Структурные и функциональные особенности пектинметилэстеразы и ее роль в поддержании стабильности транскриптома растений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Гасанова, Татьяна Владимировна

• Гасанова, Татьяна Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гасанова, Татьяна Владимировна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

I. ВВЕДЕНИЕ.

И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

II.1. РАСТИТЕЛЬНЫЕ ПЕКТИНМЕТИЛЭСТЕРАЗЫ.

II. 1.1. Структура клеточной стенки растений.

II. 1.2. Пектины как компоненты клеточной стенки.

II. 1.3. Пектинметилэстеразы и их роль в формировании клеточной стенки.14 II. 1.4. Структурные и функциональные особенности пектинметилэстераз .19 II.1.5.Взаимодействие пектинметилэстеразы с транспортным белком вируса табачной мозаики.

II.2. УМОЛКАНИЕ ГЕНОВ В РАСТЕНИЯХ.

11.2.1. Открытие явления РНК- интерференции.

11.2.2. Роль коротких двухнитевых РНК в процессе умолкания генов.

11.2.3. Вирус-индуцируемое "умолкание" РНК.

П.2.4."Умолкание" эндогенной мРНК, связанное с образованием микроРНК (miPHK).

11.2.5. Метилирование в области промотеров и подавление транскрипции.

11.2.6. Дайсеры.

11.2.7. Аргонавты и эффекторный комплекс умолкания генов.

11.2.8. РНК-зависимая РНК-полимераза растений.

11.2.9. Системное умолкание генов в растениях.

11.2.10. Метилирование ДНК и участие РНК -полимеразы.

11.2.11. Вирусные супрессоры умолкания генов.

11.2.12. Пектинметилэстераза как фактор умолкания генов.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.

IV. 1. Структурные и функциональные особенности пектинметилэстеразы табака.

IV.2. Использование трансгенных по пектинметилэстеразе растений табака для изучения созревания и локализации белка в клетке.

IV.3. Роль лидерной последовательности пектинметилэстеразы в процессе доставки белка в клеточную стенку.

IV.4. Пектинметилэстераза подавляет межклеточный и системный транспорт вирусной инфекции.

IV.5. Экспрессия чужеродных генов в растении сопровождается повышенной активностью пектинметилэстеразы.

IV.6. Транскрипционная активность гена пектинметилэстеразы возрастает при стрессовых воздействиях, вызванных механическим повреждением листа или фотоиндукцией.

IV.7. Эффект "синергизма" при совместной агроинфильтрации кДНК генов проПМЭ и р19 TBSV с различными вирусными векторами.

IV.8. Специфичность действия р19 при возникновении эффекта синергизма".

IV.9. Влияние проПМЭ на перемещение клеточных белков из ядра в цитоплазму.

IV. 10. Динамика транскрипционной активности генов ПМЭ и А1у при механической инфильтрации листьев N. benthamiana или агроинокуляции р19.

V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

VI. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурные и функциональные особенности пектинметилэстеразы и ее роль в поддержании стабильности транскриптома растений»

В последние годы широкую известность получило явление "умолкания" генов (УГ) или РНК-интерференции, которое представляет собой защитную реакцию клетки и включает в себя механизм нуклеотид-специфической регуляции транскриптома эукариот. РНК-интерференция (РНКи) - это общее название процессов регуляции или подавления экспрессии генов с помощью гомологичных коротких РНК размером 21-25 нт. Цель УГ - поддержание стабильности транскриптома.

У растений одним из факторов УГ является пектинметилэстераза (ПМЭ), участвующая в процессах биогенеза клеточной стенки (КС), развитии корневой системы, стебля, роста пыльцевой трубки и созревания плодов при морфогенезе высших растений. Первичная клеточная стенка растений содержит целлюлозу, гемицеллюлозу и пектин, состоящий из разветвленных цепей полигалактуроновой кислоты. ПМЭ деметилирует полигалактуроновую кислоту с образованием метанола. Геном растительной клетки кодирует несколько изоформ ПМЭ. Фермент синтезируется в виде предшественника, проПМЭ, включаещего ферментативную (зрелую) и лидерную части. Несколько лет назад стало очевидным, что ПМЭ участвует в клеточном контроле вирусной инфекции. Данный фермент взаимодействует с транспортным белком (ТБ) вируса табачной мозаики (ВТМ) in vitro и играет роль в распространении вирусной инфекции по растению. Однако, участие ПМЭ в вирусной инфекции этим не ограничивается. Повышение активности ПМЭ в клеточной стенке сопровождается индукцией умолкания генов ВТМ. Интенсивное разрушение вирусной РНК приводит к увеличению количества специфических коротких siPHK длиной 21 нт. Более того, УГ, вызванное ПМЭ, распространяется и на мРНК трансгенов, что сопровождается подавлением транспорта белка DCL1 в ядро. В конечном итоге это приводит к быстрому накоплению в цитоплазме miPHK. Важная роль DCL1 в жизни растительной клетки подтверждена экспериментально. Этот Dicer принимает участие не только в синтезе miPHK, но и в контроле уровня синтеза мРНК. pri-miPHK и длинные мРНК (вирусные или клеточные) содержат шпилечные структуры, которые и служат субстратом для DCL1. Введение в клетку pri-miR171 «оттягивает на себя» DCL1 и резко увеличивает накопление вирусной РНК.

Поскольку ПМЭ располагается на границе клетки, ее можно рассматривать как один из факторов, контролирующих стабильность клеточного транскриптома, который генерирует сигнал "тревоги" о вторжении в клетку чужеродной нуклеиновой кислоты и индуцирует процесс умолкания генов.

II. Обзор литературы

11.1. Растительные пектинметилэстеразы 11.1.1. Структура клеточной стенки растений

Клеточная стенка является важнейшим компонентом растительной клетки. Она образует внешний "скелет" клетки, определяет её форму, обеспечивает адгезию соседних клеток (Iwai et al., 2002; Parre and Geitmann, 2005). Клеточная стенка играет важную роль в межклеточной сигнальной системе, определяет направление роста клетки и участвует в ее дифференцировке (Carpita and Gibeaut, 1993). Растения должны защищать себя не только от поедания животными и насекомыми, которых можно отпугнуть шипами, стрекательными клетками, алкалоидами или горьким вкусом, но и от атаки фитопатогенных бактерий, грибов и растительных вирусов. У животных хорошо развита иммунная и лимфатическая системы, включая макрофаги, лейкоциты или антитела, которые могут быть доставлены в пораженные патогенами участки, то у растений такие системы отсутствуют и каждая отдельная клетка должна автономно содержать основной набор защитных механизмов. Клеточная стенка растений является важнейшим элементом защиты против внешних воздействий.

Содержимое растительной клетки ограничено липидной мембраной, за которой следует первичная клеточная стенка, толщиной около 1 мкм. После того, как клетка практически перестает расти и переключается на выполнение опорной функции, начинает формироваться вторичная клеточная , стенка, более толстая и жесткая (Varner and Lin, 1989). Дополнительную прочность клеточной стенке придают целлюлозные кристаллические фибриллы, уложенные в несколько параллельных слоев. Они соединяются между собой гемицеллюлозными цепочками, образуя целлюлозный каркас (Engelsen et al., 1996). Схематичное строение клеточной стенки представлено на рисунке 1.

Рис. 1. Схематическое расположение основных компонентов первичной клеточной стенки (по Taiz Zeiger "Plant Physiology" 3d ch. 15 p.4).

На этом рисунке отмечены целлюлозные микрофибриллы, связанные с гем и целлюлозой (ксилоглюканами). Пектины различных классов образуют гелеобразный матрикс, а структурные белки придают дополнительную жесткость целлюлозному каркасу (Marga et al., 2005). Щеточки на схеме показывают сложные разветвленные цепи пектиновых молекул, которые могут исполнять роль рецепторов. Точками обозначены ионы которые связывают параллельные линейные участки пектиновых цепей, таким образом уплотняя гель.

Целлюлозные фибриллы могут скользить друг относительно друга при растяжении стенки, так как соединение между ними не жесткое. (Brummell and Harpster, 2001). Они располагаются в геле, образованном высокогидратированным олигосахаридным матриксом, состоящим в основном из пектина, который препятствует слипанию целлюлозных фибрилл (Thakur et al., 1997). Пектиновый гель также регулирует проницаемость клеточной стенки (Dourado et al., 2004; Nergard et al, 2005), a структурные белки необходимы для дополнительной жесткости целлюлозного каркаса (Roberts et al,, 1985). Известно, что, несмотря на свою жесткость, клеточная стенка обладает достаточной пористостью. Размер пор составляет 4 нм, и через них могут проходить различные молекулы и белки с молекулярной массой до 60 кДа (Anisimov et al., 1998).

Первичная клеточная стенка состоит, относительно собственного сухого веса, из 25% целлюлозы, 25% гемицеллюлозы, 35% пектина (с вариациями +/- 10%) и содержит от 1 до 8% структурных белков (Keller and Lamb, 1989). Содержание воды в ней составляет 78-80% (Fry, 1994). Во вторичной клеточной стенке содержание целлюлозы несколько выше, чем в первичной.

11.1.2. Пектины как компоненты клеточной стенки

Пектины - это гетерологичная группа полимеров, которые состоят из кислых Сахаров, таких как галактуроновая кислота и нейтральных Сахаров -рамнозы, галактозы и арабинозы. На рис. 2 изображена химическая формула пектина, который имеет линейные участки, состоящие из остатков полигалактуроновых кислот, связанных а-1—>4 связью, и разветвленные области, в которых к основной полигалактуроновой цепи присоединены боковые цепи, состоящие из различных Сахаров. Основными сахарами боковых цепей являются арабинаны и арабиногалактаны, которые имеют общее название рамнозил. R I

Остатки дигалактуроновой кислоты

Рис. 2. Структура пектина. Линейные участки цепи состоят из 70-100 остатков галактуроновой кислоты, соединенных a-J—>4 связью. Линейные участки разветвляются боковыми цепями, состоящими преимущественно из остатков рамнозила-R (Round et al., 2001).

Пектины - наиболее растворимый компонент клеточной стенки, легко вымываются горячей водой или хелатирующими реагентами, связывающими ионы кальция. Некоторые пектины имеют относительно простую линейную структуру, например гомогалактуронан с редкими боковыми цепями, состоящими из остатков рамнозила (Bailey et al1978). Среди пектинов наиболее распространенным являются рамногалактуронаны I типа (RG I) с длинной главной цепью, состоящей из дисахарида рамнозы и гал акту роковой кислоты, и многочисленными боковыми цепями из арабинанов, галактанов, арабиногалактанов и галактуронанов (McNeil et al, 1984). В молекуле RG I ветвистые области перемежаются с длинными линейными участками, состоящими из гомогалактуронанов (Limberg et al., 2000). Самый сложный класс пектинов RG II состоит, по меньшей мере, из 10 различных Сахаров и имеет очень разветвленную структуру, отличную от RG I. Ввиду своей сложности и непохожести на другие пектины, RG II, вероятно, выполняет какие-то сигнальные функции.

Рис. 3. Образование гидратированного геля и ионной связи между карбоксильными группами галактуроновых остатков в параллельных пектиновых цепях с участием катионов Са2+ (Taiz Zeiger "Plant Physiology " 3d ch. 15 p. 12).

Помимо электростатического взаимодействия анионов карбоксильных групп галактуронанов с катионами Са , молекулы пектина могут быть связаны ковалентно (Bednarska et al., 2005) (рис. 3).

Во время биосинтеза в аппарате Гольджи пектины частично эстерифицируются метальными, ацетильными и другими группами, при этом отрицательный заряд карбоксильной группы галактуроновой кислоты маскируется, что препятствует гелеобразованиго пектина через ионы кальция (MacDougall et al, 2001) (рис. 4).

Рис. 4. Секреция пектиновых Сахаров. Электронная микрофотография аппарата Гольджи из Micrasterias sp. Препарат был обработан антителами Jim 7, коньюгированными с золотом, которые реагируют только с эстерифицированным пектином (Lutz-Meindl and Brosch-Salomon, 2000).

Эстерифицированный пектин секретируется в клеточную стенку по актиновым микрофиламентам. Такой пектин считается химически инертным и не может вступать в метаболические реакции (MacKinnon et al, 2002; Wakabayashi et al., 2003) (рис. 5).

Рис. 5. Локализация эстерифицированного пектина. Электронная микрофотография первичной клеточной стенки Micrasterias sp. (PW). Препарат был обработан антителами Jim7, коныогированными с золотом, которые связываются с эстерифицированным пектином (Lutz-Meindl and Brosch-Salomon, 2000). На фотографии видно, что после секреции эстерифицированный пектин равномерно распределяется по первичной клеточной стенке.

После попадания в клеточную стенку пектин может деметилироваться. Этот процесс проиллюстрирован на рисунке 6.

Рис. 6. Распределение деэстерифицированного пектина. На фотографии препарата первичной клеточной стенки Micrasterias (PW) видно, что пектин деметилируется на самой границе стенки (Lutz-Meindl and Brosch-Salomon, 2000). Препарат был обработан антителами Jim5, которые 'Узнают" только деметилированный пектин.

11.1.3. Пектинметилэстеразы и их роль в формировании клеточной стенки

Деэстерификация пектина происходит с помощью фермента пектинметилэстеразы (ПМЭ) (ЕС 3.1 Л .11), который катализирует реакцию отщепления метальной группы из гомогалактуронового эфира в клеточной стенке (рис. 7).

СООСНз

2 HjO 2 CHjOH \

СООН О

О РМЕ О он он

Рис. 7. Реакция деэстерификации дигалактуроновых сложных эфиров, катализируемая пектинметилэстеразой (McFeeters and Armstrong, 1984; Micheli, 2001).

Ферменты ПМЭ, как правило, проводят модификацию пектина в местах, распределенных случайным образом. Такая деэстерификация характерна в большей степени при атаке фитопатогенов (Shevchik and Hugouvieux-Cotte-Pattat, 2003). При этом происходит протонный дрейф, приводящий к понижению рН вблизи клеточной стенки, что вызывает активацию полигалактуронидаз, как клеточных, так и фитопатогенных, которые разрушают пектиновые цепи (Arancibia and Motsenbocker, 2006). После действия полигалактуронидаз пектиновый гель становится более жидким, а клеточная стенка более проницаемой (Dobies et al., 2004), при этом образуются короткие 15-членные олигосахариды, которые активируют защитные механизмы клетки (Walker-Simmons et al, 1984) (рис. 8).

Рис. 8. Схематическое изображение защитных реакций клетки в ответ на образование 15-членных галактуроновых остатков (Birch et al., 1998).

Клеточные ПМЭ могут работать и линейным образом, последовательно отщепляя метильные группы (рис. 9). В этом случае параллельные пектиновые цепи взаимодействуют друг с другом через ионы Са , происходит загустение пектинового геля и клеточная стенка в этом месте становится более жесткой (Marudova et al., 2004).

Цитоплазма о rt т

5 5 5)

Апопласт

ПреПро / \ пмэ

Секреция ПреПроПМЭ и пектина в клеточную стенку

Случайная деэстери фи нация а) о

Caz+ УМ пг О

ОО АвО AJ о о

Размягчение клеточной стенки

П оследовател ьная деэстерификация б)

А Л / юоооос ц

OOOOOOf

Саа+ - -. пг

ОСЮО

Са2+Саг+Саг+Са 2*

WOCKDGOj#

Саг* Са2+Са2+Са2+ Са 2* Са2+

XX

Уплотнение клеточной стенки ф Метилированный остаток галактуроновой кислоты О" Деэстерифицированный остаток галактуроновой кислоты ПГ-полигалакгуронидаэа

Рис. 9. Две модели действия пектинметилэстераз (Capel et al., 2005).

Таким образом, пектинметилэстераза является важнейшим ферментом клеточной стенки, действие которого может локально контролировать жесткость клеточной стенки, позволяя ей растягиваться в нужном направлении и регулировать проницаемость (Baskin, 2005; Bosch et al., 2005). В зависимости от состояния клеточной стенки ПМЭ может деэстерифицировать пектин случайным образом (рис.9а), после чего деметилированные галактуроновые кислоты становятся мишенью для эндополигалактуроназ. Вследствие этого происходит разрыв пектиновых цепей и клеточная стенка размягчается (Wakabayashi et al., 2003). При деметилировании нескольких близко расположенных цепей (рис.9б) пектиновые нити взаимодействуют через ион Са2+ и клеточная стенка в этом месте становится более жесткой (Micheli, 2001).

Фитопатогены, грибы и бактерии с помощью собственной ПМЭ стремятся проникнуть сквозь клеточную стенку, что приводит к индукции различных защитных реакций клетки (McGurl et al., 1994; Oelofse and Dubery, 1996). При этом образуется перекись водорода (Mellersh et al., 2002; Troshina et al., 2006; Wojtaszek, 1997), а также происходит индукция фитоалексинов, активация SIPK киназ, секреция каллозы в места проникновения гаусторий гриба (de Torres et al., 2006; Moscatiello et al., 2006; Ndimba et al., 2003; Truman et al., 2006) (рис. 8). В ответ на экспрессию чужеродной нуклеиновой кислоты патогенов, которые проникают через поврежденную клеточную стенку, активизируются процессы, связанные с умолканием генов или РНК-интерференцией.

11.1.4 Структурные и функциональные особенности пектинметилэстераз

В пыльцевых трубках табака было найдено 7 изоформ ПМЭ, отличающихся по подвижности в фокусирующем геле с изоэлектрическими точками от 5.5 до 7.8 (Li et al., 2002). Считается, что случайную деэстерификацию катализируют ПМЭ диапазона 5.5 - 7.0, а линейную -изоформы с pi 7.0 - 7.8. Активность ПМЭ увеличивается в присутствии дивалентных и, в еще большей степени, тривалентных катионов (Nari et al., 1991; Yoo etal., 2003).

При секвенировании генома Arabidopsis было обнаружено 67 генов, которые содержат последовательности, характерные для ПМЭ (Theologis et al., 2000). Матричные РНК этих генов кодируют ПМЭ в виде предшественника (пре-проПМЭ). Ферменты, выделенные из других видов растений, имеют схожую структуру. На рисунке 10 приведены результаты выравнивания последовательностей, а также вторичная структура ПМЭ из различных видов растений (Johansson et al, 2002).

ВА1

Рис. 10. Выравнивание аминокислотных последовательностей ПМЭ из моркови, картофеля, томатов, ивы и erwinia. Коричневым цветом обозначены а/к активного центра. Желтым цветом выделены гомологичные блоки по пять а/к, а голубым - участки полной гомологии. Анализ последовательностей проводили с помощью программы Blast.

Аминокислотная последовательность пре-про участка содержит сигнальный пептид, который требуется для встраивания в эндоплазматический ретикулум (ЭР). Этот пептид состоит из N-концевых положительно заряженных аминокислот, трансмембранного домена (ТМД) и отрицательно заряженной аминокислотной последовательности. Подобная структура характерна для белков, встраивающихся в мембраны по второму типу, при этом N-конец полипептида находится в цитоплазме, а С-конец оказывается в люмене эндоплазматического ретикулума (Spiess et al., 1995) (рис. 11).

I тип II тип III тип IV тип

Рис. 11. Типы встраивания белков в ЭПР. Спиралью обозначен трансмембранный домен. Положительно заряженная область аминокислот экспонирована в цитоплазму, отрицательно заряженная последовательность а/к находится в люмене ЭПР.

Наличие у белка аминокислоткой последовательности K/HDEL позволяет предположить, что ПМЭ способна перемещаться в аппарат Гольджи, где происходит окончательное созревание белка. При секреции ПМЭ в клеточную стенку осуществляется отщепление пре-про области и в апопласте пре-проПМЭ не обнаруживается.

При анализе последовательностей различных генов ПМЭ из Arabidopsis выяснилось, что их можно разделить на две группы (Gaffe et al., 1997) (рис. 12).

Группа I I и

М-конец ТИД Q11 ЗА OT39D1WOl97Fi R22SP с-коней

Группа II

N-квнец

27,7-45,3 кДа

VIGW

RRLLQS

Q113A Q1Э501360157F R225P

С-конец

52,4-105,6 кДа ipe npo последовательное ть ПМЭ зрелая час<ь ПМЭ

17-70 иДэ 32-53,3 кДа

Рис. 12. Схематическое изображение структурных доменов двух групп ПМЭ (Pelloux et al., 2007). Нумерация аминокислот активного центра приведена для ПМЭ моркови.

Гены первой группы имеют пять-шесть интронов и короткую пре-про область или не содержат её вовсе. На N-конце обеих групп ПМЭ находятся лидерная последовательность, включающая в себя сигнал встраивания в ЭПР, после которого располагается трансмембранный домен. Данная последовательность отщепляется в сайте VIGVV. При окончательном созревании белка предшественник подвергается протеолизу по сайту RRLLQS. ПМЭ первой группы имеют структуру, похожую на ПМЭ фитопатогенов (Christgau et al., 1996; Draborg et al., 1995) и участвуют в размягчении клеточной стенки (Duvetter et al., 2006). Гены второй группы содержат только два-три интрона и длинную пре-про область. Выдвигаются различные гипотезы, зачем нужна пре-про область ПМЭ. Одна из них основана на том, что третичные структуры пре-про области и ингибитор инвертаз имеют значительное сходство (Rausch and Greiner, 2004). Следовательно, ПМЭ секретируется в клеточную стенку в неактивном состоянии, поскольку ее ферментативная часть связана со своим же ингибитором в соотношении 1:1 (Di Matteo et al., 2005). Пути секреции ПМЭ и пектинов совпадают, поэтому пре-про область, являясь cis-ингибитором ферментативной области ПМЭ, предотвращает преждевременную деэстерификацию Сахаров (Camardella et al, 2000). Известно, что большинство фитопатогенов не секретируют пектины, поэтому, возможно, их ПМЭ в большинстве случаев не имеют протяженных пре-про областей (Khanh et al., 1991). Другая гипотеза предполагает, что пре-про область может служить шапероном для правильной укладки ферментативной части белка. В наших экспериментах ПМЭ с делениями в пре-про области не обладали ферментативной активностью, поэтому можно предположить, что способы созревания ПМЭ фитопатогенов и ПМЭ растений различаются. Ферментативная часть ПМЭ имеет размер 33-53 кДа и представляет собой бочкообразную глобулу, сложенную из 29 |3-слоёв, на С-конце имеются 3 а-спирали (Рис. 13).

L Г- у*. ам> 1 ь -Z,

C-trrm

N~4rlrn

Рис. 13. Схематическое изображение 3D структуры ПМЭ моркови (Daucus carota) (Pelloux et al., 2007). Бочкообразная форма белка образована /?-слоями. На С-конце расположены а-спирали.

Такая структура характерна для многих бактериальных и растительных ферментов, гидролизующих пектины: пектинлиаз, пектатлиаз, полигалактуроназ и рамногалактуроназ (Ding et al., 2002). Вдоль молекулы фермента проходит желобок, образованный (З-слоями. Он является местом связывания субстрата - полигалактуроновой цепи (рис. 14). В средней части желобка расположены остатки ароматических аминокислот, которые связывают карбогидраты: Phe84, Tyrl39, Phel60, Tyr222, Trp227, Phe250 и Тгр252.

Рис. 14. Трехмерная модель зрелой части ПМЭ моркови (Daucus с a rota), полученная на основе рентгеноструктурного анализа.

В узкой части субстрат-связывающего желобка находится активный центр фермента. В него входят две карбогидрат-связывающие аминокислоты Asp 136 и Asp 157 и пять аминокислот активного центра: Gin 113, Gin 135, Phe 160, Arg 225 и Trp 227, которые осуществляют реакцию деметилирования (рис. 15).

Рис. 15. Реконструкция активного центра ПМЭ, взаимодействующего с метилированной галактуроновой кислотой (Johansson et al., 2002).

11.1.5. Взаимодействие ПМЭ с транспортным белком вируса табачной мозаики

Во время инфекции вирусы растений в своей транспортной форме переходят из клетки в клетку через особые контакты - плазмодесмы, перемещаясь по мезофиллу листа, пока не достигнут клеток обкладки проводящего пучка и флоэмы. Ранее считалось, что движение вирусов по сосудистой системе растения, которое называется дальним (системным) транспортом, осуществляется пассивным способом вместе с током клеточных Сахаров, которые синтезируются в процессе фотосинтеза (Leisner and Howell, 1993). В противоположность дальнему транспорту, межклеточный (ближний) транспорт осуществляется активно. Для эффективного межклеточного транспорта вирусной инфекции необходимо значительное расширение пропускной способности плазмодесм, которое осуществляется транспортными белками вирусов (Carrington et al., 1996). Вирус табачной мозаики (ВТМ) имеет один транспортный белок (ТБ), в отличие от, например, Х-вируса картофеля, которому для межклеточного транспорта необходимо четыре белка (Howard et al., 2004; Schepetilnikov et al., 2005; Tamai and Meshi, 2001). В настоящее время наиболее детально изучен транспортный белок ВТМ. Было показано, что ТБ локализуется в плазмодесмах (Atkins et al, 1991; Ding et al, 1992) и увеличивает их пропускную способность, как минимум, в десять раз (Wolf et al., 1989; Wolf et al, 1991). Кроме этого, ТБ ВТМ способен кооперативно связываться с однонитевыми нуклеиновыми кислотами (Citovsky et al, 1990; Citovsky et al, 1992; Kiselyova et al, 2001) и взаимодействовать с актином и тубулином (McLean et al, 1996; Heinlein et al, 1996). Исходя из этих данных, считается, что ТБ переносит вирусную РНК из зон репликации в соседние клетки, используя клеточный цитоскелет и модифицированные плазмодесмы (Citovsky and Zambryski, 1993; Ghoshroy et al, 1997). Dorokhov et al, (1999) и Chen et al, (2000) показали, что, помимо взаимодействия с белками цитоскелета (Heinlein et al., 1995; McLean et al, 1995) транспортный белок

ВТМ взаимодействует с белком клеточной стенки - пектинметилэстеразой in vitro (рис.16). Транспортный белок ВТМ также связывается с ПМЭ и в дрожжевой двугибридной системе, причем взаимодействуют только функционально-активные по транспорту мутанты ТБ (Chen et al., 2000).

BSA ззкм 97К * 66К

55К -42К —40К

ЗОК 21К

14.4К

Рис. 16. Результаты элюции фракции белков из клеточных стенок с аффинной по ТБ колонки. ПААГгель окрашен по Кумасси.

На рисунке 16 показаны результаты экстракции белков из клеточных стенок с помощью 1М NaCl. На третьей дорожке видна двойная полоса, которая соответствует белкам с молекулярными массами в районе ЗЗкДа. Данные белки из двойной зоны были выделены и секвенированы.

Сравнение аминокислотных последовательностей ПМЭ и пептидов из этих зон показало, что они имеют существенную гомологию между собой (Dorokhov etal., 1999).

На рисунке 17 хорошо заметно накопление ПМЭ в районе плазмодесмы (ПД). Там же локализуется ТБ ВТМ, при этом его количество намного превышает содержание ТБ в окружающей ПД клеточной стенке.

Рис. 17. Электронная микрофотография среза клеточной стенки, который был обработан антителами к ПМЭ, конъюгированными с золотом. Детекция ПМЭ в клеточной стенке мезофилла табака. V -вакуоль, PD - плазмодема, CW - клеточная стенка, CHL - хлоропласт, N -ядро, С - цитоплазма (Chen et al, 2000).

11.2. УМОЛКАНИЕ ГЕНОВ В РАСТЕНИЯХ

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Гасанова, Татьяна Владимировна

VI. выводы

1. Исследован механизм синтеза ПМЭ с использованием стабильно трансформированных растений и временной системы экспрессии. Показано, что ПМЭ - это мембранный белок II типа, для экспорта которого в клеточные стенки и апопласт необходим 24 а.к.-трансмембранный домен в лидерной части проПМЭ.

2. В трансгенных растениях, при повышенной ферментативной активности ПМЭ наблюдается задержка как системного (по флоэме), так и межклеточного (по плазмодесмам) транспорта вируса.

3. Анализ различных линий стабильно трансформированных растений продемонстрировал, что ферментативная активность ПМЭ возрастает независимо от последовательности трансгена. Это сопровождается накоплением коротких интерферирующих siPHK.

4. Показано, что транскрипционная активность гена ПМЭ возрастает при стрессовых воздействиях, таких, как механическое повреждение листа, проникновение вируса, агроинокуляция или фотоиндукция. В последнем случае был определен 10-часовой временной максимум транскрипционной активности.

5. На примере химерного белка ЗФБ-СЯЛ, содержащего сигнал ядерной локализации и ядерного белка А1у, ответственного за экспорт мРНК, установлено, что ПМЭ влияет на ядерно-цитоплазматический транспорт белков.

6. Уровень транскрипции гена А1у увеличивается к 24 часам после стрессового воздействия и характеризуется менее длительным и не таким выраженным ответом на стресс, чем в случае ПМЭ.

7. Совместная экспрессия генов проПМЭ и р19, оказывающих противоположное воздействие на УГ, приводит к необычно высокому уровню синтеза репортерного белка ЗФБ из вирусного вектора. Это приводит к значительному усилению супрессорного действия белка Р19 вируса карликовой кустистости томатов.

8. На основании полученных результатов сделан общий вывод, что ПМЭ — один из факторов стабильности транскриптома растений.

Благодарности

Приношу искреннюю благодарность за постоянную помощь, поддержку и внимание к моей работе академику РАН И.Г.Атабекову. Также глубоко признательна за многолетнюю помощь и поддержку моему научному руководителю, профессору Ю.Л.Дорохову. Хотела бы выразить особую благодарность к.б.н. П.А.Иванову за безотказное участие в обсуждении и интерпретации результатов экспериментов и за огромную помощь в подготовке диссертации. Выражаю признательность моим коллегам к.б.н. Е.В.Скурату и О.Ю.Фроловой за непосредственное участие и помощь в проведении многих экспериментов; к.б.н. В.К.Новикову за консультации в процессе работы; к.б.н. Л.Г.Тюлькиной за критический взгляд на постановку и проведение экспериментов, а также доброжелательное отношение. Благодарна всем сотрудникам Кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова за годы общей совместной работы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гасанова, Татьяна Владимировна, 2008 год

1. Allen, Е., Xie, Z., Gustafson, А. М., and Carrington, J. С. (2005). microRNA-directed phasing during trans-acting siRNA biogenesis in plants. Cell 121(2), 207-21.

2. Anisimov, A. V., Sorokina, N. Y., and Dautova, N. R. (1998). Water diffusion in biological porous systems: a NMR approach. Magn Reson Imaging 16(5-6), 565-8.

3. Arancibia, R. A., and Motsenbocker, С. E. (2006). Pectin methylesterase activity in vivo differs from activity in vitro and enhances polygalacturonase-mediated pectin degradation in tabasco pepper. J Plant Physiol 163(5), 488-96.

4. Atkins, D., Hull, R., Wells, В., Roberts, K., Moore, P., and Beachy, R. N. . (1991). The tobacco mosaic virus 30K movement protein in transgenic tobacco plants is localized to plasmodesmata. J Gen Virol 72 ( Pt 1), 209-11.

5. Bailey, R. W., Chesson, A., and Monro, J. (1978). Plant cell wall fractionation and structural analysis. Am J Clin Nutr 31(10 Suppl), S77-S81.

6. Baskin, Т. I. (2005). Anisotropic expansion of the plant cell wall. Annu Rev Cell Dev Biol 21, 203-22.

7. Baulcombe, D. (2004). RNA silencing in plants. Nature 431(7006), 356-63.

8. Baulcombe, D. (1996). RNA as a target and an initiator of post-transcriptional gene silencing in transgenic plants. Plant Mol Biol 32(1-2), , 79-88.

9. Baulcombe, D., Chapman, S., and Santa Cruz, S. (1995). Jellyfish green fluorescent protein as a reporter for virus infections. Plant J 7(6), 1045-53.

10. Baumberger, N., and Baulcombe, D. C. (2005). Arabidopsis ARGONAUTE1 is an RNA Slicer that selectively recruits microRNAs and short interfering RNAs. Proc Natl Acad Sci USA 102(33), 11928-33.

11. Bayne, E. H., Rakitina, D. V., Morozov, S. Y., and Baulcombe, D. C. (2005). Cell-to-cell movement of potato potexvirus X is dependent on suppression of RNA silencing. Plant J 44(3), 471-82.

12. Bednarska, E., Lenartowska, M., and Niekras, L. (2005). Localization of pectins and Ca2+ ions in unpollinated and pollinated wet (Petunia hybrida Hort.) and dry (Haemanthus albiflos L.) stigma. Folia Histochem Cytobiol 43(4), 249-59.

13. Belostotsky, D. (2004). mRNA turnover meets RNA interference. Mol Cell 16(4), 498-500.

14. Berna, A., Gafny, R., Wolf, S., Lucas, W. J., Holt, C. A., and Beachy, R. N. * (1991). The TMV movement protein: role of the C-terminal 73 amino acidsin subcellular localization and function. Virology 182(2), 682-9.

15. Bernstein, E., Caudy, A. A., Hammond, S. M., and Hannon, G. J. (2001). Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 409(6818), 363-6.

16. Bevan, M. (1984). Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucleic Acids Res 12(22), 8711-21.

17. Bickel K. S., Morris D. R. (2006). Silencing the transcriptome's dark matter: mechanisms for suppressing translation of intergenic transcripts. Mol Cell 5, 22(3), 309-16.

18. Birch, P. J., Avrora, A. O., Duncan, J. M., Lyon, G. P., Toth, R. L. (1999). Isolation of potato gene that are induced during an early stage of the hypersensitive response to phytophthora infestans. Mol. Plant-Microbe Interaction 4, 356-361.

19. Bollman, К. M., Aukerman, M. J., Park, M. Y., Hunter, C., Berardini, T. Z., and Poethig, R. S. (2003). HASTY, the Arabidopsis ortholog of exportin 5/MSN5, regulates phase change and morphogenesis. Development 130(8), 1493-504.

20. Borsani, O., Zhu, J., Verslues, P. E., Sunkar, R., and Zhu, J. K. (2005). Endogenous siRNAs derived from a pair of natural cis-antisense transcripts regulate salt tolerance in Arabidopsis. Cell 123(7), 1279-91.

21. Bosch, M., Cheung, A. Y., and Hepler, P. K. (2005). Pectin methylesterase, a regulator of pollen tube growth. Plant Physiol 138(3), 1334-46.

22. Bouche, N., Lauressergues, D., Gasciolli, V., and Vaucheret, H. (2006). An * antagonistic function for Arabidopsis DCL2 in development and a new function for DCL4 in generating viral siRNAs. Embo J25(14), 3347-56.

23. Bowman, J. L. (2004). Class III HD-Zip gene regulation, the golden fleece of ARGONAUTE activity? Bioessays 26(9), 938-42.

24. Brandizzi, F. (2004). Endoplasmic reticulum export sites and Golgi bodies behave as single mobile secretory units in plant cells. Plant Cell 16(7), 1753-71.

25. Brandizzi, F., Hanton, S., DaSilva, L. L., Boevink, P., Evans, D., Oparka, K., Denecke, J., Hawes, C. (2003). ER quality control can lead to retrograde transport from the ER lumen to the cytosol and the nucleoplasm in plants. Plant J 34(3), 269-81.

26. Brodersen, P., and Voinnet, O. (2006). The diversity of RNA silencing pathways in plants. Trends Genet 22(5), 268-80.

27. Brummell, D. A., and Harpster, M. H. (2001). Cell wall metabolism in fruit softening and quality and its manipulation in transgenic plants. Plant Mol Biol 47(1-2), 311-40.

28. Canizares, M. C., Taylor, К. M., and Lomonossoff, G. P. (2004). Surface-exposed C-terminal amino acids of the small coat protein of Cowpea mosaic , virus are required for suppression of silencing. J Gen Virol 85(Pt 11), 34315.

29. Capel, F., Nicolai, Т., Durand, D., Boulenguer, P., and Langendorff, V. . (2005). Influence of chain length and polymer concentration on the gelation of (amidated) low-methoxyl pectin induced by calcium. Biomacromolecules 6(6), 2954-60.

30. Cardon, G. H., Hohmann, S., Nettesheim, K., Saedler, H., and Huijser, P. (1997). Functional analysis of the Arabidopsis thaliana SBP-box gene SPL3: a novel gene involved in the floral transition. Plant J 12(2), 367-77.

31. Carpita, N. C., and Gibeaut, D. M. (1993). Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant /3(1), 1-30.

32. Carrington, J. C., Kasschau, K. D., Mahajan, S. K., and Schaad, M. C. (1996). Cell-to-Cell and Long-Distance Transport of Viruses in Plants. Plant Cell 8(10), 1669-1681.

33. Chan, S. W., Zilberman, D., Xie, Z., Johansen, L. K., Carrington, J. C., and Jacobsen, S. E. (2004). RNA silencing genes control de novo DNA methylation. Science 303(5662), 1336.

34. Chapman, S., Kavanagh, Т., and Baulcombe, D. (1992). Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant J 2(4), 549-57.

35. Chen M. H., Citovsky V. (2003). Systemic movement of a tobamovirus requires host cell pectin methylesterase. Plant J 35(3), 386-92.

36. Chen, J., Li, W. X., Xie, D., Peng, J. R., and Ding, S. W. (2004). Viral virulence protein suppresses RNA silencing-mediated defense but upregulates the role of microrna in host gene expression. Plant Cell 16(5), 1302-13.

37. Chen, M. H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A. K., and Citovsky, V. (2000). Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement. EMBOJ 19(5), 913-20.

38. Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., and Zambryski, P. (1990). The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein. Cell 60(4), 637-47.

39. Citovsky, V., Wong, M. L., Shaw, A. L., Prasad, В. V., and Zambryski, P. (1992). Visualization and characterization of tobacco mosaic virus movement protein binding to single-stranded nucleic acids. Plant Cell 4(4), 397-411.

40. Citovsky, V., and Zambryski, P. (1993). Transport of nucleic acids through membrane channels: snaking through small holes. Annu Rev Microbiol 47, 167-97.

41. Cohen, Y., Gisel, A., and Zambryski, P. C. (2000). Cell-to-cell and systemic movement of recombinant green fluorescent protein-tagged turnip crinkle viruses. Virology 273(2), 258-66.

42. Cohen, Y., Qu, F., Gisel, A., Morris, T. J., and Zambryski, P. C. (2000). Nuclear localization of turnip crinkle virus movement protein p8. Virology 273(2), 276-85.

43. Deom, C.M., Wolf, S., Holt, C.A., Lucas, W.J., Beachy, R.N. (1991). ' Altered function of the tobacco mosaic virus movement protein in a hypersensitive host. Virology 180(1), 251-6.

44. Demburg, A. F., Zalevsky, J., Colaiacovo, M. P., and Villeneuve, A. M. (2000). Transgene-mediated cosuppression in the C. elegans germ line. Genes Dev 14(13), 1578-83.

45. Ding, В., Haudenshield, J. S., Hull, R. J., Wolf, S., Beachy, R. N., and Lucas, W. J. (1992). Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants. Plant Cell 4(8), 915-28.

46. Ding, J. L., Hsu, J. S., Wang, M. M., and Tzen, J. T. (2002). Purification and glycosylation analysis of an acidic pectin methylesterase in jelly fig (Ficus awkeotsang) achenes. JAgric Food Chem 50(10), 2920-5.

47. Dlakic, M. (2006). DUF283 domain of Dicer proteins has a double-stranded RNA-binding fold. Bioinformatics.

48. Dobies, M., Kozak, M., and Jurga, S. (2004). Studies of gelation process investigated by fast field cycling relaxometry and dynamical rheology: the case of aqueous low methoxyl pectin solution. Solid State Nucl Magn Reson 25(1-3), 188-93.

49. Draborg, H., Kauppinen, S., Dalboge, H., and Christgau, S. (1995). Molecular cloning and expression in S. cerevisiae of two exochitinases from Trichoderma harzianum. Biochem Mol Biol Int 36(4), 781-91.

50. Dunoyer, P., Himber, C., and Voinnet, O. (2005). Dicer-like 4 is required for RNA interference and produces the 21-nucleotide small interfering RNA component of the plant cell-to-cell silencing signal. Nat Genet 37(12), 135660.69.

51. Dunoyer, P., and Voinnet, O. (2005). The complex interplay between plant viruses and host RNA-silencing pathways. Curr Opin Plant Biol 8(4), 41523. '

52. Duvetter, Т., Fraeye, I., Sila, D. N., Verlent, I., Smout, C., Hendrickx, M., and Van Loey, A. (2006). Mode of de-esterification of alkaline and acidic pectin methyl esterases at different pH conditions. J Agric Food Chem 54(20), 7825-31.

53. Ebhardt, H. A., Thi, E. P., Wang, M. В., and Unrau, P. J. (2005). Extensive 3' modification of plant small RNAs is modulated by helper component-proteinase expression. Proc Natl Acad Sci USA 102(38), 13398-403.

54. Engdahl, H. M., Hjalt, Т. A., and Wagner, Е. G. (1997). A two unit antisense RNA cassette test system for silencing of target genes. Nucleic Acids Res 25(16), 3218-27.

55. Engelsen, S. В., Cros, S., Mackie, W., and Perez, S. (1996). A molecular builder for carbohydrates: application to polysaccharides and complex carbohydrates. Biopolymers 39(3), 417-33.

56. Epel, B. L., Padgett, H. S., Heinlein, M., and Beachy, R. N. (1996). Plant virus movement protein dynamics probed with a GFP-protein fusion. Gene 173(1 Spec No), 75-9.

57. Fagard, M., and Vaucheret, H. (2000). (TRANS)GENE SILENCING IN PLANTS: How Many Mechanisms? Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 51, 167-194.

58. Finnegan, E. J., Margis, R., and Waterhouse, P. M. (2003). Posttranscriptional gene silencing is not compromised in the Arabidopsis CARPEL FACTORY (DICER-LIKE 1) mutant, a homolog of Dicer-1 from Drosophila. Curr Biol 13(3), 236-40.

59. Frenkel, C., Peters, J. S., Tieman, D. M., Tiznado, M. E., and Handa, A. K. (1998). Pectin methylesterase regulates methanol and ethanol accumulation in ripening tomato (Lycopersicon esculentum) fruit. J Biol Chem 273(8), 4293-5.

60. Fridborg, I., Grainger, J., Page, A., Coleman, M., Findlay, K., and Angell, S.2003). TIP, a novel host factor linking callose degradation with the cell-to-cell movement of Potato virus X. Mol Plant Microbe Interact 16(2), 132-40.

61. Fry, S. C. (1994). Plant cell expansion. Unzipped by expansins. Curr Biol 4(9), 815-7.

62. Gaffe, J., Tieman, D. M., and Handa, A. K. (1994). Pectin Methylesterase Isoforms in Tomato (Lycopersicon esculentum) Tissues (Effects of Expression of a Pectin Methylesterase Antisense Gene). Plant Physiol ^ 105(1), 199-203.

63. Gaffe, J., Tiznado, M. E., and Handa, A. K. (1997). Characterization and functional expression of a ubiquitously expressed tomato pectin methylesterase. Plant Physiol 114(4), 1547-56.

64. Gafny, R., Lapidot, M., Berna, A., Holt, C. A., Deom, С. M., and Beachy, R. N. (1992). Effects of terminal deletion mutations on function of the movement protein of tobacco mosaic virus. Virology 187(2), 499-507.

65. Gao, M. J., Parkin, I., Lydiate, D., and Hannoufa, A. (2004). An auxin-responsive scarecrow-like transcriptional activator interacts with histone deacetylase. Plant Mol Biol 55(3), 417-31.

66. Gasciolli, V., Mallory, A. C., Battel, D. P., and Vaucheret, H. (2005). Partially redundant functions of Arabidopsis Dicer-like enzymes and a role for DCL4 in producing trans-acting siRNAs. Curr Biol 15(16), 1494-500.

67. Gatfield, D., and Izaurralde, E. (2002). REFl/Aly and the additional exon junction complex proteins are dispensable for nuclear mRNA export. J Cell Biol 159(4), 579-88.

68. Gazzani, S., Lawrenson, Т., Woodward, C., Headon, D., and Sablowski, R.2004). A link between mRNA turnover and RNA interference in Arabidopsis. Science 306(5698), 1046-8.

69. Ghoshroy, S., Lartey, R., Sheng, J., and Citovsky, V. (1997). Transport of Proteins and Nucleic Acids through Plasmodesmata. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48, 27-50.

70. Gleba, Y., Klimyuk, V., and Marillonnet, S. (2005). Magnifection--a new platform for expressing recombinant vaccines in plants. Vaccine 23(17-18), 2042-8.

71. Gleba, Y., Marillonnet, S., and Klimyuk, V. (2004). Engineering viral expression vectors for plants: the 'full virus' and the 'deconstructed virus' strategies. Curr Opin Plant Biol 7(2), 182-8.

72. Goder, V., Junne, Т., Spiess, M. (2004). Sec61p contributes to signal sequence orientation according to the positive-inside rule. Mol Biol Cell 15(3), 1470-8.

73. Goder, V., Spiess, M. (2003). Molecular mechanism of signal sequence orientation in the endoplasmic reticulum. EMBO J 15, 22(14), 3645-53.

74. Goelet, P., Lomonossoff, G. P., Butler, P. J., Akam, M. E., Gait, M. J., and Karn, J. (1982). Nucleotide sequence of tobacco mosaic virus RNA. Proc Natl Acad Sci USA 79(19), 5818-22.

75. Grishok, A., Tabara, H., and Mello, С. C. (2000). Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science 287(5462), 2494-7.

76. Guo, H. S., Fei, J. F., Xie, Q., and Chua, N. H. (2003). A chemical-regulated inducible RNAi system in plants. Plant ./34(3), 383-92.

77. Hartmann, E., Rapoport, T. A., and Lodish, H. F. (1989). Predicting the orientation of eukaryotic membrane-spanning proteins. Proc Natl Acad Sci USA 86(15), 5786-90.

78. Hartmann, E., Wiedmann, M., and Rapoport, T. (1989). A membrane component of the endoplasmic reticulum that may be essential for protein translocation. EMBO J 8(8), 2225-9.

79. Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., and Beachy, R. N. (1995). Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science 270(5244), 1983-5.

80. Henderson, I. R., Zhang, X., Lu, C., Johnson, L., Meyers, В. C., Green, P. J., and Jacobsen, S. E. (2006). Dissecting Arabidopsis thaliana DICER functionin small RNA processing, gene silencing and DNA methylation patterning. Nat Genet 38(6), 721-5.

81. Himber, C., Dunoyer, P., Moissiard, G., Ritzenthaler, C., and Voinnet, O. (2003). Transitivity-dependent and -independent cell-to-cell movement of RNA silencing. Embo У22(17), 4523-33.

82. Но, Т., Pallett, D., Rusholme, R., Dalmay, Т., and Wang, H. (2006). A simplified method for cloning of short interfering RNAs from Brassica juncea infected with Turnip mosaic potyvirus and Turnip crinkle carmovirus. J Virol Methods 136(1-2), 217-23.

83. Han, Y., Grierson, D. (2002). The influence of inverted repeats on the production of small antisense RNAs involved in gene silencing. Mol Genet Genomics 267(5), 629-35.

84. Han, Y., Griffiths, A., Li, H., Grierson, D. (2004). The effect of endogenous mRNA levels on co-suppression in tomato. FEBSLett 563(1-3), 123-8.

85. Huettel, В., Kanno, Т., Daxinger, L., Aufsatz, W., Matzke, A. J., and Matzke, M. (2006). Endogenous targets of RNA-directed DNA methylation and Pol IV in Arabidopsis. EMBO J25(12), 2828-36.

86. Ivanov, P. A., Karpova, О. V., Skulachev, M. V., Tomashevskaya, O. L., Rodionova, N. P., Dorokhov Yu, L., and Atabekov, J. G. (1997). A tobamovirus genome that contains an internal ribosome entry site functional in vitro. Virology 232(1), 32-43.

87. Iwai, H., Masaoka, N., Ishii, Т., and Satoh, S. (2002). A pectin glucuronyltransferase gene is essential for intercellular attachment in the plant meristem. Proc Natl Acad Sci USA 99(25), 16319-24.

88. Janowski, B. A., Huffman, К. E., Schwartz, J. C., Ram, R., Nordsell, R., Shames, D. S., Minna, J. D., and Corey, D. R. (2006). Involvement of AGO 1 and AG02 in mammalian transcriptional silencing. Nat Struct Mol Biol 13(9), 787-92.

89. Johansson, K., El-Ahmad, M., Friemann, R., Jornvall, H., Markovic, O., and Eklund, H. (2002). Crystal structure of plant pectin methylesterase. FEBS Lett 514(2-3), 243-9.

90. Katiyar-Agarwal, S., Morgan, R., Dahlbeck, D., Borsani, O., Villegas, A., Jr., Zhu, J. K., Staskawicz, B. J., and Jin, H. (2006). A pathogen-inducible endogenous siRNA in plant immunity. Proc Natl Acad Sci USA.

91. Kavi, H. H., Fernandez, H. R., Xie, W., and Birchler, J. A. (2005). RNA silencing in Drosophila. FEBS Lett 579(26), 5940-9.

92. Keller, В., and Lamb, C. J. (1989). Specific expression of a novel cell wall hydroxyproline-rich glycoprotein gene in lateral root initiation. Genes Dev 3(10), 1639-46.

93. Ketting, R. F., and Plasterk, R. H. (2000). A genetic link between co-suppression and RNA interference in C. elegans. Nature 404(6775), 296-8.

94. Khanh, N. Q., Ruttkowski, E., Leidinger, K., Albrecht, H., and Gottschalk, M. (1991). Characterization and expression of a genomic pectin methyl esterase-encoding gene in Aspergillus niger. Gene 106(1), 71-7.

95. Kim, J., and Kim, H. Y. (2006). Molecular characterization of a bHLH transcription factor involved in Arabidopsis abscisic acid-mediated response. Biochim Biophys Acta 1759(3-4), 191-4.

96. Kim, J. H., Choi, D, and Kende, H. (2003). The AtGRF family of putative transcription factors is involved in leaf and cotyledon growth in Arabidopsis. Plant J36{\), 94-104.

97. Klahre, U., Crete, P., Leuenberger, S.A., Iglesias, V.A., Meins, FJ. (2002). High molecular weight RNAs and small interfering RNAs induce systemic posttranscriptional gene silencing in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 11981-11986.

98. Kraft, E., Stone, S. L., Ma, L., Su, N., Gao, Y., Lau, O. S., Deng, X. W., and Callis, J. (2005). Genome analysis and functional characterization of the E2 and RING-type E3 ligase ubiquitination enzymes of Arabidopsis. Plant Physiol 139(4), 1597-611.

99. Krishnamurthy, K., Heppler, M., Mitra, R., Blancaflor, E., Payton, M., Nelson, R. S., and Verchot-Lubicz, J. (2003). The Potato virus X TGBp3 protein associates with the ER network for virus cell-to-cell movement. Virology 309(1), 135-51.

100. Kubota, K., Tsuda, S., Tamai, A., and Meshi, T. (2003). Tomato mosaic virus replication protein suppresses virus-targeted posttranscriptional gene silencing. J Virol 77(20), 11016-26.

101. Kurihara, Y., Takashi, Y., and Watanabe, Y. (2006). The interaction between DCL1 and HYLl is important for efficient and precise processing of pri-miRNA in plant microRNA biogenesis. RNA 12(2), 206-12.

102. Kurihara, Y., and Watanabe, Y. (2004). Arabidopsis micro-RNA biogenesis through Dicer-like 1 protein functions. Proc Natl Acad Sci USA 101(34), 12753-8.

103. Kwong, R. W., Bui, A. Q., Lee, H., Kwong, L. W., Fischer, R. L., Goldberg, R. В., and Harada, J. J. (2003). Leafy cotyledon 1-like defines a class of regulators essential for embryo development. Plant Cell 15(1), 5-18.

104. Lander, E. S., Linton, L. M., Birren, В., Nusbaum, C., Zody, M. S., Baldwin, J., Devon, K., Dewar, K., Doyle, M., FitzHugh, W. (2001). Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409, 860-921.

105. Lartey, R., Ghoshroy, S., Ho, J., and Citovsky, V. (1997). Movement and subcellular localization of a tobamovirus in Arabidopsis. Plant J 12(3), 53745.

106. Lartey, R. Т., Lane, L. C., and Melcher, U. (1994). Electron microscopic and molecular characterization of turnip vein-clearing virus. Arch Virol 138(3-4), 287-98.

107. Lartey, R. Т., Voss, Т. C., and Melcher, U. (1995). Completion of a cDNA sequence from a tobamovirus pathogenic to crucifers. Gene 166(2), 331-2.

108. Lazo, G. R., Stein, P. A., and Ludwig, R. A. (1991). A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium. Biotechnology (N Y) 9(10), 963-7.

109. Lecellier, С. H., Dunoyer, P., Arar, K., Lehmann-Che, J., Eyquem, S., Himber, C.3 Saib, A., and Voinnet, O. (2005). A cellular microRNA mediates antiviral defense in human cells. Science 308(5721), 557-60.

110. Leisner, S. M., and Howell, S. H. (1993). Long-distance movement of viruses in plants. Trends Microbiol 1(8), 314-7.

111. Li, J., Yang, Z., Yu, В., Liu, J., and Chen, X. (2005). Methylation protects miRNAs and siRNAs from a З'-end uridylation activity in Arabidopsis. Curr 5zo/15(16), 1501-7.

112. Lindbo, J. A., and Dougherty, W. G. (1992). Untranslatable transcripts of the tobacco etch virus coat protein gene sequence can interfere with tobacco etch virus replication in transgenic plants and protoplasts. Virology 189(2), 725-33.

113. Lingel, A., Simon, В., Izaurralde, E., and Sattler, M. (2003). Structure and nucleic-acid binding of the Drosophila Argonaute 2 PAZ domain. Nature 426(6965), 465-9.

114. Lucy, A. P., Guo, H. S., Li, W. X., and Ding, S. W. (2000). Suppression of post-transcriptional gene silencing by a plant viral protein localized in the nucleus. EMBO J 19(7), 1672-80.

115. Luo, M. L., Zhou, Z., Magni, K., Christoforides, C., Rappsilber, J., Mann, M., and Reed, R. (2001). Pre-mRNA splicing and mRNA export linked by direct interactions between UAP56 and Aly. Nature 413(6856), 644-7.

116. Lutz-Meindl, U., and Brosch-Salomon, S. (2000). Cell wall secretion in the green alga micrasterias. JMicrosc 198(Pt 3), 208-17.

117. MacDougall, A. J., Rigby, N. M., Ryden, P., Tibbits, C. W., and Ring, S. G. (2001). Swelling behavior of the tomato cell wall network. Biomacromolecules 2(2), 450-5.

118. MacKinnon, I. M., Jardine, W. G., O'Kennedy, N., Renard, С. M., and Jarvis, M. C. (2002). Pectic methyl and nonmethyl esters in potato cell walls. JAgric Food Chem 50(2), 342-6.

119. Macrae, I. J., Zhou, K., Li, F., Repic, A., Brooks, A. N., Cande, W. Z., ' Adams, P. D., and Doudna, J. A. (2006). Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science 311(5758), 195-8.

120. Makeyev, E. V., and Bamford, D. H. (2001). Primer-independent RNA sequencing with bacteriophage phi6 RNA polymerase and chain terminators. RNA1{5\ 774-81.

121. Makeyev, E. V., and Grimes, J. M. (2004). RNA-dependent RNA polymerases of dsRNA bacteriophages. Virus Res 101(1), 45-55.

122. Mallory, A. C., Bartel, D. P., and Bartel, B. (2005). MicroRNA-directed regulation of Arabidopsis auxin response factor 17 is essential for proper development and modulates expression of early auxin response genes. Plant Cell 17(5), 1360-75.

123. Mallory, A. C., and Vaucheret, H. (2004). MicroRNAs: something important between the genes. Curr Opin Plant Biol 7(2), 120-5.

124. Marga, F., Grandbois, M., Cosgrove, D. J., and Baskin, Т. I. (2005). Cell wall extension results in the coordinate separation of parallel microfibrils: evidence from scanning electron microscopy and atomic force microscopy. Plant J 43(2), 181-90.

125. Margis, R., Fusaro, A. F., Smith, N. A., Curtin, S. J., Watson, J. M., Finnegan, E. J., and Waterhouse, P. M. (2006). The evolution and diversification of Dicers in plants. FEBS Lett 580(10), 2442-50.

126. Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., and Gleba, Y. (2005). Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nat Biotechnol 23(6), 718-23.

127. Markovic, O., and Janecek, S. (2004). Pectin methylesterases: sequence-structural features and phylogenetic relationships. Carbohydr Res 339(13), 2281-95.

128. Martin, C., and Paz-Ares, J. (1997). MYB transcription factors in plants. Trends Genet 13(2), 67-73.

129. Marudova, M., MacDougall, A. J., and Ring, S. G. (2004). Pectin-chitosan interactions and gel formation. Carbohydr Res 339(11), 1933-9.

130. McFeeters, R. F., and Armstrong, S. A. (1984). Measurement of pectin methylation in plant cell walls. Anal Biochem 139(1), 212-7.

131. McGurl, В., Pearce, G., and Ryan, C. A. (1994). Polypeptide signalling for plant defence genes. Biochem Soc Symp 60, 149-54.

132. McLean, B. G., Zupan, J., and Zambryski, P. C. (1995). Tobacco mosaic virus movement protein associates with the cytoskeleton in tobacco cells. Plant Cell 7(12), 2101-14.

133. McNeil, M., Darvill, A. G., Fry, S. C., and Albersheim, P. (1984). Structure and function of the primary cell walls of plants. Annu Rev Biochem 53, 62563.

134. Meister, G., Landthaler, M., Patkaniowska, A., Dorsett, Y., Teng, G., and Tuschl, T. (2004). Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Mol Cell 15(2), 185-97.

135. Meister, G., Landthaler, M., Peters, L., Chen, P. Y., Urlaub, H., Luhrmann, R., and Tuschl, T. (2005). Identification of novel argonaute-associated proteins. Curr Biol 15(23), 2149-55.

136. Mellersh, D. G., Foulds, I. V., Higgins, V. J., and Heath, M. C. (2002). H202 plays different roles in determining penetration failure in three diverse plant-fungal interactions. Plant/29(3), 257-68.

137. Micheli, F. (2001). Pectin methylesterases: cell wall enzymes with important . roles in plant physiology. Trends Plant Sci 6(9), 414-9.

138. Mis, J., Ner, S. S., and Grigliatti, T. A. (2006). Identification of three histone methyltransferases in Drosophila: dG9a is a suppressor of PEV and is required for gene silencing. Mol Genet Genomics 275(6), 513-26.

139. Molnar, A., Csorba, Т., Lakatos, L., Varallyay, E., Lacomme, C., and Burgyan, J. (2005). Plant virus-derived small interfering RNAs originate predominantly from highly structured single-stranded viral RNAs. J Virol 79(12), 7812-8.

140. Moscatiello, R., Mariani, P., Sanders, D., and Maathuis, F. J. (2006). Transcriptional analysis of calcium-dependent and calcium-independent signalling pathways induced by oligogalacturonides. J Exp Bot 57(11), 2847-65.

141. Nakayashiki, H. (2005). RNA silencing in fungi: mechanisms and applications. FEBS Lett 579(26), 5950-7.

142. Napoli, C., Lemieux, C., and Jorgensen, R. (1990). Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell 2(4), 279-289.

143. Nari, J., Noat, G., and Ricard, J. (1991). Pectin methylesterase, metal ions and plant cell-wall extension. Hydrolysis of pectin by plant cell-wall pectin methylesterase. Biochem J279 ( Pt 2), 343-50.

144. Ndimba, В. K., Chivasa, S., Hamilton, J. M., Simon, W. J., and Slabas, A. R. (2003). Proteomic analysis of changes in the extracellular matrix of Arabidopsis cell suspension cultures induced by fungal elicitors. Proteomics 3(6), 1047-59.

145. Nemhauser, J. L., and Chory, J. (2005). A new FronTIR in targeted protein degradation and plant development. Cell 121(7), 970-2.

146. Oelofse, D., and Dubery, I. A. (1996). Induction of defence responses in cultured tobacco cells by elicitors from Phytophthora nicotianae. Int J Biochem Cell Biol 28(3), 295-301.

147. Padgett, H. S., Epel, B. L., Kahn, T. W., Heinlein, M., Watanabe, Y., and Beachy, R. N. (1996). Distribution of tobamovirus movement protein in infected cells and implications for cell-to-cell spread of infection. Plant J 10(6), 1079-88.

148. Palauqui J.-C. and Vaucheret H. 1998. Transgenes are dispensable for the RNA degradation step of cosuppression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 9675-9680.

149. Palauqui J.C., Balzergue S. 1999. Activation of systemic acquired silencing by localised introduction of DNA. Curr. Biol. 9, 59-66.

150. Parre, E., and Geitmann, A. (2005). Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense. Planta 220(4), 582-92.

151. Pfeffer, S., Dunoyer, P., Heim, F., Richards, К. E., Jonard, G., and Ziegler-Graff, V. (2002). P0 of beet Western yellows virus is a suppressor of posttranscriptional gene silencing. J Virol 76(13), 6815-24.

152. Pillai, R. S., Artus, C. G., and Filipowicz, W. (2004). Tethering of human Ago proteins to mRNA mimics the miRNA-mediated repression of protein synthesis. RNA 10(10), 1518-25.

153. Pirrotta, V., and Gross, D. S. (2005). Epigenetic silencing mechanisms in budding yeast and fruit fly: different paths, same destinations. Mol Cell 18(4), 395-8.

154. Preall, J. В., and Sontheimer, E. J. (2005). RNAi: RISC gets loaded. Cell 123(4), 543-5.

155. Qiu, W., Park, J. W., and Scholthof, H. B. (2002). Tombusvirus PI 9-mediated suppression of virus-induced gene silencing is controlled by genetic and dosage features that influence pathogenicity. Mol Plant Microbe Interact 15(3), 269-80.

156. Qu, F., and Morris, T. J. (2005). Suppressors of RNA silencing encoded by plant viruses and their role in viral infections. FEBSLett 579(26), 5958-64.

157. Rausch, Т., and Greiner, S. (2004). Plant protein inhibitors of invertases. Biochim Biophys Acta 1696(2), 253-61.

158. Reddy, M. S., Dinkins, R. D., and Collins, G. B. (2003). Gene silencing in transgenic soybean plants transformed via particle bombardment. Plant Cell Rep 21(7), 676-83.

159. Rivas, F. V., Tolia, N. H., Song, J. J., Aragon, J. P., Liu, J., Hannon, G. J., and Joshua-Tor, L. (2005). Purified Argonaute2 and an siRNA form recombinant human RISC. Nat Struct Mol Biol 12(4), 340-9.

160. Roberts, К., Grief, С., Hills, G. J., and Shaw, P. J. (1985). Cell wall glycoproteins: structure and function. J Cell Sci Suppl 2, 105-27.

161. Roth, В. M., Pruss, G. J., and Vance, V. B. (2004). Plant viral suppressors of RNA silencing. Virus Res 102(1), 97-108.

162. Round, A. N., Rigby, N. M., MacDougall, A. J., Ring, S. G., and Morris, V. J. (2001). Investigating the nature of branching in pectin by atomic force microscopy and carbohydrate analysis. Carbohydr Res 331(3), 337-42.

163. Sarmiento, C., Gomez, E., Meier, M., Kavanagh, T. A., and Truve, E. (2006). Cocksfoot mottle virus PI suppresses RNA silencing in Nicotiana benthamiana and Nicotiana tabacum. Virus Res.8(3), 47-52.

164. Schauer, S. E., Jacobsen, S. E., Meinke, D. W., and Ray, A. (2002). Dicerlike 1: blind men and elephants in Arabidopsis development. Trends Plant Sci 7(11), 487-91.

165. Schiebel, W., Haas, В., Marinkovic, S., Klanner, A., and Sanger, H. L. (1993a). RNA-directed RNA polymerase from tomato leaves. I. Purification and physical properties. J Biol Chem 268(16), 11851-7.

166. Schiebel, W., Haas, В., Marinkovic, S., Klanner, A., and Sanger, H. L. (1993b). RNA-directed RNA polymerase from tomato leaves. II. Catalytic in vitro properties. J Biol Chem 268(16), 11858-67.о

167. Schiebel, W., Pelissier, Т., Riedel, L., Thalmeir, S., Schiebel, R., Kempe, D., Lottspeich, F., Sanger, H. L., and Wassenegger, M. (1998). Isolation of an RNA-directed RNA polymerase-specific cDNA clone from tomato. Plant Cell 10(12), 2087-101.

168. Shevchik, V. E., and Hugouvieux-Cotte-Pattat, N. (2003). PaeX, a second , pectin acetylesterase of Erwinia chrysanthemi 3937. J Bacteriol 185(10), 3091-100.

169. Shivprasad, S., Pogue, G. P., Lewandowski, D. J., Hidalgo, J., Donson, J., Grill, L. K., and Dawson, W. O. (1999). Heterologous sequences greatly affect foreign gene expression in tobacco mosaic virus-based vectors. Virology 255(2), 312-23.

170. Simon-Mateo, C., and Garcia, J. A. (2006). MicroRNA-guided processing impairs Plum pox virus replication, but the virus readily evolves to escape this silencing mechanism. J'Virol 80(5), 2429-36.

171. Sleat, D. E., Gallie, D. R., Jefferson, R. A., Bevan, M. W., Turner, P. C., and Wilson, Т. M. (1987). Characterisation of the 5-leader sequence of tobacco mosaic virus RNA as a general enhancer of translation in vitro. Gene 60(2-3), 217-25.

172. Steele, N. M., McCann, M. С., and Roberts, К. (1997). Pectin Modification in Cell Walls of Ripening Tomatoes Occurs in Distinct Domains. Plant Physiol 114(1), 373-381.

173. Stephenson, M. В., and Hawes, M. C. (1994). Correlation of Pectin Methylesterase Activity in Root Caps of Pea with Root Border Cell Separation. Plant Physiol 106(2), 739-745.

174. Takeda, A., Sugiyama, K., Nagano, H., Mori, M., Kaido, M., Mise, K., Tsuda, S., and Okuno, T. (2002). Identification of a novel RNA silencing suppressor, NSs protein of Tomato spotted wilt virus. FEBS Lett 532(1-2), 75-9. .

175. Takeda, A., Tsukuda, M., Mizumoto, H., Okamoto, K., Kaido, M., Mise, K., and Okuno, T. (2005). A plant RNA virus suppresses RNA silencing through viral RNA replication. EMBOJ24(17), 3147-57.

176. Tamai, A., and Meshi, T. (2001). Cell-to-cell movement of Potato virus X: the role of pl2 and p8 encoded by the second and third open reading frames of the triple gene block. Mol Plant Microbe Interact 14(10), 1158-67.

177. Thakur, B. R., Singh, R. K., and Handa, A. K. (1997). Chemistry and uses of pectin—a review. Crit Rev Food Sci Nutr 37( 1), 47-73.

178. Thomas, C. L., Leh, V., Lederer, C., and Maule, A. J. (2003). Turnip crinkle virus coat protein mediates suppression of RNA silencing in Nicotiana benthamiana. Virology 306(1), 33-41.

179. Tieman, D. M., and Handa, A. K. (1994). Reduction in Pectin Methylesterase Activity Modifies Tissue Integrity and Cation Levels in Ripening Tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) Fruits. Plant Physiol 106(2), 429-436.

180. Tieman, D. M., Harriman, R. W., Ramamohan, G., and Handa, A. K. (1992). An Antisense Pectin Methylesterase Gene Alters Pectin Chemistry and Soluble Solids in Tomato Fruit. Plant Cell 4(6), 667-679.

181. Timmermans, M. C., Maliga, P., Vieira, J., and Messing, J. (1990). The pFF plasmids: cassettes utilising CaMV sequences for expression of foreign genes in plants. JBiotechnol 14(3-4), 333-44.

182. Truman, W., de Zabala, M. Т., and Grant, M. (2006). Type III effectors orchestrate a complex interplay between transcriptional networks to modify basal defence responses during pathogenesis and resistance. Plant J 46(1), -14-33.

183. Tyulkina, L. G., Skurat, E. V., Zvereva, A. S., Dorokhov, Y. L., and Atabekov, J. G. (2006). Movement protein stimulates tobacco mosaic virus reproduction in infected cells. Dokl Biochem Biophys 409, 253-6.

184. Ueki, S., and Citovsky, V. (2002). The systemic movement of a tobamovirus is inhibited by a cadmium-ion-induced glycine-rich protein. Nat Cell Biol 4(7), 478-86.

185. Ueki, S., and Citovsky, V. (2005). Identification of an interactor of cadmium ion-induced glycine-rich protein involved in regulation of callose levels in plant vasculature. Proc Natl Acad Sci USA 102(34), 12089-94.

186. Uhrig, J. F., Canto, Т., Marshall, D., and MacFarlane, S. A. (2004). Relocalization of nuclear ALY proteins to the cytoplasm by the tomato bushy stunt virus P19 pathogenicity protein. Plant Physiol 135(4), 2411-23.

187. Vaistij, F. E., Jones, L., and Baulcombe, D. C. (2002). Spreading of RNA targeting and DNA methylation in RNA silencing requires transcription of the target gene and a putative RNA-dependent RNA polymerase. Plant Cell 14(4), 857-67.

188. Varner, J. E., and Lin, L. S. (1989). Plant cell wall architecture. Cell 56(2), . 231-9.

189. Vaucheret, H., Mallory, A. C., and Bartel, D. P. (2006). AGOl homeostasis entails coexpression of MIR168 and AGOl and preferential stabilization of miR168 by AGOl. Mol Cell 22(1), 129-36.

190. Vaucheret, H., Nussaume, L., Palauqui, J. C., Quillere, I., and Elmayan, T. (1997). A Transcriptionally Active State Is Required for Post

191. Transcriptional Silencing (Cosuppression) of Nitrate Reductase Host Genes and Transgenes. Plant Cell 9(8), 1495-1504.

192. Vaucheret, H., Palauqui, J. C., Elmayan, Т., and Moffatt, B. (1995). Molecular and genetic analysis of nitrite reductase co-suppression in transgenic tobacco plants. Mol Gen Genet 248(3), 311-7.

193. Vaucheret, H., Vazquez, F., Crete, P., and Bartel, D. P. (2004). The action of ARGONAUTE1 in the miRNA pathway and its regulation by the miRNA pathway are crucial for plant development. Genes Dev 18(10), 1187-97.

194. Vazquez, F., Vaucheret, H., Rajagopalan, R., Lepers, C., Gasciolli, V., Mallory, A. C., Hilbert, J. L., Bartel, D. P., and Crete, P. (2004). Endogenous trans-acting siRNAs regulate the accumulation of Arabidopsis mRNAs. Mol Cell 16(1), 69-79.

195. Vitale, A., Denecke, J. (1999). The endoplasmic reticulum-gateway of the secretory pathway. Plant Cell 11(4), 615-28.

196. Voinnet, O. (2001). RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends Genet 17(8), 449-59.

197. Voinnet, O. (2005a). Induction and suppression of RNA silencing: insights from viral infections. Nat Rev Genet 6(3), 206-20.

198. Voinnet, O. (2005b). Non-cell autonomous RNA silencing. FEBS Lett 579(26), 5858-71.

199. Walter, P., Johnson, A. E. (1994). Signal sequence recognition and protein targeting to the endoplasmic reticulum membrane. Annu Rev Cell Biol 10, 87-119.

200. Waring, D. A., and Kenyon, C. (1990). Selective silencing of cell communication influences anteroposterior pattern formation in C. elegans. Cell 60(1), 123-31.

201. Wassenegger, M., and Pelissier, T. (1998). A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants. Plant Mol Biol 37(2), 349-62.

202. Wojtaszek, P. (1997). Oxidative burst: an early plant response to pathogen infection. Biochem J322 ( Pt 3), 681-92.

203. Wolf, S., Deom, С. M., Beachy, R. N. and Lucas, W. G. (1989). Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit. Science 246, 377-379.

204. Wolf, S., Deom, С. M., Beachy, R., Lucas, W. J. (1991). Plasmodesmatal function is probed using transgenic tobacco plants that express a virus movement protein. Plant Cell 3(6), 593-604.

205. Wright, S. I., and Gaut, B. S. (2005). Molecular population genetics and the search for adaptive evolution in plants. Mol Biol Evol 22(3), 506-19.

206. Wu, G., Kaper, J. M., and Jaspars, E. M. (1991). Replication of cucumber mosaic virus satellite RNA in vitro by an RNA-dependent RNA polymerase from virus-infected tobacco. FEBSLett 292(1-2), 213-6.

207. Xie, Z., Allen, E., Fahlgren, N., Calamar, A., Givan, S. A., and Carrington, J. C. (2005a). Expression of Arabidopsis MIRNA genes. Plant Physiol 138(4), 2145-54.

208. Xie, Z., Allen, E., Wilken, A., and Carrington, J. C. (2005b). Dicer-like 4 functions in trans-acting small interfering RNA biogenesis and vegetative phase change in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci USA 102(36), 12984-9.

209. Xie, Z., Johansen, L. K., Gustafson, A. M., Kasschau, K. D., Lellis, A. D., Zilberman, D., Jacobsen, S. E., and Carrington, J. C. (2004). Genetic andfunctional diversification of small RNA pathways in plants. PLoS Biol 2(5), E104.

210. Xie, Z., Kasschau, K. D., and Carrington, J. C. (2003). Negative feedback regulation of Dicer-Like 1 in Arabidopsis by microRNA-guided mRNA degradation. Curr Biol 13(9), 784-9.

211. Yamada, K.(2003). Emperical analysis of transcriptional activity in Arabidopsis genome. Science 302, 842-846.

212. Yamazaki, H., Tasaka, M., and Shikanai, T. (2004). PPR motifs of the nucleus-encoded factor, PGR3, function in the selective and distinct steps of chloroplast gene expression in Arabidopsis. Plant J38(1), 152-63.

213. Yan, K. S., Yan, S., Farooq, A., Han, A., Zeng, L., and Zhou, M. M. (2003). Structure and conserved RNA binding of the PAZ domain. Nature 426(6965), 468-74.

214. Ye, K., and Patel, D. J. (2005). RNA silencing suppressor p21 of Beet yellows vims forms an RNA binding octameric ring structure. Structure 13(9), 1375-84.

215. Yoo, S. H., Fishman, M. L., Savary, B. J., and Hotchkiss, А. Т., Jr. (2003). Monovalent salt-induced gelation of enzymatically deesterified pectin. J Agric Food Chem 51(25), 7410-7.

216. Yu, В., Chapman, E. J., Yang, Z., Carrington, J. C., and Chen, X. (2006). Transgenically expressed viral RNA silencing suppressors interfere with microRNA methylation in Arabidopsis. FEBS Lett 580(13), 3117-20.

217. Zandueta-Criado, A., and Bock, R. (2004). Surprising features of plastid ndhD transcripts: addition of non-encoded nucleotides and polysomeassociation of mRNAs with an unedited start codon. Nucleic Acids Res 32(2), 542-50.

218. Zilberman, D., Cao, X., and Jacobsen, S. E. (2003). ARGONAUTE4 control of locus-specific siRNA accumulation and DNA and histone methylation. Science 299(5607), 716-9.

219. Zvereva, S. D., Ivanov, P. A., Skulachev, M. V., Klyushin, A. G., Dorokhov, Y. L., and Atabekov, J. G. (2004). Evidence for contribution of an internal ribosome entry site to intercellular transport of a tobamovirus. J Gen Virol 85(Pt 6), 1739-44.

220. Winston, W., Molodowitch, Ch., Hunter, C. (2002). Systemic RNAi in C.elegans requires the putative transmembrane pretein SID-1. Science 29, 259-9.150