Терминальные районы хромосом у двух близкородственных видов бурозубок, Sorex granarius и Sorex araneus (Soricidae, eulipotyphla) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Минина, Юлия Михайловна

• Минина, Юлия Михайловна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Минина, Юлия Михайловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Теломерные районы.

1.1.1. Структура и состав теломер.

1.1.2. Методы определения размера теломер.

1.1.3. Размеры теломер у разных видов.

1.1.4. Способы поддержания длины теломер.

1.1.4.1. Зависимость длины теломер от активности теломеразы.

1.1.4.2. Альтернативные способы поддержания длины теломер.

1.1.5. Геномная нестабильность при дисфункции теломер.

1.1.6. Теломерные повторы в интерстициальных сайтах хромосом.

1.2. Субтеломерные районы хромосом.

1.3. Структурная и функциональная связь между теломерами и ядрышком.

1.4. Sorex grancirius и So rex araneus - объекты для исследования терминальных районов хромосом.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

2.2.1. Получение первичных клеточных культур.

2.2.2. Фиксация митотических клеток.

2.2.3. Приготовление цитологических препаратов.

2.2.3.1. Приготовление препаратов метафазных хромосом для FISH.

2.2.3.2. Приготовление препаратов для микродиссекции.

2.2.3.3. Приготовление препаратов фибрилл для FISH.

2.2.4. Окраска хромосом нитратом серебра на ЯО районы.

2.2.5. Микродиссекция метафазных хромосом.

2.2.6. Получение меченых проб для FISH.

2.2.7. FISH на метафазных хромосомах и фибриллах.

2.2.8. 3D FISH и иммуноокрашивание.

2.2.9. Q-FISH.:.

2.2.10. Модифицированная Q-FISH.

2.2.11. TRF (Telomere Restriction Fragments) анализ.

2.2.12. Анализ результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Кариотипы So rex granarius и Sorex araneus: дифференциальая окраска хромосом DAPI.

3.2. Локализация теломериых повторов на хромосомах Sorex granarius.

3.2.1. Выявление теломериой ДНК с помощью проб разного происхождения.

3.3. Определение длины теломер на хромосомах Sorex granarius.

3.3.1. Определение длины теломер на хромосомах Sorex granarius с помощью Q-FISH.

3.3.2. Определение длины теломер на хромосомах Sorex granarius с помощью TRF (Terminal Restriction Fragments) анализа.

3.4. Локализация теломерных последовательностей в хромосомах Sorex araneus.

3.5. Определение размера теломер в хромосомах Sorex araneus с помощью модифицированной Q-FISH.

3.6. Теломеры и ЯО районы в хромосомах Sorex granarius и Sorex araneus.

3.6.1. Локализация теломерной и 18S рДНК на хромосомах Sorex granarius.

3.6.2. Локализация теломерной и 18S рДНК в интерфазных ядрах Sorex granarius

3.6.3. Выявление активных ЯО районов на хромосомах Sorex granarius.

3.6.4. Локализация 18S рДНК и ЯО районов на хромосомах Sorex araneus.

3.7. Изучение структуры длинных теломер на хромосомах Sorex granarius.

3.7.1. Изучение структуры длинных теломер Sorex granarius с помощью микродиссекционной пробы.

3.7.2. Выявление рДНК в длинных теломерах Sorex granarius.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Терминальные районы хромосом у двух близкородственных видов бурозубок, Sorex granarius и Sorex araneus (Soricidae, eulipotyphla)»

Актуальность. Терминальные районы представляют собой важные хромосомные домены (Louis, Vershinin, 2005), которым отводится главенствующая роль в сохранении стабильности хромосом и определяющая роль в эволюции генома. Согласно современным представлениям, терминальные районы хромосом состоят из теломер и прилегающих к ним субтеломерных районов, отграничивающих теломеру от основного эухроматинового тела хромосомы.

Впервые понятие «теломера» было введено в конце тридцатых — начале сороковых годов в работах Мёллера (Muller, 1938) и Мак Клинток (McClintock, 1938). В этих пионерских исследованиях было показано, что хромосомы сливаются, если после рентгеновского облучения они потеряли свои терминальные районы. Терминальные районы хромосом, которые как бы «запечатывали» концы хромосом и предотвращали их склеивание, Меллер назвал "теломерами".

Дальнейшие исследования показали, что стабильность хромосомных концов обусловлена специальной структурой теломер, которая позволяет обеспечить репликацию концов хромосом и предотвращает их деградацию. Теломеры состоят из гандемно повторенного, ориентированного 5'-3' геломерного повтора. Причехм одна из нитей заканчивается одноцепочечным «хвостом», «кэппирующим» конец теломеры, что позволяет клетке отличать конец хромосомы от двунитевого разрыва. Существование в клетке специального механизма, поддерживающего длину теломер, было предсказано Оловниковым, исходя из механизма репликации хромосом (Оловников, 1971; Olovnikov, 1973). В дальнейшем его предсказание блестящим образом подтвердилось. Репликация теломер осуществляется с помощью специального фермента теломеразы, представляющей собой обратную транскриптазу в комплексе с РНКовой матрицей. ДНК теломер находится в комплексе как с рядом специальных факторов, осуществляющих регуляцию длины теломер, так и рядом других факторов, играющих важную роль в функционировании теломер и участвующих, например, в репарации и рекомбинации ДНК (Saldanha et al., 2003).

Важную роль теломеры играют в правильном протекании мейоза. У всех изученных видов животных и растений теломеры на определенной стадии мейоза кластеризуются на ядерной мембране, образуя «хромосомный букет». Роль этой структуры в протекании мейоза не совсем ясна. Считается, что образование хромосомного букета способствует распознаванию гомологов (Bass, 2003). Теломеры участвуют во многих ключевых клеточных процессах, включая регуляцию клеточного цикла, клеточное старение, регуляцию транскрипции генов, находящихся как в субтеломерных, так и в других районах хромосом (Blasco et al., 1999; Feuerbach et al., 2002). Во многом они определяют структуру интерфазного ядра (Nagele et al., 2001).

Уменьшение активности теломеразы и нарушение структуры теломер в соматических клетках человека приводит к хромосомной нестабильности, старению клеток и онкотрансформации (Shay, Bacchetti, 1997; Gisselson et al., 2001). В настоящее время описан альтернативный механизм поддержания длины теломер, с помощью которого клетки преодолевают ростовой кризис в отсутствии теломеразы и становятся «бессмертными». При этом резко меняется длина теломер. Альтернативный механизм основан на рекомбинации теломерных и субтеломерных последовательностей (Bhattacharyya, Lustig, 2006; Bryan, Reddel, 1997).

Субтеломсрные районы хромосом также содержат повторенные последовательности, однако в отличие от теломерных канонических повторов это, как правило, смесь разного рода повторенных последовательностей и сегментных дупликаций. Субтеломеры относятся к наиболее пластичным хромосомным районам, характеризующимся повышенной частотой сестринских обменов, рекомбинационных и мутационных событий. Их структура и состав непостоянны и могут меняться даже в ходе онтогенеза. Это свойство субтеломер обуславливает их роль в молекулярной эволюции генома и этиологии достаточного числа врожденных заболеваний человека (Linardopoulou et al., 2005; Flint et al., 1995).

Описанные выше свойства теломер и субтеломер послужили основанием к их тщательному изучению. Несмотря на большое количество работ по изучению теломер, подавляющее большинство из них посвящено изучению структуры и функции теломер в нормальных и опухолевых клетках человека. Однако результаты немногочисленных исследований теломер в хромосомах других видов животных свидетельствуют о том, что размеры и механизмы поддержания длины теломер могут быть различными даже у близкородственных видов. Репликативный кризис, обусловленный подавлением активности геломеразы при дифференцировке клеток, свойственен далеко не всем видам млекопитающих. Сказанное выше относится и к субтеломерам. К их изучению приступили существенно позже, чем к изучению теломер. К настоящему времени подробно изучены субтсломеры лишь в хромосомах человека. При этом не ясно, в какой степени особенности субтеломерных районов хромосом человека свойственны субтеломерам хромосом других видов млекопитающих.

Анализ организации терминальных районов хромосом разных видов млекопитающих из разных отрядов позволит расширить наши представления о возможной структуре и функционировании этих хромосомных районов и позволит выяснить механизмы, лежащие в основе как стабильности, так и эволюционной лабильности кариотипов. Такой распространенный вид эволюционных перестроек как Робертсоновские слияния, очевидно, связан со структурой терминальных районов хромосом, а Робертсоновские распады требуют восстановления нормальной структуры разорванных концов хромосом.

В настоящем исследовании была изучена структура терминальных районов хромосом у двух близкородственных видов бурозубок: бурозубки иберийской (Sorex granarius) и бурозубки обыкновенной (Sorex araneus) (Soricidae, Eulipotyphla). Кариогипы этих видов составлены из практически одинаковых хромосомных плеч, однако отличаются числом акроцентрических и метацентрических хромосом. Главенствующую роль в их кариотипической эволюции сыграли Робертсоновские перестройки, обусловленные слиянием акроцентриков и распадом метацентрических хромосом. Принимая во внимание тот факт, что эти виды-близнецы дивергировали недавно, мы надеялись выявить следы недавних эволюционных преобразований, связанных с терминальными районами хромосом.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение структуры терминальных районов хромосом у двух близкородственных видов бурозубок: бурозубки иберийской (Sorex granarius) и бурозубки обыкновенной (Sorex araneus), представленной в нашем исследовании тремя хромосомными расами, которые отличаются интенсивностью Робертсоновских слияний, а также определение локализации теломерных последовательностей в хромосомах этих видов.

Непосредственные задачи исследования были сформулированы следующим образом:

1. Адаптировать дифференциальную окраску DAPI для идентификации всех хромосом S. granarius и S. araneus при проведении FISH с используемыми в исследовании пробами;

2. Используя FISH, изучить распределение теломерных последовательностей в хромосомах S. granarius и S. araneus и оценить размер теломер в хромосомах этих видов с помощью разных методических подходов: Q-FISH, модифицированной Q-FISH и TRF анализа;

3. Определить локализацию рибосомной ДНК и потенциально активных ядрышкообразующих районов на хромосомах S. granarius и S. araneus;

4. Изучить структуру теломер S. granarius, используя двуцветный FISH на фибриллах с теломерной и микродиссекционной пробой, полученной из перицентромерных районов двух акроцентриков S. granarius, а также с PNA теломерной пробой и пробой к 18S рДНК.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Впервые было изучено распределение теломерной ДНК и определены размеры теломер в хромосомах S. granarius и S. araneus. У S. granarius выявлены теломеры двух типов: очень длинные, содержащие в среднем 213 т.п.н., и очень короткие, содержащие в среднем 3,8 т.п.н. теломерного повтора. Размер теломер в разных хромосомных расах близкородственного вида S. araneus колебался от 6,8 до 15,2 т.п.н.

2. Впервые в хромосомах S. araneus Новосибирской расы были выявлены ITS, причем частота встречаемости их в перицентромерных районах была тем выше, чем позже в ходе кариотипической эволюции эти хромосомы сформировались.

3. Впервые было показано, что число и локализация потенциально активных ядрышко образующих районов может сильно различаться у видов-близнецов. У S. granarius ЯО районы были локализованы на концах коротких плеч 32-х акроцентриков, тогда как у S. araneus ЯО районы были локализованы в дистальных районах плеч t, и, о и q независимо от того, были ли они акроцентриками или входили в состав метацентриков в разных хромосомных расах.

4. Впервые у одного из видов бурозубок, S. granarius, были описаны теломеры, необычной для млекопитающих структуры, в которых теломерные последовательности перемежаются с рибосомными.

Полученные в ходе исследования результаты используются при чтении спецкурса «Цитогенетика» для студентов 4-го курса специальности «цитология и генетика» биологического отделения ФЕН Новосибирского государственного университета.

Апробация работы и публикации. Основные результаты работы были представлены на XLII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, Россия, 2004), на «The Chromosome Conference XV» (Лондон, Великобритания, 2004), на «7th Meeting of the International Sorex araneus Cytogenetic Committee (ISACC)» (Санкт-Петербург, Россия, 2005), на «17th European Colloquium on Animal Cytogenetics and Gene

Mapping» (Лиссабон, Португалия, 2006), на конференции «Современные проблемы биологической эволюции» (Москва, Россия, 2007), на Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, Россия, 2007).

По материалам диссертации опубликовано 6 работ в отечественной и зарубежной печати, в том числе три статьи в журнале «Chromosome research» и одна в журнале «Генетика».

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 108 страницах, иллюстрирована 21 рисунком и содержит 3 таблицы.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Минина, Юлия Михайловна

ВЫВОДЫ.

1. Впервые, используя комбинированный подход, сочетающий ряд методов молекулярной цитогенетики и молекулярной биологии, была изучена структура терминальных районов хромосом у близкородственных видов бурозубок: Sorex granarius и Sorex araneus. Показано, что размер и структура теломер у Sorex granarius отличаются от таковых у вида-близнеца Sorex araneus и других изученных видов млекопитающих.

2. В хромосомах Sorex granarius было выявлено два типа теломер. Длинные теломеры размером 213 ± 5,8 т.п.н. были локализованы на коротких плечах всех 32-х акроцентриков, тогда как на остальных концах хромосом были локализованы короткие теломеры (3,8 ± 0,2 т.п.н.). Длина теломерных рестрикционных фрагментов у Sorex granarius, в основном, была от 10 до 80 т.п.н.

3. Было показано, что в хромосомах Sorex araneus все теломеры близки по размеру и содержали в среднем 6,8 - 15,2 т.п.н. теломерной ДНК.

4. В перицентромерных районах хромосом Sorex araneus Новосибирской расы были выявлены интерстициальные теломерные сайты. Чем раньше в ходе кариотипической эволюции вида сформировались метацентрики, тем с меньшей частотой в них выявлялись интерстициальные теломерные сайты. По-видимому, Робертсоновские слияния у бурозубок проходили с сохранением части теломерной ДНК, которая затем постепенно либо терялась, либо мо дифицир ов алась.

5. Установлено, что на концах коротких плеч акроцентриков Sorex granarius локализованы потенциально активные ЯО районы. Наряду с теломерными повторами длинные теломеры Sorex granarius содержали 18S рибосомную ДНК.

6. У Sorex araneus потенциальные ЯО районы были выявлены в дистальных районах хромосомы tu и хромосомных плеч onq независимо от того, были ли они акроцентриками или входили в состав метацентриков в разных хромосомных расах.

7. По-видимому, формирование кариотипа Sorex granarius было связано с реорганизацией терминальных районов хромосом, сопровождающейся совместной амплификацией теломерной и рибосомной ДНК, а также негомологичной рекомбинацией хромосомных плеч.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Совокупность полученных в данном исследовании данных свидетельствует о том, что S. granarius обладает необычной структурой теломерных районов хромосом, отличающейся от структуры теломер у изученных видов млекопитающих, в том числе и у близкородственного вида S. araneus. Их уникальность заключается в том, что по размеру они могут быть разделены на две контрастные группы, каждая из которых локализована на определенных концах хромосом определенной морфологии. Теломеры на коротких плечах всех 32-х акроцентриков содержат до 300 т.п.н. теломерного повтора (в среднем 213 т.п.н.), в то время как теломеры па концах длинных плеч акроцентриков, а также на концах двух метацентриков: de и tu - содержат в среднем всего 3,8 т.п.н. теломерного повтора. Короткие теломеры мы смогли визуализировать в FTSH эксперименте только при использовании теломерной PNA пробы. Чувствительность теломерной ДНКовой пробы была недостаточной, чтобы выявить такое небольшое количество теломерного повтора. Размеры теломер были установлены с помощью Q-FISH с PNA теломерной пробой, которая в отличие от ДНКовой пробы обладает высоким сродством именно к теломерным повторам. Замена в мишени хотя бы одного нуклеотида приводит к резкому снижению интенсивности гибридизации PNA проб и стабильности образующихся дуплексов и триплексов (Demidov, 2003). Напомним, что средняя длина теломер у млекопитающих, включая человека и диких мышей, составляет от 5 до 30 т.п.н. (Moyzis et al., 1988; Zhu et al., 1998; Karlseder et al., 2002). Более длинные теломеры обнаружены у одного из видов кроликов и лабораторных мышей, у которых теломеры могут достигать 80 т.п.н. (Zijlmans et al., 1997; Manning et al., 2002; Forsyth et al., 2005). Формирование таких длинных теломер объясняют инбридингом. Длинные и гетерогенные по размеру теломеры описаны также в опухолевых клетках человека, преодолевших репликативный кризис без участия теломеразы с помощью рекомбинационных механизмов (Reddel, 2003).

Считается, что теломеры размером менее 4-5 т.п.н. характерны для стареющих клеток и являются причиной репликативного кризиса (Saldanha et al., 2003). Следует заметить, что фибробласты S. granarius не выказывают признаков репликативного старения даже при длительном (в течение года) культивировании in vitro. Клетки при этом не только интенсивно делятся, но и сохраняют практически диплоидный кариотип, что необычно для длительно культивируемых клеток (данные в этом исследовании не представлены). По-видимому, наличие в кариотипе таких коротких теломер не приводит к репликативному кризису. Возможно, что в дифференцированных клетках S. granarius не происходит значительного уменьшения активности теломеразы, либо в поддержании длины теломер в них участвуют дополнительные механизмы. Во всяком случае, отсутствие клеточного кризиса при длительном культивировании клеток в настоящее время рассматривается как указание на то, что по сравнению с человеком биология теломер у этого вида имеет некоторые особенности.

Полиморфизм по размеру теломер на длинных и коротких плечах хромосом у млекопитающих был описан ранее. Однако разница эта была в разы, а не в десятки раз, как в описанном нами случае. Согласно полученным нами данным, длинные теломеры S. granarius содержат почти в 60 раз больше теломерного повтора, чем короткие (McElligott et al., 1997; Slijepcevic et al., 1997; Zijlmans et al., 1997; Londono-Vallejo et al., 2001; Slijepcevic, 2001; Modino et al., 2002; Zhdanova et al., 2005).

Важно было установить, являются ли теломеры нетрадиционного размера особенностью S. granarius или они характерны, по крайней мере, для видов группы Sorex araneus. Для этого, используя модифицированную Q-FISH, мы определили размеры теломер в двух хромосомных расах S. araneus. Напомним, что S. araneus и S. granarius являются близкородственными видами, которых считают видами-близнецами. Использование гетерологичной FISH с хромосомоспецифичными пробами показало, что за исключением небольшого сдвига центромеры в хромосоме be S. araneus кариотипы этих видов составлены из идентичных хромосомных плеч (личное сообщение JI.C. Билтуевой и А.С. Графодатского, ИЦиГ СО РАН, Новосибирск). Для определения размера теломер у S. araneus мы выбрали Томскую и Cordon расы из-за того, что кариотипы этих рас отличаются по числу акроцентрических и метацентрических хромосом. Раса Cordon содержит 20 акроцентрических и 10 метацентрических хромосом, а Томская - 8 акроцентрических и 16 метацентрических хромосом (Wojcik et al., 2003).

Оказалось, что теломеры на хромосомах этих рас содержат в среднем от 7 до 15 т.п.н. теломерных последовательностей. При этом мы не выявили различий в размере теломер на коротких плечах акроцентриков и на остальных концах хромосом S. araneus. Таким образом, теломеры особого размера не являются особенностью бурозубок, они характерны только для S. granarius. Остальные виды бурозубок содержат, очевидно, теломеры, по размеру укладывающиеся в рамки, характерные для диких видов млекопитающих. Таким образом, можно предположить, что предшественник S. araneus имел размер теломер сходный с размером теломер у современных обыкновенных бурозубок, а в современном кариотипе S. granarius сформировались теломеры либо уникального, либо редко встречающегося среди млекопитающих размера.

Другой особенностью длинных теломер S. granairus является их необычная структура. Мы обнаружили, что наряду с теломерными повторами в длинных геломерах S. granarius локализованы повторы 18S рДНК. На мысль о том, что длинные теломеры могут содержать кроме теломерных другие повторенные последовательностей нас, в первую очередь, навели наблюдения о размере этих теломер на метафазных хромосомах. Они казались существенно больше, чем блок в 200-300 т.п.н. Эти весьма косвенные наблюдения заставили нас попытаться выявить «некие» повторенные последовательности среди теломерной ДНК на фибриллах с помощью микродиссекционной пробы из перицентримерных районов хромосом а и Ъ S. granarius. Полученная проба окрашивала перицентромерные районы всех акроцентриков S. granarius, практически совпадая при этом на метафазных хромосомах с локализацией теломерной пробы. У S. araneus она красила только.прицентромерные районы плеч а и Ь хромосом а/и be,.что убедило нас в том, что данная проба в доминирующем количестве содержит повторенные последовательности, характерные только для перицентримерных районов хромосом акроцентриков S. granarius. И действительно, проведя FISH микродиссекционной и полученной с помощью ПЦР теломерной пробами, мы обнаружили протяженные окрашенные фибриллы, на которых районы, окрашенные обеими пробами, перемежались с районами, окрашенными одной из этих проб. Полученные данные указывали на то, что длинные теломеры S. granarius могут содержать другие, нежели теломерные, повторенные последовательности. Однако, учитывая невысокую чувствительность использованных в этом эксперименте проб и сложный состав микродиссекционной пробы, мы рассматривали полученные данные как предварительные.

Дополнительные данные в пользу того, что длинные теломеры наряду с теломерными содержат еще какие-то повторенные последовательности, были получены нами при определении длины теломер S. granarius с помощью TRF анализа. Если первоначальное определение размеров теломер с помощью Q-FISH указывало на количество теломерного повтора на концах хромосом, то данные о размерах TRF фрагментов свидетельствовали о длине блоков теломерных повторов. Тот факт, что мы не выявили в хромосомах S. granarius интерстициальных теломерных последовательностей ни с помощью ДНКовой теломерной пробы, ни с помощью PNA теломерной пробы свидетельствует о том, что подавляющее большинство TRF фрагментов имеет отношение именно к теломерам. Анализ показал, что большинство TRF фрагментов имеют длину от 10 до 80 т.п.н. Фрагментов размером более 100 т.п.н. выявлено не было. Таким образом, эти данные подтвердили наше предположение о том, что блоки теломерных повторов в длинных геломерах, по всей видимости, разделены другими повторяющимися последовательностями.

Пытаясь угадать, какие же повторы могут быть локализованы в длинных теломерах S. granarius, мы обратили внимание на данные о связи между ядрышком и теломерами, которые мы привели в обзоре литературы. Обратим внимание лишь на факт, что исследования буквально последних лет показали, что в ядрышке локализованы факторы, необходимые для нормального функционирования теломеры: TRF2 и теломераза (Narayanan et al., 1999; Dundr, Misteli, 2001; Zhang et al., 2004). Таким образом, пространственное приближение на хромосомах ЯО районов к теломерам может быть функционально оправдано как для теломер, так и для ядрышек. Несмотря на то, что ничего не указывало на то, что у S. granarius ЯО районы могут быть локализованы там же, где и длинные теломеры, т.е. на концах коротких плеч акроцентриков, мы провели исследование по определению локализации ЯО районов на хромосомах этого вида. Ранее было показано, что в некоторых расах S. araneus ЯО районы локализованы на концах четырех длинных плеч: t, и, q и о.

Изучение локализации ЯО районов на хромосомах S. granarius и трех хромосомных рас S. araneus с помощью двуцветной FISH с пробой к теломерной и 18S рДНК, а также окраски серебром показало, что эти виды различаются по числу и локализации ЯО районов. Если на хромосомах S. araneus ЯО районы расположены на дистальпых концах четырех хромосомных плеч независимо от того, входят они в состав метацентрических хромосом или представляют собой акроценгрики в разных хромосомных расах, то у S. granarius ядрышкообразующими были все 16 акроцентриков (32 в диплоидном кариогипе). ЯО районы у S. granarius были локализованы на проксимальных концах (коротких плечах) акроцентриков. Причем на разных хромосомах наблюдались все 3 варианта расположения кластеров: полное перекрывание сигналов от теломерной и рДНК, их частичное перекрывание и следование друг за другом. Изучение пространственной организации ядер фибробластов S. granarius также выявило либо колокализацию, либо частичное совпадение сигналов от теломерной пробы и пробы к 18S рДНК. Таким образом, мы имели все основания предположить, что среди локализованных в длинных теломерах нетеломерных последовательностей могут быть рибосомные повторы.

Двуцветный FISH на фибриллах S. granarius с теломерной PNA пробой и пробой к 18S рДНК выявил протяженные участки окрашенных фибрилл, на которых теломерные повторы перемежались с рибосомпыми. Таким образом, мы считаем доказанным, что длинные теломеры S. granarius содержат рибосомные повторы. Причем степень перекрывания этих повторов на разных хромосомах может быть разной. Как мы уже указывали в обзоре литературы, ЯО районы нередко расположены в терминальных районах хромосом (Liu, Fredga, 1999; Dobigny et al., 2003; Rakotoarisoa et al., 2004). Однако до сих пор не было описано такой тесной связи между теломерными и рибосомпыми повторами, которую выявили мы.

Структуру длинных теломер можно, по-видимому, грубо и усредиенно представить следующим образом. На дистальных концах длинных теломер локализован блок тандемных теломерных повторов, который заканчивается одноцепочечным Г-обогащенным концом. За ним локализован район, в котором теломерные и рибосомные повторы перемежаются. Далее следует блок рибосомных повторов. Полученные данные позволяют считать, что на разных хромосомах второй и третий районы могут быть разной протяженности.

В отношении размера «истинной» теломеры пока трудно сказать что-либо определенное. Не исключено, что он сравним по размерам с короткими теломерами S. granarius. Использованные в работе методы не позволяют определить его размер. Следует заметить, что второй район в длинных теломерах по своей структуре напоминает субтеломерные районы хромосом человека, в которых нативные и частично дегенерированные теломерные последовательности перемежаются с разнообразными повторенными последовательностями (Жданова и др., 2007). Не исключено, что и в нашем случае на некоторых хромосомах он содержит дополнительные повторы, а наряду с нативиыми - частично дегенерированные теломерные последовательности. В связи с этим можно предположить, что формирование длинных теломер на концах хромосом S. granarius является первым шагом на пути выделения из теломер субтеломерных районов. >

В то же самое время теломеры похожей структуры были описаны в эмбриональных стволовых клетках мышей, у которых отсутствовала активная теломераза. После преодоления ростового кризиса в клетках этих животных в результате цис/транс амплификации сформировались длинные теломеры, в которых теломерные повторы перемежались с нетеломерными (Niida et al., 2000). Теломеры, в которых канонические теломерные повторы были заменены рибосомными или сателлитными, обнаружены у некоторых лилейных растений (Pich et al., 1996; Fajkus et al., 2005). В обзоре, посвященном роли теломер в эволюции и эволюции теломер, рассматривается возможность поддержания длины теломер у этих видов растений с помощью механизма, схожего с ALT и описанного для некоторых опухолей человека, в которых отсутствует активная теломераза (Fajkus et al., 2005).

Для, гак называемых, ALT клеток характерны теломеры гетерогенной длины: от очень длинных до очень коротких. Также для них характерна амплифицикация субтеломерных районов. Существуют доказательства, что в основе ALT лежат опосредованные репликацией ДНК рекомбинационные механизмы (Reddel, 2003; Stewart, 2005). Было показано, что оба механизма поддержания длины теломер: с помощью теломеразы и ALT - могут существовать в одних и тех же клетках (Cerone et al., 2005). Нельзя исключить, что при некоторых обстоятельствах не только длительно культивируемые и опухолевые, но и нормальные диплоидные клетки млекопитающих могут использовать для поддержания длины своих теломер как зависимый от теломеразы, так и схожий с ALT механизмы (Жданова и др., 2007). Тем более, что все факторы, необходимые для гомологичной и негомологичной рекомбинации ДНК, ассоциированы с теломерами (Saldanha et al., 2003).

Остается пока неясным, какие рибосомные цистроны активны на хромосомах S. granarius. Окраска серебром выявила окрашенные бэнды на концах коротких плеч всех акроцентриков S. granarius. Несмотря на то, что этот метод рекомендован для выявления активных ЯО районов (Verma, Babu, 1995), имеются данные о том, что не все Ag положительные бэнды представляют собой активные ЯО районы (Dobigny et al., 2002). Вероятно, корректнее рассматривать районы, окрашивающиеся серебром как потенциально активные ЯО районы. В связи с этим остается не ясно, активны ли все ЯО районы на хромосомах S. granarius, а также активны ли рибосомные цистроны, локализованные непосредственно в длинных теломерах. Следует заметить, что в активных ЯО районах диплоидных клеток млекопитающих активна только часть рибосомных цистронов (Carmo-Fonseca et al., 2000). Кроме того, не ясно, все ли копии рибосомных цистронов в длинных теломерах представляют собой совершенные копии. Возможно, что часть из них представлена частично неполными или частично деградированными копиями, которые не могут транскрибироваться. Использованные нами методы и подходы, не позволяют ответить на этот вопрос. Мы можем лишь утверждать, что активна, по крайней мере, часть рибосомных цистронов в ЯО районах, сопряженных с длинными теломерами S. granarius.

Чтобы попытаться понять, как могли сформироваться такие длинные теломеры, следует обратиться к вопросам, связанным с дивергенцией кариотипов S. araneus и S. granarius. Хромосомный полиморфизм у видов группы Sorex araneus изучался подробно. Было показано, что он обусловлен, главным образом, Робертсоновскими перестройками и обменами негомологичными плечами (Zima et al., 1998). В полной мере это относится к формированию хромосомных рас S. araneus в результате географической изоляции. Вид S. granarius так же, как и хромосомные расы, сформировался в результате географической изоляции и может рассматриваться как эндемический вид, проживающий в горных районах Португалии и центральной Испании. Согласно данным молекулярной филогении, среди группы видов Sorex araneus этот вид является наиболее близким к S. araneus. Более того, он отделился от основной ветви совсем недавно, несколько сот тысяч лет тому назад, и возможно, даже позже некоторых хромосомных рас (Taberlet et al., 1994; Hausser et al., 1998). Следует заметить, что определение филогенетических отношений путем изучения полиморфизма гена цигохрома b у видов, дивергировавших так недавно, сопряжено с некоторыми трудностями. Однако если принять за факт приведенные в цитированных источниках данные, то, как считают авторы, следует признать, что кариотип предшественника S. araneus и S. granarius содержал, как минимум, 4 метацентрических хромосомы: af, be, de и tu. А современный кариотип S. granarius сформировался в результате распада двух метацентриков af и be.

1 Главная проблема, которая возникает при распаде метацентриков - это проблема теломеризации разорванных концов хромосом. При обсуждении этой проблемы было высказано предположение, что в их стабилизации может принимать участие рДНК либо путем амплификации уже имеющихся в районе перестройки рибосомных повторов, либо путем транспозиции их из других районов генома (Hall, Parker, 1995; Rousselet et al., 2000; Dobigny et al., 2003). В пользу такой мобильности рДНК могут служить данные о совместной эволюции рибосомной и теломерной ДНК у Taterillus X (Rodentia, Gerbillinae) (Dobigny et al., 2003), а также данные о расселении рДНК по концам хромосом при формировании современного кариотипа обыкновенной полевки хромосомной, формы obscurus (Rubtsov et al., 2002). Кроме того, неоднократно отмечалось, что часто интерстициальные сайты теломерной ДНК локализованы в ЯО районах хромосом (Meyne et al., 1990). Механизмы такого расселения рДНК по хромосомам остаются не выясненными. Возможно, что это явление можно считать частным случаем известного феномена согласованной эволюции повторенных последовательностей.

Мы предполагаем, что современный кариотип S. granarius образовался в результате глобальной реорганизации терминальных районов хромосом в профазе мейоза. Известно, что во время мейотической профазы на стадии «мейотического букета» теломеры прикреплены к ядерной оболочке, образуя нечто наподобие кластера (Harper et al., 2004). По-видимому, контакт теломер в мейозе может облегчать рекомбинацию между негомологичными плечами, которая при формировании кариогипа S. granarius могла быть спровоцирована распадом двух мегацентриков. Как мы указывали ранее, структура терминальных районов хромосом в предковом кариотипе, по-видимому, была близка к структуре терминальных районов у S. araneus, у которого, как и у S. granarius наблюдается не только терминальная локализация ЯО районов, но и, возможно, чередование теломерных и рибосомных повторов в проксимальной части некоторых теломер. Вовлечение в рекомбинацию негомологичных хромосомных плеч с терминальной локализацией ЯО районов могло привести к амплификации теломерных повторов и расселению рибосомных повторов по терминальным районам негомологичных хромосомных плеч. Схожий механизм предполагается в случае расселения сегментных дупликаций по субтеломерам негомологичных хромосом человека (Der-Sarkissian et al., 2002; Linardopoulou et al., 2005).

Изучение локализации теломерной ДНК в хромосомах S. araneus выявило теломерные последовательности в перицентромерных районах метацентрических хромосом. Подробное изучение кариотипической эволюции в группе видов Sorex araneus позволяет проследить, в каком порядке формировались метацентрические хромосомы S. araneus. Первоначально были сформированы мстацентрики af, be, de и tu. Они выявлялись в кариотипах практически всех видов из группы Sorex araneus. Затем образовался метацентрик jl. Он характерен для всех хромосомных рас вида S. araneus. Остальные метацентрики сформировались уже после расслеления S. araneus и образования современных хромосомных рас (Taberlet et al., 1994; Hausseretal., 1998).

Обращает на себя внимание гот факт, что с наибольшей частотой ITS были выявлены в перицентромерных районах тех метацентриков, которые считаются наиболее «молодыми». В «старых» метацентриках ITS была существенно ниже. Поскольку схожие результаты были получены при использовании PNA пробы (личное сообщение Н.С. Ждановой и Ю.И. Рогозиной), то мы можем быть уверены, что, по крайней мере, часть выявленной в ITS теломерной ДНК представлена интактными теломерными повторами. Проще всего полученные данные объяснить, если предположить, что Rb слияния у S. araneus проходили с сохранением, по крайней мере, части теломерной ДНК, которая впоследствии как нефункционирующая проявляла тенденцию к потере или модификации. Ранее возможность такой ситуации обсуждалась Мейне с соавторами (Meyne et al., 1990).

Изучение распределения теломерной ДНК на хромосомах разных видов показало, что теломерные последовательности в интерстициальных сайтах часто совпадают ' с районами эволюционных слияний и являются следами функциональных теломер, сохранившихся после Робертсоновских или тандемных слияний (Metcalfe et al., 1998; Finato et al., 2000; Castiglia et al., 2002). Однако они могут быть также и следами репарации или негомологичной рекомбинации ДНК с участием теломеразы в ломких сайтах хромосом (Ruiz-Herrera et al., 20026). Тем или иным образом, но ITS являются следами эволюционных преобразований хромосом. В случае S. araneus это следы Робертсоновских слияний.

В заключение можно сказать, что изучение структуры терминальных районов хромосом и локализации теломерной ДНК в хромосомах двух близкородственных видов бурозубок позволило приблизиться к пониманию того, как проходила их кариотипическая эволюция и расширить наши знания о структуре теломер в хромосомах млекопитающих.

87

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Минина, Юлия Михайловна, 2008 год

1. Богданов А.А. Теломеры и теломераза // Соровекий образовательный журнал. 1998. № 12. С. 12-18.

2. Егоров Е.Е. Теломеры, теломерная ДНК, хромосомы // Биологические мембраны. 2001. Т. 18. С. 249-256.

3. Жданова Н.С., Рубцов Н.Б., Минина Ю.М. Терминальные районы хромосом млекопитающих: пластичность и роль в эволюции // Генетика. 2007. Т. 43. С. 721-732.

4. Малыгин А.А., Грайфер Д.М., Зенкова М.А., Мамаев С.В., Карпова Г.Г. Аффинная модификация 80S рибосом из плаценты человека производными три- и гексауридилатов в качестве аналогов мРНК // Молекулярная биология. 1992. Т. 26. С. 369-377.

5. Azzalin C.M., Nergadze S.G., Giolotto E. Human intrachromosomal telomeric-like repeats: sequence organization and mechanisms of origin // Chromosoma. 2001. V. 110. P. 75-82.

6. Bailey S.M., Meyne J., Chen D.J., Kurimasa A., Li G.C., Lehnert B.E., Goodwin E.Y. DNA double-strand break repair proteins are required to cap the ends of mammalian chromosomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 1489914904.

7. Bailey S.M., Brenneman M.A., Goodwin E.H. Frequent recombination in telomeric DNA may extend the proliferative life of telomerase-negative cells // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. P. 3743-3751.

8. Bailey S.M., Murnane J.P. Telomeres, chromosome instability and cancer // Nucl. Acid. Res. 2006. V. 21. P. 2408-2417.

9. Bass H.W. Telomere dynamics unique to meiotic prophase: formation and significance of the bouquet // Cell. Mol. Life Sci. 2003. V. 60. P. 2319-2324.

10. Benton M.J., Donoghue P.C. Paleontological evidence to date the tree of life // Mol Biol Evol. 2007. V. 24. P. 889-891.

11. Bertoni L., Attolini C., Faravelli M., Simi S., Giulotto E. Intrachromosomal telomere-like DNA sequences in Chinese hamster // Mamm. Genome. 1996. V. 7. P. 853-855.

12. Biessmann H., Donath J., Walter M.F. Molecular characterization of the Anopheles gambiae 2L telomeric region via an integrated transgene // Insect Mol. Biol. 1996. V. 5. P. 11-20.

13. Bhattacharyya M.K., Lustig A.J. Telomere dynamics in genome stability // Trends Biochem. Sci. 2006. V. 31. P. 114-122.

14. Blackburn E.H., Challoner P.B. Identification of a telomeric DNA sequence in Trypanosoma brucei // Cell. 1984. V. 36. P. 447-457.

15. Blackburn E.H., Greider C.W., Henderson E., Lee M.S., Shampay J. Recognition and elongation of telomeres by telomerase // Genome. 1989. V. 31. P. 553-560.

16. Blackburn E.H. Structure and function of telomeres // Nature. 1991. V. 350. P. 569-573.

17. Blackburn E.H. Telomerase and cancer // Mol. Cancer Res. 2005. V. 3. P. 477482.

18. Blasco M.A., Gasser S.M., Lingner J. Telomeres and telomerase // Genes Dev. 1999. V. 13. P. 2353-2359.

19. Blocher D., Kunhi M. DNA double-strand break analysis by CHEF (clamped homogeneous electrical field) electrophoresis // Int. J. Radiat. Biol. 1990. V. 58. P. 23-34.

20. Bodnar A.G., Ouellette M., Frolkis M. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells // Sci. 1998. V. 16. P. 349-352.7

21. Bryan T.M., Englezou A., Gupta J., Bacchetti S., Reddel R.R. Telomere elongation in immortal human cells without detectable telomerase activity // EMBO J. 1995. V. 14. P. 4240-4248.

22. Bryan T.M., Marusic L., Bacchetti S., Namba M., Reddel R.R. The telomere lengthening mechanism in telomerase-negative immortal human cells does not involve the telomerase RNA subunit// Hum. Mol. Genet. 1997. V. 6. P. 921-926.

23. Bryan T.M., Reddel R.R. Telomere dynamics and telomerase activity in in vitro immortalised human cells // Eur. J. Cancer. 1997. V. 33. P. 767-773.

24. Carmo-Fonseca M., Mendes-Soares L., Campos I. To be or not to be in the nucleolus // Nature Cell Biology. 2000. V. 2. P. 107-112.

25. Catalan J., Auffray J.C., Pellestor F., Britton-Davidian. Spontaneous occurrence of a Robertsonian fusion involving chromosome 19 by single whole-arm reciprocal translocation (WART) in wild-derived house mice // Chromosome Res. 2000. V. 8. P. 593-601.

26. Cerone M.A., Londono-Vallejo J.A., Bacchetti S. Telomere maintenance by telomerase and by recombination can coexist in human cells // Hum. Mol. Genet. 2001. V. 10. P. 1945-1952.

27. Cerone M.A., Autexier C., Londono-Vallejo J.A., Bacchetti S.A. A human cell line that maintains telomeres in the absence of telomerase and of key markers of ALT // Oncogene. 2005. V. 24. P. 7893-7901.

28. Cervantes R.B., Lundblad V. Mechanisms of chromosome-end protection // Curr. Opin. Cell. Biol. 2002. V. 14. P. 351-356.

29. Chen Q., Ijpma A., Greider C.W. Two survivor pathways that allow growth in the absence of telomerase are generated by distinct telomere recombination events // Mol. Cell. Biol. 2001. V. 21. P. 1817-1827.

30. Chen D., Huang S. Nucleolar components involved in ribosome biogenesis cycle between the nucleolus and nucleoplasm in interphase cells // J. Cell Biol. 2001. V. 153. P. 169-176.

31. Chi J.X., Huang L., Nie W., Wang J., Su В., Yang F. Defining the orientation of the tandem fusions occurred during the evolution of Indian muntjak chromosomes by ВАС mapping // Chromosoma. 2005. V. 114. P. 167-172.

32. Chong L., van Steensel В., Broccoli D., Erdjument-Bromage H., Hanish J., Tempst P., de Lange T. A human telomeric protein // Science. 1995. V. 270. P. 1663-1667.

33. Crabbe L., Karlseder J. In the end, it's all structure // Curr. Mol. Med. 2005. V. 5. P. 29-38.

34. Delany M.E., Daniels L.M., Swanberg S.E., Taylor H.A. Telomeres in the Chicken: Genome Stability and Chromosome Ends // Poultry Science. 2003. V. 82. P. 917-926.

35. Demidov V.V. PNA and LNA throw light on DNA // Trends in Biotechnology. 2003. V. 21. P. 4-7.

36. Der-Sarkissian H., Vergnaud G., Borde Y.M., Thomas G., Londono-Vallejo J.A. Segmental polymorohisms in the proterminal regions of a subset of human chromosomes// Genome Res. 2002. V. 12. P. 1673-1678.

37. Dobigny G., Ozouf-Costaz C., Bonillo C., Volobouev V. "Ag-NORs" are not always true NORs: new evidence in mammals // Cytogenet Genome Res. 2002. V. 98. P. 75-77.

38. Dobigny G., Ozouf-Costaz C., Bonillo C., Volobouev V. Evolution of rRNA gene clusters and telomeric repeats during explosive genome repatterning in TATERILLUS X (Rodentia, Gerbillinae) // Cytogenet Genome Res. 2003. V. 103. P. 94-103.

39. Dundr M., Misteli T. Functional architecture in the cell nucleus // J. Biochemistry. 2001. V. 356. P. 297-310.

40. Dunham M.A., Neumann A.A., Fasching C.L., Reddel R.R. Telomere maintenance by recombination in human cells // Nature Genet. 2000. V. 26. P. 447-450.

41. Fajkus J., Sykorova E., Leitch A.R. Telomeres in evolution and evolution of telomeres // Chrom. Res. 2005. V. 13. P. 467-479.

42. Fan Y., Linardopoulou E., Friedman C., Williams E., Trask B.J. Genomic structure and evolution of the ancestral chromosomal fusion site in 2ql3-2ql4.1 and paralogous regions on other human chromosomes // Genome Research. 2002. V. 12. P. 1651-1662.

43. Faravelli M., Azzalin C.M., Bertoni L., Chernova O., Attolini C. et al. Molecular organization of internal telomeric sequences in Chinese hamster chromosomes // Gene. 2002. V. 23. P. 11-16.

44. Fasching C.L. Bower K., Reddel R.R. Telomerase-independent telomere length maintenance in the absence of alternative lengthening on telomeres-associated promyelocytic leukaemia bodies // Cancer Res. 2005. V. 65. P. 2722-2729.

45. Finato A.O., Varella-Garcia M., Tajara E.H., Taddei V.A., Morielle-Versute E. Intrachromosomal distribution of telomeric repeats in Eumops glaucinus and

46. Euntops perotis (Molossidae, Chiroptera) // Chromosome Res. 2000. V. 8. P. 563-569.

47. Flint J., Craddock C.F., Villegas A., Bentley D.P., Williams H.J., Galanello R., Cao A., Wood W.G., Ayyub H., Higgs D.R. Healing of broken human chromosomes by the addition of telomeric repeats // Am. J. Hum. Genet. 1994. V. 55. P. 505-512.

48. Flint J., Wilkie A.O., Buckle V.J., Winter R.M., Holland A.J. et al The detection of subtelomeric idiopathic mental retardation. // Nat Genet. 1995. V. 9. P. 132140.

49. Flint J., Bates G.P., Clark K., Dorman A., Willingham D., Roe B.A., Micklem G., Higgs D.R., Louis E.J. Sequence comparison of human and yeast telomeres identifies structurally distinct subtelomeric domains // Hum. Mol. Genet. 1997. V. 6. P. 1305-1314.

50. Flint J., Knight S. The use of telomere probes to investigate submicroscopic rearrangements associated with mental retardation // Curr. Opin. Genet. Dev. 2003. V. 13. P. 310-316.

51. Ford L.P., Zou Y., Pongracz K., Gryaznov S.M., Shay J.W., Wright W.E. Telomerase can inhibit the recombination-based pathway of telomere maintenance in human cells // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 32198-32203.

52. Forsyth N.R., Elder F.B., Shay J.W., Wright W.E. Lagomorphs (rabbits, pikas and hares) do not use telomere-directed replicative aging in vitro // Mech. Ageing Dev. 2005. V. 126. P. 685-691.

53. Fumagalli L., Hausser J., Taberlet P., Gielly L., Stewart D. Phyligenetic structures of the Sorex araneus group and its relationships with S. samniticus, as inferred from mt-DNA sequences // Hereditas. 1996. V. 125. P. 191-199.

54. Game J.C. DNA double-strand breaks and the RAD50-RAD57 genes in Saccharomyces // Semin. Cancer Biol. 1993. V. 4. P. 73-83.

55. Garagna S., Broccoli D., Redi C.A., Searle J. В., Cooke H.J., Capanna E. Robertsonian metacentrics of the house mouse lose telomeric sequences but retain some minor satellite DNA in the pericentromeric area // Chromosoma. 1995. V. 103. P. 685-692.

56. Garagna S., Marziliano N., Zuccotti M., Searle J.B., Capanna E., Redi C.A. Pericentromeric organization at the fusion point of mouse Robertsonian translocation chromosomes // Proc. Natl. Acad. Sci. 2001. V. 2. P. 171-175.

57. Go Y., Rakotoarisoa G., Kawamoto Y., Randrianjafy A., Koyama N. et al. PRINS analysis of the telomeric sequence in seven lemurs // Chromosome Res. 2000. V. 8. P. 57-65.

58. Greider C.M., Blackburn E.H. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts // Cell. 1985. V. 43. P. 405-413.

59. Greider C.M., Blackburn E.H. A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis // Nature. 1989. V. 26. P. 331337.

60. Griffith J.D., Comeau L., Rosenfield S., Stansel R.M., Bianchi A., Moss H., de Lange T. Mammalian Telomeres End in a Large Duplex Loop // Cell. 1999. V. 97. P. 503-514.

61. Grobelny J.V., Godwin A.K., Broccoli D. ALT-associated PML bodies are present in viable cells and are enriched in cells in the G(2)/M phase of the cell cycle // J Cell Sci. 2000. V. 113. P. 4577-4585.

62. Grobelny J.V., Kulp-McEliece M., Broccoli D. Effects of reconstitution of telomerase activity on telomere maintenance by the alternative lengthening of telomeres (ALT) pathway // Hum. Mol. Genet. 2001. V. 10. P. 1953-1961.

63. Hall K.J., Parker J.S. Stable chromosome fission associated with rDNA mobility // Chromosome Res. 1995. V. 3. P. 417-422.

64. Hande M.P., Samper E., Lansdorp P., Blasco M.A. Telomere length dynamics and chromosomal instability in cells derived from telomerase null mice // J. Cell. Biol. 1999. V. 22. P. 589-601.

65. Harley C.B. Telomeres and aging // Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1995. P. 247-263.

66. Harper L., Golubovskaya I., Zacheus Cande W. A bouquet of chromosomes // J. Cell Sci. 2004. V. 117. P. 4025-4032.

67. Hartmann N., Scherthan H. Characterization of ancestral chromosome fusion points in the Indian muntjac deer // Chromosoma. 2004. V. 112. P. 213-220.

68. Hausser J., Fumagalli L., Taberlet P. Mitohondrial DNA evolution in shrews. In: Wojcik J.M., Wolsan ML, eds // Evolution of Shrews. Bialowieza, Poland: Mammal Research Institute. 1998. P. 295-308.

69. Hayflick L., Moorhead P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains // Exp. Cell Res. 1961. V. 25. P. 585-621.

70. Hays S.L., Firmenich A.A., Berg P. Complex formation in yeast double-strand break repair: participation of Rad51, Rad52, Rad55, and Rad57 proteins // Proc.Natl. Acad. Sci. USA 1995. V. 92. P. 6925-6929.

71. Henson J.D., Neumann A.A., Yeager T.R., Reddel R.R. Alternative lengthening of telomeres in mammalian cells // Ocogene. 2002. V. 21. P. 598-610.

72. Ijdo J.W., Wells R. A., Baldini A., Reeders S. T. Improved telomere detection using a telomere repeat probe (TTAGGG)n generated by PCR // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 4780.

73. Kalitsis P., Griffiths В., Choo K.H. 2006. Mouse telocentic sequences reveal a high rate of homogenization and possible role in Robertsonian translocation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 8786-8791.

74. Karlseder J., Smogorzevska A., de Lange T. Senescence induced by altered telomere state, not telomere loss // Science. 2002. V. 295. P. 2446-2449.

75. Kamnert I., Lopez C.C., Rosen M., Edstrom J.E. Telomeres terminating with long complex tandem repeats//Hereditas. 1997. V. 127. P. 175-80.

76. Khurts S., Masutomi K., Delgermaa L., Arai K., Oishi N., Mizuno H., Hayashi N., Hahn W. C., Murakami S. Nucleolin interacts with telomerase // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 51508-51515.

77. Kilburn A. E., Shea M. J., Geoffrey S., Wilson J. H. Insertion of a telomere repeat sequence into a mammalian gene causes chromosome instability. // Mol. And Cel. Biol. 2001. V. 1. P. 126-135.

78. Kipling D., Cooke H.J. Hypervariable ultra-long telomeres in mice // Nature. 1990. V. 347. P. 400-402.

79. Kuwano A., Ledbetter S.A., Dobyns W.B., Emanuel B.S., Ledbetter D.H. Detection of deletions and cryptic translocations in Miller-Dieker syndrome by in situ hybridization// Am. J. Hum. Genet. 1991. V. 49. P. 707-714.

80. Lansdorp P.M., Verwoerd N.P., van de Rijke F.M., Dragowska V.,. Little M.T., Dirks R.W., Raap A.K., Tanke H.J. Heterogeneity in telomere length of human chromosomes// Hum. Mol. Genet. 1996. V. 5. P. 685-691.

81. Lansdorp P.M. Major catbacks at chromosome ends // Trends Biochem. Sci. 2005. V. 30. P. 338-395.

82. Le S., Moore J.K., Haber J.E., Greider C.W. RAD50 and RAD51 define two pathways that collaborate to maintain telomeres in the absence of telomerase // Genetics. 1999. V. 152. P. 143-152.

83. Lejnine S., Makarov V.L., Langmore J.P. Conserved nucleoprotein structure at the ends of vertebrate and invertebrate chromosomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 2393-2397.

84. Lengauer C. How to tumors make ends meet? // Proc. Natl. Acad. Sci. 2001. V. 23. P. 12331-12333.

85. Levis R.W., Ganesan R., Houtchens K., Tolar L.A., Sheen F.M. Transposons in place of telomeric repeats at a Drosophila telomere // Cell. 1993. V. 75. P. 10831093.

86. Li Y.C., Lee C., Sanoudou D., Hseu T.N., Li S.Y., Lin C.C. Interstitial colocalization of two cervid satellite DNAs involved in the genesis of the Indian muntjac karyotype// Chromosome Res. 2000. V. 8. P. 363-378.

87. Li Y.C., Lee С., Chang W.S., Li S.Y., Lin C.C. Isolation and identification of a novel satellite DNA family highly conserved in several Cervidae species // Chromosoma. 2002. V. 111. P. 176-183.

88. Linardopoulou E.V., Williams E.M., Fan Y., Friedman C., Young J.M., Trask B.J. Human subtelomeres are hot sport interchromosomal recombination and segmental duplication// Nature. 2005. V. 437. P. 94-100.

89. Liu W.C., Fredga K. Telomeric (TTAGGG)n sequencws are associated with nucleolar organizer regions (NORs) in the wood lemming // Chromosome res. 1999. V. 7. P. 235-240.

90. Lo A.W., Sprung C.N., Fouladi В., Pedram M., Sabatier L., Ricoul M., Reynolds G.E., Murnane J.P. Chromosome instability as a result of double-strand breaks near telomeres in mouse embryonic stem cells // Mol. Cell. Biol. 2002. V. 22. P. 4836-4850.

91. Louis D.J., Vershinin A.V. Chromosome ends: different sequences may provide conserved functions // Bioessays. 2005. V. 27. P. 685-697.

92. Londono-Vallejo J.A., DerSarkissian H., Cazes L., Thomas G. Differences in telomere length between homologous chromosomes in humans // Nucl. Acid. Res. 2001. V. 29. P. 3164-3171.

93. Mann H.B., Whitney D.R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other // Ann. Math. Statist. 1947. V. 18. P. 50-60.

94. Manning E.L., Crosland J., Dewey M.J., Van Zant G. Influence of inbreeding and genetics on telomere length in mice // Mamm. Genom. 2002. V. 13. P. 234238.

95. Marcand S., Gilson E., Shore D. A protein counting mechanism for telomere length regulation in yeast // Science. 1997. V. 275. P. 986-990.

96. Marciniak R.A., Cavazos D., Montellano R., Chen Q., Quarenre L., Johnson B. A novel telomere structure in a human alternative lengthening of telomeres cell line II Cancer Res. 2005. V. 65. P. 2730-2737.

97. Martens U.M., Brass V., Sedlacek L., Pantic M., Exner C., Guo Y., Engelhardt M., Lansdorp P.M., Waller C.F., Lange W. Telomere maintenance in human В lymphocytes// Br. J. Haematol. 2002. V. 119. P. 810-818.

98. Martin C.L., Wong A., Gross A., Chung J., Fantes J.A., Ledbetter D.H. The evolutionary origin of human subtelomeric homologies-or where the ends begin // Am. J. Hum. Genet. 2002. V. 70. P. 972-984.

99. McClintock B. The fusion of broken ends of sister half-chromatids following chromatid break-age at meiotic anaphases // Uni. Mo. Exp. Sta. Res. Bull. 1938. V. 290. P. 1-48

100. McElligott R., Wellinger R.J. The terminal DNA structure of mammalian chromosomes// The EMBO Journal. 1997. V. 16. P. 3705-3714.

101. Mefford H.C., Trask B.J. The complex structure and dynamic evolution of human subtelomeres // Nat. Rev. Genet. 2002. V. 3. P. 91-102.

102. Morales C.P., Holt S.E., Ouellette M., Kaur K.J., Yan Y„ Wilson K.S., White M.A., Wright W.E., Shay J.W. Absence of cancer-associated changes in human fibroblasts immortalized with telomerase // Nat. Genet. 1999. V. 21. P. 115-118.

103. Moyzis R.K., Buckingham J.M., Cram L.S. A highly conserved repetitive sequence, (TTAGGG)n, present at the telomeres of human chromosomes // Proc. Natl. Acad. USA. 1988. V. 85. P.6622-6626.

104. Meyne J., Ratliff R.L., Moyzis R.K. Conservation of the human telomere sequence (TTAGGG)n among vertebrates // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 7049-7053.

105. Minina J.M., Borodin P.M., Searle J.B., Volobouev V.T., Zhdanova N.S. Standard DAPI karyotype of the common shrew Sorex araneus L. (Soricidae, Eulipotyphla) // Russian J. of Teriology. 2007. V. 6. P. 3-6.

106. Modino S., Slijepcevic P. Telomere shortening in mouse strains with constitutional chromosomal aberrations. // Int. J. Radiat. Biol. 2002. V. 78. P. 757-764.

107. Mondello C., Pirzio L., Azzalin C.M., Giulotto E. Instability of interstitial telomeric sequences in the human genom // Genomics. 2000. V. 68. P. 111-117.

108. Muller H.J. The remaking of chromosomes. // The collecting Net. 1938. V. 8. P. 182-195.

109. Nagele R.G., Velasco A.Q., Anderson W.J., McMahon D.J., Thomson Z., Fazekas J., Wind K., Lee H. Telomere associations in interphase nuclei: possible role in maintenance of interphase chromosome topology // J. Cell. Sci. 2001. V. 114. P. 377-388.

110. Nanda I., Schneider-Rasp S., Winking H., Schmid M. Loss of telomeric sites in the chromosomes of Mus musculus domesticus (Rodentia: Muridae) during Robertsonian rearrangements // Chromosome Res. 1995. V. 3. P. 399-409.

111. Nanda I. Scharama D., Feichtinger W., Haaf T. Distribution of telomeric (T2AG3)n sequences in avian chromosomes // Chromosoma. 2002. V. 111. P. 215-227.

112. Narayanan A., Lukowiak A., Jady B.E., Dragon F., Kiss Т., Terns R. M., Terns M. P. Nucleolar localization signals of box H/ACA small nucleolar RNAs // EMBO J. 1999. V. 18. P. 5120-5130.

113. Negi S.S., Olson M.O. Effects of interphase and mitotic phosphorylation on the mobility and location of nucleolar protein B23 // J. Cell. Sci. V. 2006. 119. P. 3676-3685.

114. Nergadze C.G., Rocchi M., Azzalin C.M., Mondello Ch., Giolotto E. Insertion of telomeric repeats at telomeric repeats at intrachromosomal sites during primate evolution// Genome Res. 2004. V. 14. P. 1704-1710.

115. Nielsen P.E., Egholm M., Berg R.H., Buchardt O. Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide//Science. 1991. V. 254. P. 1497-1500.

116. Norrback K.F., Roos G. Telomeres and telomerase in normal and malignant haematopoietic cells // Eur. J. Cancer. 1997. V. 33. P. 774-780.

117. Obe G., Pfeiffer P., Savage J.R. K., Johannes C., Goedecke W., Jeppesen P., Natarajan A.T., Martinez-Lopez W., Folle G.A., Drets M.E. Chromosomal aberrations: formation, identification and distribution // Mutat. Res. 2002. V. 25. P. 17-36.

118. Okazaki S., Ishikawa H., Fujiwara H. Structural analysis of TRAS1, a novel family of telomeric repeat-associated retrotransposons in the silkworm, Bombyx mori // Mol Cell Biol. 1995. V. 15. P. 4545-4552.

119. Olert J., Schmid M. Comparative analysis of karyotypes in European shrew species. I. The sibling species Sorex araneus and S. gemellus: Q-bands, G-bands, and position of NORs // Cytogenet. Cell. Genet. 1978. V. 20. P. 308-322.

120. Olovnikov A. A theory of marginotomy: The incomplete copying of template margin in enzymic synthesis of polynucleotides and biological significance of the phenomenon. // J. Theor. Biol. 1973. V. 14. P. 181-190.

121. Pack S.D., Borodin P.M., Serov O.L., Searle J.B. The X-autosome translocation in the common shrew (Sorex araneus L.): late replication in female somatic cells and pairing in male meiosis I I Chromosoma. 1993. V. 102. P. 355-360.

122. Pearson M., Pelicci P.G. PML interaction with p53 and its role in apoptosis and replicative senescence // Oncogene. 2001. V. 20. P. 7250-7256.

123. Perrem K., Colgin L.M., Neumann A.A, Yeager T.R., Reddel R.R. Coexistence of alternative lengthening of telomeres and telomerase in hTERT-transfected GM847 cells // Mol. Cell. Biol. 2001. V. 21. P. 3862-3875.

124. Perry J., Slater H.L., Choo K.H. Centric fission simple and complex mechanism//Chrom. Res. 2004. V. 12. P. 627-640.

125. Pfeiffer P., Goedecke W., Obe G. Mechanisms of DNA double-strand break repair and their potential to induce chromosomal aberrations // Mutagenesis. 2000. V. 15. P. 289-302.

126. Pich U., Fuchs J., Schubert I. How do Alliaceae stabilize their chromosome ends in the absence of TTTAGGG sequences? // Chromosome Res. 1996. V. 4. P. 207-213.

127. Pich U., Schubert I. Terminal heterochromatin and alternative telomeric sequences in Allium сера // Chromosome Res. 1998. V. 6. P. 315-321.

128. Poon S.S., Martens U.M., Ward R.K., Lansdorp P.M. Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy // Cytometry. 1999. V. 1. P. 267-278.

129. Prowse K.R., Greider C.W. Developmental and tissue-specific regulation of mouse telomerase and telomere length // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 23. P. 4818-4822.

130. Ray A., Norden B. Peptide nucleic acid (PNA): its medical and biotechnical applications and promise for the future // FASEB J. 2000. V. 14. P. 1041-1060.

131. Reddel R.R., Bryan T.M., Murnane J.P. Immortalized cells with no detectable telomerase activity//Biochemistry. 1997. V. 62. P. 1254-1262.

132. Reddel R.R. Alternative lengthening of telomeres telomerase, and cancer // Cancer Lett. 2003. V. 194. P. 155-162.

133. Riethman H., Ambrosini A., Castaneda C., Finklestein J., Hu X.L., Mudunuri U., Paul S., Wei J. Mapping and initial analysis of human subtelomeric sequence assemblies//Genome Res. 2004. V. 14. P. 18-28.

134. Riethman H., Ambrosini A., Paul S. Human subtelomere structure and variation // Chrom. Res. 2005. V. 13. P. 505-515.

135. Rivero M.T., Mosquera A., Goyanes V., Slijepcevic P., Fernandez J.L. Differences in repair profiles of interstitial telomeric sites between normal and

136. DNA double-strand break repair deficient Chinese hamster cells // Exp. Cell Res. 2004. V. 15. P. 161-172.

137. Rogatcheva M.B., Ono Т., Sonta S., Oda S., Borodin P.M. Robertsonian metacentrics of the house musk shrew (Suncus murinus. Insectivora. Soricidae) lose the telomeric sequences in the centromeric area // Genes Genet. Syst. 2000. V.75.P. 155-158.

138. Rousselet J., Monti L., Auger-Rosemberg M.A., Parker J.S., Lemeunier F. Chromosome fission associated with growth of ribosomal DNA in Neodiprion abietis (Hymenoptera: Diprionidae) // Proc. Biol. Sci. 2000. V. 22. P. 1819-1823.

139. Rubtsov N.B., Rubtsova N.V., Anoprienko O.V., Karamisheva T.V., Shevchenko A.Y., Mazurok N.A., Nesterova T.V., Zakian S.M. Reorganization of the X chromosome in voles of the genus Microtus // Cytogenet. Genome Res. 2002. V. 99. P. 323-329.

140. Rudd R.M., Friedman C., Rarghi S.S., Linardopoulou E.V., Trask В.J. Elevated rates of sister Chromatis exchange at chromosome ends // PLoS Genetics. 2007. V. 3. P. 319-323.

141. Rufer N., Dragowska W., Thornbury G., Roosnek E., Lansdorp P.M. Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry//Nat Biotechnol. 1998. V. 16. P. 743-747.

142. Ruiz-Herrera A., Ponsa M., Garcia F., Egozcue J., Garcia M. Fragile sites in human and Macaca fascicularis chromosomes are breakpoints in chromosome evolution// Chromosome Res. 20026. V. 10. P. 33-44.

143. Sabatier L., Ricoul M., Pottier G., Murnane J.P. The loss of a single telomere can result in instability of multiple chromosomes in a human tumor cell line // Mol. Cancer Res. 2005. V. 3. P. 139-150.

144. Saldanha S.N., Andrews L.G., Tollefsbol Т.О. Assessment of telomere length and factors that contribute to its stability // Eur. J. Biochem. 2003. V. 270. P. 389-403.

145. Samper E., Goytisolo F.A., Slijepcevic P., van Buul P.P., Blasco M.A. Mammalian Ku86 protein prevents telomeric fusions independently of the length of TTAGGG repeats and the G-strand overhang // EMBO Rep. 2000. V. 1. P. 244-252.

146. Searle J.В., Fedyk S., Fredga K., Hausser J., Volobuev V.T. Nomenclature for the chromosomes of the common shrew (Sorex araneus) // Mem. Soc. Vaud. Sc. Nat. 1991. V. 19. P. 13-22.

147. Shay J.W., Bacchetti S. A survey of telomerase activity in human cancer // Eur. J. Cancer. 1997. V. 33. P. 787-791.

148. Shore D. Telomeric chromatin: replicating and wrapping up chromosome ends // Curr. Opin. Genet. Dev. 2001. V. 11. P. 189-198.

149. Slijepcevic P., Hande M.P., Bouffler S.D., Lansdorp P., Bryant P.E. Telomere length, chromatin structure and chromosome fusigenic potential // Chromosoma. 1997. V. 106. P. 413-421.

150. Slijepcevic P. Telomeres and mechanisms of Robertsonian fusion // Chromosoma. 1998. V. 107. P. 136-140.

151. Slijepcevic P. Telomere length measurement by Q-FISH // Methods in Cell Science. 2001. V. 23. P. 17-21.

152. Smith S., Giriat I., Schmitt A., de Lange T. Tankyrase, a poly (ADP-ribose) polymerase at human telomeres // Science. 1998. V. 282. P. 1484-1487.

153. Smogorzewska A., van Steensel В., Bianchi A., Oelmann S., Shaefer M.R., Schnapp G., de Lange T. Control of telomere length by TRF1 and TRF2 // Mol. Cell Biol. 2000. V. 20. P. 1659-1668.

154. Steinert S., White, D.M., Zou, Y„ Shay J.W., Wright W.E. Telomere biology and cellular aging in nonhuman primate cells // Exp. Cell Res. 2002. V. 15. P. 146-152.

155. Stewart S.A. Telomere maintenance and tumorigenesis: An "ALT'ernative road // Current Molecular Medicine. 2005. V. 5. P. 253-257.

156. Stindl R. Is telomere erosion a mechanism of species extinction? // J. Experimental Zoology B. Mol. Dev. Evol. 2004. V. 302. P. 111-120.

157. Taberlet P., Fumagalli L., Hausser J. Chromosomal versus mitochondrial DNA evolution: tracking the evolutionary history of the southwestern European populations of the Sorex araneus group (Mammalia, Insectivora) // Evolution. 1994. у. 48. P. 623-636.

158. Takata H., Tanaka Y., Matsuura A. Late S phase-specific recruitment of Mrel 1 complex triggers hierarchical assembly of telomere replication proteins in Saccharomyces cerevisiae// Mol. Cell. 2005. V. 18. P. 573-583.

159. Teng S.C., Zakian V.A. Telomere-telomere recombination is an efficient bypass pathway for telomere maintenance in Saccharomyces cerevisiae // Mol. Cell. Biol. 1999. V. 19. P. 8083-8093.

160. Verma R.S., Babu A. // Human Chromosomes. Principles and Techniques. New York: McGraw-Hill. 1995.

161. Volobuev V., Dutrillaux B. Chromosomal evolution and phylogenetic relationships of the Sorex araneus-arcticus species group // Mem. Soc. Vaud. Sc. Nat. 1991. V 19. P. 131-139.

162. Wang R.C., Smogorzewska A., de Lange T. Homologous recombination generates T-loop sized deletions.at human telomeres // Cell. 2004. V. 29. P. 35536.

163. Warburton P.E. Chromosomal dynamics of human neocentromere formation // Chrom. Res. 2004. V. 12. P. 627-640.

164. Weber В., Allen L., Magenis R.E., Goodfellow P.J., Smith L., Hayden M.R. Intrachromosomal location of the telomeric repeat (TTAGGG)n // Mamm. Genome. 1991. V. 1. P. 211-216.

165. Weipoltshammer К., Schofer С., Almeder M., Philimonenko V. V., Frei К., Wachtler F., Hozak P. Intranuclear anchoring of repetitive DNA sequences: centromeres, telomeres, and ribosomal DNA//J. Cell Biol. 1999. V. 147. P. 14091418.

166. Wijmenga C., Hewitt J.E., Sandkuijl L.A., Clark L.N., Wright T.J. Chromosome 4q DNA rearrangements associated with facioscapulohumeral muscular dystrophy // Nature Genet. 1992. V. 2. P. 26-30.

167. Wojcik J.M., Borodin P.M., Fedyk S., Fredga K., Hausser K. et al. The list of the chromosome races of the common shrew Sorex araneus II Mammalia. 2003. V. 2. P. 169-178.

168. Wong H.P., Slijepcevic P. Telomere length measurement in mouse chromosomes by a modified Q-FISH method // Cytogenet Genome Res. 2004. V. 105. P. 464470.

169. Wright W.E., Tesmer V.M., Huffman K.E., Levene S.D., Shay J.W. Normal human chromosomes have long G-rich telomeric overhangs at one end // Genes Dev. 1997. V. 11. P. 2801-2809.

170. Wright W.E., Shay J.W. Telomere dynamics in cancer progression, and prevention: fundamental differences in human and mouse telomere biology // Nat. Med. 2000. V. 6. P. 849-451.

171. Yeager T.R., Neumann A.A., Englezou A., Huschtscha L.I., Noble J.R., Reddel R.R. Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body // Cancer Res. 1999. V. 59. P. 4175-4179.

172. Zhang S., Hemmerich P., Grosser F. Nucleolar localization of the human telomeric repeat binding factor 2 (TRF2) // J. Cell Sci. 2004. V. 117. P. 3935-3945.

173. Zhong S., Salomoni P., Ronchetti S., Guo A., Ruggero D., Pandolfi P.P. Promyelocytic leukemia protein (PML) and Daxx participate in a novel nuclear pathway for apoptosis // J. Exp. Med. 2000. V. 191. P. 631-640.

174. Zhu L., Hathcock K.S., Hande P., Lansdorp P.M., Seldin M.F., Hodes R.J. Telomere length regulation in mice is linked to a novel chromosome locus // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. V. 21. P. 8648-8653.

175. Zijlmans J.M., Martens U.M., Poon S.S., Raap A.K., Tanke H.J., Ward R.K., Lansdorp P.M. Telomeres in the mouse have large inter-chromosomal variations in the number of T2AG3 repeats // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 8. P. 7423-7428.

176. Zima J., Lukacova L., Macholan M. Chromosomal evolution in shrews // In: Wojcik J.M., Wolsan M., eds. Evolution of Shrews. Bialowieza: Mammal Research Institute. 1998. P. 175-218.