Структурно-функциональная организация хромосом описторхид тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, кандидат биологических наук Задесенец, Кира Сергеевна

• Задесенец, Кира Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Задесенец, Кира Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Семейство Opisthorchiidae (Platyhelminthes, Trematoda).

1.1 Систематическое положение исследованных видов описторхид.

1.1.1 Подсемейство Opisthorchiinae Looss, 1899.

1.1.2 Подсемейство Metorchiinae Lühe, 1909.

1.2. Географическое распространение видов, вовлеченных в исследование.

1.3.1 Яйцо.

1.3.2 Мирацидий.

1.3.4 Церкария.

1.3.5 Метацеркария.

1.3.6 Марита.

1.5. Культивирование трематод.

1.6Хромосомы описторхид.

1.6.1 Методы приготовления хромосомных препаратов описторхид.

1.6.1.1. Приготовление препаратов метафазных хромосом из соматических клеток

1.6.2. Методы дифференциального окрашивания хромосом трематод.

1.6.2.1. С-дифференциальное окрашивание хромосом

1.6.2.2 Окрашивание азотнокислым серебром (AgNOR-бэндинг)

1.6.3 Гибридизация нуклеиновых кислот in situ.

1.6.3.1 Д1 IK-пробы, специфичные повторенным последовательностям

1.6.3.2 Хромосомоспецифичные ДНК-пробы

1.6.3.3 Физическое картирование хромосом трематод с помощью FISH 47 1.7 Кариотипы трематод.

1.7.1 Число хромосом и плоидность генома трематод.

1.7.2 Определение пола у трематод.

1.7.3 В-хромосомы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональная организация хромосом описторхид»

Актуальность работы. Исследование хромосомной организации описторхид является актуальной фундаментальной задачей. Класс трематод, к которому относятся исследованные в настоящей работе виды описторхид, представляет одну из наиболее эпидемиологически значимых групп паразитических червей. В состав данного таксона входит более 16 ООО видов (свыше 140 семейств) паразитов беспозвоночных и позвоночных животных, включая человека (Скрябин, 1950; Gibson et al., 2002). Характерной особенностью трематод является наличие сложного жизненного цикла ди- или триксенного типа, в течение которого происходит чередование бесполого (партеногенетического) и полового поколений. Дефинитивными хозяевами трематод являются пресмыкающиеся, птицы, млекопитающие, в том числе человек.

Особенно стоит выделить виды, образующие так называемую «описторхозную триаду» (О. felineus, О. viverrini, С. sinensis), ареалы инвазии этими паразитами обширны и практически сливаются друг с другом в один крупный очаг. Также паразитозы, вызываемые видами «описторхозной триады», имеют схожую клиническую картину. Кроме того, указанные виды описторхид внесены в список биологических канцерогенов. Самый крупный очаг зараженности О. felineus расположен в Российской Федерации, в Обь-Иртышском бассейне, причем в некоторых его районах уровень инвазии среди местного населения может достигать 100%. Также немаловажно отметить, что ареалы инвазии описторхидами расширяются, возникают новые, что связано преимущественно с миграцией населения.

В связи с этим, описторхиды являются важным и актуальным объектом, полноценное и разностороннее изучение которых будет иметь не только фундаментальное, но и практическое значение, например, при разработке чувствительных и специфичных методов диагностики, а также создания новых лекарственных препаратов.

Кроме того, полноценное изучение описторхид помимо описания их морфологии, жизненного цикла, ареала зараженности, клинической картины вызываемых ими заболеваний, взаимоотношений паразит - хозяин, систем размножения должно включать также детальное изучение их генома. Известно, что геномы не только описторхид, но и трематод в целом, несмотря на сложную программу онтогенеза, относятся к малоразмерным (300-400 МЬ).

Исследование генома описторхид может быть проведено как на хромосомном уровне (цитогенетические методы), так и на молекулярном уровне (полногеномное секвенирование). Стоит отметить, что трематоды до сих пор остаются малоизученным таксоном с точки зрения цитогенетики, а семейство описторхиды является практически неизученным. На сегодняшний день опубликовано большое количество работ, посвященных разностороннему изучению трематод за исключением цитогенетического анализа их хромосом: работ, посвященных цитогенетике трематод крайне мало, для описторхид они и вовсе единичны.

Основной причиной того, что описторхиды, как и все трематоды, не являются малоизученным объектом с точки зрения цитогенетики, является наличие сложного жизненного цикла. На сегодняшний день в лабораториях мира удавалось лишь частично воспроизвести жизненный цикл трематод. В случае с описторхидами это связано с микст-инвазией первого промежуточного хозяина трематод - моллюска, и чрезвычайно низкой частотой заражения моллюсков мирацидиями в лабораторных условиях. Поэтому многие исследователи при изучении трематод работают с их дефинитивными стадиями, а именно маритами. Однако, одним из главных вопросов, которые встают перед исследователем при работе с хромосомами не только описторхид, но и трематод в целом, является следующий: какую ткань или орган мариты следует брать для приготовления хромосомных препаратов и каким образом фиксировать выбранный материал? Для ответа на этот вопрос было целесообразно провести комплексный микроскопический анализ, который предварял исследование непосредственно самих хромосом описторхид. Главной целью подготовительного этапа является поиск тканей или органов мариты описторхид, которые характеризуются высоким митотическим или мейотическим индексом.

Традиционно изучение кариотипа любого биологического объекта начинается с применения классических методов цитогенетики, таких как С-дифференциалыюе окрашивание, А§>Ю11-бэндинг и др. С помощью данных методов возможно выполнить изучение общей организации кариотипа исследуемых видов, а именно: описать морфологию и число хромосом в кариотипе, выявить полиморфизм хромосом внутри популяции или между ними, определить локализацию и размер блоков конститутивного гетерохроматина, ЯО районов. Цитогенетический анализ более высокого уровня разрешения проводится на пахитенных хромосомах или фибриллах ДНК с привлечением молекулярно-цитогенетических методов, таких как FISH. Следующим этапом является проведение сравнительного анализа описанных кариотипов исследуемых видов. Важно отметить, что сравнительный анализ хромосом не только у описторхид, но и у трематод в целом, проводился в единичных работах и включал в себя лишь сравнение хромосомных чисел и морфологии хромосом. Цитогенетика трематод является слабо изученной областью: в истории цитогенетики данного таксона больше всего исследований было посвящено изучению хромосом шистосоматид. До проведения настоящей работы для описторхид были известны лишь хромосомные числа для нескольких видов и проведено дифференциальное окрашивание хромосом только одного из них (О. viverrini).

Таким образом, в связи с высокой значимостью изучения цитогенетики описторхид, были сформулированы цели и задачи настоящего исследования. Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы является изучение особенностей структурно-функциональной организации хромосом описторхид. В связи с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1 Разработать методы приготовления препаратов митотических и мейотических (в том числе пахитенных) хромосом из марит описторхид (Opisthorchis felineus, Opisthorchis viverrini, Metorchis xanthosomus, Metorchis bilis, Clonorchis sinensis);

2 Провести цитогенетический анализ хромосом описторхид с использованием методов дифференциального окрашивания и гибридизации in situ: а) выполнить морфометрический анализ хромосом описторхид; б) провести дифференциальное окрашивание хромосом исследуемых видов описторхид (С- и AgNOR-окрашивание); в) получить микродиссекционные ДНК-пробы, специфичные хромосомам 1 и 2 О. felineus и М. xanthosomus; г) изучить локализацию кластеров (рДНК, теломерные повторы) и распределение диспергированных последовательностей в хромосомах описторхид.

3 Выполнить сравнительный межвидовой анализ хромосом исследуемых видов описторхид.

Научная новизна

При изучении структурно-функциональной организации хромосом описторхид были использованы морфометрические и молекулярно-цитогенетические методы, в результате которых впервые:

• дано описание кариотипа М. bilis;

• показано, что кариотип С. sinensis из Дальнего Востока РФ содержит 7 пар хромосом;

• проведен морфометрический анализ хромосом М. bilis, М. xanthosomus;

• изучена локализация ЯО районов и С-позитивных блоков в хромосомах описторхид;

• получены микродиссекционные ДНК-пробы для хромосом описторхид;

• показано наличие хромосомоспецифичных кластеров повторенных последовательностей в хромосомах у плоских червей (у О. felineus и М. xanthosomus);

• определена локализация рДНК в хромосомах описторхид;

• установлено, что кластеры теломерной ДНК у описторхид состоят из повторов (TTAGGG)n и локализованы тольков в теломерных районах хромосом;

• построены идиограммы мелких пахитенных хромосом описторхид.

Теоретическая и практическая значимость

Результаты, полученные при проведении комплексного микроскопического анализа мариты кошачьей двуустки, дополняют уже имеющиеся данные по морфологии трематод и могут быть использованы в курсе лекций по паразитологии. Данные, полученные при проведении цитогенетического анализа хромосом описторхид, являются весомым вкладом в столь мало изученную область и паразитологии как цитогенетика трематод. Впервые полученные в настоящей работе пахитенные хромосомы не только для описторхид, но и для трематод в целом, позволили провести сравнение хромосомной организации у описторхид на высоком уровне разрешения; полученные при этом данные являются не только оригинальными, но и одними из первых в сравнительной цитогенетике трематод. Разработка метода приготовления пахитенных хромосом станет мощным инструментом в руках исследователей, как в области сравнительной цитогенетики, так и при проведении полногеномного секвенирования описторхид на этапе финальной сборки генома. Положения, выносимые на защиту

1) В ходе кариотипической эволюции внутри семейства Opisthorchiidae (О. felineus,

О. viverrini, М. bilis, М. xanthosomus) имели место внутрихромосомные перестройки.

2) Хромосомы описторхид имеют единственный кластер рибосомных генов, состоящий из двух GC-богатых субблоков, разделенных АТ-богатым участком.

3) Теломерная ДНК описторхид представлена мотивом (TTAGGG)n и локализована только на концах плеч всех хромосом. В хромосомах описторхид интерстициальные кластеры теломерной ДНК отсуствуют.

4) У представителей плоских червей (описторхид), впервые было показано наличие хромосомоспецифичных кластеров повторенных последовательностей.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на следующих конференциях и сессиях:

1. Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления "Живые системы" 25-27 ноября 2009г. Москва.

2. III Межрегиональная конференция паразитологов Сибири и Дальнего Востока, посвященная 80-летию профессора К.П.Федорова. // 15-20 сентября 2009 г. Новосибирск; th

3. 7 International conference on bioinformatics of genome regulation and structure/system biology (BGRS/SB'2010). // 20-27 июня 2010 г. Новосибирск;

4. V Международная конференция по кариосистематике беспозвоночных животных (KARYO V). // 16-20 августа 2010 г. Новосибирск;

5. Международная научная конференция "Теоретические и практические проблемы паразитологии"// 30 ноября - 3 декабря 2010 г. Москва; th

6. 18 International Chromosome Conference (18 ICC)// 29 августа - 2 сентября 2011 г. Манчестер, Великобритания;

7. Отчетная сессия ИЦИГ СО РАН, 26 марта - 3 апреля 2012 г, Новосибирск; th

8. 8 International conference on bioinformatics of genome regulation and structure\system biology (BGRS/SB'2012). // 25-29 июня 2012 г. Новосибирск;

9. Международная конференция "Хромосома 2012" // 2-7 сентября 2012 г. Новосибирск.

10. Международная конференция "Современные проблемы общей паразитологии". // 30 октября - 1 ноября 2012 г. Москва.

Публикации

1. Zadesenets K.S., Katokhin A.V., Mordvinov V.A., Rubtsov N.B. Telomeric DNA in chromosomes of five opisthorchid species. // Parasitology International. 2012. 61(1). P.81-83.

2. Zadesenets K.S., Karamysheva T.V., Katokhin A.V., Mordvinov V.A., Rubtsov N.B. Distribution of repetitive DNA sequences in chromosomes of five opisthorchid species (Trematoda, Platyhelminthes). // Parasitology International. 2012.61(1). P. 84-86.

3. Zadesenets K.S., Katokhin A.V., Mordvinov V.A., Rubtsov N.B. Comparative cytogenetics of opisthorchid species (Trematoda, Opisthorchiidae). // Parasitology International. 2012. 61(1). P. 87-89.

4. Богомолов А.Г., Задесенец K.C., Карамышева T.B., Подколодный H.JI., Рубцов Н.Б. Визуализация хромосомоспецифичных последовательностей ДНК при проведении FISH микродиссекционных ДНК-проб с метафазными хромосомами. // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2012. - 16(2). -С. 202-211.

Тезисы конференций

1. Мордвинов В.А., Катохин А.В., Брусенцов И.И., Романов К.В., Шеховцов С.В., Татьков С.И., Фурман Д.П., Сивков А.Ю., Помазной М.Ю., Львова М.Н., Шаманина М.Ю., Задесенец К.С., Рубцов Н.Б. Исследование генетического разнообразия возбудителей биогельминтозов человека, передающихся через рыбу, ракообразных и продукты их переработки. // Итоговая конференция по приоритетному направлению "Живые системы". Москва, 2009.

2. Задесенец К.С., Карамышева Т.В., Рубцов Н.Б., Катохин А.В., Мордвинов В.А. Молекулярно-цитогенетический анализ хромосом видов Opistorchis felineus и Metorchis xanthosomus. II III Межрегиональная конференция паразитологов Сибири и Дальнего Востока, посвященная 80-летию профессора К.П.Федорова. Новосибирск, 2009.

3. Rubtsov N.B., Zadesenets K.S. Chromosome organization in the Opisthorchiidae tVi

Trematoda). // 7 International conference on bioinformatics of genome regulation and structure\system biology (BGRS/SB'2010). Novosibirsk, 2010.

4. Задесенец K.C., Карамышева T.B., Рубцов Н.Б., Катохин А.В., Мордвинов В.А. Хромосомы описторхид (Trematoda, Opisthorchiidae). // V Международная конференция по кариосистематике беспозвоночных животных (KARYO V). Новосибирск, 2010.

5. Задесенец К.С., Карамышева Т.В., Катохин А.В., Мордвинов В.А., Рубцов Н.Б. Анализ распределения повторенных последовательностей в хромосомах О. felineus и М. xanthosomus. II Международная научная конференция "Теоретические и практические проблемы паразитологии". Москва, 2010.

6. Zadesenets K.S., Karamycheva T.V., Katokhin A.V., Mordvinov V.A., Rubtsov N.B. Chromosomes of five species of liver flukes (Platyhelminthes, Trematoda). // Manchester, UK, 2011.

7. Pakharukova M.Y., Ershov N.I., Vavilin V.A., Zadesenets K.S., Katokhin A.V.,

Merkulova T.I., Mordvinov V.A. Organization of xenobiotic-metabolizing system h phase 1 in Opisthorchis felineus (Trematoda, Platyhelminthes). //12 International Symposium on Flatworm Biology. Stockholm, Sweden, 2012.

8. Bogomolov A.G., Zadesenets K.S., Karamysheva T.V., Podkolodyy N.L., Rubtsov N.B. Fluorescence in situ hybridization with chromosome-derived DNA probes on Opisthorchis felineus and Metorchis xanthosomus chromosomes without suppression of repetitive DNA sequences. // 8th International conference on bioinformatics of genome regulation and structure\system biology (BGRS/SB'2012). Novosibirsk, 2012.

9. Задесенец K.C., Карамышева T.B., Катохин A.B., Мордвинов В.А., Рубцов Н.Б. Структурно-функциональная организация хромосом описторхид (Platyhelminthes, Trematoda). // Хромосома - 2012. Новосибирск, 2012.

10. Задесенец К.С., Дюкалова М.Б., Виноградова М.С., Катохин А.В., Мордвинов В.А., Рубцов Н.Б. Комплексный микроскопический подход в изучении морфологии кошачьей двуустки Opisthorchis felineus (Rivolta, 1884). // Современные проблемы общей паразитологии. Москва, 2012. t

По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из них 10 работ - в виде тезисов и материалов к конференциям, и 4 статьи, из которых 3 в зарубежной печати.

Вклад автора

Автор принимал непосредственное участие в планировании и проведении всех экспериментов, получении и интерпретации результатов.

Работа, посвященная комплексному микроскопическому анализу мариты описторха выполнялась совместно с: д.б.н. М.С. Виноградовой и студенткой 5-го курса НГУ М.Б. Дюкаловой (гистологическое и гистохимическое изучение описторха), к.б.н. С.И. Байбородиным (лазерная сканирующая микроскопия).

Получение микродиссекционных ДНК-проб проводилось совместно с к.б.н. Т.В. Карамышевой и д.б.н. Н.Б. Рубцовым.

Большая часть экспериментов проведена автором самостоятельно.

Заключение диссертации по теме «Клеточная биология, цитология, гистология», Задесенец, Кира Сергеевна

выводы

1. В результате проведения цитогенетичеекого анализа хромосом описторхид с использованием методов дифференциального окрашивания и флуоресцентной гибридизации in situ было показано:

- кариотип С. sinensis из Дальнего Востока РФ представлен 2п=14, образован двумя парами крупных метацентрических хромосом и пятью парами мелких хромосом (субмета-, мета- и акроцентрических);

- кариотип М. bilis (2п=14) представлен, двумя парами крупных метацентрических хромосом и пятью парами субмета- и акроцентрических хромосом;

- наличие узких С-позитивных блоков в прицентромерных районах всех хромосом исследованных видов описторхид, интерстициальные (у О. felineus, M. xanthosomus) и прителомерные (у всех видов) С-позитивные блоки; обнаружено наличие одного транскрипционно активного ЯО района в одной из мелких хромосом у всех изученных видов описторхид;

- кластер рДНК расположен в терминальной части q-плеча хромосомы 3 у исследованных видов описторхид и представлен двумя субблоками, локализованными в GC-богатых районах; показано, что теломерная ДНК описторхид (TTAGGG)n локализована только в теломерных районах их хромосом;

- наличие кластеров хромосомоспецифичных повторов для хромосом 1 и 2 О. felineus и М. xanthosomus; показано, что хромосомы описторхид, несмотря на небольшой размер их генома, содержат большое количество диспергированных повторов;

2. Проведение морфометрического анализа хромосом описторхид позволило установить, что их кариотипы обладают схожей морфологией и имеют одинаковое хромосомное число (2п=14) за исключением виверровой двуустки О. viverrini (2п=12), в кариотипе которой присутствует метацентрическая хромосома средних размеров;

3. Разработанный метод приготовления препаратов пахитенных хромосом позволил впервые предложить номенклатуру хромосом для описторхид (О. felineus, О. viverrini, М. xanthosomus, М. bilis). Сравнительный анализ хромомерной организации мелких хромосом описторхид (О. felineus, О. viverrini, М. bilis, М. xanthosomus) выявил наличие видоспецифических внутрихромосомных перестроек (преимущественно перицентрических инверсий). Установлено, что хромосома 3 виверровой двуустки О. viverrini возникла в ходе слияния хромосом 3 и 7 возможного предкового кариотипа описторхид.

115

Заключение

Плоские черви являются примитивными беспозвоночными животными с билатеральной симметрией тела. Среди представителей данного типа встречаются как свободноживущие, так и паразитирующие черви. В состав типа Плоские черви входят трематоды, или дигенетические сосальщики. Их сложный жизненный цикл протекает со сменой хозяев и жизненных стадий, каждая из которых имеет выраженные адаптативные особенности, позволяющие выживать в различных условиях окружающей среды. При этом размер генома, в котором зашифрована сложная программа онтогенеза трематод, невелик (около 300-400 м.п.н.). Перед исследователями давно стоял вопрос: каким образом организован геном у плоских червей? Первые попытки разобраться с этим вопросом были начаты при проведении классических описаний кариотипов у трематод. На сегодняшний день общее описание кариотипа, включающее определение числа хромосом, их морфологии, выполнено примерно для 230 видов, в то время как класс трематод включает в себя около 16 тыс. видов дигенетических сосальщиков. Особого внимания заслуживают представители семейства Ор1вИюгс1ш(1ае, которые занимают среди трематод особое положение, так как являются эпидемиологически значимыми видами и отличаются высокой экологической пластичностью. В связи с этим изучение жизненного цикла, ареала распространения, морфологии, патофизиологических процессов, протекающих при заражении хозяина, посвящены многочисленные исследования. Однако виды данной таксономической группы с точки зрения цитогенетики изучены слабо: классические описания кариотипа были проведены лишь для пяти видов. Причин, по которым трематоды не являются распространенным объектом для изучения в цитогенетике, несколько: ограниченное количество материала для приготовления хромосомных препаратов, отсутствие клеточных культур, малый размер хромосом. До сих пор во всех работах источником хромосомного материала служили преимущественно партениты, ткани которых характеризовались высоким митотическим индексом. В случае с описторхидами использование данного подхода проблематично: у моллюсков, в которых развиваются партениты, часто встречается микст-инвазия. Решением проблемы приготовления хромосомных препаратов описторхид остается лишь оптимизация метода приготовления хромосомных препаратов из марит. Для того чтобы определить какую ткань или орган следует взять при приготовлении препаратов митотических и мейотических хромосом, необходимо провести микроскопический анализ морфологии мариты, ее отдельных органов и тканей.

Соответственно, изучение морфологии и структурно-функциональной организации хромосом описторхид должно включать в себя следующие этапы:

• оптимизация методов приготовления препаратов митотических и мейотических хромосом;

• описание кариотипа исследуемого вида, включающее определение числа хромосом, описание их морфологии и проведение их морфометрии;

• проведение и анализ дифференциального окрашивания хромосом, а именно: определение локализации районов, содержащих кластеры повторенных последовательностей (рДНК, кластеры повторов, формирующих С-позитивные блоки);

• проведение сравнительного анализа хромосом близкородственных видов описторхид;

• анализ распределения в хромосомах кластеров эволюционно значимых повторенных последовательностей, таких как теломерные повторы, рДНК, с использованием гибридизации in situ;

• получение и использование хромосомоспецифичных и районоспецифичных ДНК-проб в гетерологичной гибридизации для выявления внутри- и межхромосомных перестроек;

• построение физических карт хромосом описторхид с помощью гибридизации клонированных последовательностей и последующее проведение сравнительного анализа физических карт хромосом разных видов описторхид;

• секвенирование геномов описторхид с дальнейшей сборкой их геномов с привлечением данных по локализации их уникальных последовательностей;

• проведение сравнительного геномного анализа описторхид с использованием данных по секвенированию их геномов.

Следует отметить, что при выполнении перечисленных выше работ может возникнуть ряд серьезных проблем, связанных с особенностями изучаемого объекта. До сих пор не было получено положительных результатов при использовании методов дифференциального окрашивания С-негативных районов хромосом трематод (G-, R-, Q-бэндинг) и хромосом других видов, имеющих близкие по размеру геномы. Также не были разработаны: методы получения клеточных культур трематод; методы получения препаратов хромосом, позволяющие проводить цитогенетический анализ на высоком уровне разрешения; способы наработки достаточного количества геномной ДНК трематод для получения Cotl/2-ДНК, которая необходима для подавления гибридизации повторенных последовательностей при проведении CISS-гибридизации. Альтернативой использованию G-, R-, Q-бэндинга может быть получение и анализ пахитенных хромосом изучаемых видов. К сожалению, на сегодняшний день не существует разработанных методов получения пахитенных хромосом не только для описторхид, но и для Плоских червей в целом. Разработка методов приготовления препаратов пахитенных хромосом описторхид позволила бы единовременно решить проблему проведения цитогенетического анализа на высоком уровне разрешения. Кроме того, на сегодняшний день отсутствуют библиотеки космид, фосмид и ВАС-клонов, содержащие фрагменты ДНК описторхид.

В то же время отсутствие большого количества делящихся клеток не только у описторхид, но и трематод в целом, является ограничением использования хромосомного сортинга для получения хромосомоспецифичных ДНК-проб; единственной возможностью получения таких ДНК-проб является проведение микродиссекции с последующей амплификацией ДНК собранного материала индивидуальных хромосом. Также необходим подбор условий проведения FISH хромосомоспецифичных ДНК-проб с хромосомами описторхид без супрессии повторяющихся последовательностей ДНК избытком Cot 1/2-ДНК.

В настоящей работе, посвященной изучению хромосомной организации у описторхид, найдены решения проблем, связанных с получением хромосомных препаратов из марит описторхид; особенностями проведения методов дифференциального окрашивания; получения хромосомоспецифичных ДНК-проб, проведения FISH с ними. Полученные данные обеспечат базу для проведения дальнейших исследований по построению физических карт хромосом описторхид, необходимых для успешного завершения полного секвенирования их геномов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Материалы 2.1.1 Реактивы

AgN03 - «Реахим» Ва(ОН)2 - «Реахим»

BSA (бычий сывороточный альбумин )— «Fluka» СС14 - «Реахим» DAPI — «Sigma»

О.С.Т. médium (Optimal Cutting Temperature médium) - «Sakura»

PB S (фосфатный буфер) - «Amresco»

SDS (додецил сульфат натрия) — «Serva»

Tween 20 (полиоксиэтиленсорбитан монолаурат) — «Amresco»

Амберлитовая смола для деионизации формамида — «Sigma»

Антифейд - «VECTASHIELD, Vector Laboratories »

Глицерин - «Fluka»

Декстран сульфат - «Pharmacia»

Диметилдихлорсилан - «Fluka»

Желатин - «Serva»

Колхицин — «Sigma»

Краситель Гимза — «Sigma»

Культуральная среда RPMI - «Sigma»

Метанол 100% - «Вектон»

Муравьиная кислота - «Реахим»

Набор реактивов для проведения ПЦР — «Fermentas»

Пентоксирезоруфин - «Sigma»

Уксусная кислота - «Реахим»

Формальдегид - «Amresco»

Формамид - «Sigma»

ЭДТА (динатриевая соль этилендиаминтетрауксуной кислоты) — «Amresco» Этанол 100% - перегнанный Этидиум бромид — «Sigma»

Реактивы для проведения гистологических и гистохимических окрашиваний -«Реахим»

2.1.2 Ферменты и коныогаты

Биотинилированный дезоксиуридинтрифосфат (биотин-16-дУТФ) — «Медиген» Биотинилированная (CCCTAA)3-PNA-npo6a - «Applied Biosystems» Дигоксигенин-11-дУТФ — «Roche»

ChromaTide®Alcxa Пиог488-5-дУТФ - «Molecular Probes»; авидин-А1еха488 -«Molecular Probes»

Антитела овцы к дигоксигенину, коньюгированные с родамином (Rho) - «Roche» Панкреатическая РНКаза А - «Fluka»; пепсин — «Sigma»

2.1.3 Растворы и буферы

3 M ацетат натрия

ГС (гибридизационная смесь): 50 % формамид, 2XSSC, 1 % Tween 20, 10 % декстран сульфат

Гипотонический раствор 1 - 0,05 М; гипотонический раствор 2 - 0,075 M KCl lxPBS (фосфатный буфер): 137 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 10 мМ Na2HP04, pH 7,4 20xSSC: 3 M NaCl, 0,3 M C6H5Na307 (цитрат натрия), pH 7,0 50xTAE: 2 M Трис, 0,5 мМ ЭДТА, pH 8,0

2.1.4 Мариты описторхид

В настоящей работе проводилось изучение хромосомной организации пяти видов описторхид: О. felineus, О. viverrini, M. xanthosomus, M. bilis, С. sinensis (Таблица 2.1; Приложение 1 Рисунок 1).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Задесенец, Кира Сергеевна, 2013 год

1. Ахметов, К.К. Функциональная морфология кожно-мускульного мешка и пищеварительной системы трематод различных таксономических и экологических групп: автореф. дис.докт. биол. наук. / К.К. Ахметов -Алматы, 2004. 53 с.

2. Баршене, Я.В. Кариотипы трематод / Я.В. Баршене. Вильнюс: "Academia", 1992.-371 с.

3. Беэр, С.А. Биология возбудителя описторхоза / CA. Беэр. М. : Товарищество научных изданий КМК. - 2005. - 336 стр.

4. Близнюк, И.Д. Экспериментальное заражение рыб свободноплавающими церкариями кошачьей двуустки / И.Д. Близнюк // Вестник зоологии. 1969. -№3. - С.76-79.

5. Богомолов, А.Г. Визуализация хромосомоспецифичных ДНК при проведении FISH микродиссекционных ДНК-проб с метафазными хромосомами / А.Г. Богомолов и др. // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2012. - 16(2). -С. 202-211

6. Брусенцов, И.И. ДНК-диагностика микст-инвазий Opisthorchis felineus и Metorchis bilis с помощью метода ПЦР. / И.И. Брусенцов и др. // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2010. - №2. - С. 10-13.

7. Гинецинская, Т.А. Трематоды их жизненные циклы, биология и эволюция / Т.А. Гинецинская. JI.: Наука, 1968. - 411 с.

8. Гребенщиков, В.М. Микроморфологические и гистохимические исследования половой системы и гаметогенеза некоторых трематод в норме и при действииантгельминтиков: дис. канд.биол. наук. / В.М. Гребенщиков. Кемерово,1984. 190 с.

9. Дроздов, В.Н. О способах проникновения личинок описторхиса в рыб / В.Н. Дроздов // Зоологический журнал. 1965. - Т.44. Вып.9. - С. 1405-1406.

10. Жданова, Н.С. Картирование хромосом свиньи (Sus scrofa Dom.L.) на основе межвидовых гибридов соматических клеток: дисс. .докт. биол. наук. / Н.С. Жданова. Новосибирск, 2002. - 245 с.

11. Звягина, В.В. Начева J1.B. Состояние гликогена в органах и тканях метацеркарий Opistorchis felineus. / B.B. Звягина, JI.B. Начева // Мед паразитология. 1993. - №5. - С.23-26.

12. Ильинских, E.H. Актуальные вопросы изучения проблемы описторхоза в Сибири / E.H. Ильинских // Бюллетень сибирской медицины. 2002. - № 1. - С. 63-70.

13. Ильинских, И.Н. Инфекционная кариопатология / И.Н. Ильинских и др. -Томск : Издательство Томского университета, 2005. 168 с.

14. Куперман, Б.И. Ультраструктура взрослых трематод Opisthorchis felineus / Б.И. Куперман, А.Г. Гиновкер, A.B. Володин, Л.Г. Поддубная, В.В. Кривенко // Доклады Академии наук СССР. 1991. - Т.317. №2. - С. 462-464.

15. Лилли, Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия / Р. Лилли // М.: Издательство "Мир", 1969. 645 с.

16. Маниковская, Н.С. Морфофункциональные особенности пищеварительной системы трематод при формировании системы "паразит-хозяин": автореф. дис. . канд. биол. наук/ Н.С. Маниковская. М., 2005. - 169 с.

17. Мясоедов, B.C. Эпидемиология описторхоза / B.C. Мясоедов. Томск, 1960. -100 с.

18. Начева, Л.В. Морфоэкологический анализ и эволюционная динамика тканевых систем трематод, реактивность органов и тканей при действии антигельминтиков: автореф. дис. . докт. биол. наук / Л.В. Начева. М., 1993. -57 с.

19. Прокофьева-Бельговская, A.A. Гетерохроматические районы хромосом / A.A. Прокофьева-Бельговская. М.: Наука, 1986. 430 с.

20. Размашкин, Д.А. О видовой принадлежности метацеркарий рода Metorchis (Trematoda, Opisthorchidae) из рыб Западной Сибири / Д.А. Размашкин // Паразитология. 1978. - Вып. 12. № 1. - С. 68-78.

21. Романенко, J1.H., Морфология хромосом Opisthorchis felineus (Rivolta, 1884) / JI.H. Романенко // материалы научной конференции Всес. общества гельминтологов. Москва, 1973. - Вып. 25. - С. 183-188.

22. Трехмерная организация интерфазных ядер фибробластов у двух близкородственных видов бурозубок, различающихся структурой терминальных районов хромосом / Н.Б. Рубцов, Т.В. Карамышева, Ю.М. Минина, Н.С. Жданова. // Цитология. 2008. - 50(5). - С. 430-438.

23. Скрябин, К.И. Трематоды животных и человека / К.И. Скрябин. М. : Изд-во академии наук СССР, 1950. - Т.4. - Стр. 81-329.

24. Шульман, Е.С. Материалы по изучению метацеркариев О. felineus / Е.С. Шульман, Г.М. Старобинец, А.А. Лапина // Проблемы паразитологии: тез. докл. 4-ой научн. конф. паразитологов УССР. Киев, 1997.- С.297-298.

25. Шустов, А.И. Необычная локализация метацеркариев описторхиса / А.И. Шустов, Т.А. Середина. // Мед. паразитология. 1977. - Т.46. №2. - С. 233-234.

26. Юрлова, Н.И. Обская болезнь / Н.И. Юрлова // Наука из первых рук. 2008. -№2.-С. 12-21.

27. Adiyodi, K.G. Accessory sex glands / K.G. Adiyodi, R.G. Adiyodi // Reproductive biology of invertebrates. Vol. 3. 1988. - 542 p.

28. Armignacco, O. Human illnesses caused by Opisthorchis felineus flukes, Italy / O. Armignacco et al. // Emerging Infectious Diseases. 2008. - Vol. 14. No. 12. - P. 1902-1905.

29. Beukeboom, L.W. Reproductive modes, ploidy distribution, and supernumerary chromosome frequencies of the flatworm Polycelis nigra (Platyhelminthes:

30. Tricladida) / L.W. Beukeboom, T.F. Sharbel, N.K. Michiels // Hydrobiologia. 1998. - 383.-P. 277-285.

31. Blair, D. Paragonimiasis and the genus Paragonimus / D. Blair, Z.-B. Xu, T. Agatsuma // Adv. Parasitol. 1998. - 42. - P. 113-222.

32. Bouvard, V. A review of human carcinogens Part B: biological agents / V. Bouvard et al. // Lancet Oncol. - 2009. - 10(4). - P.321-322.

33. Breen, M. Reciprocal chromosome painting reveals detailed regions of conserved synteny between the karyotypes of the domestic dog (Canis familiaris) and human / M. Breen et al. // Genomics. 1999. - 61(2). - P. 145-155.

34. Britt, H.B. Chromosomes of digenetic trematodes / H.B. Britt // The American Naturalist. 1947. - Vol. 81. No. 799 - P. 276-296.

35. Brooks, D.R. Phylogenetic analysis of the Digenea (Platyhelminthes: Cercomeria) with comments on their adaptive radiation / D.R. Brooks, R.T. O'Grady, D.R. Glen // Can J Zool. 1985.- 63.-P. 411-443.

36. Burt, D.W. Origin of avian microchromosomes / D.W. Burt // Cytogenet Genome Res. 2002. - 96. - P.97-112.

37. Cabrero, J. Multiregional origin of B chromosomes in the grasshopper Eyprepocnemis plorans / J. Cabrero et al. // Chromosoma. 2003. - 112. - P. 207211.

38. Cameron, T.W.M. Parasites carried by fresh-water fish / T.W.M. Cameron // Canadian Journal of Comparative Medicine. 1945. - 9(11). - P. 302-312.

39. Cernyavsky, F.B., Kozlovsky A.I. Species status and history of the arctic lemmings (Dicrostonyx, Rodentia) of the Wrangel Island / F.B. Cernyavsky, A.I. Kozlovsky // Zool Zh. 1980. - 59. - P. 266-273.

40. Chai, J-Y. Fish-borne parasitic zoonoses: status and issues / J-Y Chai, K.D. Murrell, A.J. Lymbery // International Journal Parasitology. 2005. - 35. - P.1233-1254.

41. Cho, H. Studies on the chromosomes of parasitic helminthes. (1). Chromosomes in meiocytes, spermiogenesis and fertilization observed by means of a squash method in

42. Clonorchis sinensis (Trematoda: Opisthorchiidae) / H. Cho // Jpn J Parasitol. 1978. -27.-P. 399-410.

43. Chowdhary, B.P. Mapping genomes at the chromosome level / B.P. Chowdhary, T. Raudsepp // Mammalian genomics. Edit, by A. Ruvinsky and J.A. Graves . CABI International. UK. 2005. Chapter 2. - P. 23-67.

44. Cox, D.R. Radiation hybrid mapping: a somatic cell genetic method for constructing high-resolution maps of mammalian chromosomes / D.R. Cox et al. // Science. -1990. Vol. 250. - P. 246-250.

45. Criscione, C.D. Genomic linkage map of the human blood fluke Schistosoma mansoni / C.D. Criscione et al. // Genome Biology. 2009. - 10: R71.

46. Ditrich, O. Species determination of eggs of opisthorchiid and heterophyid flukes using scanning electron microscopy / O. Ditrich, M. Giboda, J. Sterba. // Angew Parasitol. 1990.-31.-P. 3-9.

47. Dobigny, G. "AgNORs" are not always true NORs: new evidence in mammals / G. Dobigny, C. Ozouf-Costaz, C. Bonillo, V. Volobuev //Cytogenet Genome Res. -2002. 98. - P. 75-77.

48. Dong, H. Studies on the silver-stained nucleolar organizer region associated protein cultured cells from Schistosoma japonicum / H. Dong et al. // Chinese Journal of Zoonoses. 2004-06.

49. Dudits, D. Fusion of human cells with carrot protoplasts induced by polyethylene glycol / D. Dudits, I. Rasko, GY. Hadlaczky, A. Lima-De-Faria. // Hereditas. 1976. -82.-P. 121-124.

50. Dutrillaux, B. Very large analogy of chromosome banding between Cebus capucinus (Platyrrhini) and man / B. Dutrillaux // Cytogenet Cell Genet. 1979. - 24(2). - P. 8494.

51. Ersfeld, K. Fiber-FISH: fluorescence in situ hybridization on stretched DNA / K. Ersfeld // Methods in Molecular Biology. 2004. - 270. - P. 395-402.

52. Ferguson-Smith, M.A. Mammalian karyotype evolution / M.A. Ferguson-Smith, V. Trifonov // Nat Rev Genet. 2007. - 8(12). - P. 950-962.

53. Fillon, V. The chicken as a model to study microchromosomes in birds: a review / V. Fillon // Genet Sel Evol. 1998. - 30. - P. 209-219.

54. Gibson, D.I. Keys to the Trematoda / D.I. Gibson, A. Jones, R.A. Bray. CAB International, Wallingford. 2002. - Vol. 1. - 521 pp.

55. Goss, S.J. New methods for mapping genes in human chromosomes / S.J. Goss, H. Harris //Nature. 1975. -255. - P. 680-684.

56. Goodpasture, C. Visualization of nuclear organizer regions in mammalian chromosomes using silver staining / C. Goodpasture, S.E. Bloom // Chromosoma (Berl.).- 1975.- 53.-P. 37-50.

57. Graphodatsky, A.S. The genome diversity and karyotype evolution of mammals / A.S. Graphodatsky, V.A. Trifonov, R. Stanyon // Molecular Cytogenetics. 2011. -4:22.

58. Gregory, R.T. The evolution of the genome / R.T. Gregory // Elsevier Academic Press.-2005.-740 p.

59. Grossman, A.I. Karyotype evolution and sex chromosome differentiation in Schistosomes (Trematoda, Schistosomatidae) / A.I. Grossman, R.B. Short, G.D. Cain // Chromosoma (Berl.). 1981. - 84. - P. 413-430.

60. Guan, X.-Y. Generation of band-specific painting probes from a single microdissected chromosome / X.-Y. Guan, J.M. Trent, P.S. Meltzer // Human Molecular Genetics. -1993. Vol.2. No.8. - P.l 117-1121.

61. Hackett, F. The culture of Schistosoma mansoni and production of life cycle stages / F. Hackett // Methods in Parasitology: Protocols in Molecular Parasitology. 1993. -Vol. 2. - P. 89-99.

62. Henikoff, S. The centromere paradox: stable inheritance with rapidly evolving DNA / S. Henikoff, K. Ahmad, H.S. Malik // Science. 2001. - 293. - P. 1098-1102.

63. Hinz, E. Current status of food-borne zoonoses in West Germany / E. Hinz // Southeast Asian J Trop Med Public Health. 1991. - P. 78-84.

64. Hirai, H. Paragonimus ohirai: identification of nucleolar organizer regions (NORs) and silver nitrate staining pattern in spermatogenesis / H. Hirai // Experimental Parasitology. 1988. - Vol. 67. No 2. - P. 281-286.

65. Hirai, H. FISH mapping for helminth genome / H. Hirai, Y. Hirai. // Parasite Genomics Protocols. Methods in Molecular Biology. 2004. - Vol.270. - P.379-394.

66. Hirai, H. FISH techniques for constructing physical maps on Schistosoma chromosomes / H. Hirai, P.T. LoVerde // Parasitology Today. 1995. - 11(8). - P.310-314.

67. Hirai, H. Identification of the telomeres on Schistosoma mansoni chromosomes by FISH / H. Hirai, P.T. LoVerde // J Parasitol. 1996. - 82. - P. 511-512.

68. Hirai, H. C-banding analysis of six species of lung flukes, Paragonimus spp. (Trematoda: Platyhelminthes), from Japan and Korea / H. Hirai, Y. Sakaguchi, S. Habe, H.T. Imai // Z. Parasitenkd. 1985. - 71 - P.617-629.

69. Hirai, H. C-band polymorphism in a Japanese lung fluke Paragonimus ohirai (Trematoda; Platyhelminthes) / H. Hirai, Y. Sakaguchi, H.T. Imai // Heredity. 1981. - 47(2). - P. 249-252.

70. Hirai, H. Schistosoma mansoni: chromosomal localization of DNA repeat elements by in situ hybridization using biotinylated DNA probes / H. Hirai, L.D. Spotilla, P.T. LoVerde // Exp. Parasitol. 1989. - 69(2). - P. 175-188.

71. Hirai, H. Schistosoma mansoni: Chromosomal localization of female-specific genes and a female-specific DNA element / H. Hirai, M. Tanaka, P.T. LoVerde // Exp. Parasitol. 1993. - 76. - P. 175-181.

72. Hortvath, J.E. Lessons from the human genome transitions between euchromatin and heterochromatin / J.E. Hortvath, J.A. Bailey, D.P. Locke, E.E. Eichler // Human Molecular Genetics. 2011. - Vol. 10. No.20. - P. 2215-2223.

73. Howell, W.M. Visualization of ribosomal gene activity: silver stains proteins associated with rRNA transcribed from oocyte chromosomes / W.M. Howell // Chromosoma (Berl.). 1977. - 62. - P. 361-367.

74. Howell, W.M. Controlled silver staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: a 1-step method / W.M. Howell, D.A. Black // Experientia. 1980. 36. P. 1014-1015.

75. Hozier, J. Preparative in situ hybridization: selection of chromosome region-specific libraries on mitotic chromosomes / J. Hozier et al. // Genomics. 1994. - 19. - P. 441-447.

76. Ijdo, J.W. Improved telomere detection using a telomere repeat probe (TTAGGG)n generated by PCR / J.W. Ijdo, R.A. Wells, A. Baldini, S.T. Reeders // Nucleic Acids Res. 1991. - 19(17): 4780.

77. International Agency for Research on Cancer. Biological agents (Opisthorchis viverrini and Clonorchis sinensis). IARC Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans. 2011. - 100B. - P. 342-370.

78. International Agency for Research on Cancer. Infection with liver flukes {Opisthorchis viverrini, Opisthorchis felineus and Clonorchis sinensis). IARC Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans. 1994. - Vol. 61. - P. 121-175.

79. Janes, D.E. Genome evolution in Reptilia, the sister group of Mammals / D.E. Janes et al. // Annu Rev Genomics Hum Genet. 2010. - 11. - P.239-264.

80. Jankun, M. Ribosomal genes in Coregonid fishes (Coregonus lavaretus, C. albula and C. peled) (Salmonidae): single and multiple nucleolus organizer regions / M. Jankun et al. // Heredity. 2001. - 87, - P. 672-679.

81. Jauch, A. Reconstruction of genomic rearrangements in great apes and gibbons by chromosome painting / A. Jauch, J. Wienberg, R. Stanyon, N. Arnold, S. Tofaneli, T. Ishida, T. Cremer // Proc Natl Acad Sci USA. 1992. - Vol. 89. - P. 8611-8615.

82. Joffe, B.I. Ordered arrangement and rearrangement of chromosomes during spermatogenesis in two species of planarians (Platyhelminthes) / B.I. Joffe, I.V. Solovei, H.C.Macgregor // Chromosoma. 1998. - 107. - P. 173-183.

83. Johnson, D.A. Genomes and genomics of parasitic flatworms / D.A. Johnson // Parasitic flatworms: molecular biology, biochemistry, immunology and physiology (edit. By Maule A.G. and Marks N.J.). CAB International. 2006. - P.37-81.

84. Kaewkes, S. Taxonomy and biology of liver flukes / S. Kaewkes // Acta Tropica. 2003.- 88. -P.177-186.

85. Kaewkong, W. Chromosomes and karyotype analysis of a liver fluke, Opistorchis viverrini, by scanning electron microscopy / W. Kaewkong et al. // Parasitol Int. -2012.-61(3).-P. 504-507.

86. Kang, S. Molecular identification and phylogenetic analysis of nuclear rDNA sequences among three opisthorchiid liver fluke species (Opisthorchiidae: Trematoda) / S. Kang et al. // Parasitol Int. 2008. - 57. - P. 191-197.

87. Karpenko, S.V. Characteristics of opisthorchiasis foci in southern West Siberia / S.V. Karpenko et al. // Contemporary Problems of Ecology. 2008. - Vol. 1, No 5. - P. 517-521.

88. Katokhin, A.V. Assessment of the genetic distinctions of Opisthorchis felineus from O.viverrini and Clonorchis sinensis by ITS2 and COI sequences / A.V. Katokhin et al. // Dokl Biochem Biophys. 2008. - 421. - P.214-217.

89. Keiser, J. Emerging food-borne trematodiases / J. Keiser, J. Utzinger // Emerg Infect Dis. 2005. - 11. - P.1507-1514.

90. Keiser, J. Food-borne Trematodiasis / J. Keiser, J. Utzinger // Clinical Microbiology Reviews. 2009. - Vol. 22, No. 3. - P. 466-483.

91. King, M. Regularities and restrictions governing C-band variation in acridoid grasshoppers / M. King, B. John // Chromosoma (Berlin). 1980. - 76(2). - P. 123150.

92. King, S. Trematodes of the family Opisthorchiidae / S. King, T. Scholz // The Korean Journal of Parasitology. 2001. - 39(3). - P.209-221.

93. Komalamisra, C. Chromosomes and C-banding of Opisthorchis viverrini / C. Komalamisra // Southeast Asian J Trop Med Public Health. 1999. - 30(3). - P.576-579.

94. Komalamisra, C. Chromosomes and chromosome breakage in the lung fluke, Paragonimus heterotremus / C. Komalamisra // J Trop Med Parasitol. 2005. - 28. -P. 69-72.

95. La Rue, G.R. Host-parasitic relations among the digenetic trematodes / G.R. La Rue // J Parasitol. 1951. - 37(4). - P.333-342.

96. Leksomboon, R. Organization of the nervous system in Opisthorchis viverrini investigated by histochemical and immunohistochemical study / R. Leksomboon et al. // Parasitol Int. 2012. - 61(1). - P. 107-11.

97. Levan, A. Nomenclature for centromeric position on chromosomes / A. Levan, K. Fredga, A.A. Sandberg // Hereditas. 1964. - 52(2). - P.

98. Lichter, P. Delineation of individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppression hybridization using recombinant DNA libraries / P. Lichter et al. // Hun Genet. 1988. - 80. - P. 224-234.

99. Lim, J.H. Liver flukes: the malady neglected / J.H. Lim // Korean J Radiol. 2011. - 12(3). - P. 269-279.

100. Lim, J.H. Biliary parasitic diseases including Clonorchiasis, opisthorchiasis and fascioliasis / J.H. Lim, E. Mairiang, G.H. Ahn // Abdom Imaging. 2008. - 33. - P. 157-165.

101. LoVerde, P,T. Chromosomes of two species of Paragonimus / P.T. LoVerde // Trans. Amer. Micr. Soc. 1979. - Vol.98. No 2. - P.280-285.

102. Lum, Z.-R. Clonorchiasis: a key foodborne zoonosis in China / Z.-R. Lum et al. // THE LANCET Infectious Diseases. 2005. - Vol. 5. Issue 1. - P. 31-41.

103. Matsui, S. Differential staining of nucleolus organizers in mammalian chromosomes / S. Matsui, M. Sasaki // Nature. 1973. - 246. - P. 148-150.

104. Meyne, J. Conservation of the human telomere sequence (TTAGGG)n among vertebrates / J. Meyne, R.L. Ratliff, R.K. Moyzis // Proc Natl Acad Sei USA. 1989. -86. - P. 7049-7053.

105. Mordvinov, V.A. Opisthorchis felineus and Metorchis bilis are the main agents of liver fluke infection of humans in Russia / V.A. Mordvinov, N.I. Yurlova, L.M. Ogorodova, AN. Katokhin // Parasitology International. 2012. - 61(1). - P. 25-31.

106. Multani, A.S. Heterochromatin and interstitial telomeric DNA homology / A.S. Multani et al. // Chromosoma. 2001. - 110. - P. 214-230.

107. Murphy, M.J. Phylogenetic relationships of African killiflshes in the genera Aphylosemion and Fundulopanchax inferred from mitochondrial DNA segments / M.J. Murphy, G.E. Collier // Mol Phylogenetics and Evolution. 1999. - 11(3). - P. 351-360.

108. Murrel, K.D. Food-borne zoonoses: fish and plant-borne parasites / K.D. Murrel, B. Fried // Springer. 2007. - Vol. 11. - 429 p.

109. Mutafova, T. Karyological studies on some species of the families Echinostomatidae and Plagiorchiidae and aspects of chromosome evolution in trematodes / T. Mutafova // Systematic Parasitology. 1994. - 28. - P. 229-238.

110. Nanda, I. Distribution of telomeric (TTAGGG)n sequences in avian chromosomes /1. Nanda et al. // Chromosoma. 2002. - 111. - P. 215-227.

111. Nerurkar, P.V. Methoxyresorufin and benzyloxyresorufin: substrates preferentially metabolizaed by cytochromes P4501A2 and 2B, respectively, in the rat and mouse / P.V. Nerurkar et al. // Biochem Pharmacol. 1993. - 46(5). - P. 933-943.

112. Olson, P.D. Phylogeny and classification of the Digenea (Platyhelminthes: Trematoda) / P.D. Olson, T.H. Cribb, V.V. Tkach, R.A. Bray, D.T.J. Littlewood // Int J of Parasitology. 2003. - 33. - P.733-755.

113. Paddock, S. Optical sectioning slices of life / S. Paddock // Science. - 2002. -295.-P. 1319-1321.

114. Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging / S. Paddock // BioTechnologies. 2008. - 44. P. 643-648.

115. Park, G.-M. Chromosomes of the liver fluke, Clonorchis sinensis. / G.-M. Park, K. Im, S. Huh, T.-S. Yong // The Korean J Parasitology. 2000. - Vol. 38. No. 3. - P. 201-206.

116. Park, G.-B. Geographical variation of the liver fluke, Clonorchis sinensis, from Korea and Chine based on the karyotypes, zymodeme and DNA sequences / G.-B. Park, T.-S. Yong // Southeast Asian J Trop Med Public Health. 2001. - 32(2). - P. 12-17.

117. Pinkel, D. Cytogenetic analysis using quantitative high sensitivity fluorescence hybridization / D. Pinkel, T. Straume, J.W. Gray // Proc Natl Acad Sci USA. 1986. -V.83. - P.2934-2938.

118. Polyakov, A.V. Comparative analysis of karyotypes of Opisthorchis felineus from West Siberia / A.V. Polyakov et al. // Contemporary Problems of Ecology. 2010. -Vol.3, Nol. - P. 1-3.

119. Popescu, N.C. Heterogeneity of constitutive heterochromatin in somatic Syrian hamster chromosomes / N.C. Popescu, J.A. DiPaolo // Cytogenet Cell Genet. 1979. -24(1).-P. 53-60.

120. Preuksaraj, S. Public health aspects of opisthorchiasis in Thailand / S. Preuksaraj // Drugs Res. 1984.-34.-P.l 119-1120.

121. Reeves, A. MicroMeasure: a new computer program for the collection and analysis of cytogenetic data / A. Reeves // Genome. 2001. - 44(3). - P. 439-443.

122. Richard, F. Reconstruction of the ancestral karyotype of eutherian mammals / F. Richard, M. Lombard, B. Dutrillaux // Chromosome Research. 2003. - 11(6). - P. 605-618.

123. Rim, H.J. The current pathobiology and chemotherapy of clonorchiasis / H.J. Rim Kisaengchunghak Chapchi 24 (suppl). 1986. - 1-141.

124. Rim, H.J. Clonorchiasis: an update / H.J. Rim // J Helminthol. 2005. - 79(3). - P. 269-281.

125. Roosen-Rung, E. C. The process of spermatogenesis in animals / E. C. Roosen-Rung // Cambridge University Press. USA. 1977. - 217 p.

126. Rubtsov, N.B. Zoo-FISH with region-specific paints for mink chromosome 5q: delineation of inter- and intrachromosomal rearrangements in human, pig, and fox / N.B. Rubtsov et al. // Cytogenet Cell Genet. 2000. - 90(3-4). - P. 268-70.

127. Rubtsov, N. A new simple version of chromosome microdissection tested by probe generation for 24-multi-color FISH, multi-color banding (MCB), ZOO-FISH and in clinical diagnostics /N. Rubtsov et al. // Medgen. 2000. - V. 12. - 65.

128. Ruvinsky, A. Mammalian Genomics / A. Ruvinsky, J.A.M. Graves // CAB International UK. 2005. - P. 23-67.

129. Sato, H. Functional visualization of the excretory system of adult Schistosoma mansoni by fluorescent marker resofurin / H. Sato, J.R. Kusel, J. Thornhill // Parasitology. 2002. - 125(6). - P. 527-535.

130. Schell, J.J. Fish chromosome and their evolution / J.J. Schell // Interval Report of Denmark Akavarium Charlottenlund, Denmark. 1973.

131. Scherthan, H. Comparative chromosome painting discloses homologous segments in distantly related mammals / H. Scherthan et al. // Nature Genetics. 1994. - Vol. 6. - P. 342-347.

132. Schmid, M. Evolutionary conservation of a common pattern of activity of nucleolus organizers during spermatogenesis in vertebrates / M. Schmid, C. Loser, J. Schmidtke, W. Engel // Chromosoma (Berl). 1982. - 86. - P. 149-179.

133. Schmid, M. Silver staining of nucleolus organizer regions during human spermatogenesis / M. Schmid, Hj. Muller, S. Stasch, W. Engel // Hum Genet. 1983. -64.-P. 363-370.

134. Scholz, T. Family Opisthorchiidae Looss, 1899 / T. Scholz // Keys to the Trematoda (edit, by R.A. Bray et al). Natural History Museum. London. 2008. -Vol.3.-P. 9-51.

135. Senger, G. Multicolor-FISH the identification of chromosome aberrations by 24 colors / G. Senger, I. Chudoba, A. Plesch // Bioforum. - 1998. -N 9. - P.499-503.

136. Shekhovtsov, S.V. A novel nuclear marker, Pm-int9, for phylogenetic studies of Opistorchis felineus, Opisthorchis viverrini, and Clonorchis sinensis (Opisthorchiidae, Trematoda) / S.V. Shekhovtsov et al. // Parasitol Res. 2009. -106. -P.293-297.

137. Short, R.B. Conventional Giemsa and C-banded karyotypes of Schistosoma mansoni and S. rodhaini / R.B. Short, A.I. Grossman // J Parasitol. 1981. - 67. - P. 661-671.

138. Short, R.B. Conventional Giemsa-stained and C-banded chromosomes of seven strains of Schistosoma mansoni / R.B. Short, J.D. Liberatos, W.H. Teehant, J.I. Bruce //J Parasitol. 1989. - 75(6). - P.920-926.

139. Sithithaworn, P. C. Liver Flukes / P. Sithithaworn, P. Yongvanit, S. Tesana, C. Pairojkul // Food-borne parasitic zoonoses: fish and plant-borne parasites. Springer. -2007. -P.3-53.

140. Slijepcevic, P. Telomeres and mechanisms of Robertsonian fusion / P. Slijepcevic // Chromosoma. 1998. - 107. - P. 136-140.

141. Smyth, J.D. The physiology of trematodes / J.D. Smyth, D.W. Halton // Cambridge University Press. 2d edition. 1986. - 446 p.

142. Spakulova, M. Current knowledge on B chromosomes in natural populations of helminth parasites: a review / M. Spakulova, J.C. Casanova // Cytogenet Genome Res. 2004. - 106. - P. 222-229.

143. Spakulova, M. Cytogenetics and chromosomes of tapeworms (Platyhelminthes, Cestoda) / M. Spakulova, M. Orosova, J.S. Mackiewicz // Adv. Parasitol. 2011. -74.-P. 177-230.

144. Sripa, B. Liver fluke induces cholangiocarcinoma / B. Sripa et al. // PLoS Med. -2007.-4(7): e201.

145. Sripa, B. Cholangiocarcinoma: lesssons from Thailand / B. Sripa, C. Pairojkul // Opin Gastroenterol. 2008. - 24. - P. 349-356.

146. Sugiyama, H. Karyotypic findings of the lung fluke, Paragonimus westermani (Kerbert, 1878), in the Uda area of Nara Prefecture, Japan / H. Sugiyama et al. // Jpn J Vet Sci. 1985. - 47(6). - P.889-893.

147. Sumner, A.T. A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin / A.T. Sumner // Exp. Cell. Res. 1972. - 75. - P. 304-306.

148. Sumner, A.T. Chromosome banding and identification absorption staining / A.T. Sumner // Methods in Molecular Biology: Chromosome Analysis Protocols. 1994. -Vol. 29. - P.59-81.

149. Sumner, A.T. Chromosomes: organization and function / A.T. Sumner. Blackwell Science Ltd. 2003. - 287 p.

150. Taguchi, T. DNA probes for identifying chromosomes 5, 6, and 7 of Schistosoma mansoni / T. Taguchi et al. // J Parasitol. 2007. - 93(3). - P. 724-726.

151. Terasaki, K. Morphological comparisons and hypotheses on the origin of polyploids in parthenogenetic Fasciola sp. / K. Terasaki, Y. Noda, T. Shibahara, T. Itagaki // J of Parasitology. 2000. - Vol. 86. No. 4. - P. 724-729

152. Trask, B. Human cytogenetics: 46 chromosomes, 46 years and counting / B. Trask // Nature Reviews. 2002. - 3. - P. 769-778.

153. Tselepatiotis, E. A case of Opisthorchis felineus infestation in a pilot from Greece / E. Tselepatiotis et al. // Infection. 2003. - Vol. 31. No. 6. - P. 430-432.

154. Volobujev, V.T. B-chromosomes system of the mammals / V.T. Volobujev // Caryologia. 1981. - 34. - P. 1-23.

155. Voltolin, T. Origin and molecular organization of supernumerary chromosomes of Prochilodus lineatus (Characiformes, Prochilodontidae) obtained by DNA probes / T. Voltolin et al. // Genetica. 2010. - 138. - P.l 133-1139.

156. Voss, S.R. Origin of amphibian and avian chromosomes by fission, fusion, and retention of ancestral chromosomes / S.R. Voss et al. // Genome Research. 2011. -21. -P.1306-1312.

157. Wannaprapo, S. Morphological features of the testes of the adult liver fluke, Opisthorchis viverrini. / S. Wannaprapo et al. // Srinagarind Med J. 2008. - 23(4). -P. 346-352.

158. Weise, A. High-throughput sequencing of microdissected chromosomal regions / A. Weise et al. //European Journal of Human Genetics. 2010. - 18. - P.457-462.

159. WHO. Control of foodborne trematode infections. Report of a WHO study group. WHO Tech. Rep. Ser. 1995. - 849. - P. 1-157.

160. Wienberg, J. The origin of human chromosome 2 analyzed by comparative chromosome mapping with a DNA microlibrary / J. Wienberg et al. // Chromosome Research. 1994. - 2. - P.405-410.

161. Wienberg, J. Molecular cytotaxonomy of primates by chromosomal in situ suppression hybridization / J. Wienberg, A. Jauch, R. Stanyon, T. Cremer // Genomics. 1990. - 8. - P. 347-350.

162. Wienberg, J. Homologies in human and Macaca fuscata chromosomes revealed by in situ suppression hybridization with human chromosome specific DNA libraries / J. Wienberg, R. Stanyon, A. Jauch, T. Cremer // Chromosoma. 1992. - 101. - P. 265270.

163. Wykoff, D.E. Opisthorchis viverrini in Thailand the life cycle and comparison with O. felineus / D.E. Wykoff, C. Harinasuta, P. Juttijudata, M.M. Winn // J Parasitology. - 1965. - Vol. 51. No. 2. - P. 207-214.

164. Zadesenets, K.S. Distribution of repetitive DNA sequences in chromosomes of five opisthorchid species (Trematoda, Opisthorchiidae) / K.S. Zadesenets et al. // Parasitol Int. 2012. - 61(1). - P. 84-86.

165. Zadesenets, K.S. Comparative cytogenetics of opisthorchid species (Trematoda, Opisthorchiidae) / K.S. Zadesenets, A.V. Katokhin, V.A. Mordvinov, N.B. Rubtsov // Parasitol Int. 2012. - 61(1). - P. 87-89.