Биохимические свойства транспортных белков потекс- и гордеивирусов, кодируемых первым из трех генов транспортного модуля тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Самуилова, Ольга Витальевна

• Самуилова, Ольга Витальевна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Самуилова, Ольга Витальевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ:

Структура плазмодесм

Общая характеристика межклеточного транспорта вируса в растении

Системы межклеточного транспорта вирусов в растении:

Вирус табачной мозаики

Вирус мозаики костра

Вирус огуречной мозаики

Межклеточный транспорт вирусов с образованием

тубулярных структур

Межклеточный транспорт вирусов с тройным блоком генов

X вирус картофеля и родственные потексвирусы

Вирус штриховатой мозаики ячменя

Вирус некротического пожелтения жилок свеклы

Вирусные РНК хеликазы

Три суперсемейства предполагаемых РНК хеликаз

Консервативные мотивы

Характеристика вирусных хеликаз

РНК хеликазаня активность РБК и ДНК вирусов

Участие хеликаз, в процессах не связанных с репликацией вирусов

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Реактивы

2. Ферменты

3. Векторы для клонирования и бактериальные штаммы

4. Выделение плазмидной ДНК

5. Трансформация бактериальных клеток плазмидной ДНК

6. Расщепление ДНК рестриктазами

7. Электрофорез в агарозном геле

8. Извлечение фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы

9. Затупление концов фрагментов ДНК и лигирование

10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

11. Очистка ПЦР-фрагментов электрофорезом в агарозном геле

12. Амплификация на РНК-матрице

13. Транскрипция in vitro

14. Экспрессия гена 25 кДа транспортного белка ХВК

15. Хроматографическая очистка (Гис)6-транспортных белков

на №2+-нитрилотриацетатной агарозе

16. Электрофорез белков в денатурирующих условиях

17. Перенос белков с полиакриламидных гелей на

нитроцеллюлозные мембраны

18. Субклеточное фракционирование растительного материала

19. Получение антисыворотки к 25 кДа

транспортному белку и иммуноблоттинг

20. Анализ активностей АТФазы, ГТФазы, УТФазы

21. Фотохимическое связывание белков с нуклеозидтрифосфатами

22. Анализ РНК-связывающей активности

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Клонирование и экспрессия гена 25 кДа транспортного

белка ХВК и его делеционных вариантов в векторе pQE-ЗО

Аффинная хроматография 25 кДа белка ХВК и его

делеционных вариантов на Ni-HTA агарозе

Анализ НТФазной активности 25 кДа белка ХВК

Анализ НТФазной активности мутантных вариантов

25 кДа белка ХВК

РНК-связывающие свойства 25 кДа белка и его

делеционных мутантов

Экспрессия и очистка 63 кДа белка ПЛВМ и его мутантов

Анализ НТФазной активности 63 к Да белка и его мутантов

Анализ РНК-связывающих свойств 63 кДа белка ПЛВМ и его

мутантных вариантов

Субклеточная локализация 25 кДа белка ХВК в

зараженных растениях

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТФ аденозинтрифосфат

БО белок оболочки

ВМБ вирус мозаики бамбука

ВМБК вирус мозаики белого клевера

ВМК вирус мозаики костра

ВМКГ вирус мозаики коровьего горошка

BMJIx вирус мозаики лисохвоста

ВМТ вирус мозаики турнепса

ВМЦК вирус мозаики цветной капусты

ВНМКК вирус некротической мозаики красного клевера

ВНПЖС вирус некротического пожелтения жилок свеклы

ВОМ вирус огуречной мозаики

ВТМ вирус табачной мозаики

ВШМЯ вирус штриховатой мозаики ячменя

ГТФ гуанозинтрифосфат

ДСН додецилсульфат натрия

ДТТ дитиотрейтол

ИПТГ изопропил-1 -тио-Р-Б-галактозид

кДа кило-Дальтон

КС клеточная стенка

НТФ рибонуклеозидтрифосфат

ОРТ открытая рамка трансляции

ПААГ полиакриламидный гель

ПД плазмодесмы

ПЛВМ полулатентный вирус мятлика

ППС предельная пропускная способность

ПЦР полимеразная цепная реакция

Рназин плацентарный ингибитор РНКаз

ТБ транспортный белок

ТБГ тройной блок генов

ТБГр белок, кодируемый тройным блоком генов

ТЕМЕД N, N, N', N' -тетраметилэтилендиамин

Т7 промотор транскрипции бактерофага Т7

УТФ уридинтрифосфат

ХВК X вирус картофеля

ЦТФ цитозинтрифосфат

ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭПР эндоплазматический ретикулум

аа аминокислотные остатки

GUS ß-глюкуронидаза

2+

Ni-HTA нитрилотриацетат в комплексе с катионом Ni

SF суперсемейство

ts температурочувствительный

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биохимические свойства транспортных белков потекс- и гордеивирусов, кодируемых первым из трех генов транспортного модуля»

ВВЕДЕНИЕ

Транспорт вирусной инфекции в зараженном растении является в настоящее время одной из наиболее изучаемых проблем в молекулярной вирусологии растений. Исследование молекулярных механизмов этого процесса, являющегося, по-видимому, частным примером общей физиологической функции транспорта макромолекул в растениях, имеет не только важное теоретическое значение, но и существенно для разработки эффективных способов защиты растений от вирусной инфекции.

Ключевую роль в процессе вирусного транспорта выполняют кодируемые вирусом транспортные белки (ТБ), обеспечивающие перенос вирусного генома внутри клетки к плазмодесмам (ПД) - цитоплазматическим каналам, соединяющим соседние клетки растения, далее через ПД в здоровые клетки эпидермиса и мезофилла (межклеточный или ближний транспорт) и по сосудам флоэмы (дальний транспорт) (Carrington et al., 1996).

Реализация функции транспорта обеспечивается множественными функциональными активностями ТБ в процессе их взаимодействия с вирусными нуклеиновыми кислотами и различными вирусными и клеточными белками, участвующими в переносе вирусного генома. ТБ, кодируемые единственным геном у многих филогенетически далеких групп вирусов, несмотря на значительные отличия в первичной структуре, имеют сходные биохимические свойства. Например, для ТБ вируса табачной мозаики (ВТМ), вируса некротической мозаики красного клевера (ВНМКК) и вируса огуречной мозаики (ВОМ) было показано, что они эффективно взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами, связывают ГТФ; содержат сигнал локализации в ПД, увеличивают пропускную способность ПД и способны переносить вирусную нуклеиновую кислоту к/через ПД (Carrington et al., 1996; Ghoshroy et al., 1997). Известно, что за эти активности

ответственны функциональные субдомены ТБ, которые могут физически перекрываться.

Объектом настоящей работы являются ТБ, кодируемые первым геном тройного блока генов (ТБГ) представителей двух различных групп вирусов -потексвируса - Х-вируса картофеля (ХВК) и гордеивируса - полулатентного вируса мятлика (ПЛВМ). ТБГ представляет собой особый транспортный модуль, перекрывающиеся гены которого кодируют три ТБ, обозначаемых как ТБГр1, ТБГр2, ТБГрЗ (Morozov et al., 1989; Solovyev et al., 1996). Предполагается, что активности ТБ, кодируемых единственным геном, разнесены между тремя ТБ вирусов, имеющих в своем геноме ТБГ (Morozov et al., 1991). ТБГр2 и ТБГрЗ являются высоко гидрофобными белками и ассоциированы с мембранами (Morozov et al., 1990, 1991; Donald et al., 1993) и клеточными стенками (Hefferon et al., 1997). ТБГр1 белок содержит семь консервативных аминокислотных мотивов, характерных для суперсемейства I РНК НТФаз/хеликаз (Gorbalenya and Koonin et al., 1993). Поскольку транспорт вирусного генома требует значительных затрат энергии практически на всех этапах этого процесса, наличие собственной АТФазной активности у ТБ, видимо, является эволюционным приобретением вирусов с ТБГ с целью повышения эффективности распространения вирусной инфекции в зараженных растениях. Детальное изучение биохимических свойств ТБГр1 белков и локализация субдоменов этих белков, ответственных за различные активности, важны как для изучения молекулярных механизмов транспорта вирусов с ТБГ, так и для понимания общих принципов функционирования системы транспорта макромолекул (белков и нуклеиновых кислот) в растении.

Целью настоящей работы было исследование некоторых биохимических свойств ТБ, кодируемых первым геном ТБГ потексвируса ХВК и гордеивируса ПЛВМ, а также субклеточной локализации ТБГр1 белка

ХВК в зараженных растениях. В ходе исследования решались следующие задачи:

-получение бактериальных штаммов-продуцентов рекомбинантных ТБ - 25 кДа белка ХВК и 63 кДа белка ГОШМ и серии их мутантных вариантов;

-изучение НТФазной и РНК-связывающей активностей 25 кДа белка ХВК и 63 кДа белка ПЛВМ и их мутантов;

-выявление функциональных суб доменов ТБГр1 белков, ответственных за эти активности;

-получение поливалентной антисыворотки к 25 кДа белку ХВК и изучение кинетики синтеза и субклеточной локализации этого белка в растениях табака ШсоНапа 1аЪасит, зараженных ХВК.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

При заражении растений вирусы проникают в ограниченное число первично инфицированных клеток. Для успешного развития инфекции необходимо, чтобы вирус из первично инфицированных клеток растения попал в близлежащие здоровые клетки. Для системного инфицирования растения вирус должен проникнуть в проводящую систему растения, а затем покинуть ее для дальнейшего межклеточного транспорта в незараженном листе. Данный обзор литературы посвящен проблеме межклеточного транспорта вирусов в растении.

Структура плазмодесм

Наиболее очевидным и, видимо, единственным путем перемещения вируса из клетки в клетку является его переход через плазмодесмы. ПД -тонкие цитоплазматические каналы, соединяющие соседние клетки растений - играют важную роль в коммуникации клетка-клетка и распределении воды и питательных веществ в растении (Deom et al., 1992). ПД, которые формируются в процессе цитокинеза (первичные ПД), первоначально возникают как тубулярные структуры, ограниченные цитоплазматической мембраной, диаметром около 25-30 нм (рис. 1). Внутри таких структур позже образуется аксиальный компонент, называемый десмотрубочкой, которая состоит из спрессованной мембраны эндоплазматического ретикулума двух соседних клеток (Overall and Blackman, 1996). С помощью высокоразрешающего электронного микроскопа были обнаружены белки, встроенные в плазматическую мембрану (Р2), и эндоплазматический ретикулум (PI). Эти белки соединяли "мостики" из белка, которые разделяют ПД на микроканалы (Overall and Blackman, 1996). В разрезе ПД делится на 10-20 дискретных цилиндрических каналов, каждый из которых имеет радиус 1,5-3,0 нм (Robards, 1975; Terry and Robards, 1987). При поперечном сечении ПД обнаруживается, что эти каналы образованы окружающими

десмотрубочку глобулярными структурами, каждая из которых имеет диаметр около 5 нм (Robarás, 1975).

мк

L Р2

Рис.2 Схема устройства сложной развлетленной

плазмодесмы (из Lucas and Gilbertson, 1994).

ДТ

Рис.1 Схема устройства плазмодесмы (из Lucas and Gilbertson, 1994). Сверху - продольное сечение, правее -поперечное сечение. КС - клеточная стенка, СП- срединная пластинка, ДТ- десмотрубка, МК-микроканал, PI, Р2, L - белки плазмодесм ПМ-плазматическая мембрана.

Механизм, контролирующий местоположение и плотность первичных ПД неизвестен, но показано, что во всех клеточных стенках в пределах меристемы первичные ПД представлены с высокой частотой расположения (Lucas and Gilbertson, 1994). ПД, обазующиеся после цитокинеза (вторичные ПД), формируются в результате слияния плазматических мембран. Простые вторичные ПД могут образовываться на новом месте в результате инвагинации плазматической мембраны и эндоплазматического ретикулума в клеточную стенку одновременно с двух сторон. Чаще сложные вторичные ПД (рис. 2) образуются из первичных (Ding et al., 1992). Формирование вторичных ПД необходимо для нормального функционирования листа. Блокирование образования вторичных ПД в клетках мезофилла табака коррелирует с началом ускоренного старения (Ding et al., 1993).

Белковый состав ПД до конца не изучен, однако, известно, что белки с молекулярными массами 26 и 27 кДа (РАР26 и РАР27) являются

компонентами ПД (Yahalom et al., 1991; Kotlizky et al., 1992). Эти белки иммунологически гомологичны белкам семейства коннексинов, выделенных из межклеточных соединений клеток животных. Клеточное фракционирование показало, что РАР27 содержится в мембранной фракции, а РАР26 ассоциирован с клеточными стенками. В центре десмотрубочки находятся белковые частицы, связанные нитчатыми структурами с белковыми глобулами на наружной поверхности эндоплазматического ретикулума, что помогает поддерживать структуру десмотубулы (Citovsky et al., 1993). Белковые глобулы на поверхности десмотубулы, вероятно, представлены актином, поддерживающим структуру ПД, так как актин был локализован в ПД и при обработке протеазами или цитохалазином, разрушающим актин, увеличивается диаметр ПД, особенно в районе "шеи" (участок ПД, плотно прилегающий к клетке) (Overall and Blackman, 1996). В области "шеи", а также в области центральной полости (у некоторых ПД есть в середине слегка увеличенная полость между плазматической мембраной и десмотрубочкой) обнаружены белковые спицы, соединяющие актиновые глобулы с белками плазмалеммы. Скорее всего, они состоят из миозина (Overall and Blackman, 1996; Citovsky et al., 1993).

В плазматической мембране в районе "шеи" есть якорные белки, взаимодействующие с сократительными белками и с предполагаемым внеклеточным сфинктером (возможно, эти внеклеточные структуры обеспечивают заякоривание компонентов ПД на клеточной стенке). Сократительные белки связывают плазматическую мембрану с

эндоплазматическим ретикулумом в районе "шеи" и представлены, по-

2_|_

видимому, центрином — С а -связывающим фосфопротеином, основным белком ряда нитчатых структур. Эти структуры быстро сокращаются при повышении внутриклеточной концентрации Са , а их удлинение АТФ-зависимо и сопряжено с фосфорилированием.

Результаты опытов по микроинъекции флуоресцентно-меченных молекул декстрана разного размера и данные электронной микроскопии показали, что предельная пропускная способность (ППС) ПД клеток мезофилла здоровых растений составляет 1 кДа, причем вычисленный радиус Стокса для молекул такой массы, равный 0,75 нм, соотносился с диаметром (1,5 нм) микроканалов (Wolf et al., 1989). Недавние эксперименты с использованием новых низкомолекулярных флуоресцентных красителей свидетельствуют о том, что ПД играют большую роль в процессе развития растений. Эмбрионы высших растений объединены в простой симпласт, где цитоплазма всех клеток соединяется между собой посредством ПД. В процессе развития растения отдельные группы клеток становятся изолированными, причем основную роль здесь играют именно ПД, которые по какой-то причине перестают функционировать. Такая изоляция приводит к тому, что отдельные компартменты растения функционируют независимо друг от друга, что позволяет рассматривать зрелое цветущее растение как мозаику симпластических доменов (McLean et al., 1997). При этом система является динамичной и в ответ на физиологические условия, условия внешней среды, ППС ПД может уменьшаться или полностью элиминироваться, предотвращая транспорт, либо увеличиваться, позволяя перемещаться через ПД большим молекулам (Ghoshroy et al., 1997).

Размер ПД значительно меньше размера вирусных частиц и произвольно свернутой нуклеиновой кислоты. Было обнаружено, что фосфоинозитиды, а также (З-глюкан (каллоза) способствуют уменьшению проницаемости ПД (Baron-Eppel et al., 1988; Wolf et al., 1989). Работы последних лет представили доказательства участия эндогенных макромолекул в изменении ППС ПД в растении. Например, показано, что транскрипционный фактор из кукурузы гомеодоменный белок KNOTTED 1 (KN1) передвигается из клетки в клетку. В процессе развития кукурузы мРНК, кодирующая KN1, выявляется во всех меристемных слоях, включая

наружный. Эксперименты по микроинъекции показали, что белок увеличивает ППС ПД до 40 кДа и участвует в транспорте своей мРНК (Lucas et al., 1995).

В опытах по ко-инъекции комплекса KN1 белка с частицами золота (615 нм) и ТБ В ОМ в растения показано, что только при молярном соотношении 1:7000 ТБ ВОМ способен блокировать межклеточный транспорт комплекса KN1 с частицами золота. Подобные результаты были получены и при использовании этого комплекса и свободного KN1. В опытах с использованием ТБ ВТМ и комлекса ТБ ВТМ с частицами золота (15 нм) было показано, что комплекс блокирует транспорт свободного ТБ ВТМ. Кроме того, показано, что этот комплекс предотвращает транспорт KN1 белка (присутствующего в инфицированных клетках в соотношении 1:70). Эти результаты свидетельствуют в пользу того, что KN1 белок и ТБ ВОМ и ВТМ, вероятно, используют один и тот же рецептор в ПД растения для межклеточного транспорта (Kragler et al., 1998). По аналогии с другими транспортными процессами, в частности, транспорта макромолекул через комплекс ядерной поры, предполагают, что процесс транслокации включает три последовательных шага: KN1 связываясь с шапероном и/или рецептором в ПД, способствует увеличению ППС, белок транспортируется через микроканалы ПД при участии «транслокационной системы» и далее белок высвобождается в цитоплазме соседних клеток (Kragler et al., 1998).

Получены доказательства транспорта белков при изучении флоэмного сока. В нем были обнаружены белки с молекулярной массой 10-200 кДа. Предполагается, что эти белки транспортируются в ситовидные элементы через ПД, связывающие их с клетками-спутниками, так как зрелые ситовидные элементы лишены ядра и белок-синтезирующего аппарата. При этом транспорт является селективным, поскольку не все белки, найденные в клетках-спутниках, выявляются в ситовидных элементах (Seron and Haenni, 1996). Результаты опытов по микроинъекции ФИТЦ-декстранов

подтверждают гипотезу о том, что большинство (или все) белки флоэмного сока взаимодействуют с рецепторами ПД клеток мезофилла и увеличивают ППС и транспортируются из клетки в клетку (Balachandran et al., 1997).

В последних сообщениях было показано, что СшРР16 белок, выделенный из Cucurbita maxima, обладает свойствами вирусных транспортных белков (Xoconoste-Cazares et al., 1999). Результаты опытов по микроинъекции показали, что CmPPlö белок транспортируется из клетки в клетку и выполняет роль «посредника» при транспорте для РНК.

Общая характеристика межклеточного транспорта

вируса в растении

В настоящее время точный молекулярный механизм межклеточного транспорта вирусов не ясен. В течение последних нескольких лет была экспериментально подтверждена предложенная гипотеза (Atabekov and Dorokhov et al., 1984) о том, что большинство вирусов растений кодируют белки, не участвующие прямо в репликации вирусного генома, но необходимые для передвижения вируса из места репликации в первично зараженной клетке в соседние здоровые клетки. Это так называемые транспортные белки.

Межклеточный транспорт рассматривают как процесс, состоящий из трех основных этапов: 1) перенос вирусного генома из места репликации для последующего внутриклеточного транспорта; 2) транспорт вирусного генома к ПД; 3) перенос вирусного генома через ПД.

Репликация большинства +РНК-содержащих вирусов проходит в цитоплазме в ассоциации с поверхностью мембран. Репликация некоторых других типов вирусов таких, как одноцепочечные ДНК геминивирусов и некоторых -РНК-содержащих вирусов проходит в ядре. Возможно, что инициация процесса внутриклеточного транспорта осуществляется в результате взаимодействия ТБ с белками, участвующими в репликации.

Кроме того, для некоторых вирусов показано, что белки, участвующие в репликации, действуют как модуляторы межклеточного и дальнего транспорта (Carrington et al., 1996). Интересные результаты были получены для потивирусов. Было показано, что С1 белок, необходимый для репликации геномной РНК, выполняет также функцию ТБ (Carrington et al., 1998).

Внутриклеточный транспорт комплекса ТБ-вирусный геном, возможно, происходит при участии компонентов, ассоциированных с цитоскелетом (Carrington et al., 1996).

Предполагается, что ТБ взаимодействует и связывается с некими хозяйскими рецепторами, локализованными в ПД, что способствует распространению вирусной инфекции через ПД. Как было предложено (Atabekov and Talyansky, 1990) узнавание между хозяйскими факторами и ТБ требует некоторого сродства между ними и уровень этого сродства может варьировать для различных комбинаций ТБ вируса-факторы растения хозяина. Согласно этому предположению, при полном отсутствии сродства (например, в нехозяйских растениях) между ТБ и хозяйским фактором вирус остается только в первично инфицированных клетках растения, что играет важную роль в определении круга хозяев вируса.

ТБ, кодируемые единственным геном у многих филогенетически далеких групп вирусов, несмотря на значительные отличия в первичной структуре, имеют сходные биохимические свойства.

Было показано, что вирусные ТБ модифицируют размеры ПД. Используя меченные соединения, обнаружили, что в трансгенных по гену 30 кДа ТБ ВТМ растениях размер ПД увеличивался - если в контрольных растениях ПД пропускают молекулы размером до 850 Да, то в трансгенных растениях размер ПД увеличивался так, что они были способны пропускать молекулы с молекулярной массой до 10 кДа. Возможно, что 30 кДа ТБ ВТМ способен входить во вторичные ПД и взаимодействовать с эндогенными

белками ПД и таким образом увеличивать ППС (Lucas and Gilbertson, 1994; Wolf et al., 1991). В опытах по микроинъекции ТБ также показано, что имеет место увеличение ППС ПД (Waigmann et al., 1994; Carrington et al., 1996; Ghoshroy et al., 1997) и в комплексе с нуклеиновыми кислотами ТБ могут перемещаться через ПД (Fujiwara et al., 1993; Ding et al., 1995).

Перенос комплекса ТБ-вирусный геном через ПД, видимо, состоит из трех этапов - связывание с поверхностью ПД, перенос комплекса через пору и высвобождение генома в соседних клетках растения. Связывание комплекса ТБ-вирусный геном с ПД, вероятно, происходит с участием неких рецепторов или заякоривающих белков, расположенных на поверхности ПД. Транспорт комплекса в ПД, возможно, происходит без участия компонентов, ассоциированных с цитоскелетом, вовлеченных во внутриклеточный перенос. Скорее всего транспорт такого комплекса является активным процессом, в котором геном вируса и ТБ транспортируются через ПД в результате взаимодействия с транспортными механизмами ПД. Этот транспортный механизм обеспечивается функционированием сопутствующих белков, шаперонов и/или молекулярных моторов (Carrington et al., 1996). Механизм высвобождения комплекса в соседние клетки мало изучен.

Если провести аналогию с другими транспортными процессами, то, вероятно, процесс транспорта является энергозависимым (Carrington et al., 1996). Существует как минимум три этапа, где может использоваться энергия гидролиза НТФ: 1) внутриклеточный транспорт ТБ и/или вирусспецифического РНП к клеточной стенке (к ПД или компартмент, расположенный поблизости от ПД); 2) увеличение Ш 1С ПД; 3) перенос белков или РНП через ПД (Ghoshroy et al., 1997; Heinlein et al., 1998; Boevink et al., 1998). Для многих ТБ показано, что они обладают способностью связывать и гидролизовать НТФ, что, вероятно, нужно для того, чтобы обеспечить этот процесс необходимой энергией.

Сравнение аминокислотных последовательностей ТБ разных групп вирусов растений позволило выявить четыре основных суперсемейства: 30К-суперсемейство (названо по молекулярной массе ТБ ВТМ), суперсемейство белков, закодированных тройным блоком транспортных генов, суперсемейство тимовирусных ТБ и суперсемейство геминивирусных ТБ (Koonin et al., 1991; Mushegian et al., 1993). До сих пор непонятно, используют ли разные вирусы растений для межклеточного транспорта одну и ту же хозяйскую систему транспортировки макромолекул, однако очевидно, что существует более одного механизма собственно вирусного транспорта. При этом механизм, используемый тем или иным вирусом, не определяется типом ТБ. Часто вирусы, кодирующие ТБ, относящиеся к разным суперсемействам, используют один и тот же механизм межклеточного транспорта, в то время как близкие по последовательности ТБ обеспечивают разные пути транспорта (McLean et al., 1997; Santa Cruz et al., 1998). Более того, известно, что один и тот же вирус может использовать разные стратегии межклеточного транспорта на разных стадиях развития инфекции или в разных типах ткани (Jansen et al., 1998; Waigmann et al., 1995).

Часто в процесс межклеточного транспорта могут вовлекаться дополнительные вирусспецифические белки, например репликаза (Petty et al., 1994). Однако, согласно последним представлениям, именно участие белка оболочки (БО) определяет механизм межклеточного транспорта вируса. На основе этого выделяют два механизма межклеточного транспорта вируса: 1) межклеточный транспорт не зависит от присутствия БО, такой механизм транспорта присущ ВТМ (Takamatsu et al., 1987); 2) межклеточный транспорт требует присутствия БО, такой механизм межклеточного транспорта присущ, например, вирусу мозаики коровьего горошка (Wellink et al., 1989; Van Lent et al., 1990). В данном случае межклеточный транспорт идет с образованием так называемых тубулярных структур. Отдельную

группу составляют вирусы, чей межклеточный транспорт требует участия БО, но образования тубулярных структур при этом не наблюдается. Сюда относятся, например ХВК и вирус мозаики костра.

Системы межклеточного транспорта вирусов растений

Вирус табачной мозаики

Тобамовирусы - группа палочковидных вирусов растений с +РНК-геномом. Типовой представитель тобамовирусов - вирус табачной мозаики (ВТМ) является модельным объектом современной молекулярной вирусологии.

126К ЗОК БО 1

183К

Рис. 3. Схема организации генома ВТМ. Прямоугольники - ОРТ, эллипс - кэп-структура на 5'-конце, тРНК-подобная структура на З'-конце.

Геномная РНК кодирует три неструктурных белка (126, 183 и 30 кДа) и белок оболочки (Beachy et al., 1976; Bruening et al., 1976) (рис. 3). 126 и 183 кДа белки, предполагаемые компоненты РНК-полимеразы) транслируются непосредственно с геномной РНК, причем 180 кДа белок синтезируется при супрессии слабого ашЬег-терминирующего ко дона гена 130 к Да белка (Pelham et al., 1978). БО и 30 кДа ТБ кодируются с различных 3'-котерминальных субгеномных РНК (Dawson and Lehto, 1990).

Первые доказательства транспортной роли 30 кДа белка ВТМ были получены при изучении дефектных по транспорту мутантов ВТМ. Транспорт таких мутантов был возможен при низкой (пермиссивной) температуре - 22°, но не при высокой - 32°. Определение аминокислотной последовательности показало, что в отличие от родительского штамма, у 30 кДа белка температуро-чувствительного мутанта Lsl присутствует единственная

замена пролина на серин в положении 154 (Ohno et al., 1983). Введение аминокислотной замены, характерной для 30 кДа белка Lsl (пролин заменяли на серин), в инфекционную кДНК копию ВТМ приводило к Lsl фенотипу (Meshi et al., 1987). Было установлено, что 30 кДа белок штамма другого температуро-чувствительного мутанта №2519 содержит замену аргинина на глицин в положении 144 (Zimmern and Hunter, 1983).

Atabekov and Dorokhov, 1984 предположили, что межклеточный транспорт вирусной инфекции может осуществляться в форме вирусспецифических рибонуклеопротеиновых комплексов (вРНП). Возможными компонентами таких комплексов являются вирусные РНК, ТБ и, возможно, клеточные факторы. Вирусспецифические РНП комплексы были впервые обнаружены в инфицированных ВТМ клетках табака по отличной от частиц зрелого вируса плавучей плотности в CsCI (Dorokhov et al., 1983, 1984). Saito et al., 1988 выявили домен в составе 30 кДа белка, богатый основными аминокислотами. Было сделано предположение о том, что этот домен отвечает за связывание с РНК. Позже Citovsky et al., 1990 продемонстрировали образование комплекса 30 кДа-РНК in vitro. Данные по электронной микроскопии показывают, что 30 кДа белок может разворачивать свернутые молекулы РНК, формируя длинные и тонкие вРНП диаметром около 2 нм (Citovsky et al., 1992). На основании этих данных была предложена модель, по которой глобулы ТБ "одевают" вирусную РНК по всей длине, наподобие SSB белков Е. coli. Диаметр РНП комплекса соответствовал размеру модифицированных плазмодесм, что свидетельствует в пользу гипотезы о том, что такие комплексы выполняют роль транспортных интермедиатов in vivo. Надо отметить, что мутации в 30 кДа белке, приводящие к неспособности ТБ связываться с РНК, приводят к полной потере транспортной функции ВТМ (Citovsky et al., 1992).

Представляется маловероятным, что протяженная молекула вРНП комплекса достигает ПД в результате пассивной диффузии. Было сделано

предположение, что и межклеточный транспорт и внутриклеточное перемещение к ПД являются активными процессами (Zambryski, 1995). Связывание 30 кДа белка с цитоскелетом позволяет допустить, что транспортный комплекс перемещается внутри цитоплазмы по микротрубочкам, а затем направляется по актиновым филаментам через ПД (McLean et al., 1996). Reichel et al., 1998 предполагают, что внутриклеточный транспорт ТБ, также как и межклеточный транспорт ВТМ, происходит в результате через эндоплазматический ретикулум. Авторы преполагают, что в этом процессе участвуют микротрубочки. Ассоциация ТБ ВТМ с эндоплазматическим ретикулумом на ранней стадии развития инфекции и последующие морфологические изменения эндоплазматического ретикулума может подтверждать, что этот клеточный компартмент участвует во внутриклеточном транспорте (Reichel et al., 1998).

В последних обзорах рассматривается возможность участия актиновых филаментов также и в процессе обратимого открывания ПД (Overall and Blackman, 1996; McLean et al., 1997). Согласно одной из моделей транспорт через ПД может регулироваться изменением упаковки актиновых филаментов, которые входят в состав белков ПД в районе шейки. Альтернативная модель предполагает увеличение ППС ПД за счет регулирования сжатия десмотрубочки. В этом процессе могли бы также участвовать актиновые филаменты (Overall and Blackman, 1996; McLean et al, 1997).

Предполагалось, что третичная структура ТБ играет важную роль для РНК-связывающей активности, так как денатурация 30 кДа, ведущая к дестабилизации третичной структуры, и к увеличению числа положительно заряженных аминокислотных остатков, снижает РНК-связываюшую активность белка (Li et al, 1996). Также было показано, что 30 кДа белок связывает ГТФ, что предполагает существование каких-то взаимодействий

комплекса с предполагаемой ГТФазой, которая ассоциирована с плазмодесмой (1л е1 а1., 1996).

На рис. 4 показаны функциональные домены 30 кДа ТБ ВТМ (Waigmann е1 а1., 1994). Делеционный анализ показал, что С-конец не требуется для индуцированного увеличения ППС плазмодесм и межклеточного транспорта (Вегпа е1 а1., 1991). 19 аминокислотных остатков (195-213), не являющимися высококонсервативными среди тобамовирусов, важны для увеличения ППС (Вегпа е1 а1., 1991). Домен (Е), захватывающий не менее 81 аминокислотных остатков, участвует в увеличении ППС ПД и быть важен для правильной укладки белка (Waigmann е1 а1., 1994).

Е (130-213) увеличение ППС D (240-268)

взаимодействие с КС фосфорилирование

! ! I-1

С (65-86) А (112-185) В (185-268)

конформация РНК-связывание РНК-связывание

Рис. 4. Расположение основных функциональных доменов 30 кДа ТБ ВТМ (по Waigmann et al., 1994).

Интересно, что делеция 110 аминокислотных остатков на N-конце 30 кДа ТБ не влияет на эффективность связывания с РНК и не приводит к потере способности увеличивать ППС, более того, это обеспечивает более эффективную диффузию 10 кДа молекул декстрана по сравнению с белком дикого типа (Waigmann et al., 1994). Эти данные не совсем согласуются с результатами, согласно которым N-концевые делеции 30 к Да белка либо исключают, либо замедляют транспорт ВТМ (Gafny et al., 1992). С-концевой участок 30 кДа белка содержит предполагаемый домен фосфорилирования белка (Atkins et al., 1991). Было показано, что клеточная протеинкиназа фосфорилирует 30 кДа белок по Ser258, Ser265 и Thr261. Активность протеинкиназы возрастает в зрелых листьях (Citovsky et al., 1993) и, по-

видимому, зависит от числа вторичных ПД, которые являются местом локализации ТБ (Ding et al., 1992). Предполагают, что фосфорилирование, изменяющее заряд молекулы, представляет механизм инактивации ТБ. Делеция 43 аминокислотных остатков с С-конца 30 кДа белка приводит к потере способности к фосфорилированию. Эти данные совпадают также с данными Watanabe et al., 1992. Интересно, что фосфорилирование Thr261, который находится в составе РНК-связывающего домена, не влияет на образование РНП комплекса (Citovsky et al., 1993).

Было показано, что 30 кДа ТБ аккумулируется в ПД растений (Tomenius et al., 1987). Позже Atkins et al., 1991 в опытах по иммуномечению золотом обнаружил, что ТБ локализуется внутри (или на поверхности) ПД, трансгенных по гену 30 кДа белка ВТМ растений. В опытах с использованием флуоресцентно меченого F-декстрана было показано, что в трансгенных растениях по гену 30 кДа белка, ППС ПД увеличивается до 5-6 нм, что соответствует молекуле декстрана с молекулярной массой 10-17 кДа (Wolf et al., 1989). Интересно, что в случае инъекции в клетки здорового растения очищенного 30 кДа белка, ППС ПД увеличивается до 6-9 нм, что соответствует молекулам декстрана с молекулярной массой 20 кДа (Citovsky et al., 1990). Интересные результаты были получены Waigmann and Zambryski, 1995. Было показано, что ППС ПД клеток трихомы (отличающихся от клеток мезофилла) не увеличивается в присутствии 30 кДа ТБ. ПД клеток трихомы способны пропускать молекулы большего размера (до 7 кДа), чем ПД клеток мезофилла. Видимо, ППС ПД клеток трихом не регулируется. В этих же опытах было обнаружено, что гибридный ТБ ВТМ, слитый с Р-глюкуронидазой (GUS), самостоятельно перемещается из клетки в клетку, в то время как при совместной микроинъекции ТБ и GUS, (3-глюкуронидаза оставалась в пределах первичной клетки. В связи с этим предполагают две модели, которые могут объяснить особенности транспорта в трихомах: 1) 30 кДа белок после взаимодействия с неким клеточным

шапероном расправляется, что позволяет ему пройти через ПД, 2) ввиду большей толщины клеточной стенки в трихомах в сравнении с мезофиллом, длина ПД увеличена, если предположить, что ТБ несет сигнал для быстрого изменения 1111С, то возможно, что ПД между клетками трихомы открываются не сразу, а по мере прохождения ТБ, за которым могут не успеть декстраны, свободно диффундирующие в цитоплазме (Waigmann and Zambryski, 1995; McLean et al, 1997).

В 1992 г. Ding et al. показали, что в трансгенных растениях ТБ преимущественно накапливается во вторичных ПД несосудистых тканей и локализуется вместе с микротрубочками и в меньшей степени с актиновыми филаментами (McLean et al., 1995; Heinlein et al., 1995). Было показано, что протопласты, инфицированные ВТМ дикого типа или модифицированным ТБ ВТМ 30 кДа-GFP, содержали ТБ или ТБ-GFP, ассоциированные с кортикальными микротрубочками. Эти данные подтверждаются экспериментами in vitro по связыванию ТБ с актином и тубулином (McLean et al., 1995).

Таким образом, приведенные выше данные свидетельствуют о том, что все стадии межклеточного транспорта вируса являются активными процессами. Функция ТБ, по-видимому, сводится к увеличению ППС ПД и приданию вирусной РНК конформации, необходимой для прохождения через ПД. ТБ имеет сигнал локализации в ПД, он сам перемещается в район ПД и перемещает вирусный РНП. Показано, что вирусная РНК в составе РНП комплекса с ТБ выводится из процесса репликации и вовлекается в межклеточный транспорт (Karpova et al., 1997). В процессе перемещения через ПД нетранслируемый РНП комплекс дестабилизируется белками ПД и/или происходит его разборка, РНП комплекс переходит в транслируемую форму и во вновь зараженной клетке опять начинается репликация вируса. Возможно, определенную роль в этом процессе играет фосфорилирование ТБ (Karpova et al., 1999).

Вирус мозаики костра

Бромовирус мозаики костра является икосаэдрическим вирусом. Геном представлен тремя +РНК (рис. 5), независимо инкапсидирующимися. РНК1 и РНК2, необходимые и достаточные для репликации ВМК в протопластах (Kroner et al., 1989, 1990), кодируют соответственно репликативные белки 1а и 2а, которые способны связываться друг с другом и с неидентифицированными хозяйскими факторами и клеточными мембранами клетки, формируя вирусный репликативный комплекс (Sun and Као, 1997; O'Reilly et al., 1997, 1998). РНКЗ кодирует ТБ За и БО 36, которые не участвуют в репликации вируса, но необходимы для межклеточного транспорта ВМК (Schmitz and Rao, 1996).

РНК1

CL

la

PHK2

Г

0.

2a

РНКЗ

лГ

0.

За

ЗЬ

if

Рис. 5. Схема организации генома ВМК, большие прямоугольники - ОРТ, эллипсы - кэп-структура на 5'-конце, тРНК-подобная структура на 3'-конце.

Скорее всего ВМК использует механизм транспорта, описанный для комовирусов (Wellink and Van Kämmen, 1989; Van Lent et al., 1990; Kasteel et al., 1997), неповирусов (Wieczoreck and Sanfacon, 1993) и каулимовирусов (Perbai et al., 1993) (см. дальше).

Было показано, что За белок подобно 30 кДа ТБ неспецифически связывается с одноцепочечными нуклеиновыми кислотами (Jansen et al., 1998; Fujita et al., 1998). Fujita et al., 1998 продемонстрировал, что За ТБ выявляется (иммунологически) в районе ПД.

Для межклеточного транспорта вируса необходимо присутствие БО (Rao and Grahtham, 1996). Предположение о необходимости инкапсидации РНК ВМК для межклеточного транспорта было подтверждено работой Kasteel et al, 1996, в которой было показано, что у клеточной поверхности протопластов, зараженных ВМК, наблюдается образование тубулярных структур, состоящих из За белка, которые содержали вирионы ВМК. В настоящее время существует две противоположные версии о роли БО в межклеточном транспорте ВМК. В опытах с использованием мутантов ВМК по БО было показано, что для системного распространения вируса в ячмене необходим БО. При заражении этими мутантами наблюдались локальные некрозы на Chenopodium hybridum, что свидетельствовало о том, что для ближнего транспорта БО не нужен (Flasinski et al, 1995). Однако эти данные противоречат результатам, полученным Rao and Grahtham, 1995, которые показали, что мутанты по БО не вызывают некротической и хлоротической реакции на листьях некоторых видов Chenopodium, включая Chenopodium hybridum. Мутанты, в которых вместо БО экспрессировался GUS, либо БО просто делетировался, не покидали первично инокулированные клетки эпидермиса листа Chenopodium quinoa. Было также показано, что мутант по За ТБ был не способен комплементировать транспорт в соседние клетки эпидермиса указанных мутантов по БО. Одно из объяснений этому заключается в том, что, возможно, имеет место конкуренция и один из вариантов подавлял другой. Второе объяснение заключается в том, что необходима инкапсидация вирусных РНК ВМК для межклеточного транспорта (Schmitz and Rao, 1996). Авторы предполагают, что, возможно, неидентифицированные сайты связывания с БО на РНКЗ находятся внутри делетированной последовательности у мутантов по БО, и тогда синтезированный БО с РНКЗ, мутантной по ТБ, оказывается не способным инкапсидировать РНКЗ с делецией по БО.

В опытах с использованием различных делеционных вариантов по БО было показано, что первые 19 аминокислотных остатков БО важны для инкапсидации и инфекционности. Было показано, что при выделении вируса из инокулированных листьев, с делецией первых 11 аминокислотных остатков в БО, количество его было на 50% ниже, чем в случае вируса дикого типа, и соответственно на 60% и 80% ниже в случае вируса с делецией 14 и 18 аминокислотных остатков. После соответствующего окрашивания препаратов было показано, что они содержат икосаэдрические вирионы, похожие на вирионы дикого типа (Rao and Grantham, 1996). Первые 25 положительно заряженных аминокислотных остатков БО важны для связывания с РНК, делеция этих аминокислотных остатков приводит к нарушению образования вирионов и потере инфекционности. Недавние эксперименты in vivo показали, что минимальный участок последовательности БО, необходимый для образования вирионов, составляет 19 аминокислотных остатков (Rao and Grantham, 1996).

Таким образом, За ТБ ВМК с одной стороны обладает способностью связываться с нуклеиновой кислотой, что указывает на возможность межклеточного транспорта вируса по механизму ВТМ, а с другой стороны -За ТБ образует тубулярные структуры для межклеточного транспорта вирионов.

Вирус огуречной мозаики

Геном кукумовируса огуречной мозаики представлен тремя одноцепочечными +РНК (Palukaitis et al., 1992). РНК1 и PHK2 кодируют компоненты РНК-зависимой РНК-полимеразы. РНКЗ кодирует 30 кДа (За) ТБиБО.

Свойства За ТБ подобны свойствам, описанным для ТБ ВНМКК и ВТМ (Fujiwara et al., 1993; Waigmann et al., 1994; Ding et al., 1995).

Возможно, что За ТБ функционирует как шаперон для транспорта РНК через плазмодесмы (Ding et al., 1995), как это предполагается для 30 кДа ТБ ВТМ.

В опытах с использованием электронной микроскопии показали, что в пределах ПД инфицированной В ОМ ткани растения, находятся вирионы. На основе этого сообщения было сделано предположение, что межклеточный транспорт ВОМ осуществляется в форме вириона через структурно модифицированные ПД. Однако в последующих исследованиях с использованием метода иммуномечения вирионы ВОМ не были обнаружены в инфицированных тканях растения (Ding et al., 1995). Эти данные подтверждаются результатами опытов Kaplan et al., 1998, в которых также было показано, что образования вирионов не требуется для межклеточного транспорта.

В опытах с использованием мутантов по БО ВОМ с делецией 19 N-концевых аминокислот или с делецией участка БО, содержащего кластер из шести аргининов в N-концевом домене, было показано, что вирус способен транспортироваться из клетки в клетку, хотя сборка вирионов нарушена (Schmitz and Rao, 1998).

Было показано, что За ТБ ВОМ обнаруживается во вторичных ПД мезофилла растения, инфицированного ВОМ (Ding et al., 1995), а также в клеточной стенке трансгенного по гену За ТБ N. tabacum (Vaquero et al., 1994). За ТБ увеличивает ППС ПД и участвует в переносе вирусной РНК, видимо, в составе РНП комплекса через ПД (Ding et al., 1995).

С. quinoa - пермиссивный хозяин для ВОМ и ВМК. Была получена химерная конструкция ВМК, содержащая ТБ ВОМ. Протопласты заражали химерной конструкцией дикого типа и конструкцией, содержащей мутантный ТБ ВОМ (Nagano et al., 1997). Данные этих экспериментов показали, что 33 аминокислотных остатка с С-конца ТБ ВОМ отвечают за специфичность транспорта вирусного генома. Известно, что для межклеточного транспорта ВОМ требуются ТБ, БО и другие вирусные

компоненты (Canto et al., 1997). Результаты экспериментов показали, что в случае использования конструкции с интактным ТБ ВОМ, ТБ не способен успешно взаимодействовать с белками ВМК, однако, удаление 33 аминокислотных остатков с С-конца ТБ ВОМ приводит к успешному межклеточному транспорту вируса (Nagano et al., 1997). На основе этих данных было высказано предположение, что связывание между ТБ и РЕПС ВОМ in vivo специфическое, и за специфичность отвечает 33 аминокислотных остатка, расположенных с С-конца (Nagano et al., 1997). Однако удаление аминокислотных остатков с С-конца ТБ ВОМ приводит к снижению эффективности транспорта вируса. Возможно это связано с конформационными изменениями в белке (Nagano et al., 1997).

Генетический анализ ВОМ и ВМК показал, что для межклеточного транспорта этих вирусов требуется и ТБ и БО (Schmits and Rao, 1996; Canto et al., 1997; Rao, 1997). Однако механизм участия БО этих двух вирусов в межклеточном транспорте различен. Для ВМК было показано, что имеет место образования тубулярных структур в инфицированных ВМК протопластах, в которых выявляются вирусо-подобные частицы (Kasteel et al., 1997). Мутационный анализ также показал, что в случае нарушения сборки вирусной частицы, межклеточный транспорт ВМК невозможен (Schmits and Rao, 1996) тогда, как ВОМ может транспортироваться в невирионной форме (Schmitz and Rao, 1998). На основании этих данных предполагается, что межклеточный транспорт ВОМ осуществляется в форме РНП комплекса (Schmitz and Rao, 1998).

Межклеточный транспорт вирусов с образованием тубулярных структур

Комо-, каулимо- и неповирусы можно выделить в особую транспортную группу, поскольку их межклеточный транспорт осуществляется через тубулярные структуры (Wellink and Van Kämmen,

1989; Van Lent et al., 1990; Kasteel et al., 1997; Wieczoreck and Sanfacon, 1993; Perbal et al., 1993).

Геном каулимовируса мозаики цветной капусты представлен двуцепочечной кольцевой ковалентно несвязанной молекулой ДНК. Репликация осуществляется с участием ревертазы через образование РНК-транскриптов.

Возможно, механизмы межклеточного транспорта РНК- и ДНК-вирусов сходны, нельзя исключить, что распространение каулимовирусной инфекции из клетки в клетку происходит с участием РНК-транскриптов.

Геном комовируса мозаики коровьего горошка представлен двумя РНК (В- и М-). В-РНК кодирует все необходимое для репликации вируса, М-РНК кодирует 58/48 кДа белки и два БО. Экспериментально было показано, что оба БО и ТБ необходимы для межклеточного транспорта вируса (Wellink et al., 1997).

Показано, что межклеточный транспорт этих вирусов осуществляется через тубулярные структуры, образованные с участием вирусных ТБ. Тубулярные структуры собираются на переферии возле мембраны. После полной сборки они "одеваются" плазмолеммой и выбрасываются наружу. В листе, видимо, происходит "врастание" трубки через плазмодесму в соседние клетки. Этот процесс включает и модификацию плазмодесм. В процессе принимают участие вирусные ТБ (Hull et al., 1989). В длину тубулярные структуры достигают 20 нм, имеют ширину стенки 3-4 нм и внутренний диаметр около 30 нм.

Мутационный анализ 48 кДа ТБ ВМКГ показал, что этот белок необходим для образования тубулярных структур. Видимо, 48 кДа белок взаимодействует с неким хозяйским фактором или факторами. Не исключено также, что 58 кДа белок участвует в образовании тубулярных структур (Kasteel et al., 1993). Было показано, что тубулярные структуры образуются не только в клетках, но и в протопластах, инокулированных ВМКГ (Van Lent

et al., 1991). В этих протопластах тубулярные структуры образуются на поверхности клеток и высовываются в культуральную среду, более того, 48 кДа белок был обнаружен в среде, в которой инкубировали протопласты с ВМКГ (Wellink et al., 1987). Тубулярные структуры пронизывали

U II ^ 11

поверхность клеток, придавая протопластам характерный волосатый фенотип (Van Lent et al., 1991). Тубулярные структуры формируются на ранней стадии развития вирусной инфекции. Сформировавшиеся тубулярные структуры содержат зрелые вирионы (Van Lent et al., 1990, 1991). Мутационный анализ 48 кДа белка показал, что N-концевой домен необходим для образования тубул, а С-концевой домен, видимо, отвечает за взаимодействие с вирусными частицами (видимо, связывается с их БО) (Lekkerkerker et al., 1996).

Для каулимовирусов были получены следующие результаты. Мутации в гене 1, кодирующем Р1 (38 кДа) белок ВМЦК препятствуют распространению вируса из клетки в клетку и развитию системной инфекции, но не влияют на способность реплицироваться в одиночных клетках (Thomas et al., 1993). Анализ тонких срезов листьев, инфицированных ВМЦК, меченных иммунозолотом, показал, что 38 кДа белок находился в ассоциации с ПД и все ПД между клетками мезофилла растения, инфицированного ВМЦК, имели увеличенный диаметр плазмодесменного канала и тубулярную структуру. 38 кДа белок был еще обнаружен в стенках паренхимальных клеток флоэмы, но здесь размер ПД не менялся (Linstead et al., 1988). Было показано, что по всей длине ПД располагались вирусные частицы (Linstead et al., 1988).

В опытах с использованием иммунофлуоресцентной микроскопии показано, что время накопления Р1 белка в инфицированных протопластах совпадает с временем накопления БО (Perbal et al., 1993).

В листьях, зараженных ВМЦК, обнаруживается несколько различающихся по молекулярной массе белков: 46 кДа, 42 к Да, 38 кДа. Эти

белки являются продуктами гена 1, отвечающего за транспортную функцию. Распределение этих трех белков варьировало в зависимости от возраста листа. Самые молодые листья содержали преимущественно 46 кДа белок, старые, системно зараженные листья - 42 кДа и 38 кДа белки. Интересно, что инокулированные листья содержали равные количества всех трех форм ТБ (Maule et al., 1989). Предполагается, что эти белки выполняют несколько различные функции (Maule et al., 1989).

В опытах с использованием иммунофлуоресцентного мечения было показано, что ТБ ВМЦК входит в состав тубулярных структур, также было показано, что белок локализуется в виде больших агрегатов в цитоплазме инфицированных клеток (Kasteel et al., 1996).

Компьютерный анализ показал, что имеется сходство в распределении консервативных и вариабельных доменов аминокислотных последовательностей между ТБ каулимо- и комовирусов, это предполагает, что ТБ этих вирусов структурно родственны (Thomas et al., 1995).

Межклеточный транспорт вирусов с тройным блоком генов

К вирусам с тройным блоком генов относятся - гордеивирусы (Gustafson and Amour, 1986; Jackson et al., 1989, 1991), фуровирусы (Bouzoubaa et al., 1986), потексвирусы (Morozov et al., 1989, 1991; Forster et al., 1988) и карлавирусы (Zavriev et al., 1991).

Впервые тройной блок генов был идентифицирован как единый элемент геномов вирусов растений различных групп при сравнительном анализе геномов Х-вируса картофеля (ХВК), гордеивируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) и фуровируса некротического пожелтения жилок свеклы (ВНПЖС) (Morozov et al., 1989). Позже тройной блок генов был обнаружен в геноме карлавирусов, а также у Х-вируса лука-шалота (Kanyuka et al., 1992) и фуровируса мозаики N. veluntina (Randies and Rohde, 1990).

Тройной блок генов составляют три частично перекрывающиеся открытые рамки трансляции (ОРТ). Причины перекрывания ОРТ не известны. Однако считают, что это перекрывание позволяет координировать трансляцию трех ОРТ (Morozov et al, 1991).

Взаимное положение генов тройного блока всегда одинаковое, в то время как в геномах вирусов, принадлежащих к различным группам, сам тройной блок может быть по-разному расположен относительно других генов. В геноме потеке- и карлавирусов тройной блок располагается между геном репликазы (ОРТ1) и геном БО. В случае фуро- и гордеивирусов - на РНК2 за геном БО. Участие белков, кодируемых тройным блоком генов в межклеточном транспорте, было предложено для ХВК (Scryabin et al, 1988), экспериментально продемонстрировано для ВШМЯ (Petty et al, 1990; Petty and Jackson, 1990 a, b), фуровируса некротического пожелтения жилок свеклы, ВМБК, ХВК (Beck et al, 1991; Santa Cruz et al, 1998; Lough et al, 1998).

Показано, что первый продукт тройного блока генов - для потеке- и карлавирусов - белок с молекулярной массой 25-26 кДа, для ВНПЖС - 42 кДа и 58 кДа - для ВШМЯ. Сравнительный анализ показал, что имеет место высокая гомология белков первого гена тройного блока; в их составе была найдена общая консервативная последовательность, гомологичная хеликазному домену репликативного белка (Scryabin et al, 1988; Gorbalenya and Koonin, 1993) (см. далее). Продуктами, кодируемыми двумя другими ОРТ тройного блока, являются два относительно коротких гидрофобных белка.

Было показано, что вирусы с ТБ ВТМ-класса способны комплементировать дефектные вирусы, содержащие тройной блок, в смешанной инфекции (Malyshenko et al, 1989). Было продемонстрировано, что функция межклеточного транспорта мутанта ВТМ Lsl может быть комплементирована ХВК при смешанной инфекции (Taliansky et al, 1982),

следовательно геном ХВК кодирует белок/белки, которые являются функциональным аналогом 30 кДа ТБ ВТМ.

X вирус картофеля и родственные потексвирусы

Группа потексвирусов (название группы является производным от названия типового представителя - X вируса картофеля - potato virus X) объединяет вирусы растений, вирионы которых обладают спиральной симметрией. Вирионы потексвирусов представлены гибкими нитями длиной от 470 до 580 нм (Гиббс и Харрисон, 1978). Геном типового представителя потексвирусов ХВК представлен оц +РНК молекулой (рис. 6).

12К

165К 25 К JX К БО

Рис. 6. Схема организация генома ХВК, прямоугольники - ОРТ, эллипс - кэп-структура на 5'-конце, черный прямоугольник - полиА тракт на З'-конце.

На 5'-конце имеется кэп-структура и нетранслируемая последовательность а(3-лидер. Геномная РНК кодирует 5 белков: 5'-проксимальный ген кодирует 165 кДа белок, который является компонентом РНК-полимеразы. За терминирующим кодоном идет межцистронный район длиной 30 нуклеотидов и далее следует тройной блок генов, кодирующий белки с молекулярной массой 25 кДа, 12 кДа и 8 кДа. ОРТ2 перекрывает первые 20 аминокислотных остатков ОРТЗ, а ОРТЗ перекрывает на 68 аминокислотных остатков ОРТ4. Далее идет межцистронный участок и 3'-проксимальное положение занимает ген БО. Перед полиаденилированным трактом расположена нетранслируемая область длиной 75 нуклеотидов. Репликативный белок транслируется прямо с геномной РНК (Miroshnichenko et al., 1988), в то время как для синтеза БО, 25 кДа и 12 кДа, 8 кДа белков используется 3 субгеномные РНК, что было показано in vitro (Morozov et al., 1991) и in vivo (Vercoñ et al., 1998). Экспрессия БО, видимо, может идти по

по механизму внутренней инициации трансляции, показанная Hefferon et al., 1997.

Известно, что для межклеточного транспорта потексвирусов необходим БО, мутации, ведущие к нарушению сборки вирионов ХВК, предотвращают накопление вируса в инокулированном листе (Beck et al., 1991; Chapman et al., 1992).

До сих пор полностью непонятно какую роль в межклеточном транспорте вируса играет каждый белок тройного блока. Особенно мало известно о функциях 12 кДа и 8 кДа белков. Сравнительный анализ обнаружил, что имеется сходство в аминокислотной последовательности между 12 кДа белком ХВК и соответствующими белками гордеи-, фуро- и карлавирусов. На N- и С-концах этих белков выявлены два блока гидрофобных аминокислотных остатков, между которыми располагается гидрофильный район (Morozov et al., 1987). Для 8 кДа белка ХВК не было показано гомологии с соответствующими белками гордеи- и фуровирусов (Morozov et al., 1989). В N-концевой части этого белка был найден гидрофобный район, за которым следует высоко консервативная среди потексвирусов последовательность, ограниченная с двух сторон остатками цистеина. Интересно, что предсказанная для N-концевой части 8 кДа белка вторичная структура имеет некоторые общие черты с N-концевыми участками клеточных секретируемых белков, имеющих отщепляемый или неотщепляемый сигнальный пептид. В последнем случае этот белок должен быть связан с мембранными структурами. Анализ последовательностей 8 кДа и 12 кДа белков ХВК указал на их вероятную ассоциацию с клеточными мембранами. Это было экспериментально подтверждено в опытах по экспрессии 12 кДа и 8 кДа белков in vitro - продукты находились в мембранной фракции (Morozov et al., 1990). Место локализации 8 кДа белка ХВК на тонких срезах растений табака, инфицированных ХВК, и трансгенных по 8 кДа белку растений картофеля, продукта ОРТЗ, было

определено с использованием меченных золотом антител. Частицы золота наблюдали в пределах клеточных стенок ткани листа, инфицированного растения на 8 день после инокуляции. В трансгенных растениях золотые частицы наблюдали в районе плазматической мембраны и внутри клеточных стенок, кроме того, "золотые кластеры" обнаруживались в большой вакуоле, однако, частицы золота не были обнаружены в районе плазмодесм (Hefferon et al., 1997). Предполагается, что 8 кДа и 25 кДа белки вовлечены в межклеточный транспорт на ранних стадиях развития инфекции (Hefferon et al., 1997).

Было показано, что мутация в гене для 8 кДа белка, в результате которой инициирующий кодон AUG был делетирован, приводит к тому, что межклеточный транспорт блокируется, однако, вирус, в котором больше, чем половина 8 кДа белка была делетирована, был способен к межклеточному транспорту в растении (Boevink et al., 1998).

Значительно больше данных получено в отношении 25 кДа белка, кодируемого первым геном тройного блока. Наличие хеликазного мотива и участие 25 кДа белка в межклеточном транспорте позволило предположить, что по аналогии с 30 кДа ТБ ВТМ, 25 кДа участвует в транспорте вирусной РНК через ПД в составе вирусспецифического РНП комплекса. Для 26 кДа ТБГр1 белка потексвируса мозаики лисохвоста (BMJIx) показано, что он способен связываться с РНК (Rouleau et al., 1994). В 1996 г. Kalinina et al., продемонстрировали, что 25 кДа ТБ ХВК способен связываться с РНК. Недавно было показано, что 25 кДа ТБ участвует в модификации ППС ПД клеток трихомы N. clevelandii (Angelí et al., 1996). Были поставлены опыты с использованием генно-инженерной конструкции XBK.GUS по изучению роли 25 кДа белка. Было обнаружено, что 25 кДа белок увеличивает ППС ПД. Модифицированные ПД были способны пропускать молекулы F-декстрана размером 4,4 кДа и 10 кДа, но не 20 кДа. Мутанты ХВК с делецией в 25 кДа белке накапливались в инокулированных протопластах на

том же уровне, что и ХВК дикого типа. Однако этот мутант не был способен к межклеточному транспорту из первоначально инфицированных клеток и не был способен модифицировать ПД для транспорта молекул F-декстрана размером 10 кДа, хотя молекулы F-декстрана размером 4,4 кДа были способны транспортироваться из клеток, инфицированных мутантным вирусом (Angelí et al., 1996). Данные этих экспериментов показывают, что "полная" модификация ПД требует наличия функционального 25 кДа белка. Увеличение ППС ПД может быть результатом изменения диаметра плазмодесменного канала или результатом изменения порядка расположения белков, формирующих эти микроканалы (Angelí et al., 1996).

В работе Morozov et al., 1997 была показана функциональная гомология 25 кДа ТБ ХВК и 30 кДа ТБ ВТМ. Было показано, что 30 кДа был способен комплементировать транспортную функцию мутантного 25 кДа белка при ко-бомбардменте листьев табака плазмидами, одна из которых содержала под контролем каулимовирусного 35Б-промотора полную копию мутантного по гену 25 кДа ТБ ХВК, а другая - ген 30 кДа ТБ ВТМ. Интересно, что 30 кДа ТБ комплементирует функцию 25 к Да белка ХВК, но обратного процесса не происходит - 25 кДа ТБ, экспрессирующийся в трансгенных растениях, либо в составе ХВК дикого типа, не комплементировал дефект по транспорту мутантного по 30 к Да ТБ ВТМ (Ares et al., 1998).

В трансгенных растениях по ТБГр1 потексвируса мозаики белого клевера было показано, что имеет место увеличение ППС ПД. В опытах по микроинъекции FITC-декстранов обнаружили, что 10-кДа и 20-кДа декстраны, но не 40-кДа декстраны могли транспортироваться из клетки в клетку в трангенных растениях по ТБГр1 ВМБК. Таким образом, ТБГр1 ВМБК, экспрессирующийся в растениях, обладает способностью взаимодействовать с плазмодесмами и индуцировать увеличение ППС для транспорта молекул размером не более 40 кДа. Интересно, что для

модификации ППС ПД не требовались ТГБр2 и ТБГрЗ и БО (Lough et al., 1998). Показано, что имеет место ограниченый межклеточный транспорт ТБГр1 и 10-кДа F-декстрана при одновременной инъекции ТБГр1 и 10-кДа декстрана в клетки мезофилла контрольного растения. Такой же эффект наблюдался при совместной инъекции в растения, экспрессирующие ТБГр2 или ТБГрЗ. Однако при инъекции ТБГр1 и 10 кДа F-декстрана в растения, трансгенные по генам обоих белков - по ТБГр2 и ТБГрЗ, наблюдался эффективный межклеточный транспорт. Таким образом, для эффективного межклеточного транспорта ТБГр1 вируса мозаики белого клевера требуется присутствие ТБГр2 и ТБГрЗ (Lough et al., 1998).

Вопрос о форме, в которой потексвирусы транспортируются из клетки в клетку остается неясным. Результаты исследований, проведенных Santa Cruz и коллегами (Santa Cruz et al., 1998) свидетельствуют о том, что транспортной формой ХВК являются вирионы. Показано, что для увеличения ППС ПД растений, инфицированных ХВК, необходим один или более ТБ тройного блока и не требуется БО. Было показано, что в ПД инфицированных клеток имеется фибриллярный материал (Oparka et al., 1996). Использование очищенной антисыворотки к БО ХВК, специфично реагирующей с цельными капсидами ХВК, но не с отдельными субъединицами капсида, позволило показать, что фибриллярный материал, находящийся в ПД инфицированных листьев, является вирионами ХВК (Santa Cruz et al., 1998). Было обнаружено, что ПД инфицированных ХВК клеток листьев, имели необычный фенотип - в них отсутствовали десмотрубочки и наблюдались искривления. Предполагают, что такой эффект не является результатом цитологических изменений в растении на поздних стадиях развития вирусной инфекции (Santa Cruz et al., 1998). Вероятно, что БО требуется для инкапсидации вирусной РНК перед началом межклеточного транспорта и именно такие интактные вирионы транспортируются через ПД (Santa Cruz et al., 1998). Отсутствие

индуцированных вирусом тубулярных структур в инфицированных ХВК растениях, предполагает, что механизм межклеточного транспорта отличается от механизма, описанного для непо- и комовирусов.

Показано, что в инфицированных ХВК, BMJIx растениях БО накапливается в районе ПД (Rouleau et al, 1995; Oparka et al, 1996). Было обнаружено, что при инъекции 10-кДа F-декстрана в растения, трансгенные по БО потексвируса мозаики белого клевера (ВМБК), транспорт из инфицированных клеток мезофилла не наблюдается, т.е. БО не способен увеличивать 1JUL1C ПД. Кроме того, показано, что БО не влияет на способность ТБГр1 транспортироваться через ПД в присутствии ТБГр2 и ТБГрЗ (Lough et al, 1998).

Полагают, что транспорт ХВК в виде вирионов может отвечать более серьезным требованиям к размеру свободного диаметра ПД по сравнению с транспортом в виде вРНП комплекса (Santa Cruz et al, 1998). Для межклеточного транспорта ХВК вирионов необходимо, чтобы диаметр ПД был не менее 13 нм, в то время как для транспорта комплекса РНК-ТБ ВТМ диаметр ПД должен быть 2 нм (Citovsky et al, 1992). Вероятно, в поре плазмодесмы инфицированного ХВК растения происходит удаление внутренних мембран и белков для последующего транспорта вирионов (Santa Cruz et al, 1998).

Lough et al, 1998 предложили гипотезу межклеточного транспорта для ВМБК, по которой транспорт через ПД осуществляется в виде комплекса ТБГр1-одноцепочечная РНК-БО.

Важную роль в обеспечении процесса транспорта играют ТБГр2 и ТБГрЗ белки. Были проведены эксперименты по изучению функций ТБГр2 и ТБГрЗ белков в транспорте РНК. ТБГр2 и ТБГрЗ различных вирусов, чей геном содержит тройной блок транспортных генов, рассматриваются как мембрано-ассоциированные белки (Morozov et al, 1990, Niesbach-Klosgen et al, 1990, Donald et al, 1993). Были проведены эксперименты по изучению

механизма, по которому функционирует ТБГр2: были получены трансгенные растения, экспрессирующие мутантный ТБГр2 и ТБГрЗ дикого типа. Мутантный ТБГр2 белок (была проведена замена аминокислотных остатков в пределах консервативного гидрофильного района) задерживал распространение ВМБК дикого типа в пределах инокулированного листа. Таким образом, консервативный гидрофильный район ТБГр2 белка вовлечен в транспорт комплекса ТБГр1-одноцепочечная РНК-БО (Lough et al., 1998).

Показано, что ТБГр1 белок в присутствии одноцепочечной РНК не способен увеличивать ППС. Предполагается, что БО взаимодействует с ТБГр1 и/или с РНК и восстанавливает способность комплекса увеличивать ППС. Вероятно, что в процессе инфекции ВМБК транспортируется из клетки в клетку в ткани растения в виде комплекса ТБГр1- одноцепочечная РНК-БО. Такой комплекс может транспортироваться из клетки в клетку не реплицируясь. Представляется маловероятным, что БО в процессе транспорта требуется для инкапсидации. Это гипотеза подтверждается результатами опытов с использованием РНК-ТОТО фага MS2 (см. выше) (Lough et al., 1998), а также тем, что БО обнаруживается в пределах плазмодесм инфицированных клеток (Oparka et al., 1996). Хотя попытки прямой реконструкции этой системы путем микроинъекции одноцепочечной РНК-ТОТО в клетки, экспрессирующие и БО и ТБГр1 не удались, высказано предположение о том, что межклеточный транспорт ВМБК осуществляется двумя путями: один включает образование комплекса ТБГр1-одноцепочечная РНК-БО, а второй механизм осуществляется с участием вирусных частиц (Lough et al., 1998).

Вероятно, что во внутриклеточном транспорте РНК ВМБК участвуют компоненты растительного цитоскелета, как это предполагается и для 30 кДа белка ВТМ. Комплекс ТБГр1- одноцепочечная РНК-БО образуется в инфицированных клетках и доставляется к отверстию плазмодесмы с участием транспортных систем цитоскелета. Таким образом, предполагают,

f4f

что ТБГр2 и ТБГрЗ выполняют две функции: 1) участвуют в доставке РНП комплекса к предполагаемому заякориваещему белку или 2) функционируют как часть мембрано ассоциированного связывающего комплекса, доставляя ТБГр1-одноцепочечная РНК-БО к заякориваещему белку ПД при участии цитоскелета (Lough et al., 1998).

Вирус штриховатой мозаики ячменя

Геном гордеивируса штриховатой мозаики ячменя представлен тремя молекулами +РНК. Геном ВШМЯ кодирует 8 полипептидов. РНКа кодирует компонент репликазы (Gustafson et al., 1989). В РНКР закодировано 5 белков. В системе трансляции in vitro из экстракта зародышей пшеницы РНКр служит как мРНК только для синтеза БО, а субгеномная PHKpi является матрицей для трансляции только 58 кДа белка. Однако субгеномная РНКР2 обеспечивает трансляцию трех белков с размерами 14, 17 и 23 кДа. 14 и 23 кДа белки узнавались антителами к pd полипептиду, эти результаты демонстрируют, что 23 кДа белок обозначенный как Pd' синтезируется в результате проскальзывания рибосомой амбер стоп-кодона ОРТ для pd белка (Zhou et al., 1996) Экспрессия четырех полипептидов с тройного блока генов является уникальной особенностью ВШМЯ, хотя pd' белок, видимо, не требуется для транспорта вируса (Donald et al., 1997). РНКу ВШМЯ кодирует предполагаемый полимеразный компонент РНК-репликазы и регуляторный белок.

Было показано, что снижение уровня синтеза 58 кДа ТБ в инфицированных клетках приводит к ослабленному фенотипу вирусной инфекции (Jackson et al., 1989; Petty and Jackson, 1990b).

Показано, что pb белок обладает РНК-связывающей активностью (Donald et al., 1997). Для pb белка показано, что основная часть белка обнаруживается во фракции растворимых белков, но 30-40% белка обнаруживается во фракции клеточных стенок, небольшое количество белка

41

обнаруживается во фракции Р1 и РЗО (Donald et al., 1993). pb белок обнаруживается на ранних стадиях инфекции 4-7 день после инокуляции, затем его количество достигает максимума, а затем после 10 дня после инокуляции его количество постепенно уменьшается. Было показано, что существует 2 формы Pb белка - pb и pb' (Petty and Jackson, 1990b). pd и Pc белки являются сильно гидрофобными и характеризуются как мембранносвязанные (Morozov et al., 1989). Иммуноблот анализ показал, что Pd белок обнаруживается в основном мембранной фракции, что согласуется с его гидрофобной природой и фракции клеточных стенок (Donald et al., 1993). Время накопления pd белка подобно динамике накопления pb белка (Donald et al., 1993).

Предполагается, что такая локализация pd белка обусловлена тем, что белок может функционировать как мост между клеточной стенкой и плазматической мембраной. Возможно, что pb белок является функциональным гомологом 30 кДа белка ВТМ (Deom et al., 1992, Wolf et al., 1991), это предположение было сделано на основе субклеточной локализации белка, а также в результате того, что в цитоплазме на ранней стадии инфекции обнаружили ассоциированный pb белок с неинкапсидированной РНК (Brakke et al., 1988), а также известно, что in vitro Pb белок образует комплекс с синтезированной РНК (Donald et al., 1997). Вероятно, что маленькие белки, кодируемые двумя другими белками тройного блока генов ВШМЯ, требуются для стабилизации или взаимодействия с белками ПД (Donald et al., 1993).

На основании полученных данных по биохимическим свойствам 58 кДа ТБ, Donald et al., 1997, предложили две гипотетические модели функционирования этого ТБ. Согласно первой модели, АТФазная активность 58 кДа белка сопряжена с расплавлением РНК-дуплексов (отсюдя и сродство к двуцепочечной РНК). Отсутствие хеликазной активности in vitro авторы объясняют возможным участием дополнительных детерминант, в комплексе

с которыми 58 кДа ТБ мог бы проявлять хеликазную активность. Согласно второй модели, функционирование 58 кДа белка не связано с хеликазной активностью, а подобно 30 кДа ТБ ВТМ. Сродство к двуцепочечной РНК, по мнению авторов, могло бы в таком случае увеличивать специфичность узнавания собственной геномной РНК путем связывания со специфическими структурированными участками РНК (Donald et al., 1997).

Мутационный анализ показал, что 17 кДа ((Зс) белок необходим для распространения ВШМЯ в ячмене, в N. benthamiana и в Chenopodium amaranticolor (Petty and Jackson, 1990b). Для 17 кДа белка не была показана гомология с аналогичными белками потеке- и фуровирусов, однако, он подобно 15 кДа белку фуровируса некротического пожелтения жилок свеклы и 8 кДа ХВК, обладает особенностями мембрано-связывающих белков (Morozov et al., 1989). 14 кДа ((3d) белок ВШМЯ, также необходимый для транспорта вируса (Petty and Jackson, 1990b), имеет явную гомологию с аналогичными белками потеке- и фуровирусов (Morozov et al., 1987).

Показано, что для межклеточного транспорта ВШМЯ в ячмене не требуется БО (Petty and Jackson, 1990b). Интересно, что мутанты ВШМЯ с делецией БО успешно заражали растения ячменя и симптомы на растении были более выраженные, чем в случае ВШМЯ дикого типа (Petty and Jackson, 1990b). Предполагают, что в период развития симптомов (острая фаза) ВШМЯ распространяется по растению в неинкапсидированной форме. Затем острая фаза сменяется хронической, характеризующейся смягчением симптомов, во время которой вирус, возможно, перемещается в форме вирионов (Petty and Jackson, 1990b).

Результаты опытов по комплементации показали, что рекомбинантные вирусы, несущие транспортный ген ВТМ, способны к межклеточному транспорту в инокулированных листьях N. benthamiana, общих хозяевах родительских вирусов (Solovyev et al., 1996).

Вирус некротического пожелтения жилок свеклы

Геном фуровируса некротичского пожелтения жилок свеклы кодирует 5 РНК. 2 самые большие РНК кодируют белки, необходимые для образования локальных некрозов при механической инокуляции листьев, 3 более маленькие РНК кодируют белки, необходимые для развития вирусной инфекции. РНК2 кодирует белки ТБГ: 42 кДа, 13 кДа и 15 кДа, необходимые для межклеточного транспорта (Gilmer et al., 1992). БО не требуется для межклеточного транспорта.

Показано, что 42 кДа ТБ обладает способностью связываться с РНК (Bleykasten et al., 1996). Эксперименты по изучению НТФазной активности 42 кДа ТБ ВНПЖС не проводились.

42 кДа и 13 кДа белки обнаруживаются с момента появления симптомов заражения. Для 42 кДа белка, кодируемого ОРТЗ ВНПЖС показано, что основная часть белка представлена в мембранной фракции РЗО. Локализация 13 кДа белка, кодируемого ОРТ4, такая же, как и в случае 42 кДа белка - большая часть белка представлена во фракции РЗО, в меньших количествах белок выявляется во фракциях ядер и клеточных стенок, но во фракции растворимых белков 42 кДа ТБ не обнаруживается (Niesbach-Klosgen et al., 1990). Предполагается, что 42 кДа белок заякоривается мембранами для взаимодействия с 13 кДа белком, однако, функция 42 кДа белка (или комплекса 42 кДа/13 кДа) неизвестна (Niesbach-Klosgen et al., 1990. ТБГр2 белок содержит высоко консервативный центральный мотив, окруженный гидрофобными аминокислотами Недавно было обнаружено, что мутации в ТБГр2 и ТБГрЗ белках снижают уровень накопления ТБГр1 белка (Lauber et al., 1998).

Результаты недавних экспериментов показали, что 30 кДа ТБ ВТМ может комплементировать все три белка ТБГ ВНПЖС. Однако

3

комплементация не наблюдалась в случае использования ТБ вирусов, чей межклеточный транспорт требует образования тубулярных структур (Lauber

et al, 1998). Интересно, что в случае ВМБК комплементация транспорта в трансгенных растениях проходит in trans, а в случае ВНПЖС - только если ТБГр2 и ТБГрЗ белки синтезируются с одной матрицы в одном и том же растении (Lauber et al, 1998).

Предполагаемый механизм межклеточного транспорта ВНПЖС состоит в том, что гидрофобные ТБГр2 и ТБГрЗ белки выполняют роль заякоривающих белков, а ТБГр1 белок в комплексе с вирусной РНК транспортируется через модифицированные ПД. Предполагается, что ТБГр1 белок вместе с другим или обоими ТБГ увеличивают ППС ПД (Lauber et al, 1998).

Поскольку объектом данной работы являются ТБГр1 белки, содержащие консервативные мотивы, принадлежащие к НТФазам/хеликазам суперсемейства I, в следующей главе рассмотрены структура и возможные механизмы функционирования хеликаз.

Вирусные РНК хеликазы

Расплетание двунитевых полинуклеотидов или шпилечных структур однонитевых молекул - необходимый этап основных генетических процессов: репликации, репарации, рекомбинации; кроме того, этот процесс обязателен на некоторых стадиях генной экспрессии. Существует несколько типов белков, способных катализировать эту реакцию. Среди них самыми важными являются полинуклеотид-зависимые нуклеозид трифосфат фосфатазы, чаще называемые хеликазами.

Функция хеликаз состоит в разрушении водородных связей, соединяющих две цепи нуклеиновых кислот в дуплексе. Источником энергии для этого процесса является НТФ. Механизм сопряжения гидролиза НТФ с расплетанием полинуклеотидных цепей пока не вполне ясен.

Три суперсемейства предполагаемых РНК хеликаз

Компьютерный анализ позволил выявить общий мотив в аминокислотной последовательности белков, для которых продемонстрирована или предполагается способность связывать НТФ, гидролизовать НТФ и расплетать дуплекс, образованный нуклеиновыми кислотами. Основываясь на сравнении аминокислотных последовательностей, выделяют 3 суперсемейства (SF) хеликаз. Хеликазы вирусов есть во всех SF. SF1 объединяет Синдбис-подобные (альфавирусо-подобные) (шР2-подобные) белки; SF2 включает полипептиды, подобные тем, которые кодируются поти-флави-пестивирусами (NS3-подобные) и хеликазу вируса осповакцины; SF3 включает пикорна-подобные белки неподобные) (Gorbalenya and Koonin, 1993; Kadare et al., 1997).

Наиболее изученные вирусные хеликазы, сгруппированные в суперсемейства по

характеру консервативных мотивов их первичной структуры.

Белок SF2 Белок SF3 Белок

(+)РНК Альфа 1а Бимо Р270 Комо Р58

вирусы Бромо 1а Поти Cl Непо Р72

растений Капилло р241 Секву Р336

Карло р26 Вайка ORF-1

Клостера р295

Кукумо 1а

Фуро р237

Гордеи р130

Идаео р190

Потеке р180

Тобамо р126

Тобра р134

Тимо р206

(+)РНК Альфа NsP2 Флави NS3 Афто 2С

вирусы Альтери Р159 Гепатита NS3 Калици р257

животных Корона ORF-lb С NS3 Кардио 2С

Гепатита ORF-1 Пести Ентеро 2С

Е Р220 Гепато 2С

Раби Рино 2С

Двухцепо HAV ОРТ В

чечные

РНК

вирусы

ДНК Гемини AL1

вирусы

растений

ДНК Герпес BBLF4, Герпес Gp51, Папова Т антиген,

вирусы Gp55, Покс UL9 Парво El

животных UL5 NPH-I, II NS1

Консервативные мотивы

В SF1 и SF2 выделяют 7 консервативных сегментов, обозначаемых как I (или А сайт), 1а и II (или В сайт), III, IV, V, VI. В SF3 выделяют только 3 консервативных сегмента, включающем А и В сайты и третий консенсус С (Gorbalenya and Koonin, 1993).

Впервые НТФ-связывающий мотив был охарактерезован Walker et al, 1982. Этот мотив состоит из А и В сайтов. А сайт состоит из гидрофобных остатков в консервативной последовательности GxxxxGKS/T, где х - любая аминокислота. В сайт содержит DE или DD в окружении гидрофобных аминокислот (Gorbalenya and Koonin, 1993). Данные кристаллографии

показали, что А сайт прямо участвует в связывании с р и у фосфатами НТФ, считается, что остаток лизина связывается с фосфатом, в то время как В сайт образует Mg-НТФ комплекс.

Мотивы I, II, V и VI являются высоко консервативными, в то время как мотивы la, III и IV - менее консервативны (Kadare and Haenni, 1997). На рис. 7 представлена схема расположения консервативных мотивов в хеликазах SF1, SF2 и SF.

SF1 •

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Самуилова, Ольга Витальевна

выводы

1. Получены бактериальные штаммы-суперпродуценты транспортных белков, кодируемых первым геном тройного блока генов (ТБГр! белков), - 25 кДа белка ХВК и 63 кДа белка ПЛВМ и серии их мутантных вариантов. Препараты рекомбинантных белков получены в очищенном виде.

2. ТГБр1 белки 25 кДа белок ХВК и 63 кДа белок ПЛВМ, содержащие семь консервативных мотивов НТФаз/хеликаз суперсемейства I, являются магний-зависимыми АТФазами. Их активность стимулируется в 1,5-1,9 раз в присутствии одноцепочечных полирибонуклеотидов. Оба белка обладают также ГТФазной и УТФазной активностями.

3. 25 кДа белок ХВК и 63 кДа белок ПЛВМ являются РНК-связывающими белками. 63 кДа белок эффективно взаимодействует с РНК. РНК-связывающие свойства 25 кДа белка проявляются только в растворах с низкой ионной силой. В составе 25 кДа белка ХВК картирован участок, ответственный за связывание с РНК, который включает собственно Ы-концевую часть белка и мотивы 1,1а и II.

4. Делеционные мутанты ТБГр1 белков, не содержащие И-концевых мотивов I, 1а и II, не обладают НТФазной и РНК-связывающей активностями. Делеционные мутанты ТБГр1 белков, не содержащие С-концевых мотивов V и VI, способны более эффективно гидролизовать АТФ/ГТФ/УТФ, чем соответствующие белки дикого типа, и сохраняют РНК-связываюшую активнолсть.

5. Методом иммуноблот-анализа изучена кинетика синтеза 25 кДа белка ХВК в инфицированных растениях и его субклеточная локализация.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Самуилова, Ольга Витальевна, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гиббс А., Харрисон Б. 1978. Основы вирусологии растений. Москва, «Мир».

2. Agranovsky А.А., Folimonov A.S., Folimonova S.Yu., Morozov S.Yu., Schiemann J., Lesemann D., Atabekov .JG. 1998. Beet yellows closterovirus HSP70-like protein mediates the cell-to-cell movement of a potexvirus transport-deficient mutant and a hordeivirus-based chimeric virus. J. Gen. Virol., 79, 889-895.

3. Agranovsky A.A., Folimonova S.Y., Folimonov A.S., Denisenko O.N, Zinovkin R.A..1997. The beet yellows closterovirus p65 homologue of HSP70 chaperones has ATPase activity associated with its conserved N-terminal domain but does not interact with unfolded protein chains. J. Gen. Virol.;78, 535-542.

4. Angell, S. M., Davies, C. &Baulcombe, D. C. 1996. Cell-to-cell movement of potato virus X is associated with a change in the size-exclusion limit of plasmodesmata in trichome cells of Nicotiana clevelandii. Virology 216, 197201.

5. Ares, X., Calamante, G., Cabrai, S., Lodge, J., Hemenway, P., Beachy, R. N. & Mentaberry, A. 1998. Transgenic plants expressing potato virus X ORF2

J

protein (p24) are resistant to tobacco mosaic virus and Ob tobamoviruses. Journal of Virology 72, 731-8.

6. Atabekov, J. G. & Dorokhov Yu, L. 1984. Plant virus-specific transport function and resistance of plants to viruses. Advances in Virus Research 29, 313-64.

7. Atabekov, J. G. & Taliansky, M. E. 1990. Expression of a plant virus-coded transport function by different viral genomes. Advances in Virus Research 38, 201-248.

8. Atkins, D., Hull, R., Wells, B., Roberts, K., Moore, P. & Beachy, R. N. 1991. The tobacco mosaic virus 30K movement protein in transgenic tobacco plants is localized to plasmodesmata. Journal of General Virology 72, 209-211.

9. Balachandran S., Xiang Y., Schobert C., Thompson G.A., Lucas W. 1997. Phloem sap proteins from Cucurbita maxima and ricinus commints have the capacity to traffic cell to cell throat plasmodesmata. PNAS, 9, 14150-14155.

10.Baron-Epel, O., Hernandez, D., Jiang, L. W., Meiners, S. & Schindler, M. 1988. Dynamic continuity of cytoplasmic and membrane compartments between plant cells. Journal of Cell Biology 106, 715-21.

11.Beachy R.N., Zaitlin M., Bruening G., Israel H.W. 1976. A genetic map for the cowpea strain of TMV. Virology, 73, 498.

12.Beck D.L., Guilford P.J., Voot D.M., Andersen M.T. and Forster R.L.S. Triple gene block proteins of white clover mosaic potexvirus are required for transport. Virology, 1991, 183, 695-702.

13.Bema, A., Gafny, R., Wolf, S., Lucas, W. J., Holt, C. A. & Beachy, R. N. 1991. The TMV movement protein: role of the C-terminal 73 amino acids in subcellular localization and function. Virology 182, 682-689.

14.Bleykasten C., Gilmer D., Guilley H., Richards K. E. and Jonard G. 1996 Beet necrotic yellow vein virus 42 kDa triple gene block protein binds nucleic acid in vitro. Journal of General Virology, 77, 889-897.

15.Boevink P., Oparka K., Santa Cruz S., Martin B., Betteridge A., Hawes C. Stacks on tracks: the plant Golgi apparatus traffics on an actin/ER network. Plant J., 1998,441-447.

16.Bouzobaa S., Ziegler V., Beck D., Guilley M., Richards K., Jonard G. 1986. Nucleotide sequnce of beet necrotic yellow vein virus RNA-2. J. of Gen. Virol., 67, 1689-1700.

17.Brakke M.K., Ball E.M., Langenberg W.G. 1988. A non-capsid protein assotiated with unencapsidated virus RNA in barley infected with barley stripe mosaic virus. J. Gen. Virol., 69,481-491.

18.Bruening, G., Beachy, R. N., Scalla, R. & Zaitlin, M. 1976. In vitro and in vivo translation of the ribonucleic acids of a cowpea strain of tobacco mosaic virus. Virology 71,498-517.

19.Burd C.G., Dreyfuss G. 1994. Conserved structures and diversity of function of RNA-binding proteins. Science, 265, 625-631.

20.Canto T, Prior DA, Hellwald KH, Oparka KJ, Palukaitis P 1997 Characterization of cucumber mosaic virus. IV. Movement protein and coat protein are both essential for cell-to-cell movement of cucumber mosaic virus. Virology, 237, 237-248

21.Carrington J.C., Jensen P.E., Schaad M.C. 1998. Genetic evidence for an essential role for potyvirus CI protein in cell-to-cell movement. The Plant J., 14, 393-400.

22.Carrington, J. C., Kasschau, K. D., Mahajan, S. K., Schaad, M. C. 1996. Cell-to-cell and long-distance transport of viruses in plants. Plant Cell 8, 1669-1681.

23.Chang B.-Y., Lin N.-Sh., Liou D.-Y., Chen J.-P., Liou J.-J., Hsu Y.-H. 1997. Subcellular localization of the 28 kDa of the triple-gene-block of bamboo mosaic potexvirus. Journal of General Virology, 78, 1175-1179.

24.Chapman, S., Hills, G., Watts, J. & Baulcombe, D. 1992. Mutational analysis of the coat protein gene of potato virus X: effects on virion morphology and viral pathogenicity. Virology 191, 223-230.

25.Citovsky V. 1993. Probing plasmodesmal transport with plant viruses. Plant Physiol., 102, 1071-1076.

26.Citovsky, V. & Zambryski, P. 1991. How do plant virus nucleic acids move through intercellular connections?. Bioessays, 13, 373-379.

27.Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G. & Zambryski, P. 1990. The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single- strand nucleic acid binding protein. Cell 60, 637-647.

28.Citovsky, V., Wong, M. L., Shaw, A. L., Prasad, B. V. & Zambryski, P. 1992. Visualization and characterization of tobacco mosaic virus movement protein binding to single-stranded nucleic acids. Plant Cell 4, 397-411.

29.Davies, C., Hills, G. & Baulcombe, D. C. 1993. Sub-cellular localization of the 25-kDa protein encoded in the triple gene block of potato virus X. Virology 197, 166-175.

30.Dawson, W. O. & Lehto, K. M. 1990. Regulation of tobamovirus gene expression. Advances in Virus Research 38, 307-342.

31.Deom C.M., Lapidot M., Beachy R.N. 1992. Plant virus movement protein. Cell, 69, 221-224.

32.Deom, C.M., Oliver, M.J., and Beachy, R.N. 1987. The 30-kilodalton gene product of tobacco mosaic virus potentiates virus mowement, Science, 237, 389-394.

33.Ding B., Haudenshield J.C, Hull RJ, Wolf S., Beachy R.N., Lucas W.J. 1992. Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants. Plant Cell, 4, 915928.

34.Ding, B., Haudenshield, J. S., Willmitzer, L. & Lucas, W. J. 1993. Correlation between arrested secondary plasmodesmal development and onset of accelerated leaf senescence in yeast acid invertase transgenic tobacco plants. Plant Journal 4, 179-189.

35.Ding, B., Li, Q., Nguyen, L., Palukaitis, P. & Lucas, W. J. 1995. Cucumber mosaic virus 3a protein potentiates cell-to-cell trafficking of CMV RNA in tobacco plants. Virology 207, 345-353.

36.Donald, R. G., Lawrence, D. M. & Jackson, A. O. 1997. The barley stripe mosaic virus 58-kilodalton beta(b) protein is a multifunctional RNA binding protein. J Virol 71, 1538-46.

37.Donald, R. G., Zhou, H. & Jackson, A. O. 1993. Serological analysis of barley stripe mosaic virus-encoded proteins in infected barley. Virology 195, 659-668.

38.Dorokhov Iu, L., Aleksandrova, N. M., Miroshnichenko, N. A., Rupasov, V. V. & Atabekov, I. G. 1984. [Virus-specific informosomes in tobacco cells infected with tobacco mosaic virus]. Mol Biol (Mosk) 18, 83-91.

39.Dorokhov Iu, L., Aleksandrova, N. M., Miroshnichenko, N. A., Rupasov, V. V. & Atabekov, I. G. 1984. [Virus-specific informosomes in tobacco cells infected with tobacco mosaic virus]. Molekuliarnaia Biologiia 18, 83-91.

40.Dorokhov Iu, L., Miroshnichenko, N. A., Aleksandrova, N. M. & Atabekov, I. G. 1984. [Analysis of polypeptides of virus-specific informosomes induced by tobacco mosaic virus and potato virus X]. Mol Biol (Mosk) 18, 1001-10.

41.Dorokhov Iu, L., Miroshnichenko, N. A., Aleksandrova, N. M. & Atabekov, I. G. 1984. [Analysis of polypeptides of virus-specific informosomes induced by tobacco mosaic virus and potato virus X]. Molekuliarnaia Biologiia 18, 100110.

42.Dorokhov Y.L., Alexandrova N.M., Miroshnichenko N.A., Atabekov J.G. 1983. Isolation and analysis of virus-specific ribonucleoprotein of tobacco mosaic virus-infected tobacco. Virology, 127, 237-252.

43.Fernandez, A., S. Lain J. A. Garcia. 1995. RNA helicase activity of PPV CI protein expressed in E. coli. Mapping of an RNA binding domain. Nucleic Acids Res. 23:1327-1332.

44.Flasinski, S., Dzianott, A., Pratt, S. & Bujarski, J. J. 1995. Mutational analysis of the coat protein gene of brome mosaic virus: effects on replication and movement in barley and in Chenopodium hybridum. Molecular Plant-Microbe Interactions 8, 23-31.

45.Forster R.L.S., Bevan M.W., Habrison S.A., Gardner K.C. 1988. The complete nucleotide sequence of potexvirus white clover mosaic virus. Nucl. Acids Res., 16,291-303.

46.Fujita, M., Mise, K., Kajiura, Y., Dohi, K. & Furusawa, I. 1998. Nucleic acid-binding properties and subcellular localization of the 3 a protein of brome mosaic bromovirus. J Gen Virol 79, 1273-80.

47.Fujiwara, T., Giesman- Cookmeyer, D., Bing, B., Lommel, S. A., Lucas, W. J. 1993. Cell-to-cell traffiking of macromolecules through plasmodesmata potentiated by red clover necrotic mosaic virus movement protein. The Plant Cell 5:1783-94.

48.Gafny, R, Lapidot, M, Berna, A, Holt, C.A, Deom, C.M, and Beachy, R.N. 1992. Effects of terminal deletion mutations on function of the movement protein of tobacco mosaic virus. Virology, 187, 499-507.

49.Ghoshroy S, Lartey R,Sheng.J, and Citovsky V. 1997 Transport of proteins and nucleic asids through plasmodesmata Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1997. 48:27-50

50.Giesman-Cookmeyer, D. & Lommel, S. A. 1993. Alanine scanning mutagenesis of a plant virus movement protein identifies three functional domains. Plant Cell 5, 973-982.

51.Gilmer D, Bouzobaa S, Hehn A, Guilley H, Richards K, Jonard G. 1992. Efficient cell-to-cell movement of beet necrotic yellow vein virus reqwuires 3'-proximal genes located on RNA2. Virol, 189, 40-47.

52.Gorbalenya, A. E, E. V. Koonin. 1993. Helicases: amino acid sequence comparisons and stracture-function relationships. Curr. Opin. Stract. Biol. 3:419-429.

53.Gorbalenya, A. E, Koonin E.V., Donchenko A.P, Blinov V.M. 1989. Two related superfamylies of putative helicases involved in replication, recombination, repair and expression of DNA and RNA genomes. Nucleic Acids Res, 17,4713-4730.

54.Graves-Woodward K.L, Gottliebs S, Challberg M.D, Weller S.K. 1997. Biochemicical analyses of mutations in the HSV-1 helicase-primase that alter ATP hydrolysis, DNA unwinding. JBChem, 14, 4626-4630.

55.Gross C.H. and Shuman S. 1998. The nucleoside triphosphatase and helicase activities of Vaccinia virus NPH-II are essential for virus replication. J. of Virology, 72, 4729-4736.

56.Gross, C. H, S. Shuman. 1996. Vaccinia virus RNA helicase: nucleic acid specifity in duplex unwinding. J. Virol. 70: 2615-2619.

57.Gross, C. H, Wengler G. 1996. Identification of an RNA-stimulated NTPase in the predicted helicase sequence of the Rubella virus nonstructural polyprotein. Virology, 217, 367-372.

58.Gustafson G., Armou R.S.L. 1986. The complete sequnce of RNA B from the type strain of barley stripe mosaic virus. Nucl. Acids. Res., 14, 3895-3909.

59.Gustafson, G., Armour, S. L., Gamboa, G. C., Burgett, S. G. & Shepherd, J. W. 1989. Nucleotide sequence of barley stripe mosaic virus RNA alpha: RNA alpha encodes a single polypeptide with homology to corresponding proteins from other viruses. Virology 170, 370-377.

60.Gwack Y, Kim D.W., Han J.H., Choe J. 1996. Characterization of RNA binding activity and RNA helicase activity of the Hepatits C virus NS3 protein. Biochemical and Biophysycal Res. Communication, 225, 654-659.

61.Hall M.C., Ozsoy A.Z., Matson S.W. 1998. Site-directed mutation in motif VI of Escherichia coli DNA helicase II result in multiple biochemical defects: evidence for the involvement of motif VI in the coupling of ATPase and DNA binding activities via conformational changes. J. Mol. Biol., 277, 257-271.

62.Hefferon KL, Doyle S, AbouHaidar MG 1997. Immunological detection of the 8K protein of potato virus X (PVX) in cell walls of PVX-infected tobacco and transgenic potato. Arch Virol 142(2):425-433

63.Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S. & Beachy, R. N. 1995. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton [see comments]. Science 270, 1983-1985.

64.Heinlein, M., Wood, M. R., Thiel, T. & Beachy, R. N. 1998. Targeting and modification of prokaryotic cell-cell junctions by tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein. Plant J 14, 345-51.

65.Hull R. 1989. The movement of viruses in plants. Annu. Rev. Phytopathol., 27, 213-240.

66Jackson A.O., Petty I.T.D., Jones R.W., Edwards M.C., French R. 1991. Analysis of barley stripe mosaic virus pathogenicity. Semin. Virol., 2, 107-119.

67.Jackson, A. O.; Hunter, B.G.; Gustafson, G.D. 1989. Hordeivirus relationships and genome organization. Annual Reviews of Phytopathology 27, 95-121.

68 Jansen, K. A., Wolfs, C. J., Lohuis, H., Goldbach, R. W. & Verduin, B. J. 1998. Characterization of the brome mosaic virus movement protein expressed in E. coli. Virology 242, 387-94.

69.Juuti J., Bamford D.M., Tuma R., Thomas G.J. 1998. Structure and NTPase activitiy of the RNA-trans locating protein (P4) of bacteriophage phi6. JMB, 5, 347-359.

70.Kadare G. and Haenni A.-L. 1997. Virus-encoded RNA helicases. J. of Virol., 71,2583-2590.

71.Kadare G., David C., Haenni A.-L. 1996. ATPase, GTPase and RNA binding activities associated with the 206-kilodalton protein of turnip yellow mosaic virus. J. Virol, 70, 8169-8174.

72.Kalinina, N. O, Fedorkin, O. N, Samuilova, O. V, Maiss, E., Korpela, T, Morozov, S. & Atabekov, J. G. 1996. Expression and biochemical analyses of the recombinant potato virus X 25K movement protein. FEBS Lett 397, 75-8.

73.Kamen RI and Jager A. 1978. Polyoma virus high molecular weight nuclear RNA codes for capsid protein VP2 in vitro. Virology, 89, 461-74

74.Kanyuka K.V, Vishichenko V.K, Levay K.E, Kondrikov DYu, Ryabov EV, Zavriev S. 1992. Nucleotide sequence of shallot virus X RNA reveals a 5'-proximal cistron closely related to those of potexviruses and a unique arrangement of the 3'-proximal cistrons. J Gen Virol, 73, 2553-2560

75.Kaplan IB, Palukaitis P. 1998. Characterization of cucumber mosaic virus. VI. Generation of deletions in defective RNA 3 s during passage in transgenic tobacco expressing the 3a gene. Virology, 251(2), 279-87

76.Karpova O.V, Rodionova N.P, Ivanov K.I, Kozlovsky S.V., Dorohkov Yu. L, Atabekov J.G. 1999 Phosphorilation Oof tobacco mosic virus movement protein abolished its translation repressing ability. In press.

77.Karpova, O. V, Ivanov, K. I, Rodionova, N. P, Dorokhov Yu, L. & Atabekov, J. G. 1997. Nontranslatability and dissimilar behavior in plants and protoplasts of viral RNA and movement protein complexes formed in vitro. Virology 230, 11-21.

78.Kasteel, D. T., Perbai, M. C., Boyer, J. C., Wellink, J., Goldbach, R. W., Maule, A. J. & van Lent, J. W. 1996. The movement proteins of cowpea mosaic virus and cauliflower mosaic virus induce tubular structures in plant and insect cells. J Gen Virol 77,2857-64.

79.Kasteel, D. T., van der Wei, N. N., Jansen, K. A., Goldbach, R. W. & van Lent, J. W. 1997. Tubule-forming capacity of the movement proteins of alfalfa mosaic virus and brome mosaic virus. J Gen Virol 78,2089-93.

80.Kasteel, D., Wellink, J., Verver, J., van Lent, J., Goldbach, R. & van Kämmen, A. 1993. The involvement of cowpea mosaic virus M RNA-encoded proteins in tubule formation. Journal of General Virology 74,1721-1724.

81.Kim D.W., Kim J., Gwack J., Han J.H., Choe J. 1997. Mutational analysis of the Hepatits C virus RNA helicase. J. Virology, 71, 9400-9409.

82.Koonin E.V., Mushegian A.R., Ryabov E.V., Dolja V.V. 1991. Diverse groups of plant RNA and DNA viruses share related movement proteins that may posess shaperone-like activity. Journal of General Virology, 72, 2985-2903.

83.Koonin E.V., Rudd K.E. 1996. Two domains of superfamily I helicases may exist as separate proteins. Protein Science, 5, 178-180.

84.Korolev S., Hsieh J., Gauss G.S., Lohman T.M., Waksman G. 1997. Major domain swiveling revealed by crystal structure of complexes of E.coli Rep helicase bound to single-stranded DNA and ADP. Cell, 90, 635-647.

85.Kotlizky G., Shurtz S., Yahalom A, Malik Z, Traub O., Epel B.L. 1992. An improved procedure for the isolation of plasmodesmata embedded in clean maize cell walls. Plant J., 2, 623-630.

86.Kragler F, Monzer J, Shash K, Xoconostle-Cazares B, Lucas WJ. 1998. Cell-to-cell transport of proteins: requirement for unfolding and characterization of binding to a putative plasmodesmal receptor. Plant J., 15(3), 367-81

87.Kroner, P. A., Young, B. M. & Ahlquist, P. 1990. Analysis of the role of brome mosaic virus la protein domains in RNA replication, using linker insertion mutagenesis. Journal of Virology 64, 6110-6120.

88.Kroner, P., Richards, D., Traynor, P. & Ahlquist, P. 1989. Defined mutations in a small region of the brome mosaic virus 2 gene cause diverse temperature-sensitive RNA replication phenotypes. Journal of Virology 63, 5302-5309.

89.Laemmli, U.R. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.

90.Lauber, E., Bleykasten-Grosshans, C., Erhardt, M., Bouzoubaa, S., Jonard, G., Richards, K.E., and Guilley, H. 1998. Cell-to-cell movement of beet necrotic yellow vein virus: I. Heterologous complementation experiments provide evidence for specific interactions among the triple gene block proteins. Mol. Plant-Microbe Interact. 11, 618-625.

91.Lekkerkerker A., Wellink J., Yaun P., van Lent J., Goldbach R., and van Kammen A.B. 1996 Distinct functional domains in the cowpea mosaic virus movement protein. Journal of virology, 70, 8, 5658-5661.

92.Li, Q. & Palukaitis, P. 1996. Comparison of the nucleic acid- and NTP-binding properties of the movement protein of cucumber mosaic cucumovirus and tobacco mosaic tobamovirus. Virology 216, 71-9.

93.Linstead P.J., Hills G.L., Plaskitt K.A., Wilson I.G., Harker C.L., Maule A.J. 1988. The subcellular location of the gene I product of cauliflower mosaic virus is consistent with a function associated with virus spread. J. of Gen. Virology, 69,1809-1818.

94.Lohman, T. M. 1992. E.coli DNA helicase: mechanism of DNA unwinding. Mol. Microbiol., 6, 5-14.

95.Lough T.J., Shash K., Xoconostle-Cazares B., Hofsra K., Beck D.L., Balmori E., Forster R.S., Lucas W.J. 1998. Molecular dissection of the mechanism by which potexvirus triple gene block proteins mediate cell-to-cell transport of infectious RNA. MPMI, 11, 801-814.

96.Lucas W.J. and Gilbertson R.L. 1994. Plasmodesmata in relation to viral movement within leaf tissues, Annu. Rev. Phytopathol., 32:387-411.

97.Lucas, W. J. 1995. Plasmodesmata: intercellular channels for macromolecular transport in plants. Current Opinion in Cell Biology 7, 673-680.

98.Malyshenko, S.I., Kondakova, O.A., Taliansky, M.E., and Atabekov, J.G. 1989 Plant virus transport function: Complementation by helper viruses in nonspecific J. Gen.Virol. 70 2751-2757.

99.Maule A.J., Harker C.L., Wilson I.G. 1989. The pattern of accumulation of cauliflower mosaic virus-specific products in infected turnips. Virology, 169, 436-446.

100. McLean B.G., Zupan J., and Zambryski P.C. 1995 Tobacco virus movement protein associates with the cytoskeleton in tobacco cells. The Plant Cell, 7, 2101-2114.

101. McLean BG, Hempel FD, Zambryski PC 1997 Plant intercellular communication via plasmodesmata.Plant Cell, 9, 1043-1054

102. Meshi, T., Watanabe, Y., Saito, T., Sugimoto, A., Maeda, T., and Okada, Y.. 1987. Function of the 30K protein of tobacco mosaic virus: involvment in cell-to-cell movement and dispensability for replication, EMBO J., 6, 2557-2563.

103. Miroshnichenko, N. A., Karpova, O. V., Morozov, S. Y., Rodionova, N. P. & Atabekov, J. G. 1988. Translation arrest of potato virus X RNA in Krebs-2 cell-free system: RNase H cleavage promoted by complementary oligodeoxynucleotides. FEBS Letters 234, 65-68.

104. Morozov, S. Y., Dolja, V. V. & Atabekov, J. G. 1989. Probable reassortment of genomic elements among elongated RNA- containing plant viruses. Journal of Molecular Evolution 29, 52-62.

105. Morozov, S. Y., Miroshnichenko, N. A., Solovyev, A. G., Fedorkin, O. N., Zelenina, D. A., Lukasheva, L. I., Karasev, A. V., Dolja, V. V. & Atabekov, J. G. 1991. Expression strategy of the potato virus X triple gene block. Journal of General Virology 72, 2039-2042.

106. Morozov, S. Y., Miroshnichenko, N. A., Zelenina, D. A., Fedorkin, O. N., Solovijev, A. G., Lukasheva, L. I. & Atabekov, J. C. 1990. Expression of RNA transcripts of potato virus X full-length and subgenomic cDNAs. Biochimie 72, 677-684.

107. Morozov, S, Fedorkin, O. N, Juttner, G, Schiemann, J, Baulcombe, D. C. & Atabekov, J. G. 1997. Complementation of a potato virus X mutant mediated by bombardment of plant tissues with cloned viral movement protein genes. J Gen Virol 78,2077-83.

108. Morozov, S, Lukasheva, L. I, Chernov, B. K, Skriabin, K. G. & Atabekov, I. G. 1987. [Primary structure of the potato virus X genome: the region preceding the capsid protein cistron]. Molekuliarnaia Genetika, Mikrobiologia, i Virusologia, 32-8.

109. Morozov, S.Yu, Fedorkin, O.N, Jüttner, G, Schiemann, J, Baulcombe, D, and Atabekov, J.G. 1997. Complementation of a potato virus X mutant mediated by bombardment of plant tissues with cloned viral movement protein genes. J. Gen. Virol. 78,2077-2083.

110. Mushegian, A. R. & Koonin, E. V. 1993. Cell-to-cell movement of plant viruses. Insights from amino acid sequence comparisons of movement proteins and from analogies with cellular transport systems. [Review]. Archives of Virology 133,239-257.

111. Nagano H, Okuno T, Mise K, Furusawa I, 1997. Deletion of the C-terminal 33 amino acids of cucumber mosaic virus movement protein enables a chimeric brome mosaic virus to move from cell to cell. J Virol, 71(3), 2270-6

112. Niesbach-Klosgen U, Guilley H, Jonard G. And Richards K. Immunodetection in vivo of beet necrotic yellow vein virus-encoded proteins. "Virology", 1990, 178, 52-61.

113. O'Reilly, O. R, Paul, J. D. & Kao, C. C. 1997. Analysis of the interaction of viral RNA replication proteins by using the yeast two-hybrid assay. J Virol 71, 7526-32.

114. O'Reilly, O. R, Wang, Z, French, R. & Kao, C. C. 1998. Interactions between the structural domains of the RNA replication proteins of plant-infecting RNA viruses [In Process Citation]. J Virol 72, 7160-9.

115. Ohno T., Takamatsu N., Meshi T., Okado Y., Nishigushi M., Kiho Y. 1983. Single amino acid substitution in 30 K protein of TMV defective in virus transport function. Virol., 131, 255-258.

116. Oparka, K. J., Roberts A.G., Roberts I.M., Prior, D.A.M., and Santa Cruz, S 1996. Viral coat protein is targeted to, but does not gate, plasmodesmata during cell-to-cell movement of potato virus X. Plant J. 10, 805-813.

117. Osman, T. A., Hayes, R. J. & Buck, K. W. 1992. Cooperative binding of the red clover necrotic mosaic virus movement protein to single-stranded nucleic acids. Journal of General Virology 73, 223-227.

118. Overall, R. L., and Blackman, L. M. 1996. A model of the macromolecular structure of plsmodesmata. Trends Plant Sci. 1, 307-311.

119. Palukaitis P, Roossinck MJ, Dietzgen RG, Francki RI. 1992. Cucumber mosaic virus. Adv Virus Res, 41, 281-348.

120. Palukaitis P., Roossinck M.J., Dieyzgen R.G., Franci R.I.B. 1992. Cucumber mosaic virus. Adv. Virus Res., 41, 281-348.

121. Pause A., Methot N., Sonenberg N. 1993. The HRIGRXXR region of DEAD box RNA helicase eucariot translation initiation factor 4A is required for RNA binding and ATP Hydrolysis. Mol. Cell. Biol., 13, 6789-6798.

122. Pause A., Sonenberg N. 1992. Mutational analysis of DEAD box RNA helicase: the mammalian translation initiation factor eIF-4A. EMBO J., 11, 2643-2654.

123. Pelham H.R.B. 1978. Leaky UAG terminaton codon in tobacco mosaic virus RNA. Nature, 272, 469.

124. Perbal M.C., Thomas C.L., Maule A.J. 1993. Cauliflower mosaic virus gene-1 product (pi) forms tubular structures wich extend fromm the surface of infected protoplasts. Virology, 195, 281-285.

125. Petty, I. T. & Jackson, A. O. 1990a. Two forms of the major barley stripe mosaic virus nonstructural protein are synthesized in vivo from alternative initiation codons. Virology 177, 829-832.

126. Petty, I. T. & Jackson, A. O. 1990b. Mutational analysis of barley stripe mosaic virus RNA beta. Virology 179, 712-718.

127. Petty, I. T, Donald, R. G. & Jackson, A. O. 1994. Multiple genetic determinants of barley stripe mosaic virus influence lesion phenotype on Chenopodium amaranticolor. Virology 198, 218-226.

128. Petty, I. T, French, R, Jones, R. W. & Jackson, A. O. 1990. Identification of barley stripe mosaic virus genes involved in viral RNA replication and systemic movement. EMBO Journal 9, 3453-3457.

129. Randies J.W. and Rohde W. 1990. Nicotiana veluntina mosaicvirus: evidence for a biparte genome comprising 3 kb and 8 kb RNAs. J. Gen. Virol, 71, 1019-1027.

130. Rao AL. 1997. Molecular studies on bromovirus capsid protein. III. Analysis of cell-to-cell movement competence of coat protein defective variants of cowpea chlorotic mottle virus. Virology, 232, 385-95

131. Rao, A. L. & Grantham, G. L. 1995. Biological significance of the seven amino-terminal basic residues of brome mosaic virus coat protein. Virology 211,42-52.

132. Rao, A. L. & Grantham, G. L. 1996. Molecular studies on bromovirus capsid protein. II. Functional analysis of the amino-terminal arginine-rich motif and its role in encapsidation, movement, and pathology. Virology 226, 294-305.

133. Reichel, C, and Beachy, R.N. 1998. Tobacco mosaic virus infection induces severe morphological changes of the endoplasmic reticulum. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 11169-11174.

134. Rikonen M, Peranen J, Kaariainen L. 1994. ATPase and GTPase activities associated with Semliki Forest virus nonstructural protein nsP2. J. Virol, 68, 5804-5810.

135. Robards A.W. 1975. Plasmodesmata. Annu. Rev. Plant Physiol, 26, 13-29.

136. Roberts, I.M, Wang, D, Findlay, K, and Maule, A.J. 1998. Ultrastructural and temporal observations of the potyvirus cylindrical inclusions (CIs) show that the CI acts transiently in aiding virus movement. Virology 245, 173-181.

137. Rodriguez P., Carrasco. 1993. Poliovirus protein 2C has ATPase and GTPase activities. J. Biol. Chem., 268, 8105-8110.

138. Rodriguez S, Vilas MP, Alonso M, Perez SI. 1995 Study of a viral-dual infection in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) by seroneutralization, western blot and polymerase chain reaction assays. Microbiología, 11(4):461-70

139. Rojas, M.R., Noueiry, A.O., Lucas, W.J., and Gilbertson, R.L. 1998. Bean dwarf mosaic geminivirus movement proteins recognize DNA in a form- and size-specific manner. Cell 95, 105-113.

140. Rouleau M., Smith R.J., Bancroft J.B., Maackie G.A. 1995. Subcellular immunolocalization of the coat protein of two potexviruses in infected Chenopodium quinoa. Virol., 214, 314-318.

141. Rouleau, M., Smith, R. J., Bancroft, J. B. & Mackie, G. A. 1994. Purification, properties, and subcellular localization of foxtail mosaic potexvims 26-kDa protein. Virology 204, 254-265.

142. Rozen F., Edery I., Meerovitch K., Dever T.E., Merric W.C., Sonenberg N. 1990. Bidirectional RNA helicase activity of eucaryotic translation initiation factors 4A and 4F. Mol.Cell. Biol., 10, 1134-1144.

143. Ryabov EV, Robinson DJ, Taliansky ME. 1999. A plant virus-encoded protein facilitates long-distance movement of heterologous viral RNA. Proc Natl Acad Sci., 96, 1212-7

144. Saito T., Imai Y., Meshi T., Okada Y. 1988. Interviral homologies of the 30 K proteins of tobamoviruses. Virol., 167, 653-656.

145. Sambrook., J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. 1989 «Molecular cloning: A Laboratory Manual», 2th ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

146. Santa Cruz, S., Roberts, A. G., Prior, D. A., Chapman, S. & Oparka, K. J. 1998. Cell-to-cell and phloem-mediated transport of potato virus X. The role of virions. Plant Cell 10, 495-510.

147. Savenkov E.I., Solovyev A.G., Morozov S.Yu. 1998. Genome sequnces of poa semilatent and lychnis ringspot hordeiviruses. Arch. Virol., 43, 1-15.

148. Schmitz, I. & Rao, A. L. 1996. Molecular studies on bromovirus capsid protein. I. Characterization of cell-to-cell movement-defective RNA3 variants of brome mosaic virus. Virology 226, 281-93.

149. Schoumacher, F., Erny, C., Bema, A., Godefroy-Colburn, T. & Stussi-Garaud, C. 1992. Nucleic acid-binding properties of the alfalfa mosaic virus movement protein produced in yeast. Virology 188, 896-899.

150. Seron, K. & Haenni, A. L. 1996. Vascular movement of plant viruses. Mol Plant Microbe Interact 9, 435-42.

151. Solovyev, A. G., Savenkov, E. I., Agranovsky, A. A. & Morozov, S. Y. 1996. Comparisons of the genomic cis-elements and coding regions in RNA beta components of the hordeiviruses barley stripe mosaic virus, lychnis ringspot virus, and poa semilatent virus. Virology 219, 9-18.

152. Subramanya H. S., L. E. Bird, J. A. Brannigan. 1996. Crystal structure of a DExx box DNA helicase. Nature. 384:379-383.

153. Sun, J. H. & Kao, C. C. 1997. RNA synthesis by the brome mosaic virus RNA-dependent RNA polymerase: transition from initiation to elongation. Virology 233,63-73.

154. Scryabin, K. G., Kraev, A. S., Morozov, S. Y., Rozanov, M. N., Chernov, B. K., Lukasheva, L. I. & Atabekov, J. G. 1988. The nucleotide sequence of potato virus X RNA. Nucleic Acids Research 16, 10929-10930.

155. Takamatsu, N., Ohno, T., Meshi, T., and Okada, Y., Expression of bacterial chloramphenicol acetyltransferase gene in tobacco plants mediated by TMV RNA, EMBO J., 1987, 6, 307-311.

156. Talyansky M.E., Malyshenko S.I., Pshennikova E.S., Atabekov J.G. 1982. Plant virus-specific transport function. Virol., 122, 327-331.

157. Terry B.R., Robards A.W. 1987. Hydrodynamic radius alone governs the mobility of molecules through plasmodesmata. Planta, 171, 145-157.

158. Thomas C.L., Maule A.J. 1995. Identification of structural domains within the cauliflower mosaic virus movement protein by scanning deletion mutagenesis and epitope tagging.The Plant Cell, 7, 561-572.

159. Thomas C.L., Perbal C., Maule A.J. 1993. A mutation of cauliflower mosaic virus gene I iterferes with virus movement but not virus replication. Virology, 192,415-421.

160. Tomenius, K.; Clapham, D.; Meshi, T. 1987. Localization by immunogold cytochemistry of the virus-coded 30K protein in plasmodesmata of leaves infected with tobacco mosaic virus. Virology 160, 363-371.

161. van Lent, J. W., Groenen, J. T., Klinge-Roode, E. C., Rohrmann, G. F., Zuidema, D. & Vlak, J. M. 1990. Localization of the 34 kDa polyhedron envelope protein in Spodoptera frugiperda cells infected with Autographa californica nuclear polyhedrosis virus. Arch Virol 111, 103-14.

162. van Lent, J., Storms, M., van der Meer, F., Wellink, J. & Goldbach, R. 1991. Tubular structures involved in movement of cowpea mosaic virus are also formed in infected cowpea protoplasts. J Gen Virol 72, 2615-23.

163. Vaquero, C., Turner, A. P., Demangeat, G., Sanz, A., Serra, M. T., Roberts, K. & Garcia-Luque, I. 1994. The 3a protein from cucumber mosaic virus increases the gating capacity of plasmodesmata in transgenic tobacco plants. Journal of General Virology, 75, 3193-3197.

164. Vercoft J., Angell M., Baulcombe D.D. 1998. In vivo translation of the triple gene block of potato virus X requires two subgenomic mRNAs. J. Virol., 72, 8316-8320.

165. Waigmann, E. & Zambryski, P. 1994. Plasmodesmata. Gateways for rapid information transfer. Curr Biol 4, 713-6.

166. Waigmann, E. & Zambryski, P. 1995. Tobacco mosaic virus movement protein-mediated protein transport between trichome cells. Plant Cell 7, 206979.

167. Walker J.E., Saraste M., Runswick M.J., Gay N.J. 1982. Distanly related sequences in the □□□andD □□-subunits of ATP synthetase, myosin, kinases

and other ATP-requiring enzymes and a common nucleotide binding fold. EMBOJ., 1,945-951.

168. Watanabe Y., Ogawa T., Okada Y. 1992. In vivo phosphorylation of the 30-kDa protein of tobacco mosaic. FEBS Letters, 313, 181-184.

169. Wellink and van Kammen 1989 Cell-to-cell transport of cowpea mosaic virus requires both the 58kDa and 48kDa proteins and the capsid proteins. J.Gen.Virol. ,71,219-223.

170. Wellink et al., EMBO Workshop, 1997

171. Wellink J., Jaegle M., Prinz H., van Kamen A., Goldbach R. 1987. Expression of the middle component RNA of cowpea mosaic virus in vivo. J. of Gen. Virology, 68, 2577-2585.

172. Wellink, J., Perbal, M. C., Thomas, C. L. & Maule, A. J. 1993. Cauliflower mosaic virus gene I product (PI) forms tubular structures which extend from the surface of infected protoplasts. Virology 195,281-285.

173. Weng Y., Czaplinski K., Pettz S.W. 1996. Identification and characterization of mutantions in the Upfl gene that affect nonsense supression and the formation of the Upfl protein complex but not mRNA turnover. Mol. Cell Biol., 16, 5491-5506.

174. Wieczorek, A. & Sanfacon, H. 1993. Characterization and subcellular localization of tomato ringspot nepovirus putative movement protein. Virology 194, 734-742.

175. Wolf, S., Deom, C. M., Beachy, R. & Lucas, W. J. 1991. Plasmodesmatal function is probed using transgenic tobacco plants that express a virus movement protein. Plant Cell, 3, 593-604.

176. Wolf, S.; Deom, C.M.; Beachy, R.N.; Lucas, W.L. 1989. Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit. Science 246, 337-339.

177. Xoconostle-Cazares, Xiang Y., Ruiz-Medrano R., Wang H.L., Monzer J., Yoo B.C., McFarland K.C., Franceschi V.R., Lucas W.J 1999. Plant paralog to

viral movement protein that potentiates transport of mRNA into phloem. Science, 283, 94-98.

178. Yahalom A, Warmbrodt R.D, Laird D.W, Traub O, Revel J.-P. 1991. Maiz mesocotyl plasmodesmata proteins cross-react with connexin gap junction protein antibodies. Plant cell, 3,407-417.

179. Zambyski P. 1995. Plasmodesmata: Plant chanells for molecules on the move. Science, 270,1943-1944.

180. Zavriev S.K, Kanyuka K.V, Levay K.E. 1991. The genome organization of potato virus M RNA. J. Gen. Virol, 72, 9-14

181. Zhou, H. & Jackson, A. O. 1996. Expression of the barley stripe mosaic virus RNA beta "triple gene block". Virology 216, 367-379.

182. Zimmern D, Hunter T. 1983. Point mutation of the 30 K open reading frame of TMV implicated in temperature sesnsitive assembly and local lesion spreading of muitant№2519. EMBO J, 2, 1893-1900.