Технология изготовления и свойства питательной среды сухой стерильной на основе гидролизатов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Богрянцева, Марина Поликарповна

• Богрянцева, Марина Поликарповна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Богрянцева, Марина Поликарповна

Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Питательные среды в клеточной биотехнологии.

2.1.1. Назначение, классификация и общие требования к вирусологическим питательным средам

2.1.2. Применение гидролизатных питательных сред в вирусологической практике.

2.2. Особенности технологии изготовления и стерилизации сухих форм вирусологических питательных сред.

2.3. Методы контроля качеству вирусологических питательных » . • сред.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Технология изготовления и свойства питательной среды сухой стерильной на основе гидролизатов»

Л

Культуры клеток животных и человека получили широкое применение в вирусологической практике, а также в производстве диагностических, лечебных и профилактических препаратов. Для получения и поддержания клеточных культур необходимы различные виды питательных сред, солевые и диспергирующие растворы. В настоящее время ферментативные белковые гидролизаты, благодаря своим питательным свойствам, доступности, простоте изготовления, относительно невысокой стоимости и перспективности для получения разнообразных клеточных культур, находят все более широкое применение в качестве аминокислотно-пептидной основы вирусологических питательных сред [2, 29, 38,46]. По мнению ряда авторов, применение ферментативных гидролизатов позволит не только заменить дорогостоящие импортные аминокислоты, но и за счет низкомолекулярных пептидов, интенсифицировать обменные процессы в клетках, а также использовать их для частичной или полной замены сыворотки крови животных в ростовых питательных средах [99-103, 122].

Традиционно ВПС для культур клеток в промышленных масштабах готовят в жидкой форме методом стерилизующей фильтрации. Существенным недостатком жидкой формы ВПС является нестабильность при длительном хранении, потребность в холодильном оборудовании, а также большие затраты, связанные с транспортировкой. В последние годы все большую популярность приобретают сухие формы ВПС и растворов для культур клеток. Они стабильны, сохраняют высокие ростстимулирующие свойства на протяжении всего срока хранения, не требуют значительных затрат на транспортировку и хранение.

Кроме этого следует отметить, что сухие стерильные ВПС за рубежом не 7 выпускают, а предлагают для использования лишь сухие коммерческие нестерильные композиции, требующие наличие у потребителя специфического оборудования и материалов для стерилизующей фильтрации.

В России в сухой стерильной форме в промышленном масштабе выпускают следующие ВПС на основе индивидуальных компонентов: Игла, 199 [113], КРМ1 - 1640, 199 М, МЕМ-4 [93, 121], а также дезагрегирующий агент - трипсин [14, 21]. Аналогичная форма ВПС на основе гидролизатов не выпускается, а исследования по изготовлению сухих стандартных образцов - референс-препаратов гидролизатных ВПС не вышли за рамки лабораторных исследований [12]. Поэтому задача разработки технологии изготовления сухой стерильной формы гидролизатных ВПС квалификации "для культур клеток" является актуальной и экономически обоснованной.

Цель и задачи исследований. Целью исследований была разработка технологии изготовления, методов оценки качества сухих стерильных питательных сред на основе гидролизатов и их апробация при получении широкого спектра культур клеток и вирусов.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

• определить общие требования к качеству исходных ингредиентов: ферментативных гидролизатов и неорганических солей, пригодных для изготовления сухой стерильной формы гидролизатных ПС;

• разработать технологию изготовления, подобрать оптимальные условия стерилизации сухих стерильных форм гидролизатных ПС;

• разработать экспресс метод оценки качества ПС;

• оценить пригодность сухих стерильных ПС на основе ферментативных гидролизатов для производства первичных и перевиваемых культур клеток; 8

• испытать сухие стерильные ПС на основе ферментативных гидролизатов в производстве противовирусных препаратов;

• определить условия и сроки хранения сухих стерильных ПС на основе ферментативных гидролизатов;

• разработать НТД на изготовление, контроль и применение сухих стерильных ПС на основе ферментативных гидролизатов.

Научная новизна. Впервые получены научно обоснованные данные, положенные в основу разработки опытно-промышленной технологии производства «Среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной», отвечающей требованиям квалификации «для культур клеток».

Впервые экспериментально обоснованы условия стерилизации многокомпонентного препарата, «Среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной», ускоренными электронами и показана возможность оценки стандартности препарата спектрофотометрическим методом. Отработаны методы контроля и определены предельно допустимые показатели качества «Среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной».

Научно обоснована трехкомпонентная форма выпуска препарата. Показано, что при длительном хранении происходит снижение качества вирусологических питательных сред за счет химического взаимодействия реакционно-активных аминокислот и глюкозы с образованием токсических продуктов. Определены оптимальные условия и сроки хранения препарата. Показана возможность применения метода «ускоренного старения» для прогнозирования длительности хранения препарата.

Доказана пригодность и перспективность применения препарата для получения широкого спектра первичных, перевиваемых культур клеток и противовирусных препаратов. 9

Приоритет и новизна научных разработок диссертации защищены авторским свидетельством (а. с. № 1566723 от 22.01.1990 г.) и патентом РФ (приоритетная справка № 99105439 от 15.03.1999 г.).

Практическая значимость работы. В ГНЦ ВБ «Вектор» разработана и внедрена в производство технология изготовления «Среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной». Экономически и практически обосновано применение препарата в биотехнологии. По материалам диссертации разработана и утверждена нормативная документация (НД) на препарат. Для вирусологической практики предложены 4 новых коммерческих препарата: среда питательная на основе ферментативного гидролизата мышечных белков сухая стерильная; среда питательная на основе ферментативного гидролизата белков сыворотки молока сухая стерильная; среда питательная на основе ферментативного гидролизата белков крови сухая стерильная; среда питательная на основе ферментативного гидролизата лактальбумина сухая стерильная.

Апробация работы. Основные результаты доложены и получили положительную оценку на I отраслевой конференции - конкурсе молодых ученых ГУ «Биопрепарат» (Новосибирск, 1988г.); Всесоюзной конференции по актуальным вопросам разработки препаратов медицинской биотехнологии (Махачкала, 1989г.); Всесоюзной конференции по питательным средам и сывороткам для культивирования клеток (Новосибирск, 1991г.); симпозиуме "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 1995г.); конференции "Перспективы развития производства биопрепаратов для медицины и сельского хозяйства" (Степногорск, 1995г.); V симпозиуме "Биология клетки в культуре" (Санкт

11

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Богрянцева, Марина Поликарповна

6. Выводы

1. Разработана технология изготовления «среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной (ПССГ)», включающая:

• отбор и входной контроль компонентов питательной среды на соответствие требованиям нормативной документации;

• высушивание и изготовление смеси солей, глюкозы и фенолового красного;

• раздельную фасовку, укупорку и этикетировку ферментативного гидролизата; смеси солей, глюкозы и фенолового красного; бикарбоната натрия;

• стерилизацию ускоренными электронами.

2. Определены условия стерилизации ПССГ ускоренными электронами. Доза облучения 25 кГр не оказывает существенного влияния на физико-химические и ростовые свойства питательных сред и гарантирует стерильность.

3. Показано, что существенный вклад в снижение качества ВПС при хранении вносят реакции, протекающие между аминокислотами и глюкозой. Достигнуто увеличение срока годности препарата с 0,5 до 2 лет хранения при температуре 6-10°С за счет разделения реакционно-активных компонентов.

4. -Научно обоснована форма выпуска препарата в виде комплекта из трех флаконов, содержащих ферментативный гидролизат; смесь солей, глюкозу и феноловый красный; бикарбонат натрия. Комплект рассчитан на приготовление 400 мл питательной

149 среды. Препарат полностью растворим в стерильной очищенной (деминерализованной) воде без признаков опалесценции в проходящем свете.

5. Определены предельно допустимые значения показателей качества ПССГ, включающие определение: внешнего вида, массовой доли влаги, растворимости, прозрачности нефильтрованных растворов, рН среды, буферной емкости, осмоляльности, содержания глюкозы, хлор иона, аминного азота, стерильности, токсичности и ростстимулирующей активности.

6. Разработан способ оценки стандартности вирусологических питательных сред методом спектрофотометрии. Для различных видов питательных сред квалификации «для культур клеток» определены доверительные интервалы изменений оптической плотности поглощения при аналитических длинах волн.

7. Показана пригодность ПССГ для получения широкого спектра первичных (ФЭК, ПЭК, ПЭС, ТБ, ПЩ) и перевиваемых линий (СПЭВ, Vero, Нер-2, Namalva) культур клеток. ПССГ не оказывали токсического влияния на ростовые свойства клеток, сроки образования монослоя и морфологию клеток в культуре.

8. Первичные и перевиваемые культуры клеток, полученные с использованием ПССГ и традиционным способом, характеризовались равноценной чувствительностью и обеспечивали накопление вирусов болезни Ауески, трансмиссивного гастроэнтерита свиней, инфекционного ринотрахеита и парагриппа-3 крупного рогатого скота в высоких титрах.

9. Показана принципиальная возможность использования ростовых питательных сред на основе ФГМ-С и ГСБМ в бессывороточном и малосывороточном (2% сыворотки крови КРС) вариантах, а на основе ГБК-С и ГЛА только в малосывороточном варианте в присутствии сывороточных ростовых факторов.

150

7. Практические предложения

На примере ферментативных гидролизатов ФГМ-С, ГСБМ, ГБК-С и ГЛА предложена технология изготовления ПССГ. Данная технология является универсальной и может быть использована для получения в сухой стерильной форме различных гидролизатных питательных сред.

Для оценки стандартности как синтетических, так и гидролизатных питательных сред разработан спектрофотометрический экспресс-метод (а. с. № №1566723). Рассчитаны доверительные интервалы изменения оптической плотности питательных сред, позволяющие с вероятностью 99% судить не только о стандартности приготовленных питательных сред, но выявлять изменения, связанные с нарушением технологии приготовления, условий хранения и транспортировки.

Показана перспективность применения ПССГ для выращивания различных клеточных культур и вирусов.

По результатам экспериментальных исследований разработана и утверждена следующая НТД:

• Технические условия. ТУ 9384-073-0000806 4-98 "Среда питательная на основе гидролизатов сухая стерильная".

• Инструкция по изготовлению и контролю среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной.

• Временное наставление по применению среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной.

Предложено 4 новых коммерческих препарата для культур клеток:

• ПССГ ФГМ-С - питательная среда на основе ферментативного гидролизата мышечных белков сухая стерильная;

152

2.4. Заключение

Обзор литературы не оставляет сомнений в том, что для увеличения сроков годности жидких питательных сред, а также для предупреждения протекания в жидких питательных средах различных термо - и фотоокислительных процессов, имеющих место при тепловой стерилизации, хранении и в результате снижающих качество питательных сред, необходимо найти рациональное решение с целью предотвратить протекание выше указанных процессов путем введения стабилизирующих добавок. Другим направлением увеличения сроков годности питательных сред может явиться разработка технологии изготовления ВПС в сухой стерильной форме. При этом наиболее перспективно создание относительно недорогих ПС на основе ферментативных гидролизатов. Приведенные данные свидетельствуют о том, что использование белковых гидролизатов возможно не

38 только для замены аминокислот, как компонентов ПС, но и при конструировании бессывороточных и малосывороточных ПС. Многокомпонентность состава, сложность технологии изготовления ПС требует комплексного подхода к оценке качества ПС. Основным показателем качества в настоящий момент является ростстимулирующая активность и токсичность. Усилия многих авторов направлены на поиск более эффективных экспресс-методов оценки качества ПС. Однако стоит отметить, что большинство предложенных эффективных экспрессных биологических методов оценки качества ПС трудоемки, требуют специального оборудования, наличия асептических условий труда и биологического материала. Поэтому поиск физико-химических экспрессных методов оценки качества ПС приобретает особое значение.

Таким образом, анализ литературных данных позволил сформулировать следующие основные направления исследований: оценить возможность использования антиоксидантов для стабилизации жидких форм питательных сред; определить общие требования к качеству и подготовке исходных компонентов для изготовления сухой стерильной формы гидролизатных ВПС; разработать технологию изготовления, подобрать оптимальные условия стерилизации сухих стерильных форм гидролизатных ВПС; разработать экспресс метод физико-химической оценки стандартности

ВПС; оценить пригодность сухих стерильных ВПС на основе ферментативных гидролизатов квалификации "для культур клеток" для производства первичных и перевиваемых культур клеток и вирусов.

39

3. Материалы и методы В исследованиях были использованы следующие питательные среды производства ГНЦ ВБ "Вектор":

Питательные среды жидкие стерильные: RPMI-1640 по ФС 42-3628-98, Игла MEM по ФС 42-3540-98, 199М по ФС 42-3500-98, питательная среда для культивирования клеток ВНК-21, ЛЭЧ [29].

Питательные среды сухие стерильные: RPMI-1640 по ФС 42-350 ВС-90. Для приготовления гидролизатных питательных сред использовали следующие ферментативные гидролизаты: гидролизат белков сыворотки молока (ГСБМ) по ТУ 10.07.44-90, гидролизат мышечных белков ферментативный сухой (ФГМ-С) по ТУ 46 12 20 -80, гидролизат белков крови ферментативный сухой (ГБК-С) по ТУ 10.09-137-91 и гидролизат лактальбумина (ГЛА) фирмы "Дифко".

Культуры клеток

В работе использовали паспортизованные клеточные культуры, полученные из музея клеточных культур ГНЦ ВБ " Вектор": перевиваемые линии клеток карциномы гортани человека (Нер-2), почки зеленой мартышки (Vero), почки сирийского хомячка (ВНК-21) и клетки лимфомы Беркитта (Namalva). Культивирование клеток проводили в течение 5-ти последовательных пассажей с 3-4 дневным циклом при посевной дозе в каждом пассаже 100-200 тыс.кл./мл. После 5-го пассажа осуществляли подсчет среднего значения индекса пролиферации (ИП) и количество жизнеспособных клеток [69].

Ростстимулирующие белки (РБ)

Образцы РБ сыворотки крови свиней и КРС получены в лаборатории клеточных культур Института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН. Фракционный состав РБ сыворотки крови свиней и КРС: альбумина - 80,8 и 60,0%; а- глобулина - 6,2 и 17,0%; р-глобулина - 13,0 и 20,0%; у-глобулина - 0 и 3,0% соответственно [27, 94, 95].

40

Вирусы

В работе использовали вирус болезни Ауески (штамм БУК-628), вирус инфекционного ринотрахеита (штамм Оренбург), вирус парагриппа-3 (штамм MB А 1/77) и вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней (штамм ВГНКИ). Штаммы поддерживали и титровали на наиболее чувствительных к вирусам тест-культурах клеток. Доза и способ заражения, сроки культивирования были общепринятыми.

Приготовление сухих стерильных питательных сред на основе ферментативных гидролизатов Приготовление сухой смеси по прописи раствора Хэнкса (ФС 42-71ВС-93)

Для приготовления смеси, содержащей неорганические соли, глюкозу, феноловый красный использовали реактивы следующей квалификации:

Натрий хлористый - "хч", ГОСТ 4233-77;

Калий хлористый -"хч", ГОСТ 4568-83;

Кальций хлористый 6-водный -"хч", ГОСТ 4460-77;

Магний хлористый 6-водный -"хч", ГОСТ 4209-77;

Магний сернокислый 7 - водный - "хч", ГОСТ4523-77;

Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный - "хч", ГОСТ4172-76;

Калий фосфорно-кислый однозамещенный - "хч", ГОСТ4198-75;

Бикарбонат натрия - "хч", ГОСТ4201-79;

Глюкоза кристаллическая безводная - "чда", ГОСТ 6038-79;

Феноловый красный - ТУ 6-09-07-1451-85 Для изучения процессов дегидратации неорганических солей и определения оптимальных температур высушивания использовали метод термогравиметрии. Термогравиметрические исследования проводили в следующих условиях: навеска вещества-100 мг, температура 20-500°С, скорость нагрева - 5 °С/мин.

41 .»оссийяда

Высушивание неорганических солей осуществляли по разработанной схеме. Контроль степени высушивания неорганических солей

Для определения степени высушивания неорганических солей определяли плотность раствора исследуемой соли с помощью ареометра (ГФ XI изд., вып 1, с.25). Используя справочные данные зависимости плотности раствора неорганической соли от ее концентрации, рассчитывали молекулярную массу кристаллогидрата и количество молекул воды в нем в соответствии с технологической инструкцией, разработанной в ГНЦ ВБ "Вектор". Изготовление смеси солей, глюкозы и фенолового красного

Измельчение и смешение сухих компонентов ПС проводили в шаровой мельнице барабанного типа, материал мельницы - фарфор. Скорость вращения барабана и продолжительность измельчения определяли экспериментальным путем. Фасовка ферментативных гидролизатов, бикарбоната натрия и смеси, содержащей неорганические соли, глюкозу и феноловый красный

Фасовку осуществляли во флаконы ФО-Ю по ТУ 64-2-10-87, которые укупоривали резиновыми пробками по ТУ 38.106618-95 и обжимали алюминиевыми колпачками по ОСТ 64-009-89.

Стерилизацию сухих ПС проводили на промышленном ускорителе электронов ИЛУ-6 в Институте ядерной физики СО РАН со следующими параметрами пучка электронов: энергия пучка электронов - 2,15-2,20 Мэв; ток пучка импульсный - 0,22+0,01 А; частота следования импульсов - 6 Гц; длительность импульсов - 500 мкс.

42

Физико-химический контроль сухих стерильных питательных сред на основе ферментативных гидролизатов

Контроль осуществляли в соответствии с требованиями "Методических рекомендаций по контролю качества вирусологических питательных сред" [69] по следующим показателям: внешний вид, цвет, запах; растворимость, концентрация ионов водорода, буферная емкость, прозрачность, массовая доля влаги, содержание хлоридов, содержание глюкозы, содержание аминного азота. Определение внешнего вида, цвета и запаха

Внешний вид, цвет и запах оценивали органолептически. Определение растворимости

Растворимость сухих стерильных питательных сред определяли в соответствии с требованием ГФ XI изд., вып.1, с. 177.

Для этого содержимое комплекта препарата вносили в бутылку вместимостью 450 мл и доводили объем среды водой очищенной до 400 мл, герметично закрывали резиновой пробкой и энергично встряхивали в течение 20 мин при температуре (20±2)°С. Растворимость препарата определяли визуально в проходящем свете. Определение показателя концентрации ионов водорода (рН)

Определение показателя концентрации ионов водорода (рН) проводили в соответствии с требованием ГФ XI изд., вып.1, с. 113 на рН-метре типа рН-121, диапазон измерения рН 4-9 ед. рН, погрешность измерения рН ±0,05 ед. рН. Определение буферной емкости

К 40 мл питательной среды добавляли 0,1 моль/л раствор гидроокиси натрия до изменения рН на 1 ед. рН.

Осмоляльность исследуемых ПС определяли по точке эвтектики с помощью осмометра ' "ОэтокЬ ", согласно инструкции по эксплуатации прибора.

43

Определения прозрачности

Прозрачность определяли на нефелометре типа НФР ( фильтр №4 ), согласно инструкции по эксплуатации прибора. Определение массовой доли влаги

Определение массовой доли влаги осуществляли методом высушивания в соответствии с требованиями ГФ XI изд., вып.1, с. 176 и ГОСТ 24061-89. Определение содержания хлор - иона

0,2 мл питательной среды помещали в колбу вместимостью 50 мл, прибавляли 5 мл раствора нитрата серебра концентрации 0,01 моль/л и 1 мл концентрированной азотной кислоты, осторожно нагревали с использованием асбестовой сетки до кипения. К испытуемому раствору добавляли по капле насыщенный раствор калия перманганата до бледно-розового окрашивания, не исчезающего в течение 5 мин. Далее прибавляли глюкозу (около 10 мг) до исчезновения окраски. После охлаждения раствора, избыток ионов серебра титровали раствором аммония роданида концентрации 0,01 моль/л до образования розового окрашивания (индикатор - железо-аммонийные квасцы). Параллельно проводили контрольный опыт, используя очищенную воду. Содержание хлор - иона в исследуемом растворе (X) в процентах вычисляли по формуле:

Х= (А - В ) -К • 0,000355 • 100 /С, (3.1) где А- количество раствора роданида аммония, пошедшее на титрование контрольной пробы, мл;

В- количество раствора роданида аммония, пошедшее на титрование исследуемой пробы, мл;

К- поправка к титру раствора роданида аммония;

0,000355 - количество хлор - иона, соответствующее 1 мл раствора аммония роданида концентрации 0,01 моль/л, г;

44

С- объем анализируемого образца, мл;

100- коэффициент пересчета г в %.

Определение аминного азота формольным титрованием

В стакан, вместимостью 50 мл, вносили 10 мл анализируемого раствора среды, добавляли 15-20 мл очищенной воды и доводили рН смеси до 7,0 ед. рН раствором натрия гидроксида или серной кислоты. К нейтрализованному раствору добавляли 2 мл формольной смеси, перемешивали и при постоянном перемешивании потенциометрически титровали раствором натрию гидроксида концентрации 0, 1 моль/л до рН 8,5 ед. рН. Содержание аминного азота в исследуемом образце (X]) вычисляли по формуле:

XI = У • К • 0,0014 • 100/С, (3.2) где V- количество раствора натрия гидроксида, израсходованного на титрование исследуемого образца, мл;

К- поправочный коэффициент к титру раствора натрия гидроксида; 0,0014- количество азота, эквивалентное 1 мл 0,1 мол/л раствора натрия гидроксида, мг; С- объем анализируемого образца, мл. Определение содержания глюкозы

3,0 г трихлоруксусной кислоты количественно переносили в мерную колбу и доводили объем очищенной водой до 100 мл. В пробирку наливали 0,9 мл 3%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и выливали в нее 0,1 мл исследуемой среды. Центрифугировали с частотой вращения 1000 мин*1. К 0,5 мл центрифугата добавляли 4,5 мл о-толуидинового реактива. Пробирку помещали в кипящую водяную баню на 3 мин, далее охлаждали при комнатной температуре (18-20)°С. Оптическую плотность определяли на спектрофотометре при длине волны 625 нм в кювете с толщиной поглощающего света 10 мм. По калибровочному графику находили содержание глюкозы в

45 исследуемом образце. (Калиброванный график строили, используя данные оптической плотности стандартного раствора глюкозы с концентрацией 100 мг%). Содержание глюкозы ( Сопыт, мг% ) определяли по формуле:

Сопыт ~~ Сст • Доп /д ст, (3.3) где Сст- концентрация глюкозы в калибровочном растворе, мг%; Допыт - оптическая плотность исследуемого образца; Дет - оптическая плотность стандартной пробы.

Контроль биологических свойств ВПС Определение ростовой активности ВПС на перевиваемой культуре клеток

Оценку ростовой активности питательной среды проводили путем пассирования тест-культуры клеток на испытуемой и контрольной сериях среды в течение пяти последовательных пассажей с учетом индекса пролиферации культуры, морфологии клеточной популяции и сроков образования монослоя. В качестве контрольной серии использовали питательную среду, ранее прошедшую испытания и отвечающую требованиям соответствующей документации - фармакопейной статьи. Контроль проводили на паспортизованных клеточных линиях Нер-2, Vero, Namalva и СПЭВ. От каждой серии питательной среды независимо от объема отбирали по две случайные фасовки по 0,5 л. Пересев клеточного материала проводили на 3-4 сутки роста, когда формировывался сплошной монослой. Ежедневно с помощью инвертированного микроскопа проводили анализ монослоя, оценивали состояние клеточного пласта и морфологию клеток в культуре. Жизнеспособные клетки должны иметь четкие границы и четкую структуру. Клеточный монослой должен быть представлен клетками, сохраняющими типичные морфологические черты используемой линии, без дегенеративных изменений, симпластов и т.д.

46

Клетки культивировали в среде с добавлением сухого стерильного глутамина (300 мг/л) и 10 % или 5 % сыворотки крови КРС. Пересев клеток осуществляли после формирования сплошного монослоя. Для снятия клеток со стекла использовали смесь 0,25 % раствора трипсина по ВФС 42 -3117-98 и раствора Версена по ФС 42-65ВС-93 в соотношении 1:10. Снятые клетки пипетировали в 5 мл среды до получения гомогенной суспензии. Каплю клеточной суспензии из пипетки помещали на край покровного стекла камеры Горяева так, чтобы суспензия под действием капилярных сил проникла в камеру подсчета. Подсчет клеток в камере Горяева проводили при 70-кратном увеличении микроскопа.

Концентрацию клеток в 1 мл (С) определяли по формуле:

С= а-2-1111-В, (3.4) где С- общее количество клеток ; а - количество клеток в камере Горяева; В- объем суспензии, мл; 1111- коэффициент пересчета; 2- степень разведения. Индекс пролиферации (ИП) определяли по формуле:

ИП=Х/У, (3.5) где X - конечная концентрация клеток, кл/мл, У - концентрация клеток при посеве.

За результат испытания принимали среднее арифметическое значение ИП трех параллельных измерений. Определение ростовой активности ВПС на первичной культуре клеток

Первичные культуры клеток ФЭК получали по общепринятой методике, используя 9-10 дневные куриные эмбрионы [29]. Подсчет клеток производили по методике, приведенной в п. 3.7.1. В качестве контрольной среды использовали 0,5% раствор гидролизата ГЛА, (фирмы "Дифко"), приготовленный методом стерилизующей фильтрации. Исследуемую среду считали пригодной, если она обеспечивала образование

47 сплошного монослоя клеток на 3-4 сутки от начала культивирования, не вызывая в клетках изменений дегенеративного характера, и ИП не менее 1,0. Определение чувствительности культур клеток к вирусам

Образцы культур клеток заражали общепринятым методом и инкубировали в стандартных условиях при температуре 36°С до момента появления цитопатических изменений. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча и выражали в ^ ТЦД 5о/Мл-Определение стерильности ВПС

Стерильность готовых питательных сред определяли в соответствии с ГФ XI вып.2, с. 187 методом прямого посева на тиогликолевую среду. Инкубирование проводили при температуре 20-25°С и 30-35°С. Учет результатов проводили в течение 14 суток инкубирования. Через каждые сутки и по окончании инкубации визуально просматривали посевы на выявление признаков роста микроорганизмов (появление мутности, осадка, хлопьев и др. изменений). При обнаружении роста хотя бы в одной Пробирке его подтверждали микроскопированием мазков по Граму. Контроль на отсутствие микоплазм

Контроль на отсутствие микоплазм осуществляли в соответствии с методическими указаниями МУК 4.1./4.2.588-96.

Испытуемую питательную среду вносили по 0,5 мл в каждую пробирку со специфической средой, предварительно аттестованной на чувствительность к микоплазмам. Посев производили пипеткой, вместимостью 1 мл, столбиком от дна пробирки. Пробирки выдерживали 14 суток при температуре (37±1)°С. Просмотр производили на 7, 10 и 14 сутки, с целью выявления признаков наличия микоплазм (появление в первичном посеве опалесценции, слабого помутнения среды). Электронные спектры поглощения (ЭСП) вирусологических питательных сред регистрировали на спектрофотометре "Спекорд М40", фирмы "Карл Цейс",

48

Германия. Использовали стеклянные УФ-микрокюветы: для синтетических питательных сред-типа ЕБ-Ю; для гидролизатных сред- типа Е8-2. Параметры измерения: диапазон регистрации 200-900 нм; время интегрирования 1 с; скорость записи 2 мм/с; растяжение ординаты 1,00; масштаб регистрации 1 мм/1,795 нм;

Статистическую обработку результатов измерения оптической плотности поглощения (ОП) проводили в соответствии с требованиями ГОСТ 8.207-76 и СТ СЭВ 1190-78. Проверку нормальности распределения исследуемых величин ОП проводили двумя способами: статистическим критерием - омега - квадрат и составным критерием с исследованием таких исходных выборок, как коэффициент асимметрии и коэффициент эксцесса. Распределение результатов измерения подчинялось нормальному закону. Исходя из этого, обработку результатов и определение доверительных интервалов изменений ОП проводили следующим образом: определяли среднее арифметическое значение ОП - (ОП):

ОП=1/п Е ОПмб,где п-количество исследуемых серий; (3.6.) проводили оценку среднеквадратичного отклонения единичного измерения- Б и среднеквадратичного отклонения средней арифметической Б]; вычисляли границы доверительного интервала для отдельного измерения (I) с где 1:0,995(11-1)- 0,995- квантиль распределения Стьюдента с (п-1 ) степенями свободы.

Спектры электронного парамагнитного резонанса ВПС записывали на ЭПР-спектрометре Е-109 относительно стандартного образца (дифенилпикрилгидразила.

3.7) вероятностью 99%: (I) = ( ОП -1:0,995(^1) ^ ; ОП + %95(п-1)8ь),

3.8.)

49

91 который состоит из 1,53-10 неспаренных электронов на 1 г вещества) при 20°С на воздухе непосредственно после облучения сухих ВПС, а затем после растворения сухих облученных образцов ВПС в очищенной воде.

Аминокислотный состав исследуемых ВПС определяли на аминокислотном анализаторе ЬС 5001 фирмы "Вю^ошс". Пики аминокислот регистрировали в области 570 нм (для Ь-пролина в области 440 нм).

Для определения сроков годности сухих стерильных ВПС был применен метод ускоренного старения при повышенных температурах [48].

Сухие стерильные ВПС выдерживали при температуре (80±5)°С в течение 0-17 сут, через каждые сутки отбирали пробы. Далее на основе отобранных термообработанных сухих питательных сред готовили жидкие ПС путем растворения их в стерильной очищенной воде и оценивали их качество.

Статистическая обработка результатов

Среднее арифметическое значение результатов - (X) определяли по формуле 3.7.

Сравнение средних значений результатов, полученных в опыте и контроле, для определения существенности их различия проводили по формуле: ХГХ21 > ^^ 1/П1 + 1/П2, (3.9.) где 5?-Л||Шх - Х\]2 +Е( х - X)?2 (3.10)

П1 +П2-2

П1 и П2 обозначают число опытов, из которых получены средние X, и Х2;

2 2

2(х - X)] и Ц х - Х)2 - суммы квадратов отклонений величин, найденных в отдельных опытах от соответствующей средней.

Значение 1Р находили в таблице Стьюдента в зависимости от числа степеней свободы п=(п] + П2 - 2) и уровню значимости 0,01.

50

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Богрянцева, Марина Поликарповна, 1999 год

1. Андреевская Н.М., Михайлова В.А., Каретникова Э.С. Влияние антиоксидантов на стабильность диагностических сывороток в процессе их хранения. // Биотехнология. -1998.-№4.- с. 68-71.

2. Артюхин В.И., Шепелин А.П, Киселева Н.В. Белковые гидролизаты в производстве питательных сред. Производство и применение продуктов микробиологических производств: Обзорн. информ. М.: ВНИИСЭНТИ Минмедпрома СССР, 1990. - вып. 9-10. - с. 31-38.

3. А. с. 1337410 СССР, МКИ3 А 61 L 2/08. Способ стерилизации продуктов / М.А.Туманян, И.И. Самойленко, М.П.Калошин. Опубл. 1972, Бюл. № 12.

4. А. с. 1025722. СССР, МКИ3 С 12 N 1/00. Питательная среда для выращивания культур клеток животных / Г.Е. Панкова, В.А. Сергеев, Л.П. Дьяконов, Д.Ф.Осидзе, А.П. Простяков, Н.Д. Скичко Опубл. 1983, Бюл. № 24.

5. А. с. 1331891 СССР, МКИ3 С 12 N 5/00. Способ определения пролиферативной способности клеток / O.A. Бочарова, Г.Н. Зацепина, Д.В. Зыбин. Опубл. 1987, Бюл. № 31.

6. А. с. 1337410 СССР, МКИ3 С 12 Q 1/04. Способ определения токсичности питательной среды, используемой для выращивания культур животных клеток / Л.Д. Мартынец. Опубл. 1987, Бюл. № 34.

7. А. с. 1507790 СССР, МКИ3 С 12 N 5/00. Способ культивирования клеток человека и животных / В.М. Бородина, Л.И. Федорова, Зеленин A.B. Опубл. 1989, Бюл. № 34.

8. А. с. 1673596 СССР, МКИ3 С 12 N 5/04. Способ стерилизации ферментных препаратов, используемых для получения протопластов / Н.М. Нафталиев, Л.А. Дубовицкая. Опубл. 1991, Бюл. № 32.

9. А. с. 1735360. СССР, МКИ3 С 12 N 1/00. Питательная среда для перевиваемых клеток млекопитающих / А.И.Коренева, А.С.Пригода Опубл. 1992, Бюл. № 19.

10. Байбаков В.И. Использование митохондрий из культур клеток в токсикологическом контроле исходного сырья при производстве питательных сред // Биотехнология. 1990. - № 2. - с. 72-75.

11. Балаж А., Блажек И. Эндогенные ингибиторы клеточной пролиферации. М., 1982. - 113 с.

12. Башашкина H.A. Стандартизация методов контроля культуральных питательных сред и их компонентов: Автореферат дис.канд. биол. наук. М., 1994. -24 с.

13. Беликов В.Г., Дубровкин И.М., Лозовский A.C. Использование автоматизированного спектрофотометрического анализа для контроля качества лекарственных препаратов: Обзорн. информ. М: ВНИИСЭНТИ, 1989. - вып.7. - 27 с.

14. Богрянцева М.П. и др. Разработка препарата сухого стерильного трипсина, используемого для культур клеток // Цитология .- 1992. т.34. - № 9. - с. 55.

15. Богрянцева М.П. и др. Готовая форма трипсина для культур клеток // Цитология. 1994. - т.36. - № 6. - с.547.

16. Блинкова Л.П. и др. Применение ферментативного гидролизата боимассы хлореллы в средах для выращивания клеток эукариот // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1995 - №6. - с. 16

17. Булатова Р.Ф., Шепелин А.П., Волков В Л. Новые подходы к разработке критериев оценки качества сухих питательных сред // Клиническая лабораторная диагностика. 1997. - № 1. - с. 23-24.

18. Буряк В.П Основные характеристики электронных спектров поглощения и количественного определения лекарственных средств, содержащих гетероатом кислорода в молекуле Автореф. дис.канд. фарм .наук.-М, 1978. 23 с.154

19. Валева Е.Б. и др. Приготовление и использование питательной среды с яичным гидролизатом для монослойного размножения клеток ВНК-21. // Ветеринарно-медицинская наука.-1980. №10. - с. 55-62.

20. Вашков В.И. Средства и методы стерилизации, применяемые в медицине. М.: Медицина, 1973. с. 124-152.

21. Величко A.B. Сухой трипсин диспергент для получения культур клеток // Цитология. - 1994. - т.36. - № 6. - с. 548-54.

22. Вильянович Л.И. и др. Использование безбелковых сред для культивирования доимплантационных эмбрионов млекопитающих // Консервация генет. ресурсов: Материалы 14 Рабочего совещ., Пущино 28-30 мая. 1996. Пущино, 1996. - с. 67-69.

23. Витакер.А. Среды для культивирования клеток млекопитающих. / Новые методы культуры животных тканей. Под ред. Фридлянского ,-М: Мир, 1976. с. 18.

24. Вишняков И.В., Жестеров В.И., Башаев и др. Использование перевиваемой культуры клеток почки сайгака в вирусологической практике. // Цитология. 1994. - т.36. - №6. - с. 549.

25. Гасанова Б.С. Культивирование клеток млекопитающих с различными видами сывороток и заменителями сывороток. Автореф. дис. канд. биол.наук.-М, 1993. с. 8-10.

26. Гасанова Б.С и др. Протеины различных видов сывороток как факторы роста клеток млекопитающих // Цитология. 1994. - т.36. - №6. - с. 61.

27. Гизитдинов H.H. и др. Питательные среды для выращивания культур клеток и вирусов // Достижения науки и техники. 1992. - № 6. -с. 22-23.

28. Голубев Д.Б., Сомина А.А, Медведева М.Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. JL: Медицина, 1976. - с. 10-36.

29. Гончаров A.A., Манина И.Н., Ионова Н.Д. О возможности радиационной стерилизации гепарина // Хим. фарм. журнал. - 1986. - №5. - с. 619-623.

30. Гризодуб А.И., Георгиевский В.П. Спектрофотометрический анализ в контроле качества многокомпонентных лекарственных средств: Обзорн. информ. М: ВНИИСЭНТИ, 1988. - вып. 9. - 28 с.

31. Громов В.А. и др. Физико-химические исследования облученных лекарственных препаратов // Тез.докладов Всесоюз. конф. по радиационной стерилизации медицинской промышленности. М., 1978. - с. 62-63.

32. Гудимо О.С., Колесникова H.A., Шошиев J1.H. Культивирование клеток Hela на питательных средах с гидролизатами альбумина сыворотки крови человека и животных // Вопросы вирусологии. 1961. №3. - с. 375119.

33. Гудрниеце Э.Ю., Королькова B.C. Стабилизация солянокислого цистеина. // В сб.: Методы получения и анализа биохимических препаратов. Рига, 1982. - 4.1. - 14 с.

34. Давиденко Т. И. и др. Физико-химические исследования полипропиленов после стерилизации // Хим. фарм. журнал. - 1994. -№.8. - с. 51-56.

35. Дамберг Б.Э. Реакция меланоидинообразования и ее биологическое значение // Известия АН Латвийской ССР.-1976.- № 1.-е. 97-105.

36. Демина Н.Г., Полажуер Б.М., Румянцева Н.Ф. Изучение стабильности глутамина в процессе его выделения из ферментационных процессов // Биотехнология. -1992.-№ 2.-с. 63-67.

37. Децина А.Н., Бачинский А.Г., Байбаков В.И. Белковые гидролизаты в качестве основы питательных сред. М.: ВНИИСЭНТИ Минмедпрома СССР, 1985. 66 с.

38. Джарылгасов С.А., Борисова С.М., Пухова Н.М. Качество материалов для культур клеток, применяемых в биотехнологии: Обзорн. информ. М: ВНИИСЭНТИ,1561987.-ВЫП.З.-28С.

39. Дьяконов Л.П. Культуры клеток животных: современные аспекты биотехнологии и взаимодействия клеток с инъекционными патогенами // Цитология. -1994,-т.Зб.-№6.-с. 503-504.

40. Дьяконов Л.П., Строкина Г.М., Конюхов А.Ф. Гидролизаты молочных, мышечных и растительных белков как основы питательных сред для культивирования клеток и вирусов. // Цитология. 1994. - т.36, - №6. - с. 522.

41. Зенькевич В.Б., Балатов В.П., Соколов С.Е. Мембранное оборудование для питательных сред и сывороток // Тез. докл. Всесоюз. конф.' "Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток." Кольцово, 14-17 окт. 1991. Новосибирск, 1991.-с. 43.

42. Зубцов В.А. и др. Способ получения и изучение биологических свойств некоторых компонентов питательных сред. // Тез. докл. Всесоюз. конф. "Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток." Кольцово, 14-17 окт. 1991. -Новосибирск, 1991.-с. 11.

43. Иванюшенкова И.В. и др. Культивирование вакцинных штаммов вируса африканской чумы лошадей в суспензии клеток с использованием гидролизата белков крови. // Вирусные и микробные болезни животных. ВНИИ защиты животных. -Владимир, 1995. с. 179-181.

44. Игудин Л.И., Кацнельсон Н.В., Блоха В.В. Принципы и методы стандартизации вирусологических питательных сред // Тез. докл. Всесоюзн. конф."Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии".-Махачкала, 1988. Ч. 2. - с. 221.

45. Карышева А.Ф. Сухой белковый концентрат и использование его при изготовлении питательных сред для микроорганизмов: Автореф. дис. докт. биол. наук Одесса, 1972.-32 с.

46. Каулен Д.Р. Труды Ташкентской конференции по мирному использованию атомной энергии. Ташкент 1966 - с. 88.

47. Каушинский А.Г., Ракитская Г.А., Самойленко И.И. Использование ускорителей электронов для стерилизации шприцев однократного применения // Тез. докл Радиобиологического съезда, Киев, 20-25 сент., 1993. Пущино, 1993. - с. 255.

48. Кизюн С.М., АфанасенГ.А. Бессывороточная синтетическая среда на основе факторов роста для высокоэффективного культивирования клеток- продуцентов урокиназы линии RH-RA. // Биотехнология. 1993. - №10. - с.22 - 25.

49. Клесова И.И., Пахальчук Т.И., Бураев В.И./ Масштабирование производства питательных сред для культур клеток // Тез. докл. Всесоюз. конф. "Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток." Кольцово, 14-17 окт. 1991. Новосибирск, 1991. - с. 22.

50. Козлов Э.И., Иванова P.A., Цибульская М.И. Витамины отечественного производства для питательных сред // Тез. докл. Всесоюзн. конф."Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии".-Махачкала, 1988. Ч. 1. - с 28.158

51. Коновалова Е.Ю. и др. Конструирование бессывороточных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих. Сообщение III. // Биотехнология. 1991. -№5. - с. 72-76.

52. Коренева А.И. и др. Конструирование бессывороточных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих. Сообщение V. // Биотехнология. 1991. - №6. -с. 64-66.

53. Корнеева А.И. Разработка питательной среды для культур клеток млекопитающих на основе ферментативного гидролизата казеина: Автореф. дис. канд биол. наук.-Москва, 1995. с. 8-10.

54. Крылов И.А., Красноштанова A.A., Манаков М.Н. Ферментативный гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов. Ш.Использование ферментативных систем поджелудочной железы. // Биотехнология. 1998. - №6. - с. 8489.

55. Кузин A.M., Каушанский Д.А. Прикладная радиобиология.-М.: Энергоиздат. -1981.-с. 5-17.

56. Куликова И.Л., Дьяконов Л.П., Жидков С.А. Культура клеток сосудов теленка и чувствительность клеток этой культуры к вирусу диареи крупного рогатого скота // Цитология. 1992. - т.34. - №9. - с. 75.

57. И-42-2-82. Инструкция по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода "ускоренного старения" при повышенной температуре. М, 1983. - 13 с.

58. Ламберт К.Дж., Берч Дж.Р. Среды для выращивания клеток. // В кн.: Биотехнология клеток животных. Под ред. Спиера P.E. М: Мир, 1989. - с. 98-125.

59. Львова М.Ш., Озерина Т.В., Эрман С.Я., Козлов Э.И. Действие облучения на растворы гомопантотеновой кислоты // Хим. фарм. журнал. - 1986. - № 5. - с. 617-619.

60. Мартынец Л.Д. и др. Определение ростовой активности суспензионных питательных сред в микроферментерах // Биотехнология. 1991. - № 2. - с. 91-93.

61. Матвеев А.Е. и др. Влияние режимов стерилизации на качество питательных сред при переменных значениях pH среды // Хим. фарм. журнал. - 1985. - № 3. - с. 228231.

62. Матвеев В.Е., Скворцов Т.Е., Куян Н.В. Разрушение аминокислот в растворах при нагревании. //Биотехнология.-1986.-№1.-с. 53-62.

63. Методические рекомендации по контролю качества вирусологических питательных сред. — М, 1985. 14 с.

64. Миронова Л.Л. и др. Отечественные линии перевиваемых клеток почек теленка субстрат для биотехнологии. // Биотехнология. - 1998. - №5. - с. 25-31.

65. Молодкина Л.М. и др. Стерилизующая фильтрация модельных питательных сред на кассетных модулях с трековыми мембранами // Цитология. 1994. - т.36. - № 6. -с. 595.

66. Нариманов A.A. Бессывороточная среда для культивирования лимфоидных клеток человека и миеломных клеток мышей // Биотехнология. 1991. - № 1. - с. 49-51.

67. Новохатский A.C. Ростовые факторы сыворотки и крови. Новые возможности получения и применения // Цитология. 1994. - т.36. - №6. - с. 506.

68. Ночевный В.Т. Биологический контроль ростовой активности питательных сред и сыворотки крови животных // Тез. докл. Всесоюз. конф. "Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток." Кольцово, 14-17 окт. 1991. Новосибирск,1991.-с. 46.

69. Овечко H.H., Жердева В.В., Раевская Н.К. Биоантиоксидант феназан- К изменяет уровень синтетических процессов в культивируемых клетках // Цитология.1992.-т.34.-№9.-с. 88-89.

70. Павлов Е.П. и др. Использование у-излучения для микробной деконтаминации лекарственных средств // Хим. фарм. журнал. - 1992. - №2. - с. 76-79.

71. Патент 1830080 Россия, МКИ3 С 12 N 5/00. Бессывороточная питательная среда для культуры ткани / В.Ф. Проути Опубл. 1993, Бюл. № 27

72. Патент 2059417 Россия , МКИ" С 12 N 5/04. Способ стерилизации питательных сред / В.Н. Данелевич, В.А. Лившиц. Опубл. 1996, Бюл. № 13.

73. Патент 2001628, Россия. МКИ3 А 61 L 2/00. Способ стерилизации лидазы / Л.И. Стекольников, И.И. Самойленко, В.В.Рыльцев, Р.Б.Вирник. Опубл. 1993, Бюл. № 39-40.

74. Патент 2036233. Россия, МКИ6 С 12 N 5/00. Питательная среда для выращивания первичных и перевиваемых культур клеток / A.B. Слободенюк, F.F. Колесникова. Опубл. 1995, Бюл. № 15.161

75. Патент 2043587, Россия МКИ6 F 26 В 5/6 Способ сушки биологических материалов / А.И. Григоренко, Н.В. Крамской, A.B. Колосков. Опубл. 1995, Бюл. №.25.

76. Патент 1566532. Россия, МКИ0 С 12 N 5/00. Способ изготовления вакцины против сибирской язвы животных / Г.Н. Романов, Ю.П. Чернецкий. Опубл. 1995, Бюл. №'35.

77. Патент 2055482 Россия, МКИ6 С 12 N 5/00. Способ получения белковонуклеинового гидролизата / Ю.М.Гафуров, Э.Л. Козловская. Опубл. 1996,1. Бюл. № 1.

78. Патент 2057176. Россия, МКИ0 С 12 N 5/00. Питательная среда для выращивания культур клеток человека и животных / К.И. Спыну, П.К.Кинтя, Т.П.Грушко. Опубл. 1996, Бюл. № 1.

79. Патент 2053297. Россия, МКИ6 С 12 N 5/00. Способ культивирования вируса кори / A.A. Смородинцев. Опубл. 1996, Бюл. № 3.

80. Патент 2035877 Россия , МКИ6 А 23 К 1/00. Антиоксиданты для стабилизации витаминов в кормосмесях / Р.И. Лыс, Т.К. Билозор. Опубл. 1996, Бюл. № 13.

81. Патент 2068879 Россия, МКИ6 С 12 N 1/00. Способ получения ферментативного гидролизата и питательная среда "Эпидермат-2" для культивирования клеток эукариотов / И.Г. Ермишина, А.Г. Майнерт, Т.Ф.Власова. Опубл. 1996, Бюл. № 31.

82. Патент 2074004. Россия, МКИ6 А 61 L 2/08. Комплекс радиционной стерилизации / Э.А. Мирочник, A.B. Мищенко, В.М. Пироженко Опубл. 1997, Бюл. №6.

83. Патент 2074249 Россия, МКИ С 12 N 1/00. Способполучения ферментативногогидролизата из мышечной ткани ластоногих и питательная среда "Целат "для культивирования клеток эукариотов / И.Г. Ермишина, А.Г. Майнерт, Т.Ф.Власова. -Опубл. 1997, Бюл. № 6.

84. Патент № 2084523 Россия, МКИ3 С 12 N 5/08. Способ получения питательной среды для культивирования лимфоцитов крови / И.В. Фролова, Г.П. Трошкова, H.A. Мазуркова, Л.П. Камший, И.А. Гинзбург Опубл. 1997, Бюл. № 27.

85. Патент 2107724, Россия, МКИ3 С 12 N 5/00.Способ получения сухих стерильных питательных сред для культур клеток / Л.П. Камший, Г.П. Трошкова, А.И. Леляк, И.В.Фролова, Е.А. Сорокина. Опубл. 1998, Бюл. № 9.

86. Подчерняева Р.Я., Хижнякова Т.М., Михайлова Г.Р., Шалунова Н.В. Анализ варианта линии клеток Vero, полученного с целью использования в вирусологии // Цитология. 1996. - т.38. - № 2. - с. 241.

87. Подчерняева Р.Я. и др. Изучение различных ростстимулирующих белков, используемых для культивирования клеток млекопитающих // Биотехнология. 1994. -№6. - с. 20-23.

88. Подчерняева Р.Я., Мельниченко Е.И., Конду Э.И. Использование ростстимулирующих белков для стандартизации условий культивирования клеток млекопитающих // Цитология. 1996. - т.38. - №2. - с. 240-241.

89. Полозков и др. Количественное определение асалина в лекарственных формах // Хим. фарм. журнал. - 1998. -№.2. - с. 43-44.

90. Пригода A.A. и др. Конструирование бессывороточных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих. Сообщение I. // Биотехнология. 1990. - №2. -с. 35.

91. Пригода A.A. и др. Конструирование бессывороточных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих. Сообщение П. // Биотехнология. 1991. - №4.с. 38-40.

92. Пригода A.C., Муратов B.C. Современное состояние, перспективы получения и использования питательных сред: Производство и применение продуктов микробиологических производств: Обзорн. информ. М: ВНИИСЭНТИ, 1989. - вып.8. -56 с.

93. Пригода A.A. и др. Конструирование бессывороточных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих. Сообщение IV. // Биотехнология. 1991. - №5. -с. 55-59.

94. Пригода A.A. и др. Конструирование бессывороточных питательных сред для культивирования клеток млекопитающих. Сообщение VI. // Биотехнология. 1993. - №7. -с. 21-25.

95. Распопина Г.И., Мартынец Л.Д., Колокольцова Т.Д. Уровень карбонильных соединений в питательных средах при культивировании клеток млекопитающих // Биотехнология. 1991. - № 1.-е. 75-79.

96. Самойленко И.И., Федотов И.С., Туманян М.А. Снижение бактериальной обсемененности ферментных препаратов комбинированными радиационными способами // Прикладная биохимия и микробиология.-1984. вып.2 - том 20 - с. 2349-244.

97. Самуйленко А.Я., Ломакина Г.А., Авдеева Г.А. Современное состояние и перспективы развития промышленного производства ветеринарных препаратов. Биотехнологическое производство: Обзорн. информ. М.: ВНИИСЭНТИ, 1994. вып.З. -с. 8.164

98. Сандахчиев JI.C., Зиновьев B.B, Подчерняева Р.Я. Применение ферментного препарата " коллаза" в работе с клеточными культурами // Цитология. 1992. - т.34. - № 9.-с. 102-103.

99. Седых Н.В., Кристапсонс М.Ж. Контроль качества в биотехнологии. Рига: Зинатне, 1990. с. 22-25.

100. Сирица И.И., Лымарь В.Т., Лобанова Т.Н. Проточно-фильтрационный способ культивирования клеток млекопитающих // Цитология. 1996. - т.38. - № 2. - с. 247-248.

101. Ситьков В.И., Сурмилова А.П., Лепишко В.И. Отработка методов фильтрации сывороточных питательных сред // Вестник ветеринарии. 1996. - № 1. - с. 71-73.

102. Смирнова Т.Д., Литвинчук Л.Ф., Сизова Л.С. Новый способ контроля свойств сыворотки крови КРС // Цитология. 1996. - т.38. - № 2. - с. 249-250.

103. Сперанская И. Д. Современные методы изготовления культуральных питательных сред. : Автореферат дис.канд.биол.наук. М., 1981. - 20 с.

104. Телишевская Л.Я. и др. Изучение ростстимулирующих компонентов гель -фильтрационных фракций панкреатических белковых гидролизатов // Биотехнология. -1993. -№11-12.-с. 33-38 .

105. Телишевская Л.Я., Максимюк H.H., Богаутдинов З.Ф. Значение пептидов в составе питательных сред для суспензионного культивирования // Цитология. 1994. -т.36. №6 .- с. 538.

106. Технические условия ТУ 46 12 20 -80. Ферментативный гидролизат мышечных белков сухой.165

107. Технические условия ТУЮ.07.44-90. Ферментативный гидролизат белков сыворотки молока.

108. Технические условия ТУ 10.09.-137-91. Ферментативный гидролизат белков крови сухой.

109. Трофимов В.И. Радиационные технологии стерилизации для трансфузиологии // Новое в трансфузиологии 1994. - №9. - с. 63-65.

110. Трошкова Т.П., Камший Л.П., Фролова И.В., Богрянцева М.П. и др. Научный отчет «Разработка экспериментально-промышленной технологии производства сухих питательных сред Игла, 199 М, МЕМ-4, RPMI-1640. НПО "Вектор"». Новосибирск, 1990.-64 с.

111. Федотова А.В и др. Выращивание клеток щитовидной железы при пониженных концентрациях сыворотки крови // Цитология. 1994. - т.36. - №6.с. 537-538.

112. Фролова И.В. и др. Готовая форма питательной среды для культивирования лимфоцитов крови человека // Цитология. 1994. - т.36 .- № 6. - с. 583.

113. Фролова И.В. и др. Готовая форма питательной среды для культивирования лимфоцитов переферической крови человека // Биотехнология. 1994. - № 9-10.с. 22-25.

114. Хижнякова Т.М., Подчерняева Р.Я., Мельниченко Е.И. Культивирование клеток на пористом микроносителе. // Биотехнология. 1998. - №5. - с. 38-41.

115. Bargess С., Knowles A. Standards in Absortion Spectrometry Ultraviolet Spectrometry Group.-New York: Chapman and Hall, 1981. 142 p.

116. Barman H.K., Rajpur Y.S. Serum-free and serum-containing media for hubridoma culture // J. Sei and Ind. Res. 1993. - 52, V. 12. - P. 803-807.

117. Bertheussen Kjell. Growth of cells in a new defined protein-free medium. // Cytotechnology. 1993. - 11, V.3. - P. 219-231.

118. Bertolero F., Kaighn M.E., Camalier R.F., Saffoiotti U. Effects of serum and serum-derived factors on growth and differentiation of mouse keratinocytes // In Vitro. 1986. - V.22. - P. 423-428.

119. Benjakul S., Morrissey M. Protein hydrolysates from pacific whiting solid wastes // Arg. and Food Chem. 1997. - 45, V.9. - P. 3425-3430.

120. Brandli J. Influence of HFST-Sterilization for Growth of Serum-Free Cell Cultures // Abstract 16th Int. Meet. Products from Cells Cells as Products., Switzerland, 25-29 April, 1999.-1999.-P. 217.

121. Briand P. et al. // J. Cell. Biol. Suppl. 1986. - V.42. - P. 22-30.

122. Brim L.,Kiefer K., Hanson G. Are media just media ? // Amer. Bioteclinol. Lab. -1991.-V.8.-P. 33-35.

123. Buchaila R., Schuttler C., Bogl K.W. Effects of ionizing radiation on ultra-high molecular-weight poluethylene: Pap. 9th Int. Meet.Radiat. Process., Istanbul, 11-16 Sept., 1994. Pt 1 // Radiat.Phys.and Chem. 1995. - 46, V.4-6. - P. 579-585

124. Chan H.M., Muramoto H. Antioxidant activity of disigned peptides based on the antioxidative peptide isolated from degists of a soybean protein. // Arg. and Food Chem. -1996. 44, V.9. - P. 2619 - 2623.

125. Cinalt Jun J., Rabenau Y., Cinalt Sen J., Daerr H.W. Die Serum- und Protein- freie Zuchtung von Zellkulturen // Z. Forum Mikrobiologie. 1989. - V.2. - P. 205-211.

126. Chen Zhaolie, Xiao Chengzy. A novel serum- free medium for the cultivation of Vero cells on microcarriers // Biotechnol. Techn. 1996. - V.6. - P. 449-452.

127. Chouaib A., Kallel H. Adaptation of Vero cells to a serum free medium for the production of rabies virus. // Abstract 16th Int. Meet. Products from Cells Cells as Products., Switzerland, 25-29 April, 1999. -1999. P. 224.167

128. Dam A.M.,Gazco L.G., Kaewpila S. Radiation treatment of pharmaceuticals // Radiat. Phys. and Chem. 1996. - V.3. - P. 515-517.

129. Domart Coulon Isabelle, Doumene Dominique, Auzoux Bondenave Stephanik. Identification of media supplements that improve the viability of primarily cell cultures of Crassostrea gigas oysters // Cytotechnology. 1994. - V.2 - P. 109-120.

130. Deblock Stephane, Istas Jacqueline Que penser des aliments irradies? // Combat nature. 1993. -V.l00. -P .42-43.

131. Dewelle J., Pirotton S., Raes M. Develpment of a serum free medium for a human diploid fibroblast cell line. // Abstract 16th Int. Meet. Products from Cells Cells as Products., Switzerland, 25-29 April, 1999. -1999. P. 216.

132. Gonze M., Maggeto C. Development of a serum free medium for MRC-5 culture. // Abstract 16th Int. Meet. Products from Cells Cells as Products., Switzerland, 25-29 April, 1999. -1999.-P. 223.

133. Heidemann R., Zhang C. et al. The Use of Peptones as Medium Additives for High-Density Perfusion Cultures of Animal Cells // Abstract 16th Int. Meet. Products from Cells Cells as Products., Switzerland, 25-29 April, 1999. -1999. P. 220.

134. Ham R.G. Impotance of the basal nutrient medium in the desing of hormonally defined media // Growth of cells in hormonally defined media. Cold Spring -1982. P. 39-60.

135. Hang N.D., Canh T.T., Thuy T.T. Radiation sterilisation of traditional medicine drugs in Vietnam: Pap. 9th Int. Meet.Radiat. Process., Istanbul, 11-16 Sept., 1994. Pt 1 // Radiat.Phys.and Chem. 1995. - 46, V.4-6. - P. 623-627.

136. Hayashi Т., Manou P. et al // J. Agr. Biol. Chem. 1981. - V. 45. - P. 111-117.

137. HyClone L., Kern D. Blended bovine sera cellular growth media and ther methods of production and use / Патент 5409827 США, МКИ6 C12 N 5/00, A 61 К 35/14. Опубл. 1995; НКИ 435 /2403.

138. Inlow D., Lowe D., Howarth В., Mac H. Improvements in hybridoma culture and bispecific antibody production // J. Cell. Biochem. 1994. -V.18. - P. 65

139. Jeon I., Fung D. Esherichia coli growth in Laboratory media as affected by phenolic antioxidants // J. Food Sci. 1996. - 61.V.5. - P. 1017-1020.

140. Jayme D., Price P. et al. Serum and Serum-free Cultivation of Mammalian Cells Used for Virus Production Applications. // Abstract 16th Int. Meet. Products from Cells Cells as Products. Switzerland, 25-29 April, 1999. -1999. P. 161.

141. Joshida D. et al. // Arg. Biol. Chem. 1980. - V.44. - P. 2521-2522.

142. Kalyazin E.P. Comparison of the radiation and conventional processing: Pap. 9th Int. Meet.Radiat. Process., Istanbul, 11-16 Sept., 1994. Pt 1 // Radiat. Phys. and Chem.-1995. -46, V.4-6.-P. 453-456.

143. Kole K., Lechner J., Reddel R. Human liver epithelian cell line and culture media there for. / Патент 5529920 США, МПК6 C12 N 5/06. Опубл. 1996; НКИ 435/240.2.

144. Lee Keun-Ho, Chu Chin-Chang. Gamma irradiation sterlizing of biomaterial medical devices or products, with improved degradation and mechanical propenties / Патент 5485496 США, МКИ4 G21 К 5/08. Опубл. 1996; НКИ 387 / 64.

145. Legrand С., Capiaumont J., Belleville F. Comparison of metabolism of hybridoma cells cultured in media supplemented with whey or fetal calf serum // Biotechnol. Progr. 1993. - V.6. - P. 573-579.

146. Lin Shin-Bin, Chaing Wen-Dtt, Cordle Chistopher Functional and immunological properties of casein hudrolysate produced from two stage membrane systen // J. Food Sci. -1997.- 62, V.3-P. 480-483.

147. Mac M. The adverse effects of UV and short-wavelength visible radiation on tissue culture. //Amer. Biotechnol. Lab. 1986. -4,V.4. - P. 30-31.

148. Mader Karsten, Domb Abraham / Gamma sterilization induced radicals in biodegradable drug delivery systems // 4 th Int. Symp. ESR Dosim. and Appl., Munich, May 1519, 1995: Final Programme and Book Abstr. Neuherberg, 1995. - P. 186-187.

149. Melnik I.L., Riordan. Polymelitis viryses in tissue culture iv Protein free nutrient media in stationary and roller tube cultures. // Proc. for Exp. Biol. Med. 1952.1. P. 208-213.

150. Mohler William. Effekt of Water Purity and addition of Common Water Contaminants on the growth of Cell in serum free media // Biotechnigues. - 1996. - V.2.1. P. 260-266.

151. Nakama Akihiko, Yamada Akio. Serum-free culture of human hepatome Hep-2 cells with egg yolk low densiry lipoprotein // Biosci., Biotechnol. and Biochem. 1993. - 57, V.3. - P. 410-413.

152. Neigen H., Poulsen A., Bertheussen K. Degradation of cell culture media by light // Cytotechnology. 1989. - V.2. - P. 79.

153. Ojioto E., Fernandez M., Chico E. Low-protein, serum-free medium for the cultivation of CHO cells in suspension culture. // Abstract 16th Int. Meet. Products from Cells Cells as Products. Switzerland, 25-29 April, 1999. -1999. P. 220.

154. Prise P., Gregory E. Relationship between in vitro growth promotion and biophysical and biochemical properties of the serum supplement // In vitro. 1982. - V.18.1. P. 576-577.

155. Sedmak J., Gameson P., Grossberg S. Procedurs for stabilization of interferons. // Meth. Enzym.- 1981.-V.78.-P. 591 -595.

156. Shidhaye Supriya, Damle Avanti. Decontaminationof veegum by gamma radiation // Indian J. Pharm. Sci. 1995. - 57, V.4. - P. 187-188.170

157. Sterilization and longterm aging of medical-grade UHMWPE: Pap. 9th Int. Meet.Radiat. Process., Istanbul, 11-16 Sept., 1994. Pt 1// Radiat.Phys.and Chem. 1995. - 46, V.4-6. - P. 893-896.

158. Southern I. A., Katz W. // J. Biol. Stand. 1984. - V. 12. - P. 231-232.

159. Tackzono Т., Sakato K. Agent for stimulating growth of animal cells and serum-free medium containing same. Патент 5318906 США, МКИ5 C12 N 5/00, A 61 К 35/14. Опубл. 1994; НКИ 435 /2402.

160. Takehisa М. Sterilisation with electron accelerators: Pap. Workshops Util Electron Bangkok and Jakarta, July 9 andl3,1992 // JAERI-M. 1993. - V.93-160. - P. 132-142.

161. Talrose V.L.,Trofimov V.I. Cryoradiation sterililization: Contemporary state and outlook: Pap. 9th Int. Meet.Radiat. Process., Istanbul, 11-16 Sept., 1994. Pt 1 // Radiat. Phys. and Chem. 1995. - 46, V.4 - 6. - P. 633-637.

162. Terzic-Vidojevic A., Todorovic M., Popov-Raljic J. Possibility of barley decontamination by ionizing radiation // Zb. rad./ Technol. fak., Novi sad.-1993. V.24-25. - P. 93-106.

163. Verwej. H., Dubellman T. Photodynamic protein cross linking // Biochem. Biophys. Acta. - 1981. - V.647. - P. 212 - 218.

164. Waymouth C., Ham R.G. and Chappie P. The Growth Requirements of Vertebrate Cells in Vitro. Cambridge Univ. Press. London and New York, 1981 P. 343-352.

165. Waymouth C., Ham R.G. Major ions, buffer systems, pH, osmolarity and water quality. Cambridge Univ. Press. London and New York, 1981 P. 105-107.

166. Welzenbach K., Al-Rubeai M. A rapid method for evaluation cell number and viability by flow cytometry. // Cetotechnology. 1997. - 24, V.2. - P.161-168.

167. Wayner D.D., Burton G.W., Ingold K.U // Biochim. Biophys. Asta. 1986. - VI. -P. 119-123.171

168. Weiss M. Stability data prove critical for assung biopharmaceutical shelf life. // Genet. Eng. News. 1994. - 14, V.2. - P. 10 - 27.

169. Whitby James L. Microbiological aspects relating to the choice of radiation sterilisation dose: Pap. 8th Int. Meet.Radiat. Process., Beijing, 13-18 Sept., 1992. Pt.2 // Radiat.Phys.and Chem. 1993. - 42, V.4-6.- P. 577-580.

170. Whitby James L. Radiation resistance of Acinetobacter spp: Pap. 9th Int. Meet.Radiat. Process., Istanbul, 11-16 Sept., 1994. Pt 1 // Radiat.Phys.and Chem. 1995. - 46, V.4-6. - P. 639-642.

171. Woolston J. Radiation sterilisation: A contract steriliser's view: Pap. 9th Int. Meet.Radiat. Process., Istanbul, 11-16 Sept., 1994. Pt 1// Radiat. Phys. and Chem.-1995. 46, V.4-6. - P. 587-590.

172. Wolfe R., Yeifetz A. Basal nutrient medium for cell culture. / Патент 5232848 CUIAJ, МКИ5 С 12 N 5/00. Опубл. 1993; НКИ 435 / 240.

173. Zegota H. et al // Effect of gamma irradiation on cefofaxime in the solid state // Radiat. Phys. and Chem. 1995. - 45, V.2. - P. 222-229.174122! Дата поступление ВХОДЯТ Я/т0р ||N гос.регистрац. 99105439

174. Приоритет 1 Ь ШЗ 4Ш, .Пи ¡51} МПК ?П ■ эо 2 5 МДР ¡5:

175. ЗАЯВЛЕНИЕ о выдаче патента Российской Федерации на изобретение

176. Представляя указанные ниже документы, прошу Спросим) выдать патент Российской Федерации на имя

177. В государственное патентное-ведомство Российской" Федерации, 121853,Москва, Береж ковская наб., 30, к,10 91. ФИПС

178. Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор"171! Заявитель:

179. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИДКИХ СТЕРИЛЬНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД НА ОСНОВЕ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ ГИДРОЛИЗАТОВдд| Адрес для переписки (полный почтовый "адрес633159, Новосибирская обл., Новосибирский р-н, пгт.Кольцово, ГНДВБ "Вектор", патентный отделу Мстюрину Ю.Н.

180. Телефон: [phone] Твлвйс." 133106 'МРО 30 Факс: [phone]

181. Патентный поверенный (полное имя, регистрационный номер)1. Телефон:1. Телекс:1. Факс:

182. Продолжение на следующем листеV

183. МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (Минсельхозпрод России)1. ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ107139,Москва,Орликов пер.,1/11 Для телеграмм:Москва 84 Минсельхоз Телетайп: 417738 ЛЕН23.QI.98r. ц 13-7-2Д156на N

184. ВРЕМЕННОЕ НАСТАВЛЕНИЕ по применению среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной (в порядке широкого производственного испытания в 19931999 гг.)1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

185. Препарат представляет собой тонкодисперсный гигроскопичный порошок от белого до светло-кремового (ФГМС, ГБКС)} или белого цвета с желтоватым или розоватым оттенком (ГСБМ, ГЛА), со слабым специфическим запахом, с массовой долей влаги не более 3%177

186. УТВЕРЖДАЮ Заместитель начальника178и полностью растворим в деминерализованной (дистиллированной) воде в течение не более 20 минут. Препарат рассчитан на изготовление 400 см3 жидкой формы среды питательной на основе гидролизатов

187. Препарат пригоден к применению в течение двух лет со дня изготвления при условии хранения в сухом темном месте при температуре (4-10)°С и относительной влажности не более 85%.

188. При отсутствии маркировки (этикеток), нарушении целостности флаконов, изменении цвета и консистенции содержимого, наличии хлопьев и посторонних примесей препарат бракуют.2.БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

189. Жидкая форма среды питательной стерильной на основе гидролизатов нетоксична и обладает выраженными ростостимулирующи-ми свойствами в отношении широкого спектра первичных и перевиваемых культур клеток.3. ПРИМЕНЕНИЕ ПРЕПАРАТА

190. Комплект среды питательной на основе гидролизатов сухой стерильной растворяют в 0,4 л стерильной деминерализованной воды с электропроводностью не более 0,5 мксим во флаконе вместимостью 0,5 л и герметически укупоривают резиновой пробкой.

191. Одобрено Советом по ветеринарным препаратам 9 октября 1997 года (протокол N0 4).1. N 000539-ОП)лоусов1. УТВЕРЖДАЮпроизводственного ис ой средысухой стерильной на основе гидролизата (ПССГ)

192. У КК)П. Шкабура '/-<-Р 199 '7—биокомбинатаг.

193. Контроль серий вакцины проведен в ОБТК Омского биокомбината. Результаты проведенных испытаний суммированны в таблицах 1, 2 и 3.

194. ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ СУХОЙ СТЕРИЛЬНОЙ НА ОСНОВЕ ГИДР0ЛИЗАТ0В ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ПЕРВИЧНЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК

195. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПЕРВИЧНЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК, ВЫРАЩЕННЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД СУХИХ СТЕРИЛЬНЫХ НА ОСНОВЕ ГИДР0ЛИЗАТ0В К ПРОИЗВОДСТВЕННЫМ ШТАММАМ ВИРУСОВ1. УТВЕРЖДАЮ

196. Заместитель директора СКЗНИВИ по^/научной работе-4иРский1997 г.иЩущШШ Иt '=;^ ivCii-W ;;>'' i1. АКТуиспытания "Среды питательной сухой стерильной на основегидролизатов (ПССГ)"п

197. Изготовление жидкой формы ПССГ, получение и выращивание культуры клеток ПЭК и культивирования вирусов проводили в соответствии с требованиями НТД. Результаты испытаний суммированы в таблицах 1 и 2.