Структурно-функциональный анализ участков внутреннего связывания рибосомы РНК вируса гепатита С и мРНК белка теплового шока HSP70 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Сизова, Дарья Викторовна

• Сизова, Дарья Викторовна
• кандидат химических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат химических наук Сизова, Дарья Викторовна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Участки внутреннего связывания рибосомы вирусных и клеточных РНК

1.1 Общая схема инициации белкового синтеза в клетках эукариот

1.2 Внутренняя инициация трансляции

1.3 Метод поиска IRES-элементов внутри 5'-НТР мРНК

1.4 Вирусные IRES-элементы

1.4.1 IRES-элементы РНК пикорнавирусов

1.4.1.1 Структура IRES-элементов у различных пикорнавирусных РНК

1.4.1.2 Белки, взаимодействующие с IRES-элементами РНК пикорнавирусов

1.4.2 IRES-элементы РНК вируса гепатита С и пестивирусов

1.4.2.1 Структура IRES-элементов РНК вируса гепатита С и пестивирусов

1.4.2.2 Белки, взаимодействующие с IRES-элементами РНК вируса гепатита С и пестивирусов

1.4.3 IRES-элементы некоторых других вирусных РНК

1.4.3.1 IRES-элемент РНК F-MLV

1.4.3.2 IRES-элемент РНК Mo-MuLV

1.4.3.3 IRES-элемент РНК HaMSV

1.4.3.4 IRES-элемент РНКЗ IBV

1.4.3.5 IRES-элемент РНК crTMV

1.5 Клеточные IRES-элементы

1.5.1 IRES-элемент мРНК BIP

1.5.2 IRES-элемент мРНК FGF-2

1.5.3 RES-элемент мРНК протоонкогена с-тус

1.5.4 IRES-элемент мРНК PDGF/c-sw

1.5.5 IRES-элемент мРНК IGFII

1.5.6 IRES-элемент мРНК VEGF

1.5.7 IRES-элементы мРНК TFID и НАР4 дрожжей________49

1.5.8 IRES-элемент мРНК морфогенетического фактора Antennapedia у дрозофилы

1.5.9 IRES-элемент мРНК eIF-4G

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Структурно-функциональный анализ участков внутреннего связывания рибосомы РНК вируса гепатита С и мРНК белка теплового шока HSP70

2.1 Структурно-функциональный анализ IRES-элемента

HCV

2.1.1 Локализация участка связывания eIF-З на IRES-элементе HCV

2.1.2 Исследование влияния структурных составляющих IRES-элемента HCV на связывание с eIF-3

2.1.3 Изучение возможности одновременного связывания eIF-З и 40S рибосомной субчастицы с IRES-элементом HCV

2.2 Структурно-функциональный анализ IRES-элемента белка теплового шока HSP70

2.2.1 Исследование способности мРНК HSP 70 к внутренней инициации трансляции

2.2.2 Изучение влияния мутантного eIF-4A (R362Q) на функционирование IRES-элемента HSP 70

2.2.3 Сравнение эффективности функционирования IRES-элементов HSP70 и BIP

2.2.4 Определение границ IRES-элемента HSP 70

2.2.5 Исследование 5'-НТР и фрагмента кодирующей последовательности мРНК Р-глобина методом бицистронных конструкций

2.2.6 Структурный анализ IRES-элемента HSP 70

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1 Реактивы и материалы

3.2 Плазмидные конструкции, использованные в работе для исследования IRES-элемента HCV

3.3 Плазмидные конструкции, использованные в работе для исследования IRES-элемента HSP 70

3.4 Получение РНК-транскриптов

3.5 Выделение 40S рибосомных субчастиц

3.6 Выделение эукариотического фактора инициации трансляции eIF3

3.7 Анализ рибонуклеопротеидных комплексов

3.7.1 Образование рибонуклеопротеидных комплексов

3.7.2 Мечение 5'-концов олигонуклеотидов

3.7.3 Анализ рибонуклеопротедных комплексов методом "toe-printing"

3.7.4 Обработка рибонуклеопротеидных комплексов РНКазами

3.7.5 Анализ фрагментов РНК, полученных после обработки рибонуклеопротеидных комплексов РНКазами

3.8 Химическое и ферментативное зондирование вторичной структуры РНК

3.9 Трансляция РНК-транскриптов in vitro

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

мРНК

тРНК

Met-tRNAi

рРНК

кДНК

5'-НТР

IRES-элемент elF

HCV HSP 70 BIP

RRL

ATP

GTP

UTP

СТР

GDP

NTP

dNTP

ПААГ

ЭДТА

IPTG

DMS

CMCT

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

матричная РНК

транспортная РНК

инициаторная тРНК

рибосомная РНК

ДНК, синтезированная

in vitro путем обратной транскрипции

5'-нетранслируемый район мРНК

участок внутреннего связывания рибосомы

эукариотический фактор инициации

трансляции

вирус гепатита С

белок теплового шока

белок, связывающий тяжелую цепь

иммуноглобулина

лизат ретикулоцитов кролика

аденозин-5'-трифосфат

гуанозин-5'-трифосфат

уридин-5'-трифосфат

цитидин-5'-трифосфат

гуанозин-5'-дифосфат

рибонуклеозид -5'-трифосфат(ы)

дезоксирибонуклеозид -5'-трифосфат(ы)

полиакриламидный гель

этилендиаминтетраацетат

изопропилтио-(3-Б-галактопиранозид

диметилсульфат

1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид-метил-/>-толуолсульфонат

SDS додецилсульфат натрия

PMSF фенилметилсульфонилфторид

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональный анализ участков внутреннего связывания рибосомы РНК вируса гепатита С и мРНК белка теплового шока HSP70»

ВВЕДЕНИЕ

Модель инициации синтеза белка у эукариот, предложенная М.Козак [1], предполагает, что первоначально 40S рибосомная субчастица при участии факторов инициации узнает кэп-структуру на 5'-конце мРНК (кэп-структура представляет собой 7-метилгуанозин, соединенный с 5'-концевым нуклеозидом 5'-5' трифосфатной связью) и связывается с мРНК на самом 5'-конце молекулы (см. рис.1). Далее 40S субчастица начинает скользить вдоль мРНК (при содействии инициаторных факторов, расплетающих вторичную структуру 5'-нетранслируемой области мРНК), "сканируя" ее в поисках AUG кодона, находящегося в благоприятном для инициации нуклеотидном контексте. После этого к ней присоединяется 60S рибосомная субчастица, и образовавшийся 80S инициаторный комплекс начинает синтез белка. Данная модель механизма инициации трансляции называется кэп-зависимой или сканирующей.

Следует отметить, что даже если мРНК не содержит кэп-структуры (например, когда она получена в Т7-транскрипционной системе), ее трансляция идет весьма активно, уступая лишь в 2-3 раза эффективности трансляции природной кэпированной матрицы. В этом случае, по не вполне пока понятным причинам, посадка 40S рибосомной субчастицы происходит также на самом 5'-конце моноцистронной молекулы эукариотической мРНК, поэтому данный механизм инициации трансляции правильнее называть 5'-конец-зависимым. Согласно такой модели посадка 40S рибосомной субчастицы внутрь цепи мРНК принципиально невозможна.

Вышеописанная модель предъявляет определенные требования к строению мРНК. Так, подавляющее большинство эукариотических мРНК кэпированы, моноцистронны, содержат относительно короткий и слабо структурированный 5'-

нетранслируемый район (5'-НТР). Инициация трансляции таких мРНК происходит, как правило, на ближайшем к 5'-концу А1Ю-кодоне.

40Э

Рис. 1 Схематическое изображение сканирующей модели инициации трансляции эукариотических мРНК. Малая и большая рибосомные субчастицы обозначены соответственно 40Б и 608.

Впоследствии оказалось, что для ряда мРНК такой механизм инициации синтеза белка не применим в силу иного строения их 5'-НТР. Для таких мРНК была предложена модель внутренней (5'-конец-независимой) инициации трансляции. В соответствии с этой моделью 408 рибосомная субчастица связывается непосредственно с внутренним участком 5'-НТР мРНК, так называемым участком внутреннего связывания рибосомы или ШЕ8-элементом (от

английского Internal Ribosome Entry Site), который может отстоять от 5'-конца молекулы мРНК на расстояние более 100 нуклеотидных остатков. Впервые такой механизм инициации трансляции был предложен для мРНК пикорнавирусов [2,3], 5'-НТР которых не кэпированы, весьма протяженны, сильноструктурированы и содержат до 11 AUG триплетов, предшествующих истинному инициаторному AUG ко дону.

Впоследствии внутренняя инициация трансляции была показана для мРНК вирусов ряда других групп, а также для нескольких клеточных мРНК. Недавно было обнаружено, что мРНК вируса гепатита С (Human Hepatitis С Virus, HCV) также использует механизм внутренней инициации трансляции [4]. IRES-элемент HCV, так же как и IRES-элементы пикорнавирусов, не содержит кэп-структуры и сильноструктурирован [5,6], но, в отличии от пикорнавирусных, он включает еще около 30 нуклеотидов кодирующей последовательности вирусного полипротеина [7], а также имеет функционально важный структурный элемент - псевдоузел [8]. Для инициации трансляции мРНК HCV не требуется участия большинства канонических эукариотических инициаторных факторов, однако присутствие инициаторного фактора 3 (eukariotic initiation factor 3, eIF-3) является обязательным [9]. eIF-3, самый большой из известных факторов инициации (содержит по крайней мере 8 различных субъединиц), способен связываться с рибосомной 40S субчастицей и предотвращать ее ассоциацию с 60S субчастицей [10]. В нашей лаборатории было показано, что eIF-3 образует комплекс с IRES-элементом HCV. Структурный анализ этого комплекса, предпринятый в настоящей работе, способен пролить свет на специфичность такого взаимодействия и его функциональную роль в ходе инициации синтеза вирусного полипротеина. HCV вызывает необычный вид гепатита (не А и не В), приводящий к тяжелым

ю

поражениям печени и, в ряде случаев, к злокачественным новообразованиям [11]. Поиск путей борьбы с этой опасной и быстро распространяющейся инфекцией занимает ученых во всем мире, поэтому любая новая информация о механизме инициации белкового синтеза у вируса гепатита С является чрезвычайно полезной.

В настоящий момент известно лишь небольшое число клеточных мРНК, использующих внутреннюю инициацию белкового синтеза, поэтому особенно интересно было найти и исследовать новый клеточный ЖЕБ-элемент. В литературе имелись данные, указывающие на то, что кандидатом на подобную роль может быть 5'-НТР мРНК белка теплового шока ШР70 [12,13]. Нахождение и структурное исследование новых клеточных 1ЫЕ8-элементов необходимо для дальнейшего изучения процесса внутренней инициации трансляции. Сравнение структурно-функциональных особенностей вирусных (в данной работе у РНК вируса гепатита С) и клеточного (в данной работе у мРНК белка теплового шока ШР70) участков внутреннего связывания рибосомы способно значительно расширить знания в области механизмов инициации синтеза белка у эукариот.

и

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Участки внутреннего связывания рибосомы вирусных и клеточных

РНК

1.1 Общая схема инициации белкового синтеза в клетках эукариот.

Трансляция мРНК, т.е. перевод информации, которую несет в себе мРНК, в белковую форму, является одним из основных этапов экспрессии генов. Белковый синтез не только производит новые необходимые клетке белки, но и заменяет те, что успели подвергнуться деградации. Для того, чтобы мРНК могла транслироваться, на ней должен собраться инициаторный комплекс. Помимо мРНК и рибосомных субчастиц, процесс сборки такого комплекса требует, как правило, участия большого количества факторов инициации (eukaryotic initiation factors, elFs), инициаторной аминоацилированной транспортной РНК (Met-tRNAj), молекул GTP и АТР [14]. Общая схема инициации трансляции эукариотических мРНК приведена на рис.2 [10].

Первым этапом процесса инициации белкового синтеза является диссоциация 80S рибосом на 40S и 60S субчастицы (рис.2, этап а)). В физиологических условиях (концентрация Mg2+ приблизительно 1-2 тМ) динамическое равновесие сдвинуто в сторону недиссоциированных 80S рибосом, поэтому на этом этапе необходимо участие факторов инициации, способных сдвинуть равновесие в сторону продуктов диссоциации. Данную функцию выполняют три белковых фактора, способные связываться с рибосомными субчастицами. Эукариотический инициаторный фактор 3 (eIF-3), наибольший из elFs, содержащий у млекопитающих по меньшей мере восемь различных субъединиц, связывается с 40S субчастицей с образованием природной 43Sn

рибосомной субчастицы [11]. Данное взаимодействие, по-видимому, стабилизируется при содействии eIF-lA. Еще один инициаторный фактор, eIF-б, способен связываться с 60S субчастицей, также способствуя накоплению необходимых для инициации трансляции свободных 40S субчастиц.

Перед тем, как связаться с 40S субчастицей, Met-tRNA; образует тройной комплекс с eIF-2 и GTP. GDP ингибирует образование тройного комплекса, поскольку бинарный комплекс eIF-2*GDP не может связывать Met-tRNAj. Однако, eIF-2,

выполнив раунд инициации, высвобождается именно в виде бинарного комплекса с GDP. Для того, чтобы eIF-2 смог участвовать в следующем раунде инициации, необходимо заменить GDP на GTP. Эту задачу выполняет инициаторный фактор eIF-2B, который связывается с eIF-2*GDP и катализирует реакцию обмена гуанинового нуклеотида. Тройной комплекс связывается с 40S субчастицей, несущей eIF-З и eIF-lA, с образованием 43S прединициаторного комплекса (рис.2, этап б)). Инициаторный фактор eIF-1 стабилизирует образование данного комплекса.

Следующие этапы инициации белкового синтеза - связывание прединициаторного 43 S комплекса с мРНК и узнавание инициаторного кодона, т.е. образование 48S инициаторного комплекса - являются наиболее интригующими и вызывающими наибольшее число споров. Основным механизмом, по которому происходит формирование 48S комплекса у большинства эукариотических мРНК, признан сканирующий механизм, суть которого изложена во введении к настоящей работе. Остановимся подробнее на роли в данном процессе инициаторных факторов. Узнавание кэп-структуры на 5'-конце мРНК происходит за счет фактора eIF-4E. Этот инициаторный фактор совместно с eIF-4A и eIF-4G образует кэп-связывающий белковый комплекс, названный

а)

ЫРЗ

(5) + («Г) т^ О^'

ь

е|р6

е!Р2 +

йТР +

МеМ!Ш

в1Р2'СТР'МвИЯМА| Мв_МНМА|

т7с-дио-(Д)л

[ 4В, 4Р,

ТО '

АТР

АОР

высвобождение факторов, еИ^-ОБР

■ йОР

•СТР

Рис.2 Схематическое изображение инициации трансляции в клетках эукариот [10]. Цифры, заключенные в ромбики, соответствуют индивидуальным факторам инициации согласно принятой на сегодняшний день номенклатуре, 3° - тройной комплекс (еШ2 • вТР• МеМШЧ А;). Малая и большая рибосомные субчастицы обозначены соответственно 408 и 608.

eIF-4F. Сродство eIF-4F к кэпированной мРНК приблизительно в 15 раз больше, чем у eIF-4E, что говорит о весьма вероятном дополнительном связывании с мРНК других субъединиц, составляющих eIF-4F [15]. Связанный eIF-4F совместно с eIF-4B обладает АТР-зависимой хеликазной активностью, позволяющей им расплетать вторичную структуру мРНК. Затем 43 S прединициаторный комплекс связывается с мРНК посредством взаимодействия eIF-4G с eIF-З (последний, как указано выше, связан с 40S субчастицей в составе 43S комплекса) (рис.2, стадия в)) [10].

Связывание 40S рибосомной субчастицы на 5'-конце мРНК не доставляет Met-tRNAj к инициаторному кодону, поскольку последний, как правило, отстоит от кэп-структуры на 50-100 нуклеотидных остатков. Узнавание AUG-кодона происходит в результате "сканирования" последовательности мРНК 43S прединициаторным комплексом. В этом процессе также, по-видимому, принимает участие eIF-4F благодаря своей способности расплетать вторичную структуру мРНК (рис.2, стадия г)). Описанная модель предполагает, что первый от 5'-конца молекулы мРНК AUG-триплет и будет инициаторным кодоном, что действительно справедливо для большинства эукариотических РНК-матриц. Непосредственное узнавание AUG-кодона, по-видимому, происходит при спаривании оснований AUG и антикодона Met-tRNAi. Однако это не единственная составляющая механизма узнавания инициаторного кодона, поскольку не все AUG-триплеты узнаются с одинаковой эффективностью. Было показано, что существует конценсусная стартовая последовательность, содержащая важные элементы в позициях -3 и +4 (если А из AUG считать позицией +1): CCC(A/G)CCAUGG. Весьма вероятно, что в узнавании инициаторного кодона задействована 40S рибосомная субчастица (точнее, ее рРНК), а также eIF-2 [14]. Недавно было

показано [16], что в этом процессе важную роль играют eIF-1 и elF-1А.

После того, как на стартовом AUG-кодоне оказывается собран 48S инициаторный комплекс, молекула GTP, связанная с eIF-2, подвергается гидролизу. Это событие происходит благодаря действию eIF-5. В результате все elFs высвобождаются с поверхности 40S рибосомной субчастицы, а затем происходит связывание последней с 60S субчастицей с образованием 80S инициаторного комплекса (рис.2, стадия д)). Сформированный 80S инициаторный комплекс вступает в фазу элонгации.

1.2 Внутренняя инициация трансляции.

Как упоминалось выше, помимо общепринятой сканирующей модели инициации трансляции, существует еще один возможный механизм связывания прединициаторного 43S комплекса с мРНК -так называемая внутренняя или 5'-конец независимая инициация белкового синтеза. Около 15 лет назад была полностью определена последовательность РНК полиовируса, и сразу стало очевидно, что первичная структура 5'-концевой части этой вирусной РНК несовместима со сканирующей моделью инициации трансляции. Так, прежде всего удивительным казалось отсутствие кэп-структуры на 5'-конце полиовирусной РНК, а также тот факт, что инициаторный AUG кодон был расположен на расстоянии 743 нуклеотида от 5'-конца [17]. Столь протяженный 5'-нетранслируемый район (5'-НТР) содержал многочисленные неиспользуемые AUG-триплеты, а также, как это следовало из результатов компьютерного моделирования, сложную вторичную структуру, которая должна была бы быть непроходимым препятствием для сканирующего 43 S прединициаторного комплекса. Данные в пользу существования альтернативного, 5'-конец независимого механизма накапливались довольно медленно,

пока полиовирусная РНК, а также другая, родственная ей РНК вируса энцефаломиокардита (encephalomyocarditis virus, EMCV), не стали первыми РНК-матрицами, для которых была показана внутренняя инициация трансляции [2,18]. Нуклеотидная последовательность и элементы ее вторичной и третичной структуры, необходимые для внутренней инициации трансляции, были названы участком внутреннего связывания рибосомы или IRES-элементом (от английского internal ribosome entry site).

1.3 Метод поиска IRES-элементов внутри 5'-НТР мРНК.

Для исследования способности некой нуклеотидной последовательности к внутренней посадке рибосомной 40S субчастицы был предложен так называемый метод бицистронных конструкций [2,18]. Этот подход проиллюстрирован на рис. 3. В бицистронной конструкции две нуклеотидные последовательности, кодирующие разные репортерные белки, разделены нетранслируемым спейсером. В соответствии со сканирующей моделью эукариотической инициации синтеза белка трансляция второго цистрона может происходить только по механизму реинициации (проскок рибосомы, несущей факторы инициации, с первого цистрона), т.е. быть крайне неэффективной (рис.ЗА). Однако в том случае, если между двумя цистронами вставляется фрагмент нуклеотидной последовательности, несущий участок внутреннего входа рибосомы (IRES-элемент), трансляция второго цистрона резко усиливается (рис.ЗБ) и оказывается совершенно независимой от трансляции первого цистрона (рис.ЗВ). Этот подход широко использовался при доказательстве наличия внутренней инициации трансляции у пикорнавирусных РНК. Так, при трансфекции в животные клетки или при трансляции in vitro контрольных (рис.ЗА) плазмид, трансляция второго цистрона практически не наблюдалась. Однако, если между двумя

цистронами вставлялся 5'-НТР пикорнавирусной РНК (рис.ЗБ), экспрессия второго цистрона протекала с высокой эффективностью. Введение в последней конструкции перед первым цистроном стабильной шпилечной структуры практически полностью подавляло белковый синтез с первого цистрона, но не оказывало никакого влияния на трансляцию второго цистрона (рис.ЗВ).

V

5'

репортёрный ген 1

А

нетранслируемыи спейсер

репортёрный ген 2 3'

V

5 репортёрный ген 1 ПЧЕЗ-элемент репортёрный ген 2 3'

1 V

В

стабильная шпилечная структура

^ Ч

репортёрный ген 1 ^ЕЭ-элемент репортёрный ген 2 3'

Рис.3 Схематическое изображение метода бицистронных конструкций. Стрелками показано движение 408 рибосомных субчастиц, волнистыми линиями - белковый синтез. Толщина стрелок и волнистых линий отражает эффективность соответствующего процесса.

1.4 Вирусные IRES-элементы.

В настоящее время известно довольно значительное количество вирусных РНК, использующих метод внутренней инициации белкового синтеза. Способность к внутренней посадке рибосомы присуща РНК многих пикорнавирусов, вируса гепатита С, пестивирусов и ряду других вирусных РНК. Остановимся подробнее на строении и свойствах этих вирусных IRES-элементов.

1.4.1 IRES-элементы РНК пикорнавирусов.

Представители семейства пикорнавирусов - это небольшие вирусы, геном которых представлен положительной цепью РНК. Физическое строение, размер и организация генома, а также основная стратегия репликации одинаковы у всех членов семейства. Представители этого семейства различаются выбором хозяина, патогенностью, а также деталями структуры и генной экспрессии. Пикорнавирусы условно разделены на 5 основных групп: энтеровирусы (например, полиовирус), риновирусы (например, вирус обычной простуды человека), афтовирусы (например, вирус ящура), кардиовирусы (например, упоминавшийся выше EMCV) и гепатовирусы (например, вирус гепатита А) [17].

Длина пикорнавирусного генома в среднем составляет 7500 нуклеотидов. РНК пикорнавирусов полиаденилирована с 3'-конца, а на 5'-конце содержит ковалентно связанный небольшой белок, называющийся VPg. Трансляция вирусной РНК идет с единственной открытой рамки считывания, которая начинается с AUG-кодона, отстоящего от 5'-конца молекулы на сотни нуклеотидов. В результате синтезируется полипротеин размером 250kD, который подвергается процессингу вирусными протеазами с образованием ряда структурных и регуляторных вирусных белков [17].

1.4.1.1 Структура IRES-элементов у различных пикорнавирусных РНК.

Длина 5'-НТР у представителей различных групп семейства пикорнавирусов составляет от 600 до более чем 1200 нуклеотидов, и все они содержат IRES-элементы, охватывающие в среднем 450 нуклеотидов. Несмотря на то, что эти районы выполняют в случае всех пикорнавирусов одни и те же функции, различные вирусные группы содержат IRES-элементы, сильно отличающиеся друг от друга как по нуклеотидной последовательности, так и по вторичной структуре [19]. Энтеро- и риновирусы с одной стороны и кардио- и афтовирусы с другой обладают весьма сходными по структуре IRES-элементами, однако между этими двумя группами IRES-элементов практически нет ничего общего (см. рис.4А,Б). Гепатовирусы, по-видимому, содержат IRES-элементы, близкие по своему строению к кардио- /афтовирусным элементам [20].

Для всех перечисленных групп пикорнавирусных IRES-элементов способность к внутренней посадке рибосомы была продемонстрирована in vitro и in vivo [2,18,21-23] при помощи метода бицистронных конструкций, описанного выше. Не так давно в работе [24] была сконструирована замкнутая в кольцо РНК, содержащая IRES-элемент EMCV, которая была способна связываться с рибосомами в присутствии ингибитора элонгации спарсомицина, а также служить матрицей для синтеза соответствующего белкового продукта. Эти эксперименты окончательно доказали, что рибосомы связываются с 5'-НТР пикорнавирусных РНК непосредственно, не используя обычный механизм сканирования со свободного 5'-конца молекулы РНК.

Полиовирусный IRES-элемент: группа энтеро-/риновирусов.

Вторичная структура 5'-НТР РНК полиовируса была смоделирована с использованием различных процедур [25-28],

А)

ПИРИМИДИН-БОГАТЫЙ РАЙОН

^ЕЭ ---1

ПИРИМИДИН-БОГАТЫЙ РАЙОН

ПЧЕБ-1

Рис.4 Схематическое изображение вторичной структуры 5'-НТР РНК полиовируса (А) (ШЕБ-элемент группы энтеро-/риновирусов) и ЕМСУ (Б) (ЖЕБ-элемент группы кардио-/афтовирусов) [17].

причем в результате были получены весьма сходные структуры, различающиеся лишь в некоторых деталях строения отдельных доменов. Схематическое представление вторичной структуры этого района полиовирусной РНК, подтвержденное данными биохимического зондирования [26,27], приведено на рис.4А. Более того, анализ вариаций исследуемой нуклеотидной последовательности у разных независимых полиовирусных изолятов подтвердил существование большинства предложенных шпилечных структур, выявив обширные нуклеотидные замены внутри двуцепочечных "стеблей" шпилек, сохраняющие неизменной вторичную структуру (так называемые компенсаторные замены), высокую степень консервативности последовательности в "петлях"

шпилек, а также большое разнообразие последовательности спейсерных районов между шпилечными структурами [29].

Для нахождения внутри полиовирусных 5'-НТР тех районов, которые контролируют инициацию трансляции, в соответствующие кДНК вводились мутации, а затем эффективность трансляции РНК-транскриптов оценивали in vitro и in vivo. Делетирование нуклеотидных последовательностей с 3'-конца НТР позволило определить правую границу IRES-элемента полиовируса в районе 600-го нуклеотида (см. рис.4А) [30-32]. Аналогичный подход для определения 5'-границы показал, что удаление первых 79 нуклеотидов не оказывает никакого влияния на трансляцию такой РНК in vitro [2,31], в то время как делетирование 139 нуклеотидов слегка понижает трансляционную эффективность. В общем случае принято считать, что участок внутреннего связывания рибосомы (IRES-элемент) полиовирусной РНК находится внутри 5'-НТР данной РНК приблизительно между нуклеотидами 130 и 600, т.е. включает в себя домены II-V и часть последовательности домена VI (рис.4А) [17]. Большая часть мутаций и делеций внутри этого района приводит к значительному подавлению функций IRES-элемента, однако делеция домена III целиком не является критичной [33]. Оказалось, что, по-видимому, определяющую роль играет не нуклеотидная последовательность спейсеров между шпилечными структурами, а расстояние между ними, и не специфическая последовательность внутри "стеблей" шпилек, а поддержание в этих районах самой вторичной структуры [29]. Большое значение вторичной структуры полиовирусного IRES-элемента было показано также в работах [30] и [34] при исследовании влияния мутаций в данном районе на вирусный фенотип.

Между доменами V и VI полиовирусного IRES-элемента находится 21-нуклеотидный пиримидин-богатый район, который очень чувствителен к мутациям [30,35-38], причем расстояние между

AUG-триплетом внутри "стебля" шпилечной структуры домена VI и этим пиримидин-богатым участком должно составлять 20-25 нуклеотидов для нормального функционирования IRES-элемента [32]. Мутация этого AUG (нуклеотиды 586-588 у полиовируса типа 1) приводила к падению эффективности трансляции in vitro с нормального старта инициации (нуклеотид 743) [31]. Предполагают, что именно этот мотив (пиримидин-богатый район/спейсер/AUG) может являться местом связывания рибосомы [39,40]. Нестартовый AUG-триплет на конце этого участка отмечает 3'-границу IRES-элемента. В нормальных условиях он не используется для инициации трансляции, однако, если его контекст улучшить при помощи мутаций окружающих нуклеотидов, он может функционировать в качестве инициаторного кодона [41]. Таким образом, у последовательности 5'-НТР полиовирусной РНК дикого типа IRES-элемент отделен от инициаторного AUG-кодона неструктурированным спейсером длиной около 150 нуклеотидов [42]. Вполне вероятно, что перенос рибосомы от места связывания к инициаторному AUG может происходить в результате сканирования (аналогично модели М.Козак).

IRES-элемент EMCV: группа кардио-/афтовирусов.

Параллельные исследования 5'-НТР EMCV показали, что эта нуклеотидная последовательность содержит элемент, ответственный за внутреннее связывание рибосомы, т.е. несущий ту же функциональную нагрузку, что и у полиовирусной РНК, однако обладающий вторичной структурой, практически не имеющей ничего общего со структурой IRES-элемента полиовируса [43]. Модель вторичной структуры данного района РНК EMCV была получена с использованием компьютерных расчетов и филогенетического подхода [44,45], а затем экспериментально подтверждена мутационным анализом [46], а также химическим и

23

ферментативным зондированием [26,47]. Схематическое изображение 5'-НТР EMCV приведено на рисунке 4Б. Практически полное отсутствие сходства между IRES-элементами EMCY и полиовируса очевидно (сравните рис.4А и 4Б). Вполне вероятно, что различные шпилечные структуры, составляющие каждый из этих IRES-элементов, взаимодействуют друг с другом, однако совсем не очевидно, что в результате образуются сходные третичные структуры [17].

Правая (3'-) граница IRES-элемента EMCV отмечена мотивом пиримидин-богатый тракт/спейсер/AUG, который является единственной общей особенностью пикорнавирусных IRES-элементов. Однако в случае EMCV AUG-триплет на конце данного мотива является истинным инициаторным ко доном, использующимся при трансляции соответствующей РНК. Поиск левого края IRES-элемента EMCV проводился аналогично случаю полиовируса. В результате 5'-граница была определена в районе 400-го нуклеотида (рис.4Б).

1.4.1.2 Белки, взаимодействующие с IRES-элементами РНК пикорнавирусов.

Функционирование пикорнавирусных участков внутреннего связывания рибосомы обеспечивается взаимодействием их структурных доменов с некоторым набором белков, по-видимому, специфичным для каждой разновидности IRES-элементов. По меньшей мере большинство этих белков должно иметь клеточное происхождение, поскольку после заражения клетки вирусная РНК начинает транслироваться сразу, то есть до того, как синтезируется первый вирусный белок.

Эукариотические факторы инициации трансляции.

В работе [48] инициация трансляции РНК EMCV была воссоздана in vitro из очищенных индивидуальных компонентов вплоть до стадии образования прединициаторного 48S комплекса. Оказалось, что эффективная сборка 48S комплекса на истинном инициаторном AUG кодоне (положение 834 РНК EMCV) требует участия лишь eIF-2, eIF-З и eIF-4F; эукариотический инициаторный фактор eIF-4B существенно стимулирует сборку этого комплекса. Положительный эффект на формирование 48S комплекса оказывает также белок РТВ (pyrimidine tract-binding protein), взаимодействие которого с пикорнавирусными IRES-элементами рассмотрено ниже. Таким образом, было продемонстрировано, что 5'-конец-независимая инициация трансляции определяется тем же набором инициаторных факторов, что и стандартная 5'-конец-зависимая инициация.

Роль инициаторного фактора eIF-4F в инициации трансляции РНК EMCV была подробно изучена в работе [49]. Было показано, что для сборки прединициаторного 48S комплекса на РНК EMCV абсолютно необходимы лишь две субъединицы, составляющие elF-4F: eIF-4A и центральная треть eIF-4G. Данный процесс абсолютно не нуждается в присутствии N-концевой трети eIF-4G, а также в elF-4Е. При помощи химического и ферментативного зондирования было найдено место связывания eIF-4G на IRES-элементе EMCV [50]. Оказалось, что данный белковый фактор связывается с 5'-НТР EMCV внутри домена J-K (см. рис. 4Б), в районе олиго(А) петли. Этот структурный мотив имеется у IRES-элементов РНК многих других пикорнавирусов, включая всех представителей кардио-, афто- и гепатовирусов, т.е. высококонсервативен. Мутации в данном районе приводят к полному подавлению сборки 48S комплекса [48], что еще раз подчеркивает ключевую роль

взаимодействия eIF-4G с IRES-элемеитом EMCV во внутренней инициации трансляции соответствующей РНК.

Транс-действующие белки.

Помимо стандартного набора эукариотических инициаторных факторов, было найдено несколько дополнительных, так называемых транс-действующих белков, оказывающих влияние на внутреннюю инициацию трансляции пикорнавирусов. Оказалось, что РНК определенных вирусных групп транслируется в различных типах клеток с различной эффективностью, проявляя явную специфичность по отношению к каким-то определенным клеточным экстрактам. Так, в ряде работ было показано, что трансляция РНК полиовирусов, риновирусов и вируса гепатита А не идет в экстракте проростков пшеницы, а также чрезвычайно неэффективно происходит в лизате ретикулоцитов кролика (rabbit reticulocyte lysate, RRL) [51,52,22]. В то же время трансляция РНК EMCV и FMDV (foot-and-mouth disease virus, вирус ящура), IRES-элементы которых относятся по своему строению к группе кардио/афтовирусов, идет с высокой точностью и эффективностью в RRL [53], но не в экстракте проростков пшеницы. Полиовирусный IRES-элемент, как и IRES-элемент EMCV, хорошо функционирует в экстракте клеток HeLa [54]. Слабая полиовирусная трансляция в экстракте проростков пшеницы становилась гораздо более эффективной после добавления в трансляционную смесь белковых факторов из клеток HeLa [51,55,56,31,57], в то время как добавление тех же белковых факторов не оказывало никакого влияния на неэффективную трансляцию РНК вируса гепатита А в экстракте проростков пшеницы или в RRL. Возможно, для эффективной трансляции РНК вируса гепатита А необходимы какие-то белки, синтезирующиеся только в клетках печени млекопитающих [58].

Существование специфических по отношению к типу клеток факторов, влияющих на внутреннюю инициацию трансляции пикорнавирусных РНК, побудило исследователей начать поиски клеточных белков, которые были бы способны прочно и специфично взаимодействовать с IRES-элементами

пикорнавирусов. Было показано, что 52 kD белок, впоследствии идентифицированный как Ьа-аутоантиген, связывается с нуклеотидами 559-642 полиовирусной РНК, т.е. с районом, включающим в себя мотив пиримидин-богатый район/спейсер/AUG [59]. Добавление рекомбинантного La к RRL значительно стимулировало полиовирусную трансляцию, а также исправляло ошибочную (так называемую аберрантную) трансляцию, обычно наблюдаемую в случае полиовирусной РНК в RRL. Однако следует отметить, что вышеуказанное воздействие La на полиовирусную трансляцию в RRL наблюдалось лишь при очень высоких концентрациях белка, превышающих его природное содержание в клетках HeLa [60,61]. В неинфицированных клетках белок La вовлечен в терминацию транскрипции РНК-полимеразой III [62]. Недавно у этого белка была обнаружена способность к связыванию и расплетанию двуцепочечной РНК [63]. Биохимическая роль La в полиовирусной трансляции в настоящий момент не ясна.

В начале девяностых годов был найден 58-60 kD белковый дублет, присутствующий в экстрактах клеток HeLa и асцитов Krebs II, а также в RRL, способный специфически связываться с IRES-элементами EMCV [64,65,46], FMDV [66,67] и полиовирусным IRES-элементом [38]. Впоследствии оказалось, что тот же самый белок связывается также с неродственными пикорнавирусным IRES-элементами, такими как IRES-элемент HCV [68], MoMuLV (Moloney murine lekemia virus) [69] и IGF-2 (insulin-like growth factor 2) [70]. Этот белковый дуплет был идентифицирован как ядерный белок РТВ

(pyrimidine tract-binding protein), также известный под именем hnRNP I (heterogenous nuclear ribonucleoprotein I) [22,71]. PTB является одним из факторов сплайсинга пре-мРНК млекопитающих, как это было определено в работах [72,73], и, возможно, действует как негативный регулятор сплайсинга [74]. Кроме того, все изоформы этого белка содержат четыре домена по 80 аминокислотных остатков каждый, которые сходны с РНК-узнающими мотивами (RNA recognition motif, RRM), характерными для многих РНК-связывающих белков [75].

Роль, которую играет РТВ во внутренней инициации трансляции пикорнавирусных РНК, была продемонстрирована различными методами. Так, например, в работе [71] было показано, что удаление РТВ из экстракта клеток HeLa приводит к селективному подавлению трансляции именно IRES-элемент-содержащих РНК, причем добавление физиологических концентраций рекомбинантного белка полностью восстанавливает такую трансляцию в РТВ-обедненных экстрактах. Кроме того, нарушение спаривания оснований в "стебле" шпилечной структуры в районе связывания РТВ с IRES-элементом EMCV приводит к подавлению связывания РТВ, в то время как компенсаторные мутации, восстанавливающие спаривание оснований в исследуемом участке, вызывают восстановление этого связывания [46].

Недавно при помощи метода химического и ферментативного зондирования были найдены все участки связывания РТВ с IRES-элементами EMCV и FMDV [76]. Оказалось, что РТВ связывается с IRES-элементом EMCV в шести участках: участок 1 (UCUU40i) расположен перед доменом Н данной РНК-структуры (см. рис. 4Б), участок 2 составляет основание "стебля" домена Н (нуклеотиды 407-410 и 440-443), участок 3 (UCUUU423) находится в верхней петле домена Н, участок 4 включает в себя верхнюю часть "стебля" и

соседнее выпетливание домена К, участок 5 (CUUUA750) находится в верхней петле домена К и участок 6 (CCUUUgis) расположен за доменом L. Места связывания РТВ с IRES-элементом FMDV в точности соответствуют участкам 3, 5 и 6 EMCV. Все эти участки имеют общий мотив последовательности CUUU и образуют две группы, расположенные ближе к 5'- или к 3'- концу исследованных IRES-элементов. РТВ в растворе образует димер [76] и нуждается в присутствии третьего и четвертого RRM доменов для нормального связывания РНК EMCV [77]. В работе [76] было выдвинуто предположение о том, что с каждой из двух групп идентифицированных участков связывается по одной субъединице РТВ-димера, что позволяет РТВ стабилизировать специфичную активную конформацию IRES-элементов EMCV и FMDV. Это предположение согласуется с полученными впоследствии данными о стимулировании сборки 48S прединициаторного комплекса на РНК EMCV при добавлении РТВ [48].

Совсем недавно был найден клеточный белок, специфически связывающийся с IRES-элементом вируса гепатита A (hepatitis А virus, HAV). Им оказался поли(гС) связывающий белок 2 (poly(rC) binding protein 2, РСВР2) [78]. Ранее РСВР2 был идентифицирован как фактор, необходимый для эффективной трансляции и репликации полиовирусной РНК [79, 80, 81]. РСВР2 связывается с полиовирусным IRES-элементом как во внутренней области (в районе домена IV, нуклеотиды 235-440), так и на самом 5'-конце вирусной РНК (в районе, предшествующем IRES-элементу, нуклеотиды 1-90) (см. рис. 4А). В работе [78] показано, что РСВР2 взаимодействует с РНК HAV в районе 5'-концевой трети его IRES-элемента. При удалении данного белка из экстракта клеток HeLa эффективность трансляции полиовирусной РНК резко падает, а при добавлении в РСВР2-обедненный экстракт рекомбинантного белка

эффективность трансляции возвращается к исходному уровню. Вполне вероятно, что роль РСВР2 во внутренней инициации трансляции полиовирусной РНК и РНК HAV, сходна с ролью РТВ в трансляции соответствующих РНК, т.е. состоит в стабилизации наиболее благоприятной для инициации пространственной организации IRES-элементов [78].

Помимо вышеописанных La, РТВ и РСВР2, способность к специфическому связыванию с пикорнавирусными IRES-элементами была обнаружена еще у ряда клеточных белков [82, 38, 83, 84], однако пока не было получено данных, подтверждающих существенную роль этих белков во внутренней инициации трансляции соответствующих вирусных РНК. Некоторый интерес может представлять некий 97-kD белок, для которого была продемонстрирована способность не только связываться с риновирусными IRES-элементами, но и стимулировать трансляцию соответствующих РНК [22].

1.4.2 IRES-элементы РНК вируса гепатита С и пестивирусов.

Вирус гепатита С (hepatitis С virus, HCV) - это недавно обнаруженный вирус, вызывающий хронический гепатит [85]. Болезни печени, связанные с HCV, представляют собой огромную проблему во всем мире [11]. Кроме того, существует четкая связь между заражением HCV и развитием гепатоклеточной карциномы [86]. HCV является членом семейства Flaviviridae и родственен пестивирусам, к которым относится, например, вирус классической свиной лихорадки (classical swine fever virus, CSFV). Геном членов этого вирусного семейства представляет собой положительную цепь РНК, кодирующую один полипротеин, который после синтеза расщепляется на отдельные структурные и неструктурные белки клеточными и вирусными протеиназами [87].

1.4.2.1 Структура IRES-элементов РНК вируса гепатита С и пестивирусов.

Инициация трансляции РНК HCV и пестивирусов происходит в результате связывания рибосомы с IRES-элементами длиной около 350 нуклеотидов [4, 88]. IRES-элементы HCV и CSFV включают в себя практически весь 5'-НТР соответствующих РНК, а также около 30 нуклеотидов кодирующей последовательности. Такая необходимость в участии кодирующей последовательности во внутренней инициации белкового синтеза сильно контрастирует с пикорнавирусной инициацией трансляции. Кроме того, было показано, что внутренняя инициация РНК HCV лишь незначительно подавляется при замене истинного инициаторного кодона на He-AUG-кодои, что также не согласуется со случаем пикорнавирусной инициации [7].

Несмотря на то, что нуклеотидные последовательности 5'-НТР HCV и CSFV различаются приблизительно в 50% позиций, большинство таких различий являются ковариантными заменами, что говорит о высокой степени консервативности вторичной и/или третичной структур [5]. На рисунке 5 приведено схематическое изображение строения 5'-НТР CSFV (рис.5А) и HCV (рис.5Б), основанное на моделях, предложенных в работах [5, 8, 89] и результатах, полученных в нашей лаборатории. Следует отметить, что IRES-элементы РНК HCV и пестивирусов резко отличаются по своему строению от IRES-элементов пикорнавирусных РНК; единственное, что объединяет эти участки внутреннего связывания рибосомы - это наличие высокоразвитой вторичной структуры (сравните рис.4 и рис.5).

Рис.5 Схематическое изображение структуры 5'-НТР РНК СБИУ (А) (IR.ES-элемент группы пестивирусов) и НСУ (Б).

В работе [90] было исследовано значение каждого из структурных доменов тЕБ-элемента НСУ (на рис.5Б обозначены римскими цифрами 1-Ш). Было показано, что все шпилечные структуры, составляющие 5'-НТР РНК НСУ, за исключением домена I, абсолютно необходимы для внутренней инициации трансляции этой вирусной РНК.

Поиск аналогий с пикорнавирусными 111Е8-элементами побудил авторов работы [91] исследовать роль двух пиримидин-богатых районов, найденных внутри ИШБ-элемента НСУ. Мутационный анализ первого пиримидин-богатого района (нуклеотиды 120-130) показал, что нуклеотидная последовательность этого мотива не важна для нормального функционирования данного ЖЕБ-элемента, в то время как шпилечная структура, образованная исследуемым участком РНК, необходима для ее эффективной трансляции. Второй пиримидин-богатый район (нуклеотиды 191-199) также оказался несущественным для внутренней инициации. Таким образом, в отличие от пикорнавирусных, ЖЕБ-элемент НСУ не содержит функционально значимого пиримидин-богатого района. В той же

работе была продемонстрирована необходимость соблюдения определенного расстояния между инициаторным AUG-кодоном и предшествующими ему доменами IRES-элемента HCV для внутренней инициации трансляции.

Абсолютно необходимым для эффективного функционирования IRES-элементов HCV и пестивирусов оказался псевдоузел, расположенный непосредственно перед инициаторным AUG-кодоном [5,8,92,93]. Было показано, что мутантные РНК, потерявшие способность к образованию исследуемого псевдоузла, были трансляционно неактивны. Компенсаторные замены, возвращающие таким РНК способность образовывать псевдоузел, приводили к восстановлению их трансляционной активности.

1.4.2.2 Белки, взаимодействующие с IRES-элементами РНК вируса гепатита С и пестивирусов.

В работе [9] процесс инициации трансляции на IRES-элементах HCV и CSFV был воссоздан in vitro вплоть до стадии образования прединициаторного 48 S комплекса из индивидуальных очищенных компонентов. Оказалось, что 40S рибосомная субчастица способна к прочному связыванию с исследуемыми IRES-элементами без помощи каких-либо инициаторных факторов. Полученные в результате бинарные комплексы нуждаются лишь в добавлении eIF-2, GTP и Met-tRNAi для сборки 48S комплекса на истинном инициаторном AUG-кодоне. Этот способ инициации трансляции весьма необычен, поскольку он не вовлекает в процесс образования инициаторного комплекса такие канонические факторы как eIF-4A, eIF-4B и eIF-4F. Эукариотический инициаторный фактор eIF-3 усиливал сборку 48S комплекса и был абсолютно необходим для образования 80S инициаторного комплекса на IRES-элементах HCV и CSFV. На основании результатов метода "toe-printing" домен III этих IRES-

элементов был идентифицирован как предполагаемое место связывания данного белкового фактора. Связывание eIF-З с IRES-элементом HCV подробно исследовано в настоящей работе.

Среди транс-действующих белковых факторов, связывающихся с IRES-элементом HCV, прежде всего следует упомянуть описанный выше белок РТВ [68]. Совсем недавно были получены данные о том, что РТВ взаимодействует не только с 5'-НТР, но и с З'-НТР этой вирусной РНК [94]. Эффективность трансляции мутантных РНК HCV, не содержащих на 3'-конце участка связывания РТВ, представляющего собой высококонсервативную шпилечную структуру, была в три-пять раз ниже, чем в случае РНК дикого типа. Функциональное значение такого необычного взаимодействия РТВ с РНК HCV подлежит дальнейшему изучению.

Ьа-аутоантиген также связывается с IRES-элементом HCV и оказывает положительное влияние на его трансляционную эффективность [95]. Кроме того, был обнаружен 25-kD белок, специфически присоединяющийся к IRES-элементу HCV и стимулирующий трансляцию соответствующей РНК [96]. В работе [97] подробно исследовано взаимодействие между IRES-элементом HCV и 68-kD белком, идентифицированным как гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин L (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L, hnRNP L). Интересно отметить тот факт, что hnRNP L способен взаимодействовать с РТВ [98]. Белок hnRNP L связывается с З'-концевым районом IRES-элемента HCV, включающим часть кодирующей последовательности соответствующей РНК [97].

1.4.3 IRES-элементы некоторых других вирусных РНК.

Помимо РНК пикорнавирусов, пестивирусов и родственного им HCV, способность к внутренней инициации трансляции была

34

показана еще для ряда вирусных РНК. IRES-элементы были обнаружены у РНК F-MLV (Friend murine leukemia virus [99], Mo-MuLV (Moloney murine leukemia virus) [69], HaMSV (Harvey murine sarcoma virus) [100], трицистронной субгеномной РНК IBV (infectious bronchitis virus) [101, 102], РНК некоторых потивирусов [103, 104], CMV (cowpea mosaic virus) [105], crTMV (crucifer infecting tobamovirus) [106] и некоторых других вирусов. Для большинства перечисленных РНК была лишь продемонстрирована способность к внутренней посадке рибосомы, в то время как вопрос относительно структуры соответствующих IRES-элементов, а также взаимодействия с ними клеточных белков подлежит дальнейшему выяснению. Тем не менее, в нескольких работах были предложены модели вторичной структуры соответствующих участков внутреннего связывания рибосомы, полученные при помощи специальных компьютерных программ и мутационного анализа. Следует, однако, отметить, что экспериментальная проверка предложенных моделей методами химического и/или ферментативного зондирования была проведена лишь в случае 5'-НТР РНК MLV. Далее рассмотрено несколько конкретных примеров участков внутреннего связывания рибосомы у непикорнавирусных и непестивирусных РНК.

1.4.3.1 IRES-элемент РНК F-MLV.

Геномная ретровирусная РНК является матрицей для трансляции генов gag и pol, кодирующих предшественников структурных белков и ферментов соответственно [99]. РНК MLV, одного из представителей семейства ретровирусов, управляет синтезом двух gag-белков: Y>v65gag и Pr75glyc0"gag. Трансляция Pr65gag начинается на AUG-кодоне (позиция 619 у Friend murine leukemia virus, F-MLV), в то время как pr75glyco"gag инициируется на CUG-кодоне (позиция 355 у F-MLV), расположенном в одной рамке считывания с AUGgag. Эксперименты по трансляции

35

соответствующих бицистронных конструкций in vitro и in vivo показали, что инициация синтеза белков Yr65gag и Pr758lyco"gag у F-MLV происходит в результате связывания рибосомы с внутренним участком 5'-лидерного района исследуемой РНК.

5'-лидерный район геномной РНК MLV вовлечен в ключевые этапы жизненного цикла вируса, такие как инициация трансляции gag-предшественников, димеризация несплайсированной геномной РНК, инициация обратной транскрипции. Этот район вирусной РНК чрезвычайно сильно структурирован [99]. Схематическое изображение вторичной структуры 5'-лидерного района РНК MLV, приведенное на рисунке 6, предложено авторами [99] на основе результатов компьютерного моделирования и химического зондирования.

Рис.6 Схематическое изображение вторичной структуры 5'-лидерного района РНК Б-МЬУ [99].

В ходе экспериментов по исследованию внутренней инициации трансляции РНК Б-МЬУ было замечено, что

соответствующий IRES-элемент функционировал значительно лучше в клетках NIH ЗТЗ, чем в HeLa клетках [99]. Этот факт говорит в пользу того, что эффективная инициация трансляции РНК F-MLV может требовать участия неких дополнительных клеточных факторов.

1.4.3.2 IRES-элемент РНК Mo-MuLV.

Геномная РНК Mo-MuLV (Moloney murine leukemia virus), еще одного представителя семейства ретровирусов, также кодирует два белка - предшественника gag, которые синтезируются в результате альтернативной инициации трансляции на стартовых кодонах CUG и AUG. В работе [69] было показано, что РНК Mo-MuLV содержит участок внутреннего связывания рибосомы, однако, в отличие от РНК F-MLV (см. выше), этот IRES-элемент расположен не перед обоими инициаторными кодонами, а между ними. В то время как инициация трансляции на AUG-кодоне происходит в результате внутреннего связывания рибосомы, инициация синтеза белка на CUG-кодоне происходит, по-видимому, в соответствии со сканирующей 5'-конец зависимой моделью.

IRES-элемент РНК Mo-MuLV составляет всего 126 нуклеотидов (позиции 495-621) и содержит пиримидин-богатый участок, расположенный на расстоянии 45 нуклеотидов от AUG-кодона (позиции 573-576), необходимый для эффективного функционирования этого IRES-элемента [69]. Данный район РНК Mo-MuLV вовлечен в образование вторичной структуры, причем функционально значимый пиримидин-богатый участок венчает "петлю" небольшой шпилечной структуры. В работе [69] было продемонстрировано, что ранее упоминавшийся белок РТВ специфически взаимодействует с этим полипиримидиновым трактом.

1.4.3.3 IRES-элемент РНК HaMSV.

Вирус HaMSV (Harvey murine sarcoma virus) возник, по всей видимости, в результате множественных событий рекомбинации между нуклеотидными последовательностями Mo-MuLV, крысиного вирус-подобного ретротранспозона 30S (VL30) и клеточного гена с-ras. Геномная РНК этого ретровируса имеет очень протяженный (1076 нуклеотидов) и сильно структурированный 5'-НТР. В работе [99] при помощи экспериментов с бицистронными конструкциями было показано, что нуклеотидная последовательность VL30, расположенная внутри этого 5'-НТР и непосредственно предшествующая онкогену v-ras, содержит участок внутреннего связывания рибосомы. Данных относительно белков, специфически связывающихся с IRES-элементом РНК HaMSV, в литературе в настоящий момент не содержится.

1.4.3.4 IRES-элемент РНКЗIBV.

Как было показано в работе [101], субгеномная мРНКЗ IBV (infectious bronchitis virus) способна управлять синтезом трех различных белков - продуктов трансляции открытых рамок считывания За, ЗЬ и Зс. В результате исследования механизма трансляции такой РНК было показано, что инициация синтеза белка Зс происходит в результате внутреннего связывания рибосомы где-то внутри кодирующих последовательностей За и ЗЬ. Схематическое изображение вторичной структуры этого района, предложенное на основании результатов компьютерного моделирования, приведено на рисунке 7. Авторы работы [101] отмечают некоторое сходство между доменом III приведенной структуры и доменом Н IRES-элемента EMCV, состоящее в основном в том, что обе шпилечные структуры венчаются "петлей",

состоящей из пиримидиновых оснований с общей последовательностью СЦШ. В случае ЖЕБ-элемента ЕМСУ данная "петля" является одним из участков связывания белка РТВ (см. выше), поэтому такое сходство действительно может иметь функциональное значение. Альтернативную модель вторичной, а также третичной структур ШЕЗ-элемента 1ВУ предложили авторы [102]. Обе предложенные модели свидетельствуют в пользу высокой структурированности данного района РНК 1ВУ.

Рис.7 Схематическое изображение вторичной структуры кодирующих последовательностей За и ЗЬ, содержащих IRES-элемент РНКЗ IBV [101]

Следует, однако, отметить, что экспериментальная проверка результатов компьютерного моделирования вторичной и третичной структур участка, содержащего IRES-элемент РНКЗ IBV, пока не была проведена.

1.4.3.5 IRES-элемент РНК crTMV.

Совсем недавно в работе [106] была продемонстрирована способность гена белка CP (coat protein) вируса crTMV (crucifer

infecting tobamovarus) к внутренней 5'-конец независимой инициации трансляции. В ходе данного исследования впервые был найден IRES-элемент, содержащийся внутри тобамовирусной РНК. Оказалось, что IRES-элемент crTMV содержится внутри района длиной 148 нуклеотидов, предшествующего кодирующей последовательности CP РНК crTMV. Интересно отметить тот факт, что IRES-элемент РНК crTMV функционирует одинаково эффективно как в RRL, так и в экстракте проростков пшеницы.

Предложенная модель вторичной структуры IRES-элемента РНК crTMV состоит из двух небольших шпилечных доменов, между которыми находится пиримидин-богатый мотив (рис.8).

Рис.8 Схематическое изображение вторичной структуры ЖЕБ-элемента РНК сгТМУ, предложенной в работе [104].

Очевидно, что строение данного весьма короткого ЖЕ8-элемента резко отличается от пикорнавирусных и пестивирусных элементов. Функциональная роль предполагаемых шпилечных структур и пиримидин-богатого района в настоящий момент не ясна.

1.5 Клеточные ШЕ8-элементы.

Стратегия экспрессии вирусных геномов обычно включает механизмы, которые уже существуют в клетках хозяина. По этой

О

<

AUG

пиримидин-богатый район

причине не удивительно, что вскоре после обнаружения первых вирусных IRES-элементов, способность к внутренней инициации трансляции была показана и для ряда клеточных мРНК, хотя все клеточные мРНК кэпированы. Первой невирусной эукариотической мРНК, у которой был найден участок внутреннего связывания рибосомы, оказалась мРНК белка, связывающего тяжелую цепь иммуноглобулина (immunoglobulin heavy-chain binding protein, BIP) [107]. Затем наличие IRES-элемента было показано у мРНК, кодирующих морфогенетические факторы Antennapedia и Ultrabithorax у Drosophila [108], фактор роста фибробластов 2 [109], инсулин-подобный фактор роста 2 [110], фактор роста сосудов эндотелия [111], фактор роста PDGF2/c->sw [112], фактор инициации эукариотической трансляции eIF-4G [113], протоонкоген с-тус

[114], а также дрожжевые факторы транскрипции TFIID и НАР4

[115]. В настоящий момент, к сожалению, существует лишь весьма ограниченное количество информации относительно точной локализации, строения и возможных механизмов функционирования клеточных участков внутреннего связывания рибосомы. Далее рассмотрено несколько конкретных примеров невирусных IRES-элементов.

1.5.1 IRES-элемент мРНК BIP.

В работе [107] при помощи метода бицистронных конструкций было показано, что мРНК, кодирующая белок BIP (immunoglobulin heavy-chain binding protein) или GRP78 (glucose regulated protein 78), содержит участок внутреннего связывания рибосомы. В результате экспериментов по определению границ данного IRES-элемента [116] было показано, что его основная часть расположена внутри З'-ближнего участка 5'-НТР, между нуклеотидами 129 и 220. Следует, однако, обратить особое внимание на тот факт, что внутренняя инициация трансляции

бицистронной РНК происходила весьма эффективно и в том случае, когда вся 3'-проксимальная часть 5'-лидерной последовательности BIP была делегирована, и перед вторым репортерным геном оставался лишь 5'-концевой фрагмент длиной всего 53 нуклеотида.

Сравнение 5'-НТР мРНК BIP (длиной всего лишь 220 нуклеотидов) с 5'-НТР пикорнавирусных РНК показало отсутствие какого-либо сходства [107]. Недавно было проведено компьютерное исследование вторичной структуры лидерной последовательности мРНК BIP [117]. Было показано, что внутри 5'-НТР мРНК BIP содержится некий специфический район длиной 92 нуклеотида, потенциально способный образовывать необычную вторичную структуру (unusual folding region, UFR). Такой район может складываться в Y-образную шпилечную структуру с дополнительной небольшой шпилькой, непосредственно предшествующей инициаторному AUG кодону (рис. 9). Наличие UFR было продемонстрировано у мРНК BIP человека (рис. 9А), хомяка, крысы, Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegans, Trypanosoma brucei и Giardia lamblia, что говорит о высокой консервативности данного района. Кроме того, UFR был обнаружен и у фактора роста фибробластов 2 (fibroblast growth factor 2, FGF-2) (рис. 9Б). Однако следует отметить, что наличие UFR, продемонстрированное при помощи методов компьютерного моделирования, говорит лишь о вероятности образования вышеописанной вторичной структуры. Фактическое же строение этих IRES-элементов подлежит экспериментальной проверке.

А)

О

,-170

Б) О"

250

С

130

1

ч- 210

223

L-ÀUG

210

302

CUG

Рис.9 Модель вторичной структуры UFR-мотива 5'-НТР мРНК BIP (А) и FGF-2 (Б) [117].

Поиск белков, способствующих функционированию IRES-элемента BIP, показал, что некие белки р95 и р60 способны специфически связываться с данным элементом. Идентификация этих белков в настоящий момент еще не проведена. Известно лишь, что это не РТВ и не La, с которыми IRES-элемент BIP не взаимодействует [116].

1.5.2 IRES-элемент мРНК FGF-2.

Альтернативная инициация трансляции мРНК фактора роста фибробластов FGF-2 , происходящая на трех стартовых кодонах CUG и одном AUG, приводит к синтезу четырех изоформ FGF-2 [109]. Этот процесс играет большую роль в дальнейшей судьбе FGF-2: продукты инициации на CUG-кодонах имеют ядерную локализацию, в то время как AUG-инициированный FGF-2 - в основном цитоплазм атический белок, способный вызывать клеточную трансформацию. Таким образом, разные изоформы FGF-2 имеют различную локализацию внутри клетки. Оказалось, что мРНК FGF-2 содержит внутри 5'-НТР IRES-элемент, расположенный между нуклеотидами 154 и 318, непосредственно перед первым CUG-кодоном [109]. Этот IRES-элемент

функционально активен в природных матрицах, поскольку мРНК FGF-2 оказалась связанной с трансляционным аппаратом в клетках, инфицированных полиовирусом, где кэп-зависимая трансляция была подавлена [119].

Анализ нуклеотидной последовательности IRES-элемента FGF-2 не выявил никакого сходства с пикорнавирусными участками внутреннего связывания рибосомы [109]. Предположения относительно возможной вторичной структуры IRES-элемента FGF-2, выдвинутые авторами [117], приведены выше. Никаких данных о специфическом взаимодействии каких-либо белков с данным IRES-элементом в литературе не содержится.

1.5.3 IRES-элемент мРНК протоонкогена с-тус.

Протоонкоген с-тус играет важнейшую роль в различных процессах внутри клетки, таких как пролиферация, дифференциация и апоптоз. Ген с-тус транскрибируется с четырех различных промоторов [114]. В нормальных клетках большинство транскриптов стартуют с промоторов Р1 и Р2, причем вклад последнего в общее количество мРНК с-тус составляет 75-90%. Дополнительные промоторы Р0 и РЗ расположены, соответственно, на расстоянии 600 нуклеотидов перед Р1 и внутри первого интрона гена. Кодирующая способность у четырех результирующих мРНК протоонкогена с-тус различна. Так, Р1 и Р2 мРНК кодируют два белка размером 64 и 67 kD, названных c-Mycl и с-Мус2 соответственно, синтезирующихся в результате альтернативной инициации на двух инициаторных кодонах CUG и AUG, находящихся в одной рамке считывания. Р0 мРНК -трехцистронная матрица, причем 3'-ближняя открытая рамка считывания кодирует белки c-Mycl и с-Мус2, в то время как средняя и 5'-ближняя рамка, инициаторный кодон которой расположен перед Р1 промотором, кодируют белки длиной 188 и 144

аминокислотных остатка соответственно. В отличие от РО, Р1 и Р2 с-тус мРНК, кодирующая способность РЗ мРНК ограничивается белком с-Мус2.

Стартовые точки транскрипции РО, Р1 и Р2 мРНК с-тус расположены на расстоянии, соответственно, 1172, 524 и 363 нуклеотида перед инициаторным кодоном CUG. Такая большая протяженность этих 5'-НТР говорит о том, что содержащие их мРНК должны малоэффективно транслироваться по 5'-конец зависимому сканирующему механизму. В работе [114] было убедительно продемонстрировано наличие IRES-элемента у РО, Р1 и Р2 мРНК протоонкогена с-тус , который расположен между нуклеотидами -363 и -95, предшествующими инициаторному CUG-кодону. Интересно отметить, что в отличие от случая РНК Мо-MuLV, где IRES-элемент содержится между двумя инициаторными кодонами CUG и AUG и направляет инициацию трансляции только AUG-кодона, IRES-элемент протоонкогена с-тус находится перед обоими инициаторными кодонами и контролирует синтез как с-Mycl, так и с-Мус2. В этом отношении он близок к IRES-элементу FGF-2. В результате исследований, проведенных в работе [119], было показано, что, как и в случае FGF-2, IRES-элемент протоонкогена с-тус функционально активен, поскольку соответствующая мРНК связана с трансляционным аппаратом в клетках с подавленной кэп-зависимой трансляцией.

Сравнение последовательностей IRES-элементов FGF-2 и протоонкогена с-тус, проведенное в работе [114] компьютерным методом "выравнивания последовательностей" ("sequence alignment") не выявила высокой гомологичности этих участков. Было найдено лишь несколько общих GC-богатых фрагментов, наличие которых в принципе может приводить к сходной вторичной структуре. Модель вторичной структуры IRES-элемента

мРНК протоонкогена с-тус, предсказанная методом Цукера [114], подлежит экспериментальной проверке. Авторы [114] проводят исследования по поиску и идентификации клеточных белковых факторов, принимающих участие в функционировании данного IRES-элемента.

1.5.4 IRES-элемент мРНК PDGF/c-sis.

Фактор роста PDGF состоит из гомо- и гетеродимеров двух белковых цепей, PDGF-A и PDGF-B [112]. Цепь PDGF-B является продуктом протоонкогена PDGF/ода, обладающего неопластическим трансформирующим потенциалом и экспрессирующимся в различных видах опухолевых тканей. В нормальных клетках экспрессия PDGF/с-sis четко регулируется благодаря целому ряду контролирующих механизмов на транскрипционном и пост-транскрипционном уровнях. мРНК PDGF/osly имеет необычное строение: ее кодирующий участок составляет всего 723 нуклеотида, в то время как 5'- и З'-НТР чрезвычайно длинны и составляют 1022 и 1625 нуклеотидов соответственно. Необычайно протяженный 5'-НТР содержит стабильную вторичную структуру и три небольшие открытые рамки считывания, предшествующие истинному инициаторному AUG-кодону.

В работе [112] было показано, что необычный для эукариотической матрицы 5'-НТР мРНК PDGF/о^ш содержит IRES-элемент, эффективность функционирования которого значительно повышена в дифференцирующихся клетках. Этот IRES-элемент был назван участком внутреннего связывания рибосомы, ассоциированным с дифференциацией, или D-IRES-элементом (differentiation-linked internal ribosome entry site, D-IRES).

Компьютерный анализ показал чрезвычайно высокую структурированность данного IRES-элемента [112]. В этом

отношении наблюдается определенное сходство между IRES-элементом мРНК PDGFlc-sis и большинством вирусных IRES-элементов. Авторами [112] выдвинуто предположение о существовании неких белковых факторов, специфически взаимодействующих с IRES-элементом PDGF lc-sis и стимулирующих его функционирование в дифференцирующихся клетках.

1.5.5 IRES-элемент мРНК IGFII.

Инсулин-подобный фактор роста II (insulin-like growth factor II, IGFII) представляет собой небольшой пептидный гормон роста. IGFII синтезируется с четырех мРНК, содержащих идентичные кодирующие последовательности и уникальные 5'-НТР [110]. 5'-лидерная последовательность мРНК, синтезированной с промотора 1, (так называемый 5'-НТР 1) состоит из 598 нуклеотидных остатков, причем содержание G/C в нем составляет 67%. Кроме того, 5'-НТР 1 содержит один дополнительный, не использующийся в качестве инициаторного, AUG-кодон в позиции 59. Способность к внутреннему связыванию рибосомы у 5'-НТР 1 мРНК IGFII была продемонстрирована в работе [110].

Вторичная структура 5'-НТР 1 мРНК IGFII была предсказана при помощи пакета компьютерных программ, основанных на алгоритме Цукера. Полученная модель предполагает наличие в исследуемом районе высокоразвитой вторичной структуры. Хотя никакого сходства между нуклеотидными последовательностями данного 5'-НТР и пикорнавирусными IRES-элементами обнаружено не было, авторами [110] была отмечена некоторая общая закономерность в расположении и строении некоторых структурных доменов IRES-элемента полиовируса и компьютерной модели 5'-НТР IGFII. В той же статье было выдвинуто предположение о том, что, подобно пикорнавирусным РНК,

47

эффективное функционирование IRES-элемента мРНК IGFII, возможно, требует участия неких специфических белковых факторов, которые еще предстоит идентифицировать.

1.5.6 IRES-элемент мРНК VEGF

мРНК фактора роста эндотелиальных сосудов (vascular endothelial growth factor, VEGF), основного ангиогенного фактора роста, содержит необыкновенно протяженный (1038 нуклеотидов) 5'-НТР. В соответствии со сканирующей моделью инициации трансляции такой 5'-НТР должен ингибировать белковый синтез с данной РНК-матрицы. В работе [111] было продемонстрировано, что трансляция мРНК VEGF происходит в результате внутреннего связывания рибосомы. Впервые было найдено два независимых IRES-элемента в пределах одного 5'-НТР, названные соответственно IRES-элемент А и IRES-элемент В. Вторичная структура 5'-НТР мРНК VEGF была предсказана на основе алгоритма Цукера. В соответствии с предложенной моделью, обширные участки со спариванием оснований соответствуют обоим IRES-элементам.

IRES-элемент А расположен внутри 293-нуклеотидного фрагмента, непосредственно предшествующего AUG-кодону (нуклеотиды 745-1038). Анализ си-элементов, вовлеченных в функционирование этого IRES-элемента, выявил необходимость по меньшей мере двух составляющих: 5'-ближней части IRES-элемента А (нуклеотиды 745-846) и внутреннего фрагмента IRES-содержащей последовательности (нуклеотиды 858-907), образующего, в соответствии с предложенной моделью, устойчивую шпилечную структуру. При помощи экспериментов по УФ-сшиванию было продемонстрировано связывание с данной шпилечной структурой некоего 100-kD белка.

IRES-элемент В расположен внутри 392-нуклеотидного сегмента между нуклеотидами 91 и 483, причем наибольший вклад в эффективное функционирование этого IRES-элемента вносят нуклеотидные фрагменты 91-134 и 379-483. Основным белком, связывающимся с 1RES-элементом В, оказался белок РТВ, играющий определенную роль во внутренней инициации трансляции пикорнавирусов (см. выше). Однако, по данным [111], связывание РТВ с IRES-элементом В никак не коррелирует с активностью функционирования этого элемента.

1.5.7 IRES-элементы мРНК TFID и НАР4 дрожжей.

В качестве возможных кандидатов на использование механизма внутренней инициации трансляции, в работе [115] были исследованы дрожжевые мРНК, содержащие наиболее протяженные 5'-НТР и AUG-кодоны, предшествующие истинному инициаторному кодону. В результате IRES-элементы были найдены у мРНК, соответствующих двум дрожжевым факторам транскрипции: TFID и НАР4. TFID или ТАТА-бокс-связывающий белок синтезируется с мРНК, содержащей 5'-НТР длиной 188 нуклеотидов. Эта лидерная последовательность включает небольшую открытую рамку считывания 18 нуклеотидов длиной, расположенную на расстоянии 83 нуклеотида перед стартовым AUG-кодоном. Существует три мРНК, соответствующих транскрипционному фактору НАР4, содержащие 5'-НТР длиной 270, 280 и 330 нуклеотидов соответственно. Лидерные последовательности каждой из этих мРНК содержат по две открытые рамки считывания длиной 27 и 9 нуклеотидов. Исследования точной локализации и строения IRES-элементов TFID и НАР4 не проводились.

1.5.8 IRES-элемент мРНК морфогенетического фактора Antennapedia у дрозофилы.

Транскрипция гена Antennapedia инициируется на двух промоторах (Р1 и Р2), в результате чего синтезируется две мРНК, различающиеся своими 5'-НТР. мРНК, инициированная на Р1, содержит 1512-нуклеотидный 5'-НТР, полученный при транскрипции с последовательностей не кодирующих белок экзонов А, В, D и Е, в то время как Р2-инициированная мРНК содержит 5'-НТР длиной 1727 нуклеотидов, полученный при транскрипции с экзонов С, D, и Е [108]. Не кодирующие белок экзоны А и В содержат 8 AUG-кодонов, предшествующие трансляционному инициаторному AUG-кодону, расположенному внутри экзона Е. Экзон С, в свою очередь, содержит 15 неиспользуемых AUG-кодонов. Все эти трансляционно неактивные AUG-кодоны соответствуют началу очень коротких рамок считывания, которые потенциально могли бы кодировать пептиды размером от 6 до 44 аминокислот. Экзон D и 5'-концевая часть экзона Е, общие для мРНК, инициированных на Р1 и Р2, не содержат AUG-кодонов. Было замечено, что большая длина 5'-НТР мРНК Antennapedia и высокое содержание внутри него неинициаторных AUG-кодонов не оказывают подавляющего эффекта на синтез соответствующего белка.

В работе [108] при помощи метода бицистронных конструкций было наглядно продемонстрировано наличие IRES-элемента внутри последовательности 5'-НТР мРНК Antennapedia, соответствующей экзону D. Точная локализация и вторичная структуры данного IRES-элемента в настоящий момент не известны. Интересно, что по меньшей мере 20% мРНК у дрозофилы содержат длинные 5'-НТР с большим количеством неинициаторных AUG-кодонов. Этот факт указывает на то, что механизм внутренней

инициации трансляции, возможно, играет весьма существенную роль в экспрессии генов данного организма.

1.5.9. IRES-элемент мРНК eIF-4G.

Авторами работы [ИЗ] было замечено, что 5'-НТР мРНК elF-4G обладает необычными для эукариотической матрицы особенностями: сравнительно большой протяженностью (368 нуклеотидов в случае мРНК eIF-4G человека), наличием четырех AUG-кодонов, предшествующих истинному инициаторному кодону, и пиримидин-богатой последовательности. В результате стандартных экспериментов с бицистронными конструкциями было показано, что 5'-лидерная последовательность мРНК eIF-4G содержит IRES- элемент.

Однако в 1998 году Гради с соавторами [118] опубликовал новый вариант кДНК eIF-4G, названный eIF-4GI, которая была идентична первоначально выделенной кДНК eIF-4G во всем за исключением того, что содержала более протяженную последовательность, соответствующую N-концевой части белка (дополнительные 115 аминокислот). Поскольку совпадение кДНК eIF-4G и eIF-4GI заканчивается строго на канонической последовательности сайта, по которому обычно происходит сплайсинг пре-мРНК, было выдвинуто предположение о том, что ранее выделенная кДНК содержала несплайсированный интрон на 5'-конце, включающий в себя описанный в работе [113] IRES-элемент.

Тем не менее, в том же 1998 году при исследовании поведения различных клеточных мРНК в условиях подавления 5'-конец зависимой трансляции было показано, что среди матриц, продолжающих эффективно транслироваться, содержится мРНК как eIF-4GI, так и eIF-4GII [119]. Ген eIF-4GII проявляет 56% сходства с геном eIF-4GI и, по-видимому, соответствующий белок

51

является функциональным гомологом eIF-4GII [118]. Таким образом, как мРНК eIF-4GI, так и мРНК eIF-4GII могут использовать метод внутренней инициации трансляции.

Проверка этого предположения была проведена авторами [119]. Оказалось, что в то время как 5'-НТР мРНК eIF-4GI содержит IRES-элемент, сходный по своей эффективности с IRES-элементом РНК полиовируса, 5'-лидерный участок мРНК eIF-4GII не выступает в роли внутреннего участка связывания рибосомы в экспериментах с бицистронными конструкциями. Таким образом, определенно о наличии участка внутреннего связывания рибосомы можно говорить лишь в случае мРНК eIF-4GI. Исследования вторичной структуры этого участка внутреннего связывания рибосомы и взаимодействующих с ним белков не проводились.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Сизова, Дарья Викторовна

выводы

1. При помощи ферментативного зондирования в пределах IRES-элемента вируса гепатита С (HCV) определен участок связывания эукариотического фактора инициации трансляции eIF-З. Впервые выявлена способность данного белкового фактора к специфическому взаимодействию с РНК.

2. Показано, что элементы вторичной структуры IRES-элемента HCV играют в специфичности связывания eIF-З не меньшую роль, чем нуклеотидная последовательность.

3. Продемонстрирована возможность одновременного связывания IRES-элемента HCV с eIF-З и рибосомной 40S субчастицей.

4. Методом бицистронных конструкций продемонстрирована способность 5'-НТР мРНК белка теплового шока HSP70 к внутренней инициации трансляции. Показано, что инициаторный фактор eIF-4F (по-видимому, за исключением кэп-связывающей субъединицы eIF-4E) необходим для эффективного функционирования IRES-элемента HSP 70.

5. Проведен сравнительный анализ эффективности внутреннего связывания рибосомы у 5'-НТР РНК HSP 70, BIP и р-глобина. Показано, что все три РНК в одинаковой степени способны к внутренней инициации белкового синтеза.

6. На основании результатов ферментативного и химического зондирования IRES-элемента HSP70 предложена модель его вторичной структуры.

7. В результате сравнения ЖЕ8-элементов НСУ и ШР 70 выдвинуто предположение о принципиальном различии вирусных и исследованного в работе клеточного ЖЕ8-элементов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Сизова, Дарья Викторовна, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Kozak, M. 1978. How do eukaryotic ribosomes select initiation regions in messenger RNA? Cell. V.15, p.1109-1123.

2. Pelletier, J. and Sonenberg, N. 1988. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature (London). V.334, p.320-325.

3. Jang, S.K., Davies, M.V., Kaufman, R.J., and Wimmer, E. 1989. Initiation of protein synthesis by internal entry of ribosomes into the 5'nontranslated region of encephalomyocarditis virus RNA in vivo. J. Virol V.63, p. 16511660.

4. Tsukiyama-Kohara, K., Iizuka, N., Kohara M., and Namoto A. 1992. Internal ribosomal entry site within hepatitis C virus RNA. J. Virol. V.66, p.1476-1483.

5. Brown, E.A., Zhang, H., Ping, L.-H., and Lemon, S.M. 1992. Secondary structure of the 5' nontranslated regions of hepatitis C virus and pestivirus genomic RNAs. Nucleic Acids Res. V. 20, p.5041-5045.

6. Honda, M., Brown, E.A., and Lemon, S.M. 1996. Structural requirements for initiation of translation by internal ribosome entry within genome-length hepatitis C virus RNA. Virology. V.222, p.31-42.

7. Reynolds, J.E., Kaminski A., Kettinen H.J., Grace, K., Clarke, B.E., Carroll, A.R., Rowlands D.J., and Jackson R.J. 1995. Unique features of internal initiation of hepatitis C virus RNA translation. EMBO J. V.14, p.6010-6020.

8. Wang, C., Le, S.Y., Ali N., and Siddiqui A. 1995. An RNA pseudoknot is an essential structural element of the internal ribosome entry site located within the hepatitis C virus 5' noncoding region. RNA. V.l, p.526-537.

9. Pestova, T.V., Shatsky, I.N., Fletcher, S.P., Jackson R.J., and Hellen, C.U.T. 1998. A prokaryotic-like mode of cytoplasmic eukaryotic ribosome binding to the initiation codon during internal initiation of translation of

hepatitis C virus and classical swine fever virus RNAs. Genes Dev. V.12, p.67-83.

1 O.Merrick, W.C. and Hershey, J.W.B. 1996. The pathway and mechanism of eukaryotic protein synthesis. In Translational control (ed. Hershey, J.W.B., Mathews, M.B. and Sonenberg, N.), p.31-70. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

1 l.Alter, H.J. 1995. To C or not to C: These are the questions. Blood V.85, p.1681-1695.

12.Joshi-Barve, S., De Benedetti, A., and Rhoads, R.E. 1992. Preferential translation of heat shock mRNAs in HeLa cells deficient in protein synthesis initiation factors eIF-4E and eIF-4y. J. Biol. Chem. V.267, p.21038-21043.

13.Duncan, R.F. 1996. Translational control during heat shock. In Translational control (ed. Hershey, J.W.B., Mathews, M.B. and Sonenberg, N.), p.271-293. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

14.Voorma, H.O., Thomas, A.A.M., and Van Heugten, H.A.A. 1994. Initiation of protein synthesis in eukaryotes. Mol. Biol. Reports. V.19, p.139-145.

15.Lawson, T.G., Cladaras, M.H., Ray, B.K., Lee, K.A., Abramson, R.D., Merrick, W.C., and Thach, R.E. 1988. Discriminatory interaction of purified eukaryotic initiation factors 4F plus 4A with the 5' ends of reovirus messenger RNAs. J. Biol. Chem. V.263, p.7266-7276.

16.Pestova, T.V., Borukhov, S.I., and Hellen, C.U.T. 1997. Eukaryotic ribosomes require initiation factors 1 and 1A to locate initiation codons. Nature. V.394, p.854-859.

17.Ehrenfeld, E. 1996. Initiation of translation by picornavirus RNAs. In Translational control (ed. Hershey, J.W.B., Mathews, M.B. and Sonenberg, N.), p.549-573. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

18.Jang, S.K., Krausslich, H.-G., Nicklin, M.J.H., Duke, G.M., Palmenberg, A.C., and Wimmer, E. 1988. A segment of the 5'-nontranslated region of

encephalomyocarditis virus RNA directs internal entry of ribosomes during in vitro translation. J. Virol. V.62, p.2636-2643.

19Jackson, R.J., Howell, M.T., and Kaminski, A. 1990. The novel mechanism of initiation of picornavirus RNA translation. Trends Biochem. Sci. V.15, p.477-483.

20.Brown, E., Zajac, A., and Lemon, S.M. 1994. In vitro characterization of an internal ribosomal entry site (IRES) present within the 5'nontranslated region of hepatitis A virus RNA: Comparison with the IRES of encephalomyocarditis virus. J. Virol. V.68, p.1066-1074.

21.Belsham, G.J., and Brangwyn, J.K. 1990. A region of the 5'noncoding region of foot-and-mouth disease virus RNA directs efficient internal initiation of protein synthesis within cells: Involvement with the role of L protease in translational control. J. Virol. V.64, p.5389-5395.

22.Borman, A., Howell, M.T., Patton, J.G., and Jackson, R.J. 1993. The involvement of a spliceosome component in internal initiation of human rhinovirus RNA translation. J. Gen. Virol. V.74, p. 1775-1788.

23.Glass, M.J., Jia, X.Y., and Summers, D.F. 1993. Identification of the hepatitis A virus internal ribosome entry site: In vivo and in vitro analysis of bicistronic RNAs containing the HAV 5'noncoding region. Virology. V.193, p.842-852.

24.Chen, C., and Sarnow, P. 1995. Initiation of protein synthesis by the eukaryotic apparatus on circular RNAs. Science. V.268, p.415-417.

25.Rivera, V.M., Welsh, J.D., and Maizel, J.V. 1988. Comparative sequence analysis of the 5'noncoding region of the enteroviruses and rhinoviruses. Virology. V.165, p.42-50.

26.Pilipenko, E.V., Blinov, V.M., Romanova, L.I., Sinyakov, A.N., Maslova, S.V., and Agol, V.I. 1989. Conserved structural domains in the 5'untranslated region of picornaviral genomes: An analysis of the segment controlling translation and neurovirulence. Virology. V.168, p.201-209.

27.Skinner, M.A., Racaniello, V.R., Dunn, G., Cooper, J., Minor, P.D., and Almond, J.W. 1989. New model for the secondary structure of the 5' noncoding RNA of poliovirus is supported by biochemical and genetic data that also show that RNA secondary structure is important in neurovirulence. J. Mol. Biol. V.207, p.379-392.

28.Le, S.-Y., and Zucker, M. 1990. Common structures of the 5' noncoding RNA in enteroviruses and rhinoviruses: Thermodynamic stability and statistical significance. J. Mol. Biol. V.216, p.729-741.

29.Poyry, T., Kinnunen, L., and Hovi, T. 1992. Genetic variation in vivo and proposed functional domains of the 5' noncoding region of poliovirus RNA .J. Virol. V.66, p.5313-5319.

30.Kuge, S., and Nomoto, A. 1987. Construction of viable deletion and insertion mutants of the Sabin strain of type 1 poliovirus: Function of the 5' noncoding sequence in viral replication. J. Virol. V.61, p.1478-1487.

31 .Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V.R., and Sonenberg, N. 1988. Cap-independent translation of poliovirus mRNA in conferred by sequence elements within the 5' noncoding region. Mol. Cell. Biol. V.8, p. 11031112.

32.Pilipenko, E.V., Gmyl, A.P., Maslova, S.V., Svitkin, Y.V., Sinyakov, A.N., and Agol, V.l. 1992. Prokaryotic-like eis elements in the cap-independent internal initiation of translation on Picornavirus RNA. Cell. V.68, p.119-131.

33.Ehrenfeld, E., and Semler, B. 1995. Anatomy of the poliovirus internal ribosome entry site. Curr. Top. Microbiol. Immunol. V.203, p.65-83.

34.Haller, A.A., and Semler, B.L. 1992. Linker scanning mutagenesis of the internal ribosome entry site of poliovirus RNA. J. Virol V.66, p.5075-5086.

35.1izuka, N., Kohara, M, Hagino-Yamagishi, K., Abe, S., Komatsu, T., Tago, K., Arita, M., and Nomoto, A. 1989. Construction of less

neurovirulent polioviruses by introducing deletions into the 5'noncoding sequence of the genome. J. Virol. V.63, p.5354-5363.

36.Meerovitch, K., Nicholson, R., and Sonenberg, N. 1991. In vitro mutational analysis of eis-acting RNA translational elements within the poliovirus type 2 5' untranslated region. J. Virol. V.65, p.5895-5901.

37.Nicholson, R., Pelletier, J., Le, S.-Y., and Sonenberg, N. 1991. Structural and functional analysis of the ribosome landing pad of poliovirus type 2: In vivo translation studies. J. Virol. V. 65, p. 5886-5894.

38.Pestova, T.V., Hellen, C.U.T., Wimmer, E. 1991. Translation of poliovirus RNA: Role of an essential eis-acting oligopyrimidine element within the 5' nontranslated region and involvement of a cellular 57-kilodalton protein. J. Virol. V.65, p.6194-6204.

39.Meerovitch, K., and Sonenberg, N. 1993. Internal initiation of Picornavirus RNA translation. Semin. Virol. V.4, p.217-227.

40.Jackson, R., Hunt, S., Gibbs, C., and Kaminsky, A. 1994. Internal initiation of translation of Picornavirus RNAs. Mol. Biol. Rep. V.19, p. 147159.

41 .Pestova, T.V., Hellen, C.U.T., Wimmer, E. 1994. A conserved AUG triplet in the 5' noncoding region of poliovirus RNA can function as an initiation codon in vitro and in vivo. Virology. V.148, p.255-267.

42.Agol, V. 1991. The 5' untranslated region of picornaviral genomes. Adv. Virus Res. V.40, p.103-180.

43.Hellen, C.U.T, and Wimmer, E. 1995. Translation of EMCV RNA by internal ribosomal entry. Curr. Top. Microbiol. Immunol. V.203, p.31-63.

44.Pilipenko, E.V., Blinov, V.M., Chernov, B.K., Dimitrieva, T.M., and Agol, V.l. 1989. Conservation of the secondary structure elements of the 5' untranslated region of cardio- and aphtovirus RNAs. Nucleic Acids Res. V.17, p.5701-5711.

45.Duke, G.M., Hoffman, M.A., and Palmenberg, A.C. 1992. Sequence and structural elements that contribute to efficient encephalomyocarditis virus RNA translation. J. Virol V.66, p. 1602-1609.

46.Jang, S.K., and Wimmer, E. 1990. Cap-independent translation of encephalomyocarditis virus RNA: Structural elements of the internal ribosomal entry site and involvement of a cellular 57-kD RNA-binding protein. Genes Dev. V.4, p. 1560-1572.

47.Evstafieva, A.G., Ugarova, T.Y., Chernov, B.K., Shatsky, I.N. 1991. A complex RNA sequence determines the internal initiation of encephalomyocarditis virus RNA translation. Nucleic Acids Res. V.19, p.665-671.

48.Pestova, T.V., Hellen, C.U.T., and Shatsky, I.N. 1996. Canonical eukaryotic initiation factors determine initiation of translation by internal ribosomal entry. Mol. Cell Biol V.16, p.6859-6869.

49.Pestova, T.V., Hellen, C.U.T., and Shatsky, I.N. 1996. Functional dissection of eukaryotic initiation factor 4F: the 4A subunit and the central domain of the 4G subunit are sufficient to mediate internal entry of 43 S preinitiation complexes. Mol. Cell Biol. V.16, p.6870-6878.

50.Kolupaeva, V.G., Pestova, T.V., Hellen, C.U.T., and Shatsky, N. 1998. Translation eukaryotic initiation factor 4G recognizes a specific structural element within the internal ribosome entry site of encephalomyocarditis virus RNA. J. Biol Chem. V. 273, p. 18599-18604.

51.Brown, B.A., and Ehrenfeld, E. 1979. Translation of poliovirus RNA in vitro: Changes in cleavage pattern and initiation sites by ribosomal salt wash. Virology. V.97, p.396-405.

52.Jia, X.-Y., Scheper, G., Brown, D., Updike, W., Harmon, S., Richards, D., Summers, D., and Ehrenfeld, E. 1991. Translation of hepatitis A virus RNA in vitro: Aberrant internal initiations influenced by 5' noncoding region. Virology. V.182, p.712-722.

53.Shih, D.S., Shih, C.T., Kew, O., Pallansch, M, Rueckert, R., and Kaesberg, P. 1978. Cell-free synthesis and processing of the proteins of poliovirus. Proc. Natl. Acad. Sei. V.75, p.5807-5811.

54.Pelletier, J., and Sonenberg, N. 1989. Internal binding of eukaryotic ribosomes on poliovirus RNA: Translation in HeLa cell extracts. J. Virol. V.63, p.441-444.

55.Dorner, A.J., Semler, B.L., Jackson, R.J., Hanecak, R., Duprey, E., and Wimmer, E. 1984. In vitro translation of poliovirus RNA: Utilization of internal initiation sites in reticulocyte lysate. J. Virol. V.50, p.507-514.

56.Philips, B.A., and Emmert, A. 1986. Modulation of the expression of poliovirua proteins in reticulocyte lysates. Virology. V.148, p.255-267.

57.Svitkin, Y.V., Pestova, T.V., Maslova, S.V., and Agol, V.l. 1988. Point mutations modify the response of poliovirus RNA to a translation initiation factor: A comparison of neurovirulent and attenuation strains. Virology. V.166, p.394-404.

58.Glass, M.J., and Summers, D.F. 1993. Identification of a irara-acting activity from liver that stimulates HAV translation in vitro. Virology. V.193, p.1047-1050.

59.Meerovitch, K., Pelletier, J., and Sonenberg, N. 1989. A cellular protein that binds to the 5' noncoding region of poliovirus RNA: Implications for internal translation initiation. Genes Dev. V.3, p. 1026-1034.

60.Meerovitch, K., Svitkin, Y.V., Lee, H.S., Lejbkowicz, F., Kenan, D.J., Chan, E.K.L., Agol, V.l., Keene, J.D., and Sonenberg, N. 1993. La autoantigen enhances and corrects aberrant translation of poliovirus RNA in reticulocyte lysate. J. Virol. V.67, p.3798-3807.

61.Svitkin, Y.V., Meerovitch, K., Lee, H.S., Dholakia, J.N., Kenan, D.J., Agol, V.l., and Sonenberg, N. 1994. Internal translation initiation on poliovirus RNA: Further characterization of La function in poliovirus translated in vitro. J. Virol. V.68, p. 1544-1550.

62.Gottlieb, E., and Steitz, J.A. 1989. Function of the mammalian La protein: Evidence for its action in transcription termination by RNA polymerase III. EMBOJ. V.8,p.851-861.

63.Xiao, Q., Sharp, T.V., Jeffrey, I.W., James, M.C., Pruijin, G.L., van Venrooij, W.J., and Clemens, M.J. The La antigen inhibits the activation of the interferon-inducible protein kinase PKR by sequestering and unwinding double-stranded RNA. Nucleic Acids Res. V.22, p.2512-2518.

64.Borovjagin, A.V., Evstafieva, A.G., Ugarova, T.Yu., Shatsky, I.N. 1990. A factor that specifically binds to the 5'-untranslated region of encephalomyocarditis virus RNA. FEBS Lett. V.261, p.237-240.

65.Borovjagin, A.V., Ezrokhi,M.V., Rostapshov, V.M., Ugarova, T.Yu., Shatsky, I.N. 1991. RNA-protein interactions within the internal translation initiation region of encephalomyocarditis virus RNA. Nucleic Acids Res. V.19, p.4999-5005.

66.Luz, N., and Beck, E. 1990. A cellular 57 kD protein binds to two regions of the internal translation initiation site of foot-and-mouth disease virus. FEBS Lett. V.269, p.311-314.

67.Luz, N., and Beck, E. 1991. Interaction of a cellular 57-kilodalton protein with the internal translation initiation site of foot-and-mouth disease virus. J. Virol. V.65, p.6486-6494.

68.AH, N., and Siddiqui, A. 1995. Interaction of polypyrimidine tract-binding protein with the 5' noncoding region of the hepatitis C virus RNA genome and its functional requirement in internal initiation of translation. J. Virol. V.69, p.6367-6375.

69.Vagner, S., Waysbort, A., Marenda, M., Gensac, M.C., Amalric, F., and Prats, A. 1995. Alternative translation initiation of the Moloney murine leukemia virus mRNA controlled by internal ribosome entry involving the p57/PTB splicing factor. J. Biol. Chem. V.270, p.20376-20383.

70.de Moor, C.H., Jansen, M., Bonte, E.J., Thomas, A.A.M., Sussenbach, J.S., and van den Brande, J.L. 1995. Proteins binding to the leader of the

6.0 kb mRNA of human insulin-like growth factor 2 influence translation. J. Biochem. V.307, p.225-231.

71 .Hellen, C.U.T., Witherell, G.W., Schmid, M., Shiner, S.H, Pestova, T.V, Gil, A., and Wimmer, E. 1993. The cellular polypeptide p57 that is required for translation of picornavirus RNA by internal ribosome entry is identical to the nuclear pyrimidine tract-binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USAV. 88, p.1711-1715.

72.Gil, A., Sharp, P.A., Jamison, S.F., and Garcia-Blanco, M.A. 1991. Characterization of cDNAs encoding the polypyrimidine tract-binding protein. Genes and Dev. V.5, p.1224-1236.

73.Patton, J.G., Mayer, S.A., Tempst, P., and Nadal-Ginard, B. 1991. Characterization and molecular cloning of polypyrimidine tract-binding protein: A component of a complex necessary for pre-mRNA splicing. Genes and Dev. V.7, p.393-406.

74.Singh, R., Valcarcel, J., and Green, M.R. 1995. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. V.268, p. 1173-1176.

75.Ghetti, A., Pinol-Roma, S., Michael, W.M., Morandi, C., Dreyfuss, G. 1992. hnRNP I, the polypyrimidine tract-binding protein: Distinct nuclear localization and association with hnRNPs. Nucleic Acids Res. V. 20, p.3671-3678.

76.Kolupaeva, V.G., Hellen, C.U.T., and Shatsky, I.N. 1996. Structural analysis of the interaction of the pyrimidine tract-binding protein with the internal ribosome entry site of encephalomyocarditis virus and foot-and-mouth disease virus RNAs. RNA. V.2, p.l 199-1212.

77.Kaminski, A., Hunt, S.L., Patton, J.G., Jackson, R.J. 1995. Direct evidence that polypyrimidine tract-binding protein (PTB) is essential for internal initiation of translation of encephalomyocarditis virus RNA. RNA. V.l, p.924-938.

78.Graff, J., Cha, J., Blyn, L.B., and Ehrenfeld, E. 1998. Interaction of poly(rC) binding protein 2 with the 5' noncoding region of hepatitis A virus RNA and its effects on translation. J. Virol. V. 72, p.9668-9675.

79.Blyn, L.B., Swiderek, K.M., Richards, O., Stahl, D.C., Semler, B.L., and Ehrenfeld, E. 1996. Poly(rC) binding protein 2 binds to stem-loop IV of the poliovirus RNA 5' noncoding region: Identification by automated liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 93, p.l 1115-11120.

80.Blyn, L.B., Towner, J., Semler, B.L., and Ehrenfeld, E. 1997. Requirement of poly(rC) binding protein 2 for translation of poliovirus RNA. J. Virol. V.71, p.6243-6246.

81.Gamarnik, A.V., and Andino, R. 1997. Two functional complexes formed by KH domain containing proteins with the 5' noncoding region of poliovirus RNA. RNA. V.3, p.882-892.

82.delAngel, R.M., Papavassiliou, A.G., Fernandez-Tomas, C., Silverstein, S.J., and Racaniello, V. 1989. Cell proteins bind to multiple sites within the 5' untranslated region of poliovirus RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. V.86, p.8299-8303.

83.Dildine, S.L., and Semler, B.L. 1992. Conservation of RNA-protein interactions among picornaviruses. J. Virol. V.66, p.4364-4376

84.Gebhard, J.R., and Ehrenfeld, E. 1992. Specific interactions of HeLa cell proteins with proposed translation domains of the poliovirus 5' noncoding region. J. Virol. V. 66, p.3101-3109.

85.Bradley, D.W., Krawczynski, K., Beach, M.J., and Purdy, M.A. 1991. Non-A, non-B hepatitis: Toward the discovery of hepatitis C and E viruses. Semin. Liver Dis. V.l 1, p.128-146.

86.Tsukuma, H., Hiyama, T., Tanaka, S., Nakao, M., Yabuuchi, T., Kitemura, T., Nakanishi, K., Fujimoto, I., Inoue, A., Yamazaki, H., and Kawashima, T. 1993. Risk factors for hepatocellular carcinoma among patients with chronic liver disease. N. Engl. J. Med. V.328, p. 1797-1801.

87.Takamizawa, A., Mori, C., Fuke, I., Manabe, S., Murakami, S., Fujita, J., Onishi, E., Andoh, T., Yoshida, I., and Okayama, H. 1991. Structure and organization of the hepatits C virus genome isolated from human carriers. J. Virol. V.65,p.l 105-1113.

88.Poole, T.L., Wang, C., Popp, R.A., Potgieter, L.N.D., Siddiqui, A., and Collett, M.S. 1995. Pestivirus translation initiation occurs by internal ribosome entry. Virology. V.206, p.750-754.

89.Smith, D.B., Mellor, J., Jarvis, L.M., Davidson, F., Kolberg, J., Urdea, M., Yap, P.-L., Simmonds, P., and The International HCV Collaborative Study Group. 1995. Variation of the hepatitis C virus 5' non-coding region: Implications for secondary structure, virus detection and typing. J. Gen. Virol. V.76, p. 1749-1761.

90.Rijnbrand, R., Bredenbeek, P.J., van der Straaten, T., Whetter, L., Inchauspe, G., Lemon, S., and Spaan, W. 1995. Almost the entire 5' non-translated region of hepatitis C virus is required for cap-independent translation. FEBS Lett. V.365, p.115-119.

91.Wang, C., Sarnow, P., and Siddiqui, A. 1994. A conserved helical element is essential for internal initiation of translation of hepatitis C virus RNA. J. Virol. V.68, p.7301-7307.

92.Honda, M., Brown, E.A., and Lemon, S.M. 1996. Stability of a stem-loop involving the initiator AUG controls the efficiency of internal initiation of translation on hepatitis C virus RNA. RNA. V.2, p.955-968.

93.Rijnbrand, R., van der Straaten, T., van Rijn, P.A., Spaan, W.J.M., and Bredenbeek, P.J. 1997. Internal entry of ribosomes is directed by the 5' noncoding region of classical swine fever virus and is dependent on the presence of an RNA pseudoknot upstream of the initiation codon. J. Virol. V.71, p. 451-457.

94.Ito, T., Tahara, S.M., and Lai, M.M.C. 1998. The 3'-untranslated region of hepatitis C virus RNA enhances translation from an internal ribosomal entry site. J. Virol. V.72, p.8789-8796.

95.Ali, N., and Siddiqui, A. 1997. The La antigen binds 5' noncoding region of the hepatits C virus RNA in the context of the initiator AUG codon and stimulates internal ribosome entry site-mediated translation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.18, p.2249-2254.

96.Fukushi, S., Kurihara, C., Ishiyama, N., Hoshino, F.B., Oya, A., and Katayama, K. 1997. The sequence element of the internal ribosome entry site and a 25-kilodalton cellular protein contribute to efficient internal initiation of translation of hepatitis C virus RNA. J. Virol. V.71, p. 16621666.

97.Hahm, B., Kim, Y.K., Kim, J.H, Kim, T.Y., and Jang, S.K. 1998. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L interacts with the 3' border of the internal ribosomal entry site of hepatitis C virus. J. Virol. V.72, p.8782-8788.

98.Hahm, B., Kim, Y.K., Kim, J.H., Kim, T.Y., and Jang, S.K. 1998. Polypirimidine tract-binding protein interacts with hnRNP L. FEBS Lett. V.425, p.401-406.

99.Berlioz, C., and Darlix, J.L. 1995. An internal ribosome entry mechanism promotes translation of murine leukemia virus gag polyprotein precursors. J. Virol. V.69, p.2214-2222.

100.Berlioz, C., Torrent, C., and Darlix, J.-L. 1995. An internal ribosome entry signal in the rat VL30 region of the Harwey murine sarcoma virus leader and its use in dicistronic retroviral vectors. J. Virol. V.69, p.6400-6407.

101.Liu, D.X., and Inglis, S.C. 1992. Internal entry of ribosomes on a tricistronic mRNA encoded by infectious bronchitis virus. J. Virol. V.66, p.6143-6154.

102.Le, S.Y., Sonenberg, N., and Maizel, J.V. 1994. Distinct structural elements and internal entry of ribosomes in mRNA 3 encoded by infectious bronchitis virus. Virology. V.198, p. 405-411.

103.Levis, C., and Astier-Manifacier, S. 1993. The 5' untranslated region of PVY RNA even located in an internal position, enables initiation of translation. Virus Genes V.7, p.367-379.

104.Basso, J., Dallaire, P., Charest, P.J., Daventier, Y., and Laliberte, J.F. 1994. Evidence for an internal ribosome entry site within the 5'-nontranslated region of turnip mosaic potyvirus RNA. J. Genes Virol. V.75,p.3157-3165.

105.Thomas, A.M., ter Haar, E., Wellink, K., and Voorma, H.O. 1991. Cowpea mosaic virus middle component RNA contains sequence that allows internal binding of ribosomes and that requires eukaryotic initiation factor 4F for optimal translation. J. Virol. V.65, p.2953-2959.

106.1vanov, P.A., Karpova, O.V., Skulachev, M.V., Tomashevskaya, O.L., Rodionova, N.P., Dorokhov, Yu.L., and Atabekov, J.G. 1997. A tobamovirus genome that contains an internal ribosome entry site functional in vitro. Virology. V.232, p.32-43.

107.Macejak, D., and Sarnow, P. 1991. Internal initiation of translation mediated by the 5' leader of a cellular mRNA. Nature. V.353, p.90-94.

108.0h, S.-K., Scott, M.P., and Sarnow, P. 1992. Homeotic gene Antennapedia mRNA contains 5'-noncoding sequences that confer translational initiation by internal ribosome binding. Genes Dev. V.6. p.1643-1653.

109.Vagner, S., Gensae, M.-C., Maret, A., Bayard, F., Amalric, F., Prats, H., and Prats, A.-C. 1995. Alternative translation of human fibroblast growth factor 2 mRNA occurs by internal entry of ribosomes. Mol. Cell. Biol. V.15, p.35-44.

110.Teerink, H., Voorma, H.O., and Thomas, A.A.M. 1995. The human insulin-like growth factor II leader 1 contains an internal ribosomal entry site. Biochim. Biophys. Acta. V.1264, p.403-408.

111.Huez, I., Crancier, L., Audigier, S., Gensac, M.-C., Prats, A.-C., and Prats, H. Two independent internal ribosome entry sites are involved in

translation initiation of vascular endothelial growth factor mRNA. Mol Cell. Biol. V.18, p.6178-6190.

112.Bernstein, J., Sella, O., Le, S.-Y., and Eiroy-Stein, O. 1997. PDGF2/osw mRNA leader contains a differentiation-linked internal ribosomal entry site (D-IRES). J. Biol. Chem. V. 272, p.9356-9362.

113.Gan, W., and Rhoads, R.E. 1996. Internal initiation of translation directed by the 5'-untranslated region of the mRNA for eIF4G, a factor involved in the picornavirus-induced switch from cap-dependent to internal initiation. J. Biol. Chem. V.271, p.623-626.

114.Nanbru, C., Lafon, I., Audigier, S., Gensac, M.-C., Vagner, S., Huez, G., and Prats, A.-C. 1997. Alternative translation of the proto-oncogene c-myc by an internal ribosome entry site. J. Biol. Chem. V.272, p.32061-32066.

115.1izuka, N., Najita, L., Franzusoff, A.M., Sarnow, P. 1994. Cap-dependent and cap-independent translation by internal initiation of mRNAs in cell extracts prepared from Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. V.14, p.7322-7330.

116.Yang, Q., and Sarnow, P. 1997. Location of the internal ribosome entry site in the 5' non-coding region of the immunoglobulin heavy-chain binding protein (BIP) mRNA: evidence for specific RNA-protein interactions. Nucleic Acids Res. V.25, p.2800-2807.

117.Le, S.-Y., and Maizel, J.V., Jr 1997. A common RNA structural motif involved in the internal initiation of translation of cellular mRNAs. Nucleic Acids Res. V.25, p.362-369.

118.Gradi, A., Imataka, H., Svitkin, Y.V., Rom, E., Raught, B., Morino, S., Sonenberg, N. 1998. A novel functional human eukaryotic translation initiation factor 4G. Moll. Cell Biol V.18, p.334-342.

119Johannes, G., and Sarnow, P. 1998. Cap-independent polysomal association of natural mRNAs encoding c-myc, BIP, and eIF-4G conferred by internal ribosome entry sites. RNA. V.4, p. 1500-1513.

120.Sierra, J.M., and Zapata, J.M. 1994. Translational regulation of the heat shock response. Mol. Biol. Rep. V19, p.211-220.

121.Pause, A., Methot, N., Svitkin, Y., Merrick, W.C. and Sonenberg, N. 1994. Dominant negative mutants of mammalian translation initiation factor eIF-4A define a critical role for eIF-4F in cap-dependent and cap-independent initiation of translation. EMBOJ. V.13, p.1205-1215.

122.Sambrook, J., Fritseh, E., Maniatis, T. 1989. Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

123.Hames, B.D., Higgins, S.J. 1984. Transcription and translation: a practical approach. IRL Press.

124.Ehresmann, C., Baudin, F., Mougel, M., Romby, P., Ebel, J.-P., and Ehresmann, B. 1987. Probing the structure of RNAs in solution. Nucleic Acids Res. V.15, p.9109-9127.

125.Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. V.227, p.680-685.