с природной неупорядоченностью чрезвычайно велико. Не так давно, Данкер и его коллеги искали природную неупорядоченность в различных функциональных классах белков и выяснили, что наибольшей степенью неупорядоченности обладали регуляторные, опухоль-ассоциированные белки, а также белки клеточного сигналинга. Интересно, что количество белков с неупорядоченными участками среди РНК-шаперонов приблизительно соответствовало количеству аналогичных белков среди регуляторных белков, а процентное содержание аминокислотных остатков, образующих неупорядоченные участки, было значительно выше, чем у остальных функциональных классов белков (Tompa and Csermely, 2004). Эти данные подтверждают, что природная неупорядоченность очень важна для осуществления белком РНК-шаперонной функции.

По всей видимости, для функционирования белка, как РНК-шаперона важны две основные особенности, которыми обладают белки с неупорядоченными участками. Одним ключевым моментом для проявления шаперонной активности является универсальность белка с неупорядоченными участками относительно выбора и распознавания лиганда. Неоднократно было показано, что природно неупорядоченные белки способны узнавать несколько разных лигандов, что, вероятно, увеличивает скорость взаимодействия, а также обеспечивать сильное неспецифическое связывание. Для многих РНК-шаперонов, таких как рибосомальный белок L5, белок REV ВИЧ, белка A.N и многих других, показано, что именно неупорядоченные участки вовлечены во взаимодействие с РНК.

Другим важным аспектом функционирования белка как шаперона является способность природно неупорядоченного белка приобретать третичную структуру от взаимодействия с лигандом. На'основании этих двух ключевых факторов, Томба и коллеги предложили механизм осуществления белком шаперонной функции. РНК-шаперон, взаимодействуя с неправильно свернувшимся субстратом, структурируется, тем самым «оплачивая» переход субстрата, попавшего энергетическую «ловушку», в метастабильное, несвернутое состояние, из которого субстрат может заново, на этот раз уже правильно, свернуться. Подобный механизм в результате, которого происходит упорядочивание шаперона и развертывание субстрата носит название «модель переноса энтропии» (Tompa and Csermely, 2004). Изменения в структурах неупорядоченного белка с активностью РНК-шаперона и РНК были детектированы в таких системах РНК:шаперон, как лизиновая тРНК и нуклеокапсидный белок ВИЧ (Tisne et al., 2001), а также в случае мРНК и белков с доменом холодового шока (Phadtare et al., 1999).

Помимо выше описанного механизма существует, и другая возможность белка с неупоряоченными участками влиять на структуру РНК, с которой он взаимодейтсвует. Так для тех белков, которые участвуют в стабилизации структуры нуклеиновой кислоты, таких как Cyt-18 или многих рибосомных белков, возможно структурирование и белка, и субстрата. В этих случаях энергия связывания может перекрыть «затраты» на упорядочивание РНК-шаперона и его лиганда.

Функции клеточных РНК-связывающих доменов, участвующих в образовании трансляционно неактивных мРНП (на примере CSD домена)

Живые организмы от бактерий до человека содержат семейство белков с очень консервативной аминокислотной последовательностью длиной около 70 аминокислотных остатков. Бактериальные белки этого семейства состоят только из этой последовательности и имеют молекулярную массу около 7 кДа. Они служат для адаптации бактерий к росту при низких температурах и получили название «главные белки холодового шока» (major CSP, Cold Shock Proteins) (Yamanaka et al., 2001). Высокогомологичная бактериальным белкам аминокислотная последовательность в составе более крупных эукариотических представителей семейства была названа доменом холодового шока (CSD, Cold Shock Domain) (Tafiiri et al., 1990). У эукариот белки с CSD (CSD белки) обнаружены в митохондриях, ядре и цитозоле и содержат от одного до пяти CSD, наряду с другими доменами, различающимися по своему строению у разных членов этого семейства. Растительные 'CSD белки, подобно бактериальным, способствуют адаптации растений к низким температурам (Karlson et al., 2003).

Характерной особенностью CSD является наличие двух уже упомянутых консенсусных мотивов РНП-1 (K/N-G-F/Y-G-F-I/V) и РНП-2 (V-F-V-H-F) (Yamanaka et al., 2001). Все известные пространственные структуры бактериальных CSD белков очень схожи и состоят из пяти ß-тяжей. Эти ртяжи формируют два антипараллельных ß-листа: один ß-лист образован тяжом ßl (ближайшим к N-концу белка) вместе с тяжами ß2 и ß3, а другой - тяжами ß4 и ß5. Эти два ß-листа в пространстве прилегают друг к другу так, что образуется бочонкообразная структура, называемая ß-баррелем. При формирования такой структуры ß-тяжи укладываются по типу «греческого ключа» (Скабкин и др., 2004). Хотя структуры различных CSD белков почти совпадают, некоторые отличия между ними наблюдаются в основном в петлях, соединяющих ß-тяжи, и прежде всего в протяженной петле между ß3 и ß4. Образуемый ß-баррель очень компактен. РНП-1 и РНП-2 консенсусы находятся, соответственно, на ß2 и ß3 тяжах и оказываются сближенными в пространстве. Таким образом, CSD домен сочетает в себе признаки как OB, так и RRM домена.

Все исследованные CSD белки обладают высоким сродством, как к ДНК, так и к РНК и могут связываться с любыми нуклеотидными последовательностями, хотя оказывают определенное предпочтение некоторым специфическим мотивам, особенно в составе одноцепочечных участков нуклеиновых кислот (рис. 9) (Matsumoto et al., 1998). Вполне вероятно, что именно эти свойства белков рассматриваемого семейства лежат в основе многочисленных функций, выполняемых ими в РНК- и ДНК-зависимых процессах. Один из CSD белков эукариот (YB-1) связывается с предшественниками эукариотических мРНК в клеточном ядре и принимает участие в сплайсинге. Этот же белок в цитоплазме упаковывает мРНК в «маскированные» мРНП (информосомы) и осуществляет глобальный позитивный и негативный контроль трансляции мРНК, а также стабилизирует мРНК, защищая ее от экзонуклеаз. Митохондриальный белок с доменом холодового шока RBP16 участвует в процессе редактирования мРНК.

Несмотря на то, что CSD белки широко распространены в живом мире от бактерий до человека, в геномах некоторых организмов гены таких белков не обнаружены (Yamanaka et al., 2001). К таким организмам относятся архебактерии. Предполагается, что архебактериям CSD-белки не нужны, поскольку они обычно обитают при высоких и стабильно поддерживаемых температурах. Однако ни одного гена CSD белков пока не обнаружено и у пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae. До сих пор нет ответа на вопрос, почему такие важные для других организмов гены отсутствуют в дрожжах, и чем компенсируется их отсутствие. История изучения CSD белков насчитывает не более 15 лет. Функции большинства членов этого семейства пока не исследованы. Наиболее хорошо изучены к настоящему времени некоторые бактериальные белки семейства, прежде всего в Escherichia coli, а также эукариотические представители подсемейства YB-1. YB-1 содержит 324 а. о. и состоит из трех доменов. На N-конце находится небольшой домен, богатый аланином и пролином (А/Р-домен), далее идет домен холодового шока (CSD), а за ним - протяженный йестуктурированный С-концевой домен (С-домен), состоящий из чередующихся кластеров положительно и отрицательно заряженных аминокислотных остатков, с размером каждого кластера примерно в 25-30 остатков (Скабкин и др., 2004).

CspA

LTN-28

DjY-1 p50/FRGY 2

Unr

Л ■ I

CSD

RGG-повторы

- заряженные островки

ССНС цинковый

Рис 9. Модульная организация различных белков с CSD доменами.

CSD белки как шапероны мРНК

Существует множество описаний бактериального CspA как шаперона мРНК (Jiang et al., 1997). Это описание также распространяется на многие другие CSD белки, взаимодействующие с мРНК, и, регулирующие трансляцию в процессе развития организмов. Общим свойством эмбриональных и постнатальных процессов является способность ооцитов, сперматоцитов и стволовых клеток резервировать генетическую информацию в виде стабильных молекул мРНК, которые удерживаются в нетранслируемой форме, до тех пор, пока не понадобятся кодируемые ими белки (Standart, 1992). Транскрипция на стадиях клеточного цикла, содержащих активный хроматин, может обеспечивать синтез и запасание мРНК, нужной на более поздних этапах, когда хроматин не активен, для начала экспрессии генов (Almouzni et al., 1993). Такая временная трансляционная репрессия является основной функцией для многих белков (так называемых маскирующих белков), связывающихся с мРНК, и, предотвращающих инициацию или элонгацию трансляции. Многие из маскирующих белков разных организмов содержат домен холодового шока: FRGY2 - CSD белок из ооцитов Xenopus участвует в репрессии трансляции материнской мРНК до созревания ооцитов и раннего эмбриогенеза; MSY2 выполняет сходную в мышиных половых клетках; LIN-28, экспрессируемый в С. elegans, отвечает за временную регуляцию генов на посттранкрипционном уровне; DjYl планарий экпрессируется в регенерирующих тканях, где он регулирует активность мРНК, отвечающих за дифференцировку клеток (Sommerville, 1999). Общим свойством всех этих белков, регулирующих развитие или стрессовые процессы, является способность поддерживать мРНК в нетранслируемой одноцепочечной форме.

Рис. 10. (а). В дополнение к CSD белку ооцитов Xenopus FRGY2, в составе мРНП частицы также присутствуют РНК хеликаза р54 и протеинкиназа СК2. В результате взаимодействий между этими белками формируется белковый комплекс -маскосома. (б). Стабильность маскированной мРНК обеспечивается белок-белковыми взаимодействиями, возможно при участии FRGY2. (в). В кроличьих ретикулоцитах CSD белок р50 в небольших концентрациях выявлен в составе полисом.

YB-1 белок (р50) в ретикулоцитах кролика является мажорным белком как нетранслируемых (свободных), так и транслируемых (полисомных) мРНП. Однако содержание этого белка в транслируемых мРНП на то же количество мРНК вдвое ниже, чем в свободных (Minich and Ovchinnikov, 1992). YB-1 белок из ретикулоцитов кролика способен ингибировать процесс трансляции как в бесклеточных системах (Minich and Ovchinnikov, 1992), так и в культуре клеток млекопитающих (Davydova et al., 1997). YB-1 белок in vitro избирательно подавляет процесс трансляции некэпированных мРНК при более низких концентрациях, чем кэпированиых мРНК (Svitkin et al., 1996).

Предполагается, что р50 может обеспечить селективное выключение трансляции тех мРНК, которые вступили на путь деградации, одним из первых этапов которой является отщепление кэпа от мРНК (Скабкин и др., 2004). Подавление трансляции кэпированных мРНК наступает при соотношениях YB-1/мРНК близких к таковому в свободных нетранслируемых мРНП, где содержание р50 очень высоко, и белок, по-видимому, насыщает мРНК. Ингибирование под действием YB-1 белка наблюдается исключительно на стадии инициации. Более детальное исследование этапа инициации трансляции, который ингибируется р50, показагго, что это происходит до присоединения малой субчастицы рибосомы к мРНК, так что мРНК обнаруживается в присутствии ингибирующих количеств р50 в форме свободных мРНП (Nekrasov et al., 2003). За ингибирование трансляции отвечает в основном неструктурированный С-домен р50. Этот домен, так же как и целый YB-1 белок, вытесняет из комплекса с мРНК фактор инициации eIF4G - наиболее крупную из субъединиц фактора инициации eIF4F, которая взаимодействует с мРНК и служит платформой для размещения двух других субъединиц этого фактора: АТФ-зависимой хеликазы eIF4A и кэп-связывающей субъединицы eIF4E, а также фактора инициации eIF3 и поли(А)-связывающего белка РАВР (Poly(A) Binding Protein), ассоциирующего с 3' концевой поли(А)последовательностью мРНК (Nekrasov et al., 2003).

В дополнение к CSD белку FRGY2, зрелая мРНП частица содержит DEAD-box РНК-хеликазу р54 и каталитическую субьединицу протеинкиназы СК2 (Ladomery et al., 1997). Так как оба фермента обнаружены в качестве стабильных, пусть даже временных, компонентов частиц мРНП, кажется логичным предположить, что они нужны для сборки частицы или рекрутирования мРНК к полисомам. Поскольку Хр54 хеликаза необходима для эффективного связывания FRGY2 с мРНК in vitro, она определенно играет важную роль на ранних этапах сборки мРНП, заключающуюся в расплетании мРНК для взаимодействия с FRGY2 (Ladomery et al., 1997). Тем не менее, Хр54 продолжает быть частью мРНП и на более поздних стадиях, и исключить то, что хеликаза важна и на этих этапах нельзя (рисю 10а). Напротив, индуцируемые изменения в структуре мРНП могут стать решающими для связывания ил if высвобождения белков. Интересно, что белок Stel3 (гомолог Хр54) нужен для прохождения мейоза, для которого необходима трансляция зрелых мРНК, кодирующих белки клеточного цикла, циклины и циклин-зависимые киназы (Gebauer et al., 1997).

Хотя фосфорилирование FRGY2 СК2 киназой в ооцитах оказывает небольшой эффект на связывание РНК in vitro, возможно это фофорилирование важно для стабильности белок-белковых взаимодействий внутри мРНП частицы (Deschamps et al.,

1997). Более того, отмена фосфорилирования специфическими ингибиторами СК2 приводит in vivo к высвобождению мРНК из трансляционно неактивной формы. Таким образом, CSD белок, РНК-хеликаза и протеинкиназа формируют макромолекулярный комплекс (маскосому), обеспечивающий маскирование мРНК (Sommerville, 1999).

Среди множества факторов, приводящих к трансляционной активации, очень важным является высвождение из состава информосомы CSD белка (Standart, 1992). Механизмы высвобождения этого белка включают изменение статуса фосфорилирования FRGY2 и взаимодействие белков, содержащих отрицательно заряженные аминокислот с основными островками на поверхности FRGY2 (рис. 106) (Meric et al., 1997). Хотя массовая деградация FRGY2 и других мРНП-формирующих белков наблюдается уже через несколько часов после оплодотворения, вполне вероятно, что эти функции могут выполнять их экспрессируемые в зиготе гомологи, например соматический CSD белок FRGY1 (Ranjan et al., 1993). Также имеются доказательства, полученные в результате исследований на клетках млекопитающих, что CSD белки присутствуют в составе полисом. Как уже говорилось ранее. р50 остается связанным с мРНК в полисомах. Более того, низкие концентрации р50 увеличивают эффективность трансляции, это является подтверждением идеи о том, что для ингибирования трансляции важно количество CSD белков, связанных с мРНК. Таким образом, большая плотность CSD белков на мРНК приводит к ингибированию трансляции, в то время как малые" концентрации CSD белка повышают эффективность трансляции.

В последнее время накапливаются доказательства, поддерживающие точку зрения, что поведение мРНК определяется рядом событий предшествующих трансляции, таких как активация транскрипции или сплайсинг (Matsumoto et al., 1998). Природа промоторов, количество и положение интронов в транскрипционной единице определяют, будет или нет, мРНК продуктивно транслироваться. Заманчиво предположить, что эта связь обеспечиваются CSD белками, которые могут быть как трансляционными активаторами, так и трансляционными репрессорами и найдены в ассоциатах с синтезированными транскриптами в хромосомах типа ламповых щеток. Способность CSD белков взаимодействовать со специфичными промоторами генов и транскриптами, а также оставаться связанными с мРНК после ремоделирования трансляционно неактивного мРНП, может помочь охарактеризовать полную картину экспрессии определенного класса генов (Sommerville, 1999).

CSD белки как гистоны ¡yiPHK.

Способность CSD белков упаковывать мРНК и регулировать её активность может рассматриваться как аналог роли коровых гистонов в упаковке и регуляции активности и уровня компактизации ДНК. Как и гистоны CSD белки, вовлеченные в маскирование мРНК, появляются собранными на новосинтезированных полинуклеотидах в результате активности мультибелковых комплексов, которые не только доставляют белки для упаковки нуклеиновой кислоты, но и организуют структуру нуклеопротеина (Yurkova et al., 1997). Кроме того, было обнаружено, что белок YB-1 и его гомологи способны эффективно стабилизировать мРНК, содержащие кэп-структуру, препятствуя их распаду в клетках и клеточных лизатах. Наибольшая стабилизация мРНК достигается при высоком соотношении YB-1/мРНК, что сопряжено с выходом мРНК из полисом и выключением из процесса трансляции. Кэп-зависимая стабилизация мРНК в клетке и лизатах не исключает чрезвычайно высокую чувствительность мРНК к эндорибонуклеазам. Парадокс легко объясняется тем, что деградация мРНК в клетке происходит обычно с концов под действием экзонуклеаз, а при высоких соотношениях YB-1/мРНК концы мРНК, вероятно, становятся недоступными для этих нуклеаз. Исследование роли различных доменов белка YB-1 в стабилизации мРНК показало, что стабилизация обеспечивается CSD, который вытесняет факторы инициации трансляции eIF4E, eIF4A и eIF4B с кэп-структуры мРНК (Nekrasov et al., 2003). С-домен, обладающий наибольшей активностью в подавлении белкового синтеза и вытесняющий eIF4G с мРНК, не повышает стабильности мРНК. Способность YB-1 и его гомологов предохранять молекулы мРНК от деградации при их насыщении белком может объяснять высокую стабильность маскированных мРНК, запасенных в виде комплексов с этими белками в половых клетках (Nekrasov et al., 2003).

Плотность упаковки, как нуклеосомных, так и CSD белков является главным условием для перехода между активным и неактивным состояниями. Такие переходы также могут обеспечиваться небольшими структурными модификациями, такими как ацетилирование гистонов пли фосфорилирование CSD белков. В дополнение к общим РНК-связывающим свойствам, для FRGY2 было продемонстрировано повышенное сродство к шестинуклеотидной последовательности AACAUC (Bouvet et al., 1995). Можно предположить, что подобные РНК-связывающие свойства будут обнаружены и для многих других CSD белков. Такая комбинация общих и специфичных РНК-связывающих свойств, приводящих к упаковке мРНК и регуляции её трансляции, напоминают свойства гистонов, упаковывающих ДНК и регулирующих её транскрипцию.

Согласно предложенной Скабкиным и его коллегами гипотезе формирование трансляционно неактивного мРНП происходит следующим образом: на первом этапе узнавание РНК обеспечивает неструктурированный С-конец белка, затем во взаимодействие включается СЭВ-домен белка УВ-1. После этого молекулы белка взаимодействуют между собой через неупорядоченные С-концевые участки, образуя глобулярные структуры, на которые наматывается РНК, подобно тому, как ДНК наматывается на нуклеосому (ЭкаЬкт е! а1„ 2004).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Реактивы.

В работе использовались следующие реактивы: агароза фирмы "Promega", "Sigma". Ni2+ нитрилотриацетатная (Ni-HTA) агароза фирмы D1AGEN/QIAGEN (Германия, США). Бактоагар, бактотриптон, дрожжевой экстракт Difco (США). Персульфат аммония, ЭДТА, ПМСФ, БСА. ГТФ, канамицин Serva (Германия). TEMED Reanal Венгрия. ИПТГ, ампициллин, тетрациклин Биопол (Москва, Россия). Акриламид, НДЧ'-метиленбисакриламид, дитиотрейтол, ß-меркаптоэтанол, неионный детергент Tween-20, глицин, кумасси ярко-голубой R-250, понциановый красный, бромфеноловый синий, BCIP/NBT, додецилсульфат натрия (ДДС-Na), NaOH, RbCl, СаС12, MnCl2, MgCl2, LiCl, Na2HP04, NaH2P04 Sigma (США). Глицерин, гуанидин гидрохлорид, фенол ICN (США). Мочевина, трисаминометан (Трис) Merck (Германия). Ледяная уксусная кислота, этанол, HCl, ацетат калия, сахароза «АО Мосреактив», Москва, Россия. Все реактивы отечественного производства имели квалификацию осч. Нитроцеллюлозная мембрана с диаметром пор 0,45 микрон (Protran).

Ферменты и наборы.

В работе использовались ферменты: РНКазаА, ДНКаза, Т4-ДНК-лигаза, Т7-РНК-полимераза, протеинкиназа С, РНазин (ингибитор РНКаз), фирмы Promega (США), Биопол (Москва, Россия). Taq-полимераза, рестриктционные эндонуклеазы BamHI, EcoRI, Xbal, Hind III производства "Fermentas" (Литва), Promega (США). Также в работе использовался набор для выделения ДНК из геля и набор для выделения вирусных нуклеиновых кислот фирмы "QIAGEN"

Векторы для клонирования и бактериальные штаммы

В работе использовали плазмидные векторы pQE30 для клонирования (QIAGEN) вектор экспрессии, содержащий ген устойчивости к ампициллину). При клонировании использовали штамм E.coli JM-109 . Белки экспрессировали в штамме E.coli М15,

Выделение плазмидной ДНК

Бактериальный клон высевали в 3 мл бульона 2xYT, содержащего ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, и выращивали в течение ночи при 37°С в режиме 185 качаний/мин. Отбирали в центрифужную пробирку Eppendorf 1,5мл ночной культуры клеток требуемого клона. Клетки осаждали центрифугированием в течение 10 минут (12000 об/мин), ресуспепдировали в 250 мкл раствора 1 (50 мМ глюкоза, 10 мМ ЭДТА. 25 мМ трис-HCl - рН 8,0) и добавляли 250 мкл раствора 2 (0,2 M NaOH, 1% DS-Na), осторожно перемешивали и выдерживали во льду 5 мин. К лизату клеток добавляли 250 мкл раствора 3 (3 M ацетат натрия, 2 M уксусная кислота, рН 4,8) перемешивали, выдерживали во льду 10 мин и центрифугировали 10-15 мин (14000 об/мин). Супернатант переносили в новые пробирки, добавляли равный объем 96% этанола, и центрифугировали 10 мин. Осадок растворяли в 100 мкл дистилированной воды, добавляли равный объем 8 M LiCl, перемешивали и выдерживали 20 мин при -20°С. После этого ДНК осаждали центрифугированием в течение 10 мин. (14000 об/мин.), осадок промывали 70% этанолом, высушивали, а затем растворяли в 50-100 мкл воды.

Амплификация фрагментов ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)

ПЦР проводили в объеме 50 мкл в пробирках для ПЦР объемом 0,4 мл. В реакционную смесь добавляли 1,25 мкл 50 мМ хлорида магния, 5 мкл 10-ти кратного буферного раствора (200 мМ трис-HCl, рН 8,4, 500 мМ КС1), 5 мкл 2 мМ раствора дезоксинуклеотидтрифосфатов, специфические олигонуклеотиды из расчета 1 мкл олигонуклеотида с концентрацией 5 о.е. на пробу, матрицу ДНК (50-100 нг) и доводили тридистиллированной водой до конечного объема 50 мкл. На пробу брали 2.5 ед. Tag-полимеразы из The г m us aquations YT1 (фирма «Fermentas», Литва или «Сибэнзим», Новосибирск). Сверху на пробу наслаивали 50 мкл минерального масла, производства «Sigma», США. В работе использовался амплификатор ДНК "Perkin Elmer Cetus". Плавление ДНК проходило в течение 45 сек. при 95°С, отжиг специфических олигонуклеотидов - в течение 1 мин при 65°С, амплификация ДНК - в течение 1 мин при 72°С. Амплификация происходила в течение 30 циклов. Полученный продукт обрабатывали равным объемом раствора фенола в хлороформе и переосаждали 3 объемами 96% этанола и 1/10 объема 3 M ацетата натрия. Осадок промывали 70% этанолом, сушили и растворяли в 20 мкл тридистиллированной воды.

Расщепление ДНК рестрикциопными эндонуклеазами

Использовались буферные растворы производства "Fermentas", Литва. Для рестрикционных эндонуклеаз: EcoRI, и HindIII буферный раствор "R" (10 мМ трис-НС1, 10 мМ MgCl2, 100 мМ КС1, 1мМ DTT; рН 8,5 при 37°С); для рестрикционной эндонуклеазы BamHI буферный раствор "В" (10 мМ трис-HCl, 10 мМ MgCl, 1 мМ DTT; рН 7,5 при 37°С); для рестрикционной эндонуклеазы Xbal буферный раствор "Y" (33 мМ трис-ацетат, 10 мМ ацетат магния, 66 мМ ацетат калия, 0,5 мМ DTT; рН 7,9 при 37°С).

Рестрикцию проводили в объеме 20 мкл. Прибавляли 1-10 ед. рестриктазы и инкубировали при 37°С в течение 1-2 часов.

Электрофорез в агарозном геле

РНК или ДНК пробы смешивали с буфером для нанесения, содержащего 50% глицерина и 0,025% бромфенолового синего, и наносили на гель (0,8-2,0%) под слой электрофорезного буфера ТБЭ (0,089 М трис-борат, 0,002 М ЭДТА pH 7,8), либо ТАЭ (0,089 М трис-ацетат, 0,002 М ЭДТА pH 7,8). Электрофорез проводили при напряжении 60-150 В.

Извлечение фрагментов ДНК из агарозы

При помощи скальпеля из геля вырезали кусочек, содержащий необходимый фрагмент ДНК и помещали его в пробирку фирмы "Eppendorf. Для выделения ДНК использовали набор для выделения фрагментов ДНК из агарозы, "DNA Extraction Kit" фирмы «QIAGEN», и точно следовали указаниям, приведенным в методическом руководстве.

Лигирование фрагментов ДНК

Реакцию лигирования фрагментов с совместимыми липкими концами проводили в следующих условиях: на Юмкл объема лигазной смеси брали 1мкл 10х лигазного буфера (MBI Fermentas) (300 мМ трис-HCl (рн 7,8), 100 мМ MgCl2,100 мМ ДТТ), 1мкл 10 мМ АТФ, 0,05 мкг вектора, 0,1-0,4 мкг фрагмента ДНК и 5 еД Т4-ДНК-лигазы. Смесь инкубировали в течение 2-3 часов при комнатной температуре.

Трансформация бактериальных клеток плазмидной ДНК

Для трансформации клеток E.coli применялась следующая методика. 0,5 мл ночной культуры клеток E.coli (штамм JM-109) высевали в 40 мл LB-среды (бакто-триптон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, NaCl 5 г/л), содержавшей тетрациклин в концентрации 5 мкг/мл, и выращивали при качании 200 об/мин около 2 часов при 37°С. Затем клетки осаждали центрифугированием при 6000 об/ мин при 4°С (ротор J-20, центрифуга JA-21 фирмы «Beckman», США). Осадок ресуспендировали в 25 мл охлажденного до 4°С раствора 10 мМ трис-HCl, pH 7,8, 50 мМ СаСЬ. Суспензию инкубировали 20 мин при Затем повторно центрифугировали при 6000 об/мин в течение 5 мин., осадок ресуспендировали в 2,5 мл раствора 50 мМ трис-HCl pH 7,8, 50 мМ СаСЬ и инкубировали 30 мин. при 0°С. В дальнейшем полученную таким образом суспензию компетентных клеток хранили при -70°С. 200 мкл суспензии компетентных клеток, размороженных при 0°С, смешивали с 20 мкл лигазной смеси (либо с менее чем 0,1 мкг плазмидной ДНК), инкубировали 20 мин во льду и, после теплового шока (2 мин при 42°С с последующем охлаждением во льду), прибавляли 0,3 мл LB-ереды и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Затем клетки высевали на чашки Петри с 1,5% агаром, приготовленном на LB-среде и содержащем ампициллин (50 мкг/мл) и тетрациклин (10 мкг/мл). Чашки Петри инкубировали при 37°С около 18 часов.

Для трансформации клеток штамма М15 E.coli применялась следующая методика: 0,25 мл ночной культуры высевали в 50 мл LB-среды, содержавшей канамицин в концентрации 25 мкг/мл, и выращивали при качании 200 об/мин 2-3 часа при 37°С. Затем клетки осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 3500 об/мин при 4°С (ротор J-20, центрифуга JA-21 фирмы «Beckman», США). Осадок ресуспендировали в 22 мл охлажденного до 4°С раствора 1 (Ш0 мМ RbCl, 100 мМ МпСЬ, 30 ацетат калия, 10 мМ СаС1г, 15% глицерин, pH 5,8) и выдерживали 2 часа во льду. Затем повторно центрифугировали при 3500 об/мин в течение 15 мин, осадок ресуспендировали в 4 мл раствора 2 (10 мМ RbCl, 10 мМ MOPS, 75 мМ СаС12,15% глицерин, pH 6,8) и оставляли на 30 мин при -70°С. Дальнейшие процедуры проводили аналогично, но вместо тетрациклина использовался канамицин (25 мкг/мл).

Экспрессия генов рекомбинантных белков

Экспрессию генов белков ТБГ1 и их мутантов осуществляли в плазмидном векторе pQE-30. Рекомбинантными плазмидами трансформировали клетки E.coli штаммов М15 и JM-109, содержащих высококопийную репрессорную плазмиду pRep-4. Анализ клонов, экспрессирующих рекомбинантный белок, проводили следующим способом. Клоны выращивали в течение ночи в 3 мл среды 2хУТ. содержащем 100 мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл канамицина. Часть ночной культуры переносили в стерильную колбу и добавляли И1ТГГ (конечная концентрация 1-2 мМ) - индуктор экспрессии клонированных генов. Культуру растили 2 часа при 37°С. Клетки отделяли от культуральной жидкости центрифугированием (6000 об/мин., 10 мин.), суспендировали в буфере для образцов и анализировали методом электрофореза в 15% ПААГ с DS-NA. Отобранные клоны выращивали в течение ночи (см. выше), часть ночной культуры переносили в стерильную колбу с большим объемом среды (50-150 мл) и выращивали при 37°С до оптической плотности 0,8-0,9 (длина волны = 600 нм). Индукцию проводили в течение 2-5 часов. Клетки отделяли, от культуральной жидкости центрифугированием (6000 об/мин., 10 мин.), клетки замораживали и хранили при -70°С.

Хроматографическая очистка (Гис)б-транспортных белков на Ni -нитрилотриацетатной агарозе

Хроматографию (Гис)б-белков проводили согласно протоколу «The QIAexpressionist» фирмы «QIAGEN» с некоторыми изменениями. Клетки ресуспендировали в буфере А (6 М гуанидингидрохлорид; 0,1 М NaH^PO^, 0,01 М трис-НС1 рН 8,0) с добавлением 60 мМ ПМСФ. Брали 5 мл буфера А на 1 г клеток E.coli. Клетки лизировали, мягко перемешивая, суспензию при комнатной температуре в течение 1 часа. Клеточные лизаты центрифугировали (10000 об/мин, 10 мин.) и добавляли к супернатангу предварительно промытую дистиллированной водой и уравновешанную буфером A Ni-HTA агарозу (из расчета 0,5 мл исходной Ni-HTA-суспензии на 200 мл среды экспрессии) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре и умеренном перемешивании. Далее суспензию переносили на колонку QIAGEN и, дав стечь клеточному лизату, промывали осадок Ni-HTA последовательно (по 5 мл) буфером А, затем буфером В (8 М мочевина; 0,1 М NaH2P04; 0,01 М трис-HCl рН 8,0), буфером С (аналогичного состава с рН 6,3). Затем связанные с Ni-HTA (Гис)б-рекомбинантные белки элюировали буфером D (аналогичного состава с рН 5,9) и буфером Е (аналогичного состава с рН 4,5), собирая фракции по 1,5 мл Состав полученных фракций анализировали методом электрофореза в ПААГ с DS-Na.

Диализ, концетрирование и определение концентрации белков

Все препараты белков непосредственно перед использованием диализовали в диализном мешке, вначале против тридистилированной воды (в объеме ~ 1 литр), проводя смены воды каждые 15-20 минут (2-3 смены) в течение 1,5 часов. Для использования в некоторых экспериментах, где нужна высокая концентрация белка, её повышали при помощи концентраторов 100К MWCO фирмы Millipore, центрифугируя в них образец белка при 8000 об/мин. Концентрацию белков определяли по поглощению при 280 нм, для чего по измеряли спектры в области 230-360 нм в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см на спектрофотометре Shimadzu UV-1601 фирмы Shimadzu scientific Instruments, Inc. (Япония) или пользовались электрофоретическим стандартом БСА.

Электрофорез белков в денатурирующих условиях в ПААГ с DS-Na.

Электрофорез проводили в пластинах полиакриламидного геля в соответствии с методом Лэммли (Laemmli, 1970). Пробы растворяли в буфере для нанесения образцов (0,06 М трис-HCl, рН 6,8, 2% DS-Na, 5% р-меркаптоэтанола, 30% глицерина и 0,001% бромфенолового синего) и прогревали 2-5 мин. при 95°С. Верхний (концентрирующий) гель содержал 3% акриламида, 0,08% метиленбисакриламида, 0,0125 М трис-HCl рН 6,8 и 0,1% DS-Na. Нижний (разделяющий) гель содержал 10% или 15% акриламида, 0,15 % метиленбисакриламида, 0,4 М трис-HCl рН 8,8 и 0,1% DS-Na. Пробы вносили в лунки верхнего геля. Электрофорез проводили в приборе фирмы «Hoeffer Scientific», США, в трис-глициновом буфере (0,025 М трис-HCl; 0,192 М глицин, 0,1% DS-Na, рН 8,3). Начальное напряжение при электрофорезе составляло 80 В (при токе не выше 30 мА), после вхождения проб в концентрирующий гель электрофорез проводили при 120-150 В (при токе не выше 40 мА). Когда зона бромфенолового синего доходила до нижней границы геля, электрофорез прекращали. Гель красили 20-30 мин. в 0,25% растворе кумасси синего R-250 (50% этанола, 10% уксусной кислоты) и обесцвечивали кипячением в дистилированной воде.

Перенос белков из полиакриламидных гелей на нитроцеллюдозные мембраны

Перенос белков из ПААГ на нитроцеллюлозные (НЦ) мембраны проводили с помощью прибора для жидкого переноса «BioRad» следующим образом: нарезали 8 листов фильтровальной бумаги по размеру пластин и закладывали в прибор по схеме (в направлении от анода к катоду) - 4 листа помещали в буфер для жидкого переноса (0,025 М трис, ОД 92 М глицин, 20% этанол), затем ПААГ, НЦ-мембрана, 4 листа смоченной буфером фильтровальной бумаги. Перенос проводили в течение 2 часов при напряжении 100 В при 4°С, либо в течение 18 часов при напряжении 30 В при 4°С. Белки переносились на нитроцеллюлозную мембрану Protran с диаметром пор 0,45микрон.

Анализ РНК связывающей активности белков .методом Норт-Вестерн

Белки, фракционированные в ПААГ с DS-Na, переносили на НЦ мембрану фирмы Schleiher and Schuell или Amersham. Белки дополнительно денатурировали в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl (рН 7,5), б М мочевину и 0,05% Твин-20 в течение 20 мин. с двумя сменами буфера. Затем ренатурировали в буфере для ренатурации, содержащем 20 мМ трис-HCl (рН 7,5), 0,02 г/л БСА, 0,02 г/л фиколла, 0,02 г/л поливинилпирролидона в течение 1,5 часов с несколькими сменами буфера. Затем инкубировали с меченым 32Р-РНК транскриптом в буфере для ренатурации, содержавшем NaCl в концентрации от 0 до 500 мМ, в течение 40 минут. Отмывали от несвязавшейся РНК буфером для ренатурации в течение 15 минут с несколькими сменами буфера. НЦ мембрану сушили и радиоавтографировали.

Анализ РНК-связывающих свойств белков методом-сдвига в геле

Для анализа РНК связывающих свойств белков использовался несколько модифицированный метод сдвига в геле (Zhou et al., 1995). РНК вируса табачной мозаики (ВТМ) инкубировали с добавлением различных количеств белка в буфере, содержащем 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 5 мМ MgCl2 , 1 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 50мМ NaCl (150-500 мМ в опытах по устойчивости к повышению ионной силы раствора), в течение 15-20 минут во льду. Пробы анализировали в 0,8-1% агарозном геле, содержащем этидиум бромид, в ТАЭ-буфере. ЭФ проводили при силе тока 20 мА, а после вхождения проб в гель - при 40 мА. В экспериментах по конкуренции РНК сначала инкубировали с одним белком в течение 15 минут, а затем добавляли второй белок и выдерживали еще 15 минут.

Измерение спектров кругового дихроизма (КД)

Спекгры кругового дихроизма рекомбинантных белков, диализованных против тридистиллированной воды, измеряли на модифицированном дихрографе Jobin-Ivon Mark V (Франция) при комнатной температуре в кюветах с длиной оптического пути 1 мм, при концентрациях белков около 200 мкг/мл Область измерения спектров - 190-260 нм. Средний молекулярный вес аминокислотного остатка принимали равным 110. Концентрации белков определяли спектрофотометрически с использованием вычисленных коэффициентов поглощения (E^so0'1 )■

ИК - Фурье спектроскопический анализ

На пластинки из германия наносили 100 мкл диализованного белка с концентрацией примерно 1мг/мл в ЮмМ Трис-HCl (рН=7,8) и высушивали до состояния тонкой пленки в вакуумном эксикаторе с силикагелем. Инфракрасные спектры полученных образцов измерялись на FTIR спектрометре Equinox 55/S (Bruker Analytic GmbH, Bremen, Germany).

Динамическое лазерное светорассеяние.

Препараты рекомбинантных белков диализовали против 10 мМ Tris-HCl (pH 7,5) и анализировали методом ДЛС. Измерения проводились на установке «Zetasizer Nano ZS» (Malvern Instruments Ltd., Великобритания) с He-Ne лазером (633 нм, 10 мВт) в качестве источника света. Температура образцов поддерживалась в пределах 0,1 °С при помощи системы Пельтье термостатирования. Измерения светорассеяния проводили под углом 173°. Детекцию и обработку автокорреляционных функций производили при помощи ПО Dispersion Technology Software (DTS) version 5.10. Для экспериментов использовали обычные полистироловые кюветы с длиной оптического пути 10 мм. Объем образца в кювете составлял 1мл. Измерения проводились в 10 мМ Tris-HCl рН 7,5 при концентрации белков в диапазоне 0,05-0,15 мг/мл.

Атомно-силовая микроскопия.

Образцы после анализа методом ДЛС разводили в 10 раз и 2,5-5,0 мкл раствора помещали на поверхность слюды, очищенной методом скалывания, на 10-15 мин для адсорбции, затем поверхность слюды промывали дистиллированной водой для удаления неадсорбировавшегося материала и высушивали при комнатной температуре. Топографические изображения частиц получены на атомно-силовом микроскопе Nanoscope III в моде прерывистого контакта зонда с поверхностью образца при скорости сканирования 0,5 Гц. Использовались коммерчески доступные кремниевые кантилеверы fpNllS и fpNll с типичной константой жесткости 11,5 Н/м. Стандартный радиус скривления острия для кантилеверов этого типа составляет 10-25 нм. Такая геометрия приводит к изменению наблюдаемых латеральных размеров исследуемых объектов по сравнению с реальными (Stemmer and Engel, 1990). Особенно сильно этот эффект проявляется при визуализации частиц с размерами сравнимыми с размером острия кантилевера. В этом случае наблюдается значительное увеличение латеральных размеров частиц - истинный размер увеличивается с каждой стороны на величину радиуса острия. Полученные изображения были обработаны с помощью специализированной программы FemtoScan Online.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Макаров, Валентин Владимирович

выводы.

1. На основании компьютерного анализа и «стереохимического метода» предсказано существование в транспортном белке ТБГ1 (63 кДа) гордеивируса полулатентного вируса мятлика (ПЛВМ) трех доменов: неструктурированного N-концевого домена (NTD); внутреннего домена с выраженной вторичной структурой (ID) и С-концевого домена с □/□-структурой, соответствующего ранее охарактеризованному НТФазно/хеликазному домену (HELD). В пользу этого предсказания свидетельствует образование в клетках Е. coli в результате спонтанного ограниченного протеолиза рекомбинантного белка 63 кДа протеолитических фрагментов, соответствующих N63 К, NTD и HELD.

2. С помощью набора физико-химических методов для делеционных мутантов белка 63 кДа, соответствующих NTD, ID и N63K, определена вторичная структура доменов: NTD является полностью неупорядоченным доменом, а для ID характерно высокое (до 40%) содержание p-структуры и наличие 10-15% а-спиралей при отсутствии четко выраженной третичной структуры. Для N-концевой половины, включающей NTD и ID, как и для белка 63 кДа, характерна высокая структурная неупорядоченность.

3. NTD и ID взаимодействуют с и оцРНК, и дцРНК, причем NTD связывается некооперативно, a ID - кооперативно. В составе N63K проявляется только некооперативное связывание с РНК по NTD-типу.

4. NTD образует низкомолекулярные олигомеры, визуализируемые методами атомно-силовой микроскопии, как глобулы различного размера, тогда как ID, N63K и белок 63 кДа способны образовывать мультимеры, представляющие собой протяженные нитевидные структуры. Предполагается, что ID "обладает способностью к самополимеризации (самосборке), которое инициируется в присутствии РНК. Показано, что в присутствии РНК ID меняет свою конформацию, становясь (3-структурным белком.

5. Предложена структурно-функциональная модель участия доменов N-концевой половины белка ТБГ1 в формировании транспортной формы гордеивируса (вирусного РНП-комплекса). Предполагается, что сходный характер доменной организации характерен и для других белков ТБГ1 с ТБГ гордеивирусного типа.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Макаров, Валентин Владимирович, 2010 год

1. Карпова О. В., Козловский С. В., Архипенко М В., Родионова Н П. Атабеков И. Г. (1999). Комплексы РНК ВТМ с транспортным белком гордеивируса инфекционны в растениях, восприимчивым к обоим вирусам. Докл. Акад. Наук 368(3), 406-408.

2. Лещинер А.Д., Минина Е.А., Ракитина Д.В., Вишниченко В.К., Соловьев А.Г., Морозов С.Ю., Калинина Н.О (2008). Олигомеризация траспортного белка 25 КДа X вируса картофеля. Биохимия., 73. № 1, 62-68.

3. Сердюк Н. Н. (2007). Структурированные белки и белки с внутренней неупорядоченностью. Молекулярная биология, 41 (2), 297—513.

4. Скабкин М. А., Скабкина О. В., Овчинников Л. П. (2004) Мультифункциональные белки с доменом холодового шока в регуляции экспрессии генов. Успехи биологической химии, т. 44, 2004, с. 3—52

5. Туроверов К.К., Уверский В.Н., Кузнецова И.М. Нативные глобулярные и нативные частично и полностью неупорядоченные белки. Фолдинг, образование надмолекулярных комплексов, агрегация. Цитология, 51(3), 190-203.

6. Agranovsky А.А., Karasev A.V., Novikov V.K., Lunina N.A., Loginov S., Tyulkina L.G. (1992). Poa semilatent virus, a hordeivirus with no internal polydisperse poly (A) in the 3-non-coding region of the RNA genome. J. Gen. Virol., 73, 2085-92

7. Almouzni G, Wolffe AP. Constraints on transcriptional activator function contribute to transcriptional quiescence during early Xenopus embryogenesis. EMBO J 1993;14:2033-2047.

8. Antson A.A. (2000) Single stranded RNA binding proteins. Curr. Opin. Struct. Biol.

9. Atabekov, J.G., Rodionova, N.P., Karpova, O.V., Kozlovsky, S.V., Novikov, V.K., Arkhipenko, M.V. (2001) Translational activation of encapsidated potato virus X by coat protein phosphorylation. Virology, 286, 466-474.

10. Auweter S.D., Oberstrass F.C., Allain H.-T. F. (2006) Sequence-specific binding of single-stranded RNA:is there a code for recognition? Nucleic Acids Research, Vol. 34, No. 17 4943-4959.

11. Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B., and Steitz, T. A. (2000). The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution. Science 289, 905920

12. Battiste, J. L., Mao, H., Rao, N. S., Tan, R., Muhandiram, D. R., Kay, L. E., Frankel, A. D., and Williamson, J. R. (1996). Alpha helix-RNA major groove recognition in an HIV-1 rev peptide- RRE RNA complex. Science 273, 1547-1551.

13. Beuth,B„ Pennell,S., Amvig,K.B., Martin,S.R. and Taylor,LA. (2005) Structure of a Mycobacterium tuberculosis NusA-RNA complex. EMBO J., 24, 3576-3587.

14. Bouvet P., Matsumoto K., Wolffe A.P. Sequence specific RNA recognition by the XenopusY-box proteins: an essential role for the cold-shock domain. JBiol Chem 1995;270:28297-28303.

15. Brach T., Soyk S., Muller C., Hinz G., Hell R. (2009). Non-invasive topology analysis of membrane proteins in the secretory pathway. Plant J., 57, 534^-1.

16. Bragg J.N., Lim H.S., Jackson A.O. (2008). Hordeiviruses. Encyclopedia of Virology. 3rd ed, ed. B Mahy, Mvan Regenmortel. Oxford: Elsevier Ltd., 2, 459-67

17. Brakke M. K., Ball E. M., and Langenberg W. G. (1988). A non-capsid protein associated with unencapsidated virus RNA in barley infected with barley stripe mosaic virus. J. Gen. Virology, 69, 481-491.

18. Bycrott M, Hubbard T.J.P., Proctor M.,Freund S.M.V., Murzin A.G. (1997) The solution structure of the SI RNA binding domain: a member of an ancient nucleic acid-binding fold. Cell 88:235-42.

19. Calero,G., Wilson,K.F., Ly,T., Rios-Steiner,J.L., Clardy,J.C. and Cerione,R.A. (2002) Structural basis of m7GpppG binding to the nuclear cap-binding protein complex. Nature Struct. Biol., 9, 912-917.

20. Callaway A., Giesman-Cookmeyer D., Gillock E.T., Sit T.L. and Lommel S.A. (2001). The multifunctional capsid proteins of plant viruses. Annu Rev Phytopathol, 39, 419460

21. Chapman S., Hills G, Watts J. and Baulcombe D. (1992); Mutational analysis of the coat protein gene of potato virus X, effects on virion morphology and viral pathogenicity. Virology, 191, 223-230.

22. Cheng J., Randall A., Sweredoski M„ Baldi, P. (2005). SCRATCH: a protein structure and structural feature prediction server. Nucleic Acids Res., 33, W72-W76.

23. Citovsky V, Mclean B.G., Zupan J.R., Zambryski P. (1993) Phosphorylation of tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein by a developmentally regulated plant cell wall-associated protein kinase. Genes Dev 7: 904-910.

24. Clodi, E., Semrad, K., and Schroeder, R. (1999). Assaying RNA chaperone activity in vivo using a novel RNA folding trap. EMBO J., 18, 3776-3782.

25. Corchero J. L., Viaplana E., Benito A., Villaverde, A. (1996). The position of the heterologous domain can influence the solubility and proteolysis of b-galactosidase fusion proteins in E. coli. J. Biotechnol., 48, 191-200.

26. Cowan G.H., Lioliopoulou F., Ziegler A., Torrance L. (2002) Subcellular localisation, protein interactions, and RNA binding of potato mop-top virus triple gene block proteins. Virology 298: 106-115.

27. Cristofari, G., and Darlix. J. L. (2002). The ubiquitous nature of RNA chaperone proteins. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 72, 223-268.

28. D'Souza,V. and Summers,M.F. (2004) Structural basis for packaging the dimeric genome of Boloney murine leukaemia virus. Nature, 431, 586-590.

29. Daughdrill G. W., Pielak G. J., Uversky V. N., Cortese M. S., Dunker A. K. 2005. Natively disordered proteins. In: Protein Folding Handbook. Pt II. Buchner J., Kiefhaber T. (Eds). Weinheim: Wiley-VCH. 275—357.

30. Davydova E.K., Evdokimova V.M., Ovchinnikov L.P., Hershey J.W.B. Overexpression in COS cells of p50, the major core protein associated with mRNA, results in translation inhibition. Nucleic Acids Res, 25, 2911-2916.

31. Dey A., York D., Smalls-Mantey A. and Summers M.F. (2005) Composition and sequence-dependent binding of RNA to the nucleocapsid protein of Moloney murine leukemia virus. Biochemistry, 44, 3735-3744.

32. DiNitto, J. P., and Huber, P. W. (2003). Mutual induced fit binding of Xenopus ribosomal protein L5 to 5S rRNA. J. Mol. Biol., 330, 979-9-92

33. Donald R. G., Lawrence D.M., and Jackson A.O. (1997). The barley stripe mosaic virus 58-kilodalton beta(b) protein is a multifunctional RNA binding protein. J. Virol., 71(2), 1538-1546.

34. Dunker A. K., Obradovie Z., Romero P., Gamer E. C., Brown C. J. (2000). Intrinsic protein disorder in complete genomes. Genome Inform. Ser. Workshop. Genome Inform., 11, 161—171.

35. Efimov A.V. (1997). Structural, trees for protein superfamilies. Proteins, 28(2), 241-60.

36. Fauquet C.M., Mayo M.A., Maniloff J., Desselberger U., Ball L.A., eds. (2005). Virus Taxonomy. VHIth Report of the ICTV. London: Elsevier/Academic. 1259 pp.

37. Forster R.L., Beck D.L., Guilford P.I, Voot D.M, Van Dolleweerd C.J. and Andersen M.T. (1992). The coat protein of white clover mosaic potexvirus has a role in facilitating cell-to-cell transport in plants. Virology, 191(1). 480-484.

38. Gebauer F., Richter J.D. Synthesis and function of Mos: the control switch of vertebrate oocyte meiosis. Bioessays 1997;19:23-28.

39. Ghoshroy S, Lartey R, Sheng J, Citovsky V. (1997) Transport of proteins and nucleic acids through plasmodesmata. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol., 48, 27-50.

40. Gorbalenya A. E. and Koonin E. V. (1993). Helicases, amino acid sequence comparisons and structure-function relationships. Curr. Opin. Cell. Biol. 3, 419-429.

41. Gorbalenya A.E., Blinov V.M, Donchenko A.P. and Koonin E.V. (1989). An NTP-binding motif is the most conserved sequence in a highly diverged nionophyletic group of proteins involved in positive strand RNA viral replication. J Mol Evol, 28(3), 256268.

42. Greenfield, N., Fasman G. D. (1969). Computed circular dichroism spectra for the evaluation of protein conformation. Biochemistry, 8, 4108-4116.

43. Gunasekaran K., Tsai C. J., Kumar S., Zanuy D., Nussinov R. (2003). Extended disordered proteins: targeting function with less scaffold. Trends Biochem. Sci., 28, 81—85.

44. Gustafson G., Hunter B., Hanau R., Armour S.L., Jackson A.O. (1987). Nucleotide sequence and genetic organization of barley stripe mosaic virus RNA y. Virology, 158, 394^406

45. Gustafson G., Larkins B.A., Jackson A.O. (1981). Comparative analysis of polypeptides synthesized in vivo and in vitro by two strains of barley stripe mosaic virus. Virology, 111,579-86.

46. Haywood V., Kragler F. and Lucas W.J. (2002). Plasmodesmata: Pathways for Protein and Ribonucleoprotein Signaling. Plant Cell, Suppl, 303-325.

47. Herschlag, D. (1995). RNA chaperones and the RNA folding problem. J. Biol. Chem.,270,20871-20874

48. Herzog E., Hemmer O., Hauser S., Meyer G., Bouzoubaa S. and Fritsch C. (1998). Identification of genes involved in replication and movement of peanut clump virus. Virology, 248,312-322.

49. Holmes K. C„ Popp D., Gebhard W., Kabsch W. (1990). Atomic model of the actin filament. Nature., 347. 44—49.

50. Horvath MP, Schweiker VL, Bevilacqua JM, Ruggles JA, Schultz SC. 1998. Crystal structure of the Oxytricha nova telomere end binding protein complexed with single strand DNA. Cell 95:963-74.

51. Hsu H.T., Chou Y.L., Tseng Y.H., Lin Y.H., Lin T.M., et al. (2008). Topological properties of the triple gene block protein 2 of Bamboo mosaic virus. Virology, 379, 19

52. Hudson,B.P., Martinez-Yamout,M.A., Dyson,H.J. and Wright,P.E. (2004) Recognition of the mRNA AU-rich element by the zinc finger domain of TISlld. Nature Struct. Mol. Biol., 11,257-264.

53. Hunter B.G., Heaton L.A., Bracker C.E., Jackson A.O. (1986). Structural comparison of poa semilatent virus and barley stripe mosaic virus. Phytopathology, 75, 322-26

54. Hunter B.G., Smith J., Fattouh F., Jackson A.O. (1989). Relationship of lychnis ringspot virus to barley stripe mosaic virus and poa semilatent virus. Intervirology, 30,18-26

55. Iseni F., Barge A., Baudin F., Blonder D., and Ruigrok R.W. (1998). Characterization of rabies virus nucleocapsids and recombinant nucleocapsid-like structures. J. Gen. Virol., 79, 2909-2919.

56. Jackson A.O., Hunter B.G., Gustafson G.D. (1989). Hordeivirus relationships andgenome organization. Annu. Rev. Phytopathol., 27, 95-121

57. Jackson D., Hake S., (1997). Morphogenesis on the move: cell-to-cell trafficking of plant regulatory proteins. Curr. Opin. Genet. Dev. 7, 495-500.

58. Jakson D., Lim H-S., Bragg J., Ganesan U., Lee M-Y. (2009). Hordeivirus Replication, Movement, and Pathogenesis. Annu. Rev. Phytopathol., 47, 385-422.

59. Kalinina N.O., Fedorkin O.N., Samuilova O.V., Maiss E., Korpela T., Morozov S.Yu.

60. I and Atabekov J.G. (1996). Expression and biochemical analyses of the recombinantpotato virus X 25K movement protein. FEBS Lett. 397, 75-78.

61. J 71. Karlson, D., Imai, R. (2003) Conservation of the cold shock domain protein family inplants.Plant.Physiol., 131, 12-15.

62. Kiselyova O. I., Yaminsky I. V., Karpova O. V., Rodionova N. P., Kozlovsky S. V.,j Arkhipenko M. V., Atabekov, J. G. (2003). AFM study of potato virus X disassemblyiinduced by movement protein. J. Mol. Biol., 332, 321-325.I1. T | 102

63. Kiselyova O.I., Yaminsky I.V., Karger E.M., Frolova O.Y., Dorokhov Y.L., Atabekov J.G.(2001). Visualization by atomic force microscopy of tobacco mosaic virus movement protein-RNA complexes formed in vitro. J Gen Virol., (Pt 6), 1503-8.

64. Koenig R., Pleij C.W.A., Beier C. and Commandeur U. (1998). Genome properties of beet virus Q, a new furo-like virus from sugarbeet, determined from unpurified virus. J Gen Virol, 79, 2027-2036.

65. Koonin E.V. and Dolja V.V. (1993). Evolution and taxonomy of positive-strand RNA viruses, implications of comparative analysis of amino acid sequences. Crit Rev Biochem Mol Biol, 28, 375-430'.

66. Kragler, F., Monzer, J., Shash, K., Xoconostle-Ca'zares, B., Lucas, W.J., (1998). Cell-to-cell transport of proteins: requirement for unfolding and characterization of binding to a putative plasmodesmal receptor. Plant J. 15, 367- 381.

67. Kriwacki R.W., Hengst L., Tennant L., Reed S.I., Wright P,E. (1996). Structural studies of p21 Wafl/Cipl/Sdil in the free and Cdk2-bound state: Conformational disorder mediates binding diversity. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93, 11504-11509.

68. Ladomery M., Wade E., Sommerville J. Xp54, the Xenopushomologue of human RNA helicase p54, is an integral component of stored mRNP particles in oocytes. Nucleic Acids Res 1997;25:965-973.

69. Lawrence D.M., Jackson A.O» (2001). Requirements for cell-to-cell movement of Barley stripe mosaic virus in monocot and dicot hosts. Mol. Plant Pathol., 2, 65-75

70. Lee J.-Y., Yoo B.-C., Lucas W. J. (2000). Parallels between nuclear-pore and plasmodesmal trafficking of information molecules. Planta, 210, 177-187.

71. Leshchiner A.D., Solovyev A.G., Morozov S.Y., Kalinina N.O. (2006). A minimal region in the NTPase/helicase domain of the TGBpl plant virus movement protein is responsible for ATPase activity and cooperative RNA binding. J. Gen. Virol., 87, 308795.

72. Lewis,H.A., Musunuru,K., Jensen,K.B., Edo,C., Chen,II., Darnell,R.B. and Burley,S.K. (2000) Sequence-specific RNA binding by a Nova KH domain: implications for paraneoplastic disease and the fragile X-syndrome. Cell, 100, 323-332.

73. Lim H-S., Bragg J.N., Ganesari U., Lawrence D.M., Yu J., et al. (2008). Triple gene block protein interactions involved in movement of barley stripe mosaic virus. J. Virol., 82,4991-5006.

74. Lucas W.J. (1995). Plasmodesmata: intercellular channels for macromolecular transport in plants. Curr Opin Cell Biol, 7, 673-680.

75. Maris,C., Dominguez,C. and Allain.F.H. (2005) The RNA recognition motif, a plastic RNA-binding platform to regulate post-transcriptional gene expression. FEBS J., 272, 2118-2131.

76. Matsumoto K. Wassarman K.M., Wolffe A.P. Nuclear history of a pre-mRNA determines the translational activity of cytoplasmic mRNA. EMBO J 1998;17:2107-2121.

77. McGeachy K.D., Barker H. (2000). Potato mop-top virus RNA can move long distance in the absence of coat protein: evidence from resistant, transgenic plants. Mol Plant-Microbe Interact, 13(1), 125-128.

78. Melcher U. (2000). The '30K' superfamily of viral movement proteins. J. Gen. Virol., 81,257-66

79. Meric F, Matsumoto K, Wolffe AP. Regulated unmasking of in vivo synthesized maternal mRNA at oocyte maturation. J Biol Chem 1997;272:12840-12846.

80. Minich, W.B., Ovchinnikov, L.P. (1992) Role of cytoplasmic mRNP proteins in translation. Biochimie, 74, 477-483.

81. Morozov S.Y., Lukasheva L.I., Chernov B.K., Skryabin K.G. and Atabekov J.G. (1987). Nucleotide sequence of the open reading frames adjacent to the coat protein cistron in potato virus X genome. FEBS Lett, 213,438-442.

82. Morozov S.Yu. and Solovyev A.G. (1999). Genome organization in RNA viruses. Molecular biology of plant viruses, pp. 47-98. Edited by C.L. Mandhar. Boston/Dordrecht/London: Kluwer.

83. Morozov S.Yu., Dolja V.V. and Atabekov J.G. (1989). Probable reassortment of genomic elements among elongated RNA-containing plant viruses. J Mol Evol, 29, 5262.

84. Morozov S.Yu., Miroshnichenko N.A., Solovyev A.G., Fedorkin O.N., Zelenina D.A., Lukasheva L.I., Karasev A.V., Dolja V.V., Atabekov J.G. (1991). Expression strategy of the potato virus X triple gene block. J Gen Virol, 72, 2039-2042.

85. Morozov, S.Y., Solovyev, A.G., (2003). Triple gene block: modular design of a multifunctional machine for plant virus movement. J. Gen. Virol. 84, 1351-1366.

86. Murzin A.G. 1993. OB (oligonucleotide/oligosaccharide 6inding)-fold: common structural and functional solution for nonhomologous sequences. EMBOJ. 12:861-67.

87. Murzin A.G. 1998. How far divergent evolution goes in proteins. Curr. Opin. Struct.Biol. 8:380-87.

88. Nagai,K., Oubridge,C., Jessen,T.H., Li,J. and Evans,P.R. (1990) Crystal structure of the RNA-binding domain of the U1 small nuclear ribonucleoprotein A. Natur e, 348, 515— 520.

89. Namba K. (2001). Roles of partly unfolded conformations in macromolecular self-assembly. Genes Cells, 6, 1-12.

90. Nashchekin D., Zhao J., VisaN., Daneholt P. (2006) A Novel Dedl-like RNA Helicase Interacts with the Y-box Protein ctYB-1 in Nuclear mRNP Particles and in Polysomes. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 281, NO. 20, pp. 1426314272.

91. Oldfield C. J., Cheng Y., Cortese M. S„ Romero P., Uversky V. N„ Dunker A. K. 2005. Coupled folding and binding with alpha- helix-forming molecular recognition elements. Biochemistry, 44, 12 454—12 470.

92. Overall R.L., Blackman L.M. (1996) A model of the macromolecular structure of plasmodesmata. Trends Plant Sci 1, 307-311.

93. Petty I.T. and Jackson A.O. (1990). Mutational analysis of barley stripe mosaic virus RNA beta Virology, 179, 712-718.

94. Phadtare, S., Alsina, J., and Inouye, M. (1999). Cold-shock response and cold-shock proteins. Curr. Opin. Microbiol., 2, 175-180.

95. Pontius, B. W. (1993). Close encounters: why unstructured, polymeric domains can increase rates of specific macromolecular association. Trends Biochem., Sci., 18, 181— 186

96. Price S.R., Evans P.R. andNagai K. (1998) Crystal structure of the spliceosomal U2B0-U2A0protein complex bound to a fragment of U2 small nuclear RNA. Nature, 394, 645-650.

97. Prilusky J., Felder C. E., Zeev-Ben-Mordehai T., Rydberg E. H., Man O., Beckmann J. S., Silman, I., Sussman, J. L. (2005). Foldlndex: a simple tool to predict whether a given protein sequence is intrinsically unfolded. Bioinformatics, 21, 3435-3438.

98. Ranjan M, Tafuii SR, Wolffe AP (1993). Masking mRNA from translation in somatic cells. Genes Dev;7:1725-1736.

99. Roberts A.G., Oparka K.J. (2003). Plasmodesmata and the control of symplastic transport. Plant, Cell and Environment, 26, 103-124

100. RodionovaN. P., Karpova O. V., Kozlovsky S. V., Zayakina O. V., Arkhipenko M. V., Atabekov, J. G. (2003). Linear remodeling of helical virus by movement protein binding. J. Mol. Biol., 333, 565-572.

101. Romero P., Obradovic Z., Kissinger C. B., Villafranca J. E., Guilliot S., Garner E., Dunker A. K. (1998). Thousands of proteins likely to have long disordered regions. Pac. Symp. Biocomput., 3, 437—448.

102. Romero P., Obradovic Z., Kissinger C., Villafrance J. E„ Dunker A. K. (1997). Identifying disordered regions in proteins from amino acid sequence. In: Proceedings of the International Conference on Neural Networks., 91—95.

103. Savenkov E.I., Solovyev A.G., Morozov S.Y. (1998). Genome sequences of poa semilatent and lychnis ringspot hordeiviruses. Arch. Virol., 143., 1379-93

104. Schlotmann M., Beyreuther K. (1979). Degradation of the DNAbinding domain of wildtype and i2d lac repressors in Escherichia coli. Eur. J. Biochem., 95, 39-49.

105. Schmitz S.K. (1990) An Introduction to Dynamic Light Scattering by Macromolecules, Academic Press, New York.

106. Schuster S.C., Khan S. (1994). The bacterial flagellar motor. Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 23. 509-539.

107. Schwer B. (2001). A new twist on RNA helicases: DExH/D box proteins as RNPases. Nat Struc Biol. 8, 113-116.

108. Sit T.L. and Abouhaidar M.G. (1993). Infectious RNA transcripts derived from cloned cDNA of papaya mosaic virus: effect of mutations to the capsid and polymerase proteins. J Gen Virol, 74, 1133-1140.

109. Skabkin M.A., Kiselyova O.I. Chernov K.G., Sorokin A.V., Dubrovin E.V., Yaminsky I.V., Vasiliev V.D., Ovchinnikov L.P (2004). Structural organization of mRNA complexes with major core mRNP protein YB-1. Nucleic Acids Res., 32(18), 5621-35.

110. Sominerville J. (1999). Activities of cold-shock domain proteins in translation control. Bioessays., 21(4), 319-325.

111. Soultanas P. and Wigley D.B. (2001). Unwinding the 'Gordian knot' of helicase action. Trends Biochem Set, 26, 47—54.

112. Spirin A.S. 1996 Masked and translatable messenger ribonucleoproteins in higher eukariotes. In Hershey J.W.B., Mathews M.B. and Sonenberg N (eds) Translation Control, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 319-334.

113. Sreerama, N., Woody, R. W. (2004). Computation and analysis of protein circular dichroism spectra. Methods Enzymol., 383, 318-351.

114. Stemmer A., Engel A. (1990). Imaging biological macromolecules by STM: quantitative interpretation of topographs Ultramicroscopy, 34(3), 129-40.

115. Subramanian A.R. (1983). Structure and function of ribosomal proteins SI. PNAS., Mol. Biol., 28, 101-142.

116. Suck D. (1997). Common fold, common iunction, common origin? Nat. Struct. Biol.4:161-65. Standart N. Masking and unmasking of maternal mRNA. Semin Dev Biol 1992;3:367-379.

117. Svitkin, Y.V., Ovchinnikov, L.P., Dreyfuss, G., Sonenberg, N. (1996) General RNA binding proteins render translation cap dependent. EMBO J., 15, 7147-7155.

118. Tafuri S.R., Wolffe A.P (1990). Xenopus Y-box transcription factors: molecular cloning, functional analysis and developmental regulation. Proc Natl Acad Sci USA, 87, 9028-9032.

119. Theobald D.L., Mitton-Fry R.M. and.Wuttke D.S. (2003). Nucleic acid recognition by OB-fold proteins. Annu. Rev. Biophys. Bioinol. Struct., 32, 115-133.

120. Tisne, C., Roques, B. P., and Dardel, F. (2001). Heteronuclear NMR studies of the interaction oftRNA(Lys)3 with HIV-1 nucleocapsid protein. J. Mol. Biol. 306, 443454

121. Tompa P, Cserinely P. (2004). The role of structural disorder in the function of RNA and protein chaperones. FASEB J., 18(11),1169-75.

122. Torrance L., Lukhovitskaya N.I., Schepetilnikov M.V., Cowan G.H., Ziegler A., Savenkov E.I (2009). Unusual long-distance movement strategies of Potato mop-top virus RNAs in Nicotiana benthamiana. Mol. Plant. Microbe Interact., 22(4), 381-90.

123. Tseng S.S., Weaver P.L., Liu Y., Hitomi M., Tartakoff A. M. and Chang T.H. (1998). Dbp5p, a cytosolic RNA helicase, is required for poly(A)+ RNA export. EMBO J, 17, 2651-2662.

124. Uversky V. N. (2002). Natively unfolded proteins: a point where biology waits for physics. Protein Sci. 11 : 739—756.

125. Uversky V. N. (2003a). Protein folding revisited. A polypeptide chain at the folding— misfolding—nonfolding cross-roads: which way to go? Cell Mol. Life Sci. 60 : 1852— 1871.

126. Uversky V. N. (2003b). A protein-chameleon: conformational plasticity of alpha-synuclein, a disordered protein involved in neurodegenerative disorders. J. Biomol. Struct. Dyn. 21 : 211—234.

127. Uversky V. N. (2007). Neuropathology, biochemistry, and biophysicsof a-synuclein aggregation. J. Neurochem., 103, 17—37.

128. Uversky V. N., Gillespie J. R., Fink A. L. (2000). Why are «natively unfolded» proteins unstructured under physiologic conditions? Proteins., 41, 415—427.

129. Uversky V. N., Oldfield C. J., Dunker A. K. (2005). Showing your ID: intrinsic disorder as an ID for recognition, regulation and cell signaling. J. Mol. Recognit., 18, 343—384.

130. Verchot-Lubicz J. (2005). A new cell-to-cell transport model for potexviruses. Mol. Plant- Microbe Interact., 18, 283-90.

131. Waigmann E. and Zambryski P. (1995). Tobacco mosaic virus movement proteinmediated protein transport between trichome cells. Plant Cell, 7, 2069-2079.

132. Williamson, J. R. (2000) Induced fit in RNA-protein recognition. Nat. Struct. Biol. 7,

133. WolfS.; Deom C. M; Beachy RN; Lucas W. L. (1989). Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit. Science, 246, 337-339.

134. Wright K.M.,Wood N.T., Roberts A.G., Chapman S., Boevink P., et al. (2007). Targeting of TMV movement protein to plasmodesmata requires the actin/ER network; evidence from FRAP. Traffic, 8, 21-31

135. Wright, P. E., and Dyson, H. J. (1999) Intrinsically unstructured proteins: re-assessing the protein structure-function paradigm. J. Mol. Biol. 293, 321-331.

136. Wung X., McLachlan J., Zamore P.D. and Hall T.M. (2002) Modular recognition of RNA by a human pumilio-homology domain. Cell, 110, 501-512.

137. Xoconostle-Cazares B, Xiang Y, Ruiz-Medrano R, Wang H-L. Monzer J, Yoo B-C, McFarland KC, Franceschi VR, Lucas WJ (1999) Plant paralog to viral movement protein potentiates transport of mRNA into the phloem. Science, 283,94-98.

138. Yamanaka, K., Inouye, M. (2001) Selective mRNA degradation by polynucleotide Phosphorylase in cold shock adaptation in Escherichia coli. J. Bacteriol., 183, 2808

139. Zamyatnin A.A.Jr., Solovyev A.G., Savenkov E.I., Germundsson A., Sandgren M., Valkonen J.P., Morozov S.Y. (2006). Transient coexprcssion of individual genes encoded by the triple gene block of potato mop-top.

140. Zhou H., Jackson A.O. (1996). Expression of the barley stripe mosaic virus RNA (3 "triple gene block." Virology, 216, 367-79.834.837.2816.